ES2590684T3 - Anticuerpos anti-Abeta y su uso - Google Patents

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Abstract

Una molécula de anticuerpo anti-péptido beta-A4 que comprende: (a) una región variable VL que comprende regiones determinantes de complementariedad, L-CDR1, L-CDR2 y LCDR3, en donde: (1) L-CDR1 comprende SEQ ID NO: 143: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala; (2) L-CDR2 comprende SEQ ID NO: 144: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr; y (3) L-CDR3 comprende SEQ ID NO: 95: Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile; y (b) una región VH variable que comprende regiones determinantes de complementariedad, H-CDR1, H-CDR2 y CDR3, en donde: (1) H-CDR1 comprende SEQ ID NO: 146: Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser; (2) H-CDR2 comprende SEQ ID NO: 192: Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly; y (3) H-CDR3 comprende SEQ ID NO: 93: Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Val.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-Abeta y su uso
5 La presente descripción se refiere a una molécula de anticuerpo capaz de reconocer específicamente dos regiones del péptido β-A4, en donde la primera región comprende la secuencia de aminoácidos AEFRHDSGY como se muestra en SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma y en donde la segunda región comprende la secuencia de aminoácidos VHHQKLVFFAEDVG como se muestra en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. Además, se desvelan moléculas de ácidos nucleicos que codifican la molécula de anticuerpo y vectores y hospedantes que
10 comprenden dicha molécula de ácidos nucleicos. Además, la presente descripción proporciona composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas o de diagnóstico, que comprenden los compuestos de la descripción, así como usos específicos de las moléculas de anticuerpo, moléculas de ácidos nucleicos, vectores u hospedantes de la descripción.
15 Diversos documentos se citan a través del texto de esta memoria. Cada uno de los documentos citados en el presente documento (incluyendo algunas especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.) están incorporados por el presente documento como referencia.
Aproximadamente el 70% de todos los casos de demencia son debidos a la enfermedad de Alzheimer que está
20 asociada al daño selectivo de regiones del cerebro y circuitos neuronales críticos para la cognición. La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por laberintos neurofibrilares en particular en neuronas piramidales del hipocampo y numerosas placas de amiloide que contienen mayormente un centro denso de depósitos de amiloide y halos difusos.
Las placas neuríticas contienen grandes cantidades de un péptido predominantemente fibrilar denominado “amiloide
25 β”, “A-beta”, “Aβ4”, “β-A4” o “Aβ”, véase Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell. Biol. 10, 373-403, Koo (1999), PNAS Vol. 96, pp. 9.989-9.990, documento US 4.666.829 o Glenner (1984). BBRC 12, 1.131. Este amiloide β está derivado de la “proteína precursora de Alzheimer/proteína precursora de β-amiloide” (APP). Las APPs son glicoproteínas integrales de membrana (véase Sisodia (1992), PNAS Vol. 89, pp. 6.075) y se escinden endoproteolíticamente dentro de la secuencia de Aβ por una proteasa de membrana de plasma, α-secretasa (véase Sisodia (1992), loc. cit). Además, la
30 actividad secretasa adicional, en particular actividad β-secretasa y γ-secretasa conduce a la liberación extracelular de amiloide-β (Aβ) que comprende o bien 39 aminoácidos (Aβ39), 40 aminoácidos (Aβ40), 42 aminoácidos (Aβ42) o 43 aminoácidos (Aβ43); véase Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053; Price (1998), Science 282, 1.078 a 1.083; documento WO 00/72880 o Hardy (1997), TINS 20, 154.
35 Cabe señalar que Aβ tiene diversas formas que se dan de manera natural, por lo que las formas humanas se refieren como las anteriormente mencionadas Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 y Aβ43. La forma más prominente, Aβ42, tiene la secuencia de aminoácidos (comenzando a partir del N-terminal): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 27). En Aβ41, Aβ40, Aβ39, los aminoácidos C-terminales A, IA y VIA están perdidos, respectivamente. En la forma Aβ43 un residuo adicional de
40 treonina está comprendido en el terminal C de la secuencia anteriormente descrita (SEQ ID NO: 27).
Se mostró que el tiempo requerido para nuclear las fibrillas de Aβ40 es significativamente mayor que el de para nuclear fibrillas Aβ42: véase Koo, loc. cit. y Harper (1997), Ann. Rev. Biochem. 66, 385-407. Como se revisó en Wagner (1999), J. Clin. Invest. 104, 1.239-1.332, la Aβ42 se encuentra con mayor frecuencia asociada a placas 45 neuríticas y se considera que es más fibrilogénica in vitro. También se sugirió que Aβ42 sirve como una “semilla” en la polimerización dependiente de nucleación de péptidos Aβ no cristalinos ordenados; Jarrett (1993), Cell 93, 1.055
1.058.
Se tiene que insistir en que ese procesamiento de APP y/o la generación de placas extracelulares que contienen
50 depósitos proteicos no son solamente conocidos en la patología del Aizheimer sino también en sujetos que padecen de otros trastornos neurológicos y/o neurodegenerativos. Estos trastornos comprenden, entre otros, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis tipo holandés, enfermedad de Parkinson, ELA (esclerosis lateral amiotrófica), enfermedad de Creutzfeld Jacob, demencia relacionada con VIH y neuropatía motora.
55 Para prevenir, tratar y/o mejorar los trastornos y/o enfermedades relacionadas con la deposición patológica de las placas de amiloide, se tienen que desarrollar medios y métodos que interfieran ambos con la formación de placa de β-amiloide, que sean capaces de prevenir la agregación de Aβ y/o sean útiles en la despolimerización de depósitos de amiloide ya formados o agregados de amiloide-β.
60 Por consiguiente, y teniendo en cuenta los defectos graves de la biología de amiloide modificada y/o patológica, son altamente deseables medios y métodos para tratar los trastornos relacionados con amiloide. En particular, se desean fármacos efectivos que o bien interfieran con la agregación patológica de amiloide o que sean capaces de despolimerización de Aβ agregado. Además, son deseables medios de diagnóstico para detectar, entre otros, placas de amiloide.
65 Por tanto, el problema técnico de la presente invención es cumplir con las necesidades anteriormente descritas en el presente documento.
imagen2
Por consiguiente, la presente descripción se refiere a una molécula de anticuerpo capaz de reconocer
5 específicamente dos regiones del péptido β-A4/Aβ4, en donde la primera región comprende la secuencia de aminoácidos AEFRHDSGY (SEQ ID NO: 1) o un fragmento de la misma y en el que la segunda región comprende la secuencia de aminoácidos VHHQKLVFFAEDVG (SEQ ID NO: 2) o un fragmento de la misma. En particular, la presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo que comprende:
(a) una región VL variable que comprende las regiones determinantes de complementariedad, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3, en donde:
L-CDR1 comprende SEQ ID NO: 143: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala; L-CDR2 comprende SEQ ID NO: 144: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr; y
15 L-CDR3 comprende SEQ ID NO: 95: Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile; y
(b) una región VH variable que comprende las regiones determinantes de complementariedad, H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3, en donde:
L-CDR1 comprende SEQ ID NO: 146: Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser; L-CDR2 comprende SEQ ID NO: 192: Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly; y L-CDR3 comprende SEQ ID NO: 93: Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Val.
En el contexto de la presente invención, el término “molécula de anticuerpo” se refiere a moléculas de
25 inmunoglobulina completas, preferentemente IgMs, IgDs, IgEs, IgAs o IgGs, más preferentemente a IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4, así como a partes de tales moléculas de inmunoglobulina, como fragmentos Fab o regiones VL, VH o CDR. Además, el término se refiere a moléculas de anticuerpo modificadas y/o alteradas, como anticuerpos quiméricos y humanizados. El término también se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales modificados o alterados, así como a anticuerpos recombinantemente o sintéticamente generados/sintetizados. El término también se refiere a anticuerpos intactos, así como a fragmentos del anticuerpo/partes del mismo, como, cadenas ligeras y pesadas separadas, Fab, Fab/c, Fv, Fab’, F(ab’)2. El término “molécula de anticuerpo” también comprende derivados de anticuerpo, los anticuerpos bifuncionales y construcciones de anticuerpo, como Fvs de cadena simple (scFv), scFv biespecíficos o proteínas de fusión a anticuerpo. Más detalles sobre el término “molécula de anticuerpo” de la invención se proporciona más adelante en el presente documento.
35 El término “reconocer específicamente” significa según esta invención que la molécula de anticuerpo es capaz de interactuar específicamente con y/o unirse a al menos dos aminoácidos de cada una de las dos regiones de β-A4 como se definen en el presente documento. Dicho término se refiere a la especificidad de la molécula de anticuerpo, es decir, a su capacidad de discriminar entre las regiones específicas del péptido β-A4 como se definen en el presente documento y otras, región no relacionada del péptido β-A4 u otra, proteína no relacionada con APP/péptido/péptido de ensayos (no relacionados). Por consiguiente, la especificidad se puede determinar experimentalmente por métodos conocidos en la técnica y métodos como se desvelan y se describen en el presente documento. Tales métodos comprenden, pero no se limitan a, transferencias tipo Western, ensayos ELISA, RIA, ECL, IRMA y barridos de péptido. Tales métodos también comprenden la determinación de los valores KD, entre
45 otros, como se ilustra en los ejemplos adjuntos. El barrido de péptido (ensayo pepspot) se emplea rutinariamente para mapear epítopos lineales en un antígeno polipéptido. La secuencia primaria del polipéptido se sintetiza a su vez sobre celulosa activada con péptidos que se superponen uno a otros. El reconocimiento de ciertos péptidos por el anticuerpo a ensayar su capacidad de detectar o reconocer un antígeno/epítopo específico se valora por un desarrollo de color rutinario (anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano y 4-cloronaftol e peróxido de hidrógeno), mediante una reacción de quimioluminiscencia o medios similares conocidos en la técnica. En el caso de, entre otros, reacciones de quimioluminiscencia, la reacción se puede cuantificar. Si el anticuerpo reacciona con un cierto conjunto de péptidos superpuestos se puede deducir la mínima secuencia de aminoácidos que es necesaria para la reacción; véase el Ejemplo ilustrativo 6 y la Tabla adjunta 2. El mismo ensayo puede revelar dos grupos distintos de péptidos reactivos, que indica el reconocimiento de un
55 epítopo discontinuo, es decir, conformacional en el polipéptido antigénico (Geysen (1986), Mol. Immunol. 23, 709715).
Además del ensayo pepspot, se puede llevar a cabo el ensayo ELISA estándar. Tal como se demuestra en los ejemplos adjuntos, pequeños hexapéptidos se pueden acoplara a una proteína y recubrir una inmunoplaca y reaccionar con anticuerpos a ensayar. La valoración se puede llevar a cabo por desarrollo de color estándar (por ejemplo, anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano y tetrametil bencidina con peróxido de hidrogeno). La reacción en ciertos pocillos se valoró por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El ruido de fondo normal (=reacción negativa) puede ser de 0,1 DO, la reacción positiva normal puede ser de 1 DO. Esto significa que la diferencia (relación) positiva/negativa puede ser de más de 10 veces. Se dan más detalles en los ejemplos adjuntos.
65 Además, los métodos cuantitativos para determinar la especificidad y la capacidad de “reconocer específicamente” las dos regiones definidas en el presente documento del péptido β-A4 son dadas más adelante en el presente
imagen3
documento.
El término “dos regiones del péptido β-A4” se refiere a dos regiones como se definen por sus secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs: 1 y 2, refiriéndose a los aminoácidos N-terminales 2 a 10 y a los 5 aminoácidos centrales 12 a 25 del péptido β-A4. El término “péptido β-A4” en el contexto de esta invención se refiere a los anteriormente descritos en el presente documento Aβ39, Aβ41, Aβ43, preferentemente a Aβ40 y Aβ42. Aβ42 también se representa en la SEQ ID NO: 27 adjunta. Cabe señalar que el término “dos regiones del péptido β-A4” también se refiere a un “epítopo” y/o un “determinante antigénico” que comprende las dos regiones del péptido β-A4 definidas en el presente documento o partes de las mismas. Según esta descripción, dichas dos regiones del péptido β-A4 están separadas (al nivel de la secuencia de aminoácidos) en la estructura primaria del péptido β-A4 por al menos un aminoácido, preferentemente por al menos dos aminoácidos, más preferentemente por al menos tres aminoácidos, más preferentemente por al menos cuatro aminoácidos, más preferentemente por al menos cinco aminoácidos, más preferentemente al menos seis aminoácidos, más preferentemente al menos nueve aminoácidos y lo más preferentemente al menos doce aminoácidos. Tal como se muestra en el presente documento y como se 15 documenta en los ejemplos adjuntos, los anticuerpos/moléculas de anticuerpo como se describen en el presente documento detectan/interactúan con y/o se unen a dos regiones del péptido β-A4 como se define en el presente documento, por lo cual dichas dos regiones están separadas (a nivel de la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos) por al menos un aminoácido y por lo cual la secuencia que separa dichas dos regiones/”epítopo” pueden comprender más de diez aminoácidos, preferentemente 14 aminoácidos, más preferentemente 15 aminoácidos o 16 aminoácidos. Por ejemplo, MSR-3 Fab (como molécula de anticuerpo descrita en el presente documento) reconoce, detecta/interactúa con dos regiones en el péptido β-A4, en donde dicha primera región comprende aminoácidos 3 y 4 (EF) y dicha segunda región comprende aminoácidos 18 a 23 (VFFAED). Por consiguiente, la secuencia de separación entre la región/epítopos a detectar/reconocer tiene una longitud de 13 aminoácidos en la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos. Igualmente, MSR Nº3.4H7 IgG1, unas 25 moléculas de anticuerpo optimizadas y maduras derivadas de MSR-3 y comprendidas en una región estructural (framework) de IgG1, detecta/interactúa con/se une a dos epítopos/regiones de β-A4 que comprenden en las posiciones 1 a 4 de la primera región (DAEF) y en las posiciones 19 a 24 de la segunda región (FFAEDV) de β-A4 como se define en el presente documento. Por consiguiente, MSR Nº 3.4H7 IgG1 reconoce/detecta/interactúa con/se une a dos epítopos/regiones que están, a nivel de la secuencia de aminoácidos primaria, separados por 14 aminoácidos. Tal como se detalla en los ejemplos adjuntos, maduración por afinidad y conversión de fragmentos Fab monovalentes a anticuerpos IgG1 de longitud completa pueden dar como resultado una cierta ampliación de los epítopos/regiones detectados en ensayos pepspot, ELISA y similares. Por lo tanto, las moléculas de anticuerpo de la descripción son capaces de reconocer simultáneamente e independientemente dos regiones del péptido β-A4/Aβ4 en donde dichas regiones comprenden la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 (o partes de
35 la misma) y la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 (o una parte(s) de la misma). Debido a la ampliación potencial de epítopos como se detalla en el presente documento, sin embargo, también se prevé que los aminoácidos en proximidad cercana a las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 se detectan/reconocen, es decir, que los aminoácidos adicionales son parte de las dos regiones a detectar/reconocer. Por consiguiente, también se prevé que, por ejemplo, el primer aminoácido de Aβ (1-42) como se define en el presente documento, denominado D (ácido aspártico) es parte de un epítopo a detectar/reconocer o que los aminoácidos localizados después de la región Aβ (1-42) como se define en SEQ ID NO: 2 se detectan/reconocen. Dicho aminoácido adicional puede, por ejemplo, ser el aminoácido en la posición 26 de SEQ ID NO: 27 (βA4/Aβ (1-42)), denominado S (Serina).
El término también puede referirse a un epítopo conformacional, un epítopo estructural o un epítopo discontinuo que
45 consiste en dichas dos regiones o partes de las mismas; véase también Geysen (1986), loc. cit. En el contexto de esta invención, un epítopo conformacional está definido por dos secuencias de aminoácidos distintas separadas en la secuencia primaria que se juntan sobre la superficie cuando el polipéptido se pliega a la proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1.365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Las moléculas de anticuerpo de la presente invención se prevén que específicamente se unen a/interactúan con epítopo(s) conformacional(es)/estructural(es) compuestos de y/o comprendiendo las dos regiones de β-A4 descritas en el presente documento o partes de las mismas como se describe más adelante en el presente documento. Las “moléculas de anticuerpo” de la presente invención se cree que comprenden una especificidad doble simultánea e independiente a (a) un tramo de aminoácidos que comprende los aminoácidos 2 a 10 (o una parte(s) del mismo) de β-A4 y un tramo de aminoácidos que comprende los aminoácidos 12 a 25 (o una parte(s) del mismo) de β-A4 (SEQ ID NO: 27). Fragmentos o partes de estos tramos
55 comprenden al menos dos, más preferentemente al menos tres aminoácidos. Fragmentos o partes preferidas son en la primera región/tramo de SEQ ID NO: 27 las secuencias de aminoácidos AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD o HDSG y en la segunda región/tramo de SEQ ID NO: 27 las secuencias de aminoácidos HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED, VFFA o FFAEDV. Tal como se mencionó anteriormente, dichos fragmentos también pueden comprender aminoácidos adicionales o pueden ser partes de los fragmentos definidos en el presente documento. Ejemplos específicos son DAE, DAEF, FRH o RHDSG.
En la técnica se han descrito un número de anticuerpos que reconocen específicamente péptidos Aβ. Estos anticuerpos principalmente se han obtenido inmunizando animales con Aβ1-40 o Aβ1-42 o fragmentos de los mismos usando tecnologías estándar. De acuerdo con los datos publicados, los anticuerpos monoclonales que se 65 generaron por inmunización con el péptido As completo (1-40 o 1-42) reconocen exclusivamente un epítopo cerca del N-terminal de Aβ. Además, los ejemplos son los anticuerpos BAP-1 y BAP-2 (Brockhaus, no publicados) que se
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generaron por inmunización de ratones con Aβ1-40 y que reconocen los aminoácidos 4-6 en el contexto de péptidos Aβ mayores, véase el Ejemplo adjunto 7, Tabla 2 y el Ejemplo 12, Tabla 7. Los anticuerpos que reconocen la parte media de Aβ derivan de inmunizaciones con péptidos más pequeños. Por ejemplo, el anticuerpo 4G8 se generó por inmunización con el péptido Aβ 1-24 y reconoce exclusivamente la secuencia 17-24 (Kim, (1988) Neuroscience
5 Research Communications 2, 121-130). Muchos otros anticuerpos monoclonales se han generado inmunizando ratones con fragmentos derivados de Aβ, y anticuerpos que reconocen el extremo C-terminal de Aβ1-40 y Aβ1-42 se usan ampliamente para distinguir y cuantificar los correspondientes péptidos Aβ en fluidos y tejidos biológicos por ELISA, transferencia tipo Western y análisis inmunohistoquímico (Ida y col., (1996) J. Biol. Chem. 271, 22.90822.914; Johnson-Wood y col., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 1.550-1.555; Suzuki y col., (1994), Science 264, 1.336-1.340; Brockhaus (1998), Neuro Rep. 9, 1.481-1.486). BAP-17 es un anticuerpo monoclonal de ratón que se ha generado inmunizando ratones con el fragmento 35-40 de Aβ. Específicamente reconoce el extremo Cterminal de Aβ1-40 (Brockhaus (1998) Neuroreport 9, 1.481-1.486). Se cree que la inmunización con antígenos dependientes de linfocito T (con frecuencia inmunógenos pobres) requiere de una escisión proteolítica del antígeno en los endosomas de células que presentan el antígeno. La
15 selección in vivo de anticuerpos de alta afinidad después de la inmunización se conduce por el contacto de linfocitos T ayudantes con células que presentan el antígeno. Las células que presentan el antígeno solamente presentan péptidos cortos y no polipéptidos de gran tamaño. Por consiguiente, estas células tienen una complicada maquinaria (pero bien conocida) para introducir por endocitosis antígeno(s), degradar el(los) antígeno(s) en endosomas, combinar péptidos seleccionados con moléculas CMH de clase II adecuadas, y para exportar el complejo péptido-CMH a la superficie celular. Esto es donde se da el reconocimiento específico a antígeno por linfocitos T, con el objetivo de proporcionar ayuda a la maduración de linfocitos B. Los linfocitos B que reciben la mayoría de la ayuda de los linfocitos T tienen la mejor oportunidad de desarrollarse dentro de las células secretoras de anticuerpo y de proliferar. Esto muestra que el procesamiento de antígeno por proteólisis es una etapa importante para la generación de una respuesta de anticuerpo de alta afinidad in vivo y puede explicar el dominio del epítopo Aβ N-terminal en los
25 anticuerpos monoclonales y policlonales de la técnica anterior derivados por inmunización. Por el contrario, la selección de anticuerpos/moléculas de anticuerpo de la presente invención se conduce por la adherencia física de fagos que expresan Fab al antígeno. No hay degradación del antígeno implicado en este proceso de selección in vitro. Los fagos que expresan el Fab con la más alta afinidad hacia el antígeno se seleccionan y propagan. Una genoteca sintética como se emplea en los ejemplos adjuntos para seleccionar moléculas de anticuerpo específicas según esta invención es particularmente apropiada para evitar cualquier sesgo para epítopos continuos sencillos que con frecuencia se encuentra en genotecas derivadas de linfocitos B inmunizados.
Cabe señalar que la técnica anterior no ha descrito moléculas de anticuerpo que reconocen dos regiones
35 independientes de Aβ4 que reconocen específicamente un epítopo(s) discontinuo(s)/estructural(es)/conformacional(es) y/o que son capaces de reconocer simultáneamente e independientemente dos regiones/epítopos de Aβ4. La vacunación de ratones transgénicos que sobreexpresan APP V717F humana mutante (ratones PDAPP) con Aβ142 dio como resultado una prevención casi completa de la deposición de amiloide en el cerebro cuando el tratamiento se inició en animales jóvenes, es decir, antes del inicio de neuropatologías, mientras que en animales más viejos se observó una reducción de placas ya formadas sugiriendo el aclaramiento de placas mediado por anticuerpo (Schenk y col., (1999), Nature 400, 173-177). Los anticuerpos generados por este procedimiento de inmunización se reactivaron frente al terminal N de Aβ4 que incluye un epítopo alrededor de los aminoácidos 3-7 (Schenk y col., (1999), loc. cit.; documento WO 00/72880). La inmunización activa con Aβ1-42 también redujo el
45 deterioro conductual y la pérdida de memoria en diferentes modelos transgénicos para la enfermedad de Alzheimer (Janus y col., (2000) Nature 408, 979-982; Morgan y col., (2000) Nature 408, 982-985). Estudios posteriores con anticuerpos periféricamente administrados, es decir, inmunización pasiva, han confirmado que los anticuerpos pueden entrar en el sistema nervioso central, decorar placas e inducir el aclaramiento de placas de amiloide preexistentes en ratones transgénicos APP (ratones PDAPP) (Bard y col., (2000) Nat. Med. 6, 916-919; documento WO 00/72880). En estos estudios, los anticuerpos monoclonales con la eficacia más potente in vivo y ex vivo (desencadenando fagocitosis en células microgliales exógenas) son aquellos que reconocen epítopos 1-5 Nterminales de Aβ4 (mab 3D6, IgG2b) o 3-6 (mab 10D5, IgG1). Así mismo, los anticuerpos policlonales aislados de ratones, conejos o monos después de la inmunización con Aβ1-42 presentaron una especificidad de epítopo Nterminal similar y eran también efectivos en desencadenar fagocitosis y aclaramiento de placa in vivo. Por el
55 contrario, los anticuerpos específicos C-terminales que se unen a Aβ1-40 o Aβ1-42 con alta afinidad no indujeron fagocitosis en el ensayo ex vivo y no eran efectivos in vivo (documento WO 00/72880). El anticuerpo monoclonal m266 (documento WO 00/72880) se enfrentó a Aβ13-28 (dominio central de Aβ) y el mapeado del epítopo confirmó la especificidad del anticuerpo para cubrir los aminoácidos 16-24 en la secuencia de Aβ. Este anticuerpo no se une bien a Aβ agregado y depósitos de amiloide y simplemente reacciona con Aβ soluble (monomérico), es decir, propiedades que sean similares a otro anticuerpo monoclonal bien conocido y comercialmente disponible (4G8; Kim, (1988) Neuroscience Research Communications 2, 121-130; comercialmente disponible en Signet Laboratories Inc. Dedham, MA EEUU) que reconoce el mismo epítopo.
