JP2005206520A - アテローム性動脈硬化抑制剤ならびにこれを含む食品および医薬 - Google Patents

Abstract

【要旨】
【課題】 肺炎クラミジアが産生するシャペロニンによる動脈平滑筋細胞の増殖を阻害し、アテローム性動脈硬化症の予防および治療に有効であり、かつ安全性の高い医薬および食品を提供する。
【解決手段】 セスキテルペン化合物、その中でも特にゼルンボン、フムレン、カリオフィレンなどのセスキテルペン類は、食用にも供される植物中に含まれる天然物であり、シャペロニンによる動脈平滑筋細胞の増殖を顕著に阻害するので、これらの１種または２種以上を含む医薬および食品は、アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化症に起因して発症する循環器系疾患の予防および治療に有用である。
【選択図】 図４

Description

本発明は、アテローム性動脈硬化抑制剤ならびにこれを含む食品および医薬に関する。

厚生労働省の最近の人口動態統計によると、疾患別死亡者の１位が悪性新生物（腫瘍およびガン）、２位が心疾患、３位が脳血管疾患である。心疾患では、血管疾患を主因とするものが大きな割合を占め、また脳血管疾患は文字通り血管疾患を原因とする。心疾患および脳血管疾患による死亡者の合計は２８万人にも達し、悪性新生物による死亡者数にほぼ匹敵する。現在、４５〜７４歳の男性の約１２％および女性の約８％が、動脈硬化など血管疾患を抱えていると推定され、血管疾患患者は年々増加の一途を辿っている。高齢化社会への移行が進む中で、糖尿病、高血圧などの予防と並んで、血管疾患の予防は非常に重大な問題である。

動脈硬化とは、動脈壁が肥厚して弾性を失う複数疾患の総称であり、その１つに、アテローム性動脈硬化症がある。アテローム性動脈硬化症は、血管内皮下のアテローム化（粥状脂肪沈着）と血管壁の肥厚性硬化とを伴う全身性の動脈疾患であり、肺炎クラミジア（Chlamydia peneumoniae）の感染によって引き起こされる。肺炎クラミジアが感染すると、初期段階では動脈平滑筋細胞が異常に増殖し、ついで血管内膜全体に粥状脂肪が沈着するアテローム化さらには血管壁の肥厚性硬化が起こり、血管内腔が狭まる。多くのアテローム病巣中で、肺炎クラミジアおよび肺炎クラミジアが産生するシャペロニン（Ｈｓｐ６０）の存在が認められている。また、シャペロニンをヒト動脈平滑筋細胞に暴露することによって、該平滑筋細胞の増殖が観察されることが報告されている。

アテローム性動脈硬化症は、特に、心臓血管（冠血管）、大動脈、下肢血管、腎臓、脳などの動脈に多くみられ、冠状動脈、冠状大動脈などのアテローム性動脈硬化、下肢動脈閉塞などを起こし、ひいては脳軟化症、狭心症、心筋梗塞、高血圧症、下肢閉塞性動脈疾患、肢壊疽などの重大な疾病を引き起こす。

なお、アテローム性動脈硬化症は、血管平滑筋線維の破壊および弾性繊維の断裂によって血管壁の硬化が起こる、血管の変性病変である動脈硬化症とは、発症の原因および病態が異なる別の疾患として明確に区別される。

従来、アテローム性動脈硬化症の治療には、コレステロール低下剤、抗高脂血症剤などが用いられる。これは、アテローム病巣が主に脂質を持つ細胞とコレステロール結晶とを含むことに基づくものであるけれども、有意な治験を得るには至っていない。したがって、予防および治療には、食事療法に頼らざるを得ないけれども、食事療法も有効な方法とはいえない。このように、アテローム性動脈硬化症の予防および治療に有効な薬剤および方法はいまだ開発されるには至らない。

