PL216190B1 - Cząsteczka przeciwciała, cząsteczka kwasu nukleinowego ją kodująca, wektor zawierający tę cząsteczkę kwasu nukleinowego, komórka gospodarza zawierająca ten wektor, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała oraz kompozycje zawierające cząsteczkę przeciwciała oraz zestaw - Google Patents

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek przeciwciała zdolnych specyficznie rozpoznawać dwa regiony peptydu β-Α4, gdzie pierwszy region zawiera przedstawioną w SEQ ID NO:1 sekwencje aminokwasów AEFRHDSGY albo jej fragment, oraz gdzie drugi region zawiera pokazaną w SEQ ID NO: 2 sekwencję aminokwasów VHHQKLVFFAEDVG lub jej fragment. Ponadto są ujawnione cząsteczki kwasów nukleinowych kodujące cząsteczki przeciwciała będące przedmiotem wynalazku oraz wektory i komórki gospodarza zawierające te cząsteczki kwasów nukleinowych. Dodatkowo niniejszy wynalazek uwzględnia mieszanki; najlepiej farmaceutyczne lub diagnostyczne, zawierające związki będące przedmiotem wynalazku, jak również uwzględnia szczególne zastosowania cząsteczek przeciwciał, cząsteczek kwasów nukleinowych, wektorów lub komórek gospodarza będących przedmiotem wynalazku.

Kilka dokumentów jest przytaczanych w tekście tego opisu. Wszystkie przytaczane tu dokumenty (włączając specyfikacje produkcyjne, instrukcje itd.) są włączane tutaj poprzez odnośniki.

Około 70% wszystkich przypadków demencji to choroba Alzheimera, która jest związana z selektywnym uszkodzeniem obszarów mózgu i obwodów neuronalnych krytycznych dla świadomości. Dla choroby Alzheimera charakterystyczne są kłębki neurofibrylarne, przede wszystkim w neuronach piramidowych hippokampa i liczne płytki amyloidowe głównie zawierające gęsty rdzeń złogów amyloidu i rozlane otoczki.

Pozakomórkowe, uszkadzające nerwy płytki, zawierają duże ilości, przede wszystkim włókienkowatego peptydu, zwanego „β amyloid, „A-beta, „Αβ4, „β-Α4 lub „Αβ, patrz Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell Biol. 10, 373-403, Koo (1999), PNAS Vol. 96, pp. 9989-9990, US 4 666 829 Iub Glener (1984), BBRC 12, 1131. Ten β-amyloid pochodzi z „białka prekursorowego Alzheimera/białka prekursorowego β-amyloidu (APR). APP są integralnymi glikoproteinami błonowymi (patrz Sisodia (1992), PNAS Vol 89, pp. 6075) i są endoproteolitycznie cięte w obrębie sekwencji Αβ przez błonową proteazę osocza, α-sekretazę (patrz Sisodia (1992), w miejscu już cytowanym). Co więcej, dodatkowo, aktywność sekretazy, w szczególności β-sekretazy i γ-sekretazy prowadzi do poza-komórkowego uwalniania amyloidu β (Αβ) zawierającego 39 aminokwasów (Αβ39), 40 aminokwasów (Αβ40), 42 aminokwasy (Αβ42) lub 43 aminokwasy (Αβ43); patrz Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053; Price (1998), Science 282, 1078 do 1083; WO 00/72880 lub Hardy (1997), TINS 20, 154.

Należy zaznaczyć, że Αβ posiada kilka naturalnie pojawiających się form, które to pojawiające się u ludzi formy, to wspomniane powyżej Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 i Αβ43. Najważniejsza forma, Αβ42 ma następującą sekwencję aminokwasów (zaczynając od N-końca): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 27). W Αβ41, Αβ40, Αβ39 aminokwasy na końcu C, odpowiednio A, IA i VIA są utracone. W formie Αβ43, dodatkowo, do opisanej powyżej sekwencji (SEQ ID NO: 27) dołączona jest na C końcu treonina.

Wykazano, że czas potrzebny do wytworzenia jądra włókien Αβ40 jest znacząco dłuższy niż ten, potrzebny do wytworzenia jądra włókien Αβ42; patrz Koo, w miejscu już cytowanym, i Harper (1997), Ann. Rev. Biochem. 66, 385-407. Jak to przedstawiono w pracy przeglądowej Wagner (1999), J. Clin. Invest. 104, 1239-1332, Aβ42 jest częściej znajdowany w powiązaniu z uszkadzającymi nerwy płytkami i jest bardziej włóknikotwórczy in vitro. Wskazywano także, że Αβ42 służy jako „ziarno w zależnej od wytworzenia jądra polimeryzacji uporządkowanych niekrystalicznych peptydów Αβ; Jarret (1993), Cell 93, 1055-1058.

Konieczne jest podkreślenie, że zmodyfikowane przetwarzanie APP i powstawanie pozakomórkowych płytek zawierających złogi białkopodobne jest znane nie tylko z patologii choroby Alzheimera, ale także spotykane u osobników dotkniętych innymi neurologicznymi i/lub neurodegeneracyjnymi chorobami. Te choroby obejmują, między innymi, zespół Downa, dziedziczne krwotoki śródmózgowe w przebiegu amyloidozy typu holenderskiego, chorobę Parkinsona, ALS (stwardnienie zanikowe boczne, ang.: amyotrophic lateral sclerosis), chorobę Creutzfeld Jacob'a, związana z HIV demencję i neuropatię ruchową.

W celu zapobiegania, leczenia i/lub zmniejszenia objawów choroby związanych z patologicznymi złogami płytek amyloidu odkryte zostały środki i metody, które przeszkadzają także w tworzeniu się płytek β-amyloidu przez co są zdolne do zapobiegania agregacji Αβ i/lub są użyteczne w depolimeryzacji już powstałych złogów amyloidu lub agregatów β-amyloidu.

PL 216 190 B1

Ze względu na to, biorąc pod uwagę, poważne uszkodzenia powodowane przez zmieniona i/lub patologiczną biologię amyloidu, środki i metody do leczenia związanych z amyloidem chorób są wysoce pożądane. W szczególności są pożądane efektywne leki, które interferują z patologiczną agregacją amyloidu albo są zdolne do depolimeryzacji już zagregowanego Αβ. Co więcej, pożądane są środki diagnostyczne do wykrywania, między innymi, płytek amyloidu.

Tak wiec technicznym zadaniem niniejszego wynalazku jest dostosowanie się do opisanych powyżej potrzeb.

Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczki przeciwciała zdolnej do swoistego rozpoznawania dwóch regionów peptydu β-Α4/Αβ4, przy czym pierwszy region zawiera sekwencję aminokwasów AEFRHDSGY, przedstawioną w SEQ ID nr 1, lub jej fragment, a drugi region zawiera sekwencję aminokwasów VHHQKLVFFAEDVG, przedstawioną w SEQ ID nr 2, lub jej fragment przy czym ta cząsteczka przeciwciała zawiera:

(a) region zmienny zawierający regiony determinujące komplementarność L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3, przy czym (1) L-CDR1 zawiera SEQ ID nr 143;

(2) L-CDR2 zawiera SEQ ID nr 144; i (3) L-CDR3 zawiera SEQ ID nr 95; i (b) region zmienny VH, zawierający regiony determinujące komplementarność H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3, przy czym (1) H-CDR1 zawiera SEQ ID nr 146;

(2) H-CDR2 zawiera SEQ ID nr 192;

(3) H-CDR3 zawiera SEQ ID nr 93.

Korzystnie, cząsteczka przeciwciała rozpoznaje przynajmniej dwa kolejne aminokwasy w obrębie dwóch regionów β-Α4.

Korzystnie, cząsteczka przeciwciała rozpoznaje w pierwszym regionie sekwencję aminokwasów zawierającą: AEERHD, EE, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD lub HDSG, a w drugim regionie sekwencję aminokwasów zawierającą: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED lub VFFA, FFAEDV.

Korzystnie, cząsteczka przeciwciała zawiera region zmienny VH przedstawiony w SEQ ID nr 89 i region zmienny VL przedstawiony w SEQ ID nr 91.

Korzystnie, cząsteczka przeciwciała zawiera region zmienny VH kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID nr 88, region zmienny VL, kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID nr 90.

Korzystnie, cząsteczka przeciwciała jest pełnym przeciwciałem (immunoglobulina), fragmentem F(ab), fragmentem F(ab)2, pojedynczym łańcuchem przeciwciała, przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem z przeszczepianym CDR, konstrukcja przeciwciała biwalentnego, przeciwciałem syntetycznym lub przeciwciałem klonowanym krzyżowo.

Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała co najmniej dwa regiony β-Α4 tworzą epitop konformacyjny lub epitop nieliniowy.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca cząsteczkę przeciwciała jak określono powyżej.

Wynalazek dotyczy także wektora zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono powyżej.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza zawierająca wektor jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała jak określono powyżej, który obejmuje hodowanie komórki gospodarza jak określono powyżej w warunkach, które umożliwiają syntezę tej cząsteczki przeciwciała i odzyskiwanie tej cząsteczki przeciwciała z tej hodowli.

Wynalazek dotyczy także kompozycji zawierającej cząsteczkę przeciwciała jak określono powyżej.

Korzystnie, kompozycja jest kompozycją farmaceutyczną lub diagnostyczną.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę przeciwciała jak określono powyżej, cząsteczką kwasu nukleinowego jak określono powyżej, wektor jak określono powyżej lub gospodarz jak określono powyżej do stosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby związanej z amyloidogenezą i/lub formowaniem płytek amyloidowych.

PL 216 190 B1

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji diagnostycznej zawierającej cząsteczkę przeciwciała jak określono powyżej do stosowania w wykrywaniu choroby związanej z amyloidogenezą i/lub formowaniem płytek amyloidowych.

Korzystnie, chorobą jest otępienie, choroba Alzheimera, neuropatia ruchowa, zespół Downa, choroba Creutzfelda-Jacoba, dziedziczne krwotoki śródmózgowe w przebiegu amyloidozy typu holenderskiego, choroba Parkinsona, otępienie związane z HIV, ALS lub zaburzenia neuronalne związane ze starzeniem się.

Przedmiotem wynalazku ponadto jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę przeciwciała jak określono powyżej do stosowania do dezintegracji płytek amyloidowych.

Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej cząsteczką przeciwciała jak określono powyżej do stosowania do immunizacji biernej przeciwko powstawaniu płytek β-amyloidowych.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw zawierający cząsteczkę przeciwciała jak określono powyżej, cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono powyżej, wektor jak powyżej lub komórkę gospodarza jak określono powyżej, który ponadto zawiera bufor lub roztwór do przechowywania.

W kontekście niniejszego wynalazku, termin „cząsteczka przeciwciała odnosi się do całej cząsteczki immunoglobuliny, lepiej IgM-γ, IgD-γ, IgE-γ, IgA-γ lub IgG-γ, jeszcze lepiej IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 lub IgG4 jak również do części cząsteczki immunoglobuliny takiej jak fragmenty Fab lub regiony VL, VH lub CDR. Poza tym, ten termin odnosi się do zmodyfikowanych i/lub zmienionych cząsteczek przeciwciała takich jak przeciwciała chimerowe i humanizowane. Termin ten dotyczy także zmodyfikowanych lub zmienionych monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał oraz równie dobrze przeciwciał otrzymanych/syntetyzowanych przez rekombinacje lub syntetycznie. Termin ten dotyczy także niezmienionych przeciwciał a także ich fragmentów/części takich jak rozdzielone lekkie i ciężkie łańcuchy, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. Termin „cząsteczka przeciwciała także obejmuje pochodne przeciwciała, przeciwciała bifunkcyjne i konstrukcje przeciwciała takie jak pojedynczy łańcuch Fvs (scFv), bispecyficzny scFvs lub przeciwciała będące białkami fuzyjnymi. Dalsze szczegóły dotyczące terminu będącej przedmiotem niniejszego wynalazku „cząsteczki przeciwciała są dostarczone tutaj poniżej.

Termin „specyficznie rozpoznające zgodnie z niniejszym wynalazkiem oznacza, że cząsteczka przeciwciała jest zdolna do specyficznego oddziaływania z i/lub wiązania do przynajmniej dwóch aminokwasów każdego z dwóch regionów β-Α4 tak jak to tutaj zdefiniowano. Ten termin dotyczy specyficzności cząsteczki przeciwciała, tzn. jego zdolności do odróżniania między specyficznymi regionami peptydu β-Α4 jak to zdefiniowano tutaj i innym, nie mającym związku regionem peptydu β-Α4 lub innymi, nie mającymi związku z APP białkami/peptydami/nie mającymi związku białkami testowymi. Odpowiednio, specyficzność może być oznaczona eksperymentalnie metodami znanymi w tej dziedzinie oraz metodami ujawnionymi i opisanymi tutaj. Takie metody obejmują, ale nie są ograniczone do Western blot, testów ELISA, RIA, ECL, IRMA i skanów peptydów. Takie metody także obejmują oznaczanie wartości KD jak to między innymi zilustrowano na załączonych przykładach. Skan peptydu (pepspot assay) jest rutynowo stosowany do mapowania liniowych epitopów w polipeptydowym antygenie. Pierwszorzędowa sekwencja polipeptydu jest syntetyzowana sukcesywnie na aktywowanej celulozie z zachodzącymi jeden na drugi peptydami. Rozpoznawanie określonych peptydów przez przeciwciało, które ma być testowane ze względu na jego zdolność do wykrywania lub rozpoznawania specyficznego antygenu/epitopu, jest oceniane przez rutynową barwną procedurę (drugorzędowe przeciwciało z peroksydazą chrzanową oraz 4-chloronaftolem i nadtlenkiem wodoru), przez reakcję chemiluminescencji lub podobnymi środkami znanymi w tej dziedzinie. W przypadku, między innymi, reakcji chemiluminescencji, wynik reakcji może być oceniony ilościowo. Jeżeli przeciwciała reagują z określonym zestawem nakładających się peptydów można dedukować minimum sekwencji aminokwasów niezbędnych do reakcji; patrz ilustrujący to Przykład 6 i załączona Tabela 2.

To samo badanie może ujawnić dwa odległe skupiska reaktywnych peptydów, co wskazuje rozpoznawanie nieliniowego, tzn. konformacyjnego epitopu w antygenie polipeptydu (Geysen (1986),

Mol. Immunol. 23, 709-715).

Oprócz badania pepspot, może być przeprowadzone standardowe badanie ELISA. Jak to przedstawiono w załączonych przykładach, małe sześciopeptydy mogą być przyłączone do białka,

PL 216 190 B1 naniesione na immunopłytkę i poddawane reakcji z testowanymi przeciwciałami. Wynik reakcji można ocenić przez uwidocznienie barwy w standardowej procedurze (np.: drugorzędowe przeciwciała z peroksydazą chrzanową i tetrametylobenzydyną z nadtlenkiem wodoru). W odpowiednich studzienkach wynik reakcji jest oceniany przez pomiar gęstości optycznej, na przykład przy 450 nm. Typowo tło (=reakcja negatywna) może wynosić 0,1 OD, dla próby gdzie zaszła reakcja (pozytywna reakcja) może wynosić 1 OD. To oznacza, że różnica (stosunek) wartości otrzymywanych dla reakcji pozytywnej/negatywnej może być większy niż 10-cio krotny. Dalsze szczegóły są podane w załączonych przykładach. Dodatkowo poniżej podano ilościowe metody oznaczania specyficzności i zdolności do „specyficznego rozpoznawania zdefiniowanych tutaj dwóch regionów peptydu β-Α4.

Termin „dwa regiony peptydu β-Α4” dotyczy dwóch regionów zdefiniowanych przez ich sekwencje aminokwasów pokazane w SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 dotyczące aminokwasów 2 do 10 N końca i aminokwasów 12 do 25 centralnej części peptydu β-Α4. Termin „peptyd β-Α4” w kontekście niniejszego wynalazku dotyczy opisanych tutaj powyżej Αβ39, Αβ41, Αβ43, lepiej Αβ40 i Αβ42, Αβ42 jest przedstawiony także w załączonym SEQ ID NQ: 27. Istotne jest, że termin „dwa regiony peptydu β-Α4 także dotyczy „epitopu” i/lub „determinanty antygenowej”, która zawiera zdefiniowane tutaj dwa regiony peptydu β-Α4 lub jego części. Te dwa regiony peptydu β-Α4 są rozdzielone (na poziomie sekwencji aminokwasów) w pierwszorzędowej strukturze peptydu β-Α4 przez przynajmniej jeden aminokwas, lepiej przez przynajmniej dwa aminokwasy, jeszcze lepiej przez przynajmniej trzy aminokwasy, jeszcze lepiej przez przynajmniej cztery aminokwasy, jeszcze lepiej przez przynajmniej pięć aminokwasów, jeszcze lepiej przez przynajmniej sześć aminokwasów, jeszcze lepiej przez przynajmniej dziewięć aminokwasów, a najlepiej przez przynajmniej dwanaście aminokwasów. Jak pokazano tutaj i jak zostało to udokumentowane w załączonych przykładach będące przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczki przeciwciał/przeciwciała wykrywają/wchodzą w interakcje i/lub wiążą się do dwóch regionów peptydu β-Α4 tak jak to tutaj zdefiniowano, w którym te dwa regiony są rozdzielone (na poziomie pierwszorzędowej struktury sekwencji aminokwasów) przez przynajmniej jeden aminokwas i w którym sekwencja rozdzialająca te dwa regiony/epitop może zawierać więcej niż 10 aminokwasów, lepiej 14 aminokwasów, jeszcze lepiej 15 aminokwasów lub 16 aminokwasów. Na przykład MSR-3 Fab (cząsteczka przeciwciała będąca przedmiotem wynalazku) rozpoznaje; wykrywa/wchodzi w interakcje z dwoma regionami peptydu β-Α4, w którym ten pierwszy region zawiera aminokwasy 3 i 4 (EF) a ten drugi region zawiera aminokwasy 18 do 23 (VFFAED). Odpowiednio, sekwencja rozdzielająca między regionami/epitopami, które mają być wykryte/rozpoznane ma długość 13 aminokwasów sekwencji aminokwasów w pierwszorzędowej strukturze. Podobnie MSR #3.4H7 IgG1, pochodząca z MSR-3 zoptymalizowana i dojrzała cząsteczka przeciwciała, wchodząca w skład zrębu IgG1, wykrywa/wchodzi w reakcje z/wiąże się do dwóch epitopów/regionów β-Α4, które zawierają, w pierwszym regionie pozycje 1-4 (DAEF) i w drugim regionie pozycje 19-24 (FFAEDV) β-Α4, jak to tutaj zdefiniowano. Zgodnie z tym, MSR#3.47 IgG1 rozpoznaje/wykrywa/wchodzi w interakcje z dwoma epitopami/regionami, które na poziomie pierwszorzędowej struktury w sekwencji aminokwasów są rozdzielone przez 14 aminokwasów. Jak szczegółowo podano w załączonych przykładach, dojrzewanie powinowactwa i konwersja, będących przedmiotem wynalazku monowalentnych fragmentów Fab, do pełnej długości przeciwciał IgG1, może prowadzić do pewnego poszerzenia wykrywania epitopów/regionów w pepspot, testach ELISA i tym podobnych. Tak więc będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała, są zdolne do równoczesnego i niezależnego rozpoznawania dwóch regionów peptydu β-Α4/Αβ4 gdzie regiony te składają się z sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID NO: 1 (lub jej części) i sekwencji aminokwasów przedstawionej w SEQ ID NO: 2 (lub jej (ich) części). W związku z potencjalnym poszerzeniem epitopów, jak tutaj jest to przedstawione w szczegółach, przyjmuje się także, że aminokwasy w bezpośredniej bliskości do sekwencji SEQ ID NO: 1 i 2 są wykryte/rozpozne, tzn., że dodatkowe aminokwasy są częścią tych dwóch regionów, które mają być wykryte/rozpoznane. Odpowiednio przyjmuje się także, że np.: pierwszy aminokwas Αβ (1-42), jak zdefiniowano tutaj, mianowicie D (kwas asparaginianowy), jest wykryty/rozpoznany w części jednego epitopu albo, że są wykryte/rozpoznane aminokwasy umiejscowione po regionie Αβ (1-42) jak zdefiniowano w SEQ ID NO: 2. Tym dodatkowym aminokwasem może np. być aminokwas w pozycji 26 SEQ ID NO: 27 (βΑ4/Αβ (1-42)), a mianowicie S (seryna).

PL 216 190 B1

Ten termin dotyczy także epitopu konformacyjnego, epitopu strukturalnego lub epitopu nieliniowego składającego się z tych dwóch regionów; lub ich części; patrz Geysen (1986), w miejscu już cytowanym. W kontekście tego wynalazku, epitop konformacyjny jest zdefiniowany przez dwie lub więcej dyskretne sekwencje aminokwasów, rozdzielone w pierwszorzędowej sekwencji, które pojawiają się razem na powierzchni, kiedy polipeptyd fałduje się w natywne białko (Sela, (1969) Science 166, 1365 i Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Będące przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczki przeciwciała są przewidziane do specyficznego wiązania/wchodzenia w interakcje z epitopem(ami) konformacyjnym/strukturalnym złożonym i/lub zawierającym dwa regiony opisanego tutaj β-Α4 lub jego części jak to tutaj poniżej ujawniono. „Cząsteczki przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku zostały pomyślane tak, żeby zawierały jednoczesną i niezależną podwójną specyficzność do (a) obszaru aminokwasów zawierającego aminokwasy 2 do 10 β-Α4 (lub jego część(ci)) i (b) obszaru aminokwasów zawierającego aminokwasy 12 do 25 β-Α4 (SEQ ID NO. 27) (lub jego część(ci)). Fragmenty lub części tych obszarów zawierają przynajmniej dwa, jeszcze lepiej przynajmniej trzy aminokwasy. Preferowanymi fragmentami lub częściami w pierwszym regionie/obszarze sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 27 są: AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD lub HDSG, i w drugim regionie/obszarze sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 27 są: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED VFFA lub FFAEDV. Jak wspomniano powyżej, te fragmenty mogą także zawierać dodatkowe aminokwasy lub mogą być częściami zdefiniowanych tutaj fragmentów. Specyficznymi przykładami są DAE, DAFF, FRH lub RHDSG.

Opisano kilka przeciwciał specyficznie rozpoznających peptydy Αβ. Przeciwciała były otrzymane głównie poprzez immunizowanie zwierząt Αβ1-40 lub Αβ1-42 lub ich fragmentami przy użyciu standardowych technologii. Stosownie do opublikowanych danych, monoklonalne przeciwciała, które wytwarzano poprzez immunizację kompletnym peptydem Αβ (1-40 lub 1-42) rozpoznawały wyłącznie epitop na N-końcu Αβ. Poza tym, są przykłady przeciwciał BAP-1 i ΒΑΡ-2 (Brockhaus, niepublikowane dane), wytwarzanych przez myszy immunizowanie Αβ1-40, które rozpoznawały aminokwasy 4-6 w kontekście większych Aβ peptydów; patrz załączony Przykład 7, Tabela 2 i Przykład 12, Tabela 7. Przeciwciała, które rozpoznają środkową część Αβ pochodzą z immunizacji mniejszymi peptydami. Na przykład przeciwciało 4G8 było wytworzone przez immunizowanie peptydem Αβ 1-24 i rozpoznaje wyłącznie sekwencję 17-24 (Kim, (1988) Neuroscience Research Communications 2, 121-130). Wiele innych monoklonalnych przeciwciał zostało wytworzonych poprzez immunizowanie myszy fragmentami pochodzącymi z Αβ i przeciwciała rozpoznające koniec C Αβ1-40 i Αβ1-42 są szeroko stosowane do rozróżniania i ilościowego oznaczania peptydów odpowiadających Αβ w płynach biologicznych i tkankach przy użyciu metod ELISA, Western blot i analizy immunohistochemicznej (Ida i wsp., (1996) J. Biol. Chem. 271, 22908-22914; Johnson-Wood i wsp., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 1550-1555; Suzuki i wsp., (1994), Science 264, 1336-1340; Brockhaus (1998), Neuro Rep. 9, 1481-1486). BAP-17 jest mysim monoklonalnym przeciwciałem , które zostało wytworzone przez immunizację myszy fragmentem Αβ35-40. Rozpoznaje ono specyficznie koniec C Αβ1-40 (Brockhaus (1998) Neuroreport 9, 1481-1486).

Uważa się, że immunizowanie antygenami zależnym od komórek T (często są to słabe immunogeny) wymaga proteolitycznego cięcia antygenu w endosomach komórek zawierających antygen. Po immunizacji, selekcja in vivo przeciwciał o wysokim powinowactwie jest przeprowadzana przez zetknięcie pomocniczych komórek T z komórkami zawierającymi antygen. Komórki zawierające antygen zawierają tylko krótkie peptydy a nie duże polipeptydy. Odpowiednio, komórki te mają skomplikowany (ale dobrze znany) mechanizm, poprzez który w endosomach zachodzi endocytoza antygenu (antygenów), degradacja antygenu (antygenów), łączenie wybranych peptydów z odpowiednimi cząsteczkami MHC klasy II i wyeksportowanie kompleksu peptyd-MHC na powierzchnie komórki. To właśnie tutaj zachodzi specyficzne rozpoznawanie antygenu przez komórki T, mające na celu zapewnienie pomocy dojrzewaniu komórek B. Komórki B, które otrzymają największą pomoc komórek T mają najlepszą szansę, żeby rozwinąć się w komórki, w których zachodzi sekrecja przeciwciała i proliferacja. To pokazuje, że przetwarzanie antygenu przez proteolizę jest ważnym etapem wytwarzania in vivo odpowiedzi przeciwciał o wysokiej specyficzności i może tłumaczyć dominację epitopu Αβ z N końcem w stosunku do uprzednio w tej dziedzinie otrzymywanych drogą immunizacji monoklonalnych i poliklonalnych przeciwciał.

PL 216 190 B1

W przeciwieństwie do tego, selekcja będących przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczek przeciwciała/przeciwciał jest otrzymywana przez fizyczną adherencję fagów, w których zachodzi ekspresja Fab, do antygenu. W tym procesie selekcji in vivo nie ma degradacji antygenu. Fagi, w których zachodzi ekspresja Fab o największym powinowactwie do antygenu, są selekcjonowane i reprodukowane. Syntetyczna biblioteka, zastosowana w załączonych przykładach, żeby wybrać specyficzne cząsteczki przeciwciał zgodnie z tym wynalazkiem, jest szczególnie odpowiednia, żeby uniknąć jakichkolwiek odchyleń pojedynczych epitopów liniowych, co często spotyka się w bibliotekach pochodzących z immunizowanych komórek B.

Należy wziąć pod uwagę, że w tej dziedzinie dotychczas nie opisano cząsteczek przeciwciał rozpoznających dwa niezależne regiony Αβ4, które specyficznie rozpoznają nieliniowy/strukturalny/konformacyjny epitop(y) i/lub, które są zdolne do jednoczesnego i niezależnego rozpoznawania dwóch regionów/epitopów Αβ4.

Szczepienie Αβ1-42 transgenicznych myszy, u których zachodzi nadmierna ekspresja zmutowanego ludzkiego APP V717F (myszy PDAPP), prowadzi do prawie całkowitego zapobiegania odkładaniu się amyloidu w mózgu, jeżeli leczenie rozpoczęto u młodych zwierząt, tzn. przed wystąpieniem neuropatologii, podczas gdy u starszych zwierząt obserwowano redukcję już powstałych płytek, co sugeruje oczyszczanie z płytek przy udziale przeciwciał (Schenk i wsp., (1999), Nature 400, 173-177). Przeciwciała wytwarzane w tej procedurze immunizacji były reaktywne przeciw końcowi N Αβ4 pokrywając epitop dookoła aminokwasów 3-7 (Schenk i wsp., (1999), w miejscu już cytowanym; WO 00/72880). Aktywna immunizacja przy pomocy Αβ1-42 zmniejsza także zaburzenia behawioralne i utratę pamięci w różnych transgenicznych modelach choroby Alzheimera (Janus i wsp., (2000) Nature 408, 979-982; Morgan i wsp., (2000) Nature 408, 982985). Następne badania u APP transgenicznych myszy (PDAPP) z podawaniem przeciwciał obwodowo, tzn. z pasywną immunizacją, potwierdziły, że przeciwciała mogą przedostawać się do ośrodkowego układu nerwowego, tam dekorują płytki i indukują oczyszczanie z poprzednio utworzonych płytek amyloidowych (Bard i wsp., (2000) Nat. Med. 6, 916-919; WO 00/72880). W tych badaniach, monoklonalne przeciwciała z największą in vivo i ex vivo skutecznością (wyzwalającą fagocytozę w egzogennych komórkach mikrogleju) były tymi, które rozpoznawały epitopy 1-5 (mab 3D6, IgG2b) lub 3-6 (mab 10D5, IgG1) N-końca Αβ4. Podobnie, poliklonalne przeciwciała izolowane z myszy, królików lub małp po immunizacji Άβ1-42, wykazują podobną specyficzność epitopu N-końca i także były skuteczne w wyzwalaniu fagocytozy i oczyszczaniu z płytek in vivo. W przeciwieństwie do tego, specyficzne przeciwciała C-końca włażące z wysokim powinowactwem do Αβ1-40 lub Αβ1-42 nie indukowały fagocytozy w badaniu ex vivo i były nieskuteczne in vivo (WO 00/72880). Przeciwciało monoklonalne m266 (WO 00/72880) było hodowane przeciw Αβ13-28 (centralna domena Αβ) a mapowanie epitopu potwierdziło specyficzność przeciwciała w pokrywaniu aminokwasów 16-24 w sekwencji Αβ. To przeciwciało nie wiąże się dobrze do zagregowanego Αβ i złogów amyloidu a reaguje tylko z rozpuszczalnym (monomerycznym) Αβ, tzn. ma właściwości podobne do innych dobrze znanych i komercyjnie dostępnych monoklonalnych przeciwciał (4G8; Kim, (1988) Neuroscience Research Communications 2, 121-130; komercyjnie dostępne z Signet Laboratories Inc. Dedham, MA USA), które rozpoznają ten sam epitop.

Ostatnio stwierdzono in vivo, że podanie obwodowo przeciwciała m266 myszom PDAPP znaczaco redukuje odkładanie się Αβ (DeMattos, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8850-8855). Jednak w przeciwieństwie do przeciwciał specyficznych względem N-końca, m266 nie dekoruje płytek amyloidowych in vivo i dlatego stawiana jest hipoteza, że obciążenie mózgu Αβ jest zmniejszane przez indukowane przeciwciałami przesunięcie równowagi między Αβ w osoczu i w o.u.n., powodujące akumulowanie pochodzącego z mózgu Αβ zkompleksowanego przez m266 na obwodzie (DeMattos, (2001), w miejscu już cytowanym).

Cząsteczki przeciwciał/przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku, przez jednoczesne (na przykład w strukturalnym/konformacyjnym epitopie tworzonym przez N-koniec i centralny region Αβ tak jak to opisano tutaj) i niezależne (na przykład w badaniu pepspot jak to udokumentowano w załączonej części eksperymentalnej) wiązanie do epitopów N-końca i centralnych, łączą w jednej cząsteczce właściwości przeciwciał specyficznych względem N-końca i przeciwciał

PL 216 190 B1 specyficznych względem centralnego epitopu. Przeciwciała z podwójną specyficznością epitopu, tak jak to opisano w niniejszym wynalazku, uważa się za bardziej skuteczne in vivo, w szczególności w medycznych i diagnostycznych zastosowaniach np.: redukcji zaburzeń powodowanych przez płytki amyloidowe lub amyloidogenezę albo w wykrywaniu złogów i płytek amyloidu. Dobrze wiadomo, że w procesie agregacji Αβ i powstawania złogów amyloidu pojawiają się zmiany konformacyjne i podczas gdy centralny epitop jest łatwo dostępny w rozpuszczalnej formie Αβ4, okazuje sie, że w zagregowanej i fibrylarnej formie jest schowany i mniej reaktywny. Fakt, że przeciwciało m266 specyficzne w stosunku do centralnego/środkowego epitopu jest skuteczne in vivo wskazuje, że neutralizacja rozpuszczalnego Αβ4 także może być krytycznym parametrem. Będące przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczki przeciwciał/przeciwciała, dzięki podwójnej specyficzności epitopu, mogą wiązać się zarówno do fibrylarnej jak i rozpuszczalnej formy Αβ4 z podobną skutecznością, co pozwala na oddziaływanie na płytki amyloidowe a także na neutralizację rozpuszczalnej formy Αβ4. Termin „jednoczesne i niezależne wiązanie do epitopów N-końca i centralnych/środkowych Αβ4 jak używane tutaj, w kontekście będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciała, dotyczy tego, że cząsteczki przeciwciał/przeciwciała opisane tutaj mogą wykrywać i/lub wiązać się do obu epitopów jednocześnie, tzn. w tym samym czasie (na przykład na konformacyjnych/strukturalnych epitopach tworzonych przez epitop N-końca (lub jego część (części)) i centralne epitopy (lub ich część (części)) Αβ4 jak zdefiniowano tutaj) i że te same cząsteczki przeciwciała są jednakże zdolne także do wykrywania/wiązania się do każdego ze zdefiniowanych epitopów w niezależny sposób, jak to między innymi przedstawiono poprzez wyniki analizy pepspot pokazane w przykładach.

In vivo, u myszy PDAPP, po bezpośrednim podaniu przeciwciał do mózgu, oczyszczenie z płytek amyloidowych nie jest zależne od podtypu IgG i może być w to włączony mechanizm, w którym nie pośredniczy Fc, tzn., bez zaangażowania w usuwanie płytek aktywowanego mikrogleju (Backskai, (2001), Abstract Society for Neuroscience 31^st Annual Meeting, November 10-15, 2001, San Diego). Ta obserwacja jest w sprzeczności do tego, co było postulowane we wcześniejszych pracach Bard (2000), w miejscu już cytowanym.

W innych badaniach stwierdzono, że przeciwciała hodowane przeciw peptydom Αβ1-28 i Αβ1-16 były efektywne w odwracaniu agregacji in vitro, podczas gdy przeciwciała specyficzne w stosunku do Αβ13-28 wykazywały w tym badaniu znacznie mniejszą aktywność (Salomon, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4109-4112). Opisywano również zapobieganie agregacji Αβ przez przeciwciała anty Αβ1-28 (AMY-33) (Salomon, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 452-455). W tych samych badaniach stwierdzono, że przeciwciało 6F/3D, które zostało wyhodowane przeciw fragmentowi Αβ 8-17 nieznacznie interferuje z indukowaną Zn²⁺ agregacja Αβ ale nie ma wpływu na samoagregację indukowaną przez inne indukujące agregację czynniki.

W tych badaniach in vitro, skuteczność różnych przeciwciał koreluje z dostępnością ich epitopów w agregatach Αβ4. N-koniec jest wyeksponowany a przeciwciała specyficzne dla N końca wyraźnie indukują depolimeryzację. Centralny region i C-koniec są ukryte i nie są łatwo dostępne, tak więc przeciwciała przeciw tym epitopom są znacznie mniej efektywne.

Badania dotyczące dostępności epitopów dla przeciwciał wykazały, że w agregatach Αβ epitop N-końca jest wyeksponowany i reaguje z przeciwciałem BAP-1, podczas gdy środkowy lub centralny epitop pozostaje ukryty, tzn. nie obserwowano jego wiązania do przeciwciał 4G8. Jednak w monomerycznym Αβ oba epitopy są jawne i w równym stopniu rozpoznawane przez oba wcześniej znane w tej dziedzinie przeciwciała.

W przeciwieństwie do tego, w niniejszym wynalazku z zaskoczeniem stwierdzono, że opisane tu cząsteczki przeciwciał rozpoznają dwie nieliniowe sekwencje aminokwasów, tzn. konformacyjny/strukturalny epitop w peptydzie Αβ. Dwie „nieliniowe sekwencje aminokwasowe” zgodnie z tym wynalazkiem oznacza, że te dwie sekwencje aminokwasów tworzące odpowiednio epitopy N-końca centralny/środkowy są rozdzielone w pierwszorzędowej strukturze β-Α4 przez przynajmniej dwa aminokwasy, które nie są częścią żadnego z epitopów.

Obszar wiążący przeciwciała Fab (=paratop) zajmuje powierzchnię cząsteczki o wymiarach w przybliżeniu 30x30 A (Laver, Cell 61 (1990), 553-556). Jest ona wystarczająca do kontaktu 15 do 22 reszt aminokwasów, które mogą być obecne na kilku pętlach na powierzchni. Nieliniowe epitopy rozpoznawane przez cząsteczki przeciwciała będące przedmiotem wynalazku, przypominają konformację, w której sekwencje N-końca (reszty aminokwasów 2 do 10 lub ich część) i części środkowej (reszty aminokwasów 12 do 25 lub ich część) są w bezpośredniej bliskości. Tylko w obrębie tej konformacji

PL 216 190 B1 otrzymywana jest maksymalna liczba kontaktów antygen-przeciwciało przy najniższym stanie energii swobodnej.

W oparciu o kalkulacje energetyczne, sugerowano, że mniejszy podzespół 5-6 reszt aminokwasów, które nie są uporządkowane w liniową strukturę ale rozproszone na powierzchni epitopu ma największy udział w energii wiązania podczas gdy otaczające reszty tworzą jedynie uzupełniający szyk (Laver (1990), w miejscu już cytowanym).

Cząsteczki przeciwciał/przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku, są zdolne do wiązania do zagregowanego Αβ i silnie reagują z płytkami amyloidowymi w mózgu pacjentów z AD (jak to udokumentowano w załączonych przykładach). Poza tym są zdolne do depolimeryzacji/dezintegracji amyloidowych agregatów.

Nie będąc związanym przez teorię, uważa się, że epitop konformacyjny/strukturalny (utworzony przez dwa regiony Αβ4 lub część (części) tych regionów jak to opisano tutaj) jest częściowo eksponowany w zagregowanym Αβ. Jednak wiadomo, że główna część środkowego/drugiego epitopu/regionu sama nie jest łatwo dostępna w tych agregatach Αβ (oparte na słabej reaktywności przeciwciał 4G8 i m266 specyficznych w stosunku do środkowego epitopu). Z drugiej strony, z punktu widzenia rozważań wspomnianych powyżej, jest prawdopodobne, że jedna lub kilka reszt aminokwasów środkowego regionu, które są składnikami konformacyjnego epitopu i w związku z resztami aminokwasów z regionu N-końca, są dostępne dla będących przedmiotem niniejszego wynalazku przeciwciał, przez to mają znaczący udział w energii wiązania w interakcji przeciwciało-Ae4. Reaktywność będących przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczek przeciwciała z konformacyjnym epitopem w zagregowanym Αβ jest więc unikalna i wyraźnie różna od reaktywności przeciwciał α-Αβ4 poprzednio opisanych w tej dziedzinie. Jak już zaznaczono tutaj powyżej, dalszą unikalną cechą będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał/przeciwciała jest ich zdolność do jednoczesnego i niezależnego wiązania do/rozpoznawania dwóch oddzielnych epitopów na β-Α4, jak to zdefiniowano tutaj i w załączonych przykładach.

W preferowanej postaci wynalazku, cząsteczka przeciwciała będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, jest cząsteczką przeciwciała, w której przynajmniej dwa regiony β-Α4 specyficznie rozpoznawane przez to przeciwciało tworzą konformacyjny/strukturalny epitop lub nieliniowy epitop; patrz Geysen (1986), w miejscu już cytowanym; Ghoshal (2001), J. Neurochem. 77, 1372-1385; Hochleitner (2000), J. Imm. 164, 4156-4161; Laver (1990), w miejscu już cytowanym). Termin „nieliniowy epitop w kontekście niniejszego wynalazku oznacza nieliniowe epitopy, które są złożone z reszt aminokwasów z odległych części polipeptydowego łańcucha. Te reszty aminokwasowe schodzą się razem na powierzchni, gdy łańcuch polipeptydu fałduje się w trójwymiarową strukturę, by stworzyć konformacyjny/strukturalny epitop. Niniejszy wynalazek dostarcza preferowanych, zaskakujących epitopów w obrębie β-Α4, co prowadzi do wytwarzania będących przedmiotem wynalazku, specyficznych cząsteczek przeciwciał zdolnych wchodzić w specyficzne interakcje z tymi epitopami. Te cząsteczki przeciwciał/przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku, dostarczają podstawy do zwiększenia skuteczności i zmniejszenia możliwych działań ubocznych. Jak zaznaczono powyżej, przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku były także zdolne do wchodzenia w niezależne interakcje z każdym z dwóch zdefiniowanych regionów/epitopów β-Α4, na przykład w badaniach Pepspot jak to udokumentowano w załączonych przykładach.

Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza unikalnych narzędzi, które mogą być użyte do depolimeryzacji zagregowanych włókien Αβ in vivo i in vitro i/lub które są zdolne do stabilizowania i/lub neutralizowania konformacyjnego epitopu monomerycznego Αβ i przez to są zdolne do zapobiegania patologicznej agregacji Αβ.

W dalszej kolejności przyjmuje się, że przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku, wiążą się do złogów Αβ na otoczkach płytek amyloidu, między innymi, w mózgu dotkniętym chorobą Alzheimera i skutecznie rozpuszczają patologiczne protowłókna i włókna.

W preferowanej postaci, cząsteczka przeciwciała będąca przedmiotem niniejszego wynalazku rozpoznaje przynajmniej dwa kolejne aminokwasy w obrębie zdefiniowanych tutaj dwóch regionów Αβ4, lepiej jeżeli ta cząsteczka przeciwciała rozpoznaje w pierwszym regionie sekwencję aminokwasów zawierającą aminokwasy: AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD lub HDSG i w drugim regionie sekwencję aminokwasów zawierających aminokwasy: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED, VFFA lub FFAEDV. Następne fragmenty lub rozszerzone części zawierają: DAE, DAEF, FRH lub RHDSG.

PL 216 190 B1

Jest szczególnie wskazane, ażeby cząsteczka przeciwciała zawierała zmienny region VH, jak ten kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak to pokazano w SEQ ID NO: 3, 5 lub 7, lub zmienny region VH jak to pokazano w sekwencji aminokwasów opisanej w SEQ ID NO: 4, 6 lub 8. Sekwencje pokazane w SEQ ID NO: 3 i 4 opisują odpowiednio region kodujący i sekwencję aminokwasów regionu VH rodzicielskiego przeciwciała MSR-3 (MS-Roche 3), sekwencje w SEQ ID NO: 5 i 6 opisują odpowiednio region kodujący i sekwencję aminokwasów regionu VH rodzicielskiego przeciwciała MSR-7 (MS-Roche 7) i SEQ ID NO: 7 i 8 opisują odpowiednio region kodujący i sekwencję aminokwasów regionu VH rodzicielskiego przeciwciała MSR-8 (MS-Roche 8). Jak to zilustrowano w załączonych przykładach rodzicielskie przeciwciała MSR-3, -7 i -8 są stosowane do przyszłego wytwarzania optymalizowanych cząsteczek przeciwciał z nawet lepszymi własnościami i/lub powinowactwem wiązania. Pewne odpowiadające i możliwe strategie są zilustrowane i pokazane na załączonych przykładach.

Strategia optymalizacji, jak to przedstawiono na załączonych przykładach prowadzi do mnogości optymalizowanych przeciwciał. Te zoptymalizowane przeciwciała wraz z ich rodzicielskimi przeciwciałami dzielą domenę CDR-3 regionu VH. Podczas gdy oryginalny zrąb regionu pozostaje ten sam (jak pokazano w załączonej Rycinie 1) w cząsteczkach przeciwciała dojrzałych/zoptymizowanych, regiony CDR1, CDR2 i/lub VL CDR-3 są zmienione. Poglądowo, motywy zmodyfikowanej sekwencji optymalizowanych cząsteczek przeciwciał pokazano w załączonej tabeli 1. Optymalizowane cząsteczki przeciwciała, które pochodzą od ujawnionych tutaj MSR-3, -7 i -8, które są zdolne specyficznie reagować z/specyficznie rozpoznawać dwa regiony peptydu β^4 tak jak to tutaj zdefiniowano. W szczególności regiony CDR, lepiej CDR1, jeszcze lepiej CDR1 i CDR2, najlepiej CDR1, CDR2 i CDR3 jak to zdefiniowano tutaj, mogą być stosowane do dalszego wytwarzania będących przedmiotem wynalazku cząsteczek/cząsteczki przeciwciała, między innymi znanymi w tej dziedzinie metodami przeszczepiania CDR; patrz Jones (1986), Nature 321, 522-515 lub Riechmann (1988), Nature 332, 323-327. Najlepiej żeby będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciał/przeciwciała, tak samo jak fragmenty lub pochodne, pochodziły z rodzicielskich przeciwciał tak jak to ujawniono tutaj i dzieliły, jak ujawniono powyżej, domenę CDR-3 regionu VH z przynajmniej jednym z tych rodzicielskich przeciwciał. Jak zilustrowano poniżej, przewiduje się, że wytwarzane są te klonowane krzyżowo przeciwciała, które winny być pomyślane jako zoptymalizowane/dojrzałe cząsteczki przeciwciał/przeciwciała. Stosownie do tego preferowane cząsteczki przeciwciała mogą także zawierać lub mogą być pochodnymi cząsteczek przeciwciał/przeciwciała, które są charakteryzowane przez regiony VH jak to pokazano w którymkolwiek z SEQ ID NO: 32 do 45 lub regiony VL jak to pokazano w SEQ ID NO: 46 do 59, albo które mogą zawierać region CDR-3 jak zdefiniowano w którymkolwiek z SEQ ID NO: 60 do 87. W szczególnie preferowanej postaci wynalazku, optymalizowana cząsteczka przeciwciała będąca przedmiotem niniejszego wynalazku zawiera regiony VH i VL albo ich części jak to opisano odpowiednio w SEQ ID NO: 88/89 i 90/91. Oprócz tego może być region(y) CDR, najlepiej region(y) CDR-3. Szczególnie preferowana cząsteczka typu optymalizowanego zawiera H-CDR3 jak to scharakteryzowano w SEQ ID NO: 92 lub 93 i/lub L-CDR3 jak scharakteryzowano w SEQ ID NO: 94 lub 95. Jest wskazane, żeby cząsteczki przeciwciał/przeciwciała były scharakteryzowane przez specyficzną reaktywność z β-Α4 i/lub peptydami pochodzącymi z tego β-Α4.

Na przykład, jak to zilustrowano w załączonych przykładach, może być ustalone i stosunek gęstości optycznych może posłużyć do zdefiniowania specyficznej reaktywności rodzicielskich lub optymalizowanych przeciwciał. Stosownie do tego, preferowanym przeciwciałem, które jest przedmiotem niniejszego wynalazku, jest przeciwciało, które reaguje w teście ELISA z β-Α4 do osiągnięcia mierzonej przy 450 nm gęstości optycznej, która jest 10 razy większa niż gęstość optyczna mierzona bez β-Α4; tj. wartości 10-cio krotnie przewyższającej tło. Najlepiej jeżeli pomiary gęstości optycznej wykonywane są w parę minut (np. 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub 7 minut) po rozpoczęciu reakcji barwnej, co ma na celu optymalizację sygnału w stosunku do tła.

Należy podkreślić, że techniki dojrzewania powinowactwa są znane w tej dziedzinie, opisane w załączonych przykładach i między innymi w Knappik (2000), J. Mol. Biol. 296, 55; Krebs (2000), J. Imm. Meth. 254, 67-84; WO 01/87337; WO 01/87338; US 6 300 064; EP 96 92 92 78.8 i następnych odnośnikach cytowanych tutaj poniżej.

Cząsteczka przeciwciała może być pełnym przeciwciałem (immunoglobulina taka jak IgG1,

IgG2, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD lub IgE) fragmentem F (ab), Fabc, Fv, Fab', F(ab')2, pojedynczym łańcuchem przeciwciała, chimerowym przeciwciałem, przeciwciałem z przeszczepionym CDR, konstrukcją biwalentnego przeciwciała, przeciwciałem fuzyjnym, przeciwciałem klonowanym krzyżowo

PL 216 190 B1 lub przeciwciałem syntetycznym. Rozpatrywane są także genetyczne odmiany genów immunoglobin. Genetyczne odmiany, np. subklasa 1 (IgG1) ciężkiego łańcucha G immunoglobuliny może zawierać markery allotypowe G1m(17) lub G1m(3) w domenie CH1 lub zawierać markery allotypowe G1m(1) lub G1m(non-1) w domenie CH3. Będąca przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczka przeciwciała zawiera także zmodyfikowane lub zmutowane przeciwciała podobne do zmutowanego IgG ze zwiększonym lub zmniejszonym wiązaniem receptora Fc lub aktywacją dopełniacza. Przyjmuje się także, wytwarzanie będących przedmiotem niniejszego wynalazku przeciwciał konwencjonalnymi środkami, np. wytwarzanie specyficznych monoklonalnych przeciwciał przez immunizację ssaków, lepiej myszy, peptydami zawierającymi dwa regiony βΑ4 tak jak to zdefiniowano tutaj, np. epitop N-końca i centralnego regionu zawierający (a) aminokwasy 2 do 10 βΑ4 (lub jego części) i (b) obszar aminokwasów zawierający aminokwasy 12 do 25 βΑ4 (lub jego części) (SEQ ID NO. 27). Stosownie do tego, osoby biegłe w tej dziedzinie mogą wytwarzać monoklonalne przeciwciała przeciw takim peptydom i mogą testować otrzymane przeciwciała na ich zdolność do jednoczesnego i niezależnego wiązania do/reagowania z N-końcem i centralnym regionem/epitopem βΑ4 jak to tutaj zdefiniowano. Odpowiadające metody skriningowe ujawniono w załączonych przykładach.

