JP2003510294A - 手術中に腫瘍の周縁を視覚化するための、血管新生の標的構造物に対する抗体−色素結合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しく形成された血管の構造物に結合するために適する抗体−色素結合物、及び病的な血管新生を手術中に視覚化するためのその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、新しく形成された血管の構造物に結合することに適する抗体−色素
結合物、及び手術中に病的な血管新生を視覚化するためのそれらの使用に関する
。

【０００２】 成体では、わずかな例外（例えば出産年齢の女性の周期）を除いて、新しい血
管形成は起こらない。しかし多くの疾患で、新しい血管の形成を認めることがで
きる。ここでは新しい血管が形成される行程を血管新生と呼び、これは一定のシ
グナルに対する応答として起きる。

【０００３】 血管新生は、優先的に病巣の周縁領域で起きる行程である。病巣の中心から因
子が放出され、病巣の周縁領域まで拡散する。これらの因子を血管新生刺激因子
とも呼ぶ。これらの血管新生刺激因子が病巣の周縁領域の正常な組織に到達する
と、それまで病巣内に組み込まれていなかった血管が刺激を受け、新しい血管芽
を形成する。これらの血管芽から伸長する血管が、病巣の周縁領域内に新しい毛
細血管網を形成する。この行程により、病巣への適当な栄養供給が常に保証され
る。特に重要なことに、腫瘍の増殖及びそれらの転移が、血管新生を誘導する能
力に依存することが分かっている。

【０００４】 外科的治療は、現在では、局在化した病巣を治療する標準的な方法である。腫
瘍を治療する場合、これは非常に重要である。しかし、外科的技術は向上してい
るにもかかわらず、人体における解剖状況から、病巣の大規模な除去は稀にしか
可能ではないので、多くの局所的な再発が考慮されうる。多くの臓器（例えば脳
）では、正常な組織を得るために、大規模な除去が行なわなければならない。外
科的治療の徹底度に伴なって、正常な臓器を害する危険性が高まる。

【０００５】 しかし、腫瘍の外科的な切除を終えた後、その腫瘍の周縁領域を組織学的に調
べたところ、かなり多数の腫瘍が完全には除去できないこと、そして腫瘍の根部
が体内に残っていることが分かった。これらの腫瘍の根部から、更なる腫瘍増殖
、そしてまた腫瘍の転移が発生しうる。外科的な治療中に正常な組織に対して病
巣治療の限界点を正確に示めす方法があれば、病巣を完全に除去すること、及び
健康な組織を大きく傷つけないでおくことが可能となろう。

【０００６】 病巣を視覚化するための色素が既に知られている（Poon, W.S. et al., J. Ne
urosurgery (1992) 76 : 679-686; Haglund, M.M. et al., Neurosurgery (1996
) 38 : 308-317）。それらは、優先的に腫瘍細胞から直接的に除去されるか、又
は腫瘍の細胞外間隙に非特異的に集積する。正常な組織にも集積する機構が存在
するので、使用されているこれらの物質の特異性及び感受性は低い。

【０００７】 今日まで、病巣の周縁領域を選択的に視覚化することによって手術中に病巣の
輪郭を示すために用いうる化合物は知られていない。 血管新生は病巣の周縁領域において優先的に起きる。血管新生の視覚化によっ
て、正常な組織の境界を視覚化することができる。病巣における血管新生を検出
するための抗体が既に知られており、これらは、組織学的組織切片において新し
く形成された血管を視覚化するために、病巣内の種々のタンパク質を検出するた
めに、又は治療物質の担体分子として用いられている。

【０００８】 抗体と色素の組合せ、いわゆる抗体−色素結合物を、病巣の周縁領域の選択的
な視覚化により手術中に病巣の輪郭を示すために用いることができるが、この様
なものは知られていない。 従って本発明の目的は、手術中に腫瘍の周縁を視覚化するための抗体−色素結
合物を調製することである。本発明の抗体−色素結合体における抗体は、血管新
生行程に特異的な構造物に対するものである。本発明の抗体−色素結合物は、濃
縮化を介した光学的な視覚化を可能にする色素を含んでなる。

【０００９】 血管新生は病巣の周縁領域において最も強く起きるので、その結果そこで最大
の光学的シグナルが生じる。 従って、本発明の抗体−色素結合物は、手術中に光学的に診断することにより
、正常な組織に対する病巣の限界点、いわゆる周縁領域を視覚するために適する
。その結果、正常な組織をほとんど傷つけないで、病巣を完全に除去することが
可能となる。