一方、ゼルンボン、フムレン、カリオフィレンなどのセスキテルペン類は、たとえば、マツ科、クワ科、ショウガ科などの植物中に存在する天然物であり、従来から安全性の高い着香料として、化粧料、整髪料、浴用剤、消臭剤、芳香剤、洗剤などに利用され、さらに食品にも添加される。また、着香料以外の用途としては、たとえば、抗アレルギー剤（たとえば、特許文献１参照）、中枢神経賦活剤（たとえば、特許文献２参照）、抗ヘリコバクター・ピロリ剤（たとえば、特許文献３）、ウイルス性疾患および細菌疾患抑制剤（たとえば、特許文献４、特許文献５参照）などの医薬用途が提案されている。ゼルンボンは抗ガン剤としての用途も公知である。さらに、β−カリオフィレンアルコールなどの誘導体は、抗消化性潰瘍剤として用いられる（たとえば、特許文献６参照）。

しかしながら、従来の特許文献に記載の医薬用途は、いずれも、アテローム性動脈硬化症とは関連性のないものである。さらに、特許文献４および５には、その特許請求の範囲に具体的な細菌名が特定されているけれども、肺炎クラミジアおよびその感染によって引き起こされるアテローム性動脈硬化症に関する記載はない。このように、セスキテルペン類をアテローム性動脈硬化症の予防および治療に用いることについての提案は、従来技術には見られない。

特開平７−２１５８４６号公報 特開平７−２５８１０１号公報 特開平１１−１４２９号公報 特開平１１−３２２６２３号公報 特開２０００−１１９１８８号公報 特開平１０−２２６６４０号公報

本発明の目的は、肺炎クラミジアの感染によって引き起こされるアテローム性動脈硬化症の予防および治療に有用であり、かつ安全性の高いアテローム性動脈硬化症抑制剤ならびにこれを含む食品および医薬を提供することである。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、セスキテルペン類が、予想外にも、優れたアテローム性動脈硬化症抑制効果を有することを見出し、本発明を完成した。

本発明は、セスキテルペン化合物を有効成分として含有することを特徴とするアテローム性動脈硬化抑制剤である。

さらに本発明のアテローム性動脈硬化抑制剤は、前述のセスキテルペン化合物が、一般式

〔式中、Ａはカルボニル基またはメチレン基を示す。Ｂは基−Ｃ（＝ＣＨ_２）−または基−ＣＲ^１−（式中Ｒ^１は低級アルキル基である）を示す。Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は同一または異なって低級アルキル基を示す。シクロトリエン骨格の１位と２位との炭素間結合および８位と９位との炭素間結合はそれぞれ一重結合または二重結合を示す。１位と９位との炭素間結合は無結合または一重結合を示す。ただし、Ｂが基−（＝ＣＨ_２）−を示す時は、１位と２位との炭素間結合は一重結合であり、Ｂが基−ＣＲ^１−を示す時は、１位と２位との炭素間結合は二重結合である。〕
で表わされるセスキテルペン化合物誘導体から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする。

さらに本発明のアテローム性動脈硬化抑制剤は、前述のセスキテルペン化合物が、フムレン、カリオフィレンおよびゼルンボンから選ばれる１種または２種以上のセスキテルペン類であることを特徴とする。

また本発明は、前述のいずれか１つのアテローム性動脈硬化抑制剤を含有することを特徴とする食品である。

また本発明は、前述のいずれか１つのアテローム性動脈硬化抑制剤を含有することを特徴とする医薬である。

本発明によって提供されるアテローム性動脈硬化抑制剤は、肺炎クラミジアが産生するシャペロニンの動脈平滑筋細胞増殖活性を阻害するので、それによって、アテローム性動脈硬化症の発症を抑制することができる。

本発明のアテローム性動脈硬化抑制剤において、有効成分として用いられるセスキテルペン化合物の中でも、アテローム性動脈硬化抑制作用および安全性を考慮すると、上記一般式（１）で表されるセスキテルペン化合物が好ましく、フムレン、カリオフィレンおよびゼルンボンから選ばれるセスキテルペン類が特に好ましい。