Jak to przedstawiono w załączonych przykładach, cząsteczki przeciwciał/przeciwciała, mogą być skonstruowane łatwo i lepiej poprzez rekombinację i podlegają ekspresji. Lepiej, jeżeli cząsteczka przeciwciała, zawiera przynajmniej jedną, lepiej przynajmniej dwie, lepiej przynajmniej trzy, jeszcze lepiej przynajmniej cztery, jeszcze lepiej przynajmniej pięć a najlepiej sześć CDR-ów zdefiniowanych tutaj rodzicielskich przeciwciał MSR-3, MSR-7 lub MSR-8 albo przeciwciał z dogrzewanym powinowactwem/zoptymalizowanych pochodzących z tych rodzicielskich przeciwciał. Należy zaznaczyć, że także więcej niż sześć CDR-ów może być zawartych w przeciwciałach, wytwarzanych przez rekombinację. Osoby biegłe w tej dziedzinie łatwo mogą wykorzystać informację daną w załączonych przykładach do wydedukowania CDR-ów odpowiadających zarówno przeciwciałom rodzicielskim jak i przeciwciałom o optymalizowanym powinowactwie. Przykłady optymalizowanych przeciwciał, które otrzymano przez dojrzewanie/optymalizację rodzicielskich przeciwciał są, między innymi, pokazane w załączonej tabeli 1. Dojrzałą/zoptymalizowaną, cząsteczką przeciwciała jest np. MSR 7.9H7, która jest także scharakteryzowana przez załączone tutaj sekwencje, które zawierają SEQ ID NO: 88 do 95 i które opisują region VH MSR 7.9H7 (SEQ ID NO: 88 i 89), region VL MSR 7.9H7 (SEQ ID NO: 90 i 91), H-CDR-3 MSR 7.9H7 (SEQ ID NO: 92 i 93) równie dobrze jak L-CDR3 MSR 7.9H7 (SEQ ID NO: 94 i 95). Poglądowa cząsteczka przeciwciała MSR 7.9H7 pochodzi od rodzicielskiego przeciwciała MSR7 i jest szczególnie preferowanym przykładem wynalazku, będącej przedmiotem wynalazku zoptymalizowanej/dojrzałej cząsteczki przeciwciała. Ta cząsteczka przeciwciała może być dalej modyfikowana zgodnie z tym wynalazkiem, na przykład w formie klonowania krzyżowego, patrz poniżej i w załączonych przykładach.

Jak udokumentowano w załączonych przykładach, przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku zawierają także klonowane krzyżowo przeciwciała, tzn. przeciwciała zawierające różne regiony przeciwciała (na przykład regiony CDR) z jednego lub więcej rodzicielskich lub z optymalizowanym powinowactwem przeciwciała (przeciwciał) jak to tutaj opisano. Te klonowane krzyżowo przeciwciała mogą być przeciwciałami w kilku różnych zrębach, gdzie najlepszym zrębem jest zrąb IgG, a nawet bardziej preferowany jest zrąb IgG1, XgG2a lub IgG2b. Szczególnie wskazane jest, jeżeli tym zrębem jest zrąb ssaka, najlepiej zrąb ludzki. Domeny na lekkich i ciężkich łańcuchach mają tę samą ogólną strukturę i każda domena zawiera cztery regiony zrębowe, których sekwencje są względnie konserwatywne i które są łączone przez trzy nadzmienne domeny znane jako regiony determinujące dopasowanie (ang. complementarity determining regions) (CDR1-3).

Tak jak użyto tutaj, „ludzki region zrębu dotyczy regionu zrębu, który jest w znacznym stopniu identyczny (około 85% lub więcej, zwykle 90-95% lub więcej) z regionem zrębu naturalnie występującym w ludzkiej immunoglobulinie. Region zrębu przeciwciała, który jest kombinacją regionów zrębów składowych lekkich i ciężkich łańcuchów, służy do umiejscowienia i ustawienia CDR-ów. Głównie CDR-y są odpowiedzialne za wiązanie do epitopu antygenu. Należy zaznaczyć, że w preferowanym (ludzkim) zrębie mogą być obecne nie tylko opisane tutaj klonowane krzyżowo przeciwciała ale także cząsteczki przeciwciała zawierające CDR-y między innymi z rodzicielskich przeciwciał MSR-3, -7 lub 8 jak to tutaj opisano lub mogą być wprowadzone do zrębu immunonoglobuliny dojrzałe przeciwciała, pochodzące z tych rodzicielskich przeciwciał. Preferowanymi zrębami są IgG1, IgG2a i IgG2b. Najbardziej preferowane są zręby ludzkie i zręby ludzkiego IgG1.

PL 216 190 B1

Jak pokazano w załączonych przykładach, możliwe jest między innymi, przeniesienie metodą inżynierii genetycznej znaną w tej dziedzinie, całego lekkiego łańcucha z optymalizowanego klonu dawcy do optymalizowanego klonu biorcy. Przykładem optymalizowanego klonu dawcy jest np. LCDR1 (L1) a przykładem optymalizowanego klonu biorcy jest H-CDR-2 (H2). Specyficzność epitopu może być zachowana przez kombinację klonów, które posiadają takie same regiony H-CDR-3. Dalsze szczegóły są podane w ilustrującym to przykładzie 13. Preferowane klonowane krzyżowo cząsteczki przeciwciała będące przedmiotem wynalazku są wybrane z grupy zawierającej MS-R #3.3H1x3.419, MS-R #3.4H1x3.4L9, MS-R #3.4H3x3.4L7, MS-R #3.4H3x3.4L9, MS-R #3.4H7x3.4L9, MS-R #3.4H7x3.4L7, MS-R #3.6H5x3.6L1, MS-R #3.6H5x3.6L2, MS-R #3.6H8x3.6L2, MS-R #7.2H2x7.2L1, MS-R #7.4H2x7.2L1, MS-R #7.4H2x7.12L2, MS-R #7.9H2x7.2L1(L1), MS-R #7.9H2x7.12L1, MS-R #7.9H2x7.12L2, MS-R #7.9H2x7.12L2(L1+2), MS-R #7.9H4x7.12L2, MS-R #7.11H1x7.2L1, MS-R #7.11H1x7.11L1, MS-R #7.11H2x7.2L1(L1), MS-R #7.11H2x7.9L1 (L1), MS-R #7.11H2x7.12L1 lub MS-R #8.1H1x8.2L1.

Wytwarzanie klonowanych krzyżowo przeciwciał jest także zilustrowane w załączonych przykładach. Powyżej wspomniane, preferowane klonowane krzyżowo cząsteczki przeciwciał/przeciwciała są zoptymalizowanymi/dojrzałymi cząsteczkami przeciwciał pochodzącymi z ujawnionych tutaj rodzicielskich przeciwciał, w szczególności z MSR-3 i MSR-7. Dodatkowo, dalsze sekwencje charakteryzujące CDR i regiony V klonowanej krzyżowo cząsteczki przeciwciał/przeciwciała są podane w załączonym SEQ ID NO: 32, 33, 46 i 47 (MSR 3.6H5x3.6.L2; regiony VH, VL; 34, 35, 48 i 49 (MSR 3.6H8x3.6.L2; regiony VH, VL); 36, 37, 50 i 51 (MSR 7.4H2x7.2.L1; regiony VH, VL); 38, 39, 52 i 53 (MSR 7.9H2x7.12.L2; regiony VH, VL); 40, 41, 54 i 55 (MSR#7.9H4x7.12.L2; regiony VH, VL); 42, 43, 56 i 57 (MSR #7.11H1x7.11.L1; regiony VH, VL); i 44, 45, 58 i 59 (MSR #7.11H1x7.2.L1; regiony VH, VL). Regiony odpowiadające CDR3 tych szczególnie preferowanych klonowanych krzyżowo cząsteczek przeciwciał są opisane w SEQ ID NO: 60 do 87. Dla dalszych cząsteczek przeciwciał MSR, regiony VH, VL, CDR mogą być wydedukowane z załączonych Tabel 8 do 10 i z załączonych sekwencji, w szczególności SEQ ID NO: 32 do 95 dla cząsteczek przeciwciał/przeciwciała MS-R #3.6H5x3.6L2, #3.6H8x3.6L2, #7.4H2x7.2L1, #7.9H2x7.12L2, #7.9H4x7.12L2, #7.11H1x7.11L1, #7.11H1x7.2L1 i #7.9H7 lub SEQ ID NO: 294 do 413 dla cząsteczek przeciwciał/przeciwciała MSR-R MSR#3.3H1x3.4L9, #3.4H1 x 3.4L9, #3.4H3x3.4L7, #3.4H3x3.4L9, #3.4H7x3.4L9, #3.4H7x3.4L7, #3.6H5x3.6L1, #7.2H2x7.2L1, #7.4H2x7.12L2, #7.9H2x7.2L1, #7.9H2x7.12L1, #7.11H2x7.2L1, #7.11H2x7.9L1, #7.11H2x7.12L1 lub #8.1H1x8.2L1. Stosownie do tego, oprócz regionów VH zdefiniowanych powyżej, preferowane cząsteczki przeciwciała mogą zawierać regiony VH tak jak zdefiniowano to w którymkolwiek z SEQ ID NO: 294 do 323. Podobnie SEQ ID NO: 324 do 353 opisują preferowane regiony VL, oprócz zdefiniowanych powyżej regionów VL, mogą być one zawarte w cząsteczkach będących przedmiotem wynalazku. Regiony odpowiadające CDR-3 są zdefiniowane powyżej, podobnie jak dodatkowe sekwencje pokazane w SEQ ID NO: 354 do 413.

Cząsteczki będące przedmiotem wynalazku mogą być łatwo produkowane w odpowiednich ilościach, między innymi, znanymi w tej dziedzinie metodami rekombinacji, patrz Bentley, Hybridoma 17 (1998), 559-567; Racher, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40 (1994), 851-856; Samuelsson, Eur. J. Immunol. 26 (1996), 3029-3034.

Teoretycznie, w rozpuszczalnym β-Α4 (monomerycznym/oligomerycznym) epitopy zarówno N-końca jak i środkowy są dostępne dla interakcji przeciwciała i będące przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczki przeciwciała mogą wiązać się oddzielnie albo do epitopu N-końca albo do środkowego ale w tych warunkach nie będzie otrzymane maksymalne powinowactwo. Jest jednak bardziej prawdopodobne, że optymalny kontakt z paratopem przeciwciała będzie osiągnięty przez jednoczesne wiązanie do obu epitopów, tj. podobnie do interakcji ze zagregowanym β-Α4. Tak więc będące przedmiotem niniejszego wynalazku przeciwciała są unikalnymi przeciwciałami anty β-Α4 przez to, że wiążą się do zagregowanego β-Α4 (przez interakcję z epitopem N-końca i środka) i w tym samym czasie są także zdolne do stabilizowania i neutralizowania konformacyjnego epitopu w rozpuszczalnym β-Α4. Te przeciwciała są odmienne od poprzednio znanych w tej dziedzinie przeciwciał.

Najbardziej preferowane, będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała są te, które wykazują się powinowactwem do Αβ lub jego określonych fragmentów z wartością KD niższą niż

2000 nM, lepiej niższą niż 100 nM, jeszcze lepiej niższą niż 10 nM, najlepiej niższą niż 1 nM. Pomiar takiego powinowactwa/powinowactw może być przeprowadzony metodami objaśnionymi w przykładach i znanymi w tej dziedzinie. Takie metody zawierają ale nie są ograniczone do badania BIACOPL 216 190 B1

RE™ (www.biacore.com; Malmquist (1999), Biochem. Soc. Trans 27, 335-340) i badania w fazie stałej przy użyciu znakowanych przeciwciał lub znakowanego Αβ.

Lepiej, jeżeli cząsteczka przeciwciała będąca przedmiotem wynalazku jest zdolna do dekorowania/reagowania z/wiązania do płytek amyloidu in vitro (post mortem) w skrawkach mózgu pochodzących od pacjentów dotkniętych zaburzeniami związanymi z amyloidem, takimi jak choroba Alzheimera. Jest także wskazane, jeżeli cząsteczki przeciwciał/przeciwciała będące przedmiotem wynalazku, zapobiegają agregacji Αβ in vivo, równie dobrze jak w badaniach in vitro, tak jak zilustrowano to w załączonych przykładach. Ta zdolność będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał/przeciwciała jest wykorzystywana w zastosowaniach medycznych, szczególnie w farmaceutycznych kompozycjach opisanych tutaj poniżej.

Wynalazek dostarcza także cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej będącą przedmiotem wynalazku cząsteczkę przeciwciała, tak jak to tutaj zdefiniowano.

Ta cząsteczka kwasu nukleinowego może być naturalnie występującą cząsteczką kwasu nukleinowego jak również rekombinowaną cząsteczką kwasu nukleinowego. Dlatego też cząsteczka kwasu nukleinowego będąca przedmiotem wynalazku może być pochodzenia naturalnego, syntetyczna lub pół-syntetyczna. Równie dobrze może zawierać DNA, RNA jak i PNA i może być ich hybrydą.

Jest oczywiste dla osób biegłych w tej dziedzinie, że do będącej przedmiotem wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego, mogą być dodane sekwencje regulatorowe. Na przykład mogą być użyte promotory, transkrypcyjne enhancery i/lub sekwencje, które pozwalają indukować ekspresję polinukleotydu będącego przedmiotem wynalazku. Odpowiednim systemem indukcyjnym jest na przykład indukcja genu regulowana tetracykliną jak to opisana np. przez Gossen i Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551) i Gossen i wsp. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62), lub system ekspresji genu indukowalny deksametazonem jak opisana np. przez Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519.

Dla dalszych zastosowań ponadto przyjmuje się, że cząsteczka kwasu nukleinowego może zawierać, na przykład, wiązania tioestrowe i/lub analogi nukleotydów. Te modyfikacje mogą być użyteczne ze względu na trwałość cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce, ochronę przed endo- i/lub egzonukleazami. Te cząsteczki kwasu nukleinowego mogą ulegać transkrypcji poprzez odpowiedni wektor zawierający gen chimerowy, który pozwala na transkrypcję tej cząsteczki kwasu nukleinowego w komórce. Pod tym względem jest także zrozumiałe, że będący przedmiotem wynalazku polinukleotyd może być użyty w zastosowaniach „celowania genowego lub „terapii genowej. Te cząsteczki kwasów nukleinowych mogą być znakowane. Metody wykrywania kwasów nukleinowych są dobrze znane w tej dziedzinie, np. Southern i Northern blotting, PCR lub wydłużanie starterów. Może być to użyteczne w metodach skriningowych, stosowanych podczas terapii genowej do weryfikacji udanego wprowadzenia będących przedmiotem wynalazku cząsteczek kwasów nukleinowych.

Cząsteczka(i) kwasu nukleinowego, będąca przedmiotem wynalazku może być chimerową cząsteczką kwasu nukleinowego otrzymywaną na drodze rekombinacji, zawierającą każdą z wcześniej wymienionych cząsteczek kwasu nukleinowego samą albo w kombinacji. Lepiej jeżeli cząsteczka kwasu nukleinowego będąca przedmiotem wynalazku jest częścią wektora.

Tak więc niniejszy wynalazek dotyczy także wektora zawierającego będącą przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczkę kwasu nukleinowego.

Będącym przedmiotem niniejszego wynalazku wektorem może być, np. plazmid, kosmid, wirus, bakteriofag lub inny wektor używany np. konwencjonalnie w inżynierii genetycznej. Może on zawierać dalsze geny takie jak geny markerowe, które pozwalają na selekcję tego wektora w odpowiedniej komórce gospodarza i w odpowiednich warunkach.

Ponadto, wektor będący przedmiotem niniejszego wynalazku, może oprócz będącej przedmiotem wynalazku sekwencji kwasu nukleinowego, zawierać elementy kontroli ekspresji przyzwalające na właściwą ekspresję kodujących regionów u odpowiednich gospodarzy. Takie kontrolne elementy są znane biegłym w tej dziedzinie i mogą zawierać promotor, kasetę splajsingu, kodon rozpoczęcia translacji, miejsce translacji i miejsce wstawienia dla wprowadzenia wstawki do wektora. Lepiej, jeżeli będąca przedmiotem wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z tą sekwencją kontroli ekspresji pozwalającą na ekspresję w eukariotycznych lub prokariotycznych komórkach.

Elementy kontrolne zapewniające ekspresję w komórkach eukariotycznych i prokariotycznych są dobrze znane biegłym w tej dziedzinie. Jak wspomniano powyżej, zazwyczaj zawierają one regulatorowe sekwencje zapewniające inicjację transkrypcji a dowolne sygnały poli-A zapewniają zakończenie transkrypcji i stabilizację transkryptu. Dodatkowe elementy regulatorowe mogą zawierać zarówno transktypcyjne jak i translacyjne enhancery i/lub naturalnie związane lub heterologiczne regiony pro14

PL 216 190 B1 motora. Możliwe elementy regulatorowe zezwalające na ekspresję na przykład w komórkach gospodarza ssaka zawierają promotor kinazy tymidyny CMV-HSV, promotor SV40, RSV, (Rous Sarcoma Virus), promotor ludzkiego czynnika wydłużania 1a, indukowalny glukokortykoidami promotor MMTV (Moloney Mouse Tumor Virus), promotory indukowalne metalotioneiną lub tetracykliną lub enhancery takie jak enhancer CMV lub enhancer SV40. Przyjmuje się, że promotory neurofilamentów PGDF, NSE, PrP lub thy-1 można wykorzystać do ekspresji w komórkach neuronów. Te promotory znane są w tej dziedzinie i opisane między innymi przez Charron (1995), J. Biol. Chem. 270, 25739-25745. Opisano mnóstwo promotorów ekspresji w komórkach prokariotycznych, np. promotor tac-lac- lub promotor trp. Oprócz elementów, które są odpowiedzialne za inicjację transkrypcji, takie regulatorowe elementy mogą także zawierać sygnały zakończenia transkrypcji, takie jak miejsce SV40-poli-A lub tk-poli-A w dół od polinukleotydu. Znane są w tym kontekście odpowiednie wektory ekspresji takie jak wektor ekspresji Okayama- Berg cDNA pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pX (Pagano (1992) Science 255, 1144-1147), wektory drożdżowego systemu dwuhybrydowego takie jak pEG202 i dpJG4-5 (Gyuris (1995) Cell 75, 791-803) lub prokariotyczne wektory ekspresji takie jak lambda gt11 lub pGEX (Amersham-Pharmacia). Obok będących przedmiotem wynalazku cząsteczek kwasu nukleinowego, w dalszej kolejności, wektor może zawierać sekwencje kwasów nukleinowych kodujące sygnały sekrecji. Takie sekwencje są dobrze znane osobom biegłym w tej dziedzinie. Poza tym, zależnie od stosowanego systemu ekspresji, sekwencje wiodące, zdolne do skierowania będących przedmiotem wynalazku peptydów do przedziału komórkowego mogą być dodane do sekwencji kodujących będące przedmiotem wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego, są one dobrze znane w tej dziedzinie. Sekwencja (sekwencje) wiodąca jest (są) zestawiona w odpowiedniej fazie z sekwencjami translacji, inicjatorową i terminacji i wskazane żeby sekwencja wiodąca zdolna była do kierowania sekrecji powstałego w wyniku translacji białka lub jego części do przestrzeni okołoplazmowej lub do zewnątrzkomórkowego środowiska. Dowolna heterologiczna sekwencja może kodować białko fuzyjne zawierające białko identyfikacji C- lub N-końca, przekazujące pożądaną charakterystykę np. trwałość lub uproszczone oczyszczenie powstałego na drodze ekspresji produktu rekombinacji. Kiedy wektor zostanie wprowadzony do odpowiedniej komórki gospodarza, komórka gospodarza jest utrzymywana w warunkach odpowiednich dla wysokiego poziomu ekspresji sekwencji nukleotydów i gdy jest to pożądane, może następować potem zbieranie i oczyszczanie będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał lub ich fragmentów. Stosownie do tego, wynalazek dotyczy także komórek gospodarza/gospodarzy, które zawierają wektor tak jak zdefiniowano to tutaj. Takie komórki gospodarza mogą być użyteczne również w procedurze otrzymywania będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał/przeciwciała jak i do zastosowań medycznych/farmaceutycznych. Te komórki gospodarza mogą także zawierać transdukowane lub transfekowane komórki neuronów, takie jak komórki neuronów pnia, lepiej dorosłe komórki neuronów pnia. Takie komórki gospodarza mogą być użyteczne w leczeniu metodą transplantacji.

Co więcej, będący przedmiotem niniejszego wynalazku wektor, może być wektorem ekspresyjnym, wektorem transferu genu lub wektorem wprowadzającym docelowo gen. Terapia genowa, która jest oparta na wprowadzaniu leczniczych genów do komórek technikami ex-vivo lub in-vivo jest jednym z najważniejszych zastosowań transferu genów. Transgeniczne myszy, u których zachodzi ekspresja neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciw czynnikowi wzrostu nerwów, są otrzymywane przy użyciu techniki „neuroprzeciwciała; Capsoni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000), 6826-6831 i Biocca, Embo J. 9 (1990) 101-108. Odpowiednie systemy dostarczające wektorów, metod lub genów do terapii genowej in-vitro lub in vivo są opisane w piśmiennictwie i są dobrze znane osobom biegłym w tej dziedzinie; patrz np. w Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Cire. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene therapy 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714716; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5 580 859; US 5 589 466; US 4 394 448 Iub Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 i cytowane tam odnośniki. W szczególności, te wektory i/lub systemy dostarczania genów są także opisane w zastosowaniach terapii genowej do tkanek/komórek neurologicznych (patrz między innymi Blomer, J. Virology 71 (1997) 6641-6649) lub w podwzgórzu (patrz między innymi, Geddes, Front Neuroendocrinol. 20 (1999), 296-316 lub Geddes Nat. Med. 3 (1997), 1402-1404). Dalsze odpowiednie konstrukcje dla terapii genowej do stosowania w neurologicznych komórkach/tkankach są znane w tej dziedzinie, na przykład Meier (1999), J. NeuPL 216 190 B1 ropathol. Exp. Neurol. 58, 1099-1110. Będące przedmiotem wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego i wektory mogą być przeznaczone do bezpośredniego wprowadzenia albo do wprowadzenia poprzez liposomy, wirusowe wektory (np. adenowirusowe, retrowirusowe), elektroporację, balistycznie (np. strzelba genowa) lub inne systemy dostarczania do komórki. Dodatkowo dla cząsteczek kwasu nukleinowego będących przedmiotem wynalazku, jako system ekspresji u eukariota może być użyty system bakulowirusa. Wprowadzenie i zastosowanie terapii genowej powinno prowadzić do ekspresji będącej przedmiotem wynalazku funkcjonalnej cząsteczki przeciwciała, gdzie ta podlegająca ekspresji cząsteczka przeciwciała jest szczególnie użyteczna w leczeniu, poprawie i/lub zapobieganiu zaburzeniom neurologicznym powiązanym z nienormalną syntezą amyloidu, gromadzeniem i/lub agregacją, jak to ma miejsce w chorobie Alzheimera i w podobnych.

Stosownie do tego, będąca przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego i będące przedmiotem niniejszego wynalazku, powyżej opisane wektory/gospodarze, mogą być szczególnie użyteczne jako kompozycje farmaceutyczne. Te kompozycje farmaceutyczne mogą być stosowane w zastosowaniach terapii genowej. W tym kontekście przyjmuje się, że będące przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego i/lub wektory mogą być stosowane do modulowania, zmieniania i/lub modyfikowania ekspresji (komórkowej) i/lub stężenia będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciała lub jego(ich) fragmentu(ów).

Dla zastosowań terapii genowej, będące przedmiotem wynalazku kwasy nukleinowe kodujące peptyd(y) lub jego(ich) fragmenty mogą być klonowane w systemie dostarczającym geny takim jak wirus i wirus użyty do infekcji i dający poprawę choroby lub efekty lecznicze w zainfekowanych komórkach lub w organizmie.

Niniejszy wynalazek dotyczy także komórki gospodarza transfekowanej lub transformowanej będącym przedmiotem wynalazku wektorem, lub innego niż ludzki gospodarza przenoszącego będący przedmiotem niniejszego wynalazku wektor, tj. komórki lub gospodarza, który jest genetycznie zmodyfikowany cząsteczką kwasu nukleinowego zgodnie z wynalazkiem lub wektorem zawierającym taką cząsteczkę kwasu nukleinowego. Termin „genetycznie zmodyfikowana oznacza komórkę gospodarza lub gospodarza, który oprócz naturalnego genomu zawiera zgodnie z wynalazkiem cząsteczkę kwasu nukleinowgo lub wektor, który był wprowadzony do komórki lub organizmu gospodarza lub do jednego z ich przodków/rodziców. Cząsteczka kwasu nukleinowego lub wektor może być obecna w zmodyfikowanej genetycznie komórce lub organizmie gospodarza, albo jako niezależna cząsteczka na zewnątrz genomu, lepiej jako cząsteczka zdolna do replikacji, albo może być trwale scalona z genomem komórki lub gospodarza.

Będąca przedmiotem niniejszego wynalazku komórka gospodarza może być komórką prokariotyczną lub eukariotyczną. Odpowiednimi komórkami prokariotycznymi są powszechnie używane do klonowania komórki takie jak E. coli. Bacillus subtilis. Poza tym, eukariotycznymi komórkami są komórki grzybów lub zwierząt. Przykładami odpowiednich komórek grzybów są komórki drożdży, lepiej tych rodzaju Saccharomyces a jeszcze lepiej tych z gatunku Saccharomyces cerevisiae. Odpowiednimi komórkami zwierząt są np. komórki insektów, komórki kręgowców, lepiej komórki ssaków takie jak np. HEK293, NSO, CHO, MDCK, U2-OHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A. Te komórki gospodarza, np. komórki CHO mogą dostarczać posttranslacyjnych modyfikacji do będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciała, włączając w to usunięcie peptydu wiodącego, składanie i zestawianie H (ciężkich) i L (lekkich) łańcuchów, glikozylację cząsteczki z właściwych stron i sekrecję funkcjonalnej cząsteczki. Poza tym, znane w tej dziedzinie, właściwe linie komórkowe otrzymywane są z depozytów linii komórkowych takich jak American Type Culture Collection (ATCC). Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, w dalszej kolejności przyjmuje się, że pierwotne hodowle komórki/komórek mogą służyć jako komórki gospodarza. W szczególności te komórki pochodzą od insektów (podobnych do insektów gatunku Drosophila lub Blata) lub ssaków (takich jak człowiek, świnia, mysz lub szczur). Te komórki gospodarza mogą także zawierać komórki i/lub pochodzić od linii komórek takich jak linie komórek nerwiaka niedojrzałego. Powyżej wspomniane pierwotne komórki są dobrze znane w dziedzinie i zawierają między innymi pierwotne astrocyty, mieszane hodowle rdzeniowe lub hodowle hipokampa.

Korzystnie, komórka gospodarza, która jest transformowana z będącym przedmiotem wynalazku wektorem jest komórką neuronu, komórką neuronu pnia mózgu (np. dorosła komórka neuronu pnia mózgu) komórką mózgu lub komórką (linią) pochodzącą z niego. Jednak, także komórka CHO zawierająca będącą przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczkę kwasu nukleinowego może być szczególnie użyteczna jako komórka gospodarza. Takie komórki mogą dostarczać właściwych wtórnych

PL 216 190 B1 modyfikacji podlegających ekspresji cząsteczek, tj. będących przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczek przeciwciała. Te modyfikacje zawierają między innymi glikozylację i fosforylację.

Gospodarze mogą być innymi niż człowiek ssakami, najlepiej jeżeli to są myszy, szczury, owce, cielęta, psy, małpy lub małpy człekokształtne. Te ssaki mogą być niezbędne dla rozwoju leczenia, lepiej leczenia wspomnianych tutaj neurologicznych i/lub neurodegeneracyjnych chorób. Poza tym, będący przedmiotem niniejszego wynalazku gospodarze mogą być szczególnie użyteczni przy otrzymywaniu będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał (lub ich fragmentów). Przyjmuje się izolowanie tych cząsteczek przeciwciał (lub ich fragmentów) z tych organizmów gospodarza. Przyjmuje się między innymi, że opisane tutaj cząsteczki kwasu nukleinowego i wektory są włączane w sekwencję w celu ekspresji transgenicznej. Wprowadzenie będących przedmiotem wynalazku cząsteczek kwasu nukleinowego jako transgenów do innych niż człowiek organizmów i następnie ich ekspresja może być wykorzystana do produkcji będących przedmiotem wynalazku przeciwciał. Na przykład ekspresja takiego transgenu(ów) w mleku transgenicznych zwierząt dostarcza środków otrzymywania będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał w dużych ilościach; patrz między innymi US 5 741 957, US 5 304 489 lub US 5 849 992. Pod tym względem użyteczne transgeny zawierają będące przedmiotem wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego, na przykład sekwencje kodujące łańcuchy lekki i ciężki opisanych tutaj cząsteczek przeciwciała, operacyjnie połączone ze strukturami promotora i/lub enhancera ze specyficznych genów tkanki sutka, takich jak gen kazeiny lub beta-laktoglobuliny.

Wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania będącej przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała, zawierającej opisane tutaj hodowanie komórki gospodarza w warunkach, które pozwalają na syntezę tej cząsteczki przeciwciała i odzyskanie tej cząsteczki przeciwciała z tej hodowli.

Wynalazek dotyczy także kompozycji zawierającej będącą przedmiotem wynalazku cząsteczkę przeciwciała, albo otrzymanej opisaną tutaj metodą cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego będącą przedmiotem wynalazku cząsteczkę przeciwciała, wektor zawierający tę cząsteczkę kwasu nukleinowego lub komórkę gospodarza jak to zdefiniowano tutaj powyżej i dowolnie, dalsze cząsteczki, albo same albo w kombinacji jak np. cząsteczki, które są zdolne do interferowania w tworzenie się płytek amyloidowych, albo które są zdolne do depolimeryzacji już utworzonych płytek amyloidowych. Termin „kompozycja tak jak zastosowano tutaj zawiera przynajmniej jeden będący przedmiotem wynalazku związek. Lepiej jeżeli taka kompozycja jest farmaceutyczną lub diagnostyczną kompozycją.

Kompozycja może mieć formę stałą lub płynną, może być między innymi w formie pudru(ów), tabletki(ek), roztworu(ów) lub areosolu(i). Ta kompozycja może zawierać jedną lub więcej będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał/przeciwciała lub będących przedmiotem wynalazku cząsteczek kwasu nukleinowego, lub będący przedmiotem wynalazku wektor lub gospodarze. Przyjmuje się także, że ta kompozycja zawiera przynajmniej dwie, lepiej trzy, jeszcze lepiej cztery, najlepiej pięć będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciała lub cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących tę cząsteczkę(i) przeciwciała. Ta kompozycja może także zawierać będące przedmiotem wynalazku, optymalizowane cząsteczki przeciwciał/przeciwciała możliwe do otrzymania metodami opisanymi poniżej i w załączonych przykładach.

Wskazane jest, żeby ta farmaceutyczna kompozycja zawierała dowolny dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i/lub rozcieńczalnik. Ujawnione tutaj farmaceutyczne kompozycje mogą być szczególnie użyteczne przy leczeniu neurologicznych i/lub neurodegeneracyjnych zaburzeń. W skład tych chorób wchodzą, ale nie są ograniczone do: choroba Alzheimera, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), dziedziczne krwotoki śródmózgowe w przebiegu amyloidozy typu holenderskiego, zespół Downa, związane z HIV otępienie, choroba Parkinsona i zaburzenia neuronalne związane ze starzeniem. Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja farmaceutyczna rozważana jest między innymi jako potencjalny inhibitor formowania się płytek amyloidowych lub jako potencjalny stymulator depolimeryzacji płytek amyloidowych. Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza farmaceutycznych kompozycji zawierających będące przedmiotem wynalazku związki do zastosowania w leczeniu chorób/zaburzeń związanych z patologiczną proteolizą APP i/lub powstawaniem płytek amyloidowych.

Przykłady odpowiednich farmaceutycznych nośników, zaróbek i/lub rozcieńczalników są dobrze znane w tej dziedzinie i zalicza się do nich bufory soli fosforanowych, wodę, emulsje takie jak olej/woda, różne typy czynników zwilżających, sterylne roztwory itp. Kompozycje zawierające takie nośniki mogą być tworzone konwencjonalnymi metodami.

Te farmaceutyczne kompozycje mogą być podawane w odpowiednich dawkach. Podawanie odpowiednich kompozycji może być wykonane różnymi drogami np. dożylnie, dootrzewnowe, podPL 216 190 B1 skórnie, domięśniowo, lokalnie, śródskórnie, donosowo lub dooskrzelowo. Jest szczególnie wskazane, żeby to podawanie było przeprowadzane przez iniekcję lub dostarczanie np. do tętnicy mózgowej albo bezpośrednio do tkanki mózgowej. Będące przedmiotem wynalazku kompozycje mogą być także dostarczane bezpośrednio do miejsca docelowego. Np. przez dostarczanie przy użyciu biolistyki do zewnętrznego lub wewnętrznego miejsca docelowego, takiego jak mózg. Sposób dawkowania będzie określony przy uwzględnieniu czynników fizycznych i klinicznych. Dobrze wiadomo w dziedzinie medycyny, że dawkowanie właściwe dla jakiegoś pacjenta zależy od wielu czynników włączając w to wielkość pacjenta, powierzchnię ciała pacjenta, wiek, to jaki konkretnie związek ma być podawany, płeć, czas i drogę podania, ogólny stan zdrowia i inne podawane w tym czasie leki. Farmaceutycznie aktywna białkopodobna substancja może być obecna w dawkach między 1 ng i 10 mg/kg ciała, jednakże przewiduje się dawki poniżej i powyżej tego przykładowego zakresu, szczególnie przy uwzględnieniu poprzednio wspomnianych czynników. Jeżeli sposobem podawania jest ciągła infuzja, to także może zakres ten może wynosić 1 μg do 10 mg jednostek na kg wagi ciała na minutę. Przebieg może być monitorowany przez okresowe badanie. Kompozycja będąca przedmiotem wynalazku może być podawana lokalnie lub doustrojowo. Należy zaznaczyć, że przeciwciała podawane obwodowo mogą wchodzić do ośrodkowego układu nerwowego, patrz między innymi Bard (2000), Nature Med. 6, 916-919. Preparaty do podawania pozajelitowego zawierają sterylne wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny i emulsje. Przykładami niewodnych rozpuszczalników są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne takie jak olej oliwkowy i nadające się do wstrzyknięć organiczne estry takie jak oleinian etylowy. Do wodnych nośników zalicza się wodę, roztwory woda/alkohol, emulsje i zawiesiny włączając w to sole i bufory. Do pozajelitowych zaróbek zalicza się roztwór chlorku sodu, dekstrozę Ringera, dekstrozę i chlorek sodu, mleczan Ringera lub oleje. Do dożylnych zaróbek zalicza się płyny odżywcze i uzupełniające, uzupełniające elektrolity (takie jak te oparte na dekstrozie Ringera) i temu podobne. Mogą być także obecne środki konserwujące i inne dodatki takie jak na przykład środki przeciwbakteryjne, antyoksydanty, czynniki chelatujące, obojętne gazy i temu podobne. Poza tym, będąca przedmiotem wynalazku farmaceutyczna kompozycja może zawierać dalsze czynniki, zależnie od przeznaczenia farmaceutycznej kompozycji. Te czynniki mogą być lekami działającymi na ośrodkowy układ nerwowy takimi jak czynniki neuroprotekcyjne, inhibitory acetylocholinesterazy, agoniści receptorów muskarynowych M1, hormony, antyoksydanty, inhibitory zapalenia itp. Jest szczególnie wskazane, żeby ta kompozycja farmaceutyczna zawierała dalej czynniki takie jak np. neuroprzekaźniki i/lub zastępcze cząsteczki neuroprzekaźników, witaminę lub kwas alfa-lipoinowy.

Farmaceutyczne kompozycje, równie dobrze jak będące przedmiotem wynalazku metody lub zastosowania opisane poniżej mogą być użyte do leczenia wszystkich rodzajów dotychczas nieznanych chorób albo mających związek albo zależnych od patologicznej agregacji lub patologicznych procesów APP. Mogą być one szczególnie użyteczne do leczenia choroby Alzheimera i innych chorób, w których pozakomórkowe złogi β-amyloidu zdają się odgrywać rolę.

W preferowanej postaci wynalazku, ujawniona tutaj powyżej kompozycja będąca przedmiotem wynalazku jest kompozycją diagnostyczną, w dalszej kolejności fakultytatywnie zawierającą odpowiednie środki pozwalające na detekcję. Kompozycja diagnostyczna zawiera przynajmniej jeden z wymienionych poprzednio, będących przedmiotem wynalazku związków.

Ta diagnostyczna kompozycja może zawierać, będące przedmiotem wynalazku związki, w szczególności i najlepiej będące przedmiotem niniejszego wynalazku cząsteczki przeciwciał w postaci rozpuszczalnej/w płynnej fazie, ale także przyjmuje się, że te związki są związane do/dołączone do i/lub złączone ze stałym podłożem.

Stałe podłoża mogą być używane w kombinacji z diagnostyczną kompozycją jak to zdefiniowano tutaj, albo związki będące przedmiotem wynalazku mogą być bezpośrednio wiązane do tego stałego podłoża. Takie podłoża są dobrze znane w tej dziedzinie i mogą zawierać między innymi komercyjnie dostępne wypełnienia kolumn, ziarna polistyrenu, ziarna lateksu, ziarna magnetyczne, koloidowe cząsteczki metalu, szklane i/lub silikonowe skrawki i powierzchnie, nitrocelulozowe paski, membrany, płytki, duracyty, studzienki i ściany płytek reakcyjnych, plastikowe probówki itp. Będące przedmiotem wynalazku związki, w szczególności będące przedmiotem niniejszego wynalazku przeciwciała mogą być wiązane do wielu różnych nośników. Do dobrze znanych nośników przykładowo należą szkło, polistyren, chlorek poliwinylu, polipropylen, polietylen, materiały poliwęglowe, dekstran, nylon, amylozy, naturalne i modyfikowane celulozy, poliakrylamidy, agarozy i magnetyty. Dla celów wynalazku, nośnik może mieć naturę rozpuszczalną lub nierozpuszczalną. Odpowiednie znaczniki i metody znakowania zidentyfikowano powyżej i są następnie wymieniane tutaj poniżej. Odpowiednie metody

PL 216 190 B1 dla ustalenia/unieruchomienia tego będącego przedmiotem wynalazku związku(ów) są dobrze znane, ale nie są ograniczone do interakcji hydrofobowych, kowalencyjnych i temu podobnych.

W szczególnie preferowanej postaci ta będąca przedmiotem wynalazku kompozycja jest stosowana do detekcji i/lub ilościowego pomiaru APP i/lub powstających z APP produktów takich jak β-amyloid albo do detekcji i/lub ilościowej oceny patologicznie i/lub (genetycznie) zmodyfikowanych efektów rozszczepienia APP.

Jak to zilustrowano w załączonych przykładach, będące przedmiotem niniejszego wynalazku związki, w szczególności będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała są szczególnie użyteczne jako odczynniki detekcyjne do wykrywania u ludzi, w skrawkach mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera, poprzez pośrednią immunofIuorescencję oryginalnych płytek amyloidu.

Dobrze jest, jeżeli te będące przedmiotem niniejszego wynalazku związki przeznaczone do kompozycji diagnostycznych są znakowane w sposób pozwalający na detekcję. Do znakowania cząsteczek biologicznych dostępne są różnorodne techniki dobrze znane osobom biegłym w tej dziedzinie i są przewidywane, żeby zawierały się w ramach niniejszego wynalazku. Takie techniki są np. opisane w Tijssen, „Practice and theory of enzyme immuno assays, Burden, RH and Knippenburg *Eds), Volume (1985), „Basic methods in molecular biology, Davis LG, Dimber MD, Battey Elsevier (1990), Mayer i wsp., (Eds) „Immunochemical methods in cell and molecular biology Academic Press, London (1987), Iub w serii „Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.

Istnieje wiele różnych znaczników i metod znakowania dobrze znanych pracującym w tej dziedzinie. Przykłady rodzajów znaczników, które mogą być użyte w niniejszym wynalazku obejmują enzymy, radioizotopy, koloidowe metale, związki fluorescencyjne, związki chemiluminescencyjne i związki bioluminescencyjne.

Zwykle stosowane znaczniki zawierają między innymi fluorochromy (takie jak fluoresceina, rodamina, Texas Red itp.), enzymy, (takie jak peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, fosfataza alkaliczna), radioaktywne izotopy (takie jak ³²P lub ¹²⁵I), biotyna, dioksogenina, koloidowe metale, związki chemi- lub bioluminescencyjne (takie jak dioksyetany, luminol lub acridinium). Procedury znakowania, takie jak połączenia kowalencyjne enzymów lub grup biotynylowych, jodowania, fosforylacje, biotynylacje itp. są dobrze znane w tej dziedzinie.

Metody detekcji zawierają ale nie są ograniczone do; autoradiografię, mikroskopię fluorescencyjną, bezpośrednie i pośrednie reakcje enzymatyczne itp. Zwykle stosowane metody detekcji obejmują metody radioizotopowe i inne niż radioizotopowe. Te obejmują między innymi Westerblotting , badanie overlay, RIA (Radioimmuno Assay) i IRMA (Immune Radioimmunometric Assay), EIA (Enzyme Immuno Assay), ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), FIA (Fluorescent Immuno Assay) i CLIA (Chemioluminescent Immune Assay).

W dalszej kolejności wskazane jest, żeby związki opisane tutaj, w szczególności będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała były stosowane w zapobieganiu i/lub leczeniu neuropatologii związanych z nienormalnymi i/lub patologicznymi przemianami APP i/lub amyloidogenezą. Cząsteczki przeciwciał, np. w formacie (skonstruowanych) immunoglobulin takich jak przeciwciała w zrębie IgG, w szczególności w zrębie IgG1 lub w formacie przeciwciał chimerowych, przeciwciał bispecyficznych, pojedynczego łańcucha Fvs (scFvs) lub bispecyficznego scFvs i podobne, stosowane są do otrzymywania dostarczonych tutaj kompozycji farmaceutycznych. Cząsteczki przeciwciał są także użyteczne w zastosowaniach diagnostycznych jak to udokumentowano w załączonych przykładach, ponieważ cząsteczki będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała wchodzą w specyficzne reakcje z/wykrywają Αβ4 i/lub złogi amyloidu/płytki.

Tak więc odkrywczym użyciem związków będących przedmiotem wynalazku jest użycie do przygotowania farmaceutycznych kompozycji do zastosowań w zaburzeniu neurologicznym, które wymaga poprawy, np. przez dezintegrację płytek β amyloidowych, oczyszczenie (z płytek) lub przez pasywną immunizację skierowaną przeciw tworzeniu β płytek amyloidowych. Jak to przedstawiono na załączonych przykładach, cząsteczki przeciwciała będące przedmiotem wynalazku są szczególnie użyteczne w zapobieganiu agregacji Αβ i w depolimeryzacji już utworzonych amyloidowych agregatów. Stosownie do tego, będące przedmiotem wynalazku przeciwciała są stosowane do redukcji patologicznych złogów/płytek amyloidu, do czyszczenia z prekursorów płytek/płytki amyloidu jak również w neuroprotekcji. W szczególności przyjmuje się, że będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała mogą być stosowane in vivo w zapobieganiu tworzeniu płytek amyloidowych jak również in vivo w oczyszczaniu już istniejących płytek/złogów amyloidowych. Co więcej będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała mogą być użyte w zastosowaniach pasywnej immunizacji skierowanej przeciw Αβ4. OczyszPL 216 190 B1 czenie Aβ4/złogów Αβ4 może być między innymi osiągnięte przez użycie do celów medycznych będących przedmiotem wynalazku przeciwciał, które zawierają część Fc. Ta część Fc przeciwciała może być szczególnie użyteczna w przypadku odpowiedzi immunologocznej przekazywanej przez receptor Fc, np. przyciąganie makrofagów (komórki fagocytów i/lub mikrogleju) i/lub komórek pomocniczych. Dla przekazania odpowiedzi immunologicznej związanej z częścią Fc, lepiej żeby będąca przedmiotem wynalazku cząsteczka przeciwciała była w zrębie IgG1 (ludzkiej). Jak tutaj dyskutowano, preferowanym obiektem, który winien być leczony będącymi przedmiotem wynalazku cząsteczkami przeciwciała, kodującymi je lub ich części cząsteczkami kwasu nukleinowego, będącymi przedmiotem wynalazku wektorami lub komórkami gospodarza, jest człowiek. Dla cząsteczek przeciwciała będących przedmiotem wynalazku rozważane są także inne zręby, takie jak zręby IgG2a lub IgG2b. Zręby immunoglobulin w formacie IgG2a i IgG2b są przewidywane szczególnie w przypadku myszy, np. w zastosowaniach cząsteczek przeciwciała będących przedmiotem wynalazku do celów naukowych, np. do badania na transgenicznych myszach ekspresji (ludzkiego) APP typu dzikiego lub zmutowanego, fragmentów APP i/lub Αβ4.

Powyżej wyliczone choroby związane z amyloidogenezą i/lub tworzeniem płytek amyloidowych zawierają, ale nie są ograniczone do: demencję, chorobę Alzheimera, neuropatię ruchową, chorobą Parkinsona, ALS (stwardnienie boczne zanikowe), biegunkę epidemiczną, demencję związaną z HIV, jak również chorobę Creutzfeld-Jakoba, dziedziczne krwotoki śródmózgowe w przebiegu amyloidozy typu holenderskiego, zespół Downa i choroby neurologiczne związane ze starzeniem. Będące przedmiotem wynalazku cząsteczki przeciwciała i dostarczone tutaj kompozycje mogą być także przydatne w poprawie stanu i zapobieganiu procesom zapalnym związanym z amyloidogenezą i/lub tworzeniem płytek amyloidowych.

W jeszcze innej postaci wynalazku, niniejszy wynalazek dostarcza zestawu zawierającego przynajmniej jedną cząsteczkę przeciwciała, przynajmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego, przynajmniej jeden wektor i przynajmniej jedną komórkę gospodarza. Korzystnie, zestaw niniejszego wynalazku zawiera dowolnie bufor(y), roztwór do przechowywania i/lub pozostałe odczynniki lub materiały potrzebne do realizacji medycznych, naukowych lub diagnostycznych badań lub celów. Co więcej części będącego przedmiotem wynalazku zestawu mogą być pakowane oddzielnie w fiolkach lub butelkach lub w kombinacji w pojemnikach lub wielopojemnikowych jednostkach.

Zestaw będący przedmiotem niniejszego wynalazku może być korzystnie stosowany między innymi do realizacji będącej przedmiotem niniejszego wynalazku metody i może być użyty do różnych zastosowań, na które się tutaj powoływano, np. jako zestaw diagnostyczny, jako narzędzie badawcze lub lecznicze. Dodatkowo będący przedmiotem wynalazku zestaw może zawierać środki do detekcji odpowiednie do celów naukowych, medycznych i diagnostycznych. Produkcja zestawów następuje zgodnie ze wskazanymi standardowymi procedurami, znanymi osobom biegłym w tej dziedzinie.

Metoda optymalizacji cząsteczki przeciwciała jak to zdefiniowano powyżej zawierającej etapy: a) konstruowania biblioteki zróżnicowanych fragmentów Fab przeciwciała pochodzących z przeciwciała zawierającego przynajmniej jeden CDR3 regionu VH kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak pokazano w SEQ ID NO; 21, 23 lub 25 i przynajmniej jedną sekwencję aminokwasów CDR3 regionu VH jak to pokazano w SEQ ID NO; 22, 24 lub 26.

(b) testowanie efektów optymalizacji biblioteki Fab przez panoramowanie przeciwko Αβ/Αβ4;

(c) identyfikowanie optymalizowanych klonów i (d) ekspresja wybranych, optymalizowanych klonów

Optymalizacja będących przedmiotem wynalazku cząsteczek przeciwciał/przeciwciała jest także udokumentowana w załączonych przykładach i może zawierać selekcję ze względu na np. większe powinowactwo dla jednego lub obu regionów/epitopów β^4 jak zdefiniowano tutaj, lub selekcję ze względu na ulepszoną ekspresję i temu podobne. W jednej z postaci, ta selekcja ze względu na większe powinowactwo do jednego lub obu regionów/epitopów β-Α4 zawiera selekcję ze względu na wysokie powinowactwo do (a) aminokwasowego obszaru β-Α4 zawierającego aminokwasy 2 do 10 (albo jego części) i/lub (b) aminokwasowego obszaru β-Α4 zawierającego aminokwasy 12 do 25 (lub jego części) (SEQ ID NO. 27).

