JP2005527199A - 抗Aβ抗体とその利用法 - Google Patents
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Abstract
Description
同様のアッセイは、2つの離れた反応性ペプチドの集合を明らかにすることができる。これは、抗原性ポリペプチドの不連続、つまり立体配座エピトープ(Geysen(1886), Mol. Immunol. 23 709-715)の認識を示す。
T細胞依存性の抗原(しばしば弱い免疫原)を用いた免疫は、抗原提示細胞のエンドソームにある抗原の、タンパク質分解による切断を必要とする。免疫後の、親和性の高い抗体のインビボでの選択は、ヘルパーT細胞の、抗原提示細胞への接触によって行なわれる。抗原提示細胞は、短いペプチドだけを提示し、サイズの大きいポリペプチドは提示しない。したがって、これらの細胞は、抗原を取り込み、エンドソーム中で抗原を分解し、選択されたペプチドと適切なMHCクラスII分子を結合させ、ペプチド‐MHC複合体を細胞表
面に輸送する、複雑な(しかし周知の)機構を有する。これにより、B細胞の成熟を助けるために、T細胞による抗原特異的な認識が起こる。T細胞の助けのほとんどを得るB細胞は、抗原分泌細胞に分化し、増殖する見込みが最も高い。このことは、タンパク質分解による抗原のプロセシングが、インビボで親和性の高い抗体の応答を得るために重要なステップであることを示し、先行技術の、免疫によって得られるモノクローナルおよびポリクローナル抗体のN末端Aβエピトープの優越を説明し得る。
対照的に、本発明の抗体分子の選択は、Fab発現ファージの抗原への物理的接着によってなされる。このインビトロの選択プロセスでは、抗原の分解は起こらない。抗原に対して最も高い親和性を有するFabを発現するファージが選択され、増殖する。本発明に関して特異的な抗体分子を得るために選択された添付の実施例で用いられている合成ライブラリーは、免疫されたB細胞由来のライブラリーでしばしば見られる、単一の連続したエピトープへのいかなる偏りも避けるために特に適している。
これらのインビトロアッセイにおける様々な抗体の効果は、Aβ4凝集でのエピトープへの接近可能性と互いに関係がある。中央の領域とC末端は隠れていて容易に接近することはできず、そのためこれらのエピトープに対する抗体は効果がずっと低いのに対し、N末端は露出しており、N末端特異的な抗体は明らかに脱重合を誘導する。
抗体の、エピトープへの接近可能性に関する調査で、中間および中央のエピトープは隠れたままなのに対し、凝集したAβではN末端が露出しており、BAP-1抗体と反応すること、すなわち、4G8抗体の結合が見られなかったことが示された。しかし、単量体のAβではどちらのエピトープも隠されておらず、従来の技術によるどちらの抗体によっても同様に認識される。
エネルギーの計算を元に、5〜6残基の小さいサブタイプが、周囲の残基は相補的な配列を構成し得るだけなのに対し、リニアーの配列をもたず、エピトープ表面に分散していて、結合エネルギーのほとんどに寄与していることが示唆された(Laver (1990) loc. cit.)。
本発明の好ましいクロスクローニング抗体分子は、MS-R #3.3H1×3.4L9、MS-R #3.4H1×3.4L9、MS-R #3.4H3×3.4L7、MS-R #3.4H3×3.4L9、MS-R #3.4H7×3.4L9、MS-R #3.4H7×3.4L7、MS-R #3.6H5×3.6L1、MS-R #3.6H5×3.6L2、MS-R #3.6.H8×3.6.L2、MS-R #7.2H2×7.2L1、MS-R #7.4H2×7.2L1、MS-R #7.4H2×7.12L2、MS-R #7.9H2×7.2L1(L1)、MS-R #7.9H2×7.12L1、MS-R #7.9H2×7.12L2、MS-R #7.9H2×7.12L2(L1+2)、MS-R #7.9H4×7.12.L2、MS-R #7.11H1×7.2L1、MS-R #7.11H1×7.11L1、MS-R #7.11H2×7.2L1(L1)、MS-R #7.11H2×7.9L1、MS-R #7.11H2×7.12L1またはMS-R #8.1H1×8.2L1からなる群から選択される。
本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または、例えば一般的に遺伝子操作に用いられている他のベクターであり得、適切な宿主細胞中および適切な条件下での、前述のベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のような、さらに他の遺伝子を含み得る。
さらに、本発明のベクターは、本発明の核酸配列に加えて、発現調節因子を含み得、適切な宿主中でのコーディング領域の適切な発現を可能にする。かかる調節因子は、当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクターに挿入物を導入するための翻訳および挿入部位を含み得る。好ましくは、本発明の核酸分子は、前述の、真核または原核細胞中で発現を可能にする発現調節配列に、作動可能に連結される。
進行は、定期的な評価によってモニターされ得る。本発明の組成物は、局所的に、または全身に投与され得る。注目すべき点は、末梢に投与された抗体が、中枢神経系に進入し得ることである。特に、Bard (2000), Nature Med. 6, 916-919参照。非経口投与用調整物には、無菌の水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性のキャリアには、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝化溶媒が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液または固定されたオイルを含む。静脈内の媒体は、流体および栄養補充剤、(リンガーデキストロースを元にしたもののような)電解質補充剤等を含む。防腐剤および他の添加物は、例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性気体等のようにして存在し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の、意図とする使用法によってさらにまた薬剤を含有し得る。前述の薬剤には、神経保護因子、コリンエステラーゼ阻害剤、M1 ムスカリン受容体のアゴニスト、ホルモン、酸化防止剤、炎症の阻害剤等のような、中枢神経に作用する薬であり得る。前述の医薬組成物は、他にも、例えば神経伝達物質および/または神経伝達物質の代用の分子、ビタミンEまたはα-リポ核酸のような薬剤をさらに含有するのが、特に好ましい。
前述の診断用組成物は、本発明の化合物を含有し得、特に、また好ましくは、本発明の抗体分子を可溶性の形態/液相で含有し得るが、前述の化合物はまた、固相支持体に結合/付着および/または連結されるとも考えられる。
検出方法としては、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡検査法、直接および間接酵素反応等が挙げられるが、これらに限定されない。一般的に用いられる検出アッセイとしては、放射性同位体または非放射性同位体を用いた方法が挙げられる。これらには、特に、ウエスタンブロッティング、オーバーレイアッセイ、RIA(ラジオイムノアッセイ)、およびIRMA(免疫放射定量アッセイ)、EIA(酵素免疫アッセイ)、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、FIA(蛍光免疫アッセイ)およびCLIA(化学発光免疫アッセイ)が含まれる。
(a)配列番号:21、23または25に示されるような核酸分子にコードされるVH領域の少なくとも1つのCDR3を、または配列番号:22、24または26に示されるようなVH領域の少なくとも1つのCDR3アミノ酸配列を含有する抗体由来の、多様なFab抗体断片のライブラリーの構築;