フムレン、カリオフィレンおよびゼルンボンから選ばれるセスキテルペン類は、従来から食用に供されてきたハナショウガなどのショウガ科、クワ科植物に含まれる天然物であるため、人体に対する安全性が非常に高い。しかも、顕著に優れたアテローム性動脈硬化抑制作用を有する。たとえば、シャペロニンによるラット動脈平滑筋細胞増殖阻害活性は、ＩＣ_５０値として、フムレンが５．４μＭ、カリオフィレンが６．９μＭおよびゼルンボンが４０．８μＭである。

さらに本発明によれば、本発明のアテローム性動脈硬化抑制剤を含む食品および医薬が提供され、これらは、アテローム性動脈硬化症の発症およびそれに起因する疾患に対する予防剤および治療剤として非常に有用である。特に、本発明の医薬は、アテローム性動脈硬化症に起因する各種循環器疾患の治療薬として有用である。

本発明のアテローム性動脈硬化抑制剤は、セスキテルペン化合物から選ばれる１種または２種以上を有効成分として含有する。

セスキテルペン化合物としては特に制限されず、公知のものを使用できるけれども、そのアテローム性動脈硬化抑制作用および安全性を考慮すると、一般式

〔式中、Ａ、Ｂ、Ｒ^２〜Ｒ^４、シクロトリエン骨格の１位と２位との炭素間結合、８位と９位との炭素間結合および１位と９位との炭素間結合は上記に同じ。〕
で表されるセスキテルペン化合物（以後「セスキテルペン化合物（１）」と称す）が好ましい。

一般式（１）において、符号Ａで示されるメチレン基は、その炭素原子上に置換基として水酸基、基−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^５（式中Ｒ^５は低級アルキル基を示す）などを有することができる。

また上記において、符号Ｒ^１〜Ｒ^５で示される低級アルキル基としては、たとえば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｓｅｃ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基などの、炭素数１〜４の直鎖または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。

セスキテルペン化合物（１）の具体例としては、たとえば、ゼルンボン、フムレン、カリオフィレンなどのセスキテルペン類、特開２００２−１５５００１号公報に記載のゼルンボン誘導体などが挙げられる。

これらの中でも、ゼルンボン、フムレンおよびカリオフィレンから選ばれる１種または２種以上のセスキテルペン類が好ましい。なお、フムレンの中ではα−フムレンが好ましい。また、カリオフィレンにはβ−カリオフィレン、γ−カリオフィレンなどがあり、その中でもβ−カリオフィレンが好ましい。

ゼルンボンは下記化学構造式を有し、主に、ハナショウガなどのショウガ科植物中に存在する天然物である。

α−フムレンは下記化学構造式を有し、主に、クワ科植物、イワタバコ科植物、マツ科植物、ホップ、チョウジ油、ラベンダー油中に存在する天然物である。

β−カリオフィレンは下記化学構造式を有し、主に、チョウジなどのフトモモ科植物、ラベンダー油中に存在する天然物である。γ−カリオフィレンも、β−カリオフィレンと同様の植物および精油中に存在する。

これらのセスキテルペン類は、上記のように、いずれも食用植物中に存在する天然物であり、人体に対する安全性が非常に高い。さらに、アテローム動脈硬化抑制作用にも顕著に優れる。

セスキテルペン類は、該セスキテルペン類を含む植物から、一般的な単離精製手段に従って得ることができる。セスキテルペン類を含む植物は、その全体を用いてもよくまたは根、茎、葉、果実、種子、果皮、樹皮、幹、枝、花、蕾などの植物の一部を用いてもよい。さらにその乾燥品、粉砕品、抽出品（たとえば、精油、生薬）などを用いることもできる。単離精製手段としては特に制限はなく、たとえば、蒸留、水蒸気蒸留、抽出、再結晶、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーなどが挙げられる。