In vivo, recientemente se encontró que el anticuerpo m266 reduce marcadamente la deposición de Aβ en ratones
65 PDAPP después de la administración periférica (DeMattos, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8.850-8.855). Sin embargo, y a diferencia de los anticuerpos específicos N-terminales, m266 no decoró las placas de amiloide in vivo, y por lo tanto se tuvo la hipótesis de que el peso del cerebro As se reducía por un desplazamiento inducido por anticuerpo en el equilibrio entre Aβ de plasma y del SNC dando como resultado la acumulación de Aβ derivado del cerebro en la periferia, firmemente formando complejo con m266 (DeMattos, (2001) loc. cit.).
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5 El anticuerpo/molécula de anticuerpo de la presente descripción, uniéndose simultáneamente (por ejemplo en un epítopo estructural/conformacional formado por la región N-terminal y central de Aβ4 como se describe en el presente documento) e independientemente (por ejemplo en los ensayos pepspot como se documentan en la parte experimental adjunta) a los epítopos N-terminales y centrales, combina las propiedades de un anticuerpo específico N-terminal y un anticuerpo específico a epítopo central en una molécula sencilla. Los anticuerpos con la especificidad doble a epítopo, como se describen en la presente invención, se consideran que son más efectivos in vivo, en particular en marcos médicos y diagnósticos para, por ejemplo, reducir el peso de la placa de amiloide o la amiloidogénesis o para la detección de depósitos y placas de amiloide. Es bien conocido que en el proceso de agregación de Aβ4 y deposición de amiloide se dan cambios conformacionales, y aunque el epítopo central es fácilmente accesible en Aβ4 soluble parecen estar escondidos y ser menos reactivos en Aβ4 agregado o fibrilar. El
15 hecho de que el anticuerpo m266 específico a epítopo central/medio es efectivo in vivo indica que la neutralización de Aβ4 soluble también puede ser un parámetro crítico. Los anticuerpos/moléculas de anticuerpo de la presente descripción, debido a la especificidad doble de epítopo, se pueden unir tanto a Aβ4 fibrilar como soluble con eficacia similar, permitiendo así la interacción con placas de amiloide, así como neutralización de Asp4 soluble. El término “unirse simultáneamente e independientemente a los epítopos N-terminales y centrales/medios de Aβ4” que se emplea en el presente documento en el contexto de las moléculas de anticuerpo como se describen en el presente documento se refiere al hecho de que los anticuerpos/moléculas de anticuerpo descritos en el presente documento pueden detectar y/o unirse a ambos epítopos simultáneamente, es decir a la vez (por ejemplo, en epítopos conformacionales/estructurales formados por el epítopo N-terminal (o una parte(s) de los mismos) y epítopos centrales (o una parte(s) de los mismos) de Aβ4 como se definen en el presente documento) y que las mismas
25 moléculas de anticuerpo, sin embargo, también son capaces de detectar/unirse a cada uno de los epítopos definidos de una forma independiente, entre otras, demostrada en el análisis pepspot mostrado en los ejemplos.
El aclaramiento de las placas de amiloide in vivo en ratones PDAPP después de aplicación directa de los anticuerpos al cerebro no es dependiente del subtipo de IgG y también puede implicar un mecanismo que no está mediado por Fc, es decir, no implicación de microglia activada en el aclaramiento de placa (Bacskai, (2001), Resumen del 31º Encuentro Anual de la “Society for Neuroscience”, 10-15 de noviembre de 2001, San Diego). Esta observación es contraria a lo que se ha postulado en un estudio anterior por Bard (2000), loc. cit.
En otro estudio, se encontró que los anticuerpos enfrentados a péptidos Aβ1-28 y Aβ1-16 son eficaces en
35 desagregar fibrillas de Aβ in vivo, mientras que un anticuerpo específico para Aβ13-28 era mucho menos activo en este ensayo (Solomon, (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4.109-4.112). Se ha informado de la prevención de la agregación de Aβ por un anticuerpo anti-Aβ1-28 (AMY-33) (Solomon, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 452455). En el mismo estudio, el anticuerpo 6F/3D que se ha enfrentado al fragmento 8-17 de Aβ ligeramente interfirió con la agregación de Aβ inducida por Zn2+ pero no tuvo efecto sobre la autoagregación inducida por otros agentes inductores de agregación. La eficacia de los diversos anticuerpos en estos ensayos in vitro se correlaciona con la accesibilidad de sus epítopos en agregados de Aβ4. El terminal N está expuesto y los anticuerpos específicos N-terminales claramente inducen la despolimerización, mientras que la región central y el terminal C están escondidos y no son accesibles fácilmente y, por tanto, los anticuerpos frente a estos epítopos son mucho menos eficaces.
45 Investigaciones con respecto a la accesibilidad a epítopo para anticuerpos han demostrado que en Aβ agregado el epítopo N-terminal está expuesto y reacciona con el anticuerpo BAP-1, mientras que el epítopo medio o central, en realidad, permanece críptico, es decir, no se observó unión del anticuerpo 4G8. Sin embargo, en Aβ monomérico ambos epítopos son patentes y son igualmente reconocidos por ambos anticuerpos de la técnica anterior.
Por el contrario, en la presente invención, sorprendentemente se encontró que las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento reconocen dos secuencias de aminoácidos discontinuas, por ejemplo, un epítopo conformacional/estructural en el péptido Aβ. Dos “secuencias de aminoácidos discontinuas” según esta invención significa que dichas dos secuencias de aminoácidos que forman los epítopos N-terminales y centrales/medios, respectivamente, están separadas en β-A4 en su estructura primaria por al menos dos aminoácidos que no son
55 parte de ningún epítopo.
El área de unión de un anticuerpo Fab (=paratopo) ocupa una superficie molecular de aproximadamente 30 x 30 A en tamaño (Laver, Cell 61 (1990), 553-556). Esto es suficiente para contactar con residuos de 15 a 22 aminoácidos que pueden estar presentes sobre diversas horquillas superficiales. El epítopo discontinuo reconocido por las moléculas de anticuerpo como se describen en el presente documento se parece a una conformación en la cual las secuencias del péptido Aβ N-terminales (residuos 2 a 10 o partes de los mismos) y medias (residuos 12 a 25 o partes de los mismos) están en proximidad cercana. Solamente dentro de esta conformación, se obtienen el número máximo de contactos antígeno-anticuerpo y el estado de energía libre más bajo.
65 Basándose en cálculos energéticos se ha sugerido que un subconjunto menor de 5-6 residuos, que no se disponen en una secuencia lineal pero que están dispersos por la superficie del epítopo, contribuye la mayoría de la energía de unión mientras que los residuos circundantes pueden simplemente constituir una formación complementaria (Laver (1990) loc. cit.).
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Los anticuerpos/moléculas de anticuerpo como se describen en el presente documento son capaces de unirse a Aβ 5 agregado y reaccionar fuertemente con placas de amiloide en el cerebro de pacientes AD (como se documenta en los ejemplos adjuntos). Además, son capaces de despolimerizar/desintegrar agregados de amiloide.
Sin estar ligado a teoría alguna, se cree que el epítopo conformacional/estructural (compuesto por las dos regiones de Aβ4 o una parte(s) de dichas regiones como se describen en el presente documento) está parcialmente expuesto en Aβ agregado. Sin embargo, se sabe que la mayor parte del epítopo/región medio/segundo solo no está libremente accesible en estos agregados de Aβ (basado en las escasas reactividades de los anticuerpos específicos a epítopo medios 4G8 y m266). Por otro lado, y en vista de las consideraciones anteriormente mencionadas, es probable que uno o diversos residuos de la región media sean componentes del epítopo conformacional, y junto con los residuos de la región N-terminal, sean accesibles a los anticuerpos de la presente descripción, de ese modo
15 contribuyendo significativamente a la energía de unión de la interacción anticuerpo-Aβ4. La reactividad de la molécula de anticuerpo como se describe en el presente documento con el epítopo conformacional en AD agregado es por lo tanto única y claramente distinta de los anticuerpos αAβ4 descritos en la técnica anterior. Aún, tal como se ha señalado anteriormente en el presente documento, una característica adicional única de los anticuerpos/moléculas de anticuerpo como se describen en el presente documento es su capacidad de simultáneamente e independientemente unirse a/reconocer dos epítopos separados en β-A4, como se define en el presente documento y en los ejemplos adjuntos.
En un aspecto preferido de la descripción, la molécula de anticuerpo como se describe en el presente documento es una molécula de anticuerpo en la que las al menos dos regiones del β-A4 a reconocer específicamente por dicho 25 anticuerpo forman un epítopo conformacional/estructural o un epítopo discontinuo; véase Geysen (1986), loc. cit.; Ghoshal (2001), J. Neurochem. 77, 1.372-1.385; Hochleitner (2000), J. Imm. 164, 4.156-4.161; Laver (1990), loc. cit. El término “epítopo discontinuo” significa en el contexto de la invención epítopos no lineales que se ensamblan a partir de residuos de porciones distantes de la cadena de polipéptido. Estos residuos se juntan sobre la superficie cuando la cadena de polipéptido se pliega dentro de una estructura tridimensional para constituir un epítopo conformacional/estructural. La presente descripción proporciona epítopos inesperados preferidos dentro de β-A4, que dan como resultado la generación de moléculas de anticuerpo específicas descritas en el presente documento, capaces de interactuar específicamente con estos epítopos. Estos anticuerpos/moléculas de anticuerpo descritos en el presente documento proporcionan la base para eficacia incrementada, y un potencial reducido para efectos secundarios. Tal como se señaló anteriormente, los anticuerpos descritos en el presente documento, sin embargo,
35 también eran capaces de interactuar independientemente con cada una de las dos regiones/epítopos definidas de β-A4, por ejemplo, en ensayos de Pepspot como se documenta en los ejemplos adjuntos.
Por consiguiente, la presente invención, proporciona herramientas únicas que se pueden emplear para despolimerizar fibrillas de Aβ agregadas in vivo e in vitro y/o que son capaces de estabilizar y/o neutralizar un epítopo conformacional de Aβ monomérico y de ese modo capaces de prevenir la agregación patológica de Aβ. Además, se prevé que los anticuerpos de la invención se unen a depósitos de Aβ en el borde de las placas de amiloide en, entre otros, cerebro de Alzheimer y disuelven eficazmente las protofibrillas y fibrillas patológicas.
La molécula de anticuerpo de la descripción reconoce al menos dos aminoácidos consecutivos dentro de las dos
45 regiones de Aβ4 definidas en el presente documento, más preferentemente dicha molécula de anticuerpo reconoce en la primera región una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos: AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD o HDSG y en la segunda región una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED, VFFA o FFAEDV. Fragmentos adicionales o partes ampliadas comprenden: DAE, DAEF, FRH o RHDSG.
Particularmente se prefiere que la molécula de anticuerpo de la descripción comprenda una región VH variable codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NO: 3, 5 o 7 o una región VH variable como se muestra en las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 4, 6 o 8. Las secuencias como se muestran en SEQ ID NOs: 3 y 4 representan la región codificadora y la secuencia de aminoácidos, 55 respectivamente, de la región VH del anticuerpo parental MSR-3 (MS-Roche 3), las secuencias en SEQ ID NOs: 5 y 6 representan la región codificadora y la secuencia de aminoácidos, respectivamente, de la región VH del anticuerpo parental MSR-7 (MS-Roche 7) y SEQ ID NOs: 7 y 8 representan la región codificadora y la secuencia de aminoácidos, respectivamente, de la región VH del anticuerpo parental MSR-8 (MS-Roche 8). Por consiguiente, la descripción también proporciona moléculas de anticuerpo que comprenden una región VL variable codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en una SEQ ID NO seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 11 o 13 o una región VL variable como la mostrada en las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NOs: 10, 12 o 14. SEQ ID NOs: 9 y 10 corresponden a la región VL de MSR-3, SEQ ID NOs: 11 y 12 corresponden a la región VL de MSR-7 y SEQ ID NOs: 13 y 14 corresponden a la región VL de MSR-8. Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, los anticuerpos parentales MSR-3, -7, y -8, se emplean para generar además
65 moléculas de anticuerpo optimizadas con propiedades y/o afinidades de unión incluso mejores. Algunas de las correspondientes y posibles estrategias se ilustran y se muestran en los ejemplos adjuntos.
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La estrategia optimizada tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos conduce a una pluralidad de anticuerpos optimizados. Estos anticuerpos optimizados comparten con los anticuerpos parentales el dominio CDR-3 de la región VH. Mientras que la región estructural original (como se muestra en la Figura adjunta 1) permanece igual, en las moléculas de anticuerpo maduradas/optimizadas, se cambian regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VL. En la 5 tabla adjunta 1 se muestran motivos de secuencia modificada ilustrativos para moléculas de anticuerpos optimizadas. Por consiguiente, dentro del alcance de la presente descripción también son moléculas de anticuerpo optimizadas que son derivadas de los MSR-3, -7 y -8 descritos en el presente documento y que son capaces de reaccionar específicamente con/reconocer específicamente las dos regiones del péptido β-A4 como se define en el presente documento. En particular, las regiones CDR, preferentemente CDR1s, más preferentemente CDR1s y CDR2s, lo más preferentemente CDR1s, CDR2s y CDR3s como se definen en el presente documento se pueden emplear para generar anticuerpos/moléculas de anticuerpo adicionales, entre otros, por métodos de injerto de CDR conocidos en la técnica; véase Jones (1986), Nature 321, 522-515 o Riechmann (1988), Nature 332, 323-327. Los anticuerpos/moléculas de anticuerpo como se describen en el presente documento, así como fragmentos o derivados de anticuerpo están derivados de los anticuerpos parentales como se describen en el presente documento 15 y comparten, como anteriormente se describió, el dominio CDR-3 de la región VH con al menos uno de dichos anticuerpos parentales. Tal como se ilustra más adelante, también se prevé que se generan anticuerpos de clonación cruzada que son a considerar como anticuerpos/moléculas de anticuerpo optimizados/maduros de la presente descripción. Las moléculas de anticuerpo como se describen en el presente documento también pueden comprender o también pueden ser derivadas de anticuerpos/moléculas de anticuerpo que se caracterizan por regiones VH como se muestran en cualquiera de SEQ ID NOs: 32 a 45 o regiones de VL como se muestran en SEQ ID NOs: 46 a 59 o que pueden comprender una región CDR-3 como se define en cualquiera de SEQ ID NOs: 60 a
87. La molécula de anticuerpo optimizada de la presente invención comprende regiones VH y regiones VL como se representan en SEQ ID NOs: 90/91, respectivamente, o partes de las mismas. Una parte de las mismas puede ser una región(regiones) CDR, preferentemente una región(regiones) CDR-3. La molécula de anticuerpo del tipo
25 optimizado comprende una H-CDR3 como se caracteriza en SEQ ID NO: 93 y/o una L-CDR3 como se caracteriza en SEQ ID NO: 95. Se prefiere que los anticuerpos/moléculas de anticuerpo de la invención se caractericen por su reactividad específica con β-A4 y/o péptidos derivados de dicho β-A4. Por ejemplo, se pueden establecer densidades ópticas en los ensayos ELISA, como se ilustra en los ejemplos adjuntos, y se puede emplear la relación de las densidades ópticas para definir la reactividad específica de los anticuerpos parentales o los optimizados. Por consiguiente, un anticuerpo preferido de la invención es un anticuerpo que reacciona en un ensayo ELISA con β-A4 para llegar a una densidad óptica medida a 450 nm que sea 10 veces mayor que la densidad óptica medida sin β-A4, es decir, 10 veces sobre el ruido de fondo. Preferentemente la medición de la densidad óptica se realiza unos pocos minutos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 minutos) después del inicio de la reacción de desarrollo de color para optimizar la relación señal y
35 ruido de fondo.
En el presente documento, las moléculas de anticuerpo descritas comprenden al menos una CDR3 de una región VL codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NOs: 15, 17 o 19 o al menos una secuencia de aminoácidos CDR3 de una región VL como se muestra en SEQ ID NOs: 16, 18 o 20 y/o dicha molécula de anticuerpo comprende al menos una CDR3 de una región VH codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NOs: 21, 23 o 25 o al menos una secuencia de aminoácidos de CDR3 de una región VH como se muestra en SEQ ID NOs: 22, 24 o 26. Lo más preferido son anticuerpos que comprenden al menos una CDR3 de una región VH como se define en el presente documento. Los dominios CDR-3 anteriormente mencionados en el presente documento se refieren a las moléculas anticuerpo parentales ilustrativas MSR-3, -7 o
45 8. Sin embargo, tal como se ilustra en las tablas adjuntas 1, 8 o 10, las moléculas de anticuerpo maduradas y/o optimizadas obtenibles por los métodos descritos en los ejemplos adjuntos pueden comprender regiones VH, VL, CDR1, CDR2 y CDR3 modificadas. Por consiguiente, la molécula de anticuerpo se puede seleccionar entre el grupo que consiste en MSR-3, -7 y -8 o una versión madurada por afinidad de MSR-3, -7 y -8. Las versiones maduradas por afinidad así como de clonación cruzada de MSR-3, -7 y -8 comprenden, entre otras, moléculas de anticuerpo que comprenden regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 como se muestran en la tabla 1 u 8 o caracterizadas en cualquiera de SEQ ID NOs: 15 a 20, 21 a 26, 60 a 74, 75 a 87, 92 y 93 o 94 y 95, así como en SEQ ID NOs: 354 a
413. El anticuerpo como se describe en el presente documento comprende al menos una CDR, preferentemente una CDR1, más preferentemente una CDR2, lo más preferentemente una CDR3 como se muestra en la tabla adjunta 1, 8 o como se documenta en la tabla adjunta 10.
55 Cabe señalar que las técnicas de maduración por afinidad son bien conocidas en la técnica, están descritas en los ejemplos adjuntos y, entre otros, en Knappik (2000), J. Mol. Biol. 296, 55; Krebs (2000), J. Imm. Meth. 254, 67-84; documentos WO 01/87337; WO 01/87338; US 6.300.064; EP 96 92 92 78.8 y referencias adicionales citadas más adelante en el presente documento.
En una realización más preferida de la invención, la molécula de anticuerpo es un anticuerpo completo (inmunoglobulina, como una IgG1, una IgG2, una IgG2b, una IgG3, una IgG4, una IgA, una IgM, una IgD o una IgE), un fragmento F(ab), Fabc, Fv, Fab’, F(ab’)2, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, una construcción de anticuerpo bivalente, una proteína de fusión a anticuerpo, un anticuerpo de
65 clonación cruzada o un anticuerpo sintético. También se prevé que sean variantes genéticas de genes de inmunoglobulina. Las variantes genéticas de, por ejemplo, la subclase 1 de la cadena pesada G de inmunoglobulina
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(IgG1) puede comprender los marcadores alotípicos G1m(17) o G1m(3) en el dominio CH1, o el marcador alotípico el G1m(1) o G1m(no-1) en el dominio CH3. La molécula de anticuerpo de la invención también comprende anticuerpos modificados o mutantes, como IgG mutante con unión al receptor Fc aumentada o atenuada o activación de complemento. También se prevé que los anticuerpos de la invención se producen por medios convencionales, por ejemplo, la producción de anticuerpos monoclonales específicos generados por inmunización de mamíferos, preferentemente ratones, con péptidos que comprenden las dos regiones de βA4 como se definen en el presente documento, por ejemplo, región/epítopo N-terminal y central que comprende (a) aminoácidos 2 a 10 (o una parte(s) de los mismos) de β-A4 y (b) una tramo de aminoácidos que comprende los aminoácidos 12 a 25 ( o una parte(s) de los mismos) de β-A4 (SEQ ID NO: 27). Por consiguiente, el experto en la técnica puede generar anticuerpos monoclonales frente a tal péptido y puede cribar los anticuerpos obtenidos para la capacidad de simultáneamente e independientemente unirse a/reaccionar con la región/epítopo N-terminal y central de βA4 como se define en el presente documento. Correspondientes métodos de cribado (screenning) se describen en los ejemplos adjuntos.
Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, los anticuerpos/moléculas de anticuerpo fácilmente y preferentemente se pueden construir y expresar de manera recombinante. Preferentemente, la molécula de anticuerpo de la descripción comprende al menos uno, más preferentemente al menos dos, preferentemente al menos tres, más preferentemente al menos cuatro, más preferentemente al menos cinco y lo más preferentemente seis CDRs de los anticuerpos parentales MSR-3, MSR-7 o MSR-8 definidos en el presente documento o de los anticuerpos madurados por afinidad/optimizados derivados de dichos anticuerpos parentales. Cabe señalar que también más de seis CDRs pueden estar comprendidas en los anticuerpos recombinantemente producidos de la invención. El experto en la técnica fácilmente puede emplear la información dada en los ejemplos adjuntos para deducir CDRs correspondientes de los anticuerpos parentales, así como los optimizados por afinidad. Ejemplos de anticuerpos optimizados que se han obtenido por maduración/optimización de los cuerpos parentales se muestran, entre otros, en la tabla adjunta 1. Una molécula de anticuerpo madurada/optimizada de la invención es, por ejemplo, MSR 7.9H7 que se caracteriza también por secuencias adjuntas en el presente documento, que comprenden las SEQ ID NOs: 88 a 95 y que representan la región VH de MSR 7.9H7 (SEQ ID NOs: 88 a 89), la región VL de MSR 7.9H7 (SEQ ID NOs: 90 a 91), la H-CDR3 de MSR 7.9H7 (SEQ ID NOs: 92 a 93) así como la L-CDR3 de MSR 7.9H7 (SEQ ID NOs: 94 a 95). La molécula de anticuerpo ilustrativo 7.9H7 está derivado del anticuerpo parental MSR7 y es un ejemplo de la invención particular preferido de una molécula de anticuerpo optimizada/madurada de la presente invención. Esta molécula de anticuerpo además se puede modificar según esta invención, por ejemplo, en forma de clonación cruzada, véase más adelante en el presente documento y los ejemplos adjuntos.