(b)得られたFab最適化ライブラリーの、Aβ/Aβ4のパニングによる検査;
(c)最適化されたクローンの同定;および
(d)選択された、最適化されたクローンの発現。
本発明の抗体/抗体分子の最適化はまた、添付の実施例に付記されており、例えば、本明細書中で規定されているようなβ-A4の領域/エピトープの一方または両方に対する親和性の高さによる選択、または発現の増加による選択等を含み得る。ある態様では、前述の、β-A4の領域/エピトープの一方または両方に対する親和性の高さによる選択は、(a)β-A4のアミノ酸2〜10を含有するアミノ酸ストレッチ(またはその部分)および/または(b)β-A4のアミノ酸12〜25を含有するアミノ酸ストレッチ(またはその一部)(配列番号:27)に対する親和性の高さによる選択を含む。
「パニング」技術はまた当業者に公知である。例として、Kay (1993), Gene 128, 59-65参照。さらに、Borrebaeck (1995), "Antibody Engineering", Oxford University, 229-266; McCafferty (1996), "Antibody Engineering", Oxford University Press; Kay (1996), A Laboratory Manual, Academic Pressのような出版物によって、本発明に従って改変され得る最適化プロトコールが提供される。
好ましくは、上述の方法のステップ(b)における前述のAβ/Aβ4(本発明においてはβA4とも書かれている)は、凝集したAβ/Aβ4である。前述のパニングは、(添付の実施例に記されているように)結合のストリンジェンシーの増加を伴って実施され得る。ストリンジェンシーは、特に、Aβ/Aβ4濃度を減らすこと、または(アッセイの)温度を上げることによって増大し得る。パニングによる最適化ライブラリーの検査は、当業者に公知であり、Kay (1993), loc. cit.に記されている。好ましくは、ステップ(c)における同定は、最低のKD値による順位付けによって行われる。
(a)本明細書中に記されている方法、および添付の実施例で説明されている方法による抗体の最適化;および
(b)最適化された抗体分子の、上述のような生理学的に許容され得る媒体を用いた製剤化。
したがって、本発明はまた、本明細書中で開示された方法によって調製され、かつ、上述のように、ベータ-A4ペプチド/Aベータ4/Aβ/A4β/βA4の2つの領域を特異的に認識し得る、さらに最適化された抗体分子を含有する医薬組成物を提供する。
配列番号:1
AEFRHDSGY
β-A4ペプチドの第1領域、「N-末端領域/エピトープ」
VHHQKLVFFAEDVG
β-A4ペプチドの第2領域、「中心/中央領域/エピトープ」
MS-Roche#3のVH-領域(核酸配列)
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC (配列番号:3)
MS-Roche#3のVH-領域(アミノ酸配列)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号:4)
MS-Roche#7のVH-領域(核酸配列)
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC (配列番号:5)
MS-Roche#7のVH-領域(アミノ酸配列)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号:6)
MS-Roche#8のVH-領域(核酸配列)
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTCTTTCTCGTGGTTATAATGGTTATTATCATAAGTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC (配列番号:7)
MS-Roche#8のVH-領域(アミノ酸配列)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLLSRGYNGYYHKFDVWGQGTLVTVSS (配列番号:8)
MS-Roche#3のVL-領域(核酸配列)
GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGGTTTATAATCCTCCTGTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG (配列番号:9)
MS-Roche #3のVL-領域(アミノ酸配列)
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQVYNPPVTFGQGTKVEIKRT (配列番号:10)
MS-Roche#7のVL-領域(核酸配列)
GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCTTTCAGCTTTATTCTGATCCTTTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG (配列番号 11)
MS-Roche#7のVL-領域(アミノ酸配列)
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCFQLYSDPFTFGQGTKVEIKRT (配列番号:12)
MS-Roche#8のVL-領域(核酸配列)
GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGCTTTCTTCTTTTCCTCCTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG (配列番号:13)
MS-Roche#8のVL-領域(アミノ酸配列)
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQLSSFPPTFGQGTKVEIKRT (配列番号:14)
MSR-3のVL-領域のCDR3(核酸配列)
CAG CAG GTT TAT AAT CCT CCT GTT │
(配列番号:15)
MSR-3のVL-領域のCDR3(アミノ酸配列)
QQVYNPPV (配列番号:16)
MSR-7のVL-領域のCDR3(核酸配列)
TTT CAG CTT TAT TCT GAT CCT TTT│
(配列番号:17)
MSR-7のVL-領域のCDR3(アミノ酸配列)
FQLYSDPF (配列番号 18)
MSR-8のVL-領域のCDR3(核酸配列)
CAG CAG CTT TCT TCT TTT CCT CCT
(配列番号 19)
MSR-8のVL-領域のCDR3(アミノ酸配列)
QQLSSFPP (配列番号:20)
MSR-3のVH-領域のCDR(核酸配列)
CTT ACT CAT TAT GCT CGT TAT TAT CGT TAT TTT GAT GTT
(配列番号:21)
MSR-3のVH-領域のCDR(アミノ酸配列)
LTHYARYYRYFDV (配列番号:22)
MSR-7のVH-領域のCDR(核酸配列)
GGT AAG GGT AAT ACT CAT AAG CCT TAT GGT TAT GTT CGT TAT TTT GAT GTT
(配列番号:23)
MSR-7のVH-領域のCDR(アミノ酸配列)
GKGNTHKPYGYVRYFDV (配列番号:24)
MSR-8のVH-領域のCDR(核酸配列)
CTT CTT TCT CGT GGT TAT AAT GGT TAT TAT CAT AAG TTT GAT GTT
(配列番号 25)
MSR-8のVH-領域のCDR(アミノ酸配列)
LLSRGYNGYYHKFDV (配列番号:26)
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (配列番号:27)