Protokóły optymalizacji przeciwciał są znane w tej dziedzinie. Te protokóły optymalizacji zawierają między innymi kroczącą mutagenezę CDR jak ujawniono tutaj, zilustrowano i opisano w Yang (1995), J. Mol. Biol. 25, 392-403; Schier (1996), J. Mol. Biol. 263, 551-567; Barbas (1996), Trends. Biotech 14, 230-34 lub Wu (1998), PANS 95, 6037-6042; Schier (1996), Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Moore (1997), J. Mol. Biol. 272, 336. Techniki „Panning są także znane w tej dziedzinie, patrz np. Kay (1993), Gene 128, 59-65. Poza tym publikacje takie jak Borrebaeck (1995), „Antibody Engineering, Oxford University, 229-266; McCafferty (1996), „Antibody Engineering, Oxford

PL 216 190 B1

University Press; Kay (1996), A Laboratory Manual, Academic Press dostarcza protokółów optymalizacji, które mogą być modyfikowane zgodnie z tym wynalazkiem.

Metoda optymalizacji może poza tym zawierać etap (ca), gdzie optymalizowane klony są dalej optymalizowane przez mutagenezę kasetową jak to przedstawiono w załączonych przykładach.

Opisana tutaj metoda optymalizacji cząsteczki przeciwciała jest dalej ilustrowana w załączonych przykładach jako dojrzewanie powinowactwa rodzicielskich cząsteczek przeciwciał/przeciwciała zdolnych specyficznie rozpoznawać dwa regiony peptydu beta-A4/Abeta4/Ae/Ae4/eA4).

Lepiej jeżeli ten Αβ/Αβ4 (w kontekście tego wynalazku także oznaczany jako βΑ4) na etapie (b) opisanej tutaj powyżej metody jest zagregowanym Αβ/Αβ4. To panoramowanie może być przeprowadzone (jak opisano w załączonych przykładach) ze zwiększeniem ograniczenia wiązania. Ograniczenie może być zwiększone między innymi przez zmniejszenie stężenia Αβ/Αβ4 albo przez zwiększenie temperatury (badanie). Badanie zoptymalizowanej biblioteki przez panoramowanie jest znane pracownikom biegłym w tej dziedzinie i opisane w Kay (1993), w miejscu już cytowanym. Dobrze jeżeli identyfikacja w etapie (c) jest przeprowadzana przez ranking względem najmniejszej wartości KD.

Najlepiej jeżeli ta identyfikacja w etapie (c) jest przeprowadzana poprzez ranking według stałej dysocjacji. Ranking według stałej dysocjacji jest znany biegłym w tej dziedzinie i opisany w Schier (1996), w miejscu już cytowanym, Schier (1996) J. Mol. Biol. 255, 28-43 lub Duenas (1996) Mol. Immunol. 33, 279-286. Poza tym ranking według stałej dysocjacji jest zilustrowany w załączonych przykładach. Stała dysocjacji może być mierzona tak jak to opisano w załączonych przykładach.

Jak wspomniano powyżej, zidentyfikowane klony, w celu dalszej oceny mogą być poddawane ekspresji. Ekspresja może być przeprowadzana znanymi metodami, między innymi zilustrowanymi w załączonych przykładach. Ekspresja może między innymi prowadzić do otrzymania w drodze ekspresji fragmentów Fab, scFvs, bispecyficznych immunoglobulin, bispecyficznych cząsteczek przeciwciała, białek fuzyjnych Fab i lub Fv lub pełnych przeciwciał takich jak IgG-y, w szczególności IgG1.

Optymalizowane przeciwciała, w szczególności optymalizowane Fab-y lub optymalizowane IgG-y, lepiej IgG1-y mogą być testowane metodami, które zilustrowano w załączonych przykładach. Takie metody zawierają, ale nie są ograniczone do: badanie powinowactwa wiązania, oznaczanie wartości KD, analiza pepspot, badanie ELISA, badanie RIA, badanie CLIA, (immuno) histologiczne badanie (na przykład wybarwianie płytek amyloidowych), badania depolimeryzacji lub zależnej od przeciwciał fagocytozy β-Α4.

Optymalizowane przeciwciała mogą być wytwarzane przez klonowanie krzyżowe. Ta metoda jest także zilustrowana w załączonych przykładach i zawiera etap kombinacji niezależnie optymalizowanych regionów CDR, na przykład przez kombinację niezależne optymalizowanego H-CDR2 i L-CDR2 z dojrzałych klonów z H-CDR3, lepiej z takim samym H-CDR3.

PL 216 190 B1

Przykładowe sekwencje jak wymieniono tutaj:

SEQ ID NO: 1

AEFRHDSGY

Pierwszy region peptydu β-Ά4

SEQ ID NO: 2

VHHQKLVFFAEDVG

Drugi region peptydu β-Α4

SEQ ID NO: 3

Region VH MS-Roche#3 (sekwencja kwasu nukleinowego) CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGC

GTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGT

GCGCCAAGCCCCIGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGC

GGCAGCACCTATIATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATA

ATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGCAAGATACGGC

CGTGTATTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGAT

GTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC (SEQ ID NO : 3)

SEQ ID NO: 4

PL 216 190 B1

Region VH MS-Roche#3 (sekwencja aminokwasów )

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV3AISGSG

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFD

VWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO : 4)

SEQ ID NO: 5

Region VH MS-Roche#7 (sekwencja kwasu nukleinowego)

CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGC

GTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGT

GCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGC

GGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTACCATTTCACGTGATAA

TTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCC

GTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTC

GTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC (SEQ

ID NO: 5)

SEQ ID NO: 6

Region VH MS-Roche#7 (sekwencja aminokwasów )

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM3WVRQAPGKGLEWVSAISGSG

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDIAVYYCARGKGNTHKPYGYV

RYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)

3EQ ID NO: 7

Region VH MS-Roche#8 (sekwencja kwasu nukleinowego)

CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGC

GTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGT

GCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGACTGGGTGACCGCCATTAGCGGTAGCGGC

GGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATA

PL 216 190 B1

ATTCGAAAAACACCCTGTAICTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGC

CGTGTATTATTGCGCGCGTCTTCTTTCTCGTGGTTATAATGGTTATTATCATAAG TTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC (SEQ ID NO; 7)

SSQ ID NO: 8

Region VH MS-Roche#8 (sekwencja aminokwasów )

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG

GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLLSRGYNGYYHK

FDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8)

SEQ ID NO: 9

Region VL MS-Roche#3 (sekwencja kwasu nukleinowego) gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtg CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTA ccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgt GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGGT TTATAATCCTCCTGTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG (SEQ ID NO: 9)

SEQ ID NO: IG

Region VL MS-Roche#3 (sekwencja aminokwasów )

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR AlGV PAR FSGSGSGT DFTLTIS SLE PE DFAVYYCQQVYNP PYT FGQGTKV SI KRT (SEQ ID NO: 10)

SEQ ID NO: 11

Region VL MS-Roche#7 (sekwencja kwasu nukleinowego)

PL 216 190 B1

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCTTTCAGCT _{ttattctgatccttttacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacg} (SEQ ID NO. 11)

SEQ ID NO: 12

Region VL MS-Roche#7 (sekwencja aminokwasów )

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR

ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCFQLYSDPFTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO : 12)

SEQ ID NO: 13

Region VL MS-Roche#8 (sekwencja kwasu nukleinowego)

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGCT

TTCTTCTTTTCCTCCTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG (SEQ ID NO: 13)

SEQ ID NO: 14

Region VL MS-Roche#8 (sekwencja aminokwasów )

PL 216 190 B1

DIVLTQSPAT1,SLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASS

ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQLSSFPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO : 14)

SEQ ID NO: 15

CDR3 regionu V_L MSR-3 (sekwencja kwasu nukleinowego) |CAG GAG GTT TAT AAT CCT CCT GT13 s I (SEQ ID NO : 15) '

SEQ ID NO: 16

CDR3 regionu V_Ł MSR-3 (sekwencja aminokwasów)

QQVYNPPV (SEQ ID NO: 16)

SEQ ID NO: 17

CDR3 regionu V_L MSR-7 (sekwencja kwasu nukleinowego)

TTT CAG CTT TAT TCT GAT CCT TTT (SEQ ID NO : 17)

SEQ ID NO: 18

CDR3 regionu V_L MSR-7 (sekwencja aminokwasów)

FQLYSDPF (SEQ ID NO. 18)

SEQ ID NO: 19

CDR3 regionu V_L MSR-8 (sekwencja kwasu nukleinowego) CAG CAG CTT TCT TCT TTT CCT CCT (SEQ ID NO. 19)

SEQ ID NO: 20

CDR3 regionu V_L MSR-8 (sekwencja aminokwasów)

QQLSSFPP (SEQ ID NO: 20)

SEQ JD NO: 21

PL 216 190 B1

CDR regionu V_H MSR-3 (sekwencja kwasu nukleinowego)

CTT ACT CAT TAT GCT CGT TAT TAT CGT TAT TTT GAT GTT (SEQ ID NO: 21)

SEQ ID NO: 22

CDR regionu V_H MSR-3 (sekwencja aminokwasów)

LTHYARYYRYFDV (SEQ ID NO: 22)

SEQ ID NO: 23

CDR regionu V_H MSR-7 (sekwencja kwasu nukleinowego)

GGT AAG GGT AAT ACT CAT AAG CCT TAT GGT TAT GTT CGT TAT TTT GAT GTT (SEQ ID NO: 23)

SEQ ID NO: 24

CDR regionu V_H MSR-7 (sekwencja aminokwasów)

GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 24)

SEQ ID NO: 25

CDR regionu V_1{ MSR-8 (sekwencja kwasu nukleinowego)

CTT CTT TCT CGT GGT TAT AAT GGT TAT TAT CAT AAG TTT GAT GTT (SEQ ID NO. 25)

SEQ ID NO: 26

CDR regionu V_K MSR-8 {sekwencja aminokwasów)

LLSRGYNGYYHKFDV (SEQ ID NO: 26)

SEQ ID NO: 27 Αβ4 (aminokwasy 1 to 42) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO:

27)

SEQ ID NO: 28 starter

5'-GTGGTGGTTCCGATATC-3' (SEO ID NO: 28)

PL 216 190 B1

SEQ ID NO: 29 starter

5'- AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGTTA-3' (SEQ

ID NO: 29)

SEQ ID NO: 30 starter

5'“CAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEQ ID NO: 30)

SEQ ID NO: 31 starter

5'-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3' (SEQ ID NO: 31)

3EQ ID NO: 32 VH MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2; DNA;

sztuczna sekwencja

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGA gctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgcca

AGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGIGAGCGCTATTTCTGAGTCTGGTAAGACT aagtattatgctgattctgttaagggtccttttaccatttcacgtgataattcga aaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgta ttattgcgcgcgtcttactcattatgctcgttattatcgttattttgatgtttgg

GGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA {SEQ ID NO: 32)

SEQ ID NO. 33: prot region VH MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencja

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISESGKT

KYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFDVW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33)

SEQ ID NO: 34 region VH MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2; DNA; sztuczna sekwencja

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGA

GCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCA

PL 216 190 B1

AGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTTCTGAGTATTCTAAGTTT

AAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGA

AAAACACCCTGIATCIGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTA

TTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATIATCGTTATTTTGATGTTTGG

GGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO: 34)

SEQ ID NO: 35 prot region VH MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencja

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISEYSKF

KYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFDVW

GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 35)

SEQ ID NO: 36 region VH MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1; DNA; sztuczna sekwencja

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGA

GCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCA

AGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATTATAATGGTGCTCGT

ATTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGA

AAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTA

TTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTAT

TTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO:

36)

SEQ ID NO: 37 prot region VH MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINYNGAR

IYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNT.HKPYGYVRY

FDVWGQGTLVTVSS {SEQ ID NO: 37)

PL 216 190 B1

SEQ ID NO: 38 region VH MS-Roe.he#7.9H2 x 7.12 L2 ;

DNA; sztuczna sekwencja

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGA

GCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCA

AGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTGATGGTAATCGT

AAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGA

AAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTA

TTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTAI

TTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO:

38)

SEQ TD NO: 39 prot region VH MS~Roche#7.9H2 x 7.12 L2; białko/1; sztuczna sekwencja

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINADGNR

KYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRY

FDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 39)

SEQ ID NO: 40 region VH MS-Roche#7.9H4 x 7.12L2; DNA; sztuczna sekwencja

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGGAGCCTGCGTCTGA

GCTGCGCGGCCTCCGGATITACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCA

AGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTGTTGGTATGAAG

AAGTTTTATGCTGATTCTGTTAAGGGICGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGA

AAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTA

TTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTAT

TTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO: 40)

PL 216 190 B1

SEQ XD NO: 41 prot region VH MS-Roche#7.9H4 x

7.12L2; biaiko/1; sztuczna sekwencja

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAM3WVRQAPGKGLEWVSAINAVGMK

KFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRY

FDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 41)

SEQ ID NO: 42 region VH MS-Roche#7.11H1 x 7.11L1;

DNA; sztuczna sekwencja

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGA

GCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCA

AGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTATTAATGCTGCTGGTITTCGT

ACTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGA

AAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTA

TTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTAT

TTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO:

42)

SEQ ID NO. 43 prot VH region MS-Roche#7.11H1 x 7.11L1; biaiko/1; sztuczna sekwencja

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGINAAGFR

TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLGMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRY

FDVWGQGTLVTVSS {SEQ ID NO: 43)

SEQ ID NO: 44 region VH MS-Roche#7.11H1 x 7.2L1; DNA; sztuczna sekwencja

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGC-CAGCCTGCGTCTGA

GCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCA

AGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTAITAATGCTGCTGGTTTTCGT

PL 216 190 B1

ACTTATTAIGCTGATTCIGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGA

AAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTA

TTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACICATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTAT

TTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO:

44}

SEQ ID NO: 45 prot region VH MS-Roche#7.11H1 x 7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWSGINAAGFR

TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRY

FDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 45)

SEQ ID NO: 46 region VL MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2; DNA; sztuczna sekwencja

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTTTCTTTCTCGTTATTATCTGGCGTGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGAC

TTATAATTATCCTCCTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG (SEQ ID NO: 46)

SEQ ID NO:47 prot region VL MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencja

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFLSRYYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTYNYPPTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 47)

PL 216 190 B1

SEQ ID NO: 48 region VL MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2; DNA; sztuczna sekwencja

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTTTCTTTCTCGTTAITATCTGGCGTGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGAC

TTATAATTATCCTCCTACCTTTGGCCAGGGIACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG (SEQ ID NO: 48)

SEQ ID NO: 49 prot region VL MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencja

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFLSRYYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQIYNYPPTFGQGTKVEIRRT (SEQ ID NO: 49)

SEQ ID NO: 50 region VL MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1; DNA; sztuczna sekwencja

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTATGTTGATCGTACTTATCTGGCGIGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATITATGGCGCGAGCAGCCGT

GCAACTGGGGICCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGAT

TTATTCTTTTCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGIACG (SEQ ID NO: 50)

SSQ ID NO: 51 prot region VL MS-Roche#7,4H2 x 7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQYVDRTYLAWYQQKPGQAPRLLTYGASSR

ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQIYSFPHTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 51)

SEQ ID NO: 52 region VL MS~Roche#7.9H2 x 7,12 L2; DNA; sztuczna sekwencja

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGCGTTTTTTTTATAAGTATCTGGCGTGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTCTGGTTCTTCTAACCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCTTCAGCT

TTATAATATTCCTAATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGIACG (SEQ ID NO: 52)

SEQ ID NO: 53 prot region VL MS-Roche#7.9H2 x 7.12 L2; białko/1; sztuczna sekwencja

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRFFYKYLAWYQQRPGQAPRLLISGSSNR ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQLYNIPNTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 53)

SEQ ID NO: 54 region VL MS-Roche#7.9H4 x 7.12L2; DNA; sztuczna sekwencja

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGCGTTTTTTTTATAAGTATCIGGCGTGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTCTGGTTCTTCTAACCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCTTCAGCT

PL 216 190 B1

ITATAATATTCCTAATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGIACG (SEQ ID NO: 54)

SEQ ID NO: 55 prot region VL MS-Roche#7.9H4 x 7.12L2; białko/1; sztuczna sekwencja

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRFFYKYLAWYQQKPGQAPRLLISGSSNR

ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQLYNIPNIFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 55) ,

SEQ ID NO: 56 region VL of MS-Roche#7. 11H1 x 7.11L1; DNA; sztuczna sekwencja

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGCGTATTCTTCGTATTTAICTGGCGTGGTA

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTAIIAATTTATGGCGCGAGCAGCCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGGT

ITATTCTCCTCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG {SEQ ID NO: 56)

SEQ ID NO: 57 prot region VL M3-Roche#7.11H1 x 7.11L1; białko/1; sztuczna sekwencja

DIVLTQSPAILSLSPGERATLSCRASQRILRIYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR atgvparfsgsgsgtdftltisslepedfatyycqgvyspphtfgqgikve±krt (SEQ ID NO: 57)

SEQ ID NO: 58 region VL MS-Roche#7.11H1 x 7.2L1; DNA; sztuczna sekwencja

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTG

CGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTATGTTGATCGTACTTATCTGGCGIGGTA

PL 216 190 B1

CCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGT

GCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCC

TGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGAT

ITATTCTTTTCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG {SEQ ID NO: 58)

SEQ ID NO: 59 prot region VL MS-Roche#7.llHł x 7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQYVDRTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR ATGVPARESGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQIYSFPHTFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 59)

SEQ ID NO: 60 region HCDR3 MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2; DNA; sztuczna sekwencja

CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 60) SEQ ID NO: 61 prot region HCDR3 MS-Roche#3.6H5 x

3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencja

LTHYARYYRYFDV (SEQ ID NO: 61)

SEQ ID NO: 62 region HCDR3 MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2; DNA; sztuczna sekwencja

CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 62) SEQ ID NO: 63 prot region HCDR3 MS-Roche#3.6H8 x

3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencj a

LTHYARYYRYFDV {SEQ ID NO: 63)

SEQ ID NO: 64 region HCDR3 MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1;

DNA; sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTITGATGTT (SEQ ID NO: 64)

SEQ ID NO: 65 prot region HCDR3 MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja

GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 65)

SEQ ID NO: 66 region HCDR3 MS-Roche#7.9H2 x 7.12 L2; DNA; sztuczna sekwencja

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 66)

SEQ ID NO: 67 prot region HCDR3 #MS~Roche 7.9H2 x 7.12 L2; białko/1; sztuczna sekwencja GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 67)

SEQ ID NO: 68 region HCDR3 MS-Roche#7.9H4 :··

7.12L2; DNA; sztuczna sekwencja

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGIICGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 68)

SEQ ID NO: 69 prot region HCDR3 MS-Roche#7.9H4 x 7.12L2; białko/1; sztuczna sekwencja GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 69)

SEQ ID NO: 70 region HCDR3 MS-Roche#7. lilii x 7.11L1; DNA; sztuczna sekwencja

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCT7ATGGTTATGTTCGTTAITTTGATGTT (SEQ ID NO: 70)

SEQ ID NO: 71 prot region HCDR3 MS-Roche#7.11H1 x

7.11L1; białko/1; sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 71)

SEQ ID NO: 72 region HCDR3 MS-Roche#7.11H1 x 7.2L1; DNA; sztuczna sekwencja

GGTAAGGGTAATACTCAIAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 72)

SEQ ID NO: 73 prot region HCDR3 MS-Roche#7,11H1 x 7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja

GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO; 73)

SEQ ID NO: 74 region LCDR3 MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2;

DNA; sztuczna sekwencja

CAGCAGACTTAIAATTATCCTCCT (SEQ ID NO: 74)

SEQ ID NO: 75 prot region LCDR3 MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencja GGTYNYPP (SEQ ID NO: 75)

SEQ ID NO: 76 region LCDR3 MS-Roche#3.6H8 x 3.6D2; DNA; sztuczna sekwencja

CAGCAGACTTATAATTATCCTCCT (SEQ ID NO: 76)

SEQ ID NO: 77 prot region LCDR3 MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2; białko/1; sztuczna sekwencja QQTYNYPP (SEQ ID NO: 77)

SEQ ID NO: 78 region LCDR3 MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1; DNA; sztuczna sekwencja

CAGCAGATITATTCTTTTCCICAT (SEQ ID NO: 78)

SEQ ID NO: 7 9 prot region LCDR3 MS-Roche#7„4H2 x

7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

QQIYSFPH (SEQ ID NO: 79)

SEQ ID NO: 80 region LCDR3 MS-Roche#7.9H2 x 7.12

L2; DNA; sztuczna sekwencja

CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT (SEQ ID NO: 80)

SEQ ID NO: 81 prot region LCDR3 M3-Roche#7.9H2 x 7.12 L2; białko/1; sztuczna sekwencja LQLYNIPN (SEQ ID NO: 81)

SEQ ID NO: 82 region LCDR3 MS-Roche#7.9H4 x 7.12L2; DNA; sztuczna sekwencja CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT (SEQ ID NO: 82)

SEQ ID NO: 83 prot region LCDR3 MS-Roche#7.9H4 x 7.12L2; białko/1; sztuczna sekwencja LGLYNIPN (SEQ ID NO: 83)

SEQ ID NO: 84 region LCDR3 MS-Roche#7.11H1 x 7.11L1; DNA; sztuczna sekwencja CAGCAGGTTTATTCTCCTCCTCAT (SEQ ID NO: 84)

SEQ ID NO: 85 prot region LCDR3 M3-Roche#7.11H1 x 7.11L1; białko/1; sztuczna sekwencja QQVYSPPH (SEQ ID NO: 85}

SEQ ID NO: 86 region LCDR3 MS~Roche#7.11Η1 x 7.2L1; DNA; sztuczna sekwencja CAGCAGATTTATTCTTTTCCTCAT (SEQ ID NO: 86)

SEQ ID NO: 87 prot region LCDR3 MS-Roche#?.11H1 x 7.2L1; białko/1; sztuczna sekwencja OOIYSFPH {SEQ ID NO: 87)

PL 216 190 B1

SEQ ID NO: 88 region VH MS-Roche#7.9H7; DNA;

sztuczna sekwencja

Caggtgcaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgc gtctgagctgcgcggectccggaLttacctttagcagctatgcgatgagctgggt gcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggt actcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgata attcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggc cgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgtt cgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctca (SEQ

ID NO: 88)

SEQ ID NO: 89 prot region VH MS~Roche#7.9H7; białko/1; sztuczna sekwencja

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASG

TRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYV

RYFDVWGQGTLVTVSS {SEQ ID NO: 89)

SEQ ID NO: 90 region VL MS-Roche#7.9H7; DNA;

sztuczna sekwencja

Gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtg cgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggta ccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgt gcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccc tgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagat ttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacg (SEQ ID NO: 90)

PL 216 190 B1

SEQ ID NO: 91 prot region VL MS-Roche#7.9H7; białko/1 sztuczna sekwencja

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSR

ATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 91)

SEQ ID NO: 92 region HCDR3 MS-Roche#7.9H7; DNA; sztuczna sekwencja Ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt (SEQ ID NO: 92)

SEQ ID NO: 93 prot region HCDR3 MS-Roche#7.9H7; białko/1; sztuczna sekwencja

GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 93)

SEQ ID NO: 94 region LCDR3 MS-Roche#7.9H7; DNA; sztuczna sekwencja Cttcagatttataatatgcctatt (SEQ ID NO: 94)

SEQ ID NO: 95 prot region LCDR3 MS-Roche#7.9H7; białko/1; sztuczna sekwencja

LQIYNMPI (SEQ ID NO: 95)

Dalsze sekwencje ilustrujące są przedstawione w załączonych listach sekwencji i są także pokazane w załączonych tabelach, w szczególności w tabelach 1, 8, i 10

Ryciny przedstawiają:

_®

Rycina 1: Streszczenie sekwencji biblioteki HuCAL^®-Fab1

Numerowanie jest zgodne z VBASE za wyjątkiem przerwy w pozycji 9 VLX. W VBASE przerwa jest ustawiona w pozycji 10 (Chothia i wsp., 1992). W sumarycznym przedstawieniu sekwencji uwidocznione są wszystkie reszty CDR3, które były stałe. Odpowiednie sekwencje stosowane dla biblioteki HuCAL-Fab1 można znaleźć w załączonej liście sekwencji.

A: sekwencja aminokwasów B: sekwencja DNA _®

Rycina 2: Zobrazowanie wektora pMORPH^®18_Fab dla Fab

Mapa wektora i sekwencja DNA zawierająca miejsca restrykcyjne (R)

Rycina 3: Wektor ekspresyjny pMORPH^®x9_Fab dla Fab

Mapa wektora i sekwencja DNA zawierająca miejsca restrykcyjne

Rycina 4: Sekwencje rodzicielskich fragmentów Fab MS-Roche-3, MS-Roche-7 i MS-Roche-8 A: sekwencja aminokwasów B: sekwencja DNA

Rycina 5: Pośrednia immunofluorescencja płytek amyloidowych w ciętych na kriostacie skrawkach kory skroniowej człowieka. Płytki znakowano MS-R#3.2 Fab (górny panel) i MS-R#7.4 Fab (dolny panel) dla 20 μg/ml (lewe panele) i 5 μg/ml (prawe panele) ściśle przestrzegając warunków blokowania. Wiązanie MS-R Fab było ujawniane przy użyciu koziego anty-ludzkiego Cy3.

Rycina 6: Pośrednia immunofluorescencja płytek amyloidowych w ciętych na kriostacie skrawkach kory skroniowej człowieka. Płytki znakowano MS-R#3.3 IgG1 (górne panele) i MS-R #7.12 IgG1 (dolne panele) dla 0,05 μg/ml (lewe panele) i 0,01 μg/ml (prawe panele) ściśle przestrzegając warunków blokowania. Wiązanie przeciwciała MS-R IgG1 było ujawniane przy użyciu koziego anty-ludzkiego (H+L)-Cy3.

Rycina 7: Pośrednia immunofluorescencja płytek amyloidowych w ciętych na kriostacie skrawkach kory skroniowej człowieka przy użyciu przeciwciał po zakończeniu dojrzewania powinowactwa. Płytki znakowano MS-R#7.9H7 IgG1 (MAB 31, górny panel), MS-R #7.11.H1x7.2.L1 IgG1 (MAB 11, środkowy panel) i MS-R # 3.4.H7 (dolny panel). Używano przeciwciał w stężeniach 0,05 μg/ml (lewe panele) i 0,01 μg/ml (prawe panele) ściśle przestrzegając warunków blokowania. Wiązanie przeciwciała MS-R IgG1 było ujawniane przy użyciu koziego anty-ludzkiego (H+L)-Cy3.

Skala: 8,5 mm = 150 μm

Rycina 8: Badanie polimeryzacji. Przeciwciała anty-Αβ zapobiegają włączaniu biotynylowanego Αβ do wstępnie uformowanych agregatów Αβ.

PL 216 190 B1

Rycina 9: Badanie depolimeryzacji. Przeciwciała anty-Αβ indukują uwalnianie biotynylowanego Αβ z zagregowanego Αβ.

Rycina 10: Dekoracja in vivo płytek amyloidowych u podwójnie transgenicznej myszy po dożylnej iniekcji 1 mg MS-Roche IgG #7.9.H2x7.12.L2. Po trzech dniach mysz perfundowano buforem fosforanowym i zabijano. Obecność ludzkiej IgG związanej do płytek amyloidowych ujawniano przy użyciu mikroskopii konfokalnej, po wyznakowaniu ciętych na kriostacie skrawków kory czołowej koniugatem kozi anty-ludzki IgG-Cy3 (panel B). Te same skrawki, w celu uwidocznienia płytek amyloidowych, barwiono kontrastowo monoklonalnym mysim przeciwciałem anty-Abeta (koniugat BAP-2-Alexa488, panel A). Pokazano oddzielnie sygnały z kanałów czerwonego (panel B) i zielonego (panel A), połączony obraz (panel D) i kolokalizację.

Skala: 1 cm = 50 μm

Rycina 11: Dekoracja in vivo płytek amyloidowych u podwójnie transgenicznej myszy APP/PS2 po dożylnej iniekcji 1 mg MS-Roche IgG #7.9.H4x7.12.L2. Warunki doświadczalne i procedura barwienia były identyczne do tych opisanych w legendzie do Ryciny 10. Skala: 1,6 cm = 50 μm

Rycina 12: Dekoracja in vivo płytek amyloidowych u podwójnie transgenicznej myszy APP/PS2 po dożylnej iniekcji 1 mg MS-Roche IgG #7.11.H1x7.2.L1 (MAB 11). Warunki doświadczalne i procedura barwienia były identyczne do tych opisanych w legendzie do Ryciny 10.

Skala: 1,4 cm = 70 μm

Rycina 13: Dekoracja in vivo płytek amyloidowych u podwójnie transgenicznej myszy APP/PS2 po dożylnej iniekcji 2 mg MS-Roche IgG#7.9.H7 (MAB 31) w dniu 0, 3 i 6. Po 9 dniach mysz perfundowano buforem fosforanowym i zabijano. Obecność ludzkiej IgG związanej do płytek amyloidowych ujawniano przy użyciu mikroskopii konfokalnej po wyznakowaniu ciętych na kriostacie skrawków kory czołowej koniugatem kozi anty-ludzki IgG Cy3 (panel B). Te same skrawki, w celu uwidocznienia płytek amyloidowych, barwiono kontrastowo monoklonalnym mysim przeciwciałem anty-Abeta (koniugat BAP-2-Alexa488, panel A). Oddzielnie pokazano sygnały z kanałów czerwonego (panel B) i zielonego (panel A), połączony obraz (panel D) i kolokalizację. Skala: 1,6 cm = 80 μm (panele A, B, C); 1,0 cm = 50 μm (panel D)

Rycina 14: Dekoracja in vivo płytek amyloidowych u podwójnie transgenicznej myszy APP/PS2 po dożylnej iniekcji 2 mg MS-Roche IgG #7.11.H1x7.2.L1 (MAB 11) w dniu 0, 3 i 6. Warunki doświadczalne i procedura barwienia były identyczne do tych opisanych w legendzie do Ryciny 13.

Skala: 1,6 cm = 80 μm

Rycina 15: Analiza wiązania przeciwciał anty-Αβ do APP na powierzchni komórek. Wiązanie przeciwciał do ludzkich komórek HEK293 transfekowanych APP i nietransfekowanych komórek kontrolnych analizowano przy pomocy cytometrii przepływowej.

Przykłady ilustrujące wynalazek.

P r z y k ł a d 1: Konstrukcja i skrining biblioteki ludzkich kombinatorycznych przeciwciał (HuCAL^®-Fab 1)

Klonowanie HuCAL^®-Fab1 _®

HuCAL^®-Fab1 jest biblioteką całkowicie syntetycznego ludzkiego modularnego przeciwciała _® w formacie fragmentu przeciwciała Fab. HuCAL^®-Fab1 zostało zgromadzone poczynając od biblioteki dla ®_ przeciwciała w formacie pojedynczego łańcucha (HuCAL^®_scFv; Knappik, (2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86).

_®

Pozycje 1 i 2 VX. Oryginalne HuCAL geny główne były skonstruowane z ich autentycznymi

N-końcami: VLX: QS (CAGAGC), VLX2: QS (CAGAGC) i VLX3: SY (AGCTAT). Sekwencje zawierają_® ce te aminokwasy pokazano w WO 97/08320. Podczas konstruowania biblioteki HuCAL^® pierwsze dwa aminokwasy były zmienione na DI w celu ułatwienia klonowania biblioteki (miejsce EcoRI).

_®

Wszystkie biblioteki HuCAL zawierają geny VLX z miejscem EcoRV GATATC (DI) na końcu 5'.

_®

Wszystkie geny HuCAL^® kappa (geny główne i wszystkie geny w bibliotece) zawierają DI na końcu 5' (rycina 1A i 1B).

PL 216 190 B1 _®

Pozycja 1 VH. Oryginalne HuCAL^® geny główne były skonstruowane z ich autentycznymi

N-końcami: VH1A, VH1B, VH2, VH4 i VH6 z Q (=CAG) jako pierwszym aminokwasem a VH3 i VH5 z E (=GAA) jako pierwszym aminokwasem. Sekwencje zawierające te aminokwasy pokazano w WO _®

97/08320. W czasie klonowania biblioteki HuCAL^®-Fab 1 aminokwas w pozycji 1 w VH był zmieniony na Q (CAG) we wszystkich genach VH (ryciny 1A i B).

Projektowanie bibliotek CDR

Pozycja 85 Vk1/Vk3. Ponieważ do wprowadzenia biblioteki CDR3 użyto procedury mutagenezy kasetowej (Knappik, (2000), w miejscu już cytowanym), pozycją 85 Vk1 lub Vk3 może być albo T albo V.

_®

W ten sposób, podczas konstruowania biblioteki HuCAL^®-scFv1, pozycja 85 Vk1 i Vk3 może różnić się w następujący sposób: oryginalny Vk1, 85T (kodon ACC); biblioteka Vk1, 85T lub 85V (kodony TRIM ACT lub GTT); oryginalny Vk3, 85V (kodon GTG); biblioteka Vk3, 85 T lub 85 V (kodony TRIM ACT lub GTT); to samo dotyczy HuCAL^®-Fab 1.

Projektowanie CDR3. Wszystkie stałe reszty CDR3 są wykazane na rycinie 1A i B.

Długość CDR3. Projektowany rozkład długości CDR3 jest następujący. Reszty, które różniły się są pokazane w nawiasach (x) na rycinie 1. V kappa CDR3, 8 reszt aminokwasów (pozycja 89 do 96) (okazjonalnie 7-10 reszt) z ustalonymi Q89, S90 i D92; i VH CDR3, reszty aminokwasów 5 do 28 (pozycja 95 do 102) (okazjonalnie 4-28) z ustalonym D101.

HuCAL^®-Fab1 klonowano do fagmidowego wektora ekspresyjnego pMORPH^®18_Fab1 (rycina 2). Ten wektor zawiera fragment Fd z sygnałową sekwencją phoA połączoną na końcu C ze skróconym białkiem genu III filamentu faga i dalej zawiera lekki łańcuch VL-CL z sekwencją sygnałową ompA.

Oba łańcuchy są pod kontrolą operonu lac. Stałe domeny Ci Ck i CH1 są syntetycznymi genami _® w pełni zgodnymi z modularnym systemem HuCAL^® (Knappik, (2000), w miejscu już cytowanym).

Cały łańcuch VH (fragment Munl/Styl) był zastąpiony przez niemy fragment 1205 bp, zawierający jednostkę transkrypcji β-laktamazy (bla), ułatwiając tym następne etapy przygotowywania fragmentu wektora i pozwalając na wybór usunięcia kompletnego VH.

Po zastąpieniu VH, VLi było usunięte przez EcoRI/Dralll a VLk przez EcoRI/BsIWI i zastąpione fragmentem (1420bp) genu fosfatazy alkalicznej (bap). Jako że zmienność lekkich łańcuchów jest mniejsza niż ciężkich łańcuchów, klonowanie rozpoczęto od bibliotek łańcucha lekkiego. Biblioteki lekkiego łańcucha VLi i VLk zróżnicowane w L-CDR3, które zostały stworzone dla biblioteki _®

HuCAL^®-scFv (Knappik, (2000), w miejscu już cytowanym) były także używane do klonowania HuCAL^®-Fab1. W przypadku i składały się one ze zrębu HuCAL^® i1-, i2- i i3- i miały całkowitą zmienność 5,7x10⁶. Fragmenty VLi były amplifikowane przez 15 cykli PCR (polimeraza Pwo) ze starterami 5'-GTGGTGGTTCCGATATC-3' (SEQ ID NO: 28) i

5'-AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGTTA-3' (SEQ ID NO: 29). Produkty PCR trawiono EcoRV/Dralll i oczyszczano na żelu. W przypadku biblioteki VLi, niemy bap usuwano z biblioteki wektora. 2 μg oczyszczonego na żelu wektora ligowano z trzykrotnym molarnym nadmiarem łańcuchów VLi przez 16 godzin w 16°C i mieszaninę ligacyjną elektroporowano do 800 μl komórek E. coli TOP10F (Invitrogen) otrzymując razem 4,1x10⁸ niezależnych kolonii. Transformanty amplifikowano około 2000-krotnie w 2xYT/1% glukoza/34 pg/ml chloramfenikol/100 pg ampicylina, zbierano i przechowywano w 20% (w/v) glicerolu w -80°C.

_®

Biblioteka k zawiera k 1-, k 2-, k 3- i k 4- HuCAL^® geny główne z całkowitą zmiennością 5,7x10⁶. Łańcuchy VLk zostały otrzymane przez restrykcyjne trawienie EcoRV/BsIWI i oczyszczenie na żelu. W przypadku biblioteki VLk, nieme bap usuwano z biblioteki wektora przy użyciu EcoRV/BsIWI. 2 μg oczyszczonego na żelu wektora mieszano z 5-krotnym molarnym nadmiarem łańcuchów VLk. Ligację i transformację do komórek E. coli TOP10F (Invitrogen) przeprowadzano tak jak opisano dla łańcuchów VLi, otrzymując w sumie 1,6 x 10⁸ niezależnych kolonii.

Przygotowano DNA bibliotek dwóch lekkich łańcuchów i nieme bla usuwano przy użyciu Munl/Styl, _® wytwarzając w ten sposób dwa wektory dla wstawek sub-bibliotek VH. Bibliotek VH HuCAL^®-scFv używano do wytwarzania HuCAL^®-Fab1. Biblioteki VH HuCAL^®-scFv składają się z genów głównych VH1A/B-6 zróżnicowanych w dwóch kasetach trójnukleotydowych bibliotek VH-CDR3, różniących się oddzielnie w długości CDR3 i każda biblioteka VH łączyła się z biblioteką VLk i biblioteką VLi. Dla wytworzenia DNA _®

HuCAL^®-Fab1 z tych bibliotek VH, był on otrzymywany przy zachowaniu oryginalnej zmienności. DNA trawiono Munl/Styl i oczyszczano na żelu. 5-krotny molarny nadmiar łańcuchów VH ligowano z 3 μg wektora biblioteki VLk przez 4 godziny w 22°C. Mieszaninę ligacyjną elektroporowano dla każdego wektora do

1200 μl komórek E. Coli TOP10F (Invitrogen) otrzymując w sumie 2,1 x 10 niezależnych kolonii. TransPL 216 190 B1 formanty były amplifikowane około 4000 krotnie w 2 x YT/1%glukoza/34 μg/ml chloramfenikol/10 μg/ml tetracyklina, zbierane i przechowywane w 20% (W/v) glicerolu w -80°C.

W celu kontroli jakości, lekki łańcuch i ciężki łańcuch z pojedynczej kolonii sekwencjonowano odpowiednio z 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEQ ID NO: 30) i 5'-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3' (SEQ ID NO: 31).

Uwalnianie fagmidu, amplifikacja i oczyszczanie faga _®

HuCAL -Fab1 amplifikowano w pożywce 2 x YT zawierającej 34 μg/ml chloramfenikolu, 10 ąg/ml tetracykliny i 1% glukozę (2 x TY-CG). Po infekcji pomocniczym fagiem (VCSM13) w 37°C i OD₆₀₀ około 0,5, odwirowaniu i ponownym zawieszeniu w 2 x TY / 34 μg/ml chloramfenikolu / 50 μg/ml kanamycyny komórki hodowano przez noc w 30°C. Fagi strącano z supernatantu PEG (Ausubel, (1998), Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc., New York, USA), ponownie zawieszano w PBS / 20% glicerol i przechowywano w -80°C. Amplifikacja faga między dwoma cyklami panoramowania była przeprowadzana następująco: komórki TG1 fazy mid-log infekowano eluowanym fagiem i umieszczano na agarze LB uzupełnionym 1% glukozą i 34 μg/ml chloramfenikolu. Po inkubacji przez noc w 30°C, kolonie zbierano, doprowadzano OD600 do 0,5 i dodawano fag pomocniczy tak jak to opisano powyżej.

P r z y k ł a d 2: Panoramowanie w fazie stałej

Płytki mikrotitracyjne (Wells Maxisorp™ microtiterplates F96 (Nunc)) były pokryte 100 μl 2,5 mM ludzkiego peptydu Αβ (1-40) (Bachem) rozpuszczonego w TBS zawierającym NaN3 (0,05% v/v). Zamknięte płytki inkubowano w 37°C przez 3 dni, podczas których peptyd był skłonny do agregacji na płytce. Po zablokowaniu 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku w TBS, dodano 1-5 x 10¹² oczyszczo_® nego tak jak powyżej faga HuCAL^®-Fab na 1 h W 20°C. Po kilku etapach przemywania, związane fagi eluowano przy użyciu pH-elucji 500 mM NaCl, 100 mM glicyny o pH 2,2 i następnie zobojętniano 1 M TRIS-Cl o pH 7. Wykonano trzy cykle panoramowania z amplifikacją faga przeprowadzoną między poszczególnymi cyklami, jak to opisano powyżej, ograniczenie przemywania wzrastało w kolejnych cyklach.

P r z y k ł a d 3: Subklonowanie wybranych fragmentów Fab w celu ekspresji _®

Kodujące Fab wstawki wybranych fragmentów HuCAL^®-Fab subklonowano do wektora ekspre_® syjnego pMORPH^®x7_FS dla ułatwienia szybkiej ekspresji rozpuszczalnego Fab. Preparat DNA wy_® branych klonów HuCAL^®-Fab był trawiony Xhal/EcoRI, w ten sposób wycinano kodujące Fab wstawki (ompA-VL i phoA-Fd). Subklonowanie oczyszczonych wstawek do ciętego Xbal/EcoRI wektora _® pMORPH^®x7, poprzednio niosącego wstawki scFv doprowadza do projektowanego wektora ekspre_® syjnego Fab pMORPH^®9_Fab1 (rycina 3). Fab-y podlegające ekspresji w tym wektorze niosą dwa tagi C końca (FLAG i Strep) w celu detekcji i oczyszczania.

P r z y k ł a d 4: Identyfikacja fragmentów Fab wiążących Αβ przy użyciu ELISA

Płytki mikrotitracyjne (Wells Maxisorp^TM microtiterplates F384 (Nunc) były pokryte 20 μl 2,5 μΜ ludzkiego peptydu Αβ (1-40) (Bachem) rozpuszczonego w TBS zawierającym NaN3 (0,05% v/v). Zamknięte płytki inkubowano w 37°C przez 3 dni, podczas których peptyd jest skłonny do agregacji na płytce. Ekspresja konkretnego Fab była indukowana 1 mM IPTG przez 16 h w 22°C. Rozpuszczalny Fab ekstrahowano z E. coli przy zastosowaniu Iizy BEL (kwas borny, NaCl, EDTA i bufor o pH 8 zawierający lizozym) i stosowano w ELISA. Fragment Fab wykrywano koniugatem koziego przeciwciała anty Fab z fosfatazą alkaliczną (Dianova/Jackson Immuno Research). Odczytywano po dodaniu substratu fluorescencyjnego AttoPhos przy fali wzbudzenia 340 nm i fali emisji 535 nm (Roche Diagnostics).

P r z y k ł a d 5: Optymalizacja fragmentów przeciwciała

W celu optymalizacji powinowactwa wiązania wybranych fragmentów przeciwciała wiążących Αβ, pewne fragmenty Fab, MS-Roche-3 (MSR-3), MS-Roche-7 (MSR-7) i MS-Roche 8 (MSR-8) (rycina 4) były używane do konstruowania biblioteki fragmentów przeciwciał Fab przez zastąpienie rodzicielskiego łańcucha VL k3 przez pulę wszystkich łańcuchów kappa k1-3 charakteryzujących się zróż_® nicowaniem w CDR3 z biblioteki HuCAL^® (Knappik i wsp., 2000).

(R)

Fragmenty Fab MS-Roche-3, 7 i 8 klonowano poprzez Xbal/EcoRI z pMORPH^®x9_FS do pMORPH^®18. Wektor oparty na fagmidzie zawiera fragmenty Fab do wytworzenia pMORPH^®18_Fab1 _® (rycina 2). Pula łańcucha kappa była klonowana do pMORPH^®18_Fab1 poprzez miejsca restrykcyjne

Xbal/Sphl.

PL 216 190 B1

Efekty optymalizacji biblioteki Fab badano przez panoramowanie przeciwko zagregowanemu ludzkiemu peptydowi Αβ (1-40), którym pokryte jest stałe podłoże tak jak to opisano to w przykładzie 2. Optymalizowane klony identyfikowano poprzez ranking według stałych dysocjacji w badaniu Biacore, tak jak to opisano w przykładzie 8. Optymalizowane klony MS-Roche-3.2, 3.3, 3.4, 3.6, 7.2, 7.3, 7.4, 7.9, 7.11, 7.12, 8.1, 8.2 były następnie charakteryzowane i wykazano polepszenie powinowactwa i biologicznej aktywności w porównaniu do wyjściowego fragmentu MS-Roche-3, MS-Roche-7 i Ms-Roche-8 (rycina 4). Wymienione CDR-y odnoszą się do opartego na konsensusie genu przeciwciała _®

VH3kappa3 HuCAL^®. Fragment Fab MS-Roche-7.2 otrzymano poprzez klonowanie HCDR3 rodziciel_® skiego klonu MS-R7 do biblioteki HuCAL^®-Fab, przenosząc zróżnicowanie we wszystkich 6 regionach, przy użyciu procedury projektowania identycznej do tej dla kaset CDR3 opisanej w Knappik i wsp., 2000. Kasety biblioteki zaprojektowano tak, aby odpowiadały znanemu naturalnemu rozkładowi aminokwasów i towarzyszącej temu koncepcji kanonicznej konformacji CDR ustalonej przez Allazikani _® (Allazikani i wsp., 1997). Jednak w przeciwieństwie do genu głównego HuCAL^®, klon MS-Roche 7.12 zawiera aminokwas S w pozycji 49 łańcucha VL (patrz tabela 1).

Optymalizowane Fab-y, po pierwszym cyklu dojrzewania powinowactwa, wykazują polepszenie charakterystyki w stosunku do wyjściowych klonów MS-Roche-3, MS-Roche-7 i MS-Roche-8 (Rycina 4). Powinowactwo wiązania dojrzałych Fab-ów do Αβ 1-40 i Αβ 1-42 było znacznie zwiększone i osiągało wartości KD w zakresie 22 - 240 nM w porównaniu do wartości 850 - 1714 nM dla rodzicielskich klonów (tabela 3). Immunohistochemiczna analiza płytek amyloidowych w skrawkach mózgu pochodzących od ludzi z chorobą Alzheimera, także pokazuje znaczący wzrost wybarwionego profilu dojrzałych klonów, tj. otrzymano lepszy stosunek sygnału do tła i dodatnio wyznakowane płytki wykrywano przy względnie niskich stężeniach dojrzałych Fab-ów (Rycina 5).

W celu dalszej optymalizacji, regiony VH CDR2 i regiony VL CDR1 zestawu fragmentów przeciwciał pochodzących od L-CDR3 optymalizowanych MS-Roche-3, -7 i -8 (tabela 1; rycina 4) optymalizowano stosując mutagenezę kasetową, używając trójnukleotydowo ukierunkowanej mutagenezy (Virnekas i wsp., 1994). Tak więc oparta na trójnukleotydzie kaseta HCDR2 i oparta na trójnukleotydzie kaseta LCDR1 były skonstruowane przy użyciu procedury projektowania identycznej z tą dla kaset CDR3 opisanej w Knappik i wsp., 2000. Kasety biblioteki zaprojektowano tak, aby odpowiadały znanemu naturalnemu rozkładowi aminokwasów i towarzyszącej temu koncepcji kanonicznej konformacji CDR ustalonej przez Allazikani (Allazikani i wsp., 1997). Protokół użyty do optymalizacji wybranych początkowo fragmentów przeciwciał mógłby naśladować proces dojrzewania powinowactwa poprzez somatyczną hipermutację, obserwowany podczas naturalnej odpowiedzi immunologicznej.

Otrzymane biblioteki przeszukiwano oddzielnie, tak jak opisano powyżej, co doprowadziło do optymalizacji klonów w regionie H-CDR2 lub w regionie L-CDR1. Wszystkie klony były identyfikowane jak powyżej, na podstawie poprawy stałych dysocjacji wobec włókien Αβ 1-40 po rankingu według stałych dysocjacji w Biacore. Wykazano poprawę powinowactwa albo do Αβ 1-40 albo do Αβ -42 albo do obu w porównaniu do odpowiedniego rodzicielskiego klonu (Tabela 3). Tabela 1 zawiera charakterystyki sekwencji rodzicielskich, a także sekwencje optymalizowanych klonów. Wymienione CDR-y odnoszą się do opartego na konsensusie genu VH3kappa3 przeciwciała HuCAL^®.

Na przykład powinowactwo rodzicielskiego Fab MS-Roche-7 skierowanego ku Ab 1-40 było polepszone ponad 35-krotnie z 1100 nM do 31 nM po optymalizacji L-CDR3 (MS-Roche-7.9) i dalej polepszone do 5 nM po optymalizacji H-CDR2 (MS-Roche-7.9H2) jak to zilustrowano w Tabeli 3.

Procedura optymalizacji H-CDR2 i L-CDR1 nie tylko zwiększa powinowactwo ale także powoduje u pewnych klonów znaczącą poprawę znakowania płytek amyloidowych w skrawkach mózgu pochodzących od chorych z AD, szczególnie jest widoczne dla MS-Roche 7.9H2 i 7.9H3.

