JP2012077002A - ATL及びHTLV−1関連炎症疾患をターゲットとしたNF−κB亢進抑制剤及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明のNF-κB亢進抑制剤は、β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする。
【選択図】なし
Description
β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進抑制剤。
β-カリオフィレン又はその薬学上許容される塩を有効成分とする、Tax分解誘導剤。
(III-1)β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物。
(III-2)上記NF-κB亢進がTax誘導性NF-κB亢進である、(III-1)に記載する組成物。
(III-3)上記NF-κB亢進がTNF誘導性NF-κB亢進である、(III-1)に記載する組成物。
(III-4)上記疾患が、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)またはヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)関連炎症性疾患である、(III-1)に記載する組成物。
(III-5)上記HTLV-1関連炎症性疾患が、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患からなる群より選択される少なくとも1種である、(III-4)に記載する組成物。
(III-6)ヒトT細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)発症を抑制するために用いられる(III-4)に記載する組成物。
(III-7)上記成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)が急性型またはリンパ腫型ATLである(III-6)に記載する組成物。
(III-8)ヒトT細胞白血病ウイルス感染者に対して投与される組成物であって、当該感染者が急性型またはリンパ腫型ATLに移行することを阻止する介入型のATL発症予防用組成物である、(III-4)に記載する組成物。
またATL発症後は、本発明によれば、NF-κB過剰活性化が抑制できるためATL細胞の無秩序な増殖を阻止し、抗カルシウム血症や皮膚炎症症状などNF-κB過剰活性化を原因とする症状・病態を軽減することが可能になる。
ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)が産生するガン遺伝子産物Taxは、難治性の白血病・リンパ腫である成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia:ATL)発症に必須の細胞不死化やATL患者で頻繁に観察される高カルシウム血症や皮疹などの原因となるNF-κB過剰活性(Tax誘導性NF-κB亢進)を誘導する。このTax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果を検討するため、既にTax分化誘導とNF-κB抑制効果が確認されている分子シャペロン阻害剤17-DMAG(陽性コントロール)と共に、環式セスキテルペンに該当するβカリオフィレン及びゼランボン、並びにモノテルペンに該当するペリルアルデヒド及びチモール(図2)について、Tax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果を調べた。
(1-1)細胞と細胞培養法
ヒト胎児腎由来HEK293細胞(以後、「293細胞」という)は、10% FBS、2mM L-グルタミン、Penicillin-Streptomycin(PC/SM)を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium(Gibco)(以下、この培地を「DMEM」という)を培養液とし、25cm2培養フラスコ内で37℃、5%CO2で維持、3日ごとに全体の1/10量の細胞を継代に使用した。
(a)ほぼコンフルエントに293細胞が増殖した継代培養フラスコからDMEMを吸引除去し、PBS 5mLで1回洗浄。
(b)トリプシンおよび1mM EDTA含有PBS 1.5mLを加え5分静置後、ピペットにて293細胞をフラスコ底部から遊離・懸濁し、10%FBS、L-グルタミン、PC/SM添加DMEMを15mL加え更に懸濁。
(c)12ウェルプレートの各ウェルに、0.6mLずつ細胞懸濁培養液を移し(5x104/well)、〜60%コンフルエントになるまで培養(約一晩)。