より具体的には、セスキテルペン類を含む植物および／またはその一部を水蒸気蒸留に供して、セスキテルペン類を含む留分を得、この留分を、蒸留、クロマトグラフィーなどに供することにより、所望のセスキテルペン類が得られる。

また、セスキテルペン類を含む植物および／またはその一部を適当な溶媒によって抽出し、得られる抽出液を上記と同様の単離精製手段に従って精製することにより、所望のセスキテルペン類が得られる。抽出に用いられる溶媒としては特に制限されず、たとえば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール類、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどのグリコール類、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンなどが挙げられる。溶媒は１種を単独で使用できまたは２種以上を併用できる。これらの中でも、低級アルコール類、水と低級アルコール類との混合溶媒などが好ましい。なお、水と低級アルコール類との混合溶媒において、低級アルコール類の含有量は特に制限されないけれども、通常は該混合溶媒全量の５〜５０重量％である。抽出は、たとえば、セスキテルペン類を含む植物および／またはその一部をエタノールに浸漬し、室温または加熱下に、２〜３日程度撹拌を行うことにより実施できる。抽出後はろ過、遠心分離などにより固形分を除去し、得られる抽出液を、蒸留、クロマトグラフィー、減圧乾燥、凍結乾燥などに供することにより、セスキテルペン類を得ることができる。
さらに、商業的に入手できるセスキテルペン類を用いることもできる。

本発明のアテローム性動脈硬化抑制剤は、セスキテルペン化合物の１種または２種以上のみからなるものでもよく、またはそれと共に適当な添加剤を併用し、種々の形態に調製することができる。そのような形態の一例として、たとえば、食品、医薬などが挙げられる。

本発明の食品は、一般的な各種の食品に、セスキテルペン化合物、好ましくはセスキテルペン化合物（１）、さらに好ましくはセスキテルペン類から選ばれる１種または２種以上を含有させたものである。

本発明の食品の形態は特に制限されず、固体、半固体、液体、流動食などのいずれであってもよい。その具体例としては、たとえば、ガム、キャンディ、グミ、錠菓、チョコレート、焼き菓子、ケーキなどの菓子類、ゼリー、ムースなどのデザート類、かき氷、シャーベットなどの冷菓、アイスクリーム、生クリーム、ヨーグルト、バター、チーズなどの乳製品、生麺、干麺、ゆで麺、蒸し麺、あげ麺、即席麺など麺類、かまぼこ、ちくわなどの水産加工品、ハム、ソーセージなどの畜産加工品、パン、ジャムなどの農産物加工品、サラダ油、てんぷら油などの食用油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシングなどの油脂加工食品、缶詰、瓶詰などの長期保存用加工食品、ソース、たれ、スープなどの調味料類、炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、ミネラルウォーター、アルコール飲料、果汁飲料、栄養飲料などの飲料、ドリンク剤などが挙げられる。また、ハードカプセル、ソフトカプセル、顆粒、錠剤（タブレット）などに成形し、または粉末の状態で、健康食品、機能性食品などとして利用することもできる。

本発明の食品において、セスキテルペン化合物の含有量は特に制限されず、広い範囲から適宜選択できるけれども、通常は、セスキテルペン化合物を０．１〜２０００ｍｇ、好ましくは１〜１０００ｍｇの範囲で含有するものが好ましい。そして、成人１日当たりのセスキテルペン化合物の摂取量は、通常１〜５００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇを目安にすればよい。

本発明の食品は、食品原料にセスキテルペン化合物を添加するかまたは食品製造工程のうちの適当な工程で加工中の食品にセスキテルペン化合物を添加する以外は、通常の食品製造方法と同様にして製造できる。