Tal como se documenta en los ejemplos adjuntos, los anticuerpos de la invención también comprenden anticuerpos de clonación cruzada, es decir, anticuerpos que comprenden diferentes regiones de anticuerpo (por ejemplo, regiones CDR) de uno o más anticuerpos parentales u optimizados por afinidad como se describen en el presente documento. Estos anticuerpos de clonación cruzada pueden ser anticuerpos en diversas regiones estructurales diferentes, por lo cual la región estructural más preferida es una región estructural de IgG, incluso más preferidos es una región estructural de IgG1, IgG2a o IgG2b. Particularmente se prefiere que dicha región estructural de anticuerpo sea una región estructural de mamífero, lo más preferentemente una humana. Los dominios en las cadenas ligeras y pesadas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones estructurales, cuyas secuencias están relativamente conservadas, juntadas por tres dominios hipervariables conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDR1-3).
Tal como se usa en el presente documento, una “región estructural humana” se refiere a una región estructural que es básicamente idéntica (aproximadamente 85 % o más, normalmente 90-95 % o más) a la región estructural de una inmunoglobulina humana que se da de manera natural. La región estructural de un anticuerpo, que son las regiones estructurales combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDRs. Las CDRs son responsables principales de la unión a un epítopo de un antígeno. Cabe señalar que no solamente los anticuerpos de clonación cruzada descritos en el presente documento pueden estar presentes en una región estructural de anticuerpo preferida (humana), sino también las moléculas de anticuerpo que comprenden CDRs de, entre otros, los anticuerpos parentales MSR-3, -7 u -8 como se describe en el presente documento o de los anticuerpos madurados derivados de dichos anticuerpos parentales, pueden estar introducidos en una región estructural de inmunoglobulina. Las regiones estructurales preferidas son IgG1, IgG2a e IgG2b. Las más preferidas son las regiones estructurales humanas y las regiones estructurales de IgG1 humanas.
Tal como se muestra en los ejemplos adjuntos es posible, entre otros, transferir, por ingeniería genética conocida en la técnica, cadenas ligeras totales desde un clon donante optimizado a un clon receptor optimizado. Ejemplo de un clon donante optimizado es, por ejemplo, L-CDR1 (L1) y un ejemplo de un clon recipiente optimizado es H-CDR2 (H2). La especificidad de epítopo se puede conservar combinando clones que poseen las mismas regiones H-CDR3. Detalles adicionales se dan en el Ejemplo ilustrativo 13.
Moléculas de anticuerpo de clonación cruzada se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en MS-R Nº3.3H1x3.4L9, MS-R Nº3.4H1x3.4L9, MS-R Nº3.4H3x3.4L7, MS-R Nº3.4H3x3.4L9, MS-R Nº3.4H7x3.4L9, MS-R Nº3.4H7x3.4L7, MS-R Nº3.6H5x3.6L1, MS-R Nº3.6H5x3.6L2, MS-R Nº3.6H8x3.6L2, MS-R Nº7.2H2x7.2L1, MS-R Nº7.4H2x7.2L1, MS-R Nº7.4H2x7.12L2, MS-R Nº7.9H2x7.2L1(L1), MS-R Nº7.9H2x7.12L1, MS-R Nº7.9H2x7.12L2, MS-R Nº7.9H2x7.12L2(L1+2), MS-R Nº7.9H4x7.12L2, MS-R Nº7.11H1x7.2L1, MS-R Nº7.11H1x7.11L1, MS-R
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Nº7.11H2x7.2L1(L1), MS-R Nº7.11H2x7.9L1(L1). MS-R Nº7.11H2x7.12L o MS-R Nº8.1H1x8.2L1.
La generación de anticuerpos de clonación cruzada también se ilustra en los ejemplos adjuntos. Los anticuerpos/moléculas de anticuerpo de clonación cruzada preferidos anteriormente mencionados son moléculas de anticuerpo optimizadas/maduradas derivadas de anticuerpos parentales descritos en el presente documento, en particular de MSR-3 y MSR-7. Además, se dan secuencias de CDR y regiones V características adicionales de los anticuerpos/moléculas de anticuerpo de clonación cruzada en las SEQ ID NOs adjuntas: 32, 33, 46 y 47 (MSR 3.6H5x3.6L2; regiones VH, VL); 34, 35, 48 y 49 (MSR 3.6H8x3.6L2; regiones VH, VL); 36, 37, 50 y 51 (MSR 7.4H2x7.2L1; regiones VH, VL); 38, 39, 52 y 53 (MSR Nº7.9H2x7.12L12; regiones VH, VL); 40, 41, 54 y 55 (MSR Nº7.9H4x7.12L2; regiones VH, VL); 42, 43, 56 y 57 (MS-R Nº7.11H1x7.11L1; regiones VH, VL); y 44, 45, 58 y 59 (MSR Nº7.11H1x7.2L1; regiones VH, VL). Regiones CDR3 correspondientes de estas moléculas de anticuerpo de clonación cruzada preferidas particulares se representan en SEQ ID NOs: 60 a 87. Para moléculas de anticuerpo MSR adicionales, se pueden deducir regiones VH, VL, CDR de las Tablas adjuntas 8 o 10 y del listado de secuencia adjunto, en particular SEQ ID NOs: 32 a 95 para los anticuerpos/moléculas de anticuerpo MS-R Nº3.6H5x3.6L2, Nº3.6H8x3.6L2, Nº7.4H2x7.2L1, Nº7.9H2x7.12L2, Nº7.9H4x7.12L2, Nº7.11H1x7.11L1, Nº7.11H1x7.2L1 y Nº7.9H7 o SEQ ID NOs: 294 a 413 para anticuerpos MSR-R/moléculas de anticuerpo MS-R Nº3.3H1x3.4L9, Nº3.4H1x3.4L9, Nº3.4H3x3.4L7, Nº3.4H3x3.4L9, Nº3.4H7x3.4L9, Nº3.4H7x3.4L7, Nº3.6H5x3.6L1, Nº7.2H2x7.2L1, Nº7.4H2x7.12L2, Nº7.9H2x7.2L1, Nº7.9H2x7.12L1, Nº7.11H2x7.2L1, Nº7.11H2x7.9L1, Nº7.11H2x7.12L1 o Nº8.1H1x8.2L1. Por consiguiente, aparte de las regiones VH anteriormente definidas, las moléculas de anticuerpo preferidas de la descripción pueden comprender regiones VH como se definen en una cualquiera de SEQ ID NOs: 294 a 323. Igualmente, SEQ ID NOs: 324 a 353 representan regiones VL preferidas que, aparte de las regiones VL anteriormente definidas que pueden estar comprendidas en la molécula de anticuerpo como se describe en el presente documento. Regiones CDR-3 correspondientes se definieron anteriormente, así como en secuencias adicionales mostradas en SEQ ID NOs: 354 a 413. La molécula de anticuerpo de la invención fácilmente se puede producir en cantidades suficientes, entre otros, por métodos recombinantes conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Bentley, Hybridoma 17 (1998), 559-567; Racher, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40 (1994), 851-856; Samuelsson, Eur. J. Immunol. 26 (1996), 3.029-3.034.
Teóricamente, en β-A4 soluble (monomérico/oligomérico) tanto los epítopos N-terminales como los medios son accesibles para la interacción de anticuerpo y las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden o bien unirse al epítopo N-terminal o al medio por separado, pero bajo estas condiciones no se obtendrá la afinidad máxima. Sin embargo, es más probable que se consiga un contacto óptimo al paratopo de anticuerpo por unión simultánea a ambos epítopos, es decir, similar a la interacción con β-A4 agregado. Por tanto, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos anti-Aβ únicos de manera que se unen a β-A4 agregado (mediante la interacción con el epítopo N-terminal y medio), y a la vez también son capaces de estabilizar y neutralizar el epítopo conformacional en β-A4 soluble. Estos anticuerpos son diferentes a los anticuerpos de la técnica anterior.
Las más preferidas son moléculas de anticuerpo de la invención que tienen una afinidad a Aβ o sus fragmentos definidos con un valor KD menor de 2.000 nM, preferentemente menor de 100 nM, más preferentemente menor de 10 nM, lo más preferentemente menor de 1 nM. La medición de tal afinidad o afinidades se puede llevar a cabo por métodos ilustrados en los ejemplos y conocidos en la técnica. Tales métodos comprenden, pero no se limitan a, ensayos de BIACORET™ (www.biacore.com; Malmquist (1999), Biochem. Soc. Trans 27, 335-340) y ensayos en fase sólida que usan anticuerpos marcados o Aβ marcado.
Preferentemente, la molécula de anticuerpo de la invención es capaz de decorar/reaccionar con/unirse a placas de amiloide en secciones de cerebro in vitro (post-mortem) de pacientes que padecían de trastornos relacionados con amiloide, como la enfermedad de Alzheimer. Aún, también se prefiere que el anticuerpo/moléculas de anticuerpo de la invención prevengan la agregación de Aβ in vivo, así como en ensayos in vitro, tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos. Igualmente, las moléculas de anticuerpo de la presente invención son preferidas para despolimerizar el agregado de Aβ en ensayos in vivo y/o in vitro mostrados en los ejemplos. Esta capacidad de los anticuerpos/moléculas de anticuerpo de la invención es, entre otros, para emplearse en marcos médicos, en particular en composiciones farmacéuticas descritas más adelante en el presente documento.
La invención también proporciona una molécula de ácidos nucleicos que codifica una molécula de anticuerpo de la invención como se define en el presente documento.
Dicha molécula de ácidos nucleicos puede ser una molécula de ácidos nucleicos que se da de manera natural, así como una molécula de ácidos nucleicos recombinante. Por lo tanto, la molécula de ácidos nucleicos de la invención puede ser de origen natural, sintético o semisintético. Puede comprender ADN, ARN, así como APN y puede ser un híbrido de los mismos.
Es evidente para un experto en la técnica que las secuencias reguladoras se pueden añadir a la molécula de ácidos nucleicos de la invención. Por ejemplo, se pueden emplear promotores, potenciadores transcripcionales y/o secuencias que permiten la expresión inducida del polinucleótido de la invención. Un sistema inducible adecuado es, por ejemplo, la expresión génica regulada por tetraciclina como se describe, por ejemplo, por Gossen y Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5.547-5.551) y Gossen y col., (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62), o un sistema de expresión de gen inducible por dexametasona como se describe, por ejemplo, por Crook (1989) EMBO J. 8, 513
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519.
Además, se prevé para propósitos adicionales que la molécula de ácidos nucleicos puede contener, por ejemplo,
5 enlaces tioéster y/o análogos de nucleótidos. Dichas modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de la molécula de ácidos nucleicos frente a endo y/o exonucleasas en la célula. Dichas moléculas de ácidos nucleicos se pueden transcribir mediante un vector apropiado que contiene un gen quimérico que permite la transcripción de dicha molécula de ácidos nucleicos en la célula. A este respecto, también se entiende que el polinucleótido de la invención se puede usar para planteamientos “terapéuticos génicos” o “de diana génica”. En otra realización dichas moléculas de ácidos nucleicos están marcadas. Los métodos para la detección de los ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, transferencia tipo Southern y Northern, PCR o extensión de cebador. Esta realización puede ser útil para los métodos de cribado para verificar la introducción con éxito de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención durante los planteamientos de terapia génica.
15 La(s) molécula(s) de ácidos nucleicos de la invención puede(n) ser una molécula de ácidos nucleicos quimérica producida de manera recombinante que comprende alguna de las moléculas de ácidos nucleicos anteriormente mencionadas o bien sola o en combinación. Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos de la invención es parte de un vector.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos de la presente invención. El vector de la presente invención puede ser, por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector usado, por ejemplo, de manera convencional en ingeniería genética, y puede comprender además genes tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula hospedadora adecuada y bajo
25 condiciones adecuadas. Además, el vector de la presente invención puede comprender, además de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención, elementos control de la expresión, que permiten la expresión apropiada de las regiones codificadoras en hospedantes adecuados. Tales elementos control son conocidos por los expertos y pueden incluir un promotor, un casete de corte y empalme, codón de iniciación de la traducción, sitio de traducción e inserción para introducir un inserto en el vector. Preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos de la invención está operativamente ligada a dichas secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células eucariotas o procariotas.
Elementos control que aseguran la expresión en células eucariotas y procariotas son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tal como se mencionó anteriormente en el presente documento, normalmente comprenden
35 secuencias reguladoras que aseguran la iniciación de la transcripción y opcionalmente señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcripto. Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales, así como de traducción, y/o regiones promotor naturalmente asociadas o heterólogas. Posibles elementos reguladores que permiten la expresión en, por ejemplo, células hospedantes de mamífero comprenden el promotor de timidina quinasa de CMV-HSV, SV40, promotor RSV (Virus del sarcoma de Rous), promotor del factor 1α de elongación humano, el promotor de MMTV inducible por glucocorticoide (Virus del Tumor de Ratón de Moloney), promotores inducibles por metalotioneina o tetraciclina, o potenciadores, como potenciados de CMV o potenciador de SV40. Para la expresión en células neurales, se prevé que se pueden emplear promotores de neurofilamento, PGDF, NSE, PrP o thy-1. Dichos promotores se conocen bien en la técnica y, entre otros, están descritos en Charron (1995), J. Biol. Chem. 270, 25.739-25.745. Para la expresión en células
45 procariotas, se han descrito una multitud de promotores que incluyen, por ejemplo, el promotor tac-lac o el promotor de trp. Aparte de los elementos que son responsables de la iniciación de la transcripción tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de transcripción, tales como el sitio poli-A de SV40
o el sitio poli-A de tk, en dirección 3’ del polinucleótido. En este contexto, los vectores de expresión adecuados se conocen en la técnica tal como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pX (Pagano (1992) Science 255, 1.144-1.147), dos vectores híbridos de levadura, tales como pEG202 y dpJG4-5 (Gyuris (1995) Cell 75, 791-803), o vectores de expresión procariota, tales como lambda gt11 o pGEX (Amersham-Pharmacia). Aparte de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, el vector puede además comprender secuencias de ácidos nucleicos que codifican las señales de secreción. Tales secuencias son bien conocidas por los expertos en la técnica. Además, 55 dependiendo del sistema de expresión usado se pueden añadir secuencias líder capaces de dirigir los péptidos de la invención a un compartimento celular a la secuencia codificadora de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención y son bien conocidas en la técnica. La(s) secuencia(s) líder se ensamblan(n) en la fase apropiada con secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una proteína de la misma, dentro del espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación C-terminal o N-terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Una vez que el vector se ha incorporado dentro del hospedador apropiado, el hospedador se mantiene bajo condiciones adecuadas para alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos, y, como si se desea, puede seguir la colección y purificación de las moléculas de
65 anticuerpo o fragmentos de las mismas de la invención. Por consiguiente, la invención también se refiere a hospedantes/células hospedantes que comprenden un vector como se define en el presente documento. Tales
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hospedantes pueden ser útiles para en los procesos obtener anticuerpos/moléculas de anticuerpos de la invención, así como en marcos médicos/farmacéuticos. Tales células hospedantes también pueden comprender células neuronales sometidas a transducción o a transfección, como células madre neuronales, preferentemente células madre neuronales adultas. Tales células hospedantes pueden ser útiles en terapias de trasplante.
Además, el vector de la presente invención también puede ser una expresión, un vector de transferencia génica o de diana génica. La terapia génica, que se basa en la introducción de genes terapéuticos dentro de células por técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Los ratones transgénicos que expresan un anticuerpo neutralizante dirigido al factor de crecimiento de nervio se han generado usando la técnica de “neuroanticuerpo”; Capsoni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000), 6.826-6.831 y Biocca, Embo J. 9 (1990), 101-108. Vectores, métodos o sistemas de liberación de gen adecuados para la terapia génica in vitro o in vivo están descritos en la bibliografía y son conocidos por los expertos en la técnica; véase, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Cir. Res. 77 (1995), 1.077-1.086; Onodua, Blood 91 (1998), 3036; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2.243-2.251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (sup. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documentos WO 94/29469; WO 97/00957; US 5.580.859; US 5.589.466; US 4.394.448 o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, y referencias citadas en el presente documento. En particular, dichos sistemas de liberación de genes y/o vectores también están descritos en los planteamientos de terapia génica en tejido/células neurológicas (véase, entre otros, Blömer, J. Virology 71 (1997) 6.641-6.649) o en el hipotálamo (véase, entre otros, Geddes, Front Neuroendocrinol. 20 (1999), 296-316 o Geddes, Nat. Med. 3 (1997), 1.402-1.404). Adicionales construcciones de terapia génica adecuadas para su uso en células/tejidos neurológicos son conocidos en la técnica, por ejemplo, en Meier (1999), J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58, 1.099-1.110. Las moléculas de ácidos nucleicos y los vectores de la invención pueden estar diseñados para la introducción directa o para introducción por liposomas, vectores víricos (por ejemplo, adenovirales, retrovirales), electroporación, balísticos (por ejemplo, pistola de gen) u otros sistemas de liberación en las células. Además, se puede usar un sistema baculoviral como sistema de expresión eucariota para las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. La introducción y el planteamiento terapéutico génico debería, preferentemente, conducir a la expresión de una molécula de anticuerpo funcional de la invención, por lo cual dicha molécula de anticuerpo expresada es particularmente útil en el tratamiento, mejoramiento y/o prevención de trastornos neurológicos relacionados con síntesis anormal de amiloide, ensamblaje y/o agregación, como, la enfermedad de Alzheimer y similares.
Por consiguiente, la molécula de ácidos nucleicos de la presente invención y/o los vectores/hospedantes anteriormente descritos de la presente invención pueden ser particularmente útiles como composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden emplear en planteamientos de terapia génica. En este contexto, se prevé que las moléculas de ácidos nucleicos y/o vectores de la presente invención se pueden emplear para modular, alterar y/o modificar la expresión (celular) y/o concentración de las moléculas de anticuerpo de la invención o de un fragmento(s) de las mismas.
Para aplicaciones de terapia génica, los ácidos nucleicos que codifican el(los) péptido(s) de la invención o fragmentos de los mismos se pueden clonar dentro de un sistema de liberación de gen, tal como un virus y el virus usado para la infección y confiriendo mejoramiento de la enfermedad o efectos de curación en las células infectadas u organismo.
La presente invención también se refiere a una célula hospedadora sometida a transfección o transformada con el vector de la invención o un hospedador no humano que porta el vector de la presente invención, es decir, a una célula hospedadora u hospedadora que está genéticamente modificada con una molécula de ácidos nucleicos según la invención o con un vector que comprende tal molécula de ácidos nucleicos. El término “genéticamente modificado” significa que la célula hospedadora o el hospedador comprende además de su genoma natural una molécula de ácidos nucleicos o vector según la invención que se introduce en la célula u hospedador o en uno sus predecesores/padres. La molécula de ácidos nucleicos o vector puede estar presente en la célula hospedadora genéticamente modificada u hospedador o bien como molécula independiente fuera del genoma, preferentemente como molécula que es capaz de replicación, o puede estar establemente integrada en el genoma de la célula hospedadora u hospedador.
La célula hospedadora de la presente invención puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Las células procariotas adecuadas son aquellas generalmente usadas para clonar como E. coli o Bacillus subtilis. Además, las células eucariotas comprenden, por ejemplo, células fúngicas o animales. Ejemplos de células fúngicas adecuadas son células de levadura, preferentemente aquellas del género Saccharomyces y lo más preferentemente aquellas de la especie Saccharomyces cerevisiae. Células animales adecuadas son, por ejemplo, células de insecto, células de vertebrados, preferentemente células de mamífero, tales como, por ejemplo, HEK293, NSO, CHO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A. Estas células hospedantes, por ejemplo, células CHO, pueden proporcionar modificaciones post-traducción a las moléculas de anticuerpo de la invención, incluyendo la separación del péptido líder, pliegue y ensamble de cadenas H (pesadas) y L (ligeras), glicosilación de la molécula en lados correctos y secreción de la molécula funcional. Líneas celulares adicionales adecuadas conocidas en la técnica son obtenibles de los depósitos de línea celular, como “The American Type Culture Collection” (ATCC). Según la presente invención, además se prevé que las células/cultivos celulares primarios pueden funcionar como células hospedantes. Dichas células en particular están derivadas de insectos (como insectos de las especies de Drosophila o Blatta) o mamíferos (como humanos, marranos, ratón o rata). Dichas células hospedantes también pueden comprender células de y/o derivadas de líneas celulares como líneas
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5 celulares de neuroblastoma. Las células primarias anteriormente mencionadas son bien conocidas en la técnica y comprenden, entre otras, astrocitos primarios, cultivos espinales (mezclados) o cultivos de hipocampo.
En una realización preferida la célula hospedadora que está transformada con el vector de la invención es una célula neuronal, una célula madre neuronal (por ejemplo, una célula madre neuronal adulta), una célula de cerebro o una célula (línea) derivada de las mismas. Sin embargo, también una célula CHO que comprende la molécula de ácidos nucleicos de la presente invención puede ser particularmente útil como hospedador. Tales células pueden proporcionar modificaciones secundarias correctas en las moléculas expresadas, es decir, las moléculas de anticuerpo de la presente invención. Estas modificaciones comprenden, entre otros, glicosilaciones y fosforilaciones.
15 Los hospedantes pueden ser mamíferos no humanos, lo más preferentemente ratones, ratas, oveja, terneros, perros, monos o simios. Dichos mamíferos pueden ser indispensables para el desarrollo de una cura, preferentemente una cura para trastornos neurológicos y/o neurodegenerativos mencionados en el presente documento. Además, los hospedantes de la presente invención pueden ser particularmente útiles en la producción de las moléculas de anticuerpo (o fragmentos de las mismas) de la invención. Se prevé que dichas moléculas de anticuerpo (o fragmentos de las mismas) se aíslan de dicho hospedador. Se prevé, entro otros, que las moléculas de ácidos nucleicos y/o vectores descritos en el presente documento se incorporan en secuencias para la expresión transgénica. La introducción de las moléculas de ácidos nucleicos de la invención como transgenes dentro de los hospedantes no humanos y su posterior expresión se puede emplear para la producción de los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, la expresión de tal(es) transgen(es) en la leche del animal transgénico proporciona medios
25 para obtener la molécula de anticuerpo de la invención en cantidades cuantitativas; véase, entre otros, los documentos US 5.741.957, US 5.304.489 o US 5.849.992. Transgenes útiles a este respecto comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, secuencias codificadoras para las cadenas ligeras y pesadas de las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, operativamente ligadas al promotor y/o estructuras potenciadoras de un gen específico de glándula mamaria, como caseína o beta-lactoglobulina.
La invención también proporciona un método para la preparación de una molécula de anticuerpo de la invención que comprende el cultivo de la célula hospedadora anteriormente descrita en el presente documento bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de anticuerpo y la recuperación de dicha molécula de anticuerpo de dicho cultivo.