5'-GTGGTGGTTCCGATATC-3´ (配列番号:28)
5´- AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGTTA-3´ (配列番号:29)
5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´ (配列番号:30)
5´-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3´ (配列番号:31)
CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTTCTGAGTCTGGTAAGACTAAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (配列番号:32)
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISESGKTKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号:33)
CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTTCTGAGTATTCTAAGTTTAAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (配列番号:34)
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CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATTATAATGGTGCTCGTATTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (配列番号:36)
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CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTGATGGTAATCGTAAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (配列番号:38)
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CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTGTTGGTATGAAGAAGTTTTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (配列番号:40)
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CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT (配列番号:60)
LTHYARYYRYFDV (配列番号:61)
CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT (配列番号:62)
LTHYARYYRYFDV (配列番号:63)
GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (配列番号:64)
GKGNTHKPYGYVRYFDV (配列番号:65)
GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (配列番号:66)
GKGNTHKPYGYVRYFDV (配列番号:67)
GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (配列番号:68)
GKGNTHKPYGYVRYFDV (配列番号:69)
GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (配列番号:70)
GKGNTHKPYGYVRYFDV (配列番号:71)
GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (配列番号:72)
GKGNTHKPYGYVRYFDV (配列番号:73)
CAGCAGACTTATAATTATCCTCCT (配列番号:74)
QQTYNYPP (配列番号:75)
CAGCAGACTTATAATTATCCTCCT (配列番号:76)
QQTYNYPP (配列番号:77)
CAGCAGATTTATTCTTTTCCTCAT (配列番号:78)
QQIYSFPH (配列番号:79)
CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT (配列番号:80)
LQLYNIPN (配列番号:81)
CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT (配列番号:82)
LQLYNIPN (配列番号:83)
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QQVYSPPH (配列番号:85)
CAGCAGATTTATTCTTTTCCTCAT (配列番号:86)
QQIYSFPH (配列番号:87)
Caggtgcaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctca (配列番号:88)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS (配列番号:89)
Gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacg (配列番号:90)
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Ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt (配列番号:92)
GKGNTHKPYGYVRYFDV (配列番号:93)
Cttcagatttataatatgcctatt (配列番号:94)
LQIYNMPI (配列番号:95)
HuCAL(登録商標)-Fab 1のクローニング
HuCAL(登録商標)-Fab 1は、Fab抗体断片形式の完全に合成のモジュール(modular)ヒト抗体ライブラリーである。HuCAL(登録商標)-Fab 1は、単鎖形式の抗体ライブラリー(HuCAL(登録商標)-scFv; Knappik,(2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86)から始めて合成した。
Vλ 1位および2位。オリジナルのHuCAL(登録商標)マスター遺伝子を、その真正N-末端: VLλ1: QS (CAGAGC)、VLλ2: QS (CAGAGC)およびVLλ3: SY (AGCTAT)を用いて構築した。これらのアミノ酸を含有する配列は国際公開公報WO 97/08320に示されている。HuCAL(登録商標)ライブラリー構築の際、ライブラリークローニングを容易にするために最初の2つのアミノ酸をDIに置換した(EcoRI部位)。すべてのHuCAL(登録商標)ライブラリーは、5’-末端にEcoRV部位 GATATC (DI)を有するVLλ遺伝子を含有する。すべてのHuCAL(登録商標)κ遺伝子(マスター遺伝子およびライブラリー内のすべての遺伝子)は5’-末端にDIを含有する(図1AおよびB)。
VH 1位。オリジナルのHuCAL(登録商標)マスター遺伝子を、その真正 N-末端: 第1アミノ酸としてQ (=CAG)を有するVH1A、VH1B、VH2、VH4およびVH6ならびに第1アミノ酸としてE (=GAA)を有するVH3およびVH5を用いて構築した。これらのアミノ酸を含有する配列は国際公開公報WO 97/08320に示されている。HuCAL(登録商標)-Fab1ライブラリーのクローニングの際、すべてのVH遺伝子においてVHの1位のアミノ酸をQ (CAG)に置換した(図1AおよびB)。