【００１０】 血管新生が活発な組織には強く発現しているが、隣接する組織には非常に低レ
ベルにしか発現していない分子に対する抗体が知られている（ＷＯ９６／０１６
５３）。 抗体−色素結合物においては、血管増殖因子に対する受容体、炎症仲介因子が
結合する内皮細胞上の受容体、マトリクス分子が結合する内皮細胞上の受容体、
及び新しく形成された血管に特異的に発現するマトリクスタンパク質（Brekken
et al., Cancer Res. (1998) 58 : 1952-9; Schold, S.C. Jr. et al., Invest.
Radiol. (1993) 28 : 488-96)に対する抗体が特に興味深い。

【００１１】 マトリクスタンパク質であるＥＤＢ−フィブロネクチンに対する抗体又は抗体
断片が好ましい。腫瘍胎児性フィブロネクチンとも知られているＥＤＢ−フィブ
ロネクチン（ＥＤＢＦＮ）は、血管新生行程において新しく形成された血管にお
いて特異的に形成されるフィブロネクチンのスプライス変異体である。ＥＤＢ−
フィブロネクチンに対する抗体の特別な利点は、手術中に病巣を切除する際に損
傷があっても、正常な組織にはＥＤＢ−フィブロネクチンの新しい形成が起きな
いことである。従って、外科的治療中に特異性が保持される。内皮細胞の増殖因
子受容体又は炎症仲介因子に対する抗体が考えられるが、それらは腫瘍の周縁領
域に特異的に発現しているが、外科的治療中に病巣近傍の正常な組織においても
新しく形成されうる。

【００１２】 本発明の抗体−色素結合体では、ＥＤＢ−フィブロネクチンに対する抗体Ｌ１
９及びＥ８が特に好ましい（Viti, F. et al., Cancer Res. (1999) 59 : 347-3
52）。 この様な抗体−色素結合物も本発明の対象である。 これらの既知の抗体を色素と結合し、組織内へのその集積を光学的に検出する
ことができ、それによって手術中に病巣の周縁領域の輪郭を示すことが可能とな
る。

【００１３】 ここで本発明の抗体−色素結合物の利点は、これを、血管新生段階の組織を選
択的に蛍光染色するために用いうることにある。この蛍光染色は腫瘍特異的とな
り、そして高いシグナル／背景比で検出しうる蛍光シグナルを生じる。 蛍光画像化のための抗体−色素結合物が、経皮的で非侵襲的な腫瘍の視覚化の
ためにも知られている（Neri, D. et al., Nature Biotechnology (1997) 15 :
1271-1275)。 しかし、病巣の周縁領域に優先的に集積する抗体−色素結合物は知られていな
い。

【００１４】 また、手術中に腫瘍を視覚化するためのタンパク質−色素結合物も知られてい
る。 これらの結合物の欠点は、特に低酸素状態にあり、かつ代謝的に栄養不足であ
る腫瘍細胞がその結合物を取り込むことである。しかし、腫瘍の周縁領域にある
組織は十分な血管を有しており、従ってその細胞には酸素及び栄養が適当に供給
されているので、正にこの理由から、既知のタンパク質−色素結合物の適当な集
積はあり得ない。 しかし、本発明の抗体−色素結合物は、病巣の代謝状態とはほとんど無関係で
ある。

【００１５】 病巣の境界を様々な方法で光学的に検出することができるが、一般的には、対
応する励起光によって惹起される色素特異的な蛍光放射を検出することが好まし
い。この場合、放射波長に応じて、その蛍光を、肉眼検査又は顕微鏡検査により
直接的に視覚的に検出するか、場合によっては、同時に画像検出系によってデジ
タル的に記録し、そして画面上に視覚化することができる。

【００１６】 スペクトル領域４００〜６５０nmの蛍光放射を視覚的に検出できる。特に４５
０〜６００nmの波長が好ましい。可視領域の光を用いる特別の利点は、低技術コ
ストで蛍光検出が可能であることにある。適当なレーザー又は半導体レーザーに
よって作られる励起光を、光ファイバーにつなぎ、それを介して診断する領域に
運ぶ。 手術中に腫瘍周縁の検出を、当該領域への大規模な放射によって行う。反射し
た励起光をフィルター（例えば作業者が身に付けたフィルター眼鏡）によって遮
り、そして色素特異的な蛍光を観察する（肉眼観察）。あるいは、蛍光の検出を
、手術用顕微鏡によって行うこともできる（顕微鏡観察）。組織内への可視光の
侵入長は小さいので（数mm）、この様にして、表面上に位置する新しく形成され
た血管を検出することができる。