35 La invención también se refiere a una composición que comprende una molécula de anticuerpo de la invención o producida por el método anteriormente descrito, una molécula de ácidos nucleicos que codifica la molécula de anticuerpo de la invención, un vector que comprende dicha molécula de ácidos nucleicos o una célula hospedadora como se definió anteriormente y opcionalmente, moléculas adicionales, o bien solas o en combinación, como, por ejemplo, moléculas que son capaces de interferir con la formación de placas de amiloide o que son capaces de despolimerizar placas de amiloide ya formadas. El término “composición” tal como se emplea en el presente documento comprende al menos un compuesto de la invención. Preferentemente, tal composición es una composición farmacéutica o una composición de diagnóstico.
45 La composición puede estar en forma sólida o líquida y puede estar, entre otras, en una forma de polvo(s), comprimido(s), solución(es) o aerosol(es). Dicha composición puede comprender uno o más anticuerpos/moléculas de anticuerpo de la invención o moléculas de ácidos nucleicos, vector u hospedantes de la invención. También se prevé que dicha composición comprenda al menos dos, preferentemente tres, más preferentemente, cuatro, lo más preferentemente cinco moléculas de anticuerpo de la invención o molécula(s) de ácidos nucleicos que codifica(n) dicha(s) molécula(s) de anticuerpo. Dicha composición también puede comprender anticuerpos/moléculas de anticuerpo de la invención optimizadas obtenibles por los métodos descritos más adelante en el presente documento y en los ejemplos adjuntos.
Se prefiere que dicha composición farmacéutica, opcionalmente comprenda un vehículo farmacéuticamente
55 aceptable y/o diluyente. La composición farmacéutica descrita en el presente documento puede ser particularmente útil para el tratamiento de trastornos neurológicos y/o neurodegenerativos. Dichos trastornos comprenden, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis tipo holandés, síndrome de Down, demencia por VIH, enfermedad de Parkinson y trastornos neuronales relacionados con la vejez. La composición farmacéutica de la invención se prevé, entre otros, como inhibidores potentes de la formación de placa de amiloide o como un estimulador potente para la despolimerización de placas de amiloide. Por lo tanto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención a usar para el tratamiento de enfermedades/trastornos asociados con proteólisis patológica de APP y/o formación de placa de amiloide.
65 Ejemplos de vehículos, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas taponadas, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de
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agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales vehículos se pueden formular por métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas se puede efectuar por diferentes medios, por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. Particularmente se prefiere que dicha administración se lleve a cabo por inyección y/o reparto, por ejemplo, a un sitio en la arteria cerebral o directamente en el tejido cerebral. Las composiciones de la invención también se pueden administrar directamente al sitio diana, por ejemplo, por reparto biolístico a un sitio diana externo o interno, como el cerebro. El régimen de dosificación se determinará por el médico que atiende y los factores clínicos. Tal como se sabe bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general, y otros fármacos que se administran al mismo tiempo. La materia farmacéuticamente activa proteínica puede estar presente en cantidades entre 1 ng y 10 mg/kg de peso corporal por dosis; sin embargo, se conciben dosis por encima o por debajo de este intervalo de ejemplo, considerando especialmente los factores anteriormente mencionados. Si el régimen es una infusión continua, también debería estar en el intervalo de 1 µg a 10 mg de unidades por kilogramos de peso corporal por minuto. El progreso se puede controlar por valoración periódica. Las composiciones de la invención se pueden administrar local o sistémicamente. Cabe señalar que los anticuerpos periféricamente administrados pueden entrar al sistema nervioso central, véase, entre otros, Bard (2000), Nature Med. 6, 916-919. Preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Vehiculizantes parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijados. Vehiculizantes intravenosos incluyen rellenantes fluidos y nutrientes, rellenantes de electrolito (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención además puede comprender agentes adicionales dependiendo del uso previsto de la composición farmacéutica. Dichos agentes pueden ser fármacos que actúan sobre el sistema nervioso central, como, factores neuroproctectores, inhibidores de colinesterasa, agonistas del receptor muscarínico M1, hormonas, antioxidantes, inhibidores de inflamación, etc. Particularmente se prefiere que dicha composición farmacéutica comprenda agentes adicionales como, por ejemplo, neurotransmisores y/o moléculas de sustitución para neurotransmisores, vitamina E
o ácido alfa-lipoico.
Las composiciones farmacéuticas, así como los métodos de la invención o los usos de la invención descritos más adelante se pueden usar para el tratamiento de todo tipo de enfermedades hasta hora desconocidas o que están relacionadas con o dependen de agregación patológica de APP o procesamiento patológico de APP. Pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades en las que los depósitos extracelulares de amiloide-β, parecen jugar un papel. Deseablemente se puede emplear en humanos, aunque el tratamiento animal también abarca los métodos, usos y composiciones descritos en el presente documento.
En una realización preferida de la invención, la composición de la presente invención como se describió anteriormente en el presente documento es una composición de diagnóstico que comprende además, opcionalmente, medios adecuados para la detección. La composición de diagnóstico comprende al menos uno de los compuestos anteriormente mencionados de la invención. Dicha composición de diagnóstico puede comprender los compuestos de la invención, en particular y preferentemente las moléculas de anticuerpo de la presente invención, en forma soluble/fase líquida, pero también se prevé que dichas composiciones están unidas a/acopladas a y/o ligadas a un soporte sólido.
Los soportes sólidos se pueden usar en combinación con la composición de diagnóstico como se define en el presente documento o los compuestos de la presente invención pueden estar directamente unidos a dichos soportes sólidos. Tales soportes son bien conocidos en la técnica y comprenden, entre otros, materiales de columna comercialmente disponibles, esferas de poliestireno, esferas de látex, esferas magnéticas, partículas coloidales de metal, pedacitos y superficies de cristal y/o silicona, tiras de nitrocelulosa, membranas, láminas, duracytes, pocillos y paredes de bandejas de reacción, tubos de plástico, etc. El(los) compuesto(s) de la invención, en particular los anticuerpos de la presente invención, pueden estar unidos a muchos vehículos diferentes. Ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen, cristal, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser o bien soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Las marcas y métodos apropiados para la marcación anteriormente se han identificado y además están mencionados más adelante en el presente documento. Se conocen bien los métodos adecuados para la fijación/inmovilización de dicho(s) compuesto(s) de la invención e incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares.
Particularmente se prefiere que la composición de diagnóstico de la invención se emplee para la detección y/o cuantificación de APP y/o productos del procesamiento de APP, como amiloide-β o para la detección y/o cuantificación de lados de escisión de APP patológicos y/o modificados (genéticamente).
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Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, los compuestos de la presente invención, en particular la molécula de anticuerpo de la invención es particularmente útil como reactivo de diagnóstico en la detección de placas de amiloide humas genuinas en secciones de cerebro de pacientes con la enfermedad de Alzheimer por inmunofluorescencia indirecta.
5 Se prefiere que dichos compuestos de la presente invención a emplear en una composición diagnóstica se marquen de manera detectable. Una diversidad de técnicas está disponible para la marcación de biomoléculas, son bien conocidas por los expertos en la técnica y se consideran que están dentro del alcance de la presente invención. Tales técnicas están descritas, por ejemplo, en Tijssen, “Practice and theory of enzyme immuno assays”, Burden, RH y von Knippenburg (Eds), Volumen 15 (1985), “Basic methods in molecular biology”; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer y col., (Eds) “Immunochemical methods in cell and molecular biology” Academic Press, Londres (1987), o en la serie “Methods in Enzymology”, Academic Press, Inc.
Hay muchos marcadores y métodos de marcación diferentes conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de
15 los tipos de marcadores que se pueden usar en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes.
Marcadores comúnmente usados comprenden, entre otros, fluorocromos (como fluoresceína, rodamina, Rojo Texas, etc.), enzimas (como peroxidasa de rábano, β-galactosidasa, fosfatasa alcalina), isótopos radioactivos (como 32P o 125I), biotina, digoxigenina, metales coloidales, compuestos quimio o bioluminiscentes (como dioxetanos, luminol o acridinios). Procedimientos de marcación, como el acoplamiento covalente de enzimas o grupos de biotinilo, iodinaciones, fosforilaciones, biotinilaciones, etc. son bien conocidos en la técnica. Métodos de detección comprenden, pero no se limitan a, autorradiografía, microscopía de fluorescencia, reacciones enzimáticas directas e indirectas, etc. Ensayos de detección comúnmente usados comprenden métodos
25 radioisotópicos o no radioisotópicos. Estos comprenden, entre otros, transferencia tipo Western, ensayos de superposición, RIA (Radioinmunoensayo) e IRMA (Ensayo Radioinmunométrico Inmune), EIA (Ensayo inmunoenzimático), ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), FIA (Ensayo Inmunofluorescente) y CLIA (Ensayo inmunoquimioluminiscente).
Además, la presente invención proporciona el uso de una molécula de anticuerpo de la invención, o una molécula de anticuerpo producida por el método de la invención, de una molécula de ácidos nucleicos, vector o un hospedador de la invención para la preparación de una composición farmacéutica o una composición de diagnóstico para la prevención, tratamiento y/o diagnosis de una enfermedad asociada con amiloidogénesis y/o la formación de placa de amiloide. Además, se prefiere que los compuestos descritos en el presente documento, en particular las moléculas
35 de anticuerpo de la invención, se empleen en la prevención y/o tratamiento de neuropatologías asociadas con el procesamiento modificado o anormal de APP y/o amiloidogénesis. Las moléculas de anticuerpo, por ejemplo, en formato de inmunoglobulinas (modificadas por ingeniería), como anticuerpos en una región estructural de IgG, en particular en una región estructural de IgG1, o en formato de anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, Fvs de cadena simple (scFv) o scFvs biespecíficos y similares se emplean en la preparación de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento. Aún, las moléculas de anticuerpo también son útiles en marcos de diagnóstico como se documentan en los ejemplos adjuntos, puesto que las moléculas de anticuerpo de la invención interactúan específicamente con/detectan Aβ4 y/o depósitos/placas de amiloide.
Por lo tanto, un uso de la invención de los compuestos de la presente invención es el uso para la preparación de una
45 composición farmacéutica para un trastorno neurológico que requiere la mejora, por ejemplo, por desintegración de placas de β-amiloide, por aclaramiento de amiloide (placa) o por inmunización pasiva frente a la formación de placa de β-amiloide. Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, las moléculas de anticuerpo de la invención son particularmente útiles en prevenir la agregación de Aβ y en la despolimerización de agregados de amiloide ya formados. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención a emplear en la reducción de depósitos/placas de amiloide patológicos, en el aclaramiento de placas/precursores de placa de amiloide, así como en la protección neuronal. En particular, se prevé que las moléculas de anticuerpo de la invención se emplean en la protección in vivo de placas de amiloide, así como en el aclaramiento in vivo de placas/depósitos de amiloide preexistentes. Además, las moléculas de anticuerpo de la invención se pueden emplear en planteamientos de inmunización pasivos frente a Aβ4. El aclaramiento de depósitos de Aβ4/Aβ4 se puede conseguir, entre otros, mediante el uso médico de
55 anticuerpos de la presente invención que comprenden una parte de Fc. Dicha parte de Fc de un anticuerpo particularmente puede ser útil en respuestas inmunes mediadas por el receptor Fc, por ejemplo, la atracción de macrófagos (células fagocitas y/o microglia) y/o células ayudantes. Para la medición de inmunorespuestas relacionadas con la parte de Fc, la molécula de anticuerpo de la invención preferentemente está en una región estructural de IgG1 (humana). Tal como se discute en el presente documento, el sujeto preferido a tratar con la molécula de anticuerpo de la invención, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican la misma o partes de las mismas, los vectores de la invención o las células hospedantes de esta invención es un sujeto humano. También se prevén otras regiones estructurales, como las regiones estructurales de IgG2a o IgG2b para la molécula de anticuerpo de la invención. Particularmente se prevén regiones estructurales de inmunoglobulina en formato IgG2a e IgG2b en marcos de ratón, por ejemplo, en usos científicos de la molécula de anticuerpo de la invención, por
65 ejemplo, en ensayos en ratones transgénicos que expresan la APP tipo natural (humana) o mutada, fragmentos de APP y/o Aβ4.
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Las enfermedades anteriormente citadas asociadas con amiloidogénesis y/o formación de placa de amiloide comprenden, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, neuropatía motora, enfermedad de Parkinson, ELA (esclerosis lateral amiotrófica), tembladera, demencia relacionada con el VIH, así como la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, hemorragia cerebral hereditaria, con amiloidosis tipo holandés, síndrome de Down y trastornos neuronales relacionados con la vejez. Las moléculas de anticuerpo de la invención y las composiciones proporcionadas en el presente documento también son útiles en la mejora y/o prevención de procesos inflamatorios que se relacionan con amiloidogénesis y/o formación de placa de amiloide.
Por consiguiente, en el presente documento también está descrito un método para tratar, prevenir y/o retrasar trastornos neurológicos y/o neurodegenerativos que comprenden la etapa de administrar a un sujeto que padece de dicho trastorno neurológico y/o neurodegenerativo y/o a un sujeto susceptible de dicho trastorno neurológico y/o neurodegenerativo una cantidad eficaz de la molécula de anticuerpo de la invención, la molécula de ácidos nucleicos de la invención y/o una composición como se definió anteriormente en el presente documento.
También se describe en el presente documento un kit que comprende al menos una molécula de anticuerpo, al menos una molécula de ácidos nucleicos, al menos un vector o al menos una célula hospedadora de la invención. Ventajosamente, el kit comprende, opcionalmente un tampón(tampones), soluciones de almacenamiento y/o reactivos restantes o materiales requeridos para la conducción de los ensayos y propósitos médicos, científicos o de diagnóstico. Además, las partes del kit se pueden empaquetar individualmente en viales o botellas o en combinación en recipientes o unidades de recipiente múltiple.
El kit se puede usar de manera ventajosa, entre otros, para llevar a cabo el método de la invención y se podría emplear en una diversidad de aplicaciones referidas en el presente documento, por ejemplo, como kits de diagnóstico, como herramientas de investigación o herramientas médicas. Además, el kit de la invención puede contener medios para la detección adecuada para propósitos científicos, médicos y/o de diagnóstico. La fabricación de los kits sigue preferentemente procedimientos estándar que son conocidos por los expertos en la técnica.
En el presente documento también se describe un método para la optimización de una molécula de anticuerpo como se definió anteriormente en el presente documento comprendiendo las etapas de:
(a)
construcción de una genoteca de fragmentos de anticuerpo Fab diversificados derivados de un anticuerpo que comprende al menos una CDR3 de una región VH codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NOs: 21, 23 o 25 o al menos una secuencia de aminoácidos de CDR3 de una región VH como se muestra en SEQ ID NOs: 22, 24 o 26.
(b)
ensayo de la genoteca de optimización de Fab resultante por inmunoadsorción (panning) frente a Aβ/Aβ4;
(c)
identificación de clones optimizados; y
(d)
expresión de clones optimizados y seleccionados.
La optimización de los anticuerpos/moléculas de anticuerpo como se describe en el presente documento también está documentada en los ejemplos adjuntos y puede comprender la selección por, por ejemplo, afinidad superior para una o ambas regiones/epítopos de β-A4 como se define en el presente documento o la selección por expresión mejorada y similares. En una realización, dicha selección por afinidad superior por una o ambas regiones/epítopos de β-A4 comprende la selección por alta afinidad a (a) un tramo de aminoácidos que comprende aminoácidos 2 a 10 (o una parte(s) del mismo) de β-A4 y/o (b) un tramo de aminoácidos que comprende aminoácidos 12 a 25 (o una parte(s) del mismo) de β-A4 (SEQ ID NO: 27).
El experto en la técnica fácilmente puede llevar a cabo el método que emplea las enseñanzas de la presente invención. Los protocolos de optimización para anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Estos protocolos de optimización comprenden, entre otros, mutagénesis dirigida por CDR como se describe e ilustra en el presente documento y se describe en Yang (1995), J. Mol. Biol. 25, 392-403; Schier (1996), J. Mol. Biol. 263, 551-567; Barbas (1996), Trends. Biotech 14, 230-34 o Wu (1998) PANS 95, 6.037-6.042; Schier (1996), Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Moore (1997), J. Mol. Biol. 272, 336.
Las técnicas de inmunoadsorción son bien conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Kay (1993), Gene 128, 59
65. Además, publicaciones como Borrebaeck (1995), “Antibody Engineering”, Oxford University, 229-266; McCafferty (1996), “Antibody Engineering”, Oxford University Press; Kay (1996), “A Laboratory Manual”, Academic Press, proporcionan los protocolos de optimización que se pueden modificar según esta invención.
El método de optimización además puede comprender una etapa (ca), por la cual los clones optimizados se optimizan más por mutagénesis en casete, como se ilustra en los ejemplos adjuntos.
El método para la optimización de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento se ilustra más en los ejemplos adjuntos como maduración por afinidad de anticuerpos/moléculas de anticuerpo parentales capaces de reconocer específicamente dos regiones del péptido beta-A4/Abeta4/Aβ/Aβ4/βA4. Preferentemente, dicho Aβ/Aβ4 (también denominado como Aβ4 en el contexto de esta invención) en la etapa (b) del método anteriormente descrito en el presente documento es Aβ/Aβ4 agregado. Dicha inmunoadsorción se puede llevar a cabo (tal como se describe en los ejemplos adjuntos) con severidad de unión aumentada. La severidad se puede incrementar, entre otros, reduciendo la concentración de Aβ/Aβ4 o elevando la temperatura (ensayo). El ensayo de la genoteca optimizada por inmunoadsorción es conocido por los expertos en la técnica y está descrito en Kay (1993), loc. cit. Preferentemente, la identificación en la etapa (c) se lleva a cabo clasificando según los valores
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5 de KD más bajos.
Lo más preferentemente, dicha identificación en la etapa (c) se lleva a cabo por clasificación por koff. La clasificación por koff es conocida por los expertos en la técnica y está descrita en Schier (1996), loc. cit.; Schier (1996), J. Mol. Biol. 255, 28-43 o Duenas (1996), Mol. Immunol. 33, 279-286. Además, la clasificación por koff está ilustrada en los
10 ejemplos adjuntos. La constante de índice off se puede medir como se describe en los ejemplos adjuntos.
Tal como se menciona en el presente documento, se pueden expresar los clones identificados para evaluación adicional. La expresión se puede llevar a cabo por métodos conocidos, entre otros, ilustrados en los ejemplos adjuntos. La expresión puede, entre otros, conducir a fragmentos Fab expresados, scFvs, inmunoglobulinas
15 biespecíficas, moléculas de anticuerpo biespecífico, proteínas de fusión a Fab y/o Fv, o anticuerpos completos, como IgGs, en particular IgG1.
Anticuerpos optimizados, en particular Fabs optimizados o IgGs optimizados, preferentemente IgG1s, se pueden ensayar por métodos como los ilustrados en los ejemplos adjuntos. Tales métodos comprenden, pero no se limitan
20 a, el ensayo de afinidades de unión, la determinación de los valores KD, análisis pepspot, ensayos ELISA, ensayos RIA, ensayos CLIA, estudios (inmuno-) histológicos (por ejemplo, tinción de placas de amiloide), ensayos de despolimerización o fagocitosis de β-A4 dependiente de anticuerpo.
En el presente documento se describe un método en el que los anticuerpos optimizados se generan por clonación
25 cruzada. Este método también se ilustra en los ejemplos adjuntos y comprende la etapa de combinar regiones CDR independientemente optimizadas, por ejemplo, combinando H-CDR2 y L-CDR2 independientemente optimizadas de clones maduros con H-CDR3, preferentemente el mismo H-CDR3.
También se describe un método para la precipitación de una composición farmacéutica que comprende las etapas 30 de:
(a) optimización de un anticuerpo según el método descrito en el presente documento e ilustrado en los ejemplos adjuntos; y
(b) formulación del anticuerpo/molécula de anticuerpo optimizado con un vehículo fisiológicamente aceptable, 35 como anteriormente se describió en el presente documento.
Por consiguiente, la invención también proporciona una composición farmacéutica preparada por el método descrito en el presente documento y que comprende además moléculas de anticuerpo optimizadas capaces de reconocer específicamente dos regiones del péptido beta-A4/Abeta4/Aβ/βA4, como se describió anteriormente en el presente
40 documento.