PL 216 190 B1

Tabela

ίΌ tó ¢3 O tn

> Ο X OT X OT OT § TC X Η

O Ił OT OT ot OT OT p£ OT TC X J=L

O jj OT & >* >- g OT TC X d

G Ul OT Cd OT >1 Cd *ΐ OT tc X

> G ot TC ot § ot TC X

> Q Ęł cd i cci >

2> α Eł > cd >< >1 X £-.j

> α £» A1 Cd >h >- Pd < >4 X

α Ił >’ •d > >i s

> ta Ul oi > > < >* X H u3

£> >* X > iw g> £H tJ

> P X >4 X >4 >4 X e£ Im X 5th P

> 0 Ul X X >4 >4 X H d

O X >, X >- Jm OC < > tu 5

> C! Ul >· X >« >4 5 X S

δ X >4 X > X < Λ1 X E- X

> Q iw X Tw s OT X OT dJ

LTHYARYYRYFD^ j

> 0 OT >4 OT OT OT g OT X OT

> P OT OT OT d < OT X OT OT

> 0 OT OT X OT g OT X OT A

> Q OT OT OT OT OT g OT X OT A

> O OT OT PC OT X < >4 X OT

> Q OT OT X OT OT s OT in OT .0

CS OT OT X X >4 X *w

X Gd α o 1 X

0 id > w Cł < OT OT TC 0 0 cg 0 cg H

0 id > CO Q < >4 OT En tG O O ω V cg X <

u Nj > TC £ >1 OT X TC 0 0 cg O tc H *fi

0 > tg o < ot OT X tg O O tg e tg w

U Td > 10 ca ot OT X co 0 O to o co μ

c co P <c f- CG O O tg O co ł-H i£

O y; > to 0 < >* c-« O O i? CO 0 CO H «;

tg k< > co 0 < >< w Z >4 (? X W co ! -i «Ϊ

<0 id > co >4 £, Im O O cd O cg w <

13 X > CO Q < >4 >? H Im X CO P3 tg ł-4 >

O X ćg α < >t >4 fcd >4 O tg Js3 O‘ to I-I ;>

> <0 Ci c >4 >4 Wl X Łj O O to I-i

?3 id t> co 0 fi >4 >4 ki X H u: Eh fcd to W

id > co ca >4 >4 E-« X C0 1 0 X i>

0 id > OT O a X M X X O E-* O OT M

O Łd > OT O a > I-I x s O E-4 X OT H #*

0 X > OT Cl a OT Hł 3 0 > O CO OT

e X OT OT C cf, OT OT C-i OT 3i 0 OT OT OT H <

0 OT Cl OT OT M i 0 OT fci OT OT

0 X > co Q < OT OT id X od 0 X ω to w <

e to 0 < OT OT id § co co ul co

0 id > TC 0 < OT OT id 0 X 0 TC OT TC IW *T

0 OT TC O OT OT w OT OT CO Ul OT TC OT

0 X > TC Q < OT OT w TC O 0 O TC M >

C X T> cg c < OT OT h-c OT X Ó OT ΪΛ OT sT

r- o Cb

3s

&

2-:

Sf

)£

2

3!

s

s

s

2

2

&

Ss

!5

a

S

is

s

S

X C3 O ł 3?

co § OT TC tc OT X OT Π

<0 OT cg to Ił e cg

cg i OT cg cg OT X OT Q

co § OT co tg Ił OT V

co § OT TC co TC X TC Φ

co £ rf Im cg cg U? Pu

CO co co &Ł Eh Cm s?

CO co co Cu Eh iM '11?

W s co to Ul D

CO B co co X e Π

co § >4 CO co Ul ε co

to £ co co fr* X n

ŁO >4 to to X ε (Π

co 2; cli >4 to to X £ i f)

CO § >» to OT X E CC

OT S > OT OT X £ OT

cg OT OT OT X E OT

OT 2 < OT OT OT X X OT OT

co £ rf OT CO co OT OT OT 0

to OT tg to X E rn

TC OT TC TC OT OT !n.

TC OT TC TC OT E CO

TC 2 < OT TC TC OT OT OT rn

TC OT TC TC OT OT X ro

co OT TC CO OT X OT ć!)

m αί O o 1

> eu OT OT > 0 Ά

OT P- > cg OT > O 0

CU TC >1 to ot μ O Ą

tu TC OT co cg 2 0 -ffi

CU CU OT Q OT X ?T

fu fU >* c > t-l O S?

CU ru >< Zn >< α Ω

CU ŁU > <0 I- K 0 Q

CU Cł; >« fO ί* M CU i?

X X >-* CO to X α S?

X X >< co co 2 O

X X UJ co 2 α pq

X X > Q >' E-4 O

X X >4 α >« 6-4 O Q

X X >4 0 >4 8 0

X X > >1 Eh O OTi

X X OT Q OT OT O O

X X OT Ci OT 5 n

Pi X OT α OT OT α o

(U X OT O OT OT O Ci

X X OT O OT OT σ n

X X OT O OT OT 2 W3

X X >' 0 OT OT O <\

X X OT O OT OT O <*

X X OT □ OT X R

OT> ω « o α

>

X

>

>

X

i-·

>

>

>

>

>

Eh

ε·Η

OT

&H

OT

OT

Eh

f-t

OT

OT

X

X X O CJ 1 X

X s cg co Jl

X < OT <g cg < £L

X s TC co

X < cd tg co < SP

X tg co d&

s£ £Ł cg CG Λ O

co to <

Eh s co Ui < <?

cg 01 < n

§ X <g co < co

£-4 a tg *ΐ ίΠ

s X CO co < co

H a <0 tg SP

s co to < n

X f£ X OT OT < CG

B CO CO OT

OT X W OT < ?g

OT OT OT rt cg

OT i CO CO <

OT 3 to to .< cg

OT g TC TC < (!)

OT X TC TC <

OT 3 TC CO TC

cg TC ro

£4 s TC TC < O

σ U= tJ O IX

>1

OT

OT

OT

OT

>

>

>·

Im

Iw

>4

OT

OT

OT

OT

OT

OT

OT

OT

OT

t—t X α u X

5 ot tg cg cg > w α tg i

s ot cg cg to > tg Ο» tg 2

5 >« cg w to > co 0 cg Ś

< X U< cg tg tg > tg 0 cg s

3 OT to co cg > co 0 to *4 R

<c >4 >4 CG tg cg > cg α to

s >< co CO co > to 01 to $

< »4 co to tg i> to O σι s

3 >4 CO co co > co σ to *5 ΡΊ

5 >· cg co co > tg α co

> cg to tO > to 0 to ri X

< ~3 >4 CO co co có α co

a >4 tg tg tg tó O to < d

3 W co to to > co 0 ;o 3

a OT OT OT »> OT Ol OT < nr

3 Tm CO CO OT > OT Ot OT 3

*ΐ OT OT OT OT OT O OT <

Cl OT OT OT OT > OT O OT 3

3 OT CO CO co > co 0 co 3

a OT co to CO > to 0 tg ft.

?£ X >4 TC TC TC > co σ TC

OT TC TC TC > to O TC fYj

3 OT TC TC TC > TC O TC 3

< .-1 OT TC TC > cg 0 TC a

< OT TC TC TC CO O TC 3

Ή f“» U Γ-ί «3 +3 ιο •9 π <0 φ G <3 Gj' 2r ·ν Ν <tf π3 -Μ S

n-> Φ t> 0 Ρί TC 2

cn =*n '1' xi <j 0 PS t cg 2

CM po cy d3 υ 0 oś i tg s

Π * Φ X u Q TC tg 2

’Ν’ =»= X? 'J O CO 2

<-«0 rg * & Λ υ o os tg X

t£> m 4fc S) U 0 ci co X

X <N ro * Φ Χί O 0 X <0 2

r\j X c\ ΓΟ =*s Φ ,c1 U 0 X to

r—4 X to ng 3k O .4 O O i to 2

e·; X fO n 4t= Φ Λ u 0 X co 2

σ X ro to w 05 x; υ o d w s

X •ςτ Π0 «*5 01 x: c 0 X tg 2

CM □3 •T cO 4?- Φ X3 O O X OT 2

n X TT Γ0 Φ Λ U Ó X OT 2

T X OT a> X υ 0 X OT 2

ϋ3 X H? CC 3*.- Φ X U O X OT 2

<0 X •ϊΓ OT 4tr GS X U O cd OT 2

r-' X «34 fO cy „ci 0 0 d « to

co X -5f ro ¢- c· O X CO

σ X PO 4* CD dl O 0 X TC 2

O r-i X tt CO =#: ω AJ 0 0 ώ f co S

TC ,-ł «Τ TC OJ d 0 X TC TC

X TC HT TC! Φ υ G X to £

no TC *3· PO * Φ TCJ q X i TC £

PL 216 190 B1

> Ω U A- >4 X Η Π] e x Η- ω X Α- Χ o o te W co w «Ł

> o X >4 X CM A s Α- Χ ε- πί

> n U X > >4 X < > H

> n U A- Ci A- A·· S :m X H X

> ΰ U > Pi A< ΪΗ g > X Ei A

Ω U >* 03 Al Α- Χ i Α- Χ Em ,.q

> C3 Ifc p: >-. > s Am CH

> « X >4 g Λ4 X Hf

> Ω Eu >4 X >4 >4 g >4 X IH HI

> Ω tu >4 X >M >4 >4 Ή H Hi

> Ω U >4 X Am >4 X < >4 rC £m

s u >4 X >4 >4 g >4 X X , 1

> o u X >M >4 >4 X H

> Ω U >4 X >4 >4 X >4 X &M H3

n u >4 X >4 >4 X < >4 X Em HI

> c u > X >4 >< < Am X ΪΜ HI

> Ω U >4 X Am Am X C-4

ί> Ω f*l >M X > >M C3 >M X U X Em s D ro

> Ω U Am te > >4 C3 >+ X te ffi 5ς G te n

> Q U Α- Χ > >4 £ >4 X te Hi H G te ro

> Ω U > te > > e Am X te G te co

> Ω U te X > te 13 te X te £E H E 13 te FD

> Ω U te g te 13 £< X XJ Fm E 13 U 13

> Q U >4 X > te 13 te X Ad X Fm E te u te

> Q U >-· X > Am 13 >’ X X Ή X E 13 Ad ro

n u >4 X i o A-i X X X &4 2: 13 X fi

> p A* X > >1 13 >4 X X te £m E 13 X fi

> Ω >4 X >4 13 Α- Χ X X Η E O X 11

13 X > te a *£ A« > w > 13 01 w to W <

13 X > te Ω < >M A- H U O w to PM niL

13 «3 > te Ω a >4 >—i § 8 te ł-i j3L

o X > to Ω a » t- CO O 13 to O to )-M 2&

o co O c >M Am Ε» CO O O CO 13 CO H £.

<5 > to Q £ >· Em to <3 to co o to w

O X > CO Ci 5 >M >4 Em W L? to CO O CO ł~M <£.

O X > CO Ω S >- >4 W Am O o co X co M SL·

O X > co 9 1-3 >4 >M Em X M O X Ή X M >

O X V-* to Ω < >4 >M W U X o fc-t &3 <•0 M ϊ>

o X > CO Ω < >M >M W X X o X u w Cd

O X > to Q < >- >4 &« X CO co X co n rf;

O X > to Ω a >4 H Z EM O X Hf to

O X > <0 Q a £ u X co >4 Łx3 CO W <

13 £ > CO Ω < >- >m Em CO O 13 CO O co t-M

co > to α a >4 EM co D C3 co o co H

O te > to α < >M AM &M to O o co o to M cT

o te > to Ω >4 >4 Em 00 U 13 CO C3 CO Hi ff

O te > co Ω <3 >M >4 to O o to o to H «Τ

o te > Cfi Ω < Am Am CO O O co CO CO w <r

> te Ω te Em te O 13 co O te n i-f

13 > te Ω r£ te te X te O 13 te <3 te H p£

13 X > te Ω fi te te X co te te te o co H <f

13 % te Q Ah >4 X te 13 13 te O te M rf

13 X > te Ω < Am Am &4 te 13 13 te 13 te H

13 £ te Ω < ?M A* Fh te 13 13 te 13 te H

(3 X > co O a >4 Em te 13 13 co 13 te H

&

2e

&

&

&

&

&

2S

Ss

as

£

s

Σ3:

£

S

2

s

S

S

3c

£

SC

SC

CO

to

CO s

to s

CO X

CO

co

to §

co §

CO

to

co

co §

to

CO

to

CO

CO

CO

to §

to §

te

rO

te

te

te

te

te

> ro co X Ł -AL

>4 to to tu H U -Ll

Am to to u £ -Ł2.

A< to te U H U -L2.

>4 CO co U Em U -&

>M co to U Em Łu C,J>

>ł co to H lu Ί?

>4 CO to fu E·, Eu JŁ

> CO co Eu ε -U,

>4 co co Cli Ui y

>4 <0 to H U

>4 CO co u K ro

>4 to co u &

<o CO U £4 U V

>4 co CO U &M U ś!?

>4 co co E-« u O

>4 to CO u Em U to

>- CO co U e co

>4 to co u £ ro

a co Oi tu Ęm ΓΠ

te co ro U fc rn

te te te u H U te

te te te U Em U (3

>4 te te u u te

>4 te te U X U

s te te X Em U '1

Am te te U e-< u

A- te te U £

X X >1 Q EH α JX

X fu A- Ω A- s XL

X CU 5m Ω JM & 2Ł

X X 5* O Α-< H O> -OL

Du Cu α H α

0-1 X H O >4 E O -CL

CU CU >ł Cł rM JBl

cu Pi >ł O > Em Of -SX

X X >4 Em O -CL

u u £ Em O £L

X X >4 Ξ > &M Of Λ

X X >4 X >4 s -OL

Pi X >4 p- α r*

X X >4 z Am Fm α fi*

X X >4 s >4 Em 8

X X >4 z Am Em O m

Cu X >4 g Em O! rv

U Pi « CO >4 H3 C> h

X co CO ΪΜ HI Ol pr

X X u CO >- H O tor

U X ffi CO te > o

X X u X te H 8

U X te te te X

>4 X X te >4 HI O

u X <£ te £ Qt

H X U te > O

H P4 £ E A* HM cx

HwL X X X E > O

(H

H

£~f

h

Em

IH

Em

>

>

>

>

>

>

>

>

>

Em

>

H

>

>

H

>

H

>

ΪΜ

L· a

s Ci

{H *C 03

&·* s

H ci

Fm a

EH $

Em g

Em g

i

Em g

Fm g

Em lit

Em

E_, Ź

frM s

i

i

H Ź

Fm g

Em i

a

-

H g

H §

H

Η

<0 -U

CO co < -J£

te to < -ŁŁ

UJ to < φ

to to hu

to to < Λ2.

VI C3 < <,7

σ} CO < CD

co co < -i2

co to < J2

CO to

co co *£

co ro < W

co co

CO

co CO < £0

co co < ro

ro co < ro

to to c fO

CO co f£ rn

CO te fi te

co co te

te co *£ te

te te < te

X te CO <

co co a

X to te co

X te te

>«

a-

>-i

>*

>4

>-f

>M

>4

>4

>4

>4

>-

Am

>«

>4

>4

>4

te

te

Am

>4

>

-HX

a Am to CO co > co α CO

HI Am to CO CO > 00 α co &

a to to to J> to O to A

s >M CO co CO > te O to

< HI SH u pi o H W o co ii

< J >4 CO X £-* M s O to J.

a >· >« > X H X X to JŁ

< h3 >M a o 3 o co

6C HI >4 CO to co > co O co

< H Am CO co co > to O co Λ

H| >· to to to > to o to J.

a >4 co CO to > co α co i

a >M CO co co > co o co F

a Am CO co co > co O co a

3 CO co co > co o

O HI >4 U X o s-i u o σ} <=C

pC HI A-t >4 X co U U o to a

5 >4 CO co i co Oi co < X

a >4 CO CO co > co Ol co $

< HI A* CO to to > co o 01 a

a te <o C- te > te O te a

a te te te te > te α te a

Mi rl >1 te te te > te < α

3 >M te co te > to Ot te a

X A-i te co te > te O te i

< Π >4 te te te > te O te

a A- te te te > te Of te <

a > te te te > te o te kL

ST

to

H

00

r~-

co

<5Ί

Ή

pM

r\J

i-1

«3·

UD

vO

oo

;ri

03

£

X

HI

HI

HI

HI

X

X

x

X

X

X

K

HI

H

co

PO

CJ

<n

to

co

o

rf<

<d*

TT

TT

co

to

to

u

•o

£>

\O

vc

<£-

r-

r-

•H

Γ-

r-

r-

n

ro

ro

ro

to

<n

ro>

00

Cl

PO

to

co

Cl

CO

Φ

*ε

=i=

ot=

4te

=*:

=#=

*

4fc

fi

»«=

»=

*

=*

=te

i±fc

=te

*

tli

U

X

flf

cy

Φ

01

©

O

Φ

<r

<1>

0

0)

Φ

Φ

Φ

Φ

3?

to

ω

Φ

α

a?

fl)

d>

O

45

Hi

Λ

Hi

.H

Hi

X!

XI

ΛΊ

.C

JZ

Λ

Hi

X

JG

X

„H

jJ

Π

Χί

jG

O

tj

u

u

U

υ

f>

n

fi

O

Π

<J

tj

tj

Ł>

O

U

U

(

t>

!>

υ

o

υ

t>

{_}

X

c

o

O

t)

0

Ό

υ

O

O

O

0

o

o

O

0

0

O

O

O

η

o

o

o

o

O

1 co £

X

X

X

X

X

X

X

X

X

0

x i

QC t“

x

X

Pi

ci !

tó i

X

X

X

X f

u 5

X i

X j

X

X

X

i to

i co

co

! te

1 te

1 te

1 co

f to

1 te

ł

CO

CO

CO

m

CO

CO

X

to

co

CO

CO

fO

-o

GO

£0

£

£

te

£

£

£

£

£

te

£

£

£

£

£

S

£

X

£

s

£

£

X

PL 216 190 B1

MS-Roche 3P.11 EASOSVSSSYLA Y ŁlASSRAT T boVY5FPH

PL 216 190 B1

MS-Roche #7.9.H8 IrASQSVSSSYLA ’* EASSRAT T ŁqIYNMRI iGFTFSSYAMS W felNASGSKIYYADSVKG feKGNTHKPYGYWTDY

PL 216 190 B1

P r z y k ł a d 6 _®

Konstrukcja wektorów ekspresyjnych immunogIobuliny HuCAL^®

Klonowanie ciężkiego łańcucha. Miejsce wielokrotnego klonowania pcDNA3.1+ (Invitrogen) usunięto (Nhel/Apal) i podstawnik kompatybilny do miejsc restrykcyjnych użytych do projektowa_® nia HuCAL^® wstawiono w celu ligacji sekwencji wiodącej (Nhel/EcoRI), domen VH (Munl/) i stałych regionów immunoglobulin (Blpl/Apal). Sekwencja wiodąca (EMBL 83133) była wyposażona w sekwencję Kozak (Kozak, 1987). Stałe regiony ludzkiej IgG (PIR A02146), IgG4 (EMBL K01316) i IgAl z surowicy (EMBL J00220) były rozcięte na zachodzące na siebie oligonukleoty o długości około 70 zasad. Ciche mutacje były wprowadzone w celu usunięcia miejsc restrykcyj_® nych niekompatybilnych z projektem HuCAL^®. Oligonukleotydy były zespalane metodą overlap extension-PCR.

W czasie subklonowania z Fab do IgG, sekwencja VH DNA Fab jest wycinana przez MfeI/BlpI i ligowana do wektora IgG otwartego przez EcoRI/BlpI. EcoRI (g/aattc) i MfeI (c/aattg) mają udział w kompatybilnych lepkich końcach (aatt) i sekwencja oryginalnego miejsca MfeI w Fab zmienia się z: c/aattg na: g/aattg po ligacji do wektora ekspresyjnego IgG, niszcząc w ten sposób oba miejsca i MfeI i EcoRI i prowadząc także do zmiany aminokwasu z Q (kodon: caa) na E (kodon: gaa).

Klonowanie lekkiego łańcucha. Miejsce wielokrotnego klonowania pcDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen) było zastąpione przez dwa różne podstawniki. k-podstawnik dostarczał miejsc restrykcyjnych _® dla wstawienia lidera-k (Nhel/EcoRV) , domen Vk HuCAL^®-scFv (EcoRV/BsiWI) i stałego regionu łańcucha κ (BsiWI/Apal). Odpowiadającymi miejscami restrykcyjnymi w λ-podstawniku były Nhel/EcoRV (lider-λ), EcoRV/Hpal (domeny νλ) i Hpal/Apal (stały region łańcucha λ). Iider-κ (EMBL Z00022) równie dobrze jak lider-λ (EMBL J00241) był wyposażony w sekwencję Kozak. Stałe regiony ludzkich łańcuchów κ (EMBL L00241) i λ (EMBL M18645) były składane metodą overlap extension PCR tak jak to opisano powyżej.

Wytwarzanie komórek CHO, w których zachodzi ekspresja IgG. Komórki CHO- K1 były kotransfekowane równomolarną mieszaniną ekspresyjnych wektorów łańcucha lekkiego i ciężkiego IgG. Transfekanty z podwójną opornością selekcjonowano G418 600 μg/ml i Zeocin 300 μg/ml (Invitrogen) otrzymywanymi przez ograniczone rozcieńczenie. W supernatancie zawierającym pojedyncze kolonie szacowano ekspresję IgG przy użyciu wychwytu ELISA. Pozytywne klony rozprzestrzeniano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% ultra-niskim IgG-FCS (Life Technologies). Po doprowadzeniu pH supernatantu do 8,0 i sterylnym sączeniu, roztwór poddawano standardowej chromatografii kolumnowej białka A (Poros 20 A, PE Biosystems).

P r z y k ł a d 7: Analiza pepspot przy użyciu dekapeptydów

Następującą sekwencję aminokwasów obejmującą Αβ (1-42) podzielono na 43 zachodzące ₁ na siebie dekapeptydy z przesunięciem co jedną resztę aminokwasową. ISEVKM¹DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVI⁴²ATV IV (SEQ ID NO: 414). Stosownie, DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVIA (SEQ ID NO: 27) jak załączono reprezentuje aminokwasy 1 do 42 peptydu Αβ4/β-Α4.

dekapeptydy były syntetyzowane z acetylacją N-końca i kowalencyjnym dołączeniem C końca do płytki celulozowej (pepspot) przez komercyjnego producenta (Jereni BioTools, Berlin). Płytka celulozowa jest inkubowana przez dwie godziny na kołyszącej platformie z przeciwciałem monoklonalnym (2 g/ml) w buforze blokującym (50 mM TrisHCl, 140 mM NaCl, 5 mM NaEDTA, 0,05% NP40 (Fluka), 0,25% z żelatyną (Sigma), 1% albuminą frakcja V surowicy wołowej (Sigma), pH 7.4). Płytki przemywano na kołyszącej platformie trzy razy po trzy minuty TBS (10 mM Tris.HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5). Następnie zwilżano buforem katodowym (25 mM zasada Tris, 40 mM kwas 6-aminoheksanowy, 0,01% SDS, 20% metanol) i transferowano do półsuchego blotting stack z peptydową stroną odwróconą do membrany PVDF (Biorad).

Półsuchy blotting stack składa się z świeżo zwilżonej bibuły filtracyjnej (Whatman Nr 3) nieznacznie większej niż peptydowa płytka:

bibuły zwilżone buforem katodowym płytka peptydowa płytka membrany PVDF zwilżonej metanolem bibuły zwilżone buforem Anodowym 1 (30 mM zasada Tris, 20% metanol) bibuły zwilżone buforem Anodowym 2 (0,3 mM zasada Tris, 20% metanol).

PL 216 190 B1 ₂

Przenoszenie jest prowadzone przy gęstości prądu między katodą i anodą 0,8 mA/cm² przez 40 minut, co jest wystarczające do wymycia większości przeciwciał z płytki celulozowej i osadzenia ich na membranie PVDF. Membrana PVDF jest następnie zamieniana na drugą membranę PVDF i przeprowadza się przenoszenie przez następne 40 minut dla zapewnienia całkowitego wymycia z płytki celulozowej.

Membrana PVDF jest zanurzana w buforze blokującym na 10 minut. Następnie dodawane jest znakowane HRP anty ludzkie Ig H+L (Pierce) w rozcieńczeniu 1:1000 i membrana jest inkubowana na kołyszącej platformie przez 1 godzinę. Następnie jest przemywana 3 x 10 minut TBST (TBS z 0,005% Tween20). Reakcja barwna jest wywoływana przez zanurzenie membrany w roztworze otrzymanym przez rozpuszczenie 3 mg 4-chloronaftolu w 9 ml metanolu z 41 ml PBS (20 mM fosforan sodu, 150 mM NaCl, pH 7,2) i 10 μΙ 30% nadtlenku wodoru (Merck). Po wybarwieniu niebiesko-czarnych plam membranę intensywnie płukano wodą i suszono.

Wyznaczenie pepspotów reagujących z przeciwciałem jest wykonywane przez badanie wzrokowe poprzez przezroczyste podłoże plamy. Epitopy badanych przeciwciał są zdefiniowane jako minimalna sekwencja aminokwasów w reaktywnych peptydach. Dla porównania w ten sam sposób badane są monoklonalne przeciwciała myszy (PAP-2, BAP-1, BAP-17, BAP-21, BAP-24 i 4G8) z tą różnicą, że używane jest znakowane HRP anty mysie Ig zamiast anty ludzkiego Ig.

Należy podkreślić, że dojrzewanie powinowactwa i konwersja monowalentnych fragmentów Fab do pełnej długości przeciwciał IgG1 powoduje zwykle rozszerzenie sekwencji rozpoznawania epitopu jak wskazują na to wyniki analiz pepspot i ELISA. To może wiązać się z zaangażowaniem większej liczby kontaktowych punktów w obszarze interakcji przeciwciało-antygen jako konsekwencją dojrzewania powinowactwa albo z silniejszym wiązaniem do minimalnego epitopu tak, że mogą być wykryte także słabe reakcje z przyległym aminokwasem. To ostatnie może mieć miejsce, kiedy pochodzące od Αβ peptydy są testowane przeciwciałami IgG pełnej długości. Tak jak to zilustrowano w Tabeli 2 dla wyników analizy pepspot, sekwencja rozpoznawania epitopów N końca i środkowego jest rozciągnięta do trzech aminokwasów jeżeli porównuje się Fab-y rodzicielskie i odpowiadające w pełni dojrzałe przeciwciała IgG. Należy jednak pamiętać, że dekapeptydy są zmodyfikowane przez kowalencyjne przyłączenie aminokwasu C końca i dlatego ten aminokwas może nie być łatwo dostępny dla przeciwciała pełnej długości ze względu na przeszkodę przestrzenną. Jeśli tak jest w istocie, ostatni aminokwas C końca, nie ma znaczącego wkładu w sekwencję rozpoznawania epitopu i potencjalna redukcja minimalnej sekwencji rozpoznawania przez jeden aminokwas na zakończeniu C końca musi być wzięta pod uwagę w analizie pepspot jak (to zrobiono) w niniejszym wynalazku.

przeciwciało	pozycja	pozycja
MSR-3 Fab	3-4	18-23
MSR-7 Fab	3-5	19-24
MSR-8 Fab	4-5	18-21
MSR-9 Fab	(1) 3-9	18-24
MSR-10 Fab	(4-10)	19-20
MSR-11 Fab	3-7	(18-20)
MSR-26 Fab	3-5	(16)-19-23
MSR-27 Fab	(3) 6-9	13-18 (20)
MSR-29 Fab		14-16 (20)
MSR-37 Fab	(4-6)	(19-24)
MSR-41 Fab	3-7	(17-21)
MSR-42 Fab	(4-9)	(18-24)
MSR 3.4.H7 IgG1	1-3	19-26
MSR 7.9.H2 IgG1	1-4	19-24

PL 216 190 B1

MSR 7.9.H7 IgG1	4-6	19-26
MSR 7.2.H2x7.2.L1 IgG1	(1-4)5-9	18-26
MSR 7.11.H1x7.2.L1 IgG1	4-6	19-26
BAP-2	4-6
4G8		19-20 (23)
BAP-21		32-34
BAP-24		38-40
BAP-1	4-6
BAP-17		38-40

Tabela 2: Analiza pepspot wiązania Fab-ów i pełnej długości przeciwciał IgG do dekapeptydów na płytkach celulozowych. Liczby odnoszą się do istotnych aminokwasów z sekwencji Αβ 1-40, które muszą być obecne w dekapeptydzie dla optymalnego wiązania przeciwciała. Słaba reaktywność peptydu, a więc słaby wkład do epitopu są wskazane przez umieszczenie w nawiasach.

P r z y k ł a d 8: Oznaczanie wartości KD dla wiązania przeciwciał Fab MS-R i dla IgG1 MS-R do włókien Αβ 1-40 i Αβ 1-42 in vitro przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego (SPR)

Wiązanie przeciwciał anty Αβ (Fab-ów i IgG1) do fibrylarnego Αβ mierzono w czasie rzeczywistym przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego (SPR). Powinowactwo molekularnych interakcji mierzono tak jak to opisano przez Johnson, Anal. Biochem. 1991, 198, 268-277, Richalet-Secordel, Anal. Biochem. 1997, 249, 165-173. Do tych pomiarów używano aparatów Biacore 2000 i Biacore 3000. Włókna Αβ 1-40 i Αβ 1-42 wytwarzano in vitro przez inkubację syntetycznych peptydów w stężeniu 200 μg/ml w 10 mM buforze octanu sodu (pH 4,0) przez trzy dni w temperaturze 37°C. Analiza z zastosowaniem mikroskopii elektronowej potwierdziła fibrylarną strukturę obu peptydów, Αβ 1-40 wykazujących przede wszystkim krótsze (< 1 mikron) i Αβ 1-42 wykazujących przede wszystkim dłuższe (> 1 mikron) włókna. Przyjmuje się, że te włókna reprezentują zagregowane peptydy Αβ w mózgu ludzi chorych na AD dokładniej niż źle określone mieszaniny bezpostaciowych agregatów i nieustrukturalizowanych strątów. Włókna były rozcieńczane 1:10 i bezpośrednio łączone do „Pioneer Sensor Chip F1” jak opisano w Instrukcji producenta (BIAapplication Handbook, version AB, Biacore AB, Uppsala, 1998). W początkowych doświadczeniach stwierdzono, że wybrane Fab-y MS-Roche różnią się istotnie w kinetyce reakcji i dlatego sposób analizy danych musiał być wybrany stosownie. Dla substancji wiążących z wolną kinetyką wartości KD obliczono przez dopasowanie krzywych odpowiedzi czujnika w funkcji czasu, tj. ze stosunku koff/kon (stała dysocjacji/stała asocjacji). Substancje wiążące z szybką kinetyką analizowano przez dopasowanie czujników, zależnych od stężenia, stanie równowagi (izotermy adsorbcji). Wartości KD obliczano z sensogramów Biacore opartych na całkowitym stężeniu Fab oznaczonym przez badanie białka. Dla klonów pochodzących z pierwszego i drugiego cyklu dojrzewania powinowactwa, zawartość aktywnego Fab w każdym preparacie oznaczano w Biacore zgodnie z metodą opisaną przez Christen, Analytical Biochemistry (1997) 249, 153-164. W skrócie, zależne od czasu wiązanie białek do włókien Αβ 1-40 unieruchomionych na chipie Biacore mierzono w czasie fazy asocjacji w warunkach ograniczenia masy przy różnych szybkościach przepływu analizowanego roztworu. Warunki ograniczenia masy osiągano poprzez unieruchomienie dużych ilości włókien Αβ (2300 jednostek odpowiedzi) na powierzchni chipu mierzącego kanału i przez pracowanie przy względnie niskich stężeniach analitu, tj. 160 nM (w oparciu o całkowite stężenie białka Fab).

Sumaryczne przedstawienie wartości KD, wybranych klonów MS-Roche, zidentyfikowanych w pierwotnym przeszukiwaniu biblioteki HuCAL i odpowiadających im dojrzałych pochodnych po pierwszym i drugim cyklu dojrzewania powinowactwa, pokazano w Tabeli 3. W pierwszym cyklu dojrzewania powinowactwa ciężki łańcuch CDR3 (VH-CDR3) był utrzymywany stały a optymalizowanie skupiało się na zmienianiu lekkiego łańcucha CDR3 (VL-CDR3). W drugim cyklu dojrzewania powinowactwa dokonywano zmieniania VL-CDR1 i VH-CDR2. Pewne substancje wiążące z pierwszego cyklu dojrzewania były przekształcane do ludzkich przeciwciał IgG1 pełnej długości zgodnie z technologią odkrytą przez MorphoSys i opisaną w Przykładzie 6, a wartości KD

PL 216 190 B1 oznaczano w Biocore jak to opisano powyżej. Wartości KD dla wiązania pełnej długości IgG1 do włókien Αβ 1-40 i Αβ 1.

Dojrzałe pochodne z biblioteki L-CDR1 a także z biblioteki H-CDR2 po drugim cyklu dojrzewania były identyfikowane i dopuszczano kombinację lekkich i ciężkich łańcuchów. Strategia klonowania krzyżowego jest opisana w Przykładzie 13. Były wymieniane albo całe lekkie łańcuchy LCDR1 albo L-CDR1+2. Wartości KD wybranych, zklonowanych krzyżowo Fab-ów pokazano w Tabeli 8.

Pewne Fab-y z pierwszego i drugiego cyklu dojrzewania i z klonowania krzyżowego substancji wiążących były przekształcane do pełnej długości ludzkich przeciwciał IgG1 zgodnie z technologią odkrytą przez MorphoSys i opisaną w Przykładzie 6. Wartości KD wiązania IgG1 do włókien Αβ 1-40 i Αβ 1-42 oznaczano w Biacore. W skrócie: stosowano kinetyczny model dla krokowego formowania biwalentnych kompleksów i wartości KD obliczano przy użyciu analizy typu Scatcharda równowagi wiązania. Ze względu na bardzo wolny proces asocjacji przeciwciał przy niskich stężeniach (kilkanaście godzin dla osiągnięcia równowagi) dane wiązania w stanie równowagi, dla długich przedziałów czasowych, otrzymywano przez ekstrapolację krzywych asocjacji. Stałe asocjacji i dysocjacji powstawania monowalentnego i biwalentnego kompleksu oznaczano poprzez procedurę dopasowania krzywej i stosowano w celu ekstrapolacji. W oparciu o wartości Req wykonywano analizę Scatcharda i oznaczano wartości KD dla monowalentnych i biwalentnych kompleksów. Dane podsumowano w Tabeli 5. Z wykresu krzywoliniowego Scatcharda wyższe (biwalentne) i niższe (monowalentne) powinowactwo interakcji pochodziło z MS-R IgG-ów pochodzących z drugiego cyklu dojrzewania powinowactwa i klonowania krzyżowego. Te dwa powinowactwa reprezentują niższe i wyższe wartości KD zakresu wskazanego w Tabeli 5.

PL 216 190 B1

	MS-R tł	KD Api-40	KD Apl-42	MS-R #	> 1 o	KD APi.42	MS-R #	KD Αβι-ήΟ	KD •^Pl-42
Klony wydzielone z		nM	nM		nM	nM		nM	nM
Początkowego przeszukiwań ia	3	930	1300	7	1100	1714	8	850	1000
1-szego cyklu dojrzewania	3,2	52	240	7,2	22	58	8, 1	24	42
	3,3	38	104	7,3	23	88	8,2	24	64
	3,4	32	103	7,4	28	103
	3,6	40	68	7,9	31	93
				7,11	22	74
				7,12	28	60
2-go cyklu dojrzewania powinowactwa	3.2H1	4,4	3,3	7.2H1	9,3	10,2	8.1H1	13, 6	9,2
	3.2H2	5,2	1,1	7.2H2	8,2	8,2	8.2H1	1.6a	2.1*
	3.3H1	17,1	19, 4	7.2H3	45, 4	5,3	8.2H3	n.d.	3,1
	3.3H2	10,6	22,8	7.2H4	5,9	5,0	8.2H4	12,1	11,9
	3.3H3	1,4	3,3	7.2H5	8,0	10,1	8.2L1	4,8	3,7
	3.4H1	13,5	14,0	7.2H6	1,0	n.d.
	3.4H3	6,7	8,4	7.2H7	15,5	8,1
	3.4H4	33,0	43,0	7.2H8	1,5	2,1
	3.4H5	26,5	36, 0	7.2L1	13,3	12,7
	3.4H6	49, 0	60, 0	7.2L2	5,6	4,0
	3.4H7	19, 2	31, 7	7.2L4	1,1	1,1
	3.4H3	10, 7	26, 5	7.3H1	8,0	11,2
	3.4H9	21,7	18, 6	7.3L1	4,5	6,0
	3.4H10	8,1	10,1	7.4K1	8,0	6, 6
	3.4H11	19,5	8,3	7.4H2	9, 9	6,2
	3.4H12	25,5	27,0	7.9B1	4,9	5,4
	3.4H13	32,3	18,8	7.9B2	5,0	5,7
	3.4H14	13,3	16,3	7.9H3	4,2	2,8
	3.4H16	25,5	15, 6	7.9H4	4,8	4,2
	3.4H17	2,0	4,3	7.9H5	1,7	1,8
	3.4H18	17,1	10,0	7.9H6	1,2	1,2
	3.4L7	9,3	9,3	7.9H7	1,0	0,9
	3.4L3	6,2	13,0	7.9H8	0,8	0,7
	3.4L9	16, 3	9,1	7.9H9	0,9	0,9
	3.4L11	5,3	2,6	7.9L1	1,0	1,1
	3.6H1	18,9	e	7.9L2	1,0	0,5
	3.6H2	19, 8	54,0	7.11H1	12,7	6,7
	3.6H3	5,4	7,5	7.11H2	0, 3	0,3
	3.6H4	13, 0	7,8	7.11H3	6, 6	4,4
	3.6H5	3,2	6, 0	7.11H4	1,0	1,7
	3.6H6	36,0	11,8	7.11H5	3,4	1,7
	3.6H8	2,5	2,5	7.11L1	1,1	1,2
	3.6L1	15,6	11,1	7.12H1	0,6	0,8
	3.6L2	13,7	13,1	7.12L1	n.d.	3,8
				7.12L2	4,0	5,4
				7.12L3	0, 8	0,9
				7.12L4	2,0	0, 6
				7.12L5	0,8	0, 6
				7.12L6	n. d.	n.d.
				7.12L7	n.d.	n.d.

PL 216 190 B1

T a b e l a 3. Wartości KD dla wiązania Fab MS-R do włókien Αβ1-40 i Αβ1-42 oznaczone w Biacore. Dla klonów pochodzących z pierwszego i drugiego cyklu dojrzewania powinowactwa wartości są skorygowane dla zawartości aktywnego Fab w każdej próbce jak to opisano w tekście. ^a wartości obliczano z zależnej od stężenia odpowiedzi czujnika w stanie równowagi; n.d. nie oznaczano.

T a b e l a 4:

MS-R #	KD Αβ1-40 nM	KD Αβ1-42 nM
3.3 IgG1	3,7	6,6
7.11 IgG1	2,3	5,7
7.12 IgG1	3,1	13,7
8.1 IgG1	6,6	12,3

T a b e l a 4: Wartości KD dla wiązania IgG1 MS-R do włókien Αβ1-40 i Αβ1-42 oznaczone w Biacore. IgG-y były pochodnymi Fab-ów MS-R wybranymi po pierwszym cyklu dojrzewania powinowactwa. Wartości są skorygowane w każdej próbce dla zawartości aktywnego Fab jak to opisano w tekście.

	MS-R IgGl Klony wybrane z	KB Αβχ-40 nM	KD Αβϊ_42 nH
1-ego cyklu	3,3	3,7	6, 6
dojrzewania
powinowactwa
	7, 11	2, 3	5,7
	7, 12	3,1	13,7
	8,1	6, 6	12, 3
2-go cyklu	3.4.H7	0, 10-0,30	0, 10-0,30
dojrzewania
powinowactwa
	7.2.H4	0,09-0,30	0, 10-0,66
	7.9.H2	0,12-0,42	0,11-0,38
	7.9.H3	0,10-0,50	0, 10-0,40
	7.9.H7	0,25-0,69	0,24-0,70
	7.12.LI	1,20-3,50	0,74-2,90
	8.2.H2	0,16-1,00	0,12-0,92
Fab-y	3.6.H5x3. 6. L2	0,20-1,03	0,20-0,95
klonowane
krzyżowo
	3.6.H8x3.6.L2	0,22-0,95	0,22-0,82
	7.4.H2x7.2.LI	0,12-0,63	0,12-0,56
	7.11.Hlx7.2.LI	0,14-0,66	0,15-0,67
	7.11.«1x7.11.LI	0,11-0,70	0,13-0,70

T a b e l a 5: Wartości KD dla wiązania MS-R IgG1 do włókien Aβ1-42 oznaczone w Biacore.

IgG-y pochodziły z Fab-ów MS-R wybranych po pierwszym i drugim cyklu dojrzewania powinowactwa i z klonowanych krzyżowo Fab-ów. Wartości są skorygowane dla zawartości aktywnego MS-R IgG w każdej próbie jak to opisano w tekście. Dwie wartości KD podane dla MS-R IgG pochodzących

PL 216 190 B1 z 2-go cyklu dojrzewania powinowactwa i klonowania krzyżowego substancji wiążącej, reprezentują wyższe i niższe powinowactwo interakcji jak to obliczono z krzywoliniowego wykresu Scatcharda. Dla kilku dodatkowych MS-R IgG-ów (na przykład MS-R IgG 7.9.H2x7.12.L2 i MS-R IgG 7.9.H4x7.12.L2) otrzymano skomplikowane krzywoliniowe wykresy Scatcharda i dlatego oznaczenie wartości KD nie było możliwe.

P r z y k ł a d 9: Barwienie prawdziwych ludzkich płytek amyloidowych w skrawkach mózgu od pacjenta z chorobą Alzheimera przy użyciu pośredniej immunofluorescencji

Przy zastosowaniu immunohistochemicznej analizy testowano wiązanie wybranych MS-Roche

Fab-ów i pełnej długości IgG1 do płyteke amyloidowych. Cięte na kriostacie skrawki nieutrwalanej tkanki z kory skroniowej człowieka (otrzymane pośmiertnie od pacjenta, u którego zdiagnozowano chorobę Alzheimera) znakowano stosując pośrednią immunofluorescencję przy użyciu MS-Roche Fab-ów lub pełnej długości ludzkich przeciwciał IgG1 w różnych stężeniach. Przeciwciała Fab i IgG1 były ujawniane odpowiednio przez kozi anty ludzki, o oczyszczonym powinowactwie, fragment F(ab')2 sprzężony z Cy3 i kozi anty ludzki (H+L) sprzężony z Cy3. Oba drugorzędowe odczynniki otrzymano z Jackson Immuno Research. Kontrole obejmowały nie mające związku Fab i same przeciwciała drugorzędowe, wszystkie one dawały ujemne wyniki. Typowe przykłady wybarwień płytek po reakcji z wybranymi MS-Roche Fab-ami i przeciwciałami MS-Roche IgG1 pokazano na Rycinach 5 do 7.

P r z y k ł a d 10: Badanie polimeryzacji: zapobieganie agregacji Αβ

Kiedy syntetyczny Αβ przez kilka dni jest inkubowany w wodnym buforze, spontanicznie agreguje i tworzy fibrylarne struktury, podobne do tych, które widzi się w złogach amyloidu w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera. Rozwinęliśmy metodę in vitro do mierzenia inkorporacji biotynylowanego Αβ do kształtowanych wstępnie Αβ agregatów w celu analizowania neutralizującego Αβ potencjału przeciwciał Αβ i innych białek wiążących Αβ, takich jak albumina (Bohrmann i wsp., 1999, J. Biol. Chem. 274, 15990-15995). W tym badaniu może być także analizowany wpływ małych cząsteczek na agregację Αβ.

Procedura doświadczalna:

Mikrotitracyjne płytki NUNC Maxisorb (MTP) są pokryte mieszaniną 1:1 Αβ 1-40 i Αβ 1-42 (2 μΜ każdego, 100 μΐ na studzienkę) przez trzy dni w temperaturze 37°C. W tych warunkach, w wysokim stopniu zagregowane, fibrylarne Αβ jest adsorbowane i unieruchomione na powierzchni studzienki. Pokrywający roztwór jest potem usuwany i płytki są suszone w temperaturze pokojowej przez 2-4 godziny. (Suche płytki mogą być przechowywane w temperaturze -20°C). Pozostałe miejsca wiążące są blokowane przez dodanie 300 μl/studzienkę buforu fosforanowego zawierającego 0,05% Tween 20 (T-PBS) i 1% albuminę surowicy wołowej (BSA). Po 1-2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej płytki przemywano 1 x 300 μl T-PBS. Dodawano roztwór 20 nM biotynylowanego Αβ1-40 w 20 mM TrisHCl, 150 mM NaCl o pH 7,2 (TBS) zawierający 0,05 % NaN3 i seryjnie rozcieńczane przeciwciała (100 μl/studzienkę) i płytki inkubowano w 37°C przez noc. Po przemyciu 3 x 300 μl TBS, dodawano koniugat streptawidyna-POD (Roche Molecular Biochemicals) rozcieńczony 1:1000 w T-PBS zawierającym 1% BSA (100 μl/studzienkę) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Studzienki przemywano 3 x T-PBS i dodawano 100 μl/studzienkę świeżo przygotowanego roztworu tetrametylobenzydyny (TMB). [Przygotowanie roztworu TMB: 10 ml 30 mM kwasu cytrynowego o pH 4,1 (doprowadzonego do pH przy użyciu KOH) + 0,5 ml TMB (12 mg TMB w 1 ml acetonu + 9 ml metanolu) + 0,01 ml 35% H₂O₂]. Reakcję przerywano przez dodanie 100 μl/studzienkę 1 N H₂SO₄ i absorbancję mierzono przy 450 nm w czytniku płytek mikrotitracyjnych.

Wynik:

Rycina 8 pokazuje, że przeciwciała MS-Roche IgG1 zapobiegają inkorporacji biotynylowanego Αβ1-40 do przedwstępnie uformowanych agregatów Αβ1-40/Αβ1-42. Zdolność tych pełnej długości ludzkich IgG do neutralizowania Αβ, była podobna do zdolności mysiego monoklonalnego przeciwciała BAP-1 wytwarzonego przy użyciu standardowej procedury immunizacji, który analizowany techniką Pepspot rozpoznaje specyficznie reszty aminokwasów 4-6 peptydu Αβ tak jak opisano to w przykładzie 7. Mysie monoklonalne przeciwciało BAP-2, które także reaguje wyłącznie z aminokwasami 4-6 (Brockhaus, niepublikowane) było znamiennie mniej aktywne w tym badaniu. Nawet niższą aktywność stwierdzono dla przeciwciał BAP-17 specyficznych dla C-końca Αβ1-40 (Brockhaus, Neuroreport 9 (1998), 1481-1486) i monoklonalnych przeciwciał 4G8, które rozpoznają epitop między pozycją 17 i 24 w sekwencji Αβ (Kim, 1988, Neuroscience Research Communication Vol. 2, 121-130). BSA w stężeniu do 10 μg/ml nie wpływa na inkorporację biotynylowanego Αβ i służy jako ujemna kontrola. Opisy56

PL 216 190 B1 wano jednak, że w wyższych stężeniach tj. > 100 μg/ml, BSA hamuje wiązanie biotynylowanego Αβ do wstępnie uformowanych włókien Αβ (Bohrmann, (1999) J Biol Chem 274 (23), 15990-5) co wskazuje, że interakcja BSA z Αβ nie ma wysokiego powinowactwa.

P r z y k ł a d 11: Badanie de-polimeryzacji: uwalnianie biotynylowanego Αβ z zagregowanego Αβ

W podobnym układzie doświadczalnym testowaliśmy potencjalne możliwości przeciwciał MS-Roche IgG do indukowania depolimeryzacji zagregowanego Αβ.

Biotynylowane Αβ1-40 było inkorporowane do wstępnie uformowanych włókien Αβ1-40/Αβ1-42 przed podaniem różnych przeciwciał anty Αβ. Uwalnianie biotynylowanych Αβ mierzono przy użyciu tego samego badania, które opisano przy badaniu polimeryzacji.

Procedura doświadczalna:

Mikrotitracyjne płytki NUNC Maxisorb (MTP) są pokryte mieszaniną 1:1 Αβ1-40 i Αβ1-42 jak opisano w badaniu polimeryzacji. W celu inkorporacji biotynylowanego Αβ pokryte płytki inkubowano z 200 μl/studzienkę 20 nM biotynylowanego Αβ1-40 w TBS zawierającym 0,05% NaN₃ w temperaturze 37°C przez noc. Po przemyciu płytki T-PBS 3 x 300 μl/studzienkę, dodawano przeciwciała seryjnie rozcieńczone TBS, zawierającym 0,05% NaN3 i inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Płytki przemywano i analizowano na obecność biotynylowanego Αβ1-40 tak jak opisano poprzednio.