【００１７】 可視光のスペクトル領域のもう一つの利点は、組織への侵入長の小ささ及びそ
の組織からの放射光の少なさである。従って、検出しうるシグナルは、組織のよ
り深い部分からのシグナルによって乱されず、表面上に見える組織構造物に特異
的に帰因しうる。 従ってまた本発明の対象は、可視光スペクトル領域中で色素が光学シグナルを
発する抗体−色素結合体である。

【００１８】 しかし、近赤外線（ＮＩＲ；６００〜９００nm）スペクトル領域で吸光を示す
色素を有する抗体−色素結合物の使用により、より深い組織層（１cmまで）にお
ける新しい血管形成の検出が可能となる。なぜならＮＩＲ光は、組織によりより
弱く吸収され、従ってより大きな組織侵入長を有するからである。蛍光の検出は
視覚的には不可能であり、注目する組織領域上に配置したＣＣＤカメラ（電荷結
合素子カメラ）によって行うことができる。肉眼及び顕微鏡による両検出が可能
である。当該抗体−色素結合物において、ＮＩＲスペクトル領域で吸光を示し、
かつ蛍光を発する色素を用いる利点は、隠された領域（例えば血液による）の評
価が必要な場合に機能することである。

【００１９】 光−身体的な観点から、４００〜８００nmのスペクトル領域内に吸光極大を有
し、かつ５００〜９００nm内に少くとも１つの蛍光極大を有する色素が、抗体−
色素結合物に適する。 本発明の対象は、また、色素が可視光又は近赤外光の一定の波長領域の使用に
よってのみ蛍光シグナルを発するという特徴を有する抗体−色素結合物である。

【００２０】 視覚的に検出可能な蛍光を有する色素を含んでなる抗体−色素結合物は、例え
ば下記のクラスに由来するものである： フルオレセイン、フルオレセイン−イソチオシアネート、カルボキシフルオレ
セイン又はカルセイン； テトラブロモフルオレセイン又はエオシン、テトラヨードフルオレセイン又は
エリスロシン； ジフルオロフルオレセイン、例えばオレゴングリーン^TM４８８、オレゴングリ
ーン^TM５００又はオレゴングリーン^TM５１４、カルボキシロードル（ロードルグ
リーン^TM）色素（ＵＳ ５，２２７，４８７；ＵＳ ５，４４２，０４５）、カ
ルボキシローダミン色素（例えばローダミングリーン^TM色素）（ＵＳ ５，３６
６，８６０）；

【００２１】 ４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−インダセン、例えばＢ
ｏｄｉｐｙ ＦＬ，Ｂｏｄｉｐｙ ４９３／５０３又はＢｏｄｉｐｙ ５３０／
５５０及びそれらの誘導体（ＵＳ ４，７７４，３３９、ＵＳ ５，１８７，２
８８、ＵＳ ５，２４８，７８２、ＵＳ ５，４３３，８９６及びＵＳ ５，４
５１，６６３）； シアニン色素、特にカルボシアニン及びメロシアニン； クマリン色素、例えば７−アミノ−４−メチルクマリン、テルビウム又はユウ
ロピウムによるＤＴＰＡ又はテトラアザマクロサイクレン（サイクレン、ピクレ
ン（ｐｙｃｌｅｎｅ））の金属錯体、又はテトラピロール色素、特にポルフィリ
ン。

【００２２】 近赤外色素を含んでなる抗体−色素結合物は、例えば下記のクラスに由来する
ものである： ポリメチン色素、例えばジカルボシアニン、トリカルボシアニン、メロシアニ
ン及びオキソノール色素（ＷＯ９６／１７６２８）； ローダミン色素； フェノキサジン又はフェノチアジン色素； テトラピロール色素、特にベンゾポルフィリン、コリン及びフタロシアニン。 当該抗体−色素結合物における好ましい近赤外色素は、７００〜８００nmの吸
光極大を有するシアニン色素、特にヨードジ−及びインドトリカルボシアニンで
ある。