Secuencias de ejemplo como se enumeran en el presente documento:
SEQ ID NO: 1
45 AEFRHDSGY Primera región de péptido β-A4, “región/epítopo N-terminal”
SEQ ID NO: 2 VHHQKLVFFAEDVG
50 Segunda región de péptido β-A4, “región/epítopo central/medio”
SEQ ID NO: 3
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SEQ ID NO: 4 Región VH de MS-Roche nº 3 (secuencia de aminoácidos)
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SEQ ID NO: 5 Región VH de MS-Roche nº 7 (secuencia de ácidos nucleicos)
imagen14
SEQ ID NO: 6 Región VH de MS-Roche nº 7 (secuencia de aminoácidos)
imagen15
SEQ ID NO: 7
imagen16
SEQ ID NO: 8 Región VH de MS-Roche nº 8 (secuencia de aminoácidos)
imagen17
SEQ ID NO: 9 Región VL de MS-Roche nº 3 (secuencia de ácidos nucleicos)
imagen18
SEQ ID NO: 10 Región VL de MS-Roche nº 3 (secuencia de aminoácidos)
imagen19
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SEQ ID NO: 11 Región VL de MS-Roche nº 7 (secuencia de ácidos nucleicos)
imagen21
SEQ ID NO: 12 Región VL de MS-Roche nº 7 (secuencia de aminoácidos)
imagen22
SEQ ID NO: 13 Región VL de MS-Roche nº 8 (secuencia de ácidos nucleicos)
imagen23
SEQ ID NO: 14 Región VL de MS-Roche nº 8 (secuencia de aminoácidos)
imagen24
SEQ ID NO: 15 CDR3 de región VL de MSR-3 (secuencia de ácidos nucleicos) CAGCAGGTTTATAATCCTCCTGTT (SEQ ID NO: 15)
25 SEQ ID NO: 16 CDR3 de región VL de MSR-3 (secuencia de aminoácidos) QQVYNPPV (SEQ ID NO: 16)
30 SEQ ID NO: 17 CDR3 de región VL de MSR-7 (secuencia de ácidos nucleicos) TTTCAGCTTTATTCTGATCCTTTT (SEQ ID NO: 17)
SEQ ID NO: 18 35 CDR3 de región VL de MSR-7 (secuencia de aminoácidos) FQLYSDPF (SEQ ID NO: 18)
SEQ ID NO: 19 CDR3 de región VL de MSR-8 (secuencia de ácidos nucleicos) 40 CAG CAG CTT TCT TCT TTT CCT CCT (SEQ ID NO: 19)
SEQ ID NO: 20 CDR3 de región VL de MSR-8 (secuencia de aminoácidos) QQLSSFPP (SEQ ID NO: 20)
SEQ ID NO: 21 CDR de región VH de MSR-3 (secuencia de ácidos nucleicos) CTTACT CATTAT GCTCGTTATTAT CGTTATTTT GAT GTT (SEQ ID NO: 21)
5 SEQ ID NO: 22 CDR de región VH de MSR-3 (secuencia de aminoácidos) LTHYARYYRYFDV (SEQ ID NO: 22)
10 SEQ ID NO: 23 CDR de región VH de MSR-7 (secuencia de ácidos nucleicos) GGT AAG GGT AAT ACT CAT AAG CCT TAT GGT TAT GTT CGT TAT TTT GAT GTT (SEQ ID NO: 23)
SEQ ID NO: 24 15 CDR de región VH de MSR-7 (secuencia de aminoácidos) GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 24)
SEQ ID NO: 25 CDR de región VH de MSR-8 (secuencia de ácidos nucleicos) 20 CTT CTT TCT CGT GGT TAT AAT GGT TAT TAT CAT AAG TTT GAT GTT (SEQ ID NO: 25)
SEQ ID NO: 26 CDR de región VH de MSR-8 (secuencia de aminoácidos) LLSRGYNGYYHKFDV (SEQ ID NO: 26)
25 SEQ ID NO: 27 Aβ4 (aminoácidos 1 a 42) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 27)
SEQ ID NO: 28 cebador 30 5’-GTGGTGGTTCCGATATC-3’ (SEQ ID NO: 28)
SEQ ID NO: 29 cebador 5’-AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGTTA-3’ (SEQ ID NO: 29)
35 SEQ ID NO: 30 cebador 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ (SEQ ID NO: 30)
SEQ ID NO: 31 cebador 5’-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3’ (SEQ ID NO: 31) 40 SEQ ID NO: 32 VH de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; ADN; secuencia artificial
imagen25
SEQ ID NO: 33: región VH de proteína de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen26
SEQ ID NO: 34 región VH de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; ADN; secuencia artificial
imagen27
SEQ ID NO: 35 región VH de proteína de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen28
SEQ ID NO: 36 región VH de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; ADN; secuencia artificial
imagen29
SEQ ID NO: 37 región VH de proteína de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial
imagen30
SEQ ID NO: 38 región VH de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; ADN; secuencia artificial
imagen31
SEQ ID NO: 39 región VH de proteína de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen32
SEQ ID NO: 40 región VH de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; ADN; secuencia artificial
imagen33
SEQ ID NO: 41 región VH de proteína de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen34
SEQ ID NO: 42 región VH de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; ADN; secuencia artificial
imagen35
SEQ ID NO: 43 región VH de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; proteína/1; secuencia artificial
imagen36
SEQ ID NO: 44 región VH de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; ADN; secuencia artificial
imagen37
SEQ ID NO: 45 región VH de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial
imagen38
SEQ ID NO: 46 región VL de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; ADN; secuencia artificial
imagen39
SEQ ID NO: 47 región VL de proteína de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen40
SEQ ID NO: 48 región VL de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; ADN; secuencia artificial
imagen41
SEQ ID NO: 49 región VL de proteína de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen42
SEQ ID NO: 50 región VL de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; ADN; secuencia artificial
imagen43
SEQ ID NO: 51 región VL de proteína de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial
imagen44
SEQ ID NO: 52 región VL de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; ADN; secuencia artificial
imagen45
SEQ ID NO: 53 región VL de proteína de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen46
SEQ ID NO: 54 región VL de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; ADN; secuencia artificial
imagen47
imagen48
SEQ ID NO: 55 región VL de proteína de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial
imagen49
SEQ ID NO: 56 región VL de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; ADN; secuencia artificial
imagen50
SEQ ID NO: 57 región VL de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; proteína/1; secuencia artificial
imagen51
SEQ ID NO: 58 región VL de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; ADN; secuencia artificial
imagen52
SEQ ID NO: 59 región VL de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial
imagen53
SEQ ID NO: 60 región HCDR3 de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; ADN; secuencia artificial CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 60)
25 SEQ ID NO: 61 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial LTHYARYYRYFDV (SEQ ID NO: 61)
SEQ ID NO: 62 región HCDR3 de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; ADN; secuencia artificial CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 62)
30 SEQ ID NO: 63 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial LTHYARYYRYFDV (SEQ ID NO: 63) SEQ ID NO: 64 región HCDR3 de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; ADN; secuencia artificial GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 64)
imagen54
SEQ ID NO: 65 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial 5 GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 65)
SEQ ID NO: 66 región HCDR3 de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; ADN; secuencia artificial GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 66)
SEQ ID NO: 67 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 67)
SEQ ID NO: 68 región HCDR3 de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; ADN; secuencia artificial GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 68)
15 SEQ ID NO: 69 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 69)
SEQ ID NO: 70 región HCDR3 de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; ADN; secuencia artificial GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 70)
SEQ ID NO: 71 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; proteína/1; secuencia artificial GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 71)
25 SEQ ID NO: 72 región HCDR3 de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; ADN; secuencia artificial GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT (SEQ ID NO: 72)
SEQ ID NO: 73 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 73)
SEQ ID NO: 74 región LCDR3 de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; ADN; secuencia artificial CAGCAGACTTATAATTATCCTCCT (SEQ ID NO: 74)
SEQ ID NO: 75 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº3.6H5x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial 35 QQTYNYPP (SEQ ID NO: 75)
SEQ ID NO: 76 región LCDR3 de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; ADN; secuencia artificial CAGCAGACTTATAATTATCCTCCT (SEQ ID NO: 76)
SEQ ID NO: 77 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº3.6H8x3.6L2; proteína/1; secuencia artificial QQTYNYPP (SEQ ID NO: 77)
SEQ ID NO: 78 región LCDR3 de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; ADN; secuencia artificial CAGCAGATTTATTCTTTTCCTCAT (SEQ ID NO: 78)
45 SEQ ID NO: 79 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.4H2x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial QQIYSFPH (SEQ ID NO: 79)
SEQ ID NO: 80 región LCDR3 de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; ADN; secuencia artificial CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT (SEQ ID NO: 80)
SEQ ID NO: 81 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.9H2x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial LQLYNIPN (SEQ ID NO: 81)
55 SEQ ID NO: 82 región LCDR3 de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; ADN; secuencia artificial CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT (SEQ ID NO: 82)
SEQ ID NO: 83 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.9H4x7.12L2; proteína/1; secuencia artificial LQLYNIPN (SEQ ID NO: 83)
SEQ ID NO: 84 región LCDR3 de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; ADN; secuencia artificial CAGCAGGTTTATTCTCCTCCTCAT (SEQ ID NO: 84)
SEQ ID NO: 85 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.11L1; proteína/1; secuencia artificial 65 QQVYSPPH (SEQ ID NO: 85)
SEQ ID NO: 86 región LCDR3 de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; ADN; secuencia artificial CAGCAGATTTATTCTTTTCCTCAT (SEQ ID NO: 86)
SEQ ID NO: 87 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.11H1x7.2L1; proteína/1; secuencia artificial QQIYSFPH (SEQ ID NO: 87)
SEQ ID NO: 88 región VH de MS-Roche nº7.9H7; ADN; secuencia artificial
imagen55
SEQ ID NO: 89 región VH de proteína de MS-Roche nº7.9H7; proteína/1; secuencia artificial
imagen56
SEQ ID NO: 90 región VL de MS-Roche nº7.9H7; ADN; secuencia artificial
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SEQ ID NO: 91 región VL de proteína de MS-Roche nº7.9H7; proteína/1; secuencia artificial
imagen58
SEQ ID NO: 92 región HCDR3 de MS-Roche nº7.9H7; ADN; secuencia artificial Ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt (SEQ ID NO: 92)
25 SEQ ID NO: 93 región HCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.9H7; proteína/1; secuencia artificial GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO: 93)
SEQ ID NO: 94 región LCDR3 de MS-Roche nº7.9H7; ADN; secuencia artificial 30 Cttcagatttataatatgcctatt (SEQ ID NO: 94)
SEQ ID NO: 95 región LCDR3 de proteína de MS-Roche nº7.9H7; proteína/1; secuencia artificial LQIYNMPI (SEQ ID NO: 95)
35 Secuencias ilustrativas adicionales se representan en el listado de secuencia adjunto y también se muestran en las tablas adjuntas, en particular en las tablas 1, 8 y 10.
Las Figuras muestran:
40 Figura 1. Compendio de secuencia de la genoteca HuCAL®-Fab1. La numeración según VBASE excepto el hueco (gap) en la posición 9 de VLλ. En VBASE el hueco se fija en la posición 10 (Chothia y col., 1992). En el compendio de secuencia todos los residuos CDR3 que se mantienen constantes están
indicados. Se pueden encontrar secuencias correspondientes empleadas para la genoteca HuCAL-Fab1 en el listado de secuencia adjunto.
5
A: secuencia de aminoácidos B: secuencia de ADN.
Figura 2
vector pMORPH®18_Fab de manifestación de Fab. Mapeado del incluyendo los sitios de restricción. vector y secuencia de ADN
Figura 3.
Vector pMORPH®x9_Fab de expresión de Fab. Mapeado del vector y secuencia de ADN incluyendo los sitios de restricción.
Figura 4.
Secuencias de los fragmentos Fab parentales MS-Roche-3, MS-Roche-7 y MS-Roche-8
15
A: secuencia de aminoácidos B: secuencia de ADN
Figura 5:
inmunofluorescencia indirecta de placas de amiloide de una sección de criostato de córtex temporal humano. Las placas se marcaron con MS-R Nº 3.2 Fab (paneles superiores) y MS-R Nº 7.4 Fab (paneles inferiores) a 20 µ/ml (paneles de la izquierda) y 5 µg/ml (paneles de la derecha) bajo condiciones de bloqueo estricto. El MS-R Fab unido se reveló mediante anti-Cy3 humano de cabra.
25
Figura 6 inmunofluorescencia indirecta de placas de amiloide de una sección de criostato de córtex temporal humano. Las placas se marcaron con MS-R Nº 3.3 IgG1 (paneles superiores) y MS-R Nº 7.12 IgG1 (paneles inferiores) a 0,05 µg/ml (paneles de la izquierda) y 0,01 µg/ml (paneles de la derecha) bajo condiciones de bloqueo estricto. El anticuerpo MS-R IgG1 unido se reveló mediante anti-(H+L)-Cy3 humano de cabra.
Figura 7:
inmunofluorescencia indirecta de placas de amiloide de una sección de criostato de córtex temporal humano usando anticuerpos después de la maduración por afinidad final. Las placas se marcaron con MS-R Nº 7.9H7 IgG1 (MAB 31, panel superior), MS-R Nº 7.11H1x7.2L1 IgG1 (MAB 11, panel medio) y MS-R Nº 3.4H7 (panel inferior). Los anticuerpos se usaron a 0,05 µg/ml (paneles de la izquierda) y 0,01 µg/ml (paneles de la derecha) bajo condiciones de bloqueo estricto. El anticuerpo MS-R IgG1 unido se reveló mediante anti-(H+L)-Cy3 humano de cabra. Escala: 8,5 mm = 150 µm.
35 Figura 8: Ensayo de polimerización. Los anticuerpos anti-Aβ previenen la incorporación de Aβ biotinilado en agregados Aβ preformados.
Figura 9: Ensayo de despolimerización. Los anticuerpos anti-Aβ inducen la liberación de Aβ biotinilado de Aβ agregado.
Figura 10: La decoración in vivo de las placas de amiloide en un ratón transgénico doble por APP/PS2 después de la inyección intravenosa de 1 mg de MS-Roche IgG Nº 7.9H2x7.12L2. Después de tres días el ratón se perfundió con solución salina tamponada con fosfato y se sacrificó. La presencia de IgG
45 humano unido a placas de amiloide se reveló por microscopía confocal después de marcar secciones de criostato del córtex frontal con un anti-conjugado IgG-Cy3 humano de cabra (panel B). La misma sección se sometió a contraste con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Abeta (conjugado BAP-2-Alexa488, panel A) para visualizar la posición de las placas de amiloide. Se muestran los canales individuales rojo (panel B) y verde (panel A), las señales de imagen fusionadas (panel D) y colocalizadas (panel C). Escala: 1 cm = 50 µm.
Figura 11: La decoración in vivo de las placas de amiloide en un ratón transgénico doble por APP/PS2 después de la inyección intravenosa de 1 mg de MS-Roche IgG Nº 7.9H4x7.12L2. Las condiciones experimentales y el procedimiento de tinción eran idénticos a los descritos en la leyenda de la figura
55 10. Escala: 1,6 = 50 µm.
Figura 12: La decoración in vivo de las placas de amiloide en un ratón transgénico doble por APP/PS2 después de la inyección intravenosa de 1 mg de MS-Roche IgG Nº 7.11H1x7.2L1 (MAB). Las condiciones experimentales y el procedimiento de tinción eran idénticos a los descritos en la leyenda de la figura
10. Escala: 1,4 = 70 µm.
Figura 13: La decoración in vivo de las placas de amiloide en un ratón transgénico doble por APP/PS2 después de la inyección intravenosa de 2 mg de MS-Roche IgG Nº 7.9H7 (MAB 31) en el día 0, 3 y 6. Después de nueve días el ratón se perfundió con solución salina tamponada con fosfato y se sacrificó. La 65 presencia de IgG humano unido a placas de amiloide se reveló por microscopía confocal después de marcar secciones de criostato del córtex frontal con un anti-conjugado IgG-Cy3 humano de cabra
imagen59
5 D).
Figura 14: La decoración in vivo de las placas de amiloide en un ratón transgénico doble por APP/PS2 después de inyección intravenosa de 2 mg de MS-Roche IgG Nº 7.11H1x7.2L1 (MAB 11) en el día 0, 3 y 6. Las condiciones experimentales y el procedimiento de tinción eran idénticos a los descritos en la leyenda de la figura 13. Escala: 1,6 cm = 80 µm.
Figura 15: análisis de unión de anticuerpos anti-Aβ a APP de superficie celular. La unión del anticuerpo a células HEK293 sometidas a transfección con APP y células control no sometidas a transfección se analizó por citometría de flujo.
15 Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1: Construcción y Cribado de una genoteca de anticuerpo combinatorio humano (HuCAL®-Fab1)
Clonación de HuCAL®-Fab1
HuCAL®-Fab1 es una genoteca de anticuerpo humano modular completamente sintético en el formato de fragmento de anticuerpo Fab. El HuCAL®-Fab1 se ensambló comenzando desde una genoteca de anticuerpo en el formato de cadena simple (HuCAL®-scFv; Knappik, (2000), J. Mol. Biol. 296, 57-86).
25 Posiciones 1 y 2 de Vλ. Los genes maestros de HuCAL® originales se construyeron con sus auténticos terminales
N: VLλ1: QS (CAGAGC), VLλ2: QS (CAGAGC) Y VLλ3: SY (AGCTAT). Las secuencias que contienen estos aminoácidos se muestran en el documento WO 97/08320. Durante la construcción de la genoteca HuCAL®, los dos primeros aminoácidos se cambiaron a DI para facilitar la clonación de la genoteca (sitio EcoRI). Todas las genotecas HuCAL® contienen genes VLλ con el sitio EcoRV GATATC (DI) en el extremo 5’. Todos los genes kappa de HuCAL® (genes maestros y todos los genes en la genoteca) contienen DI en el extremo 5’ (figura 1A y B).
Posición 1 de VH: Los genes maestros de HuCAL® originales se construyeron con sus auténticos terminales N: VH1A, VH1B, VH2, VH4 y VH6 con Q (=CAG) como el primer aminoácido y VH3 y VH5 con E (=GAA) como el
35 primer aminoácido. Las secuencias que contienen estos aminoácidos se muestran en el documento WO 97/08320. Durante la clonación de la genoteca HuCAL®-Fab1, el aminoácido en la posición 1 de VH se cambió a Q (CAG) en todos los genes VH (figura 1A y B).
Diseño de las genotecas CDR
Posición 85 de Vκ1/Vκ3. Debido al procedimiento de mutagénesis por casete usada para introducir la genoteca de CDR3 (Knappik, (2000), loc. cit.), la posición 85 de Vκ1 y Vκ3 puede ser o bien T o V. Así, durante la construcción de la genoteca HuCAL®-scFv1, la posición 85 de Vκ1 y Vκ3 se varió tal como sigue: Vκ1 original, 85T (codón ACC); genoteca de Vκ1, 85T u 85V (codones TRIM ACT o GTT); Vκ3 original, 85V (codón GTG); genoteca Vκ3, 85T o 85V
45 (codones TRIM ACT o GTT); lo mismo se aplica a HuCAL®-Fab1.
Diseño de CDR3. Todos los residuos CDR3, que se mantuvieron constantes, están indicados en la figura 1A y B.
Longitud de CDR3. La distribución en longitud de CDR3 diseñada es como sigue. Los residuos, que se variaron se muestran entre paréntesis (x) en la figura 1. CDR3 de V kappa, 8 residuos de aminoácidos (posición 89 a 96) (ocasionalmente 7-10 residuos), con Q89, S90 y D92 fijados; y VH CDR3, 5 a 28 residuos de aminoácidos (posición 95 a 102) (ocasionalmente 4-28) con D101 fijado.
HuCAL®-Fab1 se clonó en un vector de expresión fagómido pMORPH®18_Fab1 (figura 2). Este vector comprende
55 el fragmento Fd con una secuencia señal phoA fusionada en el terminal C a una proteína de gen III truncada de fago filamentoso, y comprende además la VL-CL de cadena ligera con una secuencia señal ompA. Ambas cadenas están bajo el control del operón lac. Los dominios constantes Cλ Cκ y CH1 son genes sintéticos completamente compatibles con el sistema modular de HuCAL® (Knappik, (2000), loc. cit.).
La cadena completa de VH (fragmento Munl/Styl) se reemplazó con un fragmento patrón (dummy) de 1.205 pb que contiene la unidad de transcripción de β-lactamasa (bla), facilitando de ese modo etapas posteriores para la preparación del fragmento vector y permitiendo la selección de la completa separación de VH.
Después del reemplazo de VH, se separó VLλ por EcoRI/Drall y VLκ por EcoRI/BsIWI y se reemplazaron con el 65 fragmento de gen de fosfatasa alcalina bacteriana (bap) (1.420 pb).
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Como la variabilidad de las cadenas ligeras es menor que la de las cadenas pesadas, se empezó la clonación con las genotecas de la cadena ligera. Las genotecas de la cadena ligera VLλ y VLκ diversificadas en L-CDR3, que se generaron para la genoteca de HuCAL®-scFv (Knappik, (2000), loc. cit.), también se usaron para la clonación de HuCAL®-Fab1. En el caso de λ consistían en λ1-, λ2-y λ3-HuCAL®-región estructural y tenían una variabilidad total de 5.7x106. Fragmentos VLλ se amplificaron mediante 15 ciclos de PCR (Pwo-polimerasa) con cebadores 5’-GTGGTGGTTCCGATATC-3’ (SEQ ID NO: 28) y 5’-AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGTTA-3’ (SEQ ID NO: 29). Los productos de PCR se digirieron con EcoRV/Drall y se purificaron con gel. En el caso de la genoteca de VLλ, se separó el bap-dummy por EcoRV/Drall del vector de la genoteca. Se ligaron 2 µg del vector gel purificado con un exceso de 3 veces molar de cadenas de VLλ durante 16 h a 16ºC, y las mezclas de ligación se sometieron a electroporización en 800 µl de células TOP10F de E. coli (Invitrogen), produciendo todo junto 4.1 x 108 colonias independientes. Los transformantes se amplificaron aproximadamente 2.000 veces en 2 x YT/glucosa al 1 %/34 µg/ml de cloranfenicol/100 µg/ml de ampicilina, se recogieron y se almacenaron en glicerol al 20 % (p/v) a -80 ºC.
Las genotecas κ comprenden los genes maestros de HuCAL® de κ1, κ2, κ3 y κ4 con una variabilidad total de 5,7 x
106. Las cadenas de VLκ se obtuvieron por digestión por restricción con EcoRV/BsiWI y se purificó con gel. En el caso de la genoteca VLκ, el bap-dummy se separó por el EcoRV/BsiWI del vector de la genoteca. 2 µg del vector gel purificado se mezclaron con un exceso de 5 veces molar de cadenas de VLκ. La ligación y la transformación en las células TOP10F de E. coli (Invitrogen) se realizaron como se describe para las cadenas de VLλ, produciendo todo junto 1,6 x 108 colonias independientes.
Se preparó el ADN de las dos genotecas de cadena ligera y el bla-dummy se separó por MunI/Styl, generando de ese modo los dos vectores para la inserción de las subgenotecas de VH. Las genotecas de VH de HuCAL®-scFv se usaron para la generación de HuCAL®-Fab1. Las genotecas de VH de HuCAL®-scFv consisten en los genes maestros VH1A/B-6 diversificados con dos casetes de genoteca de trinucleótidos de VH-CDR3 que difieren en longitud de CDR3 por separado, y cada genoteca de VH combinada con la genoteca de VLκ y con la de VLλ. Para la generación de HuCAL®-Fab1 se preparó ADN de estas genotecas de VH conservando la variabilidad original. El ADN se digirió con MunIIStyl y se purificó con gel. Un exceso de 5 veces molar de las cadenas de VH se ligaron con 3 µg del vector de la genoteca de VLλ y con 3 µ del vector de la genoteca de VLλ durante 4 h a 22ºC. Las mezclas de ligación se sometieron a electroporación para cada vector en 1.2000 µl de células TOP10F de E. coli (Invitrogen), produciendo todo junto 2,1 x 1010 colonias independientes. Los transformantes se amplificaron aproximadamente
4.000 veces en 2 x YT/glucosa al 1%/34 µg/ml de cloranfenicol/10 µg/ml de tetraciclina, se recogieron y se almacenaron en glicerol al 20 % (p/v) a -80 ºC.
Como control de calidad la cadena ligera y la cadena pesada de los clones sencillos se secuenciaron con 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’ (SEQ ID NO: 30) y 5’-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3’ (SEQ ID NO: 31), respectivamente.
Rescate del fagómido, amplificación y purificación del fago.
Se amplificó HuCAL®-Fab1 en medio 2 x TY que contenía 34 µg de cloranfenicol, 10 µg/ml de tetraciclina y glucosa al 1 % (2 x TY-CG). Después de la infección por fago ayudante (VCSM13) a 37 ºC a una DO600 de aproximadamente 0,5, centrifugación y resuspensión en 2 x TY/ 34 µg/ml de cloranfenicol/ 50 µg/ml de kanamicina, las células se dejaron crecer durante la noche a 30 ºC. El fago se precipitó con PEG desde el sobrenadante (Ausubel, (1998), Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, EEUU), se resuspendieron en PBS/glicerol al 20% y se almacenaron a -80 ºC. La amplificación del fago entre dos rondas de inmunoadsorción se condujeron tal como sigue: las células TG1 de la fase logarítmica media se infectaron con fago eluido y se colocaron en placa sobre agar LB complementado con 1 % de glucosa y 34 µg/ml de cloranfenicol. Después de incubación durante toda la noche a 30 ºC, las colonias se desecharon, se ajustaron a una DO600 de 0,5 y se añadió fago ayudante como se describió anteriormente.