本発明の医薬は、セスキテルペン化合物を含有する医薬組成物および医薬部外品である。本発明の医薬組成物は、経口的または非経口的に投与可能な種々の製剤形態に調製される。剤形の具体例としては、たとえば、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤、舌下剤、トローチなどの固形製剤、懸濁剤、乳剤、注射剤、輸剤、うがい液、うがい薬、点鼻薬、喉噴霧剤などの液状製剤、軟膏剤などの半固形製剤、エアゾール剤などが挙げられる。

本発明の医薬組成物の製剤は、通常の方法に従って製造できる。例えば、固形製剤は、デンプン、乳糖、マンニットなどの賦形剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、軽質無水ケイ酸などの流動性向上剤、安定剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤などを適宜組み合わせて処方することにより製造できる。また、液状製剤は、乳化剤、界面活性剤、相溶化剤、糖類、アルコール類、懸濁化剤、増粘剤、保存剤、溶解補助剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤などを適宜組み合わせて処方することにより製造できる。さらに、必要に応じて、蒸留水、生理食塩水、グルコース溶液などの液状担体が用いられる。半固形製剤は、油性基剤、疎水性基剤、乳剤性基剤、親水性基剤、水溶性基剤などを適宜組み合わせて処方することにより製造できる。エアゾール剤は、液状製剤の成分と共に、噴霧剤、溶媒、高級脂肪酸エステルなどを含むものである。

医薬部外品としては、たとえば、洗口剤、歯磨剤、含嗽剤、鼻炎用剤などが挙げられる。

これらの中でも、主に経口投与に供される固形製剤、経口投与または非経口投与に供される液状製剤などの製剤形態が好ましい。

本発明の医薬において、セスキテルペン化合物の含有量は特に制限されず、広い範囲から適宜選択できるけれども、通常は、セスキテルペン化合物を１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５００ｍｇの範囲で含有するように製剤化される。

本発明の医薬は、成人１日当りのセスキテルペン化合物量として、０．０５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ投与される。また本発明の医薬は、１日に１〜数回に分けて投与することができる。

本発明の医薬は、アテローム性動脈硬化症に起因する各種循環器疾患の予防および治療に特に有効である。

以下に参考例、試験例、製剤例および実施例（食品製造例）を挙げ、本発明を具体的に説明する。

（参考例１）
〔シャペロニンの合成〕
ＧｒｏＥＬ１蛋白質（ＣＰ−Ｈｓｐ６０−１、シャペロニン）をコードする遺伝子を、前駆体Ｃ．Ｐ．Ｇｒｏｌ−Ｎ（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＡＴＡＡＴＧ−３’）および前駆体Ｃ．Ｐ．Ｇｒｏｌ−Ｃ（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣ−３’）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応は、次のようにして実施した。ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＫＯＤ−プラス−、東洋紡績（株）製）１ユニット、鋳型としての肺炎クラミジアＪ１３８株のゲノムＤＮＡ ２ｎｇ、前駆体（Ｃ．Ｐ．Ｇｒｏｌ−ＮおよびＣ．Ｐ．Ｇｒｏｌ−Ｃ）０．２μＭ、およびｄＮＴＰ ０．２ｍＭを５０μＬの溶液中で混合し、９５℃で１５秒間の加熱を３０サイクル行ってゲノムＤＮＡを変性させ、５３℃で３０秒間の加熱を３０サイクル行ってアニーリングし、さらに６８℃で９０秒の加熱を３０サイクル行ってＤＮＡを拡張した。低融点アガロースゲルによるゲルろ過の後、単離された断片を、制限酵素（ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ）により切断し、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローンした。

Ｃ末端に余分なアミノ酸（ロイシン、グルタミン酸および６個のヒスチジン残基）が融合した、ベクターｐＥＴ−２２（＋）由来のＣＰ−Ｈｓｐ６０−１組換え体を、２８℃で、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１中で発現させた。得られた組み換え体蛋白質の粗製品を、Ｎｉ^２＋−ニトリロトリ酢酸カラムで精製し、続いて、セファデックス２００ＨＲ １０／３０カラム（アマーシャム・バイオサイエンス社（Amarsham
Biosciences）製、米国）を用い、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を溶出溶媒とするゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。蛋白質濃度を、親ウシ血清アルブミンを標準とするブラッドフォード法（Bradford，M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding. Anal.Biochem.1976,72,248−254）によって測定した。精製された該蛋白質は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単品であり、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０によって染色された。