CDRライブラリーの設計
Vκ1/Vκ3 85位。CDR3ライブラリーを誘導するために使用したカセット式変異誘発手順(Knappik, (2000), 前出)のため、Vκ1およびVκ3の85位は、TまたはVのいずれかであり得る。したがって、HuCAL(登録商標)-scFv1ライブラリー構築の際、Vκ1およびVκ3の85位を以下のように変化させた: Vκ1オリジナル、85T(コドンACC); Vκ1ライブラリー、85Tまたは85V(TRIMコドンACTまたはGTT); Vκ3オリジナル、85V(コドンGTG); Vκ3ライブラリー、85Tまたは85V(TRIM コドンACTまたはGTT); 同じことをHuCAL(登録商標)-Fab1にも適用する。
CDR3設計。すべてのCDR3残基は一定に維持されており、図1AおよびBに示す。
CDR3長さ。設計したCDR3の長さの分布は以下の通りである。変化させた残基は図1において大括弧(x)で示す。VκCDR3は、8個のアミノ酸残基(89〜96位)(7-10残基の場合がある)で、Q89、S90およびD92は一定;およびVH CDR3は、5〜28個のアミノ酸残基(95〜102位)(4-28の場合がある)で、D101は一定。
全VH鎖(MunI/StyI-断片)を、β-ラクタマーゼ転写単位(bla)を含有する1205 bp ダミー断片と置き換え、それによりベクター断片調製のための次の工程を容易にし、かつ完全VH取出しの選択を可能にした。
VH-置換後、VLλをEcoRI/DraIIIにより、またVLκをEcoRI/BslWIにより取出し、細菌性アルカリホスファターゼ(bap)遺伝子断片(1420 bp)と置換した。軽鎖の変異性(variability)は重鎖よりも低いため、クローニングは軽鎖ライブラリーから始めた。HuCAL(登録商標)-scFvライブラリー(Knappik, (2000), 前出)のために作製した、L-CDR3を多様に変化させたVLλおよびVLκ軽鎖ライブラリーもまた、HuCAL(登録商標)-Fab1のクローニングに使用した。λの場合、それらは、λ1-、λ2-およびλ3-HuCAL(登録商標)-フレームワークから構成され、5.7×106の全変異性を有した。VLλ?断片を、プライマー 5'-GTGGTGGTTCCGATATC-3´(配列番号:28)および5´- AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGTTA-3´(配列番号:29)を用いた15 PCRサイクル(Pwo-ポリメラーゼ)により増幅した。PCR-産物をEcoRV/DraIIIで消化し、ゲル精製した。VLλ-ライブラリーの場合では、bap-ダミーをEcoRV/DraIIIによりライブラリーベクターから除去した。2μgのゲル精製ベクターを3倍モル過剰のVLλ鎖と16時間16℃でライゲートし、ライゲーション混合物を800μl 大腸菌TOP10F細胞(Invitrogen)内にエレクトロポレーションし、全部で4.1×108の独立コロニーを得た。形質転換体を、2×YT/1%グルコース/34μg/ml クロラムフェニコール/100μg/ml アンピシリン中で約2000倍に増幅し、回収し、20%(w/v)グリセロール中に?80℃で保存した。
κライブラリーは、κ1-、κ2-、κ3-およびκ4-HuCAL(登録商標)マスター遺伝子を含有し、5.7×106の全変異性を有する。VLκ鎖は、EcoRV/BsiWIでの制限消化により得、ゲル精製した。VLκ-ライブラリーの場合では、bap-ダミーをEcoRV/BslWIによりライブラリーベクターから除去した。2μgのゲル精製ベクターを5倍モル過剰のVLκ鎖と混合した。ライゲーションおよび大腸菌TOP10F細胞(Invitrogen)への形質転換は、VLλ鎖で記載のようにして行ない、全部で1.6×108の独立コロニーを得た。
2つの軽鎖ライブラリーのDNAを調製し、bla-ダミーをMunI/StyIにより除去し、それによりVHサブライブラリーの挿入のための2つのベクターを作製した。HuCAL(登録商標)-Fab1の作製のため、HuCAL(登録商標)-scFvのVHライブラリーを使用した。HuCAL(登録商標)-scFvのVHライブラリーは、個々にCDR3長さが異なる2つのVH-CDR3トリヌクレオチドライブラリーカセットにより多様に変化させたマスター遺伝子VH1A/B-6 から構成され、各VH-ライブラリーをVLκ-およびVLλ-ライブラリーと結合した。HuCAL(登録商標)-Fab1の作製のため、これらのVH-ライブラリー由来のDNA を、オリジナルの変異性を維持したまま調製した。DNAをMunI/StyIで消化し、ゲル精製した。5倍モル過剰のVH鎖を3μgのVLλ-ライブラリーベクターおよび3μgのVLκ-ライブラリーベクターに4時間22℃でライゲートした。各ベクターについて、ライゲーション混合物を1200μlの大腸菌TOP10F細胞(Invitrogen)内にエレクトロポレーションし、全部で2.1×1010の独立コロニーを得た。形質転換体を、2×YT/1%グルコース/34μg/ml クロラムフェニコール/10μg/ml テトラサイクリン中で約4000倍に増幅し、回収し、20%(w/v)グリセロール中に-80℃で保存した。
品質対照として、単一クローンの軽鎖および重鎖を配列決定すると、それぞれ5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´(配列番号:30)および5´-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3´(配列番号:31)であった。
HuCAL(登録商標)-Fab 1を、34μg/ml クロラムフェニコール、10μg/ml テトラサイクリンおよび1%グルコースを含有する2×TY培地(2×TY-CG) 中で増幅した。約0.5のOD600で37℃でのヘルパーファージ感染(VCSM13)、遠心分離および2×TY/34μg/ml クロラムフェニコール/50μg/ml カナマイシン中への再懸濁後、細胞を30℃で一晩増殖させた。ファージを上清みからPEG-沈殿させ(Ausubel, (1998), Current protpcols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc., New York, USA)、PBS/20%グリセロール中に再懸濁し、?80℃で保存した。2回のパニング間でのファージ増幅は、以下のようにして行なった。対数期中期のTG1-細胞を溶出ファージに感染させ、1%のグルコースおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを添加したLB-寒天にプレーティングした。30℃で一晩インキュベーションした後、コロニーを削り取り、OD600を0.5に調整し、上記のようにしてヘルパーファージを添加した。
MaxiSorpTM マイクロタイタープレートF96 (Nunc)のウェルを、NaN3(0.05% v/v)含有TBSに溶解した2.5μMヒトAβ(1-40)ペプチド(Bachem) 100μlでコートし、密閉したプレートを3日間37℃でインキュベートした。この場合、ペプチドはプレート上で凝集する傾向がある。5%無脂肪粉乳を含むTBSでのブロッキング後、上記のようにして精製した1〜5×1012 HuCAL(登録商標)-Fabファージを1時間20℃で添加した。数回の洗浄工程後、結合したファージを500 mM NaCl、100 mMグリシン pH 2.2を用いたpH-溶出により溶出し、続いて1M TRIS-Cl pH 7で中和した。3回のパニングを行ない、各回間では上記のようにしてファージ増幅行ない、洗浄ストリンジェンシーは各回毎に増大させた。