Ejemplo 2: inmunoadsorción de la fase sólida
Se recubrieron pocillos de placas de microtitulación Maxi Sorp™ F96 (Nuc) con 100 µl de péptido Aβ (1-40) humano 2,5 µM (Bachem) disueltos en TBS que contenía NaN3 (0,05 % v/v) y la placa sellada se incubó durante 3 días a 37 ºC donde el péptido es propenso a agregarse sobre la placa. Después del bloqueo con leche secada sin grasa al 5 % en TBS, se añadieron 1-5 x 1012 fagos de HuCAL®-Fab purificados como anteriormente durante 1 hora a 20 ºC. Después de diversas etapas de lavado, los fagos unidos se eluyeron mediante elución por pH con NaCl 500 mM, glicina 100 mM pH 2,2 y neutralización posterior con TRIS-Cl 1 M pH 7. Se realizaron tres rondas de inmunoadsorción con amplificación de fago conducida entre cada ronda como se describió anteriormente, la severidad del lavado se incrementó de ronda en ronda.
Ejemplo 3: Subclonación de fragmentos Fab seleccionados para expresión
Se subclonaron los insertos codificadores de Fab de los fragmentos HuCAL®-Fab seleccionados en el vector de expresión pMORPH®x7_FS para facilitar la rápida expresión de Fab soluble. La preparación de ADN de los clones
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de HuCAL®-Fab seleccionados se digirieron con Xbal/EcoRI, cortando así el inserto codificador de Fab (ompA-VL y phoA-Fd). La subclonación de los insertos purificados en el vector pMORPH®x7 cortado con Xbal/EcoRI, llevándose a cabo previamente un inserto de scFv, conduce a un vector de expresión Fab denominado pMORPH®x7_Fab1 (figura 3). Los Fabs expresados en este vector lleva dos etiquetas C-terminales (FLAG y Strep) para la detección y purificación.
Ejemplo 4: Identificación de los fragmentos Fab de unión a Aβ por ELISA
Se recubrieron pocillos de placas de microtitulación Maxisorp™ F384 (Nuc) con 20 µl de péptido Aβ (1-40) humano 2,5 µM (Bachem) disueltos en TBS que contenía NaN3 (0,05 % v/v) y la placa sellada se incubó durante 3 días a 37 ºC, donde el péptido es propenso a agregarse sobre la placa. La expresión de Fab individual se indujo con IPTG 1 mM durante 16 h a 22 ºC. El Fab soluble se extrajo de E. coli por lisis BEL (ácido bórico, NaCl, EDTA y lisozima que contiene tampón pH 8) y se usó en un ensayo ELISA. El fragmento Fab se detectó con un anticuerpo anti-Fab de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Dianova/Jackson Immuno Research). Después de excitación a 340 nm se leyó la emisión a 535 nm después de la adición del sustrato de fluorescencia AttoPhos (Roche Diagnostics).
Ejemplo 5: Optimización de fragmentos de anticuerpo
Para optimizar la afinidad de unión de los fragmentos de anticuerpo de unión a Aβ seleccionados, algunos de los fragmentos Fab, MS-Roche-3 (MSR-3), MS-Roche-7 (MSR-7) y MS-Roche-8 (MSR-8) (figura 4), se usaron para construir una genoteca de fragmentos de anticuerpo Fab reemplazando la cadena VLκ3 parental mediante el acervo de todas las cadenas kappa κ1-3 diversificadas en CDR3 de la genoteca HuCAL® (Knappik y col., 2.000).
Los fragmentos Fab MS-Roche-3, 7 y 8 se clonaron por Xbal/EcoRI de pMORPH®x9_FS en pMORPH®18, un vector basado en fagómido para manifestación por fago de fragmentos Fab, para generar pMORPH®18_Fab1 (figura 2). Se clonó un acervo de cadena kappa en pMORPH®18_Fab1 por los sitios de restricción Xbal/Sphl.
La genoteca de optimización de Fab resultante se somete a cribado por inmunoadsorción frente a péptido Aβ (1-40) humano agregado revestido con un soporte sólido como se describe en el ejemplo 2.
Los clones optimizados se identificaron mediante clasificación por koff en un ensayo Biacore como se describe en el Ejemplo 8. Los clones optimizados MS-Roche-3.2, 3.3, 3.4, 3.6, 7.2, 7.3, 7.4, 7.9, 7.11, 7.12, 8.1, 8.2, se caracterizaron más y mostraron afinidad y actividad biológica mejorada en comparación con el fragmento de partida MS-Roche-3, MS-Roche-7 y MS-Roche-8 (figura 4). Las CDRs enumeradas se refieren al gen de anticuerpo basado en consenso HuCAL® VH3kappa3. El fragmento Fab MS-Roche-7.12 se obtuvo clonando la HCDR3 del clon parental MS-R 7 en un genoteca HuCAL®-Fab, que porta diversidad en todas las 6 regiones CDR usando un procedimiento de diseño idéntico al de los casetes de CDR3 descrito en Knappik y col., 2000. Los casetes de genoteca se diseñaron fuertemente sesgados para la distribución natural conocida de aminoácidos y siguiendo el concepto de las conformaciones de CDR canónicas establecidas por Allazikani (Allazikani y col., 1997). Sin embargo, a diferencia de los genes maestros de HuCAL®, el clon MS-Roche 7.12 contiene el aminoácido S en la posición 49 de la cadena VL (véase la tabla adjunta 1).
Los Fabs optimizados después de la primera ronda de maduración por afinidad mostraron características mejoradas sobre los clones MS-Roche-3, MS-Roche-7 y MS-Roche-8 de partida (Figura 4). Las afinidades de unión de los Fabs madurados a Aβ1-40 y Aβ1-42 se incrementaron significativamente produciendo valores KD en el intervalo de 22-240 nM en comparación con 850-1.714 nM de los clones parentales (Tabla 3). El análisis de inmunohistoquímico de las placas de amiloide en secciones de cerebro con AD humano también mostró un perfil de tinción significativamente incrementado de los clones madurados, es decir, se obtuvieron mejores relaciones de señal y ruido de fondo y se detectó tinción de placa positiva a concentraciones relativamente bajas de los Fabs madurados (Figura 5).
Para más optimización, las regiones VH CDR2 y las regiones VL CDR1 de un conjunto de fragmentos de anticuerpo derivados de MS-Roche-3, -7, y -8 optimizados con L-CDR3 (tabla 1; figura 4) se optimizaron mediante mutagénesis de casete usando mutagénesis dirigida a trinucleótido (Virnekäs y col., 1994). Por lo tanto, se construyeron un casete de HCDR2 basado en trinucleótido y un casete de LCDR1 basado en trinucleótido usando un procedimiento de diseño idéntico al de los casetes de CDR3 descrito en Knappik y col., 2000. Los casetes de genoteca se diseñaron fuertemente sesgados para la distribución natural conocida de aminoácidos y siguiendo el concepto de las conformaciones de CDR canónicas establecidas por Allazikani (Allazikani y col., 1997). El protocolo usado para la optimización de los fragmentos de anticuerpo seleccionados iniciales mimetizarían el proceso de maduración por afinidad mediante hipermutación somática observada durante la respuesta inmune natural.
Las genotecas resultantes se someten a cribado por separado tal como se describió anteriormente conduciendo a clones optimizados o bien en la región H-CDR2 o en la L-CDR1. Todos los clones se identificaron como anteriormente por un koff mejorado hacia fibras Aβ1-40 después de una clasificación por koff en el Biacore y mostraron afinidad mejorada o bien para Aβ1-40 o Aβ-42 o ambos cuando se compararon con el correspondiente clon parental (Tabla 3). La Tabla 1 contiene las características de secuencia parentales, así como las secuencias de los clones optimizados. Las CDRs enumeradas se refieren al gen de anticuerpo basado en el consenso de HuCAL®
VH3kappa3.
Por ejemplo, la afinidad del Fab parental MS-Roche-7 hacia Aβ1-40 se mejoró unas 35 veces desde 1.100 nM a 31 nM después de optimización con LCDR3 (MS-Roche-7.9) y se mejoró más a 5 nM después de optimización con H5 CDR2 (MS-Roche-7.9H2) como se ilustra en la Tabla 3.
El procedimiento de optimización con HCDR2 y LCDR1 no solamente incrementó la afinidad sino también dio como resultado para algunos de los clones una tinción significativamente mejorada de placas de amiloide en la sección de cerebro con AD, como particularmente se ve con MS-Roche 7.9H2 y 7.9H3.
10 Tabla 1
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5
15
25
35
45
55
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Ejemplo 6
Construcción de vectores de expresión de inmunoglobulina de HuCAL®
Clonación de cadena pesada. El sitio de clonación múltiple de pcDNA3.1+ (Invitrogen) se separó (Nhel/Apal), y se insertó una región de relleno (stuffer) compatible con los sitios de restricción usados para el diseño de HuCAL® para la ligación de las secuencias líder (Nhel/EcoRI), dominios de VH (Munl/), y las regiones constantes de inmunoglobulina (Blpl/lApal). La secuencia líder (EMBL 83133) se equipó con una secuencia Kozak (Kozak, 1997). Las regiones constantes de la IgG humana (PIR A02146), IgG4 (EMBL K01316), e IgA1 de suero (EMBL J00220) se analizaron minuciosamente en los oligonucleótidos de superposición con longitud de aproximadamente 70 bases. Se introdujeron mutaciones silenciosas para separar los sitios de restricción no compatibles con el diseño HuCAL®. Los oligonucleótidos se sometieron a corte y empalme por PCR de extensión por superposición.
Durante la subclonación de Fab en IgG, se cortó la secuencia de ADN de VH del Fab por MfeI/BlpI y se ligó en el vector de IgG abierto por EcoRI/bopI. Eco I (g/aattc) y Mfe I (claattg) comparten extremos cohesivos compatibles (aatt) y la secuencia de ADN del sitio MfeI original en los cambios de Fab: c/aattg a: g/aattg después de ligación en el vector de expresión de IgG, destruyendo de ese modo tanto el sitio MfeI como EcoRI, conduciendo así también a un cambio de aminoácido de Q (codón: caa) a E (codón: gaa).
Clonación de cadena ligera. El sitio de clonación múltiple de pcDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen) se reemplazó por dos regiones de relleno diferentes. La región de relleno de κ proporcionó sitios de restricción para la inserción de un líder de κ (Nhel/EcoRV), dominios de Vκ de HuCAL®-scFv (EcoRV/BsiWI), y la región constante de cadena κ (BsiWI/Apal). Los correspondientes sitios de restricción en la región de relleno de λ eran Nhel/EcoRV (λ-líder), EcoRV/Hpal (dominios de Vλ), y Hpal/Apal (región constante de cadena λ). El líder de κ (EMBL Z00022) así como el líder de λ (EMBL J00241) ambos se equiparon con secuencias Kozak. Las regiones constantes de la cadena κ (EMBL L00241) y la cadena λ humana (EMBL M18645) se ensamblaron mediante PCR de extensión por superposición como se describió anteriormente.
Generación de células CHO que expresan IgG. Las células CHO-K1 se sometieron a transfección conjunta con una mezcla equimolar de vectores de expresión de cadena pesada y ligera de IgG. Se seleccionaron transfectados doblemente resistentes con 600 µg/ml de G418 y 300 µg/ml de Zeocin (Invitrogen) seguido de dilución limitante. Se valoró la expresión de IgG en el sobrenadante de clones simples mediante ELISA de captura. Los clones positivos se desarrollaron en medio RPMI-1640 complementado con IgG-FCS ultra bajo al 10 % (Life Technologies). Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8,0 y la filtración estéril, la solución se sometió a cromatografía en columna de proteína A estándar (Poros 20 A, PE Biosystems).
Ejemplo 7: Análisis Pepspot con decapéptidos
La siguiente secuencia de aminoácidos que abarca Aβ (1-42) se dividió en 43 decapéptidos de superposición con un marco de lectura (frameshift) de 1 aminoácido. ISEVKM1DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVI42ATV IV (SEQ ID NO: 414). Por consiguiente, DAEFRHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVIA (SEQ ID NO: 27) como se adjunta representa aminoácidos 1 a 42 del péptido Aβ4/β-A4. Los 43 decapéptidos se sintetizaron con acetilación N-terminal y acoplamiento covalentes C-terminal a una lámina de celulosa (“pepspot”) de un proveedor comercial (Jerini BioTools, Berlín). La lámina de celulosa se incuba durante 2 horas sobre una plataforma de balanceo con anticuerpo monoclonal (2 µg/ml) en tampón de bloqueo (Tris HCl 50 mM, NaCl 140 mM, NaEDTA 5 mM, NP40 al 0,05 % (Fluka), gelatina al 0,25 % (Sigma), fracción V de albumina de suero bovina al 1 % (Sigma), pH 7,4). La lámina se lava 3 veces 3 minutos sobre una plataforma de balanceo con TBS (Tris HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). A continuación, se mojó con tampón de cátodo (Tris base 25 mM, ácido 6-aminohexano 40 mM, SDS al 0,01 %, metanol al 20 %) y se transfirió a una pila de transferencia semi seca con el lado del péptido enfrentado a la membrana de PVDF (Biorad) de igual tamaño. La pila de transferencia semi seca consiste fuera de los papeles frescamente mojados (Whatman nº 3) ligeramente más largos que la lámina peptídica:
3 papeles mojados con tampón cátodo
la lámina peptídica
una lámina de membrana de PVDF mojada con metanol
3 papeles mojados con tampón ánodo 1 (Tris base 30 mM, metanol al 20 %)
3 papeles mojados con tampón ánodo 2 (Tris base 0,3 mM, metanol al 20 %)
La transferencia se conduce en una densidad de corriente entre el cátodo y el ánodo de 0,8 mA/cm2 durante 40 minutos que es suficiente para eluir la mayoría del anticuerpo de la lámina de celulosa y depositarlo sobre la membrana de PVDF. A continuación, la membrana de PVDF se intercambia por una segunda membrana de PVDF y se transfiere durante otros 40 minutos para asegurar la completa elución de la lámina de celulosa. La membrana de PVDF se sumerge en tampón de bloqueo durante 10 minutos. A continuación, se añade anti-Ig H+L humano marcado con HRP (Pierce) en dilución 1:1.000 y la membrana se incuba sobre una plataforma de balanceo durante 1 hora. Se lava 3 veces 10 minutos con TBST (TBS con Tween20 al 0,005 %). El color se
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desarrolla sumergiendo la membrana en una solución hecha de 3 mg de 4-cloronaftol disuelto en 9 ml de metanol con 41 ml de PBS (Na-fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.2) y 10 µl de peróxido de hidrógeno al 30 % (Merck). Después del desarrollo de las manchas azul oscuras la membrana se lava exhaustivamente con agua y se seca. La asignación de las manchas de péptido (pepspots) reactivas a anticuerpo se hace por inspección visual a través
5 de una matriz de mancha transparente. Los epítopos del anticuerpo en cuestión se define como la secuencia de aminoácidos mínima en péptidos reactivos. Por comparación se analizaron anticuerpos monoclonales de ratón (BAP-2, BAP-1, BAP-17, BAP-21, BAP-24 y 4G8) del mismo modo, excepto usando anti-Ig de ratón marcado con HRP en lugar de anti-Ig humano.
10 Cabe señalar que la maduración por afinidad y la conversión de los fragmentos Fab monovalentes en los anticuerpos IgG1 de longitud completa normalmente da como resultado alguna ampliación de la secuencia de reconocimiento del epítopo como se indica por el análisis pepspot y ELISA. Esto se puede referir al reclutamiento de más puntos de contacto en el área de interacción anticuerpo-antígeno como consecuencia de la maduración por afinidad o a una unión más fuerte al epítopo mínimo de modo que también se pueden detectar las interacciones
15 débiles con aminoácidos adyacentes. Esto puede ser la causa cuando se sondan los péptidos derivados de Aβ con anticuerpos IgG de longitud completa. Tal como se ilustra en la Tabla 2 para el análisis pepspot, las secuencias de reconocimiento de los epítopos N-terminales y medios se alargan por hasta tres aminoácidos cuando se comparaban Fabs parentales y correspondientes anticuerpos IgG completamente madurados. Sin embargo, hay que tener en mente que los decapéptidos son modificados por acoplamiento covalente en el aminoácido C-terminal y
20 este aminoácido, por lo tanto, no puede ser fácilmente accesible al anticuerpo de longitud completa debido al impedimento estérico. Si este es el caso, el último aminoácido C-terminal no contribuye significativamente a la secuencia de reconocimiento de epítopo y hay que considerar una reducción potencial de la secuencia de reconocimiento mínimo por un aminoácido en el extremo C-terminal en el análisis pepspot como se usa en la presente invención.
25 Tabla 2: Análisis pepspot de la unión de Fabs y anticuerpos IgG de longitud completa a decapéptidos sobre una lámina de celulosa. Los números se refieren a los aminoácidos esenciales de la secuencia de Aβ1-40 que tienen que estar presentes en el decapéptido para la unión óptima del anticuerpo. Una reactividad de péptido débil, y así una contribución débil al epítopo, está indicada entre paréntesis.
30
Anticuerpo
Posición Posición
MSR-3 Fab
3-4 18-23
MSR-7 Fab
3-5 19-24
MSR-8 Fab
4-5 18-21
MSR-9 Fab
(1)3-9 18-24
MSR-10 Fab
(4-10) 19-20
MSR-11 Fab
3-7 (18-20)
MSR-26 Fab
3-5 (16)-19-23
MSR-27 Fab
(3)6-9 13-18(20)
MSR-29 Fab
14-16(20)
MSR-37 Fab
(4-6) (19-24)
MSR-41 Fab
3-7 (17-21)
MSR-42 Fab
(4-9) (18-24)
MSR 3.4H7 IgG1
1-3 19-26
MSR 7.9H2 IgG1
1-4 19-24
MSR 7.9H7 IgG1
4-6 19-26
MSR 7.2H2x7.2L IgG1
(1-4) 5-9 18-26
MSR 7.11.H1x7.2L1 IgG1
4-6 19-26
BAP-2
4-6
4G8
19-20(23)
BAP-21
32-34
BAP-24
38-40
BAP-1
4-6
BAP-17
38-40
Ejemplo 8: Determinación de los valores KD para MS-R Fab y anticuerpo MS-R IgG1 que se unen a fibras de Aβ1-40 y Aβ1-42 in vitro por resonancia por plasmón superficial (SPR)
35 Se midió la unión de anticuerpos anti-Aβ (Fabs e IgG1) a Aβ fibrilar en línea por resonancia por plasmón superficial (SPR), y se determinaron las afinidades de las interacciones moleculares como se describe en Johnson, Anal. Biochem. 1991, 198, 268-277, y Richalet-Sécordel, Anal. Biochem. 1997, 249, 164-173. Se usaron instrumentos Biacore2000 y Biacore3000 para estas mediciones. Se generaron fibras Aβ1-40 y Aβ1-42 in vitro por incubación de péptidos sintéticos a una concentración de 200 µg/ml en tampón de Na-acetato 10 mM (pH 4,0) durante tres días a
40 37 ºC. El análisis microscópico de electrones confirmó una estructura fibrilar para ambos péptidos, Aβ1-40 que
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muestra fibras predominantemente más cortas (<1 micra) y Aβ1-42 predominantemente más largas (<1 micra). Estas fibras se asumen que representan péptidos Aβ agregados en cerebro AD humano mejor que las mezclas definidas enfermas de agregados amorfos y precipitados no estructurados. Las fibras se diluyeron 1:10 y se acoplaron directamente a un “Chip Sensor F1 Pioneer” como se describe en el Manual de Instrucciones del fabricante (BIAapplication Handbook, versión AB, Biacore AB, Uppsala, 1998). En experimentos iniciales se encontró que los MS-Roche Fabs seleccionados diferían básicamente en sus cinéticas de reacción y, por lo tanto, el modo de análisis de datos tenía que elegirse en consecuencia. Para ligantes con valores KD de cinéticas lentas se calcularon por ajuste de curva de las respuestas del sensor dependientes del tiempo, es decir, a partir de la relación koff/kon. Los ligantes con cinéticas rápidas se analizaron ajustando las respuestas del sensor dependientes de concentración en equilibrio (adsorción-isotermas). Los valores KD se calcularon a partir de los sensogramas Biacore basados en la concentración total de Fab determinada por un ensayo de proteína. Para los clones derivados del 1º y 2º ciclo de maduración por afinidad el contenido de Fab activo en cada preparación se determinó en el Biacore según un método descrito por Christensen, Analytical Biochemistry (1997) 249, 153-164. En resumen, se midió la unión de proteína dependiente del tiempo a fibras de Aβ1-40 inmovilizadas en el chip de Biacore durante la fase de asociación bajo condiciones limitadas por masa a diferentes caudales de la solución de analito. Las condiciones de limitación por masa se realizaron inmovilizando altas cantidades de fibras Aβ (2.300 unidades de respuesta) sobre la superficie del chip de un canal de medición y funcionando a concentraciones de analito relativamente bajas, es decir, 160 nM (basado en la concentración total de proteína Fab). En la tabla 3 se muestra un compendio de los valores KD de los clones MS-Roche seleccionados identificados en el cribado primario de la genoteca HuCAL y sus correspondientes derivados madurados después del 1º y 2º ciclo de maduración por afinidad. En el 1º ciclo de maduración por afinidad la CDR3 de la cadena pesada (VH-CD3) se mantuvo constante y la optimización se centró en la diversificación de la CDR3 de la cadena ligera (VL-CDR3). En el 2º ciclo de afinidad se realizó la diversificación de VL-CDR1 y VH-CDR2. Algunos de los ligantes del 1º ciclo de maduración se convirtieron en anticuerpos IgG1 humanos de longitud completa según la tecnología desarrollada por MorphoSys como se describe en el Ejemplo 6 y valores KD determinados en el Biacore como se describió anteriormente. Los valores KD para la unión de IgG1 de longitud completa a fibras de Aβ1-40 y fibras de Aβ42 se muestran en la Tabla 4.
Se identificaron derivados madurados de tanto la genoteca de L-CDR1, así como de H-CDR2 después del 2º ciclo de maduración y se permitió la combinación de cadenas ligeras y pesadas. La estrategia de clonación cruzada se describe en el Ejemplo 13. Una de las cadenas ligeras completas, LCDR1 o L-CDR1+2 se intercambiaron. Los valores KD de Fabs de clonación cruzada seleccionados se muestran en la Tabla 8. Algunos de los Fabs del 1º y 2º ciclo de maduración y de los ligantes de clonación cruzada se convirtieron en anticuerpos IgG1 humanos de longitud completa según la tecnología desarrollada por MorphoSys como se describe en el Ejemplo 6. Los valores KD de la unión de IgG a fibras de Aβ1-40 y Aβ1-42 se determinaron en el Biacore. En resumen, se usó un modelo cinético para la formación paso a paso de un complejo bivalente, y se calcularon los valores KD por análisis tipo Scatchard de unión en equilibrio. Debido al proceso de asociación muy lento a baja concentración de anticuerpo (varias horas para alcanzar el equilibrio) los datos de unión en equilibrio se obtuvieron por extrapolación de las curvas de asociación para largos intervalos de tiempo. Los índices on y off para la formación del complejo monovalente y bivalente se determinaron por el procedimiento de ajuste de curva y se usó para la extrapolación. En base a estos valores de Req se realizó un análisis Scatchard y se determinaron los valores KD para la formación del complejo monovalente y el bivalente. Los datos se resumen en la Tabla 5. A partir del trazo de Scatchard curvilíneo se derivó una mayor (bivalente) y menor (monovalente) interacción por afinidad para las MS-R IgGs del 2º ciclo de maduración por afinidad y clones cruzados. Estas dos afinidades representan los valores KD inferiores y superiores del intervalo indicado en la Tabla 5.