NF-κB結合配列を有し、NF-κB依存的にホタルルシフェラーゼの転写・翻訳を誘導するベクター NF-κB-luc(Dr. M. Lienhard Schmitz. Department of Immunochemistry, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany.より入手)をNF-κB活性化を測定するためのリポータープラスミドとして、また、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター依存的にβガラクトシダーゼを発現するRSV-βgal(Dr. Kuan Teh Jeang, Molecular Virology Section, Laboratory of Molecular Microbiology, NIAID, the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA.より入手)をトランスフェクションモニターとして、それぞれ使用した。さらにTax遺伝子導入実験系においては、SV40プロモーター及びβグロビンイントロン依存的にTaxを発現するpSG5-Taxか、HTLV-1 LTR依存的にTaxタンパク質を発現するベクターpLTR-Tax(Iha, H.,未発表)を用いた。
Tax遺伝子導入実験系では、(1-1)で調製したトランスフェクション実験用細胞に、NF-κB-luc(0.05μg)、pRSV-βgal(0.05μg)、ベクターpSG5-Tax(またはpLTR-Tax)および、対照群としてpSG5(Agilent)を0.25μg、またTNF-α投与実験系では、(1-1)で調製したトランスフェクション実験用細胞に、NF-κB-luc(0.05μg)、pRSV-βgal(0.05μg)、およびpcDNA3(Invitrogen) (0.25μg)を、それぞれ導入(トランスフェクション)した。
96ウェルプレートの各ウェルに細胞溶解液を5μLずつ分注し、直ちにルシフェラーゼアッセイ用基質Luciferase Assay Substrate (Promega)50μLまたはβ-ガラクトシダーゼアッセイ用基質Galacto-Star: Galacto-Star Reaction Buffer Diluent(Applied Biosystems) 1:50混合液基質を自動分注し、発光強度を測定するルミノメーター(GloMax-96 Microplate Luminometer、Promega)で解析した。
NF-κB活性(%)は、最低3回の同一実験から得られたルシフェラーゼアッセイ測定値をβ-ガラクトシダーゼアッセイ測定値で割り標準化した後、平均値±SDで示した。トランスフェクション操作から24時間後にコントロール用にPBSを加えた細胞のルシフェラーゼ値及びβ-ガラクトシダーゼ値を常に基準値(100%)とし、それに対する相対値から各細胞のNF-κB活性を算出した。
Tax遺伝子導入実験系における各被験化合物のNF-κB抑制効果(IC50)は、17-DMAG(177 nM)、βカリオフィレン(225μM)、ゼランボン(16.7μM)、ペリルアルデヒド(133μM)、チモール(352μM)であった(図3(A))。一方、TNF-α投与実験系における各被験化合物のNF-κB抑制効果(IC50)は、17-DMAG(191 nM)、βカリオフィレン(211μM)、ゼランボン(17.7μM)、ペリルアルデヒド(197μM)、チモール(300μM)であった(図3(B))。
実験例1で示されたTax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果の作用機序を検討するため、Tax遺伝子導入系における3種類の蛋白質(Tax、I-κB、Tubulin)の細胞内安定性について免疫ブロット法(WB)用いて検討した。なお、I-κBの分解はNF-κB活性化と逆相関関係にあり、またTubulinの減少は細胞の死滅と相関関係にあることが知られている。
細胞のトランスフェクション、テルペン類の投与と細胞の回収、溶解、ルシフェラーゼ活性の測定までは、上記実験例1と全く同様の方法で行った。
ルシフェラーゼ活性測定後の細胞融解液は、超音波処理により核染色体DNAを分解後、Protein Assay Kit (Bio-Rad)にて、蛋白質濃度を測定した。各細胞融解液を10μgずつ、βメルカプトエタノール入りSDSサンプルバッファと4:1の容量比で混和し、95℃で5分加熱処理後SDS-PAGEで泳動・展開後、半乾式蛋白転写法を用いてPVDF-membrane(Millipore)に転写し、抗Tax抗体(田中勇悦博士、琉球大学医学部免疫学講座より入手)、抗I-κB(Cell Signaling Technology)、抗Tubulin(Sigma)を用いて、それぞれの発現量を検出した。
結果を図4に示す。対照群(図4(A)レーン1)に対してTax遺伝子導入群はNF-κBの活性が20.4倍増加した(図4(A)レーン2)。その様な条件に、テルペン類を加えると以下のようにNF-κBの活性が抑制された。17-DMAG:3μM(1.2、5.9%)(図4(A)レーン3)、βカリオフィレン: 300 μM(4.2、20.6%)(図4(A)レーン6)、ゼランボン: 30 μM(3.5、17.2%)(図4(A)レーン7)、ペリルアルデヒド: 300 μM(6.7、32.8%)(図4(A)レーン5)、チモール: 300 μM(12.6、61.8%)、(図4(A)レーン4)。図4(B)に、その際の上記3種類の蛋白質分子(Tax、I-κB、Tubulin)の発現を示す。
上記実験例1及び2で示されたβカリオフィレン及びその他のテルペン類による、抗Tax・抗NF-κB効果が、果たして末梢血リンパ球(PBL)にはあまり影響を与えず、ATL細胞対して特異的にアポトーシス若しくは増殖の抑制を誘導するか、キャスパーゼ活性(Caspase3/7アッセイ)並びに細胞増殖活性(CCK-8アッセイ)にて検討した。