Wynik:

Ryciny 9A do D pokazują, że przeciwciała będące przedmiotem wynalazku indukują de-polimeryzację zagregowanego Αβ, jak to mierzono poprzez uwalnianie inkorporowanego biotynylowanego Αβ1-40. Przeciwciała MS-R i mysie monoklonalne przeciwciała BAP-1 miały podobną aktywność, podczas gdy przeciwciała BAP-2, BAP-17 i 4G8 były znacznie mniej efektywne w uwalnianiu biotynylowanego Αβ z masy unieruchomionego zagregowanego Αβ. BAP-1 może być wyraźnie odróżniony od przeciwciał MS-R z powodu jego reaktywności z pełnej długości APP na powierzchni komórki (patrz Rycina 15). Przeciwciała z takimi własnościami, podobne do BAP-1, nie są przydatne do zastosowań terapeutycznych, gdyż mogą być indukowane potencjalne autoimmunologiczne reakcje. Interesujące jest zwrócenie uwagi, że BAP-2 oprócz jego specyficzności do aminokwasowej reszty 4-6, która jest wyeksponowana w zagregowanym Αβ, ma znacznie niższą aktywność w tym badaniu, co wskazuje, że nie wszystkie przeciwciała specyficzne względem N końca są a priori równie skuteczne w uwalnianiu Αβ z wstępnie uformowanych agregatów. IgG-y MS-Roche jasno wykazują swoją przewagę w stosunku do BAP-2 ze względu na aktywność depolaryzacyjną. Względnie niska w tym badaniu skuteczność BAP-17 (specyficznego w stosunku do C końca) i 4G8 (specyficznego w stosunku do reszt aminokwasowych 16-24) wiąże się z tym, że te dwa epitopy w zagregowanym Αβ są ukryte. Jak już zwrócono uwagę w badaniu depolimeryzacji, w używanych tutaj stężeniach, BSA nie ma wpływu na agregację Αβ.

Przeciwciała MS-R pochodzące z 2-go cyklu dojrzewania powinowactwa i z klonowania krzyżowego substancji wiążących wykazują ogólnie większe powinowactwo w badaniu depolimeryzacji (porównanie ryciny 9A z rycinami 9B i C), co jest zgodne ze wzrostem powinowactwa tych przeciwciał (patrz tabele 3-5). Donoszono, że przy zachowaniu pewnych warunków doświadczalnych, monoklonalne przeciwciała AMY-33 i 6F/3D zapobiegają agregacji Αβ in vitro (Salomon, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 452-455; przeciwciała AMY-33 i 6F/3D otrzymano odpowiednio z Zymed Laboratories Inc., San Francisco (Oder Nr 13-0100) i Dako Diagnostics AG, Zug, Switzerland (Order Nr M087201). Jak przedstawiono na rycinie 9D oba te przeciwciała były kompletnie nieaktywne w badaniu depolimeryzacji.

P r z y k ł a d 12: Analiza epitopu koniugatów peptydów przy użyciu ELISA

Następujące heptapeptydy (kod pojedynczych liter) otrzymano w wyniku syntezy w fazie stałej i oczyszczeniu przy użyciu chromatografii cieczowej stosując techniki znane w tej dziedzinie.

AEFRHDC

EFRHDSC

FRHDSGC

RHDSGYC

HDSGYEC

DSGYEVC

SGYEVHC

YEVHHQC

PL 216 190 B1

EVHHQKC

VHHQKLC

HHQKLVC

HQKLVFC

QKLVFFC

KLVFFAC

LVFFAEC

VFFAEDC

FFAEDVC

FAEDVGC

AEDVGSC

EDVGSNC

DVGSNKC

VGSNKGC

GSNKGAC

CSNKGAI

CNKGAII

CKGAIIG

CGLMVGG

CMVGGVV

CGGVVIA

Peptydy rozpuszczono w DSMO tak, żeby otrzymać stężenie 10 mM.

Albuminę wołową (istotnie wolną od kwasów tłuszczowych BSA, Sigma Lot 112F-9390), rozpuszczano tak, żeby otrzymać stężenie 10 mg/ml w 0,1 M dwuwęglanie sodowym i aktywowano przez dodanie na ml 50 μl roztworu zawierającego 26 mg/ml propionian N-sukcynimidylomaleinoimidu (NSMP, Pierce) w DSMO. Po 15 minutach reakcji w temperaturze pokojowej aktywowany BSA oczyszczano przez sączenie na żelu (NAP-10 Pharmacia) stosując PBS z 0,1% azydkiem sodu jako rozpuszczalnik. 50 μl BSA (6,7 mg/ml) aktywowanego NSMP rozcieńczano 50 μl PBS zawierającego 0,1% azydek sodu i dodawano 10 μl roztworu peptydu (1 mM w DSMO). Jako ujemna kontrola stosowany był aktywowany BSA przeprowadzany przez procedurę w pozorowany sposób bez dodawania peptydu. Po 4 godzinach w temperaturze pokojowej reakcję przerywano przez dodanie 10 μl 10 mM cysteiny. Roztwór mieszaniny reakcyjnej koniugatu rozcieńczano 1:100 0,1 M buforem dwuwęglanu sodowego i niezwłocznie pipetowano do studzienek (100 μθ płytek ELISA (Nunc Immuno-Plate). Po 16 godzinach w temperaturze 4°C dodawano do każdej studzienki 100 μl buforu blokującego (patrz wyżej) i inkubowano przez następne 30 minut. Płytki przemywano 2x300 μl/studzienkę TBST (jak powyżej) i dodawano 100 μl przeciwciał w stężeniu 10 μg/ml lub 2 μg/ml w buforze blokującym. Płytki trzymano 16 godzin w temperaturze 4°C i przemywano 2x300 μl TBST. Dodawano 100 μl/studzienkę HRP sprzężonego z anty ludzkim Ig H+L (Pierce, rozcieńczenie 1:1000 buforem blokującym) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia. Płytki przemywano 3x300 μl/studzienkę TBST. Reakcję barwną rozpoczynano przez dodanie 100 μl odczynnika tetrametylobenzydyna/nadtlenek wodoru. Reakcję przerywano po 5 minutach przez dodanie 100 μl/studzienkę kwasu siarkowego, gęstość optyczną mierzono w czytniku optycznym (Microplate Reader 3550, BioRad) przy 450 nm. W celu porównania, mysie monoklonalne przeciwciała analizowano w ten sam sposób, z wyjątkiem stosowania jako czynnika uwalniającego, znakowanego HRP anty mysiego Ig zamiast anty ludzkiego Ig.

Stosując specyficzne, powyżej opisane heptapeptydy pochodzące z Αβ, przeprowadzono specyficzne, opisane tutaj powyżej testy ELISA. Wskazane, żeby przeciwciała będące przedmiotem wynalazku zawierały przeciwciała, które wykazują przy pomiarze gęstości optycznej stosunek sygnału do tła powyżej „10”, kiedy ich reaktywność z pochodzącym od A-beta peptydem (AEFRHD; aminokwasy 2-7 A-beta) jest porównywana do nie mającego związku białka/peptydu takiego jak BSA. Najlepiej, jeżeli dla odpowiednich reakcji, z przynajmniej jednym z następujących trzech Αβ pochodnych peptydów: (VFFAED; aminokwasy 18 do 23 Αβ) lub (FFAEDV aminokwasy 19 do 24 Αβ) lub (LVFFAE aminokwasy 17 do 22 Αβ), stosunek gęstości jest powyżej „5”.

PL 216 190 B1

Wyniki odpowiadające będącym przedmiotem wynalazku cząsteczkom przeciwciał rodzicielskich lub dojrzałych są pokazane w następujących dwóch tabelach:

MS-R#	Peptyd 2-7 2-7/BSA	Peptyd 17-22 17-22/BSA	Peptyd 18-23 18-23/BSA	Peptyd 19-24 19-24/BSA	Stosunek peptydów 17-22/2-7	Stosunek peptydów 18-23/2-7	Stosunek peptydów 19-24/2-7
7	24	4	7	4	0,17	0,29	0,17
8	28	10	29	25	0,36	1,04	0,89
7.2	34	12	16	9	0,35	0,47	0,26
7.3	34	11	15	9	0,32	0,44	0,26
7.4	36	10	13	6	0,28	0,36	0,17
7.9	28	9	13	8	0,32	0,46	0,29
7.11	37	11	15	9	0,30	0,41	0, 24
7.12	38	6	8	7	0,16	0,21	0,18
8.1	30	1	11	8	0,03	0,37	0,27
8.2	32	4	28	23	0,13	0,88	0,72
3.2H2	26	12	23	20	0,46	0,88	0,77
3.3H1	23	4	12	8	0,17	0,52	0,35
3.3H3	31	2	5	2	0,06	0,16	0,06
3.4H1	27	2	8	2	0,07	0,30	0,07
3.4H2	16	11	1	1	0,69	0,06	0,06
3.4H3	22	9	17	11	0,41	0,77	0,50
3.4H5	28	5	13	4	0,18	0,46	0,14
3.4H7	24	2	6	5	0,08	0,25	0,21
3.4H17	28	5	12	11	0,18	0,43	0,39
3.4L11	31	6	20	5	0,19	0,65	0,16
3.6H6	25	1	4	7	0,04	0,16	0, 28
3.6H1	23	3	13	5	0,13	0,57	0,22
3.6H2	19	2	8	3	0,11	0,42	0,16
7.2H1	38	8	11	9	0,21	0,29	0,24
7.2H2	16	10	10	10	0,63	0,63	0,63
7.2H3	33	17	20	18	0,52	0,61	0,55
7.2H4	23	12	13	12	0,52	0,57	0,52
7.2H5	30	13	18	15	0,43	0, 60	0,50
7.2L1	24	14	16	11	0,57	0,68	0,45
7.4H1	31	16	20	16	0,52	0,65	0,51
7.4H2	36	17	20	16	0,47	0,56	0,46
7.9H1	32	7	12	6	0,23	0,36	0,19
7.9H2	35	3	6	8	0,08	0,16	0,23
7.9H3	35	11	20	9	0,31	0,57	0,27

PL 216 190 B1

7.9H4	30	10	15	7	0,32	0,49	0,22
7.11H1	31	8	9	8	0,25	0,29	0,25
7.11H2	34	10	12	14	0,29	0,36	0,41
7.12L1	16	10	12	10	0,60	0,70	0,59
8.1H1	29	22	25	25	0,77	0,88	0,86
8.2H1	22	7	23	20	0,34	1,05	0,94
8.2L1	26	15	32	31	0,60	1,26	1,22

T a b e l a 6: Reaktywność MS-R Fab-ów ze sprzężonymi z BSA heptapeptydami Abeta 2-7 (AEFRHD), 17-22 (LVFFAE), 18-23 (VFFAED) i 19-24 (FFAEDV). Podane są stosunki odczytów ELISA (gęstość optyczna) otrzymanych dla BSA sprzężonego i niesprzężonego z peptydem. Wskazane są także intensywności sygnału otrzymane dla 17-22, 18-23 i 19-24 w stosunku do peptydu 2-7.

MS-R IgG AEFRHD # 2-7/BSA	LVFFAE 17-22/BSA	VFFAED 18-23/BSA	FFAEDV 19-24/BSA	Stosunek peptydów 17-22/2-7	Stosunek peptydów 18-23/2-7	Stosunek peptydów 19-24/2-7
3.3	17	11	16	11	0,65	0, 94	0,65
7.12	19	11	13	11	0,58	0,68	0,58
8.1	16	7	16	14	0,44	1,00	0,88
3.4H7	22	3	16	15	0,14	0,73	0,68
7.9H2	13	5	8	6	0,38	0,62	0,46
7.9H3	13	6	8	6	0,46	0,62	0,46
7.9.H7	30	5	16	10	0,17	0,53	0,33
7.11H2	10	6	7	6	0,60	0,70	0,60
8.2.H2	18	10	15	14	0,56	0,83	0,78
3.6.H5x3.6.L2	11	7	9	8	0,64	0,82	0,73
7.11.H2x7.9.L1 (L1)	14	8	10	9	0,57	0,71	0,64
8.2.H2x8.2.L1	13	20	25	25	1,54	1,92	1,92
Mysie mab
BAP-1	21	1	1	1	0,05	0,05	0,05
BAP-2	21	1	1	1	0,05	0,05	0,05
4G8	1	23	20	1	23	20	1
6E10	18	1	1	1	0,06	0,06	0,06
6F/3D*	1	1	1	1	1	1	1
Amy 33	16	2	1	3	0,13	0,06	0,19

T a b e l a 7: Reaktywność MS-R IgG-ów i mysich monoklonalnych przeciwciał BAP-1, BAP-2, 4G8, 6E10 Amy-33 i 6F/3D z sprzężonymi z BSA heptapeptydami Αβ 2-7 (AEFRHD), 17-22 (LVFFAE), 18-23 (VFFAED) i 19-24 (FFAEDV). Podane są stosunki odczytów ELISA (gęstość optyczna) otrzymanych dla peptydu sprzężonego i niesprzężonego z BSA. Wskazane są także intensywności sygnału otrzymane dla peptydów 17-22. 18-23 i 19-24 w stosunku do peptydu 2-7. * to przeciwciało jest specyficzne dla sekwencji 8-17 i nie rozpoznaje sekwencji epitopu N końca lub epitopu środkowego.

PL 216 190 B1

P r z y k ł a d 13: Łączenie optymalizowanych H-CDR2 i L-CDR1 przy użyciu klonowania krzyżowego

Modułowe projektowanie biblioteki HuCAL pozwala na wymianę regionów determinujących komplementarność (CDR-ów) dwu różnych kodujących Fab genów w prostym etapie klonowania. Dla dalszej poprawy powinowactwa łączono niezależnie zoptymalizowane H-CDR2 i L-CDR1 z dojrzałych klonów z tym samym H-CDR3, ponieważ było większe prawdopodobieństwo, że ta kombinacja będzie prowadziła do dalszej poprawy powinowactwa (Yag i wsp., 1995, J. Mol. Biol. 254, 392-403; Schier i wsp., 1996b. J. Mol. Biol. 263, 551-567; Chen i wsp., 1999, J. Mol. Biol. 293, 865-881). Całe lekkie łańcuchy lub ich fragmenty były transferowane z klonu dawcy optymalizowanego L-CDR1 do klonu biorcy optymalizowanego H-CDR2. Klony dawcy i biorcy były łączone tylko wtedy, jeżeli oba przenosiły identyczną sekwencję H-CDR3. Wszystkie klony dawcy i biorcy przenosiły zrąb VH3-Vk3.

Było to osiągnięte przez transferowanie całego lekkiego łańcucha z optymalizowanego klonu dawcy L-CDR1 do optymalizowanego klonu biorcy H-CDR2. Specyficzność epitopu była zachowana tylko przez klony łączone z tym samym H-CDR3. Przez wymianę lekkiego łańcucha optymalizowany klon H-CDR2 otrzymał tylko optymalizowany L-CDR1, jeżeli wymiana pojawiła się między klonami z takim samym L -CDR- 3 . Jeżeli L-CDR3 klonów, które miały być kombinowane był różny, optymalizowany klon H-CDR2 wymagał oprócz optymalizowanego L-CDR1 innego L-CDR3 (L-CDR2 pozostał sekwencją konsensusową HuCAL (Knappik i wsp., 2000)) i kiedy pochodne MS-Roche#7.12 były użyte jako donory lekkiego łańcucha, L-CDR1, 2 i 3 były wymieniane w zoptymalizowanym klonie akceptora H-CDR-2. Stosowano trzy różne strategie klonowania:

1) Przy użyciu restrykcji endonukleazami Xbal i Sphl, cały fragment lekkiego łańcucha przeciwciała był wycięty z plazmidu 1 (np. pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H1_FS) i w ten sposób otrzymana podstawa wektora była ligowana do fragmentu lekkiego łańcucha plazmidu 2 (np. pMx9_Fab_MS-Roche#7.2.L1_FS) wytwarzanego przez trawienie Xbal i Sphl. Wskutek tego został wytworzony nowy plazmid (nomenklatura: pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H1x7.2.L1_FS) kodujący L-CDR1,2,3 rodzicielskiego klonu #7.2.L1 i H-CDR1, 2, 3 rodzicielskiego klonu #7.11.H1.

2) Przy użyciu restrykcji endonukleazami Xbal i Acc651 kodujący fragment L-CDR1 został wycięty z plazmidu 1 (np. pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2_FS) i w ten sposób otrzymana podstawa wektora była ligowana do fragmentu L-CDR1 plazmidu 2 (np. pMx9_Fab_MS-Roche#7.12.L1_FS) wytwarzanego przez Xbal i Sphl. Wskutek tego został wytworzony nowy plazmid (nomenklatura: pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2x7.12.L1(L-CDR1)_FS) kodujący L-CDR1 rodzicielskiego klonu #7.12.L1 podczas gdy L-CDR2, 3 i H-CDR1, 2, 3 są pochodnymi rodzicielskiego klonu #7.11.H2.

3) Używając restrykcji endonukleazami Xbal i BamHI kodujący fragment L-CDR1 i L-CDR2 został wycięty z plazmidu 1 (np. pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2_FS) i w ten sposób otrzymano podstawę wektora, która była później ligowana do fragmentu L-CDR1 i L-CDR2 plazmidu 2 (np. pMx9_Fab_MS-Roche#7.12.L1 FS) otrzymanego przez trawienie Xbal i BamHI. W ten sposób został otrzymany nowy plazmid (nomenklatura: pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2x7.12.L1(L-CDR1+2)_FS) kodujący L-CDR1 i L-CDR2 rodzicielskiego klonu #7.12.L1 podczas gdy L-CDR3 i H-CDR1,2,3 są pochodnymi rodzicielskiego klonu #7.11.H2.

Przykłady ilustrujące różne strategie klonowania a także sekwencje dla klonów dawcy i biorcy są przedstawione w tabeli 8.

Po ekspresji na dużą skalę i oczyszczeniu, ich powinowactwo oznaczano na włóknach Aβ(1-40). Poza tym wartości KD dla wybranych klonowanych krzyżowo MS-R Fab/przeciwciał są podane w załączonej Tabeli 9.

PL 216 190 B1

ri X F	Γ! X	Ci X ><
£	>	>
F	0	t.O
	F
Οι	iX	X
	X	X
X	X	X
F	F	F
0	0	f‘l
	i*·;	X 0
0	o
u	r Ί	0
X	X	X
	ϊ>
	CO	to
'0	Q	n
st:	fJj
>1
; F	>1	F
	.1-4	F
; ai	CO	X
	0	|J-I
i		O
3	0 0
	:o
	I-I
o		0
	s	j2
co	σ>	X
£	E	X
x		<s
f	F
co	co	;o
co	ro	ω
X	X	X
f-	i.r	X
X	X	X
0	0	0
ci;	X	X
r,	Pt	X
Ri	X
0	0	0
F	F
	1—£
α	O	o
Ci	o	o
F	F	Ei
F	F	F
	<	<
(X	X	F
CO	ti	to
Ul	jj>
	<£
0	0	0
F	>,	F
<ΐ	f-t
i 1		X
	F	F
	F	F
	tx	X
·Γ„0		α
>	;>
	>‘	><
o	o	O
	co	co
pf		<
X	X	ίϋ
X	, 1 n	i-ł X C\l F
	<\l	K
		X
	F =lfe	i-i
Φ	<1' X	F
c- c rr'	IJ 0 Pi	3fc
tr-	E	0 0
		X W X

J>		;
c	Q	α ·
X	X
F	>-i
X	X	X
F	t-l	>-
0	0	0
F	F	F
X	X	X
X	X	X
X	32
Em	F	F
0	0	0
X	X	X
0	0	0
rr	0	0
X
0	co	0
	C	α
ri	Ft	X
>1	F
0	F	F
	F
	co
	co
		0
	ćó	Z
	0	PEj
	co
		<
rs	s	*
0	U)	0
a	ϋ~	a
>1	F	F
to	0
co	70
X		X
C 1		F
Lu		X
0	0	0
,_,	Z;
	'ij	X
X	:—1	X
00	Τ’	0
F	>	F
O	O	O
α	X	Ci
F >	F
F
X	Oj	X
to		0
to	0	co
ri!	0	<
0	0	0
>	0
<	fil2	<
	X
F	F	F
t*		X X
co	X
co	X	X
		---.
co	F	F
o	0t	O
co	0	co
r.	<	*x
¢.	X	X
		X
£J	X	8
	‘.
	CM
		Φ 3
an <}	Tfe	h
C‘ 1 <3	X u o	§ *
i	X	B
ϊ <o	to	i-f
5	X	i—1
		F

PL 216 190 B1 g tra tegia klonowania 3)

>	>
u	C4	Q
Lu	{.).(	Eu
X	>''	X
tó	(X	cd
0	X Cl	X 0		CO £&
X		χ		8
Dr	ib	CU		EJ
Pd	;x	w		tu
c	!X	;r
Er*	£-,
		!Z
V	0	0
Ld	Pd
O	0	O
O	0	0
	X	Pd
	>	>
V)	cc	0
Q	c	Ct
«C	<	<		_.
		X		s
>1	>'1	X
id	H	ki		H
&	0-	NI X
X	0		w
0	0	o
g>	CD
in	(9	rai
	CC	Pi
hi	Hi	1—1
κζ
				θ'
ps	S	s		o
				o
				o<
CO	0	0
g	o	g
X	x	X		td
co	cc	yj		Q
0	0	cc		o
Pu	tu	Łu
{Ht	χ	i—I		aj
Eu	tu	t'U
O	0	0
H3
Cu	ίΧι	Ci	m
Cu	M	Tu	cd
to	2L	0	Q
χ	X	>··	U
>	•4	>
o	O	O	»4
O	0	O
H >	e |	W to 0 co (X
X	f-i	Łu \
		fi i	$
(X	o2	cd ł
cc			Q
w	w	cc i	EJ
ril	!fj	0
0	u	o i	W
		‘	σ»
		i	*r
X		iO \	oł
		s	0
		i	Ot
rt		<
0	u
>·	X	χ l
CO	cd	0- i
CO	X	cd l	cd
cc	Lu		P
>	o		u
CO	X	>< i
O	O	O	0
iC	V)	CO i
< Pd	<4 rt,	l a, i
		Λ ś	•ri
		04 <	0»
		4· t	□
		ł-t S	<tf
CM	*—ł	§		N
	0		flf
			H
cM	<M	►4?	Ϊ
r-4
X	r-	«3 Λ u u M rt ’		H •rt
ie	4fc		0
Qi	<jł	f 1	s itf
Λ	,0	m '	X»
<j	<J	9 Γ-	Wł
Q	(j	s	0
Et	cd	ęif	P
		«	0
0	cc
IX	PI	ł-t ί	<3
		«Η	3
			N
		X ί	<5
		=tfc [	£5

Q 0 tu Li., χ cd X X < pi X X X X	δ i'* X >4 cd < > X		6 X Cd >< X	§ e! S £ X X >4 X cd cd < < X X Li -4 P		Ω p £ £ X X X Xi Eu [ £u td ; Ld X : X Eu i X Pi i 0 S 0 >d M 0 l 0 i	6 Lu X cd X 0 X Pd Cu 0 pL( 0
o o > cc to η α < < x x Pd X £-·« W Pd ‘ 7 0 O CO 0 1.0 o CO Vi ι-u H < <	P > co n < P E-< M ID co W cO i-u f-cj		o X Q P- >1 X tu co X 04 σι H	LU 0 X PC ?) to Q Q κί X x Η X CO ij-i ϋ Pd 0 co 0 ί*·Ί 03 W ί—1 f..| λ:		0 id CO C4 < X M Cd 0 X l—f ΚΪ	0 fxl CO Ω βζ} X Η X 0 0 0 0 0 <	0 Cd 0 X Hi 0 S !—1 ?£
S /S			£	s s		ΰ£	Lsi	I£
CO 0 S 5 X X CC X co co Łu jj Im tu Lu O (0	co s >4 CO co fu fu 1>.S to		CO s X co 07 tu tu <2>	co co § g X X co co c.o co X X Lu X 0 0		'3 ’Ο CO ................................	£ •'Ο ro E' 0	co ś 0 r.O Pu E « Pu 0’
Oj CLi CU CU > χ £ > iu f-t O O CCI o	Pu Cu b ΪΜ (H o> O	• l· i du t Cu Cu ; X Cu Oj i > ί >·ι >f \ >β P £ i L·1 S E-1 Lr-* iOSO o iO:O o	i \ i 5 \ O!	0 1 1 O o	tt5 CU Pu co X 1· 1 O o
> >	>	i > (> >	i >	E i	C 1	—
Eu H a g f0 co CO X < < O cc	id co co r-U O >4	! % • co f f-O i < ίϋ ...........i...	Eu x Cl· < td X CO •0 Oi < < 0 0	i X i < ; X i GO i 72 i < i *d>	X rt! cd LO 0 < 19	< bd 0 co O
	>4 '(-I > i	i P-1	>'	i-
łi ri >4 >4 >4 V) > CO cd o co > Ι-ΰ CO fu O CJ CO CO fi r£ Cd cd m Co X X ŚO t£ ΓΟ ΓΟ 4t; Φ ti Q O O id cd 1 1 fO co pi pi	3 03 co J s co ri Cd		< ; < < U S rJ J >' S >i >' CO i >4 > Ϊ co s o· ; x ro i CO CO >'44 co ; U X O i O O co ; CO GO ł-i, ; ńl) Sj tZ i tli oi	i 3 • X : 72 • CO ; 72 ; 72 ; O • '0 ί < ;	0 >4 E- Cd P X o 72 <ζ Cd	c .4 X' i-l od 0 X Oi 0 g
<N cJ to co X in m w CO 3C •g £ co X	i co ; X ί y? ; ro ί ΰ? i ii ; o i Q ; Cd i 3 ; CO L	CS *4 EC OJ · i 1 CO ο κ • co co ac at φ . cj <n X «= u Q Φ X X 3 O V3 0 s: & 1 «3 £	; om i X ί 4T S E’’ : -* i ί φ ! X t υ	0 Ot] 9 0	3 CM X X CM w a< X 3fc 5 0 0 M 1 CQ S

PL 216 190 B1

>

[>

>

>

E>

Ο

O

O

Ci

0

n

c

Ci

Q

n

O

En

Z

Ltt

hi

[if

Eli

C.T.I

Łi

Eu

lu

,-¾

ri

j*4

M

o

Cd

X

td

id

.od

z

fd

vd

Z

Z >1

Z h

Z

. ·

ri

£

ί

>4

ί>Η

> ><

ih

n

>

>4

c<

EO

V

0

0

0

0

0

0

O

0

0

0

>4

>4

IX

;·-·

ri1

ri

>d

>r

X

Sh

>4

Z

Z

CL

d

Cd

0

Cm

Z

Λ

lir,

to

z

:c

W

M

Z

cc

z

Z

Z

Z

ri;

0-!

X

£>

X

X

:.ϋ

X

X

X

X

X

>4

>4

F™·

f..|

EH

t j

0

£-»

X

X

Z

Z

Z

z

Z

Z

Z

Z

E-

0

ES

0

o

0

0

o

0

ES

0

0

1

+Uł

Z

X

Z

w

z

Z

Z

z

X

o

ES

ES

o

0

O

o

0

OJ

<3

X!

li

0

0

0

0

ES

o

0

0

E0

0

0 Z

0

0

ixi

X

X

z

χ

Z

z

z

z

Z

z

>

4>

Z

>

i>

';.

*>

44n|

r.G

CO

co

0

ω

cO

co

co

to

CO

0

0

tb

CO

-i.

L-I

e

0

Ci

Ci

Z

i-l

Q

o

Q

0

r-\

r o

CO

ri

ri

ri

Z

<

lZ

<

<

•^C

<

<c

<

to

>4

>,

>(

>4

Sd

><1

$

>

{

>4

ri

ri'

Tli Z

>

0

0

>d

w*

>·'

>1

>1

>•4

>-s

>!

£ 1

Ea

U.|

• i

[ F

X ΪΖ

to

co

Z

CO

Z

Z

00

Z

X

0

r£

Z

co

>4

0

V

0

X

Z

f«1

i*. |

Z

0

H

0

0

O

0

0

(0

0 5

•0

0

0

Eu

O <

rn 0

n <

riC

0 ;.o

Z 0

5

z

0 CO

Z Γ0

X

Z

C 3

z

co

V~j

Z

n

1—!

ł-d

H

1—<

Ί—1

H4

I-i

Z

ri

z

ri

ri

Z

-'•C

0

0

0

<

0

>

<

V)

M

t*

s

γΞ

£?

Ss

Si

S

s

Dt

z

3

[3

3

St

S

3:

0

&

0

VI

co

co

co

CO

:r>

co

CO

X

0

co

co

VI

v 0

5

§

0

ri

ξ

i

H

r“

p£

§

§

ri;

A*

z

Pi

>-1

>4

>4

>4

0

to

co

co

CO

co

co

P

EO

co

co

co

CO

Γ/Ί

CO

CO tt,

co 6-

co

ń

co Z

:o

CO

0

co En

co f.u

[-0

co

Z

co

r-0

H

ri

ri

ri

£

L!

r-i

8

łr1

X

Pd

Pd

z

C-;

(-14

Eu

Id

X

Eu

j_i

h

En

X,

X

Cr,

z

x^

[-1

0

0

0

0

0

00

0

0

0

CO

0

Eu Ml

X

2

r-.

k-S Cu

z

z

z

X

X

X

X

fi.

Z

Cu

Oi

σι

Z

z

Z

z

iz

Z

s—i

ł—!

s:

1 1

Oj

OS

z

X

0

>4

O.

Z

f2

z

z

:ii

CO

Q

0

co

co

Z

co

C0

>4

!>

>(

>J

u

>

co

Z

M

o

O'

O

0

CS

α

CS

O

O

>4

0

0i

rs

ot

OK

4”*

4-1

H.4

-3

*-Ί

O

0

o

0

o

o

σ

L· » rOI

m

?-4 >

>

ri

>

>

;·,

-,

dl ul 0 00 ft

£-

X

H

Pd

>

E-

E-

u-l

[·„ ri Cd Z

ri

t-i

c·

ri

OJ ffi P CJ

Z

E-i

[ 1

E i

C-4

Γ-'

§ 0

Cd

§ to

«ι, Z

-E Z Z

£? co

VI

< z co

s 0

<ę z

co

FlC Z

c z co

ri Z· co

0

to

ĆÓ 0’

co

cj

<0

•co

co

co

•CO

co

CO

co

co

co

O

co ES

ri 0

co

CD EO

'0

•0

z

tf. 0

a

0

<C 0

f:C 0

0

ri 0

Ch

y,

co

CO

co

CO

>•9

>ł

w

>“

>'

>4

>

Z

>d

>

0

ft

ri

ri

ri

<

ri

r41

r-i)

O >4

<

Z

f-4

ri VI

z

sl z

uJ ri co

ri </;

Z

z >> V}

. 1 h

X Ód CO

Z >4

£

rii >! j-f

Z >d

VI

co

Od

>;

VI

Ci

z

>1

V5

X

Z

co

Cu

Z

0

1 5

O

0

X

n

1-, 4

E>

in

(Jj

Z

o

F g

VI

cc

Z

co

Cd

rd

VI

Z

co

Z

M

σ

CS

CS

Oi

ot

α

o

0

O

o

CS

o

CS

Z

ryj

CO ri «

CO

co

co

w

0

co

CO

0

co

Ż

<1 ŁK

(3. oc

3

ri cd

s

a

ś

ri. X

3

3

£

co 3

•r-i

ΓΜ a* 00 Γ- ąc

c·^ 0 Γ' i*ł=

a «Μ H r* X N w cn

«τ X o\ ri sHb

C'-J 0 2j 4L

Ci h! CM H ri X 'ł S <Λ

V 5 X i---! 1— =3t=

ri Z 1-i Γ- 3fc

1 ttf •w •H £ -H 0

w »4 w K w Pi ł“i

•—4

! ł «Ν

>4 <M Γ- Η r-1 X H rH

X Ol

z 'T DO FS£-

Ol »4 ^a> l*> X i-ł Ot σι

<t) Ϊ) O

c -C G C

ri * Φ

13 2j 3

0) Z G

ri Oi

4) Z υ o

q Tj 0

c 4J W

r* 5*

9

G Z G 0

r- 3fc ffi

s 13 o

G Z ϋ O

σι st «

! CO

Cd 0

s l§

Jl Z

Z 0

ji □ £

tó M

fd 0 £3

i » $

•s 0 Pi

z a

Z Ci

Λ α s

0

•00

Λ O s

ai

w

%

£

ra

£

8

H cd

ί

a i

Z

PL 216 190 B1

Cl U, tó OT Ci OT OT (H

-- T Cl Itó ρ ot 3

[ί- ο?. Itó OT os & OT ot rrj łH

Cl Ir., tó S- >' tó OT >, X te tó

O tói tó OT tó OT

> Cl Ul tó* Cd >4 tó tó F-ζ tó tó £·

Cl Ui tó tó tó tó ot >·« tó Eg

Cl U, >4 tó Fi, X f.fi

b57 p & tó tó tói AC tó O-i b

! > Cl ; U tó tó tó tó tó P tó

tó Cl u tó tó tó tó te Fi Ul

O Uf tóf tó tóf tó tó· > tó

> Cl u tó tó rl) £~i X e-r i-O

> Cl tó tó OT tó tó te C-> i-3

Π te 8 1 te

OT H . i

cii OT OT tó < OT tó

« P te >’ OT tó

>-* tX !>* rc fOT OTt X h1

> u u, p OT to OT Ul te X H $ te O

a Ul >4 K te OT u, u: OT tó to

;> OTi te b tó! te

te tó ω O OT tó tó w co OT ω co OT

te tó tó Q OT ot te to (0 e to tó tó

O tó > CO Q OT OT tó i£ w Vi B Itó to 1—1 OT

;o tó ćo tó OT >1 OT tó tó te te a ŁO H

te tó OT Q < tó OT £-< CO O <5 OT te OT I-I

*,_> tó p tó Q ί tó tó O

te tó > OT Q OT tó >1 O t i o OT

tó !tó OT Q < tó >1 t * OT tó tó OT OT <

Cl Ui > s xi p.

c.y tó ;> o o >4 >4 z; tó o e-9 cc CG W

> CO 0.1 tó ς-ι OT C? c? OT OT '/Ί tó

OT tó Cl tó >t tó tó OT H tri C) I-I

<..!) łCC, €0 C tó >-* OT HI tó OT

OT tó > ii? Jtó ju OT co C H tó

te 8 i ts

OT tó c/.! a tó HI tó OT s-u tó 0> i 4

OT iU J> to G >' OT tó OT tó OT co Ud co tó

OT tó OT Cl OT- H OT to OT co OT vi n OT

O p (.u ΓΊ -OT OT- Ł £-d tói ω a Ui ! 1 ^1

t? te > CO C] tó >1 te te s te H* te te i..., OT

te LU > te Cs OT >1 >1 OT te te te te H OT

te tó te O OT >4 OT to tó X! Ó te ot;

rs

rs

B

B

s

te

te

s

te

<

s

S

3t

te

OT «3* to 0 Pd

S

3

13

s

Es

s

W E OT L·) co Et, Ł O

CO 5 OT ćo co te

co OT to to Ł»j IOT Ud V

to ś OT to tó, c

Ci K OT tó OT c-0 L·.· O

tó tó < tó tó tó tó tó tó

OT OT OT tó fc-‘ tó tó

OT V a OT OT Ud H Eu tó

CG Ś5 tó to o; u u. r.

co § tó* OT OT OT

VI Ξ tó OT OT U H Eu OT

tó tó E- tó OT

to JH to u £ to

to s OT to W tó tó Cl

rd te 8 1 te

ω § OT OT OT Ul OT Ul ! 11

to s OT tó OT tó OT

OT OT OT OT OT p 5

VI p CO ω Ud JH i»d

to OT to to u OT U te

te te te Ul OT u

to § OT CO te łtó łOT Uf

tó p n OT H σ o

Ot 0-Ł Cł OT 3 O

tb Ot! >M s 0·

□fi tó C & O

Cb 0i tó Cl tó o a

Os tó b te a o

tó tó P a o*

tó tó tó a tó f-i o o

P, Łtó p U-s σ o

tó p tó O OT

U. tó C >- Ε- C.I* O

fiu >’ Q H O £I

Pd tó OT OT O σ

tó tó ó o o

OT »43

OT tó tó OT OT ri

tó tó p a a

u, a, OT OT O a

tei χ OT1 OT- O c.

a! u co >' O σ

:i; tó ω >! a Ck

tó E-i to OT- Hi Cli Cii

te

£-*

C i

Γ-*

te

p

e-

)OT

t-

» U7 0 CO P.

OT

>

>

)>

OT

OT

L *

OT fti to ‘i o

i co CO OT Cl

te* s to Oj OT -i2.

tó OT cc! CO to OT te

E-i OT tó OT OT ri! te

te OT X tó tó OT ;o

fiw 3 OT CO < O

itó < tó OT OT tó

fc-+ s Ł0 CO F-C V)

tó 1 OT tó e

F tó tó OT OT C5

E-* g tó {.0 tó (0

Ic tó co to tó

1 co OT tó OT

CM s OT >4

OT Si to OT tó OT

OT tó to OT rt! OT

EH OT te OT OT OT O

S to to OT to

OT OT tó u? Ul OT O

1 US Ui OT te

f-1 OT tó te te OT to

OT

>1

>'

tó

tó

tó

tó

tó

>1

;w

>-

OT

0i 0 Cm

OT

OT

OT

>*

OT

OT*

OT Oj co ω to o Uj OT tó

OT OT 3.1 H tó tó V) OT tó

OT tó >1 OT > X tó tó W 1

ot; Ul to OD OT OT O CO OT tó

fX Cl tó Cl tó tó O co ii! tó

rt* C tó teł tó tó »tó G-e O tó tó

tó tó OT OT OT OT c.> to tó

r<C tó tó tó > X tó tó to tó

5 tó tó X 1—1 ni tó ω Ft; tó

tó tó OT OT OT. > OT a OT tó tó

tó tó tó tó tó OT tó tó

.tó 1

tó tó >4 CO to P {/2 a CO u.

tó tó OT tó OT P a co s

rd g OT Ul

tó tó OT i Ί tó OT tó tó O to 3

OT Li ip OT OT r> OT tó

OT tó OT Ul te a u, ? OT ot

OT teł tó L·. teł O Hł Uj a to Γ0

OT I 1 OTi te te te W te te

OT i 1 OT tó a > OT a u> 3

OT H-l OT. Hd tó p H Qf to 3

•e—1 te Φ tó. o o tó 1 to OT

σ. tó •er Φ ci c tó to

tó n X H te m 4fc © tó 0 tó g

Ή ΓΠ Ufc -ł> O O OT

r- ’d 0 tó 1 OT

r* tó *T OT X OT te «* OT 3te 1 0 & 1 to 2

X -tt1 OT ii O rri 1 OT 21

01 tó -rr* ΪΌ fiłfc & eC c o OT Σ1

<n tó OT X OT te OT * Φ ś S 1 £

t- X OT. O XI u 0 tó 1 to £

θ'. ,0 <V> s»· ω 6 tó 1 ul

ffi. Ul «# OT K r- te «3» OT at 1 & g

i

OT 'd OT ω u o tó 1 VI

tó rrji OT •JU ω tó u 0 tó to

n © 0 «r « nr rr1 2 ‘rl •r> U c nl P n •9 m © 2 N Rl S5

r-> tó m X r- te m 4ts © *§ O te w 2

uO OT, <1? tó t> o tó to

3 35= Cl· U O tó 1 to ?1

r-l J 1£> CD X LO te CO 3fc © Λ 0 0 te β 8 2

''-J X CM =ifc q 6 tó to

Ul 5#= • tó υ tó te Z

«—I sJ CM H X Ci CM H * © ¢0 X

PL 216 190 B1

η Ευ >< α; ’> ta 0 ta ta ta 0 ta

h Ui >·* ta > S-I o S-i Ul ta X H 0 ta 0

> dj 0 Łu ta £ δ ta Ω

Q ρ ta <3 >! C ta s 0 O

q ta > ta 0 >ł c ta ta F* δ 3 0

Q ta, δ >* o >i 0. ta ea: h Γ!

c c > c 3 t; δ ίτ <5

o ta ta ta ta p Ol ta ;t; 1' δ ta U

Q Im pL >-! <0 (ta 1*1 K EH 1'^ O <0

Γ5-. >1 LG ta ta δ 3

/).0..5 λ ο.ΛλΙΆα.<3

Q Sta >( ta 0 </ L< X 0 δ tal rt)

0 ta CG ο < >- ta & < 0 J2 >< <

0 ta tÓ Q < S-« >* Γ i oo <0 0 OO 0 co s—» 2?.

O Lsi; £> O < >< W et.; C2j 0 £ 3 E—1 J&.

0 ta ta Q S >« ta ta ta 0 O < <

e ta I> co O ί ;?-i Cj 0 0 δ to rtl

o ta to < tó S? < 3 <

CG j> co c >' ;» 3 3 6 s 3 H <

o ta w ta ta ta to 13 O CO <3 to K <

O tal c<i Q μ-Η ta* >-t Lii Ó «I I-C

CG fet, > Q ta ta 3 ta δ ta fiC

to ta 5 co O taj O CO s

tai > ίΜ >·< ta δ 9

&

j£

3

Ξ

:s

s

s

Ϊ5

<0 S <0 CO ta Η Lu 0

VJ 0 >< V) V2 Lu Lu 0

c/5 δ CO1 ryj Γτ. Er- Lt. Ć.9

f) § Im to to ta H Iii 0

CO co ta H e-

W 5i ^•* 00 to (Lu e-, IC O

<0 § > ! <0 <0 ta E·^ α

§ •to co .Tj ta •IG

£ f.o LG Eta to

co < ta <0 £ ta ta i 9

ta) 5 co w ta ta 0

L-0 ta1 Łd co f/L Pu H Pu

X ta ta & >ι Μ O O

ES 1 1 2L iM k4 O tal

3 Lh ł—i 3 ta* S

ta 3 1—l C«

X. c ta CO > 0 O

LE ib Łr- '-0 Q

X c c CO o o

ta ta to > O Ot

ita ta, to H O

ta g Q

3 ta e ; 3 EM ta α ,ί

3 (ta M ii o h-l

>

>

>

H

ta

E.,

F-,

R

>

E>

0 < m; <o w < O

% CO ω 0

EM g 3 ω w Q

H 3 to to <

ta tó <•0 co < o

H £ <01 co < i 3

i ta to C0 < U

R 3 10 C0 δ IG

ta* ta< co CO n

ta < ta to- to rtj C.5

H < pi Ls to to 13

taj OL δί to o

>-

05

V)

>·

>,

>-

Im

ta

>·

tai

co

ta ω tn V, > co O ω <

a ta Yi Im Lu Lu ta O to ol

i 1 ta* ta Lm Pu Ir..i tó O cg tx*

< c Im to to to > to O to g

< ta ta C > O to < ta

O-i O <0 < CL

-< ta b) co co co o to < ta

a ta rri Q >1 Ot •to

’ϊ| tal Eta Eta 9 >1 α CO ta

< ta tO CO co > er; O co < ta

6.Γ, ta LXi (Xj ta ta O Pi <·< ta

< 1 1 >•1 GL rta Wj ta O CQ

Cm X Γ- Mfc li Λ ϋ 0 <0

CM i-l CO Γ-- ^r= 0> δ y 0$ to

IN X w H r* « CM W «3· Γ * <u §

co E£ O Γ'- ifc 0) XJ C) O ta to

3K Φ X! U O ta, co

rU A 04 Γ- « C4 Οί o 4k Φ s

cg r =s= <u Λ·) O Ό ta to

ta ta r- =a= δ -0 □- •ta

tta hJ CJ IM X CM W tH [M * Φ X ϋ o tó ŁO S

c< X en Γ * CU ta 0 o ta CG ta

r-ł ta CM 0 Mti X L) O ta tg

H ta Γ4 rM t> <N 5C o Γ“ 3fc Φ X O s ś

PL 216 190 B1

η X θ ώ	. Cl F X F Φ F X k 8 X Φ	> Ω X X > ίο F X X X F 8 k ο	Ο X F X Ο >·» Cu Pu X C-i ZU O P2 <,*?		o k F O E 8 X 0 ω	O k X F F 0 0 X ro Ω	Cl X Pi ί! i F 8 O X 0 o .4	k· X F X e> F 0 F X g O	4· « X F X > > i O F X Pi X F X Φ 8	> X F X :> :> i o F X Pi F X Φ
<Ν 0£ Ω υ 1 tu	g ο η < F X X F £; ιΐ	ο k 0 Ω κ/; F F X 0 0 0 0 0 Η r<	o > <n Q < F F k k >•4 0 z ff£ rtj		Φ X 0 Ω F H ω o ui o; ro H!	0 X 83 X >·’ F E-i 0 Φ O 0 O V) ł 1 <	Φ X 0 O F F X 0 O r.,'1 X 0 X	Φ Pi 0 X F X X 8 < X <	o X 0 α «t >1 σι φ o Φ 0 X z	EO k 0 Ω < > F p; k F I-I
F -9 « 0 α	(¾		1¾		i£	Ss	s	[s		g
3 Ω C Β	0 < 0 0 X F X	0 ϊ F 0 0 X F Φ	ω 5ij > s co ω X F X Γ0		0 rti F f.n 0 X F X	go s 0 0 X {., X Φ	co F ćo C/5 X X o	0 < 0 0 F t ?£i CD	0 ś F CO s X o	ΓΌ 0 0 F 0
0 « 8 Ω	32 X X 0 F S Ο	Η Οι '& F U-I Ο Ω	ł—I Zj PS F O		X X 0 X o α	X F 0 0 O o	X X F 0 0 (J Ci O	0 X X 0 F F. Ci O	X z F 1 1 <>	Z X X Z I-i O kl
η *λ 0 οο ft	F	X	F		X	X	E-U	F	>·	>
OJ & α υ α	F < X 0 0 C φ	F < X 0 0 κΐ. 0	F 2 CO CO r-ΐ		E-* 0 0 Φ	X < X 0 0 fi! Φ	$ co ω (o	EF < lY 0 0 ri Φ	F ti X Z CO 0 O	F 'Ά (U 0 O
σι « 0 £h	F	F	F		F	F		F	0	0
X X Ω Φ Ω	li >·. ω φ 0 > 0 οι 0 < X	ί< ι·4 F X X 0 X X <3 $	<ć 4-1 F tó co co X X α co s		h-r* 0 0 0 0 O 0 '‘-A X	F X VC 0 X <3 0 fi X	X φ 0 X Cł 0 fi X	< F 0 0 0> 0 Ot 0 X	fi ki F X X X F O 0	ki F s X ΐχ O </) <! ΡΊ
•η Φ 0 < Η < •Η ϊ X -η 0 C <β 4 Μ 3 03 S Μ ίβ 2	ί\! X τ—1 Γ- 4J-· Φ .η ο X ω £	Ω ο -łp GJ X Ο Ο 0 0	X Ω σ F W 04 W X X F =tfc 1 0 ti		i—[ X .1 Cij GJ ’d o Pi 0 E	i—I X X 4fc <13 -C U O X 0	X A f\l CO M H X co * i $ 03 £	C4 X r~- ^u- Φ 7. Cj ϋ X 0 F	X ki M r—4 r~·- <y ϋ υ o X co £	j—1 k) OJ τΊ F * <N X F X F *= Φ k 0 0 ? 0 £

-Η δ

$ ro

Μ

Φ £

Φ £

Ν φ

r£ υ

>Ί £

ΤΊ >1 ϋ

>ί ί>Ί

Ρ

4J

Φ

X £

•ϋ >1

Μ £

φ c

ω

-Γ ·Ί

Φ

-Η £

Φ

-Η £

Φ

Ν

Φ ι-Μ

Ο

Οι

Φ'¹

-η

Φ

Μ

Φ
Ad	Ό
0	T3
Cg	•H £
Ή	N
ki	rO
rM	.-l
d N	Qi
M	ΧΊ
-P	Φ
ω	-H £
co	T5 a)
d	H
H	£
Φ	0
Q	i-^4
Φ	Ό
Η	O

PL 216 190 B1

MS-R#	KD Αβ1-40 nM	KD Αβ1-42 nM
3.3H1x3.4L9	2,16	2,97
3.4H1x3.4L9	0,25	0,5
3.4H3x3.4L7	0,92	0,92
3.4H3x3.4L9	1,05	0,93
3,4H7x3.4L9	2,66	3,51
3.4H7x3.4L7	1,19	1,23
3.6H5x3.6L1	1,25	1,04
3.6H5x3.6L2	1,26	0,84
7.2H2x7.2L1	1,29	1,43
7.4H2x7.2L1	1,4	1,4
7.4H2x7.12L2	1,4	1,8
7.9H2x7.2L1(L1)	1,4	1,4
7.9H2x7.12L1	1,2	1,1
7.9H2x7.12L2(L1+2)	0,4	0,4
7.11H1x7.2L1	1,75	1,39
7.11H1x7.11L1	0,41	0,47
7.11H2x7.2L1(L1)	1	0,6
7.11H2x7.9L1(L1)	0,1	1
8.1H1x8.2L1	1,3	1,6

Tabela 9: Wartości KD dla wiązania klonowanego krzyżowo MS-R Fab do włókien Αβ1-40 i Αβ 1-42 oznaczone w Biacore. Przygotowanie klonowanych krzyżowo Fab-ów jest opisane w przykładzie 13. Wartości KD oznaczano przez dopasowanie krzywych kinetycznych i korygowano dla obecności aktywnego Fab w każdej próbce jak opisano to w tekście. Te same Fab-y, w celu usunięcia zagregowanego materiału, dodatkowo oczyszczano przy użyciu chromatografii wyłączania lub preparatywnego ultrawirowania. (L1), klon akceptora dojrzałego H-CDR2 otrzymał tylko L-CDR1 z klonu donora z ulepszonym L-CDR1; (L1+2), klon akceptora dojrzałego H-CDR2 otrzymał L-CDR1+2 z klonu donora z ulepszonym CDR1.