可溶性Fabの迅速発現を促進するため、選択したHuCAL(登録商標)-Fab断片のFabコード挿入物を発現ベクターpMORPH(登録商標)x7#FS内にサブクローニングした。選択したHuCAL(登録商標)-Fab クローンのDNA調製物をXbaI/EcoRIで消化し、Fabコード挿入物(ompA-VLおよびphoA-Fd)をかくして切出した。予めscFv挿入物を保有したXbaI/EcoRI切断ベクターpMORPH(登録商標)x7内への精製挿入物のサブクローニングは、pMORPH(登録商標)x9#Fab1(図3)で表されるFab発現ベクターをもたらす。このベクターで発現されるFabは、検出および精製のための2つのC-末端タグ(FLAGおよびStrep)を保有する。
MaxisorpTMマイクロタイタープレートF384 (Nunc)のウェルを、NaN3 (0.05% v/v)を含有するTBSに溶解した2.5μMヒトAβ(1-40)ペプチド(Bachem)20μlでコートし、密閉したプレートを3日間37 ℃でインキュベートした。この場合、ペプチドはプレート上で凝集する傾向がある。個々のFabの発現を、1 mM IPTGにより16時間22℃で誘導した。可溶性Fabを、BEL溶解(ホウ酸、NaCl、EDTAおよびリゾチーム含有バッファー pH 8)により大腸菌から抽出し、ELISAにおいて使用した。Fab断片は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗-Fab抗体(Dianova/Jackson Immuno Research)により検出した。340 nmで励起後、AttoPhos 蛍光基質(Roche Diagnostics)の添加後に535 nm での発光を読み取った。
選択したAβ結合抗体断片の結合親和性を至適化するため、いくつかのFab断片、MS-Roche-3 (MSR-3)、MS-Roche-7 (MSR-7)およびMS-Roche-8 (MSR-8) (図4)を使用し、親VLκ3鎖を、HuCAL(登録商標)ライブラリー(Knappikら, 2000)由来のCDR3を多様に変化させたすべてのκ鎖κ1〜3のプールと置き換えることにより、Fab抗体断片のライブラリーを構築した。
Fab断片MS-Roche-3、7および8をXbaI/EcoRIにより、pMORPH(登録商標)x9 #FSから、Fab断片のファージディスプレイ用ファージミド系ベクターであるpMORPH(登録商標)18にクローニングし、pMORPH(登録商標)18#Fab1 (図2)を作製した。κ鎖プールをXbaI/SphI 制限部位によりpMORPH(登録商標)18#Fab1内にクローニングした。
例えば、Ab1-40に対するMS-Roche-7親Fabのアフィニティーは、表3に示すように、L-CDR3至適化後(MS-Roche-7.9)1100 nMから31 nMまで35倍を超えて向上し、H-CDR2至適化後(MS-Roche-7.9H2)5 nMまでさらに向上した。
H-CDR2およびL-CDR1至適化手順はアフィニティーを増大させただけでなく、いくつかのクローンでは、MS-Roche 7.9H2および7.9H3で特に見られるようなAD脳切片におけるアミロイド斑の有意に向上した染色がもたらされた。
HuCAL(登録商標)免疫グロブリン発現ベクターの構築
重鎖クローニング。リーダー配列(NheI/EcoRI)、VH-ドメイン(MunI/)および免疫グロブリン定常領域(BlpI/ApaI)のライゲーションのため、pcDNA3.1+(invitrogen)のマルチ(multiple)クローニングサイトを除去し(NheI/ApaI)、HuCAL(登録商標)設計に使用した制限部位に適合性のあるstufferを挿入した。リーダー配列(EMBL 83133)に、コザック配列(Kozak, 1987)をつけた。ヒトIgGの定常領域(PIR A02146)、IgG4の定常領域(EMBL K01316)および血清IgA1の定常領域(EMBL J00220)の定常領域を、約70塩基長のオーバーラップオリゴヌクレオチドに細分した。HuCAL(登録商標)設計には不適当な制限部位を除去するため、サイレント変異を誘導した。オリゴヌクレオチドを重複伸長-PCRによりスプライシングした。
FabからIgGへのサブクローニングの際、FabのVH DNA配列をMfe I/Blp Iにより切出し、EcoR I/Blp Iにより開裂したIgG ベクターにライゲートした。EcoR I (g/aattc)およびMfe I (c/aattg)は、適合性付着性末端(aatt)を共有し、IgG発現ベクターへのライゲーション後、FabのオリジナルMfe I部位のDNA配列はc/aattgからg/aattgに変化し、それにより、Mfe IおよびEcoR I部位の両方が破壊され、したがって、Q(コドン: caa)からE(コドン: gaa)へのアミノ酸変化ももたらされる。
軽鎖クローニング。pcDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)のマルチクローニングサイトを、2つの異なるstufferで置換した。κ-stufferは、κ-リーダー(NheI/EcoRV)、HuCAL(登録商標)-scFv Vκ-ドメイン(EcoRV/BsiWI)およびκ鎖定常領域 (BsiWI/ApaI)の挿入のための制限部位を提供した。λ-stufferにおける対応制限部位は、NheI/EcoRV(λ-リーダー)、EcoRV/HpaI(Vλ-ドメイン)およびHpaI/ApaI (λ鎖定常領域)であった。κ-リーダー(EMBL Z00022)およびλ-リーダー(EMBL J00241)の両方に、コザック配列をつけた。ヒトκ鎖の定常領域(EMBL L00241)およびλ鎖の定常領域(EMBL M18645)を、上記の重複伸長-PCRにより合成した。
IgG-発現CHO-細胞の作製。CHO-K1細胞を、IgGの重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターの等モル混合物で同時トランスフェクトした。二重耐性トランスフェクタントを600μg/ml G418および300μg/ml Zeocin (Invitrogen)により、続いて限界希釈により選択した。単一クローンの上清みをIgG発現について捕捉-ELISAにより評価した。陽性クローンを、10%超低IgG-FCS (Life Technologies)を添加したRPMI-1640培地中で拡大した。上清みのpHを8.0に調整し、滅菌濾過した後、溶液を標準タンパク質Aカラムクロマトグラフィー(Poros 20 A、PE Biosystems)に供した。
Aβ(1-42)を含む以下のアミノ酸配列を、1アミノ酸のフレームシフトを伴う43個のオーバーラップデカペプチドに分割した。
ISEVKM1DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVI42ATV IV (配列番号:414)。したがって、含有されている(enclosed)DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVIA(配列番号:27)はAβ4/β-A4ペプチドのアミノ酸1〜42を示す。
43個のデカペプチドを、N-末端アセチル化および市販業者(Jerini BioTools, Berlin)のセルロースシート("pepspot")へのC-末端共有結合により合成した。セルロースシートを、振動台上で2時間、モノクローナル抗体(2μg/ml)含有ブロッキングバッファー(50 mM Tris.HCl、140 mM NaCl、5 mM NaEDTA、0.05% NP40 (Fluka)、0.25%ゼラチン(Sigma)、1% ウシ血清アルブミン第V画分(Sigma)、pH 7.4)とともにインキュベートする。振動台上でシートをTBS (10 mM Tris.HCl、150 mM NaCl、pH 7.5)で3回3分間洗浄する。次いで、それをカソードバッファー(25 mM Tris塩基、40 mM 6-アミノヘキサン酸、0.01% SDS、20%メタノール)で湿らせ、ペプチド側を同じ大きさのPVDF膜(Biorad)に向けて半乾燥ブロットスタック(stack)に移す。