(1-1)細胞と細胞培養法
ATL患者由来リンパ球(ATL4、ATL9:大分大学医学部第2内科緒方正男講師より分与)及びATL細胞株C8166、MT4そして急性Tリンパ芽球性白血病株Jurkat(Dr. Kuan Teh Jeang, Molecular Virology Section, Laboratory of Molecular Microbiology, NIAID, the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA.より入手)、ヒト正常リンパ球(PBL、大分大学医学部微生物学講座ボランティアより取得)は、10% FBS、2mM L-グルタミン、Penicillin-Streptomycin(PC/SM)を添加したRoswell Park Memorial Institute(RPMI1640、Gibco)を培養液とし、75cm2培養フラスコ内で37℃、5%CO2で維持、3日ごとに全体の1/10量の細胞を継代に使用した。必要に応じてIL-2を10ng/mL添加した。
上記ATL患者若しくは健常人由来リンパ球を5x105/mLのRPMI1640細胞懸濁液とし、12ウエルプレートに分注後、各被験化合物(17-DMAG、βカリオフィレン、ゼランボン、ペリルアルデヒド、チモール、リモネン、γ-テルピネンまたはミルセン)をそれぞれ図5の横軸に示す濃度(mM)になるように(5μL)、また無添加対照群には被験化合物に代えて等量(5μL)のDMSOを加えて培養した。培養開始から24、48、72、96または120時間後に50μLの細胞懸濁液を3サンプル分96ウエルプレートに分取し、25μLのCaspase-GloTM 3/7 Assay液(Promega)を加え、30分後にGloMax-96 Microplate Luminometerで発光量を測定した。
上記(1-2)と同様に細胞懸濁液に各化合物を添加、一定時間毎に細胞懸濁液50μLを3サンプル分、96ウエルプレートに分取し、25μLのCell Counting Kit-8(CCK-8)溶液を加え、30分後にMolecular Devices E MAXで450nmの吸光度を測定した。
細胞死の誘導は大きく分けて3種類(1.アポトーシス、2.オートファジー、3.ネクローシス)あり、2と3は必ずしもカスパーゼの活性化(Caspase3/7アッセイ)を伴わない。ATL治療に求められるのはATL細胞特異的に積極的なアポトーシスを誘導させる作用であり、正常なリンパ球をアポトーシス誘導することは好ましくない。また、通常行われる細胞生存率試験はミトコンドリアの呼吸能の活性をホルマザン色素の濃淡(CCK-8アッセイ)で表しているが、この数値からは細胞死が上記3種類の何れによって誘導されているか見分けがつかない。
[数1]
アポトーシス誘導強度(IAI) = Caspase3/7値 / CCK-8値
ATL細胞(株化細胞C8166、MT4、ATL04)、Jurkat、そして正常ヒトリンパ球(PBL01、PBL02、PBL03)に対する各被験化合物のアポトーシス誘導活性をCapase3/7キットにて測定した結果を、図5に示す。これらの値は全て被験化合物投与後24時間の時点で計測した値である。ペリルアルデヒドは0.2mMから、チモール、リモネン、及びγテルピネンはいずれも0.3mMから有意なアポトーシス誘導活性を示し、特にリモネン及びγテルピネンは1mMでATL細胞並びにJurkatに対して顕著なアポトーシス誘導効果を示した。以上4種のモノテルペン(ペリルアルデヒド、チモール、リモネン、γ-テルピネン)は何れも正常ヒトリンパ球であるPBLに対してはアポトーシスを誘導しなかった。一方、モノテルペンのうちミルセンは明確な効果は認められなかった。
Claims (5)
- β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進抑制剤。
- β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物。
- 上記疾患が、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)またはヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)関連炎症性疾患である、請求項2に記載する組成物。
- 上記HTLV-1関連炎症性疾患が、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項3に記載する組成物。
- ヒトT細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)発症を抑制するために用いられる、請求項3に記載する組成物。
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WO2023210481A1 (ja) * | 2022-04-28 | 2023-11-02 | 学校法人近畿大学 | カリオフィレン含有組成物 |
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