P r z y k ł a d 14: Ujawniona przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skanującej i analizy kolokalizacji dekoracja in vivo amyloidowej płytki w mysim modelu choroby Alzheimera

Wybrane przeciwciała MS-R IgG1 testowano u podwójnie transgenicznych myszy APP/PS2 (Odnośniki: Richards i wsp., Soc. Neurosci. Abstr., Vol. 27, Program Nr 5467, 2001) ze względu na dekorację amyloidowych płytek in vivo. Przeciwciała (1 mg/mysz) podawano dożylnie, po trzech dniach mózg perfundowano roztworem soli i przygotowywano do cięcia w stanie zamrożonym. W innym badaniu myszy poddano działaniu większych stężeń przeciwciał tj. podano dożylnie 2 mg w dniu 0, 3, i 6. Myszy zabijano w dniu 9. Obecność przeciwciał związanych do amyloidowych płytek badano w nieutrwalanych skrawkach krojonych na kriostacie, metodą podwójnego znakowania pośredniej fluorescencji używając kozich anty ludzkich IgG (H+L) sprzężonych z którymś z Cy3 (#109165-003, Jackson Immuno Research) a następnie immunokoniugatu BAP-2-Alexa488. Obrazowanie wykonano przy użyciu konfokalnej mikroskopii laserowej a przetwarzanie obrazu do ilościowej detekcji kolokalizacji przy użyciu IMARIS i oprogramowania COLOCALIZATION (Bitplane, Switzerland). Typowe przykłady pokazano na Rycinach 10-14. Stwierdzono, że wszystkie testowane przeciwciała wykazują immunodekorację amyloidowych płytek in vivo, chociaż zauważono pewną zmienność.

P r z y k ł a d 15: Badanie wiązania różnych monoklonalnych przeciwciał do białka prekursorowego amyloidu (APP) na powierzchni komórek HEK293:

APP jest szeroko reprezentowane w ośrodkowym układzie nerwowym. Wiązanie przeciwciał do APP na powierzchni komórek może prowadzić do aktywacji dopełniacza i zniszczenia komórek w zdrowych obszarach mózgu. Tak więc jest obligatoryjne dla przeciwciał Αβ mających mieć zastosowanie terapeutyczne, żeby były one pozbawione reaktywności w stosunku do APP. Przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw domenie N-końca A-beta (np. BAP-1, BAP-2) rozpoznają odpowiedni epitop także w zrębie APP. W przeciwieństwie do tego, przeciwciała przeciwko środkowemu

PL 216 190 B1 epitopowi (np. 4G8) i przeciwciała będące przedmiotem wynalazku, co zaskakujące, są niezdolne do rozpoznawania APP na powierzchni komórek.

Tak więc, przeciwciała będące przedmiotem wynalazku, które dekorują A-beta, ale nie APP in vivo, mają przewagę nad nieselektywnymi przeciwciałami.

Metoda cytometrii przepływowej jest dobrze znana w tej dziedzinie. Względne jednostki fluorescencji (FL1-H) mierzone przy użyciu cytometrii przepływowej wskazują wiązanie odpowiedniego przeciwciała przez powierzchnię komórki. Przesunięcie fluorescencji w transfekowanych APP komórkach HEK293 w porównaniu do nietransfekowanych komórek HEK293 wskazuje na niechcianą reakcję z APP na powierzchni komórki. Przykładowo przeciwciała BAP-1 i BAP-2 przeciwko domenie N końca wykazują znaczące przesunięcie sygnału FL-1 w HEK293/APP (mocna linia) w porównaniu do nietransfekowanych komórek HEK293 (kropkowana linia). Przeciwciało 4G8 (specyficzne dla środkowego epitopu A-beta) i wszystkie przeciwciała będące przedmiotem niniejszego wynalazku (specyficzne względem epitopów A-beta N końca i środkowego) nie wykazują znaczącego przesunięcia fluorescencji. Różnice w podstawowej fluorescencji między komórkami HE293/APP i HEK293 są związane z różnym rozmiarem komórek. Stosowano aparat FACScan w połączeniu z Cellquest Pro Software package (oba Becton Dickinson).

P r z y k ł a d 16: Lista zidentyfikowanych SEQ ID NO odnoszących się do cząsteczek przeciwciał będących przedmiotem wynalazku.

Załączona tabela 10 odnosi się do sekwencji, jak zdefiniowano tutaj, dla pewnych specyficznych cząsteczek przeciwciał będących przedmiotem wynalazku.

T a b e l a 10: Identyfikacja SEQ ID NO dla cząsteczek przeciwciał rodzicielskich a także przeciwciał zoptymalizowanych, dojrzałychi/lub klonowanych krzyżowo.

Cząsteczka #	VH prot	VL prot	VH DNA	VL DNA	HCDR3 prot	HCDR3 DNA	LCDR3 prot	LCDR3 DNA
3	4	10	3	9	22	21	16	15
7	6	12	5	11	24	23	18	17
8	8	14	7	13	26	25	20	19
3.6H5x3.6L2	33	47	32	46	61	60	75	74
3.6H8x3.6L2	35	49	34	48	63	62	77	76
7.4H2x1.2L1	37	51	36	50	65	64	79	78
7.9H2x7.12L2	39	53	38	52	67	66	81	80
7.9H4x7.12L2	41	55	40	54	69	68	83	82
7.11K1x7.11L1	43	57	42	56	71	70	85	84
7.11H1x7.2L1	45	59	44	58	73	72	87	86
7.9H7	89	91	88	90	93	92	95	94
3.3H1x3.4L9	295	325	294	324	355	354	385	384
3.4H1x3.4L9	297	327	296	326	357	356	387	386
3.4H3x3.4L1	299	329	298	328	359	358	389	388
3.4H3x3.4L9	301	331	300	330	361	360	391	390
3.4H7x3.4L9	303	333	302	332	363	362	393	392
3.6H5x3.6L1	307	337	306	336	367	366	397	396
7.2H2x7.2L1	309	339	308	338	369	368	399	398
7.4H2x7.12L2	311	341	310	340	371	370	401	400
7.9H2x7.2L1	313	343	312	342	373	372	403	402
7.9H2x7.12L1	315	345	314	344	37 5	374	405	404
7.11H2x7.2L1	317	347	316	346	377	376	407	4 06
7.11H2x7.9L1	319	349	318	348	379	378	409	408
7.11H2x7.12L1	321	351	320	350	381	380	411	410
8.1K1x8.2L1	323	353	322	352	38 3	382	413	412

PL 216 190 B1

1/165 Lista	sekwencji	OK-IT-14/5S068
<110>	F. Hoffmann-La Roche AG MorphoSys AG
<120>	Przeciwciała anty A-beta	i ich zastosowanie
<130>	F 2842 PCT
<1405.	EP 02003844.4
< 1 4 Τ ί	2002-02-20
<150>	EP 02003844,4
<151>	2002-02-20
<160>	414
<170>	Patenty w wersji 3.1
<210>	1
<211>	9
<212>	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220> <223 >	konstrukcja syntetyczna	pierwszy region peptydu beta-A4
<400>	1
Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly	Tyr

5 <210> 2 <211> 14 <212 > PET <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; drugi region peptydu beta-A4 <400> 2

Val His His Sin Lys Leu Val Phe Phe Ala Siu Asp Val Gly 15 10 <210> 3 <211> 368 <2125. DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; region VH MS-Roche#3 <400> 3 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120

PL 216 190 B1

2/165

cctgggaagg	gtctcgagtg ggtgagcgcg attagcggta gcggcggcag cacctattat	180
gcggatagcg	tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat	240
ctgcaaatga	acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtcttact	300
cattatgctc	gttattatcg ttattttgat gtttggggcc aaggcaccct ggtgacggtt	360
agctcagc		368

<210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; region VH MS-Roche#3 <400> 4

Gin Val -i _L	Gin Leu	Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
5	10	15
Ser Leu	Arg Leu	Ser	Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr	Phe Ser Ser Tyr
	20		25	30
Ala Met	Ser Trp	Val	Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly	Leu Glu Trp Val
	35		40	45
Ser Ala	Ile Ser	Gly	Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr	Ala Asp Ser Val
50			55 60
Lys Gly	Arg Phe	Thr	Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys	Asn Thr Leu Tyr
65			70 75	80
Leu Gin	Met Asn	Ser	Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala	val Tyr Tyr Cys
		85	90	95
Ala Arg	Leu Thr	His	Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr	Phe Asp Val Trp
	100		105	110
Gly Gin	Gly Thr	Leu	Val Thr Val Ser Ser
	115		120
<210>	5
<211>	379
<212>	DNA
<213?	sztuczna	sekwencj a

PL 216 190 B1

3/165 <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; region VH MS-Roche#7 <400> 5

caggtgcaat	tggtggaaag	cggcggcggc	ctggtgcaac	cgggcggcag	cctgcgtctg	60
agctgcgcgg	cctccggatt	tacctttagc	agctatgcga	tgagctgggt	gcgccaagcc	12 0
cctgggaagg	gtctcgagtg	ggtgagcgcg	attagcggta	gcggcggcag	cacctattat	180
gcggatagcg	tgaaaggccg	tttaccattt	cacgtgataa	ttcgaaaaac	accctgtatc	240
tgcaaatgaa	cagcctgcgt	gcggasgata	cggccgtgta	ttcittgcgcg	cgtggtaagg	300
gtaatactca	taagccttat	ggttatgttc	gttattttga	tgtttggggc	caaggcaccc	360
tggtgacggt	tagctcagc					379

<210>	€
<211>	126
<212>	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223.·-	konstrukcja syntetyczna;	region vh MS	-Roche#7
<400>	S
Gin Val Gin Leu Val Glu. Ser Gly	Gly Gly Leu	Val Gin Pro Gly Gly

10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Aap Thr Ala Val Tyr Tyr Cyn

90 95

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr

100 105 110

PL 216 190 B1

4/165 <210> 7 <211> 374 <212> DNA <2ł3> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; region VH MS-Roche#8 <400> 7

caggtgcaat	tggtggaaag	cggcggcggc	ctggtgcaac	cgggcggc&g	cctgcgtctg	60
aSct9cgcgg	cctccggatt	taectttagc	agctatgcga	tgagctgggt	gcgccaagcc	120
cctgggaagg	gtctcgagtg	Sgtgagcgcg	attagcggta	gcggcggcag	cacctattat	180
gcggatagcg	tgaaaggccg	ttttaccatt	tcacgtgata	at t ega aa. a a	caccctgtat	240
ctgcaaatga	acagcctgcg	tgcggaagat	acggccgtgt	afcOat tgege	gcgtcttctt	300
tctcgtggtt	ataatggtta	ttatcataag	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	cagc					374

<210> 8 <21ł> 124 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; region VH MS-Roche#8 <40Q> 8

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

Ξ5 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

70 75 80

PL 216 190 B1

5/165

Ala Arg Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 330 < 212 > DNA <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna; region VL MS-Roche#3 <400> 9

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gagcgtgagc	ągcagctatc		C C&CJC 3ŁCJ 23. aa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	gqcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	1Θ0
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcggttta	ttattgccag	caggtttata	atcctcctgt	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

PL 216 190 B1

6/165

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Tyr Asn Pro Pro 85 90 95

Val Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <21Q> 11 <211> 330 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja < 2 2 0 >

<223s konstrukcja syntetyczna; region VL· MS-Rcche#7 <400> 11

gatatcgtgc	fcgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gagcgtgagc	agcagctatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgcttt	cagctttatt	ctgatccttt	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> <211> <212> <213>	12 110 PRT sztuczna	sekwencj a
<220> <223>	konstrukcja syntetyczna;
<400>	12
Asp Ile Val Leu	Thr Gin Ser Pro

region VL MS-Roche#7

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

5

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 20

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lya 35 40

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala 50 55

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 25 30

Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 45

Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 60

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

PL 216 190 B1

<210> 13 <211> 330 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja < 22 0 >

<223> konstrukcja syntetyczna,- region VL MS-Hoche#8 <400> 13 .

gatatcgtgc	tgacccsgag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gagcgtgagc	agcagctatc	tggcgtggta	CC3CJCcłCJĆ3.a.t3.	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagctttctt	ottttcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210>	14
<211>	110
<212 >	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna;	region VL MS~Roche#8
<400>	14
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro	Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

PL 216 190 B1

8/165

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu ,Glu 65 70 75 60

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Ser Ser Phe Pro 85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 HO <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VL MS-Roche#3 <400> 15 cagcaggttt ataatcctcc tgfcfc <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VL MS-Roche#3 <400> 16

Gin Gin Val Tyr Asn Pro Pro Val <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>

konstrukcja syntetyczna,· CDR3 regionu vl MS-Roche#7 <400> 17 tttcagcttt attctgatcc tttt

<210>	18
<211>	8
<212>	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220> <2 2 3 >	konstrukcja syntetyczna
<400>	18

PL 216 190 B1

9/165

Phe Gin Leu Tyr Ser Asp Pro Phe

1	5
<210> <212> <213>	19 24 DNA sztuczna sekwencja

<220> 7 7 3

konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VL MS-Roche#8

<400> 19 ca.gcagcfct.fc cttcttttcc tcct 24

<210> <211> <212> <213>

20 8 PRT sztuczna sekwencja

<220> <223>	konstrukcja syntetyczna,· CDR3 regionu vl MS-Roche#8
<400>	20

Gin. Gin Leu Ser Ser Phe Pro Pro 1 5

<210> --211-.- <212> <213>

21 39 DNA sztuczna sekwencja

<22Q> <223>	konstrukcja syntetyczna,- CDR3 regionu VH M3-Roche#3
<40G>	21

cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt

<210> <211> <212> <213>

22 13 PRT sztuczna sekwencja

<220> <223>	konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VH MS-Roche#3
<400>	22

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val

1	5 10
<210 > <2łl>	23 51

PL 216 190 B1

10/165 <212> DNA <213» sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VH MS-Roche#7 <400> 23 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51

<210> <211> <212> <213 >	24 17 PRT sztuczna sekwencja
< 22 0 > <223>	konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VH MS~Roche#7
<40Q>	2 4

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 15 10 15

Val
<210> <211> <212> <213>	25 45 DNA sztuczna sekwencja
<2 20 > <223»	konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VH MS-Roćhe#8

<400> 25 cttctttctc gtggttataa tggttattat cataagtttg atgtt 45

<210> <211» <212 > <213>	26 15 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; CDR3 regionu VH MS-Roche#8
<400>	26

Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp Val

1	5 10 15
<210> <211» <213»	27 42 PRT sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

11/165 <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; peptyd bet.a-A.4 <400=. 27

Asp Ala Glu Phe Arg His

Asp

Ser

Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys

1

5

10

15

Leu

Val

Phe

Phe

Al h

Glu

Asp

Val

Giy

Ser

Asn

Lys

Gly

Ala

Ile

Ile

20

25

30

Gly

Leu

Met

Val

Gly

Gly

Val

Val

Ile

Ala

40 <2l0> 28 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukcja syntetyczna; starter VL dla <400> 28 gtggtggttc cgatatc 17 <210> 29 <211> 43 <212> DNA <2i3> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna,· wsteczny starter VŁ ' <400> 29 agcgtcacac tcggtgcggc tttcggctgg ccaagaacgg tta 43 <210> 30 <21117 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; starter kontrolny dla <400> 30 caggaaacag ctatgac 17 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

PL 216 190 B1

12/155 <223> konstrukcja syntetyczna,- kontrolny starter wsteczny <400> 31 taccgttgct cttcacccc 19 <210> 32 <211> 360 <212> DNA <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2 <40 0> 32

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	c&accgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagcfcat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctatttct	gagtctggta	agactaagta	ttafcgctgat	130
tctgttaagg	gfccgttttac	catttcacgt	gafcaattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tactcattat	300
gctcgttatt	atcgttattt	tgatgtttgg	ggccasggca	ccctggtgac	ggttagctca	360

<210? 33 <211? 120 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#3.6H5 x 3.5L2 <400? 33

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 15 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Ser Glu Ser Gly Lys Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin

70 75 80

PL 216 190 B1

<210> 34 <211> 360 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna,- VH MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2 <400=· 34

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttaccfct	tagcagctat	gcgatgagct	Sggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctatttct	gagtattcta	agtttaagta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatcfcgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tactcattat	300
gctcgttatt	atcgttattt	tgatgtttgg	ggccaaggca	ccctggtgac	ggttagctca	360

<210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2 <400> 35

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15

He Ser Glu Tyr Ser Lys Phe Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala

40 45

PL 216 190 B1

14/165

Arg Phe 65	Thr	Ile Ser	Arg Asp Asn 70	Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin
75	eo
Met Asn	Ser	Leu Arg	Ala Glu Asp	Thr Ala Vał	Tyr Tyr Cys Ala Arg
		35		90	95
Leu Thr	Hia	Tyr Ala	Arg Tyr Tyr	Arg Tyr Phe	Asp Val Trp Gly Gin
		100		105	110
Gly Thr	Leu	Val Thr	Val Ser Ser
	115		120
<210>	36
<211»	372
<212>	DNA
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	kons	trukcja !	syntetyczna;	VH MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1

<400» 36

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	12 0
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctattaat	tataatggtg	ctcgtattta	ttatgctgat	ISO
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattega	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372

<210»	37
<211>	124
<212»	PR.T
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223 >	konstrukcja syntetyczna	VH M5 RochGit7.4H2 x	7.2L1
<400>	37
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly	Leu Val Gin Pro Gly	Gly Ser Leu

5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala

PL 216 190 B1

15/165

35	40	45
Ile Asn Tyr Asn Gly Ala	Arg Ile Tyr Tyr Ala	Asp Ser Val Lys Gly
50	55	60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg	Asp Asn Ser Lys Asn	Thr Leu Tyr Leu Gin
65 70	75	80
Met Asn Ser Leu Arg Ala	Glu Asp Thr Ala Val	Tyr Tyr Cys Ala Arg
8 5	90	95
Gly Lys Gly Asn Thr His	Lys Pro Tyr Gly Tyr	Val Arg Tyr Phe Asp
100	105	110
Val Trp Gly Gin Gly Thr	Leu Val Thr Val Ser	Ser
115	120
<210> 38
<211? 372
<212> DNA
<213> sztuczna sekwencja
<220?
<223? konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#7,9H2 x 7.12L2

<400> 38

caattggfcgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gattfcacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agt-gggtgag	cgctattaat	gctgatggta	atcgtaagta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	oatttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcn	tgogtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372

<27 0-.- 39 <211> 124 <212> PRT <213? sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#7.9H2 x 7.12L2 <4Q0> 39

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 15 10 15

PL 216 190 B1

16/165

Arg	Leu	Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr	Plie	Ser	Ser	Tyr Ala Met 3 0
20	25
Ser	Trp	Val Arg	Gin Ala Pro Gly Lys Gly	Leu	Glu	Trp	Val Ser Ala
		35	40			45
Ile	Asn	Ala Asp	Gly Asn Arg Lys Tyr Tyr	Ala	Asp	Ser	Val Lys Gly
	50		55		60
Arg	Phe	Thr Ile	Ser Arg Asp Asn Ser Lys	Asn	Thr	Leu	Tyr Leu Gin
65			70	75			80
Met	Asn	Ser Leu	Arg Ala Glu Asp Thr Ala·	Val	Tyr	Tyr	Cys Ala Arg
			85 90				95
Gly	Lys	Gly Asn	Thr His Lys Pro Tyr Gly	Tyr	Val	Arg	Tyr Phe Asp
		100	105				110
Val	Trp	Gly Gin	Gly Thr Leu Val Thr Val	Ser	Ser
		115	120
<210>	40
<211>	372
<212>	DNA
<213 >	sztuczna	sekwencja
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#7.9H4 z	: 7.12L2

<400> 40

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctattaat	gctgttggta	tgaagaagtt	ttatgctgat	130
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat.	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372

<210> 41 <211> 124 <212> PRT <213 > sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

17/165 <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#7.9H4 x 7.12L2 <400> 41

Gin Leu 1	Val Glu	Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu
5	10	15
Arg Leu	Ser Cys	Ala	Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser	Ser Tyr Ala Met
	20		25	30
Ser Trp	Val Arg	Gin	Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu	Trp Val Ser Ala
	35		40	45
Ile Asn	Ala Val	Gly	Met Lys Lys Phe Tyr Ala Asp	Ser Val Lys Gly
50			55 60
Arg Phe	Thr Ile	Ser	Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr	Leu Tyr Leu Gin
65			70 75	80
Met Asn	Ser Leu	Arg	Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr	Tyr Cys Ala Arg
		85	90	95
Gly Lys	Gly Asn	Thr	His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val	Arg Tyr Phe Asp
	100		105	110
Val Trp	Gly Gin	Gly	Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
	11S		120
<210>	42
<211>	372
<212>	DNA
<213>	sztuczna	sekwencja

<220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#7.11H1 x 7.11L1 <400> 42

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	SSgtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cggtattaat	gctgctggtt	ttcgtactta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaa t	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372

PL 216 190 B1

18/165
<210>	43
<211>	124
<212>	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<22 0>
<223>	konstrukcja syntetyczna;
<400>	43
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

Arg Łeu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly 35 40 45

Tle Asn Ala Ala Gly Phe Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 10 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 100 105 110 val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210=· 44 <211> 372 <212> DNA <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#7,11H1 x 7.2L1 <400> 44

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cggtattaat	gctgctggtt	ttcgtactta	ttatgctgat	180

PL 216 190 B1

19/165

tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc ctfcatggtta tgttcgttat tttgatgttt ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct ca		372

<210? 45 <211? 124 <212> PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#?.11H1 x 7.2L1 <400> 45

Gin Leu 1	val Glu	Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu
5	10	15
Arg Leu	Ser Cys	Ala	Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser	Ser Tyr Ala Met
	20		25	30
Ser Trp	Val Arg	Gin	Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu	Trp Val Ser Gly
	35		40	45
Ile Asn	Ala Ala	Gly	Phe Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp	Ser Val Lys Gly
50			55 60
Arg Phe	Thr Ile	Ser	Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr	Leu Tyr Leu Gin
65			70 75	80
Met Asn	Ser Leu	Arg	Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr	Tyr Cys Ala Arg
		85	90	95
Gly Lys	Gly Asn	Thr	His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val	Arg Tyr Phe Asp
	100		105	110
Val Trp	Gly Gin	Gly	Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
	115		120
<210?	46
<211?	330
<212?	DNA
<213?	sztuczna	sekwencj a

<220?

<223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#3,SH5 x 3.6L2

PL 216 190 B1

20/165 <400» 46

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gtttctttct	cgttattatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggteccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	cŁ TL c c Q g C cl	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	24 0
cctgaagact	ttgcggttta	ttattgccag	cagacttata	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210» 47 <211> 110 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2 <400» 47

Asp 1	Ile Val	Leu Thr 5	Gin	Ser	Pro Ala	Thr Leu 10	Ser	Leu	Ser	Pro 15	Gly
Glu	Arg Ala	Thr Leu	Ser	Cys	Arg Ala	Ser Gin	Phe	Leu	Ser	Arg	Tyr
		20			25				30
Tyr	Leu Ala	Trp Tyr	Gin	Gin	Lys Pro	Gly Gin	Ala	Pro	Arg	Leu	Leu
	35				40			45
Ile	Tyr Gly	Ala Ser	Ser	Arg	Ala Thr	Gly Val	Pro	Ala	Arg	Phe	Ser
	50			55			60
Gly	Ser Gly	Ser Gly	Thr	Asp	Phe Thr	Leu Thr	Ile	Ser	Ser	Leu	Glu
65			70			75					80
Pro	Glu Asp	Phe Ala	Val	Tyr	Tyr Cys	Gin Gin	Thr	Tyr	Asn	Tyr	Pro
		85				90				95
Pro	Thr Phe	Gly Gin	Gly	Thr	Lys Val	Glu Ile	Lys	Arg	Thr
		100			105				110
<21C	ι» 48
<211> 330
<212» DNA
<213	> sztuczna sekwencj	a
<220>
<223	> konst	;rukcja i	syntetyczna; VL MS-Roche#3.6H8 x	3.6L2

PL 216 190 B1

21/165
< 4 0 0 > 4 8 gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gtttctttct	cgttattatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcggttta	ttattgccag	cagacttata	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210? 49 <211> 110 <212> PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2 <4 00> 49

Asp 1	Ile	val	Leu	Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser	Leu	Ser	Pro 15	Gly
5	10
Glu	Arg	Ala	Thr	Leu Ser	Cys Arg Ala Ser Gin Phe	Leu	Ser	Arg	Tyr
			20		25		30
Tyr	Leu	Ala	Trp	Tyr Gin.	Gin Lys Pro Gly Gin Ala	Pro	Arg	Leu	Leu
		35			40	45
Ile	Tyr	Gly	Ala	Ser Ser	Arg Ala Thr Gly Val Pro	Ala	Arg	Phe	Ser
	50				55 60
Gly	ser	Gly	Ser	Gly Thr	Asp Phe Thr Leu Thr Ile	Ser	Ser	Leu	Glu
65				70	75				80
Pro	Glu	Asp	Phe	Ala Val	Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr	Tyr	Agn	Tyr	Pro
				85	90			95
Pro	Thr	Phe	Gly	Gin Gly	Thr Lys Val Glu Ile Lys	Arg	Thr
			100		105		110
<210>	50
<211?	330
<212>	DNA
<213?	sztuczna	sekwencja

<220>

PL 216 190 B1

22/1SS <223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roehe#7.4H2 x 7.2L1 <400> 50

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	50
ctgagctgca	gagcgagcca	gtatgttgat	cgtacttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaattfcat	ggcgcgagca	gecgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagatttatt	cttttcctca	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> 51 <211> 110 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#7.4H2 x 7.2L1 <400> 51

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Tyr Val Asp Arg Thr 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala. Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 S0

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cya Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro 85 90 95

His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 52 <211> 330 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

23/J6S <22 Ο» <223> konstrukcja syntetyczna,- VL MS“Roche?47.9H2 x 7.12L2 <400> 52

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagc tgca	geicjcg&gcCci	gcgttttttt	a t t t c:	tggcgtggta	ccagc&gaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttct	ggttcttcta	accgtgcaac	tggggtcccg	180
gegcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	11gcggttta	11 a 11 c c 11	cagctttata	atattcctaa	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> 53 .

<211> 110 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukcja syntetyczna,· VL MS~Rache#7.9H2 x 7.12Ł2 <400> 53

Asp 1

Ile

Val

Leu

Thr Gin Ser 5

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu Ser Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Arg

Phe

Phe

Tyr

Lys

20

25

30

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr Gin Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

35

40

45

Ile

Ser

Gly

Ser

Ser Asn Arg

Ala

Thr

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

50

55

6Q

Giy

Ser

Gly

Ser

Gly Thr Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

65

70

75

80

Pro

Glu

Asp

phe

Ala Val Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gin

Leu

Tyr

Asn

Ile

Pro

85

90

95

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin Gly Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

<210>

54

<211>

330

<212>

DNA

<213>

sztu

o zna

sekwencj a

PL 216 190 B1

24/165 <220·<223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#7,9H4 x 7.12L2 <400> 54

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gcgttttttt	tataagtatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttct	ggttcttcta	accgtgcaac	tggggtcccg	1Θ0
gcgcgtttta	gcggctctgg	a ł—! f-! fł{”T rM a f-t {·“* ci u. c. c, y y u. ac y	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcggttta	ttattgcctt	cagctttata	atattcctaa	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> 55 <211> 110 <212> PRT <213=· sztuczna sekwencja <220=· <223 > konstrukcją syntetyczna; VL MS-Rochei#7.9H4 x 7.12L2 <400> 55

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 s 10 ' 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Arg Phe Phe Tyr Lys 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu S5 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Leu Tyr Asn Ile Pro

90 95

Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110 <210> 56 <211> 330 <212> DNA

PL 216 190 B1

25/165 <213? sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#7.11H1 x 7.11L1 <400» 56 .

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gcgtattctt	cgtatttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgact ta	ttattgccag	caggtttatt	ctcctcctca	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> S7 <211? 110 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#7.11H1 x 7.11L1 <400» 57

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Arg Ile Leu Arg Ile 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 S0 <210> 58 <211> 330

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Tyr Ser Pro Pro

90 95

His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

PL 216 190 B1

26/165 <212=. DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#7.11H1 x 7.2L1 <400> 58

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gtatgttgat	cgtacttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagatttatt	cttttcctca	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210>	59
<211>	110
<212>	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna;	VL MS-Roche#7.11H1 X 7.2L1
<400 >	59
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro	Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Tyr Val Asp Arg Thr 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 <210> 60

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro

90 95

His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

PL 216 190 B1

27/165 <211> 39 <212? DNA <213? sztuczna sekwencja <220?

<223> HCDR3 MS-Roche#3.6Η5 X 3.6L2 <400? 60 cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt 33 <210? 61 <211? 13 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? HCDR3 MS-Roche#3,6H5 X 3.6L2 <400? 61

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val

10 <210? 62 <211? 39 <212> DNA <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? HCDR3 WS-Roche#3.6HS x 3.6L2 <400? 62 cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt 39 <210? 63 <211? 13 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? HCDR3 MS-Roche#3.6H8 X 3.6L2 <400? 63

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val

10

<210?	64
<211?	51
<212?	DNA
<213?	sztuczna sekwencja
<220?
<223?	HCDR3 MS-Rochefi7.lH2x7.2Ll

PL 216 190 B1

28/165 <400> 64 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51 <210» 65 <211» 17 <212» PRT<213» sztuczna sekwencja <220» <223» HCDR3 MS-Roche#7.4H2x7.2L1 <400» 65

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

10 15

Val <210» 66 <211» 51 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» HCDR3 MS-Roche#7.9H2x7.12L2 <400» 66 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51 <210» 67 <211» 17 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» HCDR3 MS-ROChe#7.9H2x7.12L2 <400» 67

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

10 15

Val <210» 68 <211» 51 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» HCDR3 MS-Roche#7.9H4x7,12L2

PL 216 190 B1

29/16S <400> 68 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tacgttcgtt attttgatgt t 51 <210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 O >

<223> HCDR3 MS-Roche#7.9H4x7.12L2 <400> 69

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

10 15

Val <210> 70 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> HCDR3 MS-Roche#7 , HHlx7,11L1 <400> 70 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> HCDR3 MS -Rochetf? . HHlx7 . ULI <400> 71

Gly Lys Gly Aen Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

5 10 15

Val <210> 72 <211> 51 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220 >

PL 216 190 B1

30/16Ξ <223> HCDR3 MS-Roche#7.11Η1Χ7.2L1 <400? 72 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51 <210? 73 <211? 17 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? HCDR3 MS-Roche#7.11Η1χ7.2L1 <400? 73

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 1 S 10 15

Val <210? 74 <211? 24 <212? DNA <213? sztuczna sekwencja <22 0 ?

<223? LCDR3 MS-Roche#3.6H5 X 3,6L2 <400? 74 cagcagactt ataattatcc tcct 24 <210? 75 <211? 8 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? LCDR3 MS-Roche#3.6H5 x 3.6L2 <400? 75

Gin Gin Thr Tyr Asn Tyr Pro Pro 1 5

<210?	76
<211?	24
<212?	DNA
<213?	sztuczna	sekwencja
<220? <223?	LCDR3 MS-	-Roche#3.6H8 x 3.6L2
<400?	76

PL 216 190 B1

31/165 eagcagactt ataattatcc tcct 24 <210» 77 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» LCDR3 MS-Roche#3.6H8 x 3.6L2 <400» 77

Gin Gin Thr Tyr Asn Tyr Pro Pro 1 5 <210» 78 <211» 24 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» LCDR3 MS-Roche#7.4H2x7.2L1 <400> 78 cagcagattt attcttttcc tcat 24 <210» 79 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» LCDR3 MS-Roche#7.4H2x7.2L1 <400» 79

Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro His 1 5 <210» 80 <211» 24 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» LCDR3 MS-ROche#7,9H2x7.12L2 <400» 80 cttcagcttt ataatattcc taat 24 <210» 81 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja

100

PL 216 190 B1

32/165

<220» <223>	LCDR3 MS-Roche#7.9H2x7.12L2
<400»	81

Leu Gin Leu Tyr Asn Ile Pro Asn

1	5
<210» <211» <212> <213 >	82 24 DNA sztuczna sekwencja

<220» <223»

LCDR3 MS-Roche#7.9H4x7.12L2

<400» 82 cttcagcttt ataatattcc taat 24

<210> <211» <212» <213»

83 8 PRT sztuczna sekwencja

<220> <223 >	LCDR3 MS-Roche#7 , SIi4x7.12L2
<400»	83

Leu Gin Leu Tyr Asn ile Pro Asn

1	5
<210» <211» <212» <213»	84 24 DNA sztuczna sekwencja

<220» <223»

LCDR3 MS“Soche#7.11Η1Χ7.11L1

<400» 84 cagcaggttt attctcctoc tcat 24

<210» <211» <212» <213»

85 8 PRT sztuczna sekwencja

<220» <223>	LCDR3 MS-Roche#7.11HlX7.11Ll
<4 00»	85

Gin Gin Val Tyr Ser Pro Pro His

PL 216 190 B1

101

33/165 _ 5 <210> 86 <211» 24 <212» DNA <213> sztuczna sekwencja <220» <223> LCDR3 MS-Roche#7.11Η1Χ7.2L1 <40ΰ> 86 cagcagattt attcttttcc tcat 24 <210» 87 <211> 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» LCDR3 MS-Roche#7.11Η1χ7.2L1

-.400» 87

Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro His

5 <210» 88 <211> 378 <212> DNA <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna; VH MS-Roche#7.9H7 <400» 88

caggtgcaat	tggtggaaag	cggcggcggc	ctggtgcaac	cgggcggcag	cctgcgtctg	60
agctgcgcgg	cctccggatt	tacctttagc	agctatgcga	tgagctgggt	gcgccaagcc	120
cctgggaagg	gtctcgagtg	ggtgagcgct	attaatgctt	ctggtactcg	tacttattat	180
gctgattctg	ttaagggtcg	ttttaccatt	tcacgtgata	attcgaaaaa	caccctgtat	240
ctgcaaatga	acagcctgcg	tgcggaagat	acggccgtgt	attattgcgc	gcgtggtaag	300
ggtaatactc	ataagcctta	tggttatgtt	cgttattttg	atgtttgggg	ccaaggcacc	360
ctggtgacgg	ttagctca					378

<210> 89 <211> 126 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

102

PL 216 190 B1

34/165 <223? konstrukcja syntetyczna,- VH MS-Roche#7,9H7 <400? 39

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly ¹⁵ io 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr ²⁰ 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val ⁵⁰ 55 6Q

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn, Ser Lys Aan Thr Leu Tyr ⁶⁵ 70 75 so

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 _S5

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyi- Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110

Phe Asp Val Trp Gly Gin Gły Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ¹¹⁵ 120 125 <210? 90 <211? 330 <212? DNA .

<213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna,- VL MS-Roche#7,9H7 <400? 90

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gagcgtgagc	agcagctatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgcctt	cagatttata	atatgcctat	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				33 0

<210? 91

PL 216 190 B1

103

35/165 <211> 110 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; VL MS-Roche#7.9H7 <400> 91

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly ¹ 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser

25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

55 60 '

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu ⁶⁵ 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <2l0> 92 <211> 51 <212 > DNA <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR3 MS-Roche#7.9H7 <400> 92 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51

«.·>'!'> 93 <211> 17 ' <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR3 MS-Roche#7.9H7 <400> 93

104

PL 216 190 B1 ,36/165 ^G1Y Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp ¹ 5 10 15

Val <210? 94 <211? 24 <212? DNA<213> sztuczna sekwencja <220?

<223> konstrukcja syntetyczna,- LCDR3 MS~Roche#7.3H?

<400> 94 cttcagattt ataatatgcc tatt <210? 95 <211? 8 <212? PRT <213> sztuczną sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; LCDS3 MS-Roche#7.3H7 <400? 35

Leu Gin Ile Tyr Asn Met Pro Ile

5 <210? 96 <211? 12 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; LCDRl MS-Roche#3 <400? 96

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala ¹ 5 10 <210? 9?

<211? 7 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<323? konstrukcja syntetyczna; LCDR2 MS-Roche#3 <400? 97

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

PL 216 190 B1

105

37/165

X 5 <210» 98 <211> 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#3 <400» 98

Gin Gin Val Tyr Asn Pro Pro Val

5 <210> 99 <211» 10 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDRi MS-Roche#3 <400» 99

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser ¹ 5 10 <210» 100 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3 <400» 100

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 io 15

Gly

<210»	101
<211»	13
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<22 0»
<223»	konstrukcja syntetyczna; HCDR3 MS-Koche#3
<400»	101

106

PL 216 190 B1

38/155

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val ¹ 5 io <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#3.l <400> 102

Gin Gin Val Tyr Ser Val Pro Pro

5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#3.2 <400> 103

Gin Gin Ile Tyr Ser Tyr Pro Pro

5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#3.3 <4Q0> 104

His Gin Met Ser Ser Tyr Pro Pro

5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#3.4 <400> 105

Gin Gin. Thr Tyr Asp Tyr Pro Pro

5

PL 216 190 B1

107

39/165 <21 Οι- 106 <211? 8 <212? PRT <213> sztuczna sekwencja <22:·?

<223>	konstrukcja syntetyczna	LCDR3	MS-Roch-e#3.5
<40O>	106
Gin Gin Ile Tyr Asp Tyr Pro Pro 1 5
<210? <211? <212? <213?	107 8 PRT sztuczna sekwencja
<220? <223?	konstrukcja syntetyczna;	LCDR3	MS-Roche#3,6

<400? 107

Gin Gin Thr Tyr Asn Tyr Pro Pro 1 5 <210? 108 <211> 17 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3-2H1 <400> 108

Ala Ile Ser Glu His Gly Leu Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹⁵ 10 15

Gly <210? 109 <211? 17 <212? PRT <213> sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna? HCDR2 MS-Rcche#3.2H2 <400? 109

Ala Ile Ser Gin Arg Gly Gin Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ¹ 5 io

40/165

Val Lys 15

108

PL 216 190 B1

40/165

Gly <210> 110 <211? 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223>	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#3„3H1
<400>	110
Val Ile Ser Glu Lys Ser Arg Phe	Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1	5	10 15
Gly

<210>	111
<211>	17
<212 >	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220 ·.·· <223 >	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#3.3H2
<400>	111
Val Ile Ser Gin Glu Ser Gin Tyr 1 5	Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 10	Val Lys 15
Gly

<-2i:>	112
<211>	17
<212 >	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#3.3H3
<400>	112
Ala Ile Ser Gin Asn Gly Phe His	Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser	Val Lys
1	5	10	15

Gly

PL 216 190 B1

109

41/165 <210> 113 <211» 17 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetycznaHCDR2 MS-Roche#3.4H1 <400» 113

Ala Ile Ser Glu Thr Ser Ile Arg Lye Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹⁵ 10 is

Gly <210» 114 <211» 16 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS~Roche#3.4H2 <400> 114

Val Ile Asp Met Val Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 ₁₅ <210» 115 <211» 17 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna,· HCDR2 MS-Roche#3.4H3 <400» 115

Val Ile Ser Gin Thr Gly Arg Lys Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 Ig

Gly <210» 116 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.4H4

110

PL 216 190 B1

42/165 <400> 116

Ala Ile Ser Glu Thr Gly Met His	Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val	Lys
1 Gly	5	10	15
<210»	117
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS~Roehe#3.4H5
<400>	117
Val Ile 1	i Ser Gin Vał Gly Ala His 5	Ile Tyr 10	Tyr Ala Asp Ser	Val 15	Lys
Gly
<210>	118
<211»	17
<212»	PRT
<213 >	sztuczna sekwencja
<220>
<223»	konstrukcja syntetyczna	HCDR2 MS-Roche#3.4H6
<400»	118
Ala Ile 1	! Ser Glu Ser Gly Trp Ser 5	Thr Tyr 10	Tyr Ala Asp Ser	Val 15	Lys
Gly
<210>	113
<211>	17
<212>	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220>
<223»	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS~Roche#3.4H7
<400>	119
Val Ile 1	i Ser Glu.Thr Gly Lys Asn 5	Ile Tyr 10	Tyr Ala Asp Ser	Val 15	Lys

PL 216 190 B1

111

43/165

Giy <210» 120 <211> 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3,4H8 <400» 120

Ala Ile Ser Glu His Gly Arg Phe Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹⁵ 10 15

Giy <210» 121 <211> 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.4H9 <400» 121

Ala Ile Ser Glu Ser Ser Lys Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹⁵ 10 15

Gly <210» 122 <211> 17· <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0>

<223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.4H10 <400> 122

Ala Ile Ser Glu Ser Gly Arg Gly Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹ 5 io 15

Gly

44/165

112

PL 216 190 B1

44/165 <210» 123 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220»

<223»	konstrukcja	syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3-4H11
<400»	123
Ala Ile	Ser Glu Phe	Gly Łys Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1	5	10 15
Gly

<210»	124
<211>	17
<212>	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukej a syntetyczna	HCDR2 S-Roche#3-4H12
<400»	124
Val Ile Ser Gin Thr Gly Gin Asn	Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser	Val Lys
i	5	10	15
Gly

<210»	125
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 S-Roche#3-4H13
<400»	125
Ala Ile	i Ser Glu Gin Gly Arg Asn	Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser	Val Lys
1	5	10	15

Gly <210» 126 <211» 17 <212» PRT<213> sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

113

45/165 <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.4Η14 <400> 126

Ala Ile Ser Glu Ser Gly Gin Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹⁵ 10 15

Gly <210» 127 <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3,4H16 <400> 127

Ala He Ser Glu Ser Gly Val Asn Tle Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹⁵ 10 15

Gly <210> 128 <211> 17 <212> PRT <213 > sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 S~Roche#3,4H17 <400> 128

Ala Ile Ser Glu Phe Gly Gin Phe Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹⁵ 10 15

Gly

<210>	129
<211>	17
<212>	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.4H18
<400»	129

114

PL 216 190 B1

46/165

Ala Ile Ser Gin Gin Ser Asn Phe Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 S 10 15

Gly <210» 130 <211» 12 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#3.4L7 <400» 130

Arg Ala Ser Gin Arg Leu Gly Arg Łeu Tyr Leu Ala 15 10 <210» 131 <211> 12 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR.1 MS-Roche#3,4L8 <400» 131

Arg Ala Ser Gin Trp Ile Thr Lys Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 132 <211> 12 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna,- LCDR1 MS-Roche#3 „4L9 <400» 132

Arg Ala Ser Arg Arg Ile His Val Tyr Tyr Leu Ala 15 10

<210»	133
<211»	12
<212»	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#3.4L11
<400 »	133

PL 216 190 B1

115

47/165

Arg Ala Ser Gin Leu Val Gly Arg Ala Tyr Leu Ala 15 10 <210» 134 <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3,SH1 <400> 134

Val Ile Ser Glu Ser Gly Gin Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210» 135 <211> 17 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.SH2 <400» 135

Val Ile Ser Glu Arg Gly Ile Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ¹ 5 10 15

Gly <210» 136 <211» 17 ' <212» PRT <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.6H3 <400» 136

Val Ile Ser Glu Thr Gly Lys Phe Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 io 15 θίγ

116

PL 216 190 B1

48/165 <210> 137 <211> 1?

<212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.6Η4 <400> 137

Ala Ile Ser Glu Arg Gly Arg His Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lye 15 10 15

Gly <210> 13S <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 M£~Roche#3.6H5 <400> 138

Ala Ile Ser Glu Ser Gly Lys Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 139 <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22O>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#3.6H6 <400> 139

Ala Ile Ser Glu His Gly Thr Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly <210> 140 <211> 17 <212> PRT<213> sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

117

49/165 <22 0>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS~Roche#3.6Η8 <400? 140

Ala Ile Ser Glu Tyr Ser Lys Phe Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly <210? 141 <211? 12 <212? PRT <213 > sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna? LCDR1 MS-Roche#3.6L1 <400? 141

Arg Ala Ser Gin Phe Ile Gin Arg Phe Tyr Leu Ala ¹ 5 io <210> 142 <211? 12 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#3.6L2 <400? 142

Arg Ala Ser Gin Phe Leu Ser Arg Tyr Tyr Leu Ala 1 5 io <210> 143 <211? 12 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna? LCDR.1 MS-Roche#7 <400? 143

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 io <210? 144 ?· 7 <212> PRT <213? sztuczna sekwencja

118

PL 216 190 B1

<210> 148 <211> 17 <212> PRT

PL 216 190 B1

119

51/165

<213>

sztuczna sekwencja

<220? <223»	konstrukcja syntetyczna; HCDR3 MS-Roche#7
<400»	148

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 1 5 10 15

Val
<210» <211» <212» <213»	149 8 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223>	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.1
<400»	149

His Gin Leu Tyr Ser Ser Pro Tyr

1	5
<210» <211» <212» <213»	150 8 PRT sztuczna sekwencja

<220> <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.2
<400»	150

Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro His

1	5
<210» <211» <212» <213>	151 8 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS~Roche#7,3
<400»	151

His Gin Val Tyr Ser His Pro Phe

1	5
<210» <211»	152

120

PL 216 190 B1

52/165

<212 > < 213 >

PRT sztuczna sekwencja

<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.4
<400»	152

Gin Gin Ile Tyr Asn Phe Pro Kis

1	5
<210> <211» <212» <213»	153 8 PRT sztuczna sekwencja

<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7,5
<400»	153

His Gin Val Tyr Ser Ser Pro Phe

1	5
<210> <211» <212» <213>	154 3 PRT sztuczna sekwencja

<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.6
<400»	154

His Gin Leu Tyr Ser Pro Pro Tyr

ł	5
<210» <211» <212» <2ł3>	155 8 PRT sztuczna sekwencja

<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7,7
<400»	155

His Gin Val Tyr Ser Ala Pro Phe

1	5
<210» <211» <213»	156 8 PRT sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

121

53/165 <22 0>

<223» konstrukcja syntetyczna; LCDR3 M£-Roche#7.8 <400» 156

His Gin Vał Tyr Ser Phe Pro Ile

1	5
<210» <212» <213»	157 B PRT sztuczna sekwencja
<220» <22 3»	konstrukcja syntetyczna,· ŁCDR.3 MS-Roche#7.9
<400»	157

Leu Gin Ile Tyr Asn Met Pro Ile

1	5
<210» <211» <212» <213»	158 8 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS~Roche#7.10
<400»	158

Gin Gin Val Tyr Asn Pro Pro His

1	S
<210» <211» <212» <213»	155 8 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.11
<400>	159

Gin Gin Val Tyr Ser Pro Pro His

1	5
<210» <211» <212» <213»	160 12 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDRl M3-Roche#7.12

122

PL 216 190 B1

54/165 <400» 160

Arg Ala Ser Gin Tyr Val Ser Ser Pro Tyr Leu Ala ¹ 5 io <210» 161 <211> 7 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR2 MS-Roche#7.12 <400» 161

Gly Ser Ser Asn Arg Ala Thr

5 <210» 162 <211» 8 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna,- LCDR3 MS-Roche#7.12 <400» 162

Leu Gin Leu Tyr Asn Ile Pro Asn

5 <210» 163 <211» 10 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; HCDRI MS-Roche#7.12 <400» 163

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser ¹ 5 10 <210» 164 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.12 <400» 164

Asn Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

PL 216 190 B1

123

55/165

10 15 dy <210» 165 <211» 17 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; HCDR3 MS-Roche#?.12 <400 165

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 15 10 15

Val <210» 166 <211» 8 <212» PRT <213» Sztuczna sskwcncjs <22 0» <223> konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.13 <400> 166

His Gin Val Tyr Ser Pro Pro Phe

5 <210» 167 <211» 17 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.2H1 <400» 167

Ala Ile Asn Ala Asn Gly Leu Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 168 <211» 17

124

PL 216 190 B1

56/165 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220 >

<223>	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#7.2H2
<400>	168
Ala Ile Asn Gly Thr Gly Met Lys	Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser	Val Lya
1	5	10	15
Gly

<210»	169
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 S-	-Roche#7.	. 2H3
<400»	169
Ala Ile Asn Ala Asn Gly Tyr Lys	Thr Tyr	Tyr Ala	Asp	Ser Val Lys
1	5	10			15
Giy

<210»	170
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223>	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS	-Roche#7.2H4
<400»	170
Ala Ile Asn Ser Lys Gly Ser Arg	Ile Tyr	Tyr Ala Asp Ser	Val Lys
1	5	10		15
Gly

<210» 171 <211> 17 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.2H5

PL 216 190 B1

125

57/165 <400> 171

Ala Ile Asn Ala Thr Gly Arg Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 172 <211> 17 <212 > PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<22 3 > konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS~Roche#7.2H6 <400> 172

Ala Ile Asn Ala Arg Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 173 <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Rocha#7.2H7 <400> 173

Ala Ile Asn Ser Arg Gly Ser Asp Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 174 <211» 17 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna? HCDR2 MS-Roche#7.2H8 <400» 174

Ala Ile Asn Ala Ser Gly His Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 io 15

126

PL 216 190 B1

58/165

Gly <210> 175 <211> 12 <212? PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223? konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#7.2L1 <400? 175

Arg Ala Ser Gin Tyr Val Aśp Arg Thr Tyr Leu Ala 15 10 <210? 176 <211> 12 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#7.2L2 <400? 176

Arg Ala Ser Gin Tyr Ile Ser Phe Arg Tyr Leu Ala ¹ 5 io <210? 177 <211? 12 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; LCDR1 K£Rochc#7.2L4 <400? 177

Arg Ala Ser Gin Phe Ile Arg Arg Ser Tyr Leu Ala ¹ 5 io <210? 178 <211? 8 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.3H1 <400? 178

Hia Gin Val Tyr Ser His Pro Phe

PL 216 190 B1

127

59/165

5 <210» 179 <211> 17 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#?,3Η1 <400» 179

Ala Ile Ser Ala Ile Ser Asn Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 i S

Gly <210» 180 <211=· 12 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; LCDR1 S-Roche#7.3L1 <400> 180

Arg Ala Ser Gin Tyr Leu His Tyr Gly Tyr Leu Ala 15 io <210» 181 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna,· HCDR2 KS-Roche#7.4H1 <400» 181

Ala Ile Asn Ala Thr Gly Tyr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 182 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220»

128

PL 216 190 B1

60/165 <223? konstrukcja syntetyczna; HCDR2 S-Roche#7.4H2 <400» 182

Ala Ile Asn Tyr Asn Gly Ala Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys ’ e ]_g IR

Gly <210» 183 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220»

60/165 <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#7.9H1 <400» 183

Leu Gin Ile Tyr Asn Met Pro Ile <210» 184 <211» 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.9H1 <400» 184

Ala Ile Asn Ala Asn Gly Gin Arg Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly <210» 185 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roehe#7.9H2 <400» 185

Ala Ile Asn Ala Asp Gly Asn Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

PL 216 190 B1

129

61/165 <210> 186 <211> 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja ε220» <223» konstrukcja syntetyczna; KCDR2 MS-Roche#7.9H3 <400» 186

Ala Ile Asn Tyr Gin Gly Asn Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210» 187 <211> 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS~Roche#7,9H4 <400» 187

Ala Ile Asn Ala Val Gly Met Lys Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 188 <211> 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Rocheff7.9H5 <400» 138

Ala Ile Asn His Ala Gly Asn Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

10 15

Gly <210» 189 <211» 12

130

PL 216 190 B1

62/165 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220»

<223»	konstrukcja syntetyczna;	LCDRl MS-Roche#7.9L1
<400>	189
Arg Ala Ser Gin. Arg Leu Ser Pro 1 5	Arg Tyr Leu Ala 10
< 210 »	190
<211>	12
<212»	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna;	LCDRl MS-Roche#?,9L2
<400»	190
Arg Ala Ser Gin Tyr Leu His Lys 1 5	Arg Tyr Leu Ala 10
<210>	191
<211»	17
<212»	PRT
<213 >	sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#7.9H6
<400»	191
Ala Ile Asn Ala Ser Gly Arg Leu 1 5	Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 10	Val Lys 15
Gly

<210»	192
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220» <223>	konstrukcja syntetyczna;	HCDS2 MS	~Roche#7.9H7
<400»	192
Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg 1 5	Thr Tyr 10	Tyr Ala Asp Ser	Val Lys 15

Gly

PL 216 190 B1

131

63/165 <210» 193 <211» 17 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220»

<223» konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#?	. 9H8
<400» 193
Ala Ile Asn Ala Ser Gly Ser Lys	Ile Tyr Tyr Ala	Asp Ser Val Lys
1 5	10	15
Gly

<210»	194
<211>	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#7.9H9
<400 >	194
Ala Ile Asn Gly Lys Gly Asn Lys	Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser	Val Lys
1	5	10	15
Gly

<210»	195
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna;	HCDR2 MS-Roche#7.11H1
<400»	195
Gly Ile Asn Ala Ala Gly Phe Arg	Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser	Val Lys
1	5	10	15

Gly <210» 196 <211> 17

132

PL 216 190 B1

S4/165 <212;

PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.11H2 <400> 196

Ala Ile Asn Ala Asn Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1=

Gly <210» 137 <211» 17 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.11H3 <40Q> 197

Gly Ile Asn Ala Asn Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly <210» 198 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.11S4 <400» 198

Ala Ile Asn Ala Asn Gly Tyr Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly <210» 199 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220:

<223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS~Roche#7,11H5

PL 216 190 B1

133

65/165 <400» 199

Ala Ile Asn Ala His Gly Gin Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210> 200 <211» 12 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#7.11L1 <400» 200

Arg Ala Ser Gin Arg Ile Leu Arg Ile Tyr Leu Ala 15 10 <210» 201 <211» 12 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#7.12H1 <400» 201

Arg Ala Ser Gin Tyr Val Phe Arg Arg Tyr Leu Ala 15 10 <210» 202 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna,- lcdr.3 MS-Roche#?, 12H1 <400» 202

Leu Gin Leu Tyr Asn. Ile Pro Asn

1	5
<210»	203
<211>	10
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220>

134

PL 216 190 B1

66/165 <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR1 MS-Roche#7.12H1 <4 00 > 203

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser

10 <210» 204 <211> 17 <212> PRT <2-3:·· sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.12H1 <400» 204

Asn Ile Asn Gly Asn Gly Asn Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vał Lys

5 ' 10 15

Gly <210» 205 <211» 17 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#7.12L1 <400» 205

Asn Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210» 206 <211» 12 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <22 0 » <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#7.12L2 <40Q> 206

Arg Ala Ser Gin Arg Phe Phe Tyr Lys Tyr Leu Ala

10 <210> 207

PL 216 190 B1

135

67/165 <211? 12 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <22 0?