半乾燥ブロットスタックは、ペプチドシートよりやや大きな、新たに湿らせたろ紙(Whatman No.3):
カソードバッファーで湿らせた3枚の紙
ペプチドシート
メタノールで湿らせたPVDF膜1枚
アノードバッファー 1 (30mM Tris塩基、20%メタノール)で湿らせた3枚の紙
アノードバッファー 2 (0.3 mM Tris塩基、20%メタノール)で湿らせた3枚の紙
から構成される。
PVDF膜をブロッキングバッファーに10分間浸す。次いで、HRP標識抗ヒトIg H+L(Pierce)を1:1000の希釈度で添加し、膜を前後に揺れるプラットフォーム上で1時間インキュベートする。これをTBST(0.005%Tween20を有するTBS)で3×10分洗浄する。41mlのPBS(20mM リン酸Na、150mM NaCl、pH7.2)10μl 30%過酸化水素(Merk)を有する9mlのメタノールに溶解した3mgの4-クロロナフトールからなる溶液に膜を浸すことにより呈色する。暗青色の反転が生じた後、膜を水で十分洗浄し、乾燥させる。
抗体反応性pepspotの割当を、透明なスポットマトリックスを介する視覚検査により行う。目的の抗体のエピトープを反応性ペプチド中の最小のアミノ酸配列として規定する。比較のために、マウスモノクローナル抗体(BAP-2、BAP-1、BAP-17、BAP-21、BAP-24、および4G8)を、抗ヒトIgの代わりにHRP-標識抗-マウスIgを使用すること以外は、同じ方法で解析する。
原線維Aβへの抗Aβ抗体(FabおよびIgG1)の結合を、表面プラスモン共鳴(SPR)によりオンラインで測定し、分子相互作用の親和性を、Johnson, Anal.Biochem. 1991, 198, 268-277、およびRichalet-Secordel, Anal.Biochem. 1997, 249, 165-173により記載されるように測定した。Biacore2000およびBiacore3000機器をこれらの測定のために使用した。Aβ1-40およびAβ1-42線維を、10mM酢酸Naバッファー(pH4.0)中に200μg/mlの濃度で合成ペプチドを37℃で3日間インキュベートすることによりインビトロで作製した。電子顕微鏡解析により、主により短い(<1ミクロン)線維を示すAβ1-40および主により長い(>1ミクロン)線維を有するAβ1-42の両方のペプチドの原線維構造を確認した。これらの線維は、無構造の凝集体および非構造沈殿物の曖昧な混合物よりも綿密に凝集した、ヒトAD脳中の凝集Aβペプチドを表すと考えられる。製造業者の指示説明書(BIAapplication Handbook, バージョン AB, Biacore AB, Uppsala, 1998)に記載されるように線維を1:10に希釈し、「Pioneer Sensor Chip F1」に直接結合させた。最初の実験において、選択したMS-Roche Fabがその反応速度論において実質的に異なり、それ故データ解析の様式を選択しなければならないことを見出した。緩徐な速度論を有する結合剤について、KD値を、時間依存性センサー応答のカーブフィッティング、すなわち、Koff/Konの比から計算した。迅速な速度論を有する結合剤を、平衡状態(吸着-等温線)で濃度依存センサー応答をフィッティングさせることにより解析した。KD値を、タンパク質アッセイにより測定される総Fab濃度に基づいてBiacore sensogramから計算した。第1および第2の親和性成熟サイクルに由来するクローンについて、各調製物中の活性Fabの含量を、Christensen, Analytical Biochemistry (1997) 249, 153-164により記載される方法に従ってBiacore中で測定した。手短には、Biacoreチップに固定化されたAβ1-40線維への時間依存性タンパク質結合を種々の流速の分析溶液で質量制限条件下での会合相の間測定した。大量のAβ線維(2300応答単位)を測定チャネルのチップ表面に固定化し、比較的低い解析濃度、すなわち、160nM (総Fabタンパク質濃度に基づいて)で作動させることにより、質量制限の条件を実現した。
第1および第2の親和性成熟サイクル後、HuCALライブラリーの最初のスクリーニングにおいて同定され、選択したMS-Rocheクローンおよびその対応する成熟誘導体のKD値の要約を表3に示す。第1親和性成熟サイクルにおいて、重鎖CDR3(VH-CDR3)を一定に保ち、最適化を軽鎖CDR(VL-CDR3)の多様化に焦点を合わせた。第2の親和性サイクルにおいて、VL-CDR1およびVH-CDR2の多様化を行った。第1の成熟サイクルに由来する結合剤のいくつかを、実施例6に記載のMorphoSysにより開発された技術に従って全長ヒトIgG1抗体に変換し、KD値を上記のBiacoreにおいて決定した。Aβ1-40およびAβ1-42線維への全長IgG1結合のKD値を表4に示す。
選択したMS−Roche Fabおよび全長IgG1を、免疫組織化学解析によりβ−アミロイド斑への結合について試験した。ヒト側頭皮質に由来する未固定組織クリオスタット切片(アルツハイマー病について陽性と診断された患者から死後に得られた)を、種々の濃度のMS−Roche Fabまたは全長ヒトIgG1抗体を用いて間接的な免疫蛍光法により標識した。FabおよびIgG1抗体は、それぞれCy3に結合したヤギ抗ヒト親和性精製F(ab’)2断片およびCy3に結合したヤギ抗ヒト(H+L)により表された。両方の二次試薬を、Jackson lmmuno Researchから得た。対照は、無関係のFabおょび二次抗体のみを含み、これらは全て陰性結果を示した。選択されたMS−Roche FabおよびMS−Roche IgG1抗体での斑染色の典型的な例は図5〜7に示される。
合成Aβは、水性バッファー中で数日間インキュベートされた場合、自発的に凝集し、アルツハイマー病患者の脳のアミロイド沈着物に見られるものに類似する原線維構造を形成する。我々は、抗−Aβ抗体およびアルブミン等の他のAβ一結合タンパク質(Bohrmannら、1999,J.Biol.Chem.274,15990−15995)のAβ中和能力を解析するために、プレフォームAβ凝集体へのビオチン化Aβの取り込みを測定するためのインビトロアッセイを関発した。Aβ凝集における小分子の効果もまた、このアッセイで解析されうる。
NUNC Maxisorb マイクロタイタープレート(MTP)をAβ1−40およびAβ1−42(各々2μM、ウェル毎に100μ1)の1:1混合物で37℃にて3日間被覆する。これらの条件下で、高度に凝集した原線維Aβをウェルの表面に吸着させ、固定化する。次いで、被覆溶液を除去し、プレートを室温で2〜4時間乾燥させる(乾燥プレートを−20℃で保存しうる)。残液結合部位を、0.05%Tween20(T−PBS)および1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する300μ1/ウェルリン酸緩衝化生理食塩水を添加することによりブロックする。室温で1〜2時間のインキュベーション後、プレートを1×300μ1 T−PBSで洗浄する。0.05%NaN3および段階希釈した抗体を含む20mM Tris−HCl、150mM NaCl pH7.2(TBS)中の20nMビオチン化Aβ1−40の溶液を添加し(100μ1/ウェル)、37℃で一晩インキュベートする。300μ1のT−PBSで3回洗浄後、1%BSAを含有するT−PBSに1:1000で希釈したストレプトアビジンーPODコンジュゲート(Roche Molecular Biochemicals)を添加し(100μ1/ウェル)、室温で2時間インキュベートする。ウェルをT−PBSで3回洗浄し、100μ1/ウェルの新しく調製したテトラメチルーベンジジン(TMB)溶液を添加する。[TMB溶液の調製:10mlの30mMクエン酸pH4.1(KOHで調整)+0.5mlのTMB(1m1アセトン+9mlメタノール中に12mg TMB)+0.0lmlの35%H2O2]。100μ1/ウェルのIN H2S04を添加することにより反応を停止させ、吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで450nmにて読み取る。