（参考例２）
〔ラット動脈平滑筋細胞の培養〕
ラット動脈平滑筋細胞を、ＳＤラット動脈を体外培養することによって調製した。１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾンを含むダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にて、３７℃で培養し、２〜１０継代後のものを用いた。

（試験例１）
〔シャペロニンの細胞増殖活性（１）〕
参考例２で得られたラット動脈平滑筋細胞培養液１ｍｌ（細胞数１×１０^５個）を２４ウエルプレートに注入し、１０％ＦＣＳの存在下で１日間インキュベートし、ついでＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で２４時間、３６時間または４８時間飢餓状態に晒した。

次いで、この培養液に、ＦＣＳを最終濃度が１０％になるようにまたは参考例１で得られたシャペロニンの１０％ＰＢＳ（−）溶液を最終濃度が１０μｍ／ｍｌになるように添加し、２４時間、４８時間または７２時間インキュベートした。この後、培養液中の細胞数を血球計測器により計測した。結果を図１に示す。図１は、シャペロニンによるラット動脈平滑筋細胞の増殖活性を示すグラフである。図１から、シャペロニンを添加した処理区では、ＦＣＳのみを加えた非処理区に比べて、ラット動脈平滑筋細胞の細胞数が大幅に増大し、シャペロニンが、優れたラット平滑筋細胞増殖活性を有することが明らかである。

（試験例２）
〔シャペロニンの細胞増殖活性（２）〕
参考例２で得られたラット動脈平滑筋細胞培養液１ｍｌ（細胞数１×１０^５個）を２４ウエルプレートに注入し、１０％ＦＣＳの存在下で１日間インキュベートし、ついでＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で４８時間飢餓状態に晒した。

次いで、この培養液に、参考例１で得られたシャペロニンの１０％ＰＢＳ（−）溶液を最終濃度が０．１、１．０、５．０、１０、２０または５０μｍ／ｍｌになるように添加し、４８時間インキュベートした。コントロールとして、細胞培養液にＰＢＳ（−）のみを添加し、４８時間インキュベートした。この後、培養液中の細胞数を血球計測器により計測した。試験数は各シャペロニン濃度で４回とし、その平均値を求めた。結果を図２に示す。図２は、シャペロニンによるラット動脈平滑筋細胞の増殖活性を示すグラフである。図２から、シャペロニンの曝露は、コントロールと比較して０．１、１．０および５．０μｇ／ｍｌではあまり大きな差はみられないけれども、１０、２０および５０μｇ／ｍｌでは、それぞれコントロールに対して２．３倍、３．２倍および３．７倍細胞数が増加することが判る。これらの濃度に設定したシャペロニンでは、２０μｇ／ｍｌが最大に近い細胞増殖活性を有するものと考えられる。また、シャペロニンを熱処理または酵素処理をして失活させた後、前記と同様のアッセイを行ったが、細胞数はコントロールとほぼ同じ細胞数で、増殖活性はみられなかった。

（試験例３）
〔シャペロニン阻害活性試験（１）〕
参考例２で得られたラット動脈平滑筋細胞培養液１ｍｌ（細胞数１×１０^５個）を２４ウエルプレートに注入し、１０％ＦＣＳの存在下で１日間インキュベートし、ついでＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で４８時間飢餓状態に晒した。