【００２３】 一般的には、当該抗体−色素結合物において、１又は複数のカルボキシル基を
有する前記クラスに由来する色素が好ましく、化学的活性化の後、そのカルボキ
シル基と抗体又は抗体断片のアミノ基とが連結される。アミノ酸システインのス
ルフヒドリル基との共有結合を行うためには、マレイミド又はブロモアルキル基
を有する当該色素誘導体も好ましい。 更に、アミノ基とも反応するイソチオシアネート基を有する色素が好ましい。

【００２４】 更に、当該抗体−色素結合物における色素は、高い光安定性を有さなければな
らず、実験期間中に定常的なシグナルを保証するために、光照射中に退色（光退
色）しないものである。 従って本発明の対象は、病巣細胞組織の周縁領域に優先的に集積し、従ってそ
の病巣の周縁領域を光学的に検出可能にするという抗体−色素結合物である。

【００２５】 特には、本発明の対象は、一般式Ｉ： Ｂ−（Ｆ）ｎ （Ｉ） （前記式中 ＢはＥＤＢ−フィブロネクチンに対して高結合性の抗体又は抗体断片を表し、 Ｆはクマリン、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、ジフルオロフル
オレセイン、テトラブロモフルオレセイン、テトラヨードフルオレセイン、ロー
ダミン、カルボキシローダミン、カルボキシロードル、４，４−ジフルオロ−４
−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−インダセン、ポリメチン色素若しくはテトラピロ
ール色素、又はＤＴＰＡ若しくはサイクレン及びその誘導体のテルビウム若しく
はユウロピウム錯体のクラスに由来する色素を表し、そして ｎは、１〜５を表す） で表せる抗体−色素結合物である。

【００２６】 色素がシアニン色素、メロシアニン色素、オキサノール色素、スチリル色素又
はスクアリリウム色素である抗体−色素結合物が特に好ましく、従ってこれもま
た本発明の対象である。 色素部分がシアニン色素、特にはカルボシアニン、ジカルボシアニン又はトリ
カルボシアニンである抗体−色素結合物が特に好ましく、従ってこれもまた本発
明の対象である。

【００２７】 従って本発明は、特に、一般式Ｉの色素（Ｆ）ｎが一般式II：

【化４】

【００２８】 （前記式中 Ｄは基III 又はIV：

【化５】 を表し、ただし星印で示した位置が基Ｂとの境界部位であり、

【００２９】 Ｂは基Ｖ，VI，VII ，VIII又はIX：

【化６】 を表し、ただし

【００３０】 Ｒ¹ 及びＲ² はＣ₁ −Ｃ₄ スルホアルキル、飽和又は不飽和の分鎖状又は直鎖
状Ｃ₁ −Ｃ₅₀アルキル鎖を表し、これは、場合により１５個以下の酸素原子、及
び／又は３個以下のカルボニル基、及び／又は５個以下の水酸基により置換され
てよく、 Ｒ³ は基−ＣＯＯＥ¹ ，−ＣＯＮＥ¹ Ｅ² ，−ＮＨＣＯＥ¹ ，−ＮＨＣＯＮＨ
Ｅ¹ ，−ＮＥ¹ Ｅ² ，−ＯＥ¹ ，−ＯＳＯ₃ Ｅ¹ ，−ＳＯ₃ Ｅ¹ ，−ＳＯ₂ ＮＨ
Ｅ¹ 又は−Ｅ¹ を表し、ただし

【００３１】 Ｅ¹ 及びＥ² は互いに無関係に水素原子、Ｃ₁ −Ｃ₄ スルホアルキル、飽和又
は不飽和の分鎖状又は直鎖状のＣ₁ −Ｃ₅₀アルキルを表し、これは、場合により
１５個以下の酸素原子、及び／又は３個以下のカルボニル基により仲介されてよ
く、及び／又は５個以下の水酸基によって置換されてよく、 Ｒ⁴ は水素原子、又はフッ素、塩素、臭素若しくはヨウ素原子を表し、 ｂは２又は３であり、

【００３２】 Ｘは酸素、イオウ又は基＝Ｃ（ＣＨ₃ ）₂ 若しくは−（ＣＨ＝ＣＨ）−を表し
、そして Ｌは直接的な結合、又は炭素原子数２０個以下の直鎖状又は分鎖状の炭素鎖で
あるリンカーを表し、これは、１又は複数の−ＯＨ，−ＣＯＯＨ又はＳＯ₃ 基に
より置換されてよく、及び／又は場合により１又は複数の位置で−Ｏ−，−Ｓ−
，−ＣＯ−，−ＣＳ−，−ＣＯＮＨ−，−ＮＨＣＯ−，−ＮＨＣＳＮＨ−，−Ｓ
Ｏ₂ −，ＰＯ₄ −又は−ＮＨ基又はアリール環により仲介されてよい） で表せるシアニン色素である抗体−色素結合物に関する。