図8は、M−Roche IgG1抗体が、プレフオームAβ1−40/Aβ1−42凝集体へのビオチン化Aβ1−40の取り込みを防止したことを示す。これらの全長ヒトlgGのAβ一中和能力は、標準的な免疫手順により作製され、実施例7に記載のPepspot技術により解析した場合、Aβペプチドのアミノ酸残基4〜6を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体BAP−1に類似した。アミノ酸4〜6とも排他的に反応するマウスモノクローナル抗体BAP−2(Brockhaus、未公表)は、このアッセイにおいて有意に活性が低かった。さらに低い活性は、Aβ1−40 C一末端特異的抗体BAP−17(Brockhaus,Neuroreport 9(1998),1481−1486)およびAβ配列の17〜24位のエピトープを認識するモノクローナル抗体4G8(Kim,1988,Neuroscience Research Communication Vol.2,121−130)で見出された。10μg/mlまでの濃度のBSAは、ビオチン化Aβの取り込みに影響せず、陰性対照として使用した。しかし、高濃度、すなわち、>100μg/mlでは、BSAは、プレフオームAβ繊維へのビオチン化Aβの結合を阻害し(Bohrmann,(1999)J BioChem 274(23),15990−5)、BSAとAβとの相互作用は高親和性ではないことを示す。
類似した実験設定において、我々は、凝集Aβの脱重合を誘導するMS−Roche IgG抗体の能力を試験した。まず、種々の抗−Aβ抗体での処置前に、ビオチン化Aβ1−40をプレフォームAβ1−40/Aβ1−42線維に取り込ませた。ビオチン化Aβの遊離を、重合アッセイに記載したのと同じアッセイを用いて測定した。
NUNC Maxisorb マイクロタイタープレート(MTP)を、重合アッセイに記載したようにAβ1−40およびAβ1−42の1:1混合物で被覆する。ビオチン化Aβの取り込みのために、被覆プレートを、0.05% NaN3を含有するTBS中の200μI/ウェルの20nMビオチン化Aβ1−40とともに37℃で一晩インキュベートする。3×300μ1/ウェルのT−PBSでプレートを洗浄した後、0.05%NaN3を含有するTBS中に段階希釈した抗体を添加し、37℃で3時間インキュベートした。プレートを洗浄し、上記のようにビオチン化Aβ1−40の存在について解析した。
図9A〜Dは、本発明の抗体が、組み込まれたビオチン化Aβ1−40の放出により測定される凝集Aβの説重合を誘導したことを示す。MS−R抗体およびマウスモノクローナル抗体BAP−1は同様に活性であったが、BAP−2、BAP−17および4G8抗体は、固定化されたAβ凝集体のバルクからビオチン化Aβを遊離することにおいて明らかに効率が低かった。BAP−1は、細胞表面全長APPとの反応性によりMS−R抗体とは明らかに区別され得(図15参照)、かかる特性を有するBAP−1のような抗体は、潜在的な自己免疫反応が誘導されうるので治療適用には有用ではない。BAP−2が、凝集したAβに曝されるアミノ酸残基4〜6に対する特異性にも関わらず、このアッセイでは明らかに低い活性を有することに注目することは興味深く、全てのN−末端特異的抗体が先天的にプレフォーム凝集体からAβを放出することにおいて同様に効率的ではないことを示す。MS−Roche lgGは、脱重合活性に関してBAP−2よりも明らかに優れる。このアッセイにおける、BAP−17(C−末端−特異的)および4G8(アミノ酸残基16〜24−特異的)の比較的低い効力は、凝集したAβのこれらの2つのエピトープの潜在的性質による。重合アッセイで既に記載したように、ここで使用される濃度のBSAは、凝集したAβに対して効果を有さなかった。
本発明の親および/または成熟抗体に関する対応する結果を以下の2つの表に示す。
HuCALライブラリーのモジュラーデザインは、単一クローニングエ程において、2つの異なるFabをコードする遺伝子の相補性決定領域(CDR)の交換を可能にする。親和性のさらなる改善のために、同じH−CDR3を有する成熟クローンに由来する独立して最適化されたH−CDR2およびL−CDRIを組み合わせる。なぜなら、この組み合わせが親和性のさらなる獲得を導きうる確率が高いからである(Yangら、1995.J.Mol.Biol.254,392−403:Schierら、1996b,J.Mol.Biol.263.551−567:Chenら、1999,J.Mol.Biol.293,865−881)。軽鎖全体、またはその断片を、L−CDRI最適化ドナークローンからH−CDR2最適化レシピエントクローンに移した。ドナーおよびレシピエントクローンが両方とも同一のH−CDR3配列を保有する場合、ドナーおよびレシピエントクローンのみを組み合わせた。全てのドナーおよびレシピエントクローンは、VH3−Vκ3フレームワークを保有していた。
これは、L−CDR1−最適化ドナークローンからH−CDR2−最適化レシピエントクローンに軽鎖全体を移すことにより達成した。クローンと同じH−CDR3とを組み合わせた場合にのみエピトープ特異性が保存された。クローンと同じL−CDR3との間で交換が起こった場合、軽鎖交換により、H−CDR2−最適化クローンは、最適化L−CDRIのみを得た。組み合わせるクローンのL−CDR3が異なる場合、H−CDR2−最適化クローンは、最適化L−CDR1に加えて、別のL−CDR3(L−CDR2は、HuCALコンセンサス配列を残存した(Knappikら、2000))を獲得し、MS−Roche#7.12の誘導体を軽鎖のドナーとして使用した場合、L−CDR1、2および3は、H−CDR2−最適化アクセプタークローンにおいて交換された。
3つの異なるストラテジーを使用した:
1)制限エンドヌクレアーゼXbalおよびSphIを使用して、抗体軽鎖全体の断片をプラスミド1(例えば、pMx9_Fab_MS−Roche#7. 11.H1_FS)から切り出し、それにより次いで得られたベクター骨格を、XbalおよびSphI消化により作製されたプラスミド2(例えば、pMx9_Fab_MS−Rochef#7.2.L1_FS)の軽鎖断片に連結した。それにより、親クローン#7.2.LIのL−CDR1,2,3および親クローン#7.11.H1のH−CDR1,2,3をコードする新規プラスミド(命名:pMx9_Fab_MS−Roche#7.11.Hlx7.2.L1_FS)を作製した。
大規模な発現および精製後、それらの親和性は、Aβ(1−40)線維において測定した。さらに、選択したクロスークローンMS−R Fab/抗体のKD値を付随する表9に示す。
選択したMS−R IgG1抗体を、インビポでのアミロイド斑装飾に関してAPP/PS2二重トランスジェニックマウス(参照:Richardsら、Soc.neurosci.Abstr.,Vol.27,Program NO.5467,2001)において試験した。抗体(1mg/マウス)をi.v.投与し、3日後、脳を生理食塩水で濯流し、凍結切片を調製した。別の研究において、マウスを高濃度の抗体、すなわち、0、3、および6日目に2mgをi.v.注射し、9日目に屠殺した。アミロイド斑に結合した抗体の存在を、Cy3(#109−165−003、Jackson Immuno Research)続いてBAP−2−Alexa488免疫複合体のいずれかに連結したヤギ抗−ヒトIgG(H+L)を用いる二重標識間接免疫蛍光により未固定クリオスタット薄切において評価した。画像化を、共焦点レーザー顕微鏡により行い、共存の定量的検出のための画像処理をIMARISおよびCOLOCALIZATIONソフトウェア(Bitplane,Switzerland)により行った。典型的な例を図10〜14に示す。いくらかの可変性が認められるが、試験したMS−R抗体の全てがインビボでのアミロイド斑の免疫修飾において陽性であることがわかった。