次いで、この培養液に、下記の各供試化合物のジメチルスルホキシド溶液を添加した。このとき、各供試化合物の添加量が１０００ｐｐｍおよび培養液中でのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度が１％になるようにした。ＤＭＳＯ濃度が１％の場合には、細胞の増殖に影響を及ぼさないことを予め確認した。各供試化合物を添加して１時間後に、参考例１で得られたシャペロニンの１０％ＰＢＳ（−）溶液をシャペロニンの最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように添加した。コントロールには、濃度が１％になるようにＤＭＳＯを加え、さらにシャペロニンのＰＢＳ（−）溶液またはＰＢＳ（−）のみを加えた。この状態で４８時間インキュベーションした後、培養液中の細胞数を血球計数器により計測した。試験数は各供試化合物で４回とし、その平均値を求めた。

［供試化合物］
下記供試化合物は、いずれもガン細胞に対して生理活性を示すものである。
Ｚ：ゼルンボン（ハナショウガ由来）
Ｅｕｇ：オイゲノール（柑橘類由来）
ＥｕｇＧ：オイゲノール（Ｅｕｇ）のグルコース配糖体
Ｓｅｓ：セサモール（ゴマ由来）
ＳｅｓＧ：セサモール（Ｓｅｓ）のグルコース配糖体
ＡＭ：アナカルド酸モノエン（カシューナッツ由来）
ＡＭＧ：アナカルド酸モノエン（ＡＭ）のグルコース配糖体
ＡＴ：アナカルド酸トリエン（カシューナッツ由来）
ＡＴＧ：アナカルド酸トリエン（ＡＴ）のグルコース配糖体
ＡｓｃＧ：アスコルビン酸のグルコース配糖体（ブナシメジ由来）
ゼルンボン以外の供試化合物は、下記の化学構造式を有する。

結果を図３に示す。図３は、供試化合物のシャペロニンによる細胞増殖に対する影響を示すグラフである。図３から次のことが明らかである。シャペロニンのみを曝露したものは、コントロール（ＰＢＳ（−）とＤＭＳＯを１％加えたもの）に比べ、１．５〜３．５倍細胞数が増加した。ＺおよびＳｅｓは、シャペロニンによる細胞増殖作用を５０〜６０％抑制した。一方、Ｅｕｇ−ＧおよびＡＳＣ−Ｇは、肺炎クラミジアのシャペロニンのみを曝露したものよりも２倍近く細胞数を増加させた。

（試験例４）
〔シャペロニン阻害活性試験（２）〕
試験例３において、ゼルンボン（Ｚ）およびセサモール（Ｓｅｓ）に高い阻害活性が認められたので、これらの類似化合物を供試化合物とし、各供試化合物の添加濃度を０〜２０μｇ／ｍｌの範囲で変化させる以外は、試験例３と同様にしてシャペロニン阻害活性試験を行った。コントロールには、供試化合物を添加せず、シャペロニンのみを添加した。

ゼルンボン（Ｚ）の類似化合物としては、フムレン（ＨＬ）およびカリオフィレン（ＣＡ）を用いた。

セサモール（Ｓｅｓ）の類似化合物として、セサモールのジオキシメチルが開環したバニニルアルコール（ＶａｎＡ）およびバニニルアルコールのアルコール部分の炭素数が増加したトランスフエルラ酸（ＦｅｒＡ）を用いた。これらの化合物の化学構造式は下記に示すとおりである。

得られた結果から、下記式に基づいて各供試化合物のシャペロニン阻害活性（％）を算出した。
シャペロニン阻害活性（％）＝（Ｘ−Ｙ）／Ｘ×１００
（Ｘ：コントロールの細胞数、Ｙ：各供試化合物の細胞数）

結果を図４に示す。図４は、供試化合物のシャペロニン阻害活性を示すグラフである。図４から、ラット動脈平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）に対するゼルンボン（Ｚ）ならびにその誘導体であるフムレン（ＨＬ）およびカリオフィレン（ＣＡ）が、セサモール（Ｓｅｓ）ならびにその誘導体であるバニニルアルコール（ＶａｎＡ）およびトランスフエルラ酸（ＦｅｒＡ）に比べて、非常に高いシャペロニン阻害活性を示すことが判る。