Tabla 3
Tabla 3: valores KD para la unión de MS-R Fab a fibras de Aβ1-40 y Aβ1-42 determinados en el Biacore. Para los clones derivados del 1º y 2º ciclo de maduración por afinidad los valores se corrigen para el contenido de Fab activo presente en cada muestra como se describe en el texto. a, los valores se calcularon a partir de las respuestas de sensor dependientes de concentración en equilibrio; n.d., no determinado.
Clones
MS-R KD KD MS-R KD KD MS-R KD KD
secretados
Nº Aβ1-40 Aβ1-42 Nº Aβ1-40 Aβ1-42 Nº Aβ1 Aβ1-42
de
nM nM nM nM nM nM
cribado
3 930 1.300 7 1.100 1.714 8 850 1.000
primario
1º
3.2 52 240 7.2 22 58 8.1 24 42
maduración
3.3 38 104 7.3 23 88 8.2 24 64
por afinidad
3.4 32 103 7.4 28 103
3.6
40 68 7.9 31 93
7.11
22 74
7.12
28 60
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Clones secretados de
MS-R Nº KD Aβ1-40 nM KD Aβ1-42 nM MS-R Nº KD Aβ1-40 nM KD Aβ1-42 nM MS-R Nº KD Aβ1nM KD Aβ1-42 nM
2º
3.2H1 4,4 3,3 7.2H1 9,3 10,2 8.1H1 13,6 9,2
maduración
3.2H2 5,2 1,1 7.2H2 8,2 8,2 8.2H1 1,6a 2,1a
por afinidad
3.3H1 17,1 19,4 7.2H3 45,4 5,3 8.2H3 n.d. 3,1
3.3H2 10,6 22,8
7.2H4 5,9 5,0 8.2H4 12,1 11,9
3.3H3 1,4 3,3
7.2H5 8,0 10,1 8.2L1 4,8 3,7
3.4H1 13,5 14,0
7.2H6 1,0 n.d.
3.4H3 6,7 8,4
7.2H7 15,5 8,1
3.4H4 33,0 43,0
7.2H8 1,5 2,1
3.4H5 26,5 36,0
7.2L1 13,3 12,7
3.4H6 49,0 60,0
7.2L2 5,6 4,0
3.4H7 19,2 31,7
7.2L4 1,1 1,1
3.4H8 10,7 26,5
7.3H1 8,0 11,2
3.4H9 21,7 18,6
7.3L1 4,5 6,0
3.4H10 8,1 10,1
7.4H1 8,0 6,6
3.4H11 19,5 8,3
7.4H2 9,9 6,2
3.4H12 25,5 27,0
7.9H1 4,9 5,4
3.4H13 32,3 18,8
7.9H2 5.0 5.7
3.4H14 13,3 16,8
7.9H3 4,2 2,8
3.4H16 25,5 15,6
7.9H4 4,8 4,2
3.4H17 2,0 4,3
7.9H5 1,7 1,8
3.4H18 17,1 10,0
7.9H6 1,2 1,2
3.4L7 9,3 9,3
7.9H7 1,0 0,9
3.4L8 6,2 13,0
7.9H8 0,8 0,7
3.4L9 16,3 9,1
7.9H9 0,9 0,9
3.4L11 5,3 2,6
7.9L1 1,0 1,1
3.6H1 18,9 23,1
7.9L2 1,0 0,5
3.6H2 19,8 54,0
7.11H1 12,7 6,7
3.6H3 5,4 7,5
7.11H2 0,3 0,3
3.6H4 13,0 7.8
7.11H3 6,6 4,4
3.6H5 8,2 6,0
7.11H4 1,0 1,7
3.6H6 36,0 11,8
7.11H5 3,4 1,7
3.6H8 2.5 2.5
7.11L1 1,1 1,2
3.6L1 15,6 11,1
7.12H1 0,6 0,8
3.6L2 13,7 13,1
7.12L1 n.d. 3,8 7.12L2 4,0 5,4 7.12L3 0,8 0,9 7.12L4 2,0 0,6 7.12L5 0,8 0,6 7.12L6 n.d. n.d. 7.12L7 n.d. n.d.
Tabla 4:
Tabla 4: valores KD para la unión de MS-R IgG1 a fibras de Aβ1-40 y Aβ1-42 determinados en el Biacore. Los IgGs se derivaron de MS-R Fabs seleccionados después del 1º ciclo de maduración por afinidad. Los valores se corrigen para el contenido de MS-R IgGs activos presentes en cada muestra como se describe en el texto.
MS-R Nº
KD Aβ1-40 nM KD Aβ1-42 nM
3.3 IgG1
3,7 6,6
7.11 IgG1
2,3 5,7
7.12 IgG1
3,1 13,7
8.1 IgG1
6,6 12,3
10 Tabla 5: valores KD para la unión de MS-R IgG1 a fibras de Aβ1-40 y Aβ1-42 determinados en el Biacore. Los IgGs
se derivaron de MS-R Fabs seleccionados después del 1º y 2º ciclo de maduración por afinidad y de Fabs de clonación cruzada. Los valores se corrigen para el contenido de MS-R IgGs activos presentes en cada muestra como se describe en el texto. Los dos valores KD se dan para MS-R IgGs derivados de la 2º etapa de maduración por afinidad y ligantes de clonación cruzada representan interacción por afinidad superior e inferior calculada a partir
15 de los trazos de Scatchard curvilíneos. Con un número de MS-R IgGs adicionales (por ejemplo, MSR IgG
7.9H2x7.12L2 y MS-R IgG 7.9H4x7.12L2), se obtuvieron representaciones de Scatchard curvilíneos complejas y, por lo tanto, la determinación de los valores KD no fue posible.
Clones seleccionados de 1º maduración por afinidad 2º maduración por afinidad Fabs de clonación cruzada
MS-R IgG1 3.3 7.11 7.12 8.1 3.4H7 7.2H4 7.9H2 7.9H3 7.9H7 7.12L1 8.2H2 3.6H5x3.6L2 3.6H8x3.6L2 7.4H2x7.2L1 7.11H1x7.2L1 7.11H1x7.11L1 KD Aβ1-40 nM 3,7 2,3 3,1 6,6 0,10-0,30 0,09-0,30 0,12-0,42 0,10-0,50 0,25-0,69 1,20-3,50 0,16-1,00 0,20-1,03 0,22-0,95 0,12-0,63 0,14-0,66 0,11-0,70 KD Aβ1-42 nM 6,6 5,7 13,7 12,3 0,10-0,30 0,10-0,66 0,11-0,38 0,10-0,40 0,24-0,70 0,74-2,90 0,12-0,92 0,20-0,95 0,22-0,82 0,12-0,56 0,15-0,67 0,13-0,70
5 Ejemplo 9: Tinción de placas de amiloide humanas genuinas en secciones de cerebro de un paciente con la enfermedad de Alzheimer por inmunofluorescencia indirecta
Se ensayaron MS-Roche Fabs seleccionados e IgG1 de longitud completa para la unión a placas de β-amiloide por análisis de inmunohistoquímica. Se marcaron secciones se criostato de tejido no fijado del córtex temporal humano 10 (obtenido postmortem de un paciente al que se diagnosticó positivamente para la enfermedad de Alzheimer) por inmunofluorescencia indirecta usando MS-Roche Fabs o anticuerpos IgG1 humanos de longitud completa a diversas concentraciones. Fabs y anticuerpos IgG1 se revelaron por anti-fragmento F(ab’)2 purificado por afinidad humano de cabra conjugado con Cy3 y anti-(H+L) humano de cabra conjugado con Cy3, respectivamente. Ambos reactivos secundarios se obtuvieron de Jackson Immuno Research. Los controles incluyeron un Fab no relacionado y los
15 anticuerpos secundarios solos, todos los cuales dieron resultados negativos. En las figuras 5 a 7 se muestran ejemplos típicos de tinciones de placa con MS-Roche Fabs seleccionados y anticuerpos MS-Roche IgG1.
Ejemplo 10: Ensayo de polimerización: Prevención de la agregación de Aβ
20 El Aβ sintético cuando se incuba en tampón acuoso durante varios días se agrega espontáneamente y forma estructuras fibrilares que son similares a las vistas en depósitos de amiloide en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer. Los inventores han desarrollado un ensayo in vitro para medir la incorporación de Aβ biotinilado en los agregados Aβ preformados para analizar el potencial neutralizador de Aβ de anticuerpos anti-Aβ y otras proteínas de unión a Aβ tales como albumina (Bohrmann y col., 1999, J. Biol. Chem. 274, 15.990-15.995). El
25 efecto de las pequeñas moléculas sobre la agregación de Aβ también se puede analizar en este ensayo.
Procedimiento experimental:
Se recubren placas de microtitulación Maxisorb NUNC (MTP) con una mezcla 1:1 de Aβ1-40 y Aβ1-42 (2 µM cada
30 uno, 100 µl por pocillo) a 37 ºC durante tres días. Bajo estas condiciones se adsorbe Aβ fibrilar altamente agregado y se inmoviliza sobre la superficie del pocillo. A continuación, se elimina la solución de recubrimiento y las placas se secan a temperatura ambiente durante 2-4 horas. (Las placas secas se almacenaron a -20 ºC). Los sitios de unión residuales se bloquean añadiendo 300 µl/pocillo de disolución salina tamponada con fosfato que contiene Tween20 al 0,05 % (T-PBS) y albúmina de suero bovino al 1 % (BSA). Después de 1-2 horas de incubación a temperatura
35 ambiente las placas se lavan una vez con 300 µl de T-PBS. Se añade una solución de Aβ1-40 biotinilado 20 nM en Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2 (TBS) que contiene NaN3 al 0,05 % y anticuerpo diluido en serie (100 µl/pocillo) y la placa se incuba a 37 ºC durante la noche. Después de lavar tres veces con 300 µl de T-PBS se añade (100 µl/pocillo) un conjugado de estreptavidina-POD (Roche Molecular Biochemicals), diluida 1:1.000 en T-PBS que contiene BSA al 1 %, y se incuba a temperatura ambiental durante 2 horas. Los pocillos se lavan tres veces con T
40 PBS y se añaden 100 µl/pocillo de una solución de tetrametil-bencidina (TMB) frescamente preparada. [Preparación de la solución TMB: 10 ml de ácido cítrico 30 mM pH 4,1 (ajustado con KOH) + 0,5 ml de TMB (12 mg de TMB en 1 ml de acetona + 9 ml de metanol) + 0,01 ml de H2O2 al 35 %]. La reacción se para añadiendo 100 µl/pocillo de H2SO4 1 N la absorbancia se lee a 450 nm en un lector de placa de microtitulación.
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Resultado:
La Figura 8 muestra que los anticuerpos MS-Roche IgG1 previnieron la incorporación de Aβ1-40 biotinilado en agregados Aβ1-40/Aβ1-42 preformados. La capacidad neutralizadora de Aβ de estos IgGs humanos de longitud completa era similar a la del anticuerpo monoclonal de ratón BAP-1 que se había generado por un procedimiento de inmunización estándar y específicamente reconoce residuos de aminoácidos 4-6 del péptido Aβ cuando se analizan por la técnica Pepspot como se describe en el ejemplo 7. El anticuerpo monoclonal de ratón BAP-2 que también reacciona exclusivamente con los aminoácidos 4-6 (Brockhaus, no publicado) era significativamente menos activo en este ensayo. Se encontró una actividad incluso menor con el anticuerpo específico C-terminal de Aβ1-40 BAP-17 (Brockhaus, Neuroreport 9 (1998), 1.481-1.486) y el anticuerpo monoclonal 4G8 que reconoce un epítopo entre la posición 17 y 24 en la secuencia de Aβ (Kim, 1988, Neuroscience Research Communication, Vol. 2, 121-130). BSA a una concentración de hasta 10 µg/ml no afectó a la incorporación de Aβ biotinilado y sirvió como control negativo. Sin embargo, a concentraciones mayores, es decir, > 100 µg/ml, se ha informado que BSA inhibe la unión de Aβ biotinilado en fibras Aβ preformadas (Bohrmann, (1999) J. Biol. Chem. 274 (23), 15990-5) indicando que la interacción de BSA con Aβ no es de alta afinidad.
Ejemplo 11: Ensayo de despolimerización: Liberación de Aβ biotinilado desde el Aβ agregado
En un montaje experimental similar los inventores han ensayado el potencial de anticuerpos MS-Roche IgG para inducir la despolimerización de Aβ agregado. Aβ1-40 biotinilado se incorporó primero en fibras Aβ1-40/Aβ1-42 preformadas después del tratamiento con diversos anticuerpos anti-Aβ. La liberación de Aβ biotinilado se midió usando el mismo ensayo que el descrito en el ensayo de polimerización.
Procedimiento experimental:
Se recubrieron placas de microtitulación NUNC Maxisorb (MTP) con una mezcla 1:1 de Aβ1-40 y Aβ1-40 como se describe en el ensayo de polimerización. Para la incorporación de Aβ biotinilado las placas recubiertas se incubaron con 200 µl/pocillo de Aβ1-40 biotinilado 20 nM en TBS que contiene NaN3 al 0,05 % a 37 ºC durante la noche. Después de lavar la placa con 3 x 300 µl/pocillo de T-PBS, se añadieron anticuerpos diluidos en serie en TBS que contenía NaN3 al 0,05 % y se incubaron a 37 ºC durante 3 horas. La placa se lavó y se analizó para la presencia de Aβ1-40 biotinilado como se describió anteriormente.
Resultado:
Las Figuras 9A a D muestran que los anticuerpos de la invención indujeron la despolimerización de Aβ agregado cuando se midió por la liberación de Aβ1-40 biotinilado. Los anticuerpos MS-R y el anticuerpo monoclonal de ratón BAP-1 eran igualmente activos mientras que los anticuerpos BAP-2, BAP-17 y 4G8 eran claramente menos eficaces en la liberación de Aβ biotinilado de la masa de agregados de Aβ inmovilizados. BAP-1 claramente se puede diferenciar de los anticuerpos MS-R por su reactividad con APP de longitud completa de la superficie celular (véase Figura 15), y anticuerpos como BAP-1 con tales propiedades no son útiles para las aplicaciones terapéuticas ya que se pueden inducir reacciones autoinmunológicas potenciales. Es interesante señalar que BAP-2, a pesar de su especificidad para el residuo de aminoácidos 4-6 que está expuesto en Aβ agregado tiene una actividad claramente menor en este ensayo indicando que no todos los anticuerpos específicos al terminal N, a priori, son igualmente eficaces en la liberación de Aβ de los agregados preformados. Los MS-Roche IgGs son claramente superiores a BAP-2 con respecto a la actividad de despolimerización. La eficacia relativamente baja de BAP-17 (específico al terminal C) y 4G8 (específico a residuos de aminoácidos 16-24) en este ensayo se debe a la naturaleza críptica de estos dos epítopos en Aβ agregado. Tal como ya se señaló en el ensayo de polimerización, BSA a las concentraciones usadas en el presente documento no tenía efecto sobre el Aβ agregado.
Los anticuerpos MS-R derivados del 2º ciclo de maduración por afinidad y de los ligantes de clonación cruzada muestran en general una eficacia superior en el ensayo de despolimerización (comparación de la figura 9A con las figuras 9B y C), que es consecuente con la afinidad de unión incrementada de estos anticuerpos (véase tablas 3-5). Se ha informado que los anticuerpos monoclonales AMY-33 y 6F/3D previenen la agregación de Aβ in vitro bajo ciertas condiciones experimentales (Solomon, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 452-455; anticuerpos AMY-33 y 6F/3D se obtuvieron de Zymed Laboratories Inc., San Francisco (nº de pedido 13-0100) y Dako Diagnostics AG, Zug, Suiza (nº de pedido M087201), respectivamente). Tal como se demuestra en la figura 9D ambos anticuerpos eran completamente inactivos en el ensayo de despolimerización.
Ejemplo 12: Análisis de epítopo por ELISA sobre conjugados de péptido.
Los siguiente heptapéptidos (código de letra única) se obtuvieron por síntesis en fase sólida y se purificaron por cromatografía líquida usando las técnicas conocidas en la técnica.
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Los péptidos se disolvieron en DMSO para llegar a una concentración de 10 mM.
5 Se disolvió albúmina bovina (esencialmente BSA libre de ácido graso, Sigma Lot 112F-9390) a 10 mg/ml en bicarbonato de sodio 0,1 M y se activaron mediante adición por ml de 50 µl de una solución de 26 mg/ml de Nsuccinmidil-maleinimida propionato (NSMP, Pierce) en DMSO. Después de 15 minutos de reacción a temperatura ambiente la BSA activada se purificó mediante filtración en gel (NAP-10, Pharmacia) en PBS con ácida de sodio al
10 0,1 % como disolvente. Se diluyó 50 µl de BSA activada por NSMP (6,7 mg/ml) con 50 µl de PBS, ácida de sodio al 0,1 % y se añadió 10 µl de solución de péptido (1 mM en DMSO). Como control negativo se trató BSA activada como simulacro sin adición de péptido. Después de 4 horas a temperatura ambiente la reacción se paró por adición de 10 µl de Cisteína 10 mM. Se diluyó 1:100 una alícuota de la mezcla de reacción de conjugado con tampón de bicarbonato de sodio 0,1 M e inmediatamente se rellenó en los pocillos (100 µl) de placas ELISA (Inmunoplaca
15 Nunc). Después de reposar 16 horas a 4 ºC, se añadieron 100 µl de tampón de bloqueo (como anteriormente) a cada pocillo y se incubaron durante otros 30 minutos. Las placas se lavaron con 2 x 300 µl/pocillo de TBST (como anteriormente) y se rellenaron con 100 µl de anticuerpo a 10 µg/ml o 2 µg/ml en tampón de bloqueo. Las placas se dejaron reposar durante 16 horas a 4 ºC y se lavaron con 2x300 µl de TBST. Se añadieron 100 µl/pocillo de anti-Ig H+L humano conjugado con HRP (Pierce, dilución 1:1.000 con tampón de bloqueo) y se incubaron durante 1 hora a
20 temperatura ambiente. Las placas se lavaron con 3x300 µl/pocillo de TBST. El desarrollo de color se comenzó por la adición de 100 µl de reactivo de tetrametil bencidina/peróxido de hidrógeno. La reacción se paró después de 5 minutos por la adición de 100 µl/pocillo de ácido sulfúrico 1M y la densidad óptica se midió por un lector óptico (Microplate Reader 3550, BioRad) a 450 nm. Por comparación se analizaron los anticuerpos monoclonales de ratón del mismo modo, excepto que se usó como agente revelador anti-Ig de ratón marcado con HRP en lugar de anti-Ig
25 humano.
Empleando específicos de los heptapéptidos anteriormente descritos derivados de Aβ, se llevaron a cabo ensayos ELISA específicos como se describieron anteriormente en el presente documento. Preferentemente, los anticuerpos de la invención comprenden anticuerpos que muestran, cuando se mide mediante las densidades ópticas, una 30 relación señal y ruido de fondo aproximadamente de “10” cuando su reactividad con un péptido derivado A-beta (AEFRHD; aminoácidos 2 a 7 de A-beta) se compara con una proteína/péptido no relacionado como BSA. Lo más preferentemente, la relación de las densidades ópticas es aproximadamente de “5” para una correspondiente reacción con al menos uno de los siguiente tres péptidos derivados Aβ: (VFFAED; aminoácidos 18 a 23 de Aβ) o
(FFAEDV; aminoácidos 19 a 24 de Aβ) o (LVFFAE; aminoácidos 17 a 22 de Aβ). Los resultados correspondientes para los anticuerpos parentales y/o madurados de la invención se muestran en las siguientes dos tablas:
Tabla 6: Reactividad de MS-R Fabs con heptapéptidos 2-7 (AEFRHD), 17-22 (LVFFAE), 18-23 (VFFAED) and 19-24 (FFAEDV) de Abeta conjugados con BSA. Se dan las relaciones de la lectura de ELISA (densidad óptica) obtenida con BSA conjugada con péptido y no conjugada. También se indican las intensidades de señal obtenidas con los péptidos 17-22, 18-23 y 19-24 en relación con el péptido 2-7. Tabla 7: Reactividad de MS-R IgGs y anticuerpos monoclonales de ratón BAP-1, BAP-2, 4G8, 6E10 Amy-33 y 6F/3D con heptapéptidos 2-7 (AEFRHD), 17-22 (LVFFAE), 18-23 (VFFAED) and 19-24 (FFAEDV) de Aβ conjugados con BSA. Se dan las relaciones de la lectura de ELISA (densidad óptica) obtenidas con BSA conjugada con péptido y no conjugada. También se indican las intensidades de señal obtenidas con los péptidos 17-22, 18-23 y 19-24 en relación con el péptido 2-7. * este anticuerpo es específico para la secuencia 8-17 y no reconoce secuencias de epítopo N-terminales y medio.