<223?	konstrukcja syntetyczna,-	LCDR1 MS-Roche#7.12L3
<400?	207
Arg Ala Ser Gin Phe Val Arg Arg	Gly Phe Leu Ala
1	5	10
<210?	208
<211>	12
<212?	PRT
<213?	sztuczna sekwencja
<220?
<223?	konstrukcja syntetyczna	LCDR1 MS-Roche#7.12L4
<400?	208
Arg Ala Ser Gin Arg Leu Lys Arg	Ser Tyr Leu Ala
1	5	10
<210?	209
<211?	12
<212?	PRT
<213?	sztuczna sekwencja
<220?
<223?	konstrukcja syntetyczna;	LCDR1 MS-Roche#7.12L6
<400?	209
Arg Ala Ser Gin Tyr Leu Trp Tyr	Arg Tyr Leu Ala
1	5	10
<210?	210
<211?	12
<212?	PRT
<213?	sztuczna sekwencja
<220?
<223?	konstrukcja syntetyczna,·	LCDR1 MS-Roche#7. 12L7
<400?	210
Arg Ala Ser Gin Trp Ile Arg Lys	Thr Tyr Leu Ala
1	5	10
<210?	211
<211?	12
<212?	PRT
<213?	sztuczna sekwencja

136

PL 216 190 B1

68/165 <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#8 <400» 211

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210»	212
<211>	7
<212>	PRT
<213 >	s z tuczna s ekwencj a
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna; LCDR2 MS-Roche#8
<400>	212
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

5 <210» 213 <211» 8 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223..· konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#8 <400> 213

Gin Gin Leu Ser Ser Phe Pro Pro 1 5 <210» 214 <211> 10 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; HCDR1 MS-RocheffB <400» 214

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

10

<210»	215
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#8

PL 216 190 B1

137

69/165 <400» 215

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210» 216 <211» 15 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna; HCDR3 MS~Roche#8 <400» 216 .

Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp Val <210» 217 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#8.1 <400> 217

Gin Gin Leu Ser Asn Tyr Pro Pro

5 <210» 218 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#8.2 <400» 218

Gin Gin Leu Ser Ser Tyr Pro Pro

5 <210» 219 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220»

138

PL 216 190 B1

70/165 <223> konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#B.1H1 <400» 219

Ala Ile Ser Arg Ser Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly <210» 220 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; LCDR3 MS-Roche#8.2H1 <400» 220

Gin Gin Leu Ser Ser Tyr Pro Pro <210» 221 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <22 0» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#8.2H1 <400» 221

Ala Ile Ser Ile Thr Gly Arg Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

Gly <210» 222 <211> 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#8.2H2 <400> 222

Ala Ile Ser Arg Thr Gly Ser Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

10 15

Gly

PL 216 190 B1

139

71/165

<210» <211» <212» <213»	223 16 PRT sztuczna sekwencja
<220> <223>	konstrukcja syntetyczna; HCDR2 MS-Roche#8.2H4
<400»	223

Ala Thr Ser Val Lys Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1	g 10 15
<210> <211> <212» <213 >	224 12 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; LCDR1 MS-Roche#8.2L1
<400>	224

Arg Ala Ser Gin Arg Val Ser Gly Arg Tyr Leu Ala

1	5 10
<210» <211» <212» <213>	225 109 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna; VL kappal
<220» <221» <222» <223»	CECHY MIESZANE (96) . . (96) Xaa - jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, lub Tyr

<220>

<221» CECHY MIESZANE

<222> <223»

(93)..(93) Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Gly, His, Leu, Asn lub Ser

<220» <221»

CECHY MIESZANE

<222> (92) . . (92) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Asp, Gly, Asn, Ser lub Tyr

140

PL 216 190 B1

72/165 <220» <221> CECHY MIESZANE <222» (91)..(91) <223» Xaa = any amino acid a mixture Ala, Aśp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220»

-, ρϊ?ΓΉν

0X^k_JriI ł*i X cjOZjAIN .Cł <222» (89)..(89) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Met lub G In, <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (85)..(85) <223» Xaa = can be Thr or Val <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (94).,(94) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (95)..(95) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Leu, Pro lub Ser <400» 225

Asp Ile Gin Mtet Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Xaa Tyr Tyr Cys Xaa Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95

PL 216 190 B1

141

73/165

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210» 226 <211> 114 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna.; DL kappa2 <220» <221> cechy mieszane <222» (101)..(101) <223» Xaa = any amino acid of a mixture of Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, lub Tyr <22 0» <221» cechy mieszane <222» (94) , . (94) <223» jakikolwiek aminokwas mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Met lub G In, <220» <221» cechy mieszane <222» (96)..(96) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp lub Tyr

<220»
<221>	cechy	mieszane
<222»	(97) . ,	. (9?)
<223»	Xsa —	any amino acid of a mixture of Asp, Gly, Asn, Ser or Tyr

<220»
<221»	cechy	mieszane
<222»	(98) .	. (98)
<223»	Xaa =	jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Gly, His, Leu

lub Ser <220» <221» cechy mieszane <222» (99)..(99) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, lub Tyr <220>

<221» cechy mieszane

142

PL 216 190 B1

74/165 <222» {100}..{100} <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Leu, Pro lub Ser <400» 226

Asp 1	Ile Val	Met	Thr Gin. Ser Pro Leu 5	Ser 10	Leu	Pro Val	Thr	Pro 15	Gly
Glu	Pro Ala	Ser	Ile Ser Cys Arg Ser	Ser	Gin	Ser Leu	Leu	His	Ser
		20	25				30
Asn	Gly Tyr	Asn	Tyr Leu Asp Trp Tyr	Leu	Gin	Lys Pro	Gly	Gin	Ser
	35		40			45
Pro	Gin. Leu	Leu	Ile Tyr Leu Gly Ser	Asn	Arg	Ala Ser	Gly	Val	Pro
	50		55			6 0
Asp	Arg Phe	Ser	Gly Ser Gly Ser Gly	Thr	Asp	Phe Thr	Leu	Lys	Ile
65			70		75				80
Ser	Arg Val	Glu	Ala Glu Aap Val Gly	Val	Tyr	Tyr Cys	Xaa	Gin	xaa
			85	90				95
Xaa	Xaa Xaa	Xaa	Xaa Thr Phe Gly Gin	Gly	Thr	Lys Val	Glu	Ile	Lys
		100	105				110
Arg	Thr
<210» 227
<211> 110
<212> PRT
<213» sztuczna	sekwencj a
<220>
<223> konstrukcja syntetyczna; VL kappa3

<220>

<221> cechy mieszane <222> (97)..(97} <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Siu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, lub Tyr <220>

<221» cechy mieszane <222> (90} . . (90) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Met lub

PL 216 190 B1

143

75/165
<220»
<221»	cechy	mieszane
<222 »	(86) .	- (86)
<223»	xaa =	Thr lub Va

<2 2 0» <221» cechy mieszane <222» (92) .. ΐ 921 <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp lub Tyr <220» <221» cechy mieszane <222» (93),,(93)

<223 »	Xaa = jakikolwiek	aminokwas	mieszaniny	Asp, Gly,	Asn,	Ser	lub Tyr
<220» <221»	cechy mieszane
<222»	(94) . . (94)
<223»	Xaa = jakikolwiek	aminokwas	mieszaniny	Ala, Asp,	Gly,	His,	Leu, Asn
	lub Ser

<220>

<221>

<222» <223» cechy mieszane (95).-(95)

Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, lub Tyr <220>

<221» cechy mieszane <222> (96)..-(96) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Leu, Pro lub Ser <400» 227

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser

- 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu

40 45

144

PL 216 190 B1

<220>

<221,-· CECHY MIESZANE <222> (102),,(102) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Ehe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Vał, Trp, lub Tyr <220>

<221» CECHY MIESZANE <222> (95)..(95) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Met lub G In, <220>

<221» CECHY MIESZANE <222» (97)..(97) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp lub Tyr <220>

<221> CECHY MIESZANE <222> (98) . . (98) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Asp, Gly, Asn, Ser lub Tyr <220>

<221> CECHY MIESZANE <222» (99)..(99) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Gly, His, Leu, Asn lub Ser <220>

<221> CECHY MIESZANE <222> (100).,(100)

PL 216 190 B1

145

77/165 <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His , Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (101} . . (101) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas mieszaniny Leu, Pro lub Ser <400» 228

Aap 1	Ile	Val	Met	Thr Gin 5	Ser	Pro Asp Ser Leu Ala 10	Val	Ser	Leu 15	Gly
Glu	Arg	Ala	Thr	Ile Asn	Cys	Arg Ser Ser Gin Ser	vai	Leu	Tyr	Ser
			20			25 .		30
Ser	Asn	Asn	Lys	Asn Tyr	Leu	Ala Trp Tyr Gin Gin	Lys	Pro	Gly	Gin
		35				40	45
Pro	Pro	Lys	Leu	Leu Ile	Tyr	Trp Ala Ser Thr Arg	Glu	Ser	Gly	Val
	50				55	60
Pro	Asp	Arg	Phe	Ser Gły	Ser	Gly Ser Gly Thr Asp	Phe	Thr	Leu	Thr
65				70		75				80
Ile	Ser	Ser	Leu	Gin Ala	Glu	Asp Val Ala Val Tyr	Tyr	Cys	Xaa	Gin
				85		90			95
Xaa	Xaa	Xaa	Xaa	Xaa Xaa	Thr	Phe Gly Gin Gly Thr	Lys	Val	Glu	Ile
			100			105		110
Lys	Arg	Thr
		115
<210»	229
<211»	111
<212»	PRT
<213»	sztuczna	sekwencj a
<220»
<22 3»	konstrukcja syntetyczna; VL lambdal

<22 0>

<221» CECHY MIESZANE <222» (99)..(99;

<223» Xaa = jakikolwiek aminokwas

146

PL 216 190 B1

78/165 <220?

<221? CECHY MIESZANE <222? (97)..(98) <223? Xaa = jakikolwiek aminokwas za wyjątkiem Cys lub delecja <220?

<221> CECHY MIESZANE <222? (94)..(96) <223? Xaa = jakikolwiek aminokwas za wyjątkiem Cys <220?

<221> CECHY MIESZANE <222? {92),,(92) <223? Xaa = jakikolwiek aminokwas Cys, Phe, His, Arg, Trp lub Tyr <400? 229

Asp 1	ile	Val	Leu	Thr Gin Pro 5	Pro Ser	Val 10	Ser Gly Ala	Pro	Gly 15	Gin
Arg	Val	Thr	Ile	Ser Cys Ser	Gly Ser	Ser	Ser Asn Ile	Gly	Ser	Asn
			20		25			30
Tyr	Val	Ser	Trp	Tyr Gin Gin	Leu Pro	Gly	Thr Ala Pro	Lys	Leu	Leu
		35			40		4 5
Ile	Tyr	Asp	Asn	Asn Gin Arg	Pro Ser	Gly	Val Pro Asp	Arg	Phe	Ser
	50			55			60
dy	Ser	Lys	Ser	Gly Thr Ser	Ala Ser	Leu	Ala Ile Thr	Gly	Leu	Gin
65				70			75			80
Ser	Glu	Asp	Glu	Ala Asp Tyr	Tyr Cys	Gin	Ser xaa Asp	xaa	xaa	Xaa
				85		90			95
Xaa	Xaa	Xaa	val	Phe Gly Gly	Gly Thr	Lys	Leu Thr Tal	Leu	Gly
			100		105			110
<210?	230
<211?	112
<212?	PRT
<213?	sztuczna	sekwencja
<220?
<223?	konstrukcja syntetyczna; VL	lambda2

<220?

<221> CECHY MIESZANE <222? (100)..(100)

PL 216 190 B1

147

79/165 <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas < 2 2 0 » <221» CECHY MIESZANE <222» (93) .. (93) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas Cys, Phe, His, Arg, Trp lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (95) ..(97)

<22 3 >	Xaa =	jakikolwiek	aminokwas	za wyjątkiem	CyEJ
<220>
<22X>	CECHY	MIESZANE
< 2 2 2 >	(98) . .	. 199)
<2 2 3 >	Xaa =	jakikolwiek	aminokwas	za wyjątkiem	Cys lub delecji

<400» 230

Asp

Ile

Ala

Leu

Thr

Gin

Pro

Ala

Ser

val

Ser

Gly

Ser

Pro

Gly

Gin

1

5

10

15

Ser

Ile

Thr

Ile

Ser

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

Ser

Asp

Val

Gly

Gly

Tyr

20

25

30

Asn

Tyr

Val

Ser

Trp

Tyr

Gin

Gin

His

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

35

40

45

Met

Ile

Tyr

Asp

Val

Ser

Asn

Arg

Pro

Ser

Gly

Val

Ser

Asn

Arg

Phe

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Lys

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Leu

65

70

75

80

Gin

Ala

Glu

Asp

Glu

Ala

Asp

Ty 37

Tyr

Cye

Gin

Ser

Xaa

Asp

Xaa

Xaa

85

90

95

Xaa

Xaa

Xaa

Xaa

Val

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

100

105

110

<210» 231 <211» 109 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <2 2 0 >

<223» konstrukcja syntetyczna; VL lambda3

148

PL 216 190 B1

80/165
<220»
<221»	CECHY	MIESZANE
<222 »	(97) . ,	. (97)
<223»	Xćł<3. ™	any amino acid

<220>

<221> CECHY MIESZANE <222» (90)..(90) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas Cys, Phe, His, Arg, Trp lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (92)..(94) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas za wyjątkiem Cys <220» <221» CECHY MIESZANE , <222» (95).,(96) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas za wyjątkiem Cys lub delecji <400» 231

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Val Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn. Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95

Xaa Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 <210» 232 <211» 127 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

149

81/165 <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH1A <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (99)..(112) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas lub delecja <220» <221» CECHY MIESZANE <222> (116) . . (116) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Val, Trp lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (114)..(114) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr, Val lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (113) . . (113) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas <400» 232

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Dal Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ann Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110

Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

150

PL 216 190 B1

82/165

Xaa Xaa Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 233 <211> 127 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH1B <220 » <22ł> CECHY MIESZANE <222» 09) . . (112) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas łub delecja <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (113)..(113) <223» Xaa = any amino acid <220» , <221» CECHY MIESZANE <222» (114!..(114) <223» Xaa - jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly Ile, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr, Val lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (116)..(116) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Val, Trp lub Tyr <400» 233

Gin Val Gin Leu Val Glil Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 io 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 ’ 75 80

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe

55 60

PL 216 190 B1

151

83/165

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110

Xaa Xaa Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210»	234
<211»	128
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; VH2
<220»
<221»	CECHY MIESZANE
<222»	(100)..(113)
<223»	Xaa = jakikolwiek aminokwas lub delecja

<220» <221» CECHY MIESZANE <222» (114)..(114) <223» Xaa - jakikolwiek aminokwas <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (117)..(117) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Val, Trp lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (115) .. (115) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr, Val lub Tyr

Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 <400» 234

Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin

10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

25 30

152

PL 216 190 B1

84/165

Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser 50 55 60

Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val 65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110

Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210>	235
<211»	127
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; VH3
<220»
<221»	CECHY MIESZANE
<222»	(99)..(112)
<223»	Xaa = jakikolwiek aminokwas lub delecja

<220>

<221» CECHY MIESZANE <222» (113),.(113) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas <220>

<221» CECHY MIESZANE <222> (116).,(116) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Asn Pro, Ser, Val, Trp lub Tyr <220>

<221» CECHY MIESZANE <222> (114).,(114) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly Ile, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr, Val lub Tyr <400> 235

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly L,eu Val Gin Pro Gly Gly

PL 216 190 B1

153

85/165

10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110

Xaa Xaa Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210»	236
<211»	126
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; VH4
<220>
<221>	CECHY MIESZANE
<222»	(98! .. (111)
<223»	Xaa - jakikolwiek aminokwas lub delecja

<220» <221> CECHY MIESZANE <222» (112)..(112) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (113) . . (113) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly Ile, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr, Val lub Tyr <220»

154

PL 216 190 B1

86/165 <221» CECHY MIESZANE <222» (115)..(115) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Asn Pro, Ser, Tal, Trp lub Tyr <400» 236

Gin Tal Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Tal Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110

Xaa Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Leu Tal Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210»	237
<211»	127
<212>	PST
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; TH5
<220»
<221»	CECHY MIESZANE
<222»	(99).,(112)
<223»	Xaa = jakikolwiek aminokwas lub delecja

<220»
<221»	CECHY	MIESZANE
<222»	(113) .	..(113)
<223»	Xaa -	jakikolwiek aminokwas

PL 216 190 B1

155

87/165 <22Q>

<221» CECHY MIESZANE <222» (116)..(116) <223» Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Asn Pro, Ser, Val, Trp lub Tyr <220» <221» CECHY MIESZANE <222» (1145 ..(114) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly

	Ile,	Leu, Met, Pro,	Gin,	Ser, Thr, Val lub Tyr
<400>	23 7
Gin Val	Gin	Leu Val Gin Ser	Gly	Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1		5		10 15
Ser Leu	Lys	Ile Ser Cys Lys	Gly	Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
		20		25 30
Trp Ile	Gly	Trp Val Arg Gin	Met	Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
	35		40	45
Gly Ile	Ile	Tyr Pro Gly Asp	Ser	Aap Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50		55		60
Gin Gly	Gin	Val Thr Ile Ser	Ala	Asp Lya Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65		70		75 80
Leu Gin	Trp	Ser Ser Leu Lys	Ala	Ser Aap Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
		85		90 95
Ala Arg	Xaa	Xaa Xaa Xaa Xaa	Xaa	Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
		100		105 110
Xaa Xaa	Asp	Xaa Trp Gly Gin	Gly	Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
	115		120	125
<210>	23S
<211>	130
<212 >	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna;	VH6
<220>
<221»	CECHY MIESZANE

156

PL 216 190 B1

88/165 <222> (102)..{11S) <223> Xaa - jakikolwiek aminokwas lub delecja <220>

<221> CECHY MIESZANE <222? (116)..(116) <223> Xaa = jakikolwiek aminokwas <220>

<221> CECHY MIESZANE <222> (119)..(119) <223> Xaa ~ jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Phe, His, Ile, Leu, Asn Pro, Ser, Val, Trp lub Tyr <220>

<221> CECHY MIESZANE <222> {117)..(117) <223> Xaa - jakikolwiek aminokwas oprócz mieszaniny Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr, Val lub Tyr <400? 238

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 1· 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn. 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110

Ser Ser

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

PL 216 190 B1

157

89/165

130

<210» <211» <212» <213»	239 327 DNA sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna,- Vlt kappal
<220»
<221»	cechy mieszane
<222 »	(286) . . (288)
<223»	nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT
	CAG, CGT, TCT, ACT·, GTT, TGG lub TAT

<220» <221» cechy mieszane <222» (271)..(273) <223» πηη = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (255)..(267) <223» nnn = TTT, CAT, CTT, ATG lub CAG <220» <221» cechy mieszane <222» (253!..(256) <223» nnn ~ może być ACT lub GTT <220» <221» cechy mieszane <222> (283)..(285) <223» nnn = CTT, CCT lub TCT <220» <221» cechy mieszane <222» (280)..(282} <223» nnn - GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (277)..(279) <223» nnn = GCT, GAT, GGT, CAT, CTT, AAT lub TCT <220» <221» cechy mieszane <222» (274)..(27S)

158

PL 216 190 B1

90/165 <223> tinn = GAT, GGT, AAT, TCT lub TAT <400» 23S

gatatccaga	tgacccagag	cccgtctagc	ctgagcgcga	gcgtgggtga	tcgtgtgacc	60
a t tac c tgca	gagcgagcca	gggcattagc	agctatctgg	cgtggtacca	gcagaaacca	120
ggtaaagcac	cgaaactatt	aatttatgca	gccagcagct	tgcaaagcgg	ggtcccgtcc	18C
cgttttagcg	gctctggatc	cggcactgat	tttaccctga	ccattagcag	cctgcaacct	240
gaagactttg	cgnnntatta	ttgcnnncag	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnac	ctttggccag	300
ggtacgaaag	ttgaaattaa	acgtacg				327

<210» 240 <211» 328 <212» DMA <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; 7T, kappa2 <220» <221» cechy mieszane <222» (289)..(289) <223» n = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, C AG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT .

<220» <221» cechy mieszane <222» (280)..(280) <223> n = TTT, CAT, CTT, ATG lub CAG <220» <221» cechy mieszane <222» (284).,(284) <223» n = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CAG, C GT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222> (285)..(285) <223» n = GAT, GGT, AAT, TCT lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (286)..(289) <223» n = GCT, GAT, GGT, CAT, CTT, AAT lub TCT <220» <221» cechy mieszane

PL 216 190 B1

159

91/165 <222» (287)..(287) <223» η - GCT, GAT, GAG, ΤΤΤ, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, ΑΑΤ, CCT, C AG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222> (288),.(288) <223» n = CTT, CCT łub TCT

<400» 240 gatatcgtga	tgacccagag	cccacfcgage	ctgccagtga	ctccgggcga	gcctgcgagc	SO
attagctgca	gaagcagcea	aagcctgctg	catagcaacg	gctataacta	tctggattgg	120
taccttcaaa	aaccaggtca	aagcccgcag	ctattaattt	atctgggcag	caaccgtgcc	180
agtggggtcc	cggatcgttt	tagcggcfcct	ggatccggca	ccgattttac	cctgaaaatt	240
agccgtgtgg	aagctgaaga	cgtgggcgtg	tattattgcn	cagnnnnnna	cctttggcca	300
gggtacgaaa	gttgaaatta	aacgtacg				328

<210> <211 > <212 > <213 >	241 330 DNA sztuczna sekwencja
<220> <22 3 >	konstrukcja syntetyczna; VL kappa3
<220> <221> <222> <223>	cechy mieszane (289)..(291) nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT
	CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT

<220»
<221»	cechy	mieszane
<222»	(256)	. . (258)
<223»	nnn =	może być ACT lub GTT

<220»
<221»	cechy	mieszane
<222»	(265).	.. (276)
<223»	nnn =	TTT, CAT, CTT, ATG

<220»
<221»	cechy	mieszane
<222»	(274)	.,(275)
<223»	nnn =	GCT, GAT,	GAG,	TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CAG
	CGT,	TCT, ACT,	GTT,	TGG lub TAT

160

PL 216 190 B1

92/165 <220»

<221» <222» <223»	cechy mieszane
(277) . nim =	.(279) GAT, GGT,	AAT, TCT :	Lub TAT
<220»
<221»	cechy	mi ssz 3Ti€
<222»	(280! .	, (282)
<223»	mm =	GCT, GAT,	Ζ^/**ίίΤΙ ί*Ί7\ m -Ł i ?	CTT, AAT lub TCT
<220»
<221»	cechy	mieszane
<222»	(283).	. (285)
<223>	nnn -	GCT, GAT,	GAG, TTT,	GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT,
	CAG,	CGT, TCT,	ACT, GTT,	TGG lub TAT
<220>
<221»	cechy	mieszane
<222>	(285).	. . (288)
<223>	nnn -	CTT, CCT	lub TCT
<400>	241
gatatcgtgc tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60
ctgagctgca gagcgagcca	gagcgtgagc	agcagctatc tggcgtggta ccagcagaaa 120
ccaggtcaag caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca gccgtgcaac tggggteccg 180
gcgcgt	ttta gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240
cctgaagact ttgegnnnta	ttattgcnnn	cagnnnnnnn nnnnnnnnnn nacctttggc 300
cagggtacga aagttgaaat	taaacgtacg	330
<210»	242
<211>	345
<212>	DNA
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna;	VL kappa4
<220»
<221»	cechy	mieszane
<222>	(304)	..(306)
<223>	nnn -	GCT, GAT,	, GAG, TTT,	GGT, CAT, ATT( ftAGi CTT( ATG, AAT( CCT|
	CAG,	CGT, TCT,	, ACT, GTT,	TGG lub TAT
<220>
<221»	cechy	mieszane
<222»	(283)	. . (285)
<223»	nnn -	TTT, CAT	, CTT, ATG	lub CAG

PL 216 190 B1

161

93/165 <220» <221» cechy mieszane <222» (289) .. (291) <223» nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, GAG CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222> (292)..(294) <223> nnn = GAT, GGT, AAT, TCT lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (295)..(297) <223» nnn = GCT, GAT, GGT, CAT, CTT, AAT lub TCT <220>

<221> cechy mieszane <222» (298)..(300) <223» nnn ~ GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (301;. . (303) <223» nnn = CTT, CCT lub TCT <400» 242 gatatcgtga tgacccagag cccggatagc ctggcggtga gcctgggcga acgtgcgacc 60 attaactgca gaagcagcca gagcgtgctg tatagcagca acaacaaaaa ctatctggcg 120 bgęjtancagc agaaaccagg tcagccgccg aaactattaa tttattgggc atccacccgt 180 gaaagcgggg tcccggatcg ttttagcggc tctggatccg gcactgattt taccctgacc 240 atttcgtcc-c tgcaagctga agacgtggcg gtgtattatt gcnnncagnn nnnnimnnnn 300 mrnnnnacct ttggccaggg tacgaaagtt gaaattaaac gtacg 345

<210»	243
<211»	322
<212»	DNA
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; VL	lambdal
<220»
<221»	cechy mieszane
<222»	(274)..(274)
<223»	n = TGT, TTT, CAT, CGT, TGG	lub TAT

162

PL 216 190 B1

94/165 <220» <221» cechy mieszane <222» (278).. ¢280) <223» η = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, C AG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (281)..(282) <223» n = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, C AG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT lub delecja <220» <221» cechy mieszane <222» (2B3) .. (283) <223> n = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, C CT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT

<400» 243
gatatcgtgc	tgacccagcc	gccttcagtg	agtggcgcac	caggtcagcg	tgtgaccatc	60
tcgtgtagcg	gcagcagcag	caacattggc	agcaactatg	tgagctggta	ccagcagttg	120
cccgggacgg	cgccgaaact	gctgatttat	gataacaacc	agcgtccctc	aggcgtgccg	180
gatcgtttta	gcggatccaa	aagcggcacc	agcgcgagcc	ttgcgattac	gggcctgcaa	240
agcgaagacg	aagćggatta	ttattgccag	tctngatnnn	nnngtgtttg	gcggcggcac	300
gaagttaacc	gttcttggcc	sg				322

<210»	244
<211»	336
<212»	DNA
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna; VL lambda2
<220»
<221»	cechy mieszane
<222»	(274) . . (276)
<223»	nnn = TGT, TTT, CAT, CGT, TGG lub TAT

<220»
<221»	cechy	mieszane
<222»	(290).	. . (295)
<223»	nnn =	GCT, GAT,	GAG,	TTT,	GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT
	CAG,	CGT, TCT,	ACT,	GTT,	TGG lub TAT lub delecja

<220»

PL 216 190 B1

163

95/165 <221? cechy mieszane <222? (296)..¢298) <223? nim = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, GGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220?

<221? cechy mieszane <222? (280)..(289) <223? nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT

<400? 244
gatatcgcac	tgacccagcc	agcttcagtg	agcggctcac	c agg t c aga.g	cattaccatc	60
tcgtgtacgg	gfcactagcag	cgatgtgggc	ggctataact	atgtgagctg	gtaccagcag	120
catcccggga	aggcgccgaa	actgatgatt	tatgatgtga	gcaaccgtcc	ctcaggcgtg	180
agcaaccgtt	rfcagcgg&tc	caaaagcggc	aacaccgcga	gcctgaccat	tagcggcctg	240
caagcggaag	acgaagcgga	ttattattgc	cagnnngatn	nnnnnnnnnn	nnnnnnngtg	300
tttggcggcg	gcacgaagtt	aaccgttctt	ggccag			336

<210? 245 <211? 327 <212? DNA <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna; VL lambd,-g <220?

<221? cechy mieszane <222? (265)..(267) <223? nnn = TGT, TTT, CAT, CGT, TGG lub TAT <220? ' <221? cechy mieszane <222? (286)..(288) <223? nnn = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220?

<221? cechy mieszane <222? (280)..(285) <223? nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT lub delecja <220?

<221? cechy mieszane <222? (271)..(279) <223? nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT,

164

PL 216 190 B1

96/165

CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <400» 245 gatatcgaac tgacccagcc gccttcagtg agcgttgcac caggtcagac cgcgcgtatc 60 tcgtgtagcg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtaccagca gaaacccggg 120 caagcgccag ttctggtgat ttatgatgat tctgaccgtc cctcaggcat cccggaacgc 180 tttagcggat ccaacagcgg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac tcaggcggaa 240 gacgaagcgg attattattg ecagnnngat raiimnnnimn nnnnnnnngt gtttggcggc 300 ggcacgaagt taaccgttct tggccag 327 <210» 246 <211> 382 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH1A <220>

<221» cechy mieszane <222> (345)..{347!

<223»	nnn = TTT, CAT,	ATT,	CTT,	AAT,	CCT,	TCT,	GTT,	TGG	lub TAT
<220»
<221>	cechy	mieszane
<222»	(339)	, . {341)
<223»	nnn =	GCT, GAT,	GAG,	TTT,	GGT,	ATT,	CTT,	ATG,	CCT,	CAG, TCT, ACT
	GTT	lub TAT

<220>
<221»	cechy	mieszane
<222»	(336) ,	,.(338)
<223»	nnn =	GCT, TGT,	GAT,	GAG,	TTT,	GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT
	CCT,	CAG, CGT,	TCT,	ACT,	GTT,	TGG lub TAT

<220»
<221»	cechy	mieszane
<222»	(295).	. . (335)
<223»	nnn =	GCT, TGT,	GAT,	GAG,	TTT,	GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT
	CCT,	CAG, CGT,	TCT,	ACT,	GTT,	TGG lub TAT lub delecja

<400» 246 caggtgcaat tggttcagtc tggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cctccggagg cacttttagc agctatgcga ttagctgggt gcgccaagcc 120 cctgggcagg gtctcgagtg gatgggcggc attattccga tttttggcac ggcgaactac ISO

PL 216 190 B1

165

97/165

gcgcagaagt	ttcagggccg	ggtgaccatt	accgcggatg	aaagcaccag	caccgcgtat	240
atggaactga	gcagcctgcg		acggccgtgt	attattgcgc	gcgtnnnnnn	300
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	ngatnnntgg	ggccaaggca	360
ccctggtgac	ggttagctca	gc				382

<210> 247 <211» 383 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH1B <220» <221» cechy mieszane <222» (346) ,. (348) .

<223» nnn = TTT, CAT, ATT, CTT, AAT, CCT, TCT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (295),.(336) <223» nnn = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT lub delecja <220» <221» cechy mieszane <222» (337) . . (339) <223> nnn = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (340)..(342) <223» nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, ATT, CTT, ATG, CCT, CAG, TCT, ACT, GTT lub TAT

<400» 247 caggtgcaat	tggttcagag	cggcgcggaa	gtgaaaaaac	cgggcgcgag	cgtgaaagtg	60
agctgcaaag	cctccggata	tacctttacc	agctattata	tgcactgggt	ccgccaagcc	120
cctgggcagg	gtctcgagtg	gatgggctgg	attaacccga	atagcggcgg	cacgaactac	180
gcgcagaagt	ttcagggccg	ggtgaccatg	acccgtgata	ccagcattag	caccgcgtat	240
atggaactga	gcagcctgcg	tagcgaagat	acggccgtgt	attattgcgc	gcgtnnnnnn	3C0
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nngatnnntg	gggccaaggc	36 0
accctggtga	cggttagctc	agc				383

166

PL 216 190 B1

98/165 <210» 248 <211» 386 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH2 <220» <221» cechy mieszane 2ζϊ > (349) , « (353.) <223» nnn - TTT, CAT, ATT, CTT, AAT, CCT, TCT, GTT, TGG lub TAT <220» <221> cechy mieszane <222> (298)..(339) <223» nnn = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT lub delecja <220» <221» cechy mieszane <222» (340) . . (342) <223» nnn = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (343),.(345) <223» nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, ATT, CTT, ATG, CCT, CAG, TCT, ACT, GTT lub TAT <400» 248

caggtgcaat	tgaaagaaag	cggcccggcc	ctggtgaaac	cgacccaaac	cctgaccctg	60
acctgtacct	tttccggatt	tagcctgtcc	acgtctggcg	ttggcgtggg	ctggattcgc	120
cagccgcctg	ggaaagccct	cgagtggctg	gctctgattg	attgggatga	tgataagtat	ISO
tatagcacca	gcctgaaaac	gcgtctgacc	attagcaaag	atacttcgaa	aaatcaggtg	240
gtgctgacta	tgaccaacat	ggacccggtg	gatacggcca	cctattattg	cgcgcgtnnn	300
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnngatnn	ntggggccaa	360
ggcaccctgg	tgacggttag	ctcagc				386

<210» 243 <211» 349 <212» DNA .

<213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH3

PL 216 190 B1

167

99/165 <220» <221» cechy mieszane <222» (314),,(314) <223» η = TTT, CAT, ATT, CTT, AAT, CCT, TCT, GTT, TGG lub TAT <221» cechy mieszane <222» (295).,(308) <223> n = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, C CT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT lub delecja <220?

<221» cechy mieszane <222> (309)..(309) <223» n = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, C CT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220?

<22l> cechy mieszane <222» (310)..(310) <223» n - GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, ATT, CTT, ATG, CCT, CAG, TCT, ACT, G TT lub TAT

<400» 249	tggtggaaag	cggcggcggc	ctggtgcaac	cgggcggcag	cctgcgtctg	60
agctgcgcgg	cctccggatt	tacctttagc	agctatgcga	tgagctgggt	gcgccaagcc	120
cctgggaagg	gtctcgagtg	ggtgagcgcg	attagcggta	gcggcggcag	cacctattat	180
gcggatagcg	tgaaaggccg	ttttaccatt	tcacgtgata	attcgaaaaa	caccctgtat	240
ctgcaaatga	acagcetgcg	tgcggaagat	acggccgtgt	attattgcgc	gcgtnnnnnn	300
nnrmnnnnnn	gatntggggc	caaggcaccc	tggtgacggt	tagcfccagc		349

<210» 250 <211? 346 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH4 <220>

<221» cechy mieszane <222> (311)..(311) <223» n = TTT, CAT, ATT, CTT, AAT, CCT, TCT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (292)..(305)

168

PL 216 190 B1

100/165

<223»	n = GCT, TGT, CT, CAG, CGT,	GAT, TCT,	GAG, ACT,	TTT, GTT,	GGT, CAT, ATT, AAG, CTT,	ATG,	AAT,	C
TGG	lub TAT lub delecja
<220»
<221»	cechy mieszane
<222»	(306) . . (306)
<223»	yi <ί /“irp fl = bvi f, Ikjl f	A ,	GAG,	TTT,	GGT,	CAT, ATT, .AAG, CTT,	ATG,	AAT,	C
	CT, CAG, CGT,	TCT	ACT,	GTT,	TGG	lub TAT

<220» <221> cechy mieszane <222» ¢307)..(307) <223» η = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, ATT, CTT, ATG, CCT, CAG, TCT, ACT, G TT lub TAT <400» 250

caggtgcaat	tgcaagaaag	tggtccgggc	ctggtgaaac	cgagcgaaac	cctgagcctg	60
acctgcaccg	tttccggagg	cagcattagc	agctattatt	ggagctggat	tcgccagccg	120
cctgggaagg	gtctcgagtg	gattggctat	afcttattata	gcggcagcac	caactataat	180
ccgagcctga	aaagccgggt	gaccattagc	gttgatactt	cgaaaaacca	gtttagcctg	240
aaactgagca	gcgtgacggc	33cggatacg	gccgtgtatt	attgcgcgcg	tnnnnnnnnn	3 00
nnnnnnngafc	ntggggccaa	ggcaccctgg	tgacggttag	ctcagc		346

<210» 251 <211» 349 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; VH5 <220» <221» cechy mieszane <222» (314) . . (314) <223» n = TTT, CAT, ATT, CTT, AAT, CCT, TCT, GTT, TGG lub TAT <220>

<221» cechy mieszane <222» (295)..(304) <223» n = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, C CT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT lub delecja <220» <221» cechy mieszane <222> (305)..(307) <223» Ii - GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, C CT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT

PL 216 190 B1

169

101/165 <220» <221» cechy mieszane <222> (308)..(310) <223» η = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, ATT, CTT, ATG, CCT, CAG, TCT, ACT, G TT lub TAT

<400» 251 caggtgcaat	tggttcagag	cggcgcggaa	gtgaaaaaac	cgggcg&a&g	cctgaaaatt	60
agctgcaaag	gttccggata	ttcctttacg	agctattgga	ttggcfcgggt	gcgccagatg	120
cctgggaagg	gtctcgagtg	gatgggcatt	atttatccgg	gcgatagcga	tacccgttat	180
tctccgagct	ttcagggcca	ggtgaccatt	agcgcggata	aaagcattag	caccgcgtat	240
cttcaatgga	gcagcctgaa	agcgagcgat	acggccatgt	attattgcgc	gcgtnnnnnn	300
nnnnnnnnnn	gatntggggc	caaggcaccc	tggtgacggt	tagctcagc		349

<210» 252 <211» 392 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna,· VH5 <220» <221» cechy mieszane <222» (355)..(357) <223» nnn = TTT, CAT, ATT, CTT, AAT, CCT, TCT, GTT, TGG lub TAT <220» <22l> cechy mieszane <222> (304)..(345) <223» nnn . GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT lub delecja <220» <221» cechy mieszane <222» (346)..(348) <223> nnn = GCT, TGT, GAT, GAG, TTT, GGT, CAT, ATT, AAG, CTT, ATG, AAT, CCT, CAG, CGT, TCT, ACT, GTT, TGG lub TAT <220» <221» cechy mieszane <222» (349)..(351) <223» nnn = GCT, GAT, GAG, TTT, GGT, ATT, CTT, ATG, CCT, CAG, TCT, ACT, GTT lub TAT <400» 252 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60

170

PL 216 190 B1

102/165

acctgtgcga	111ccggaga	tagcgtgagc	agcaacagcg	cggcgtggaa	ctggattcgc	120
cagtctcctg	ggcgtggcct	egagtggctg	ggccgtacct	ą11 atcgtag	caaatggtat	180
aacgattatg	cggtgagcgt	gaaaagccgg	attaccatca	acccggatac	ttcgaaaaac	24 0
cagtttagcc	tgcaactgaa	cagcgtgacc	ccggaagata	cggccgtgta	ttattgcgcg	300
cgtnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	ngatnnntgg	360
ggccaaggca	ccctggtgac	ggttagctca	gc			392

<21Q> 253 <211? 4151 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; pMLUBPH 18 Fab_5¹ <400? 253

tctagataac	gagggcaaaa	aatgaaaaag	acagctatcg	cgattgcagt	ggcactggct	60
ggtttcgcta	ccgtagcgca	ggccgatatc	gtgctgaccc	agagcccggc	gaccctgagc	120
ctgtctccgg	gcgaacgtgc	rt ni ł“ zr Ortn ^5 Cł k* t.	tgcagagcga	gccagagcgt	gagcagcagc	ISO
tatctggcgt	ggtaccagca	gaaaccaggt	caagcaccgc	gtctattaat	ttatggcgcg	240
agcagccgtg	caactggggt	cccggcgcgt	tttagcggct	ctggatccgg	cacggatttt	300
accctgacca	ttagcagcct	ggaacctgaa	gactttgcgg	tgtattattg	ccagcagcat	360
tataccaccc	cgccgacctt	tggccagggt	acgaaagttg	aaattaaacg	tacggtggct	420
gctccgagcg	tgtttatttt	tccgccgagc	gatgaacaac	tgaaaagcgg	cacggcgagc	480
gtggtgtgcc	tgctgaacaa	cttttatccg	cgtgaagcga	aagttcagtg	gaaagtagac	540
aacgcgctgc	aaagcggcaa	cagccaggaa	agcgtgaccg	aacaggatag	caaagatagc	600
acctattctc	tgagcagcac	cctgaccctg	agcaaagcgg	attatgaaaa	acataaagtg	660
tatgcgtgcg	aagtgaccca	tcaaggtctg	agcagcccgg	tgactaaatc	ttttaatcgt	720
ggcgaggcct	gataagcatg	cgtaggagaa	aataaaatga	aacaaagcac	tattgcactg	780
gcactcttac	cgttgctctt	cacccctgtt	accaaagccg	aagtgcaatt	ggtggaaagc	84 0
ggcggcggcc	tggtgcaacc	gggcggcagc	ctgcgtctga	gctgcgcggc	ctccggattt	900
acctttagca	gctatgcgat	gagctgggtg	cgccaagccc	ctgggaaggg	tctcgagtgg	960
gtgagcgcga	ttagcggtag	cggcggcagc	acctattatg	cggatagcgt	gaaaggccgt	1020
tttaccattt	cacgtgataa	ttcgaaaaac	accctgtatc	tgcaaatgaa	cagcctgcgt	1080

PL 216 190 B1

171

103/65 gcggaagata cggccgtgta ttattgcgcg cgttggggcg gcgatggctt ttatgcgatg gattattggg gccaaggcac cctggtgacg gttagcteag cgtcgaccaa aggtccaagc gtgtttccgc tggctccgag eagca&astgc accagcggcg gcacggctgc cctgggctgc ctggttaaag attatttccc ggaaccagtc accgtgagct ggaacagcgg ggcgctgacc agcggcgtgc atacctttcc ggcggtgctg caaagcagcg gcctgtatag cctgagcagc gttgtgaccg tgccgageag cagcttaggc actcagacct atatttgcaa cgtgaaccat aaaccgagca acaccaaagt ggataaaaaa gtggaaccga aaagcgaatt cgggggaggg agcgggagcg gtgattttga ttatgaaaag atggcaaacg ctaataaggg ggctatgacc

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560 gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagfcct gacgctaaag gcaaacttga ttctgtcgct 1620 actgattacg gtgctgctat cgatggtttc attggtgacg tttccggcct tgctaatggt 1680

aatggtgcta	ctggtgattt	tgctggctct	aattcccaaa	tggctcaagfc	cggtgacggt	1740
gataattcac	ctttaatgaa	taatttccgt	caatatttac	cttccctccc	tcaatcggtt	1800
gaatgtcgcc	cttttgtctt	tggcgctggt	aaaccatatg	aattttctat	tgattgtgac	186 0
aaaataaact	tattccgtgg	tgtctttgcg	tttcttttat	atgttgcćac	ctttatgtat	1920
gtattttcta	cgfcttgctaa	catactgcgt	aataaggagt	cttgataagc	ttgacctgtg	1980
aagtgaaaaa	tggcgcagat	tgtgcgacat	tttttttgtc	tgccgtttaa	tgaaattgta	2040
aacgttaata	ttttgttaaa	attcgcgtta	aatttttgtt	aaatcagctc	attttttaac	2100
caataggccg	aaatcggcaa	aatcccttat	aaatcaaaag	aatagaccga	gatagggttg	2160
agtgttgttc	cagtttggaa	caagagtcca	ctattaaaga	acgtggactc	caacgtcaaa	2220
gggcgaaaaa	ccgtctatca	gggcgatggc	ccactacgag	aaccatcacc	ctaatcaagt	2280
tttttggggt	cgaggtgccg	taaagcacta	aatcggaacc	ctaaagggag	cccccgattt	2340
agagcttgac	ggggaaagcc	ggcgaacgtg	gcgagaaagg	aagggaagaa	agcgaaagga	2400
gcgggcgcta	gggcgctggc	aagtgtagcg	gtcacgctgc	gcgtaaccac	cacacccgcc	2460
gcgcttaatg	cgccgctaca	gggcgcgtgc	tagccatgtg	agcaaaaggc	cagcaaaagg	2520
ccaggaaccg	taaaaaggcc	gcgttgctgg	cgtttttcca	taggctccgc	ccccctgacg	2580
agcatcacaa	aaatcgacgc	tcaagtcaga	ggtggcgaaa	cccgacagga	ctataaagat	2640
accaggcgtt	tccccctgga	agctccctcg	tgcgctctcc	tgttccgacc	ctgccgctta	2700
ccggatacct	gtccgccttt	ctcccttcgg	gaagcgtggc	gctttctcat	agctcacgct	2750
gtaggtatct	cagttcggtg	taggtcgttc	gctccaagct	gggctgtgtg	cacgaacccc	2820
ccgttcagtc	cgaccgctgc	gccttatccg	gtaactatcg	tcttgagtcc	aacccggtaa	2880