以上の試験結果から、ゼルンボン、フムレンおよびカリオフィレンについて、シャペロニンによって誘導されるラット動脈平滑筋細胞の増殖を５０％阻害するのに必要な化合物濃度（Ｍ）、すなわちＩＣ_５０を算出したところ、フムレン：５．４μＭ、カリオフィレン：６．９μＭ、ゼルンボン：４０．８μＭとなり、この点からも非常に高い阻害活性を示すことが確認された。

（製剤例１）
下記配合量のβ−カリオフィレン、乳糖、コーンスターチおよびカルボキシメチルセルロースカルシウムを充分混合し、メチルセルロース水溶液を用いて混合物を顆粒化し、２４メッシュの篩を通し、これをステアリン酸マグネシウムと混合し、錠剤にプレスして、１錠当りβ−カリオフィレンを３００ｍｇ含有する錠剤２０００錠を調製した。
β−カリオフィレン ６００ｇ
乳糖（日本薬局方品） ６７ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品） ３３ｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム（日本薬局方品） ２５ｇ
メチルセルロース（日本薬局方品） １２ｇ
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品） ３ｇ

（製剤例２）
下記配合量の各成分を細かく粉末にし、均一な混合物となるように混和した後、所望の寸法を有する経口投与用ゼラチンカプセルに充填して、１カプセル当りゼルンボン２００ｍｇを含有するカプセル剤を（２０００カプセル）を調製した。
ゼルンボン ４００ｇ
結晶セルロース（日本薬局方品） ６０ｇ
コーンスターチ（日本薬局方品） ３４ｇ
タルク（日本薬局方品） ４ｇ
ステアリン酸マグネシウム（日本薬局方品） ２ｇ

（実施例１）
β−カリオフィレン２ｇ、砂糖１００ｇ、水飴１００ｇ、クエン酸１ｇ、香料０.４ｇおよび着色料０.１ｇを用い、キャンディを調製した。

シャペロニンによるラット動脈平滑筋細胞の増殖活性を示すグラフである。 シャペロニンによるラット動脈平滑筋細胞の増殖活性を示すグラフである。 供試化合物のシャペロニンによる細胞増殖に対する影響を示すグラフである。 供試化合物のシャペロニン阻害活性を示すグラフである。

Claims (5)

1. セスキテルペン化合物を有効成分として含有することを特徴とするアテローム性動脈硬化抑制剤。
2. セスキテルペン化合物が、一般式
   

   

   〔式中、Ａはカルボニル基またはメチレン基を示す。Ｂは基−Ｃ（＝ＣＨ_２）−または基−ＣＲ^１−（式中Ｒ^１は低級アルキル基である）を示す。Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は同一または異なって低級アルキル基を示す。シクロトリエン骨格の１位と２位との炭素間結合および８位と９位との炭素間結合はそれぞれ一重結合または二重結合を示す。１位と９位との炭素間結合は無結合または一重結合を示す。ただし、Ｂが基−（＝ＣＨ_２）−を示す時は、１位と２位との炭素間結合は一重結合であり、Ｂが基−ＣＲ^１−を示す時は、１位と２位との炭素間結合は二重結合である。〕
   で表わされるセスキテルペン化合物から選ばれる１種または２種以上であることを特徴とする請求項１記載のアテローム性動脈硬化抑制剤。
3. セスキテルペン化合物が、フムレン、カリオフィレンおよびゼルンボンから選ばれる１種または２種以上のセスキテルペン類であることを特徴とする請求項１または２記載のアテローム性動脈硬化抑制剤。
4. 請求項１〜３のいずれか１つのアテローム性動脈硬化抑制剤を含有することを特徴とする食品。
5. 請求項１〜３のいずれか１つのアテローム性動脈硬化抑制剤を含有することを特徴とする医薬。

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