MS-R Nº 7 8 7.2 7.3 7.4 7.9 7.11 7.12 8.1 8.2 3.2H2 3.3H1 3.3H3 3.4H1 3.4H2 3.4H3 3.4H5 3.4H7 3.4H17 3.4L11 3.6H6 3.6H1
Péptido 2-7 2-7/BSA 24 28 34 34 36 28 37 38 30 32 26 23 31 27 16 22 28 24 28 31 25 23 Péptido 1722 17-22/BSA 4 10 12 11 10 9 11 6 1 4 12 4 2 2 11 9 5 2 5 6 1 3 Péptido 1823 18-23/BSA 7 29 16 15 13 13 15 8 11 28 23 12 5 8 1 17 13 6 12 20 4 13 Péptido 1924 19-24BSA 4 25 9 9 6 8 9 7 8 23 20 8 2 2 1 11 4 5 11 5 7 5 Relación de péptido 17-22/2-7 0,17 0,36 0,35 0,32 0,28 0,32 0,30 0,16 0,03 0,13 0,46 0,17 0,06 0,07 0,69 0,41 0,18 0,08 0,18 0,19 0,04 0,13 Relación de péptido 18-23/2-7 0,29 1,04 0,47 0,44 0,36 0,46 0,41 0,21 0,37 0,88 0,88 0,52 0,16 0,30 0,06 0,77 0,46 0,25 0,43 0,65 0,16 0,57 Relación de péptido 19-24/2-7 0,17 0,89 0,26 0,26 0,17 0,29 0,24 0,18 0,27 0,72 0,77 0,35 0,06 0,07 0,06 0,50 0,14 0,21 0,39 0,16 0,28 0,22
3.6H2
19 2 8 3 0,11 0,42 0,16
7.2H1
38 8 11 9 0,21 0,29 0,24
7.2H2
16 10 10 10 0,63 0,63 0,63
7.2H3
33 17 20 18 0,52 0,61 0,55
7.2H4
23 12 13 12 0,52 0,57 0,52
7.2H5
30 13 18 15 0,43 0,60 0,50
7.2L1
24 14 16 11 0,57 0,68 0,45
7.4H1
31 16 20 16 0,52 0,65 0,51
7.4H2
36 17 20 16 0,47 0,56 0,46
7.9H1
32 7 12 6 0,23 0,36 0,19
7.9H2
35 3 6 8 0,08 0,16 0,23
7.9H3
35 11 20 9 0,31 0,57 0,27
7.9H4
30 10 15 7 0,32 0,49 0,22
7.11H1
31 8 9 8 0,25 0,29 0,25
7.11H2
34 10 12 14 0,29 0,36 0,41
7.12L1
16 10 12 10 0,60 0,70 0,59
8.1H1
29 22 25 25 0,77 0,88 0,86
8.2H1
22 7 23 20 0,34 1,05 0,94
8.2L1
26 15 32 31 0,60 1,26 1,22
imagen69
MS-R IgG Nº AEFRHD LVFFAE VFFAED FFAEDV Relación Relación Relación 2-7/BSA 17-22/BSA 18-23/BSA 19-24/BSA de péptido de péptido de péptido 17-22/2-7 18-23/2-7 19-24/2-7
3.3 17 11 16 11 0,65 0,94 0,65
7.12 19 11 13 11 0,58 0,68 0,58
8.1 16 7 16 14 0,44 1,00 0,88 3.4H7 22 3 16 15 0,14 0,73 0,68 7.9H2 13 5 8 6 0,38 0,62 0,46 7.9H3 13 6 8 6 0,46 0,62 0,46 7.9H7 30 5 16 10 0,17 0,53 0,33 7.11H2 10 6 7 6 0,60 0,70 0,60 8.2H2 18 10 15 14 0,56 0,83 0,78 3.6H5x3.6L2 11 7 9 8 0,64 0,82 0,73 7.11H2x7.9L1 14 8 10 9 0,57 0,71 0,64
(L1) 8.2H2x8.2L1 13 20 25 25 1,54 1,92 1,92
mab de ratón
BAP-1 21 1 1 1 0,05 0,05 0,05 BAP-2 21 1 1 1 0,05 0,05 0,05 4G8 12320123201 6E10 18 1 1 1 0,06 0,06 0,06
6F/3D*1 11 1111
Amy 33 16 2 1 3 0,13 0,06 0,19
Ejemplo 13: Combinación de H-CDR2 y L-CDR1 optimizadas por clonación cruzada
10 El diseño modular de la genoteca HuCAL permite el intercambio de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de dos genes diferentes codificadores de Fab en una etapa de clonación simple. Para una mejora adicional de la afinidad se combinaron las H-CDR2 y L-CDR1 independientemente optimizadas de clones madurados con la misma H-CDR3, debido a que había una alta probabilidad de que esta combinación condujera a una ganancia
15 adicional de afinidad (Yang y col., 1995, J. Mol. Biol. 254, 392-403; Schier y col., 1996b, J. Mol. Biol. 263, 551-567; Chen y col., 1999, J. Mol. Biol. 293, 865-881). Cadenas ligeras completas, o fragmentos de las mismas, se transfirieron desde un clon donante optimizado L-CDR1 a un clon receptor optimizado H-CDR2. Los clones donantes y receptores solamente se combinaron, si ambos llevaban idénticas secuencias de H-CDR3. Todos los clones donantes y receptores llevaban la región estructural VH3-Vκ3.
20 Esto se consiguió transfiriendo las cadenas ligeras completas desde el clon donante optimizado L-CDR1 al clon receptor optimizado H-CDR2. La especificidad de epítopo se conservó combinando solamente clones con la misma H-CDR3. Mediante el intercambio de cadena ligera un clon optimizado H-CDR2 obtuvo solamente una L-CDR1 optimizada, si el intercambio se daba entre los clones con la misma L-CDR3. Si la L-CDR3 de los clones a combinar
25 era diferente, el clon optimizado H-CDR2 adquiría además de la L-CDR1 optimizada otra L-CDR3 (L-CDR2 mantenía la secuencia consenso de HuCAL (Knappik y col., 2000)) y cuando se usaron los derivados de MS-Roche Nº 7.12 como donantes de la cadena ligera L-CDR1, 2 y 3 se intercambiaron en el clon receptor optimizado H-CDR2. Se emplearon tres estrategias de clonación diferentes:
30 1) Usando endonucleasas de restricción Xbal y Sphl se escindió el fragmento completo de cadena ligera de anticuerpo del plásmido 1 (por ejemplo, pMx9_Fab_MS-Roche nº7.11H1_FS) y de ese modo la cadena principal del vector obtenido se ligó, a continuación, al fragmento de cadena ligera del plásmido 2 (por ejemplo, pMx9_Fab_MS-Roche nº7.2L1_FS) generado por digestión por Xbal y Sphl. De ese modo se creó un nuevo plásmido (nomenclatura: pMx9_Fab_MS-Roche nº7.11H1x7.2L1_FS) codificando L-CDR1, 2, 3 del clon parental
35 nº7.2L1 y H-CDR1, 2, 3 del clon parental nº7.11H1.
2) Usando endonucleasas de restricción Xbal y Acc651 se escindió un fragmento codificador de L-CDR1 del plásmido 1 (por ejemplo, pMx9_Fab_MS-Roche nº7.11H2_FS) y de ese modo la cadena principal del vector obtenido se ligó, a continuación, al fragmento de L-CDR1 del plásmido 2 (por ejemplo, pMx9_Fab_MS-Roche
40 nº7.12L1_FS) generado por Xbal y Acc651. De ese modo se creó un nuevo plásmido (nomenclatura: pMx9_Fab_MS-Roche nº7.11H2x7.12L1 (L-CDR1)_FS) codificando L-CDR1 del clon parental nº7.12L1 mientras que L-CDR2, 3 y H-CDR1, 2, 3 se derivan del clon parental nº 7.11H2.
imagen70
3) Usando endonucleasas de restricción Xbal y BamHI se escindió un fragmento codificador de L-CDR1 y L-CDR2 del plásmido 1 (por ejemplo, pMx9_Fab_MS-Roche nº7.11H2_FS) y de ese modo la cadena principal del
5 vector obtenido se ligó, a continuación, al fragmento de L-CDR1 y L-CDR2 del plásmido 2 (por ejemplo, pMx9_Fab_MS-Roche nº7.12L1_FS) generado por digestión por Xbal y BamHI. De ese modo se creó un nuevo plásmido (nomenclatura: pMx9_Fab_MS-Roche nº7.11H2x7.12L1 (L-CDR1+2)_FS) codificando L-CDR1 y L-CDR2 del clon parental nº7.2L1 mientras que L-CDR3 y H-CDR1, 2, 3 se derivan del clon parental nº7.11H2.
10 En la tabla 8 se dan ejemplos ilustrativos para las diferentes estrategias de clonación, así como para clones donantes y receptores de secuencias.
Después de la expresión y purificación a gran escala sus afinidades se determinaron sobre fibras Aβ (1-40). Además, en la Tabla adjunta 9 se dan los valores KD para los MS-R Fab/anticuerpos de clonación cruzada 15 seleccionados.
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Tabla 9: Valores KD para la unión de MS-R Fab de clonación cruzada a fibras de Aβ1-40 y Aβ1-42 determinados en el Biacore. La preparación de Fabs de clonación cruzada está descrita en el ejemplo 13. Los valores KD se determinaron por ajustes de la curva cinética y se corrigieron para el contenido de Fab activo presente en cada muestra como se describe en el texto. Algunos de los Fabs se purificaron adicionalmente por cromatografía de exclusión por tamaño o ultracentrifugación preparativa para separar el material agregado. (L1), el clon aceptor madurado H-CDR2 recibió solamente L-CDR1 del clon donante mejorado L-CDR1; (L1+2), el clon aceptor madurado H-CDR2 recibió L-CDR1+2 del clon donante mejorado L-CDR1.
MS-R Nº
KD Aβ1-40 KD Aβ1-42
nM
nM
3.3H1x3.4L9 3.4H1x3.4L9 3.4H3x3.4L7 3.4H3x3.4L9 3,4H7x3.4L9 3.4H7x3.4L7 3.6H5x3.6L1 3.6H5x3.6L2 7.2H2x7.2L1 7.4H2x7.2L1 7.4H2x7.12L2 7.9H2x7.2L1(L1) 7.9H2x7.12L1 7.9H2x7.12L2(L1+2) 7.11H1x7.2L1 7.11H1x7.11L1 7.11H2x7.2L1(L1) 7.11H2x7.9L1(L1) 8.1H1x8.2L1
2,16 0,25 0,92 1,05 2,66 1,19 1,25 1,26 1,29 1,4 1,4 1,4 1,2 0,4 1,75 0,41 1 0,1 1,3 2,97 0,5 0,92 0,93 3,51 1,23 1,04 0,84 1,43 1,4 1,8 1,4 1,1 0,4 1,39 0,47 0,6 1 1,6
Ejemplo 14: Decoración de placa de amiloide in vivo en un modelo de ratón de enfermedad de Alzheimer cuando se reveló por microscopía de barrido láser confocal y análisis de colocalización
Se ensayaron anticuerpos MS-R IgG1 seleccionados en ratones transgénicos doble de APP/PS2 (Referencia: Richards y col., Soc. Neurosci. Abstr., Vol. 27, Programa nº 5.467, 2001) para la decoración de placa de amiloide in vivo. Los anticuerpos (1 mg/ratón) se administraron in vivo y después de 3 días los cerebros se perfundieron con solución salina y se prepararon para criosección. En otro estudio los ratones se expusieron a mayores concentraciones de los anticuerpos, es decir, 2 mg inyectados in vivo el día 0, 3 y 6, y se sacrificaron el día nueve. La presencia de los anticuerpos unidos a las placas de amiloide se valoró sobre secciones de criostato no fijadas mediante la inmunofluorescencia indirecta doblemente marcada usando anti-IgG (H+L) humano de cabra conjugado a cualquier Cy3 (Nº109-165-003, Jackson Immuno Research) seguido de inmunoconjugado BAP-2-Alexa488. La imagen se hizo por microscopía láser confocal y el procesamiento de la imagen para la detección cuantitativa de colocalizaciones por el programa informático IMARIS y COLOCALIZATION (Bitplane, Suiza). En las Figuras 10-14 se muestran ejemplos típicos. Todos los anticuerpos MS-R ensayados se encontraron positivos en inmunodecoración de placas de amiloide in vivo, aunque se indicó alguna variabilidad.
Ejemplo 15: Investigación de la unión de diferentes anticuerpos monoclonales a proteína precursora de amiloide (APP) sobre la superficie de las células HEK293
APP se expresa ampliamente en el sistema nervioso central. La unión del anticuerpo a APP de la superficie celular puede conducir a activación del complemento y destrucción celular en áreas de cerebro sanas. Por lo tanto, es obligatorio para los anticuerpos A-beta terapéuticos estar desprovisto de reactividad hacia APP. Los anticuerpos de alta afinidad frente al dominio N-terminal de A-beta (por ejemplo, BAP-1, BAP-2) reconocen el respectivo epítopo también en la región estructural de APP. Por el contrario, los anticuerpos frente al epítopo medio (por ejemplo, AG8), y los anticuerpos de la invención sorprendentemente son incapaces de reconocer la APP de superficie celular. Por tanto, los anticuerpos de la invención que decoran A-beta, pero no APP in vivo, son superiores a los anticuerpos no selectivos.
El método de citometría de flujo es bien conocido en la técnica. Las unidades relativas de fluorescencia (FL1-H) medidas por citometría de flujo indican unión superficial celular del anticuerpo respectivo. Un cambio de fluorescencia sobre HEK293 sometidas a transfección con APP comparado con células HEK293 no sometidas a transfección indica la reacción indeseada con APP de superficie celular. Como ejemplo, anticuerpos BAP-1 y BAP-2 frente al domino N-terminal muestran un cambio significante de la señal FL-1 en HEK293/APP (línea gruesa) comparado con las células HEK293 no sometidas a transfección (línea punteada). El anticuerpo 4G8 (específico para el epítopo A-beta medio) y todos los anticuerpos de la invención (específico para epítopos A-beta N-terminales y medios) muestran cambio no significante en fluorescencia. Las diferencias en la fluorescencia basal entre las células HE293/APP y HEK293 son debidas a diferente tamaño celular. Se usó un instrumento FACScan en combinación con el paquete del programa informático Cellquest Pro (ambos de Becton Dickinson).
imagen76
5 Ejemplo 16: Lista de SEQ ID NOs identificadas en relación con las moléculas de anticuerpo de la invención
La tabla adjunta 10 se refiere a secuencias como se definen en el presente documento para algunas moléculas de anticuerpo de la invención específicas.
10 Tabla 10: Identificación de SEQ ID NOs para anticuerpos parentales, así como moléculas de anticuerpo optimizadas, maduradas y/o de clonación cruzada
N Molécula
VH Prot VL Prot VH ADN VL ADN HCDR3 Prot HCDR3 ADN LCDR3 Prot LCDR3 ADN
3
4 10 3 9 22 21 16 15
7
6 12 5 11 24 23 18 17
8
8
14 7 13 26 25 20 19
3.6H5 x 3.6L2
33 47 32 46 61 60 75 74
3.6H8 x 3.6L2
35 49 34 48 63 62 77 76
7.4H2 x 7.2L1
37 51 36 50 65 64 79 78
7.9H2 x 7.12L2
39 53 38 52 67 66 81 80
7.9H4 x 7.12L2
41 55 40 54 69 68 83 82
7.11H1x7.11L1
43 57 42 56 71 70 85 84
7.11H1x7.2L1
45 59 44 58 73 72 87 86
7.9H7
89 91 88 90 93 92 95 94
3.3H1x3.4L9
295 325 294 324 355 354 385 384
3.4H1x3.4L9
297 327 296 326 357 356 387 386
3.4H3x3.4L7
299 329 298 328 359 358 389 388
3.4H3x3.4L9
301 331 300 330 361 360 391 390
3.4H7x3.4L9
303 333 302 332 363 362 393 392
3.4H7x3.4.7
305 335 304 334 365 364 395 394
3.6H5x3.6L1
307 337 306 336 367 366 397 396
7.2H2x7.2L1
309 339 308 338 369 368 399 398
7.4H2x7.12L2
311 341 310 340 371 370 401 400
7.9H2x7.2L1
313 343 312 342 373 372 403 402
7.9H2x7.12L1
315 345 314 344 375 374 405 404
7.11H2x7.2L1
317 347 316 346 377 376 407 406
7.11H2x7.9L1
319 349 318 348 379 378 409 408
7.11H2x7.12L1
321 351 320 350 381 380 411 410
8.1H1x8.2L1
323 353 322 352 383 382 413 412
Además, la invención proporciona los siguientes puntos: 15
1. Una molécula de anticuerpo capaz de reconocer específicamente dos regiones de péptido de β-A4/Aβ4, en donde la primera región comprende la secuencia de aminoácidos AEFRHDSGY como se muestra en SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma y en donde la segunda región comprende la secuencia de aminoácidos VHHQKLVFFAEDVG como se muestra en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma.
20
2.
La molécula de anticuerpo del punto 1, en donde dicha molécula de anticuerpo reconoce al menos dos aminoácidos consecutivos dentro de las dos regiones de β-A4.
3.
La molécula de anticuerpo del punto 1 o 2, en donde dicha molécula de anticuerpo reconoce en la primera
25 región una secuencia de aminoácidos que comprende: AEFRHD, EF, EFR, FR, EFRHDSG, EFRHD o HDSG y en la segunda región una secuencia de aminoácidos que comprende: HHQKL, LV, LVFFAE, VFFAED o VFFA, FFAEDV.
4. La molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde dicha molécula de anticuerpo
30 comprende una región VH variable codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en una SEQ ID NO seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 5 o 7 o una región VH variable como se muestra en una SEQ ID NO seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 4, 6 o 8.
5. La molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde dicha molécula de anticuerpo
35 comprende una región VL variable codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en una SEQ ID NO seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 11 y 13 o una región VL variable como se muestra en una SEQ ID NO seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs: 10, 12 y 14.
imagen77
6. La molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde dicha molécula de anticuerpo comprende al menos una CDR3 de una región VL codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se
5 muestra en SEQ ID NOs: 15, 17 o 19 o al menos una secuencia de aminoácidos de CDR3 de una región VL como se muestra en SEQ ID NO: 16, 18 o 20 y/o en donde dicha molécula de anticuerpo comprende al menos una CDR3 de una región VH codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ ID NOs: 21, 23 o 25 o al menos una secuencia de aminoácidos de CDR3 de una región VH como se muestra en SEQ ID NOs: 22, 24 o 26.
7.
La molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en donde dicho anticuerpo se selecciona entre el grupo que consiste en MSR-3, -7 y -8 o una versión madurada por afinidad de MSR-3, -7 o -8.
8.
La molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 7, en donde dicha molécula de anticuerpo es
15 un anticuerpo completo (inmunoglobulina), un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)2, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, una construcción de anticuerpo bivalente, un anticuerpo sintético o un anticuerpo de clonación cruzada.
9.
La molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde dicha al menos dos regiones de β-A4 forman un epítopo conformacional o un epítopo discontinuo.
10.
La molécula de anticuerpo del punto 8 o 9, en donde dicho anticuerpo de clonación cruzada se selecciona entre el grupo que consiste en:
25 MS-R Nº3.3H1x3.4L9; MS-R Nº3.6H5 x 3.6L2; MS-R Nº3.6H8 x 3.6L2; MS-R Nº7.4H2 x 7.2L1; MS-R Nº7.9H2 x 7.12L2; MS-R Nº7.9H4 x 7.12L2; MS-RNº7.11H1 x 7.11L1; MS-R Nº7.11H1x 7.2L1; MS-R Nº3.4H1 x 3.4L9; MS-R Nº3.4H3 x 3.4L7;
35 MS-R Nº3.4H3 x 3.4L9; MS-R Nº3.4H7 x 3.4L9; MS-R Nº3.4H7 x 3.4L7; MS-R Nº3.6H5 x 3.6L1; MS-R Nº7.2H2 x 7.2L1; MS-R Nº7.4H2 x 7.12L2; MS-R Nº7.9H2 x 7.2L1; MS-R Nº7.9H2 x 7.12L1; MS-R Nº7.11H2 x 7.2L1; MS-R Nº7.11H2 x 7.9L1;
45 MS-R Nº7.11H2 x 7.12L1 o MS-R Nº8.1H1 x 8.2L1.
11.
Una molécula de ácidos nucleicos que codifica una molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 10.
12.
Un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos del punto 11.
13.
Una célula hospedadora que comprende el vector del punto 12.
55 14. Un método para la preparación de una molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 10 que comprende cultivar la célula hospedadora del punto 13 bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de anticuerpo y recuperar dicha molécula de anticuerpo de dicho cultivo.
15.
Una composición que comprende una molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 10 o una molécula de anticuerpo producida por el método del punto 14.
16.
La composición del punto 15, que es una composición farmacéutica o una composición de diagnóstico.
17.
El uso de una molécula de anticuerpo de uno cualquiera de los puntos 1 a 10 o una molécula de anticuerpo
65 producida por el método del punto 14, de una molécula de ácidos nucleicos del punto 11, de un vector del punto 12 o un hospedador del punto 13 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o

Claims (20)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de anticuerpo anti-péptido beta-A4 que comprende:
    (a)
    una región variable VL que comprende regiones determinantes de complementariedad, L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3, en donde:
    (1)
    L-CDR1 comprende SEQ ID NO: 143: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala;
    (2)
    L-CDR2 comprende SEQ ID NO: 144: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr; y
    (3)
    L-CDR3 comprende SEQ ID NO: 95: Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile; y
    (b)
    una región VH variable que comprende regiones determinantes de complementariedad, H-CDR1, H-CDR2 y CDR3, en donde:
    (1)
    H-CDR1 comprende SEQ ID NO: 146: Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser;
    (2)
    H-CDR2 comprende SEQ ID NO: 192: Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly; y
    (3)
    H-CDR3 comprende SEQ ID NO: 93: Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Val.
  2. 2. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de anticuerpo comprende una región VH variable como se muestra en una SEQ ID NO: 89 y una región VL variable como se muestra en una SEQ ID NO:
  3. 91.
  4. 3.
    La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha molécula de anticuerpo comprende una región VH variable codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en una SEQ ID NO: 88 una región VL variable codificada por una molécula de ácidos nucleicos como se muestra en una SEQ ID NO: 90.
  5. 4.
    La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha molécula de anticuerpo es un anticuerpo completo (inmunoglobulina), un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)2, un anticuerpo de cadena simple, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, una construcción de anticuerpo bivalente, un anticuerpo sintético o un anticuerpo de clonación cruzada.
  6. 5.
    Una molécula de ácidos nucleicos que codifica una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  7. 6.
    Un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 5.
  8. 7.
    Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 6.
  9. 8.
    Un método para la preparación de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7 bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de anticuerpo y recuperar dicha molécula de anticuerpo de dicho cultivo.
  10. 9.
    Una composición que comprende una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8.
  11. 10.
    La composición de la reivindicación 9, que es una composición farmacéutica o una composición de diagnóstico.
  12. 11.
    Uso de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8, de una molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 5, de un vector de la reivindicación 6 o un hospedadora de la reivindicación 7 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad asociada con amiloidogénesis y/o formación de placa de amiloide.
  13. 12.
    Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8, de una molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 5, de un vector de la reivindicación 6 o un hospedadora de la reivindicación 7 para su uso en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad asociada con amiloidogénesis y/o formación de placa de amiloide.
  14. 13.
    Uso de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8 para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de una enfermedad asociada con amiloidogénesis y/o formación de placa de amiloide.
  15. 14.
    Una composición de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8 para su uso en la detección de una enfermedad asociada con amiloidogénesis y/o formación de placa de amiloide.
  16. 15.
    Uso de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8 para la preparación de una composición farmacéutica para la desintegración de placas de β-amiloide.
  17. 16.
    Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8 para su uso en la desintegración de placas de β-amiloide.
  18. 17.
    Uso de una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8 para la preparación de una composición farmacéutica para la inmunización pasiva frente a formación de placa de β-amiloide.
  19. 18.
    Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de anticuerpo producida por el método de la reivindicación 8 para su uso en la inmunización pasiva frente a formación de placa de β-amiloide.
  20. 19.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 11, 13, 15 o 17, o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 12, o la composición de diagnóstico para el uso de la reivindicación 14, en donde dicha enfermedad es demencia, enfermedad de Alzheimer, neuropatía motora, síndrome de Down, enfermedad de Creutzfeld Jacob, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis tipo holandés, enfermedad de Parkinson, demencia relacionada con VIH, ELA o trastornos neuronales relacionados con la vejez.
    213 214
    imagen2
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