APPは、中枢神経系において広範に発現される。細胞表面APPへの抗体の結合は、健康な脳領域における補体活性化および細胞破壊を導きうる。それゆえ、治療用A−β抗体がAPPに対する反応性を欠くことは必須である。A−β(例えば、BAP−1、BAP−2)のN末端に対する高親和性抗体は、APPのフレームワークにおける反応性エピトープをも認識する。対照的に、中央のエピトープ(例えば、4G8)に対する抗体、および本発明の抗体は、驚くことに細胞表面APPを認識することができない。従って、A−βを装飾するが、インビボでAPPを装飾しない本発明の抗体は、非選択性抗体よりも
優位である。
Claims (28)
- 第1の領域が配列番号:1に示されるアミノ酸配列AEFRHDSGYまたはその断片を含み、第2の領域が配列番号:2に示されるアミノ酸配列VHHQKLVFFAEDVGまたはその断片を含有してなるβ-A4ペプチド/Aβ4の2つの領域を特異的に認識することができる抗体分子。
- 前記抗体分子がβ-A4の2つの領域内の少なくとも2つの連続したアミノ酸を認識する請求項1記載の抗体分子。
- 前記抗体分子が、第1の領域においてAEFRHD、EF、EFR、FR、EFRHDSG、EFRHDまたはHDSGを含むアミノ酸を認識し、第2の領域においてHHQKL、LV、LVFFAE、VFFAEDまたはVFFA、FFAEDVを含むアミノ酸配列を認識する請求項1または2記載の抗体分子。
- 前記抗体分子が、配列番号:3、5もしくは7からなる群より選ばれる配列番号に示される核酸分子によりコードされる可変VH-領域または配列番号4、6もしくは8からなる群より選ばれる配列番号に示される可変VH-領域を含有してなる請求項1〜3いずれか記載の抗体分子。
- 前記抗体分子が、配列番号:9、11および13からなる群より選ばれる配列番号に示される核酸分子によりコードされる可変VL-領域または配列番号10、12および14からなる群より選ばれる配列番号に示される可変VL-領域を含有してなる請求項1〜3いずれか記載の抗体分子。
- 配列番号15、17もしくは19に示される核酸分子によりコードされるVL-領域の少なくとも1つのCDR3、または配列番号:16、18もしくは20に示されるVL-領域の少なくとも1つのCDR3アミノ酸配列を含有してなり、および/または配列番号:21、23または25に示される核酸分子によりコードされるVH-領域の少なくとも1つのCDR3または配列番号:22、24もしくは26に示されるVH-領域の少なくとも1つのCDR3アミノ酸配列を含有してなる請求項1〜5いずれか記載の抗体分子。
- 前記抗体が、MSR-3、-7および-8または親和性-成熟バージョンのMSR-3、-7もしくは-8からなる群より選ばれる請求項1〜6いずれか記載の抗体分子。
- 全長抗体(免疫グロブリン)、F(ab)-断片、F(ab)2-断片、単鎖抗体、キメラ抗体、CDR-グラフト抗体、二価抗体構築物、合成抗体またはクロスクローニング抗体である請求項1〜7いずれか記載の抗体分子。
- 前記β-A4の少なくとも2つの領域が立体配座エピトープまたは不連続エピトープを形成する請求項1〜8いずれか記載の抗体分子。
- クロスクローニング抗体が、
MS-R#3.3H1 x 3.4L9;
MS-R#3.6H5 x 3.6L2;
MS-R#3.6H8 x 3.6L2;
MS-R#7.4H2 x 7.2L1;
MS-R#7.9H2 x 7.12L2;
MS-R#7.9H4 x 7.12L2;
MS-R#7.11H1 x 7.11L1;
MS-R#7.11H1 x 7.2L1;
MS-R#3.3H1 x 3.4L1;
MS-R#3.4H1 x 3.4L9;
MS-R#3.4H3 x 3.4L7;
MS-R#3.4H3 x 3.4L9;
MS-R#3.4H7 x 3.4L9;
MS-R#3.4H7 x 3.4L7;
MS-R#3.6H5 x 3.6L1;
MS-R#7.2H2 x 7.2L1;
MS-R#7.4H2 x 7.12L2;
MS-R#7.9H2 x 7.2L1;
MS-R#7.9H2 x 7.12L1;
MS-R#7.11H2 x 7.2L1;
MS-R#7.11H2 x 7.9L1;
MS-R#7.11H2 x 7.12L1または
MS-R#8.1H1 x 8.2L1
からなる群より選ばれる請求項8または9記載の抗体分子。 - 請求項1〜10いずれか記載の抗体分子をコードする核酸分子。
- 請求項11記載の核酸分子を含有してなるベクター。
- 請求項12記載のベクターを含有してなる宿主細胞。
- 請求項1〜10いずれか記載の抗体分子の合成を許容する条件下で請求項13記載の宿主細胞を培養する工程および該培養から抗体分子を回収する工程を含む、請求項1〜10いずれか記載の抗体分子の調製方法。
- 請求項1〜10いずれか記載の抗体分子または請求項14記載の方法により製造された抗体分子を含有してなる組成物。
- 医薬組成物または診断用組成物である請求項15記載の組成物。
- アミロイド形成および/またはアミロイド斑形成に関連する疾患の予防および/または処置のための医薬組成物の調製のための、請求項1〜10いずれか記載の抗体分子もしくは請求項14記載の方法により製造された抗体分子、請求項11記載の核酸分子、請求項12記載のベクターまたは請求項13記載の宿主の使用。
- アミロイド形成および/またはアミロイド斑形成に関連する疾患の検出のための診断用組成物の調製のための、請求項1〜10いずれか記載の抗体分子または請求項14記載の方法により製造された抗体分子の使用。
- β-アミロイド斑の分解のための医薬組成物の調製のための、請求項1〜10いずれか記載の抗体分子または請求項14記載の方法により調製された抗体分子の使用。
- β-アミロイド斑形成に対する受動免疫のための医薬組成物の調製のための、請求項1〜10いずれか記載の抗体分子または請求項14記載の方法により製造された抗体分子の使用。
- 前記疾患が、痴呆、アルツハイマー病、運動性ニューロパシー、ダウン症候群、クロイツフェルトヤーコブ病、アミロイドーシスオランダ型を伴う遺伝性脳溢血、パーキンソン病、HIV-関連痴呆、ALSまたは加齢に関連する神経障害である請求項17または18記載の請求項の使用。
- 請求項1〜10いずれか記載の抗体分子、請求項16記載の核酸分子、請求項17記載のベクターまたは請求項18記載の宿主細胞を含有してなるキット。
- (a)配列番号:21、23もしくは25に示される核酸分子によりコードされるVH-領域の少なくとも1つのCDR3または配列番号:22、24もしくは26に示されるVH-領域の少なくとも1つのCDR3アミノ酸配列を含有する抗体に由来する多様化したFab抗体断片のライブラリーを構築する工程、
(b)得られたFab最適化ライブラリーをAβ/Aβ4に対するパニングにより試験する工程;
(c)最適化クローンを同定する工程;および
(d)選択した、最適化クローンを発現させる工程
を含む請求項1〜10いずれかに規定される抗体分子の最適化方法。 - 工程(ca)をさらに含み、それにより最適化クローンがカセット変異誘発によりさらに最適化される請求項23記載の方法。
- 前記工程(b)のAβ/Aβ4が凝集Aβ/Aβ4である請求項23または24記載の方法。
- 前記工程(c)の同定がKoffランク付けにより行われる請求項23〜25いずれか記載の方法。
- (a)請求項23〜26いずれか記載の方法による抗体の最適化の工程;および
(b)最適化された抗体/抗体分子と生理学的に許容されうるキャリアとを製剤化する工程
を含む医薬組成物の調製方法。 - 請求項27記載の方法により調製された医薬組成物。
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