172

PL 216 190 B1

104/165

gacacgactt atcgccactg gaagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg	2940
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag	3000
tatttggtat ctgcgctctg ctgtagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt	3060
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagćg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta	3120
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc	3180
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcagatc tagcaccagg cgtttaaggg	3240
caccaataac tgccttaaaa aaattacgcc ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt	3300
aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaaa cggcatgatg aacctgaatc	3360
gccagcggca tcagcacctt gtcgcctfcgc gtataatatt tgcccatagt gaaaacgggg	3420
gcgaagaagt tgtccatatt ggctacgttt aaatcaaaac tggtgaaact cacccaggga	3480
ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc caggttttca	3540
ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact gccggaaatc gtcgtggtat	3600
tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga aaacggtgta acaagggtga	3660
acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacggaactc cgggtgagca	3720
ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt atttttcttt	3760
acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct ggttataggt acattgagca	3840
actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt gggatatatc aacggtggta	3900
tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctc ctgaaaatct cgataactca	3960
aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatagtgaa agttggaacc tcacccgacg	4020
tctaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct	4080
cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat	4140

gattacgaat t 4151 <210> 254 <211> 638 <212 > PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; białko pM0RPH18_Pab <400> 254

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 15 10 15

PL 216 190 B1

173

105/165

Thr Val Ala Gin Ala Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin 35 40 45

Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 50 5S 60

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val 65 70 75 80

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95

Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140

Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175

Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala Met Lys Gin Ser 225 230 235 240

Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr Lys 245 250 255

174

PL 216 190 B1

106/165	Pro	Gly
Ala Gin Val	Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
260	265	270
Gly Ser Leu 275	Arg Leu Ser Cys Ala 280	Ala Ser	Gly Phe Thr Phe 285	Ser	Ser
Tyr Ala Met 2 90	Ser Trp Val Arg Gin 295	Ala Pro	Gly Lys Gly Leu 300	Glu	Trp
Val Ser Ala 305	Ile Ser Gly Ser Gly 310	Gly Ser	Thr Tyr Tyr Ala 315	Asp	Ser 320
Val Lys Gly	Arg Phe Thr Ile Ser 325	Arg Asp 330	Asn Ser Lys Asn	Thr 335	Leu
Tyr Leu Gin	Met Asn Ser Leu Arg 340	Ala Glu 345	Asp Thr Ala Val 350	Tyr	Tyr
Cys Ala Arg 355	Trp Gly Gly Asp Gly 360	Phe Tyr	Ala Met Asp Tyr 365	Trp	Gly
Gin Gly Thr 370	Leu Val Thr Val Ser 375	Ser Ala	Ser Thr Lys Gly 380	Pro	Ser
Val Phe Pro 385	Leu Ala Pro Ser Ser 390	Lyg Ser	Thr Ser Gly Gly 395	Thr	Ala 400
Ala Leu Gly	Cys Leu Val Lys Asp 405	Tyr Phe 410	Pro Glu Pro Val	Thr 415	Val
Ser Trp Asn	Ser Gly Ala Leu Thr 420	Ser Gly 425	Val His Thr Phe 430	Pro	Ala
Vał Leu Gin 435	Ser Ser Gly Leu Tyr 440	Ser Leu	Ser Ser Val Val 445	Thr	Val
Pro Ser Ser 450	Ser Leu Gly Thr Gin 455	Thr Tyr	Ile Cys Asn Val 460	Asn	His
Lys Pro Ser 465	Asn Thr Lys Val Asp 470	Lys Lys	Val Glu Pro Lys 475	Ser	Glu 480
Phe Gly Gly	Gly Ser Gly Ser Gly	Asp Phe	Asp Tyr Glu Lys	Met	Ala

PL 216 190 B1

175

107/165

4S5 490 495

Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu 500 505 510

Gin Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly 515 520 525

Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly 530 535 540

Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gin Met Ala Gin 545 550 555 560

Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gin Tyr 565 570 575

Leu Pro Ser Leu Pro Gin Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly 580 585 590

Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu 595 600 S05

Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr 610 615 620

Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser 625 630 635 <210> 255 <2łl> 5020 <212» DNA <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; pMORPH xS <400> 255

atcgLgctga	cccagccgcc	ttcagtgagt	ggcgcacc&g	gtcagcgtgt	gaccatctcg	60
tgtagcggca	gcagcagcsa	cattggcagc	aactafcgtga	gctggtacca	gcagttgccc	12C
gggacggcgc	cgaaactgct	gatttatgat	aacaaccagc	gtccctcagg	cgtgccggat	180
cgttttagcg	gatccaaaag	cggcaccagc	gcgagccttg	cgattacggg	cctgcaaagc	240
gaagacgaag	cggattatta	ttgccagagc	ta fcgacćifcgc	ctcaggctgt	gtttggcggc	300
ggcacgaagt	ttaaccgttc	ttggccagcc	gaaagccgca	ccgagtgtga	cgctgtttcc	360

176

PL 216 190 B1

108/165

gccgagcagc	gaagaattgc	aggcgaacaa	agcgaccctg	gtgtgcctga	ttagcgactt	420
ttatccggga	gccgtgacag	tggcctggaa	ggcagatagc	agccccgtca	aggcgggagt	480
ggagaccacc	acaccctcca	aacaaagcaa	caacaagtac	gcggccagca	gctatctgag	540
cctgacgcct	gagcagtgga	agtcccacag	aagctacagc	tgccaggtca	cgcatgaggg	600
gagcaccgtg	gaaaaaaccg	ttgcgccgac	tgaggcctga	taagcatgcg	taggagaaaa	660
taaaatgaaa	caaagcacta	ttgcactggc	actcttaccg	ttgctcttca	cccctgttac	720
caaagcccag	gtgcaattga	aagaaagcgg	cccggccctg	gtgaaaccga	cccaaaccct	780
gaccctgacc	tgtacctttt	ccggatttag	cctgtccacg	tctggcgttg	gcgtgggctg	840
gattcgccag	ccgcctggga	aagccctcga	gtggctggct	ctgattgatt	gggatgatga	900
taagtattat	agcaccagcc	tgaaaacgcg	tctgaccatt	agcaaagata	cttcgaaaaa	960
tcaggtggtg	ctgactatga	ccaacatgga	cccggtggat	acggccacct	attattgcgc	1020
gcgttctcct	cgttatcgtg	gtgcttttga	ttattggggc	caaggcaccc	tggtgacggt	1080
tagctcagcg	tcgaccaaag	gtccaagcgt	gtttccgctg	gcfcccgagca	gcaaaagcac	114 0
cagcggcggc	acggctgccc	tgggctgcct	ggttaaagat	tatttcccgg	aaccagtcac	1200
cgtgagctgg	aacagcgggg	cgctgaccag	cggcgtgcat	aectttccgg	cggtgctgca	1260
aagcagcggc	ctgtatagcc	tgagcagcgt	tgtgaccgtg	ccgagcagca	gcttaggcac	1320
tcagacctat	atttgcaacg	tgaaccataa	accgagcaac	accaaagtgg	ataaaaaagt	1380
ggaaccgaaa	agcgaattcg	actataaaga	tgacgatgac	aaaggcgcgc	cgtggagcca	1440
cccgcagttt	gaaaaatgat	aagcttgacc	tgtgaagtga	aaaatggcgc	agattgtgcg	1500
acattttttt	tgtctgccgt	ttaattaaag	gggggggggg	gccggcctgg	gggggggtgt	1560
acatgaaatt	gtaaacgtta	atattttgtt	aaaattcgcg	ttaaattttt	gttaaatcag	1620
ctcatttttt	aaccaatagg	ccgaaatcgg	caaaatccct	tataaatcaa	aagaatagac	1680
cgagataggg	ttgagtgttg	ttccagtttg	gaacaagagt	ccactattaa	agaacgtgga	1740
ctccaacgtc	aaagggcgaa	aaaccgtcta	tcagggcgat	ggcccactac	gagaaccatc	1800
accctaatca	agttttttgg	ggtcgaggtg	ccgtaaagca	ctaaatcgga	accctaaagg	1860
gagcccccga	tttagagctt	gacggggaaa	gccggcgaac	gtggcgagaa	aggaagggaa	1920
gaaagcgaaa	ggagcgggcg	ctagggcgct	ggcaagtgta	gcggtcacgc	tgcgcgtaac	1980
caccacacce	gccgcgctta	atgcgccgct	acagggcgcg	tgctagacta	gtgtttaaac	2040
cggaccgggg	gggggcttaa	gtgggctgca	aaacaaaacg	gcctcctgtc	aggaagccgc	2100

PL 216 190 B1

177

109/165

ttttatcggg	tagcctcaet	gcccgctttc	cagtcgggaa	acctgtcgtg	cca<gcfcgc<a.t	2160
cagtgaatcg	gccaacgcgc	ggggagaggc	ggtttgcgta	ttgggagcca	gggtggtttt	2220
tcttttcacc	agtgagacgg	gcaacagctg	attgcccttc	accgcctggc	cctgagagag	2280
ttgcagcaag	cggtccacgc	tggtfctgccc	cagcaggcga	aaatcctgtt	tgatggtggt	2340
cagcggcggg	atataacatg	agetgtcctc	ggtatcgtcg	tatcccacta	cćgagatgtc	2400
cgcaccaacg	cgcagcccgg	actcggtaat	ggcacgcatt	gcgcccagcg	ccatctgatc	2460
gttggcaacc	agcatcgcag	tgggaacgat	gccctcattc	agcatttgca	tggtttgttg	2520
aaaaccggac	atggcactcc	agtcgccttc	ccgttccgct	atcggctgaa	tttCJcltfcCfCCJ	2580
agtgagatat	ttatgccagc	cagccagacg	cagacgcgcc	gagacagaac	ttaatgggcc	2640
agctaacagc	gcgatttgct	ggtggcccaa	tgcgaccaga	·. gctccacgc	ccagtcgcgt	2700
accgtcctca	tgggagaaaa	taatactgtt	gatgggtgtc	tggtcagaga	c-t.ca5.g-s-	2760
taacgccgga	acattagtgc	aggcagcttc	ęacagcaata	gcatcctggt	catccagcgg	2820
atagttaata	atcagcccsc	tgacacgttg	cgcgagaaga	ttgtgcaccg	ccgctttaca	2880
ggcttcgacg	ccgcttcgtt	ctaccatcga	cacgaccacg	ctggcaccca	gttgatcggc	2940
gcgagattta	atcgccgcga	caatttgcga	cggcgcgtge	agggccagac	tggaggtggc	3000
aacgccaatc	agcaacgact	gtttgcccgc	cagttgttgt	gccacgcggt	taggaatgta	3060
attcagctcc	gccatcgccg	cttccacttt	ttcccgcgtt	ttcgcagaaa	cgtggctggc	3120
ctggttcacc	acgcgggaaa	cggtctgata	agagacaccg	gcatactctg	cgacatcgta	3180
taacgttact	ggtttcacat	tcaccaccct	gaattgactc	tcttccgggc	gctatcatgc	3240
cataccgcga	aaggttttgc	gccattcgat	gctagccatg	tgagcaaaag	gccagcaaaa	3300
ggccaggaac	cgtaaaaagg	ccgcgttgct	ggcgtttttc	cataggctcc	gcccccctga	3360
cgagcatcac	aaaaatcgac	gctcaagtca	gaggtggcga	aacccgacag	gactataaag	3420
ataccaggcg	tttccccctg	gaagctccct	cgtgcgctct	cctgttccga	ccctgccgct	3480
taccggatac	ctgtccgcct	ttctcccttc	gggaagcgtg	gcgctttctc	atagctcacg	3540
ctgtaggtat	ctcagttcgg	tgtaggtcgt	tcgctccaag	ctgggctgtg	tgcacgaacc	3600
ccccgttcag	cccgaccgct	gcgccttatc	cggtaactat	cgtcttgagt	ccaacccggt	3660
aagacacgac	ttatcgccac	tggcagcage	cactggtaac	aggattagca	gagcgaggta	3720
tgtaggcggt	gctacagagt	tcttgaagtg	gtggcctaac	tacggctaca	ctagaagaac	3780
agtatttggt	atctgcgctc	tgctgtagcc	agttaccttc	ggaaaaagag	ttggtagctc	3840
ttgatccggc	aaacaaacca	ccgctggtag	cggtggtttt	tttgtttgca	agcagcagat	3900

178

PL 216 190 B1

110/165

tacgcgcaga	aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc	3960
tcagtggaac	gaaaactcac gttaagggat tttggtcaga tatagcacca ggcgtttaag	4020
ggcaccaata	actgccttaa aaaaattacg ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt	4080
gtaattcatt	aagcattctg ccgacatgga agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa	4140
tcgccagcgg	catcageacc ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccata gtgaaaacgg	4200
gggcgaagaa	gttgtccata ttggctacgfc ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg	4260
gattggctga	gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt	4320
caccgtaaca	cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt	4380
attcactcca	gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt	4440
gaacactatc	ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacggaac tccgggtgag	4500
cattcatcag	gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct	4560
ttacggtctt	taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt ctggttatag gtacattgag	4620
caactgactg	aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg	4680
tatatccagt	gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact	4740
caaaaaatac	gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcacccga	4800
cgtctaatgt	gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg	4860
ctcgtatgtt	gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc	4920
atgattacga	atttctagat aacgagggca aaaaatgaaa aagacagcta tcgcgattgc	4980
agtggcactg	gctggtttcg ctaccgtagc gcaggccgat	5020

<Ξ10> 256 <211> 7 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 256

Ala Glu Phe Arg His Asp Cys 1 5 <210> 257 <21i> 7 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja

PL 216 190 B1

179

111/165

<220» <223?	konstrukcja syntetyczna
<400»	257

Glu Phe Arg His Asp Ser Cys

1	5
<210» <211» <212» <213»	2Ξ8 7 sztuczna sekwencja

<220»
< 2 2 3 >	konstrukcja syntetyczna
<400>	259

Phe Arg His Asp ser Gly Cys 1 5

<210» <211» <212» <213»

259 7 PRT sztuczna sekwencja

<220» <22 3»	konstrukcja syntetyczna
<400»	259
Arg H] 1	LS Asp Ser Gly Tyr Cys 5
<210» <211» <212> <7.13»	260 7 PRT sztuczna sekwencja.

<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	260

.sp Ser Gly Tyr Glu Cys

<210» <211» <212» <213»

261 7 PRT sztuczna sekwencja

<220» <223»

konstrukcja syntetyczna

180

PL 216 190 B1

2 j 1 6 '5 <400> 261

Asp Ser Gly Tyr Glu Val Cys

1 5
<21 0>	262
<211>	7
<212>	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyezm
<400»	262

Ser Gly Tyr Glu Val His Cyś 1 5

<210»	263
< 211»	7
< 21. 2 >	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220»
<2.3 3»	konstrukcja syntetyczna
<400»	263

Tyr Glu val His His Gin Cys Ϊ 5 <2.10» 264 <211» 7 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 264

Glu Val Hi a His Gin Lys Cya

<210»	263
<211»
<2 12»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja.
<220»
<223 »	koustrukeja syntetyczna
<400»	265

Val His His Gin Lys Leu Cys

PL 216 190 B1

181

1.13/165

<210> <211? <212> <213>	2 66 7 PRT sztuczna sekwencja
<22 0> <223>	konstrukcj a syntetyczna
<4 0 0>	266
His His	3 Gin Lys Leu Val Cys

5 <2i0> 267 <211> 7 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <2 20>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 267

His Gin Lys Leu Val Phe Cys 1 ς <210» 268 <2ii> 7 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukcja syntetyczna <400» 268

Gin Lys Leu Val Phe Phe Cys 1 5 <210> 269 <211» 7 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukcja syntetyczna <400> 269 .Lys Leu Val Phe Phe Ala Cys 1 5

182

PL 216 190 B1

114/165

<210»	270
<211»	7
<212»	PRT
<213»	sztuczna, sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyc zn
<4 00»	270
Leo. Va	1 Phe Phe Ala Glu Cys

5 <210» 271 <211» 7 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 271

Val Phe Phe Ala Clu Asp Cys

1	’’
<210?..	2 72
<211»	7
<212»	PRT
<2.13»	sztuczna sekwencja.
<220»
<2 2 3»	kon s trukc ja synte tyc z na
<4 00»	272
Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys

<210» 273 <211» 7 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 273

Phe Ala Glu Asp Val Sly Cys

210» 274

211» 7

212» PRT

PL 216 190 B1

183

115/165

<213?	sztuczna sekwencja
<220? <223?	konstrukcja syntetyczna
<400?	274

Ala Glu Asp Val Gly Ser Cys

X <210? <211> <212? <213 ?

5 275 PRT sztuczna sekwencja

<220? <223 >	konstrukcja syntetyczna
<400?	275

Glu Asp Val Gly Ser Asn Cys 1 5

<210? <211? <212> <213?

276 PRT sztuczna sekwencja

<220? <223?	konstrukcja syntetyczna
<400?	276

Asp Val Gly Ser Asn Lys Cys

1	5
<210? <211> <212? <213?	277 7 PRT sztuczna sekwencja
<220? <223?	konstrukcja syntetyczna
<400?	277

Val Gły Ser Asn Lys Gly Cys 1 5

<210? <211? <212? <213?	278 7 PRT sztuczna sekwencja
<220?

184

PL 216 190 B1

116/165 <223> konstrukcja syntetyczna <400» 278

Gly Ser Asn Lys Gly Ala Cys I 5

<210» <211> <212» <213»	279 7 PRT sztuczna sekwencja
<220> <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	279

Cys Ser Asn Lys Gly Ala Ile

1	5
<210 > <211> <212> <213»	280 7 PRT sztuczna sekwencja
<223>	konstrukcja syntetyczna
<400»	280

Cys Asn Lys Gly Ala Ile Ile

1	5
<210» <211» <212» <213»	201 7 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	281

Cys Lys Gly Ala Ile Ile Gly 1 5

<210» <211» <212> <213»	292 7 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	282

PL 216 190 B1

185

117/165

Cys Gly Leu Met Val Gly Gly 1 5 <210» 283 <211» 7 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna <400» 283

Cys Met Val Gly Gly Val Val

5 <210> 284 <211» 7 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220 » <223> konstrukcja syntetyczna <400» 284

Cys Gly Gly Val Val Ile Ala 1 5 <210» 285 <211» 6 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; peptide 1 A beta <400» 285

Ala Glu Phe Arg His Asp

5 <210» 286 <211» 7 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <22 0>

<223> konstrukcja syntetyczna; peptide 2 A beta <400» 286

Glu Phe Arg His Asp Ser Gly ¹ 5

186

PL 216 190 B1

118/165 <210> 287 <211> 5 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna; peptide 3 A beta <400» 287

Glu Phe Arg His Asp

5 <210» 28 8 <211> 4 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; peptide 4 A beta <400» 208

His Asp Ser Gly <210» 289 <211» 5 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; peptide 5 A beta <400» 289

His His Gin Lys Leu

5 <210» 290 <211» 6 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; peptide 6 A beta <400» 290

Leu Val Phe Phe Ala Glu

5 <210» 291

PL 216 190 B1

187

119/165 <211> 6 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna; peptide 7 A beta <400» 291

Val Phe Phe Ala Glu Asp

5 <210» 292 <211» 4 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; peptide 8 A beta <400» 292

Val Phe Phe Ala <210» 293 <211» 6 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna; peptide 9 A beta <400» 293

Phe Phe Ala Glu Asp Val

5 <210» 294 <211» 360 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220 >

<223» konstrukcja syntetyczna <400» 294 caattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt tagcagctat gcgatgagct gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtgggtgag cgttatttct gagaagtctc gttttattta ttatgctgat 180 tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tactcattat 300

188

PL 216 190 B1

120/165 gctcgttatt atcgttattt tgatgtttgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca

36G

<210»	295
<211>	12 0
<212»	PRT
<213»	sztuczna	sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	295
Gin Leu Val Glu	Ser Gly Gly Gl;

Arg Leu Ser Cys Ala.Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val 35 40 45

Ile Ser Glu Łys Ser Arg Phe Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 70 75 30

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vał Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 296 <211> 360 <212» DNA <213 > sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna <400> 296 caattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt tagcagctat gcgatgagct gggtgcgcca agcccctggg 120

PL 216 190 B1

189

121/165
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctatttct	gagacttcta	ttcgtaagta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tactcattat	300
gctcgttatt	atcgttattt	tgatgtttgg	ggccaaggca	ccctggtgac	ggttagctca	360

<210> 297 <211? 120 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <22 0?

<223> konstrukcja syntetyczna <40Q> 297

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 15 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Ser Glu Thr Ser Ile Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 70 75 60

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210>	298
<211>	360
<212>	DNA
<213?	sztuczna sekwencja
<220>
<223>	konstrukcja syntetyczna

190

PL 216 190 B1

122/165 <400;-· 293

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgttatttct	cagacfcggtc	gtaagattta	ttatgctgat	130
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tactcattat	300
gctcgttatt	atcgttattt	tgatgtttgg	ggccaaggca	ccctggtgac	ggttagctca	360

<210» 299 <211> 120 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» ' <223» konstrukcja syntetyczna <400» 299

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val 35 40 45

Ile Ser Gin Thr Gly Arg Lys Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin ⁶⁵ 70 75 60

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg S5 90 95

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210» 300 <211» 360 <212» DNA

PL 216 190 B1

191

123/165 <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400» 300

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgttatttcfc	cagactggtc	gtaagattta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tactcattat	300
gctcgttatt	atcgttattt	tgatgtttgg	ggccaaggca	ccctggtgac	ggttagctca	360

<210> 301 <211> 120 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukcja syntetyczna <400> 301

Gin Leu Dal Glu Ser Gly Gly Gly Leu Dal Gin Pro Gly Gly Ser Leu 15 10 15

Arg Łeu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val 35 40 45

Ile Ser Gin Thr Gly Arg Lys Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 70 75 80

Gly Thr Łeu Dal Thr Val Ser Ser 115 120

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

90 95

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin

100 105 110

192

PL 216 190 B1

124/165 <21Q> 302 <211> 360 <212» DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 302 caattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt tagcagctat gcgatgagct gggtgcgcca agcccctggg 120 aagggtctcg agtgggtgag cgttatttct gagactggta agaatattta ttatgctgat ISO tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa 240 atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtct tactcattat 300 gctcgttatt atcgttattt tgatgtttgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 3S0 <210» 303 <211> 120 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna <400> 303

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu ^-5 io 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 2Q 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val 35 40 4₅

Ile Ser Glu Thr Gly Lys Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin €5 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin

PL 216 190 B1

193

125/165 ¹⁰⁰ 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210» 304 <211» 360 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 304

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgttatttct	gagactggta	agaatattta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tactcattat	300
gctcgttatt	atcgttattt	tgatgtttgg	ggccaaggca	ccctggtgac	ggttagctca	360

<210» 305 <211? 120 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 305

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu ¹ 5 io 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val 35 40

Ile Ser Glu Thr Gly Lys Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 go

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 70 75 g_Q

194

PL 216 190 B1

126/165

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin 100 105 no

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210» 306 <211> 360 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna <400» 306

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	so
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctatttct	gagtctggta	agactaagta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tactcattat	300
gctcgttatt	atcgttattt	tgatgtttgg	ggccaaggca	ccctggtgac	ggttagctca	360

<210> 307 <211» 120 <212> PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 307

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu ¹ 5 io 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met

25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala

40 45

Ile Ser Glu Ser Gly Lys Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

PL 216 190 B1

195

127/166

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Vał Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 308 <211?· 372 <212 > DNA <213> sztuczna sekwencja <220?

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 308

caattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc	60
gcggcctccg gatttacctt tagcagctat gcgatgagct gggtgcgcca agcccctggg	120
aagggtctcg agtgggtgag cgctattaat ggtactggta tgaagaagta ttatgctgat	180
tctgttaagg gtcgttttac catttcacgt gataattcga aaaacaccct gtatctgcaa	240
atgaacagcc tgcgtgcgga agatacggcc gtgtattatt gcgcgcgtgg taagggtaat	300
actcataagc cttatggtta tgttcgttat tttgatgttt ggggccaagg caccctggtg	360
acggttagct ca	372

<210>	309
<211>	124
<212?.·	PRT
<213?	sztuczna sekwencja
<220>
<223?	konstrukcja syntetyczna
<400?	309
Gin, Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu

10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

196

PL 216 190 B1

128/165

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Asn Gly Thr Gly Met Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 70 75 SO

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210» 310 <211» 372 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <22 0 >

<223» konstrukcja syntetyczna <400» 310

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctattaat	tataatggtg	ctcgtattta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattega	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372

<210» 311 <211> 124 <212» PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 311

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu

PL 216 190 B1

197

129/165

10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 3G

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Asn Tyr Asn Gly Ala Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Tal Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin S5 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210» 312 <211» 372 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 312

caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	50
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctattaat	gctgatggta	atcgtaagta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc	cttatggtfca	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372

<210» <211» <212» <213»

313

124

PRT sztuczna sekwencja

198

PL 216 190 B1

PL 216 190 B1

199

131/165
acggttagct ca	372
<210»	315
<211>	124
<212>	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	315
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly leu Dal Gin Pro Gly Gly Ser Leu

1. 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Fhe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Asn Ala Asp Gly Asn Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 SD

Arg Phe. Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin SS 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Dał Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Dał Arg Tyr Phe Asp 100 105 110

Dal Trp Gly Gin Gly Thr Leu Dal Thr Dal Ser Ser 115 120 <210> 316 <21ł> 372 <212» DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400» 316 caattggtgg aaagcggcgg cggcctggtg caaccgggcg gcagcctgcg tctgagctgc 60 gcggcctccg gatttacctt tagcagctat gcgatgagct gggtgcgcca agcccctggg 12Q aagggtctcg agtgggtgag cgctattaat gctaatggtt ataagaagta ttatgctgat 180

200

PL 216 190 B1

132/165

tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggęgccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372

<210» 317 <211? 124 <212 > PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <4C0> 317

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu.

-5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Asn Ala Asn Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr I,eu Gin S5 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vał Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210»	318
<211»	372
<212»	DNA
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223»	konstrukcja syntetyczna

PL 216 190 B1

201

133/165

<400> 318 caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gattfcacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	12 0
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctattaat	gctaatggtt	ataagaagta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	360
acggttagct	ca					372
<210> 319 <211> 124 <212> PRT

<213> sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna <400> 319

Gin I.,eu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Asn Ala Asn Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 go

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 100 105 HO *

Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

202

PL 216 190 B1

134/165 <210» 320 <211> 372 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna

<400» 320 caattggtgg	aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gcggcctccg	gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	120
aagggtctcg	agtgggtgag	cgctattaat	gctaatggtt	ataagaagta	ttatgctgat	180
tctgttaagg	gtcgttttac	catttcacgt	gataattega	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
atgaacagcc	tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtgg	taagggtaat	300
actcataagc	cttatggtta	tgttcgttat	tttgatgttt	ggggccaagg	caccctggtg	3S0
acggttagct	ca					372
<210» 321 <211> 124 <212> PRT

<213> sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna <400> 321

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu 15 io 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lya Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 35 40 45

Ile Asn. Ala Asn Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin ⁵⁵ 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

90 95

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

PL 216 190 B1

203

135/165

ŁOO 105 110

Val Trp Gly Gin Gły Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <2ł0> 3Ξ2 <211» 366 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» ' <223» konstrukcja syntetyczna <400» 322 caattggtgg gcggcctccg aagggtctcg tctgttaagg atgaacagcc ggttataatg agctca

aaagcggcgg	cggcctggtg	caaccgggcg	gcagcctgcg	tctgagctgc	60
gatttacctt	tagcagctat	gcgatgagct	gggtgcgcca	agcccctggg	12 0
agtgggtgag	cgctatttct	cgttctggtt	ctaatattta	ttatgctgat	180
gtcgttttac	catttcacgt	gataattcga	aaaacaccct	gtatctgcaa	240
tgcgtgcgga	agatacggcc	gtgtattatt	gcgcgcgtct	tctttctcgt	300
gttattatca	taagtttgat	gtttggggcc	aaggcaccct	ggtgacggtt	350
					3S6

<210» 323 <211» 122 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 323

Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vał Gin Pro Gly Gly Ser Leu ¹ 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met 20 25 30

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin ⁶⁵ 70 75 80

Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala

40 45

Ile Ser Arg Ser Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

55 50

204

PL 216 190 B1

136/165

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95

Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp Val Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 324 < 211 > 330 <212» DNA <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 324

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagegageeg	gcgtattcat	gtttattatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggegegagea	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gegcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgegaetta	ttattgecag	cagacttatg	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210» 325 <211» 110 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 325

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly ¹ 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Arg Ile His Val Tyr

25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

PL 216 190 B1

205

137/165

55

60

50

Gly 65

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 70

Asp

Phe

leu

Thr 75

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu 80

Pro

Glu

Asp

Phe

Alei 85

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin 90

Gin

Thr

Tyr

Asp

Tyr 95

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100 105 110 <210» 326 <211> 330 <212> DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 326

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagegageeg	gcgtattcat	gtttattatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	12 0
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggteccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgegaetta	ttattgccag	cagacttatg	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210»	327
<211>	110
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	327

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Arg Ile His Val Tyr 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu

40 45

206

PL 216 190 B1

138/165

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Asp Tyr Pro 85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 328 <211> 330 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 328

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gcgtcttggt	cgtctttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagacttatg	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	<3. cl CJ1t CJ ci 3 cl t	taaacgtacg				330

<210» 329 <211> 110 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 329

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly ¹ 5 io 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Arg Leu Gly Arq Leu 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu

40 45

PL 216 190 B1

207

139/165

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Asp Tyr Pro 85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210» 330 <211» 330 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna

<400» 330 gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagccg	gcgtattcat	gtttattatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gecgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagacttatg	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330
<210» 331 <21I> 110 <212» PRT

<213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 331

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly ¹ 5 io 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Arg Ile His Val Tyr

25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu

40 45

208

PL 216 190 B1

PL 216 190 B1

209

141/165

35

40

45

Ile Tyr

Gly

Ala

Ser

Ser Arg

Ala

Thr

Gly

Val

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly Ser

Gly

Ser

Gly

Thr Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

6 5

70

75

80

Pro Glu

Asp

Phe

Ala

Thr Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Pro

85

90

95

Pro Thr

Phe

Gly

Gin

Gly Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

<210>

334

<211 >

330

<212>

DNA

<213>

sztuczna

sekwencj a

<220>

<223>

konstrukcja

syntetyczna

<400> 334

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gcgtcttggt	cgtctttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagacttatg	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> 335 <211> 110 <212> PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 335

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Arg Leu Gly Arg Leu

25 30

210

PL 216 190 B1

142/165

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu ⁶⁵ 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cya Gin Gl.n Thr Tyr Asp Tyr Pro

90 95

Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr ' ¹⁰⁰ 105 HO <210» 336 <211» 330 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 336

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gtttattcag	cgtttttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	. 180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcggttta	ttattgccag	cagacttata	attatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330
<210» 337 <211» 110 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja

<22 G>

<223» konstrukcja syntetyczna <40Q> 337

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly ¹ 5 ic

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Phe Ile Gin Arg Phe

25 30

PL 216 190 B1

211

143/155

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Tyr Asn Tyr Pro 85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210» 338 <211> 330 <212» DNA <213? sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna

<400» 338 gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gtatgttgat	cgtacttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagatttatt	ctttt.cctca	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330
<210» 339 <211> 110 <212» PRT

<213» sztuczna sekwencja <220» <22 3 > konstrukcja syntetyczna <400» 339

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cya Arg Ala Ser Gin Tyr Val Asp Arg Thr

25 30

212

PL 216 190 B1

144/165

Tyr Leu	Ala Trp 35	Tyr Gin Gin Lys 40	Pro Gly	Gin Ala Pro Arg 45	Leu	Leu
Ile Tyr	Gly Ala	Ser Ser Arg Ala	Thr Gly	Val Pro Ala Arg	Phe	Ser
50		55		60
Gly Ser	Gly Ser	Gly Thr Asp Phe	Thr Leu	Thr Ile Ser Ser	Leu	Glu
65		70		75		80
Pro Glu	Asp Phe	Ala Thr Tyr Tyr	Cys Gin	Gin Ile Tyr Ser	Phe	Pro
		85	90		95
His Thr	Phe Gly	Gin Gly Thr Lys	Val Glu	Ile Lys Arg Thr
	100		105	110
<210>	340
<211>	330
<212>	DNA
<213>	sztuczna	sekwencja
<220>
<223 >	konstrukcja syntetyczna

<400> 340

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gcgttttttt	tataagtatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttct	ggttcttcta	accgtgcaac	tggggtcccg	180
gegcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcggttta	ttattgeett	cagctttata	atattcctaa	tacctttggc	3 00
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> 341 <211> 110 <212> ΡΕΤ <213> sztuczna sekwencja <220>

<223 > konstrukcja syntetyczna <400> 341

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly ¹⁵ 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Arg Phe Phe Tyr Lys

PL 216 190 B1

213

214

PL 216 190 B1

146/165 Glu Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Tyr

Val

Asp 30

Arg.

Thr

Tyr

Leu

35

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys 40

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 45

Arg

Leu

Leu

X1 θ

Tyr 50

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg 55

Ala

Thr

Gly

Val

Pito 60

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly 65

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 70

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 75

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu 80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 85

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin 90

Gin

Ile

Tyr

Ser

Phe 95

Pro

His

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100 105 110 <210» 344 <211» 330 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 344

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gtatgttttt	cgtcgttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	12 0
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttct	ggttcttcta	accgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcggttta	ttattgcctt	cagctttata	atatfccctaa	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330
<210» 345 <211» 110 <212» PRT

<213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 345

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

PL 216 190 B1

215

147/165

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Tyr

Val

phe

Arg

Arg

20

25

30

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

35

4 0

45

Ile

Ser

Gly

Ser

Ser

Asn

Arg

Ala

Thr

Gly

Dal

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

65

70

75

80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Dal

Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gin

Leu

Tyr

Asn

Ile

Pro

85

90

95

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Dal

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

<210> 346 <211» 330 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220.·· .

<223> konstrukcja syntetyczna <400» 346

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gtatgttgat	cgtacttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagatfctatt	cttttcctca	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210» 347 <211> 110 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 347

Asp Ile Dal Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

216

PL 216 190 B1

148/165

1 Glu Arg

Ala

5

cys

10

15

Thr Leu 20

Ser

Arg

Ala 25

Ser

Gin Tyr

val

Asp 30

Arg

Thr

Tyr Leu

Ala.

Trp Tyx*

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

3Ξ

40

45

Ile Tyr

Gly

Ala Ser

Ser

Arg

Ala

Thr

Gly

Val Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

50

55

60

Gly Ser

Gly

Ser Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

6 5

70

7S

80

Pro Glu

Asp

Phe Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin Ile

Tyr

Ser

Phe

Pro

85

90

95

His Thr

Phe

Gly Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile Lys

Arg

Thr

100

105

110

<210»

348

<211»

330

<212»

DNA

<213»

sztuczna sekwencja

<220>

<223»

konstrukcja :

syntetyczna

<400> 348

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gcgtctttct	cctcgttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggteccg	130
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgegaetta	ttattgeett	cagatttata	atatgcctat	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210> 349 <211» 110 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna <400> 349

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

PL 216 190 B1

217

149/165

1

5

10

15

Glu

Arg

Ala

Thr 20

Leii

Ser

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Arg

Leu

Ser 30

Pro

Arg

Tyr

Leu

Ala 35

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys 40

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro 45

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr 50

Gly

Ala

Ser

Ser

Arg 55

Ala

Thr

Gly

Val

Pro 60

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly 65

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 70

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr 75

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu 80

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala 85

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Leu 90

Gin

Ile

Ty,

Asn

Met 95

Pro

Ile

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100 105 110 <210> 350 <211> 330 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400» 350 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gtatgttttt cgtcgttatc tggcgtggta ccagcagaaa. 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttct ggttcttcta accgtgcaac tggggtcccg ISO gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcggttta ttattgcctt cagctttata atattcctaa tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg 330

<210» <211> <212» <213»	351 110 PRT sztuczna sekwencja
<220> <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	351
150/165

218

PL 216 190 B1

150/165

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Tyr Val Phe Arg Arg 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Leu Tyr Asn Ile Pro 85 90 95

Asn Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210» 352 <211> 330 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<22 3> konstrukcja syntetyczna <400> 352

gatatcgtgc	tgacccagag	cccggcgacc	ctgagcctgt	ctccgggcga	acgtgcgacc	60
ctgagctgca	gagcgagcca	gcgtgtttct	ggtcgttatc	tggcgtggta	ccagcagaaa	120
ccaggtcaag	caccgcgtct	attaatttat	ggcgcgagca	gccgtgcaac	tggggtcccg	180
gcgcgtttta	gcggctctgg	atccggcacg	gattttaccc	tgaccattag	cagcctggaa	240
cctgaagact	ttgcgactta	ttattgccag	cagctttctt	cttatcctcc	tacctttggc	300
cagggtacga	aagttgaaat	taaacgtacg				330

<210>	353
<211>	110
<212 >	PRT
<213>	sztuczna sekwencja
<220>
< 2 2 3 >	konstrukcja syntetyczna
<400>	353

PL 216 190 B1

219

151/165

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Arg Val Ser Gly Arg 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin. Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Leu Ser Ser Tyr Pro 85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110

<210 >	354
<211?	39
<212 ?	DNA
<213?	sztuczna sekwencja
<220?
<223?	konstrukcja syntetyczna
<400?	354

cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt 39 <210? 355 <211> 13 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220» <223? konstrukcja syntetyczna <400? 355

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 356 <211> 39 <212? DNA <213> sztuczna sekwencja

220

PL 216 190 B1

152/165 <220>

<223» konstrukcja syntetyczna <400» 356 cttactcatt atgctcgfcta ttatcgttat tttgatgtt 39

<210» <211» <212» <213»	357 13 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	357

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val

1	5 10
<210» <211» <212» <213>	358 39 DNA sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna

<400» 358 cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt 39

<210> <211> <212> <213>

359 13 PRT sztuczna sekwencja

<220» <223>	konstrukcja syntetyczna
<400>	359

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val

1	5 10
<210» <211» <212» <213»	360 39 DNA sztuczna sekwencja
<220» <223 »	konstrukcja syntetyczna

<400» 360 cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt 39

PL 216 190 B1

221

153/165

<210» <211» <212» <213»

361 13 PRT sztuczna sekwencja

<220> < Μ ώ p	konstrukcja syntetyczna
<400>	361

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Aap Val

1	5 10
<210» <211> <212» <213»	362 39 DNA sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna

<400» 362 cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt 39

<210» <211> <212» <213»	363 13 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	363

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val

1	5 10
<210» <211» <212» <213>	364 39 DNA sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna

<400» 364 cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat tttgatgtt 39

<210» <211» <212» <213»	365 13 PRT sztuczna sekwencja
<220»

222

PL 216 190 B1

154/165 <223» konstrukcja syntetyczna <400» 365 '

Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe Asp Val 15 10 <210» 366 <211» 39 <21.2» DNA <213» sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400» 366

cttactcatt atgctcgtta ttatcgttat	tttgatgtt	39
<210»	367
<211>	13
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400>	367
Leu Thr His Tyr Ala Arg Tyr Tyr Arg Tyr Phe	Asp	Val
1	5	10
<210>	368
<211»	51
<212>	DNA
<213»	sztuczna sekwencja
<220> <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	368
ggtaagggta atactcataa gccttatggt	tatgttcgtt	attttgatgt t	51
<210»	369
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220> <223»	konstrukcja syntetyczna
<4 00»	369
Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro	Tyr Gly Tyr	Val	Arg Tyr Phe Asp
1	5	10		15

PL 216 190 B1

223

155/165

Val <210» 370 <211» 51 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 370

99^taa999ta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t si <210» 371 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 371

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp ¹ 5 io 15

Val <210» 372 <211» 51 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna <400» 372 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51

<210»	373
<211»	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220»
<223>	konstrukcja syntetyczna
<400»	373

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp ¹ 5 io ₁₅

224

PL 216 190 B1

156/165

Val <210» 374 <211> 51 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna <400» 374 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t 51 <210» 375 <211> 17 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400> 375

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

5 10 15

Val <210» 376 <211> 51 <212> DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna <400» 376 ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t <210» 377 <211» 17 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 377

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

PL 216 190 B1

225

<210>	381
<211>	17
<212»	PRT
<213»	sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	381

226

PL 216 190 B1

153/165

Gly Lys Gly Asn Thr Hia Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 15 10 15

Val
<210» <211» <212» <213»	382 45 DNA sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna

<400» 382 cttctttctc gtggttataa tggttattat cataagtttg atgtt 45

<21G> <211> <212> <213>	383 15 PRT sztuczna sekwencja
<22Q> <223>	konstrukcja syntetyczna
<4G0>	383

Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Gly Tyr Tyr His Lys Phe Asp Val

1	5 10 15
<210» <211» <212» <213»	334 2 4 DNA sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna

<400» 384 cagcagactt atgattatcc tcct 24

<210> <211> <212» <213»	385 8 PRT sztuczna sekwencja
<220» <223»	konstrukcja syntetyczna
<400»	385

Glu Gin Thr Tyr Asp Tyr Pro Pro 1 5

PL 216 190 B1

227

<210» 389 <211» θ <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 389

Gin Gin Thr Tyr Asp Tyr Pro Pro 1 5 <210» 390 <211» 24 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220»

228

PL 216 190 B1

160/165 <223> konstrukcja syntetyczna <400» 390 cagcagactt atgattatcc tcct 24 <210» 391 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <22O>

<223» konstrukcja syntetyczna <400» 391

Gin Gin Thr Tyr Asp Tyr Pro Pro

5 <210» 392 <211» 24 <212> DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 392 cagcagactt atgattatcc tcct 24 <210 > 3 93 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 393

Gin Gin Thr Tyr Asp Tyr Pro Pro 1 5 <210» 394 <211> 24 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 394 cagcagactt atgattatcc tcct 24 <210» 395

PL 216 190 B1

229

230

PL 216 190 B1

162/165 <400» 399

Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro His 1 5 <210> 400 <2ll> 24 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220» <22 3» konstrukcja syntetyczna <400» 400 cttcagcttt ataatattcc taat <210» 401 <211» 8 <212» PET <213» sztuczna sekwencja <220» <223> konstrukcja syntetyczna <400» 401

Leu Gin Leu Tyr Asn Ile Pro Asn 1 5 <210» 402 <211> 24 <212» DNA <213> sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna.

<400» 402 cagcagattt. attcttttcc tcat <210» 403 <211» S <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 403

Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro His 1 5 <210» 404

PL 216 190 B1

231

163/165 <211? 24 <212? DNA <213? sztuczna sekwencja <220?

<223> konstrukcja syntetyczna <400? 404 cttcagcttt ataatattcc taat <210? 405 <211? 8 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna <4 00:

405

Leu Gin Leu Tyr Asn Ile Pro Asn 1 5 <210? 406 <211? 24 <212? DNA <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna <400? 406 cagcagattt attcttttcc tcat <210? 407 <211? 8 <212? PRT <213? sztuczna sekwencja <220?

<223? konstrukcja syntetyczna <400? 407

Gin Gin Ile Tyr Ser Phe Pro His

<210?	408
<211?	24
<212?	DNA
<213 >	sztuczna sekwencja
<220?
<223?	konstrukcja syntetyczna

232

PL 216 190 B1

164/165 <400» 408 cagcagattt attcttttcc tcat 24 <210» 409 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 409

Leu Głn Ile Tyr Asn Met Pro Ile

5 <210» 410 <211» 24 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja.

<220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 410 cttcagcttt ataatattcc taat 24 <210» 411 <211» 8 <212» PRT <213» sztuczna sekwencja <220» <223» konstrukcja syntetyczna <400» 411

Leu Głn Leu Tyr Asn Ile Pro Asn

5 <210» 412 <211» 24 <212» DNA <213» sztuczna sekwencja <220>

<223» konstrukcja syntetyczna <400» 412 cagcagcttt cttcttatcc tcct 24 <210» 413 <211» 8 <212» PRT

PL 216 190 B1

233

165/165 <213? sztuczna sekwencja <220?

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 413

Gin Gin Leu Ser Ser Tyr Pro Pro 1 5 <210> 414 <211> 52 <212> PRT <213? sztuczna sekwencja <220>

<223> konstrukcja syntetyczna <400> 414

Ile

Ser

Glu

Val

Lys

Met

Asp

Ala

Glu

Phe

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Tyr

1

5

10

15

G Iti.

Val

His

His

Gin

Lys

Leu

Val

Phe

Phe

Alćl

Glu

Asp

Val

Gly

Ser

20

2 5

30

Asn

Lys

Gly

Ala

Ile

He

Gly

Leu

Met

Val

Gly

Gly

Val

Val

Ile

Ala

40 45

Thr Val Ile Val

Claims (20)

1. Cząsteczka przeciwciała zdolna do swoistego rozpoznawania dwóch regionów peptydu β-Α4/Αβ4, przy czym pierwszy region zawiera sekwencję aminokwasów AEFRHDSGY, przedstawioną w SEQ ID nr 1, lub jej fragment, a drugi region zawiera sekwencję aminokwasów VHHQKLVFFAEDVG, przedstawioną w SEQ ID nr 2, lub jej fragment przy czym ta cząsteczka przeciwciała zawiera:

(a) region zmienny VL zawierający regiony determinujące komplementarność L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3, przy czym (1) L-CDR1 zawiera SEQ ID nr 143;

2. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że rozpoznaje przynajmniej dwa kolejne aminokwasy w obrębie dwóch regionów β-Α4.

(2) H-CDR2 zawiera SEQ ID nr 192;

(2) L-CDR2 zawiera SEQ ID nr 144; i (3) L-CDR3 zawiera SEQ ID nr 95; i (b) region zmienny VH, zawierający regiony determinujące komplementarność H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3, przy czym (1) H-CDR1 zawiera SEQ ID nr 146;

3. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że rozpoznaje w pierwszym regionie sekwencję aminokwasów zawierającą: AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD lub HDSG, a w drugim regionie sekwencję aminokwasów zawierającą: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED lub VFFA, FFAEDV.

(3) H-CDR3 zawiera SEQ ID nr 93.

234

PL 216 190 B1

4. Cząsteczka przeciwciała według jednego z zastrz. 1-3, znamienna tym, że zawiera region zmienny VH przedstawiony w SEQ ID nr 89 i region zmienny VL przedstawiony w SEQ ID nr 91.

5. Cząsteczka przeciwciała według jednego z zastrz. 1-3, znamienna tym, że zawiera region zmienny VH kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID nr 88, region zmienny VL kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego przedstawioną w SEQ ID nr 90.

6. Cząsteczka przeciwciała według jednego z zastrz. 1-5, znamienna tym, że jest pełnym przeciwciałem (immunoglobuliną), fragmentem F(ab), fragmentem F(ab)2, pojedynczym łańcuchem przeciwciała, przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem z przeszczepianym CDR, konstrukcją przeciwciała biwalentnego, przeciwciałem syntetycznym lub przeciwciałem klonowanym krzyżowo.

7. Cząsteczka przeciwciała według jednego z zastrz. 1-6, znamienna tym, że co najmniej dwa regiony β-Α4 tworzą epitop konformacyjny lub epitop nieliniowy.

8. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca cząsteczkę przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7.

9. Wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 8.

10. Komórka gospodarza zawierająca wektor jak określono w zastrz. 9.

11. Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza jak określono w zastrz. 10 w warunkach, które umożliwiają syntezę tej cząsteczki przeciwciała i odzyskiwanie tej cząsteczki przeciwciała z tej hodowli.

12. Kompozycja zawierająca cząsteczkę przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7.

13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że jest kompozycją farmaceutyczną lub diagnostyczną.

14. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7, cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 8, wektor jak określono w zastrz. 9 lub gospodarz jak określono w zastrz. 10 do stosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby związanej z amyloidogenezą i/lub formowaniem płytek amyloidowych.

15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 14, znamienna tym, że gdzie chorobą jest otępienie, choroba Alzheimera, neuropatia ruchowa, zespół Downa, choroba Creutzfelda-Jacoba, dziedziczne krwotoki śródmózgowe w przebiegu amyloidozy typu holenderskiego, choroba Parkinsona, otępienie związane z HIV, ALS lub zaburzenia neuronalne związane ze starzeniem się.

16. Kompozycja diagnostyczna zawierająca cząsteczkę przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7 do stosowania w wykrywaniu choroby związanej z amyloidogenezą i/lub formowaniem płytek amyloidowych.

17. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że chorobą jest otępienie, choroba Alzheimera, neuropatia ruchowa, zespół Downa, choroba Creutzfelda-Jacoba, dziedziczne krwotoki śródmózgowe w przebiegu amyloidozy typu holenderskiego, choroba Parkinsona, otępienie związane z HIV, ALS lub zaburzenia neuronalne związane ze starzeniem się.

18. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7 do stosowania do dezintegracji płytek amyloidowych.

19. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7 do stosowania do immunizacji biernej przeciwko powstawaniu płytek β-amyloidowych.

20. Zestaw zawierający cząsteczkę przeciwciała jak określono w jednym z zastrz. 1-7, cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 8, wektor jak określono w zastrz. 9 lub komórkę gospodarza jak określono w zastrz. 10, który ponadto zawiera bufor lub roztwór do przechowywania.