【００３３】 本発明の抗体−色素結合物を、医薬剤として単独で、又は製剤の形で用いうる
。 当該抗体−色素結合物を医薬剤として用いるために、これを医薬製剤の形にす
る。この医薬製剤は、抗体−色素結合物に加えて、腸管内又は腸管外投与に適す
る医薬上の有機又は無機不活性媒体、例えば水、ゼラチン、アラビアゴム、ラク
トース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレ
ングリコールなどを含有する。当該医薬製剤は固形、例えば錠剤、被覆錠剤、座
剤、カプセル、又は液形、例えば溶液、懸濁液若しくは乳状液であってよい。当
該製剤は、場合により更に、補助剤、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤若しくは
乳化剤、浸透圧を調節するための塩、又は緩衝剤を含有する。

【００３４】 腸管外適用のために、抗体−色素結合物の注射用溶液又は懸濁液、特に水溶液
が適する。 賦形剤として、界面活性剤、例えば胆汁酸の塩、又は動物性若しくは植物性リ
ン脂質、更にそれらの混合物、及びリポソーム又はそれらの成分を用いることも
できる。 経口適用のために、タルク及び／又は炭化水素賦形剤、又は結合剤、例えばラ
クトース、コーン若しくはポテトスターチを含有する錠剤、被覆錠剤又はカプセ
ルが特に適する。ジュースなどの液体の形で、場合により甘味料を加えた形で投
与を行うこともできる。

【００３５】 当該抗体−色素結合物の投与量は、投与方法、患者の年齢と体重、治療する疾
患のタイプと重症度、及び類似の要因に応じて変動しうる。境界領域を検出する
ために適用しうる抗体−色素結合物の投与量は０．５〜１０００mg、好ましくは
５０〜２００mgであり、この投与量を、１回で投与するための単一投与量として
用いても、あるいは１日に２回以上で投与する量に分けてもよい。 前記の製剤及び分配形もまた本発明の対象である。

【００３６】 従ってまた本発明は、病巣の周縁領域を手術中に視覚化するための１又は複数
の抗体−色素結合物を含んでなる医薬剤にも関する。この場合、この医薬剤は、
単独で、又は適当な溶媒、緩衝剤及び／又は賦形剤と混合した形で用いられる。 本発明の抗体−色素結合物は、血管新生依存的な疾患、例えば悪性腫瘍及びそ
の転移、良性腫瘍、前ガン的な組織変化、子宮内膜症、血管腫、並びに異所的妊
娠を外科的に治療する際に用いられる。

【００３７】 更に本発明の対象は、手術中に病巣を視覚化するための、特に手術中に病巣の
周縁領域を肉眼的又は顕微鏡的に視覚化するための、抗体−色素結合物及びその
薬剤の使用、並びに血管新生依存的な疾患、例えば悪性腫瘍及びその転移、良性
腫瘍、前ガン的な組織変化、子宮内膜症、血管腫及び異所性妊娠を外科的に治療
するための薬剤の製造のための、抗体−色素結合物の使用である。

【００３８】色素の生産 色素の生産を、文献に知られている方法に従って行う。抗体−色素結合物の生
産に適する色素は、抗体のアミノ基と共有結合するためにカルボキシル基又はイ
ソチオシアネート基を有する色素である。この場合、シアニン色素が特に好まし
い（Mujumdar, S.R. et al. (1996) 7 : 356-362; Flanagan, J.H. et al. (199
7) 8 : 751-756; Licha, K. et al. (1996) Proc SPIE Vol. 2927, 192-198)。

【００３９】 カルボキシル基を有する色素を、先ず、当分野に既知の方法に従って、反応性
エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）に変換することによ
って活性化する。イソチオシアネート基を有する色素は直接に用いることができ
る。次に、その反応性誘導体を、緩衝溶液中又は有機溶媒（例えばジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））と緩衝溶液との混
合液中で抗体と反応させる。この場合、３〜１００倍過剰なモルの色素を用いる
。その反応が完了した後、限外濾過及び／又はクロマトグラフィーにより未反応
部分を分離する。 同様な方法により下記色素を生産する。

【００４０】生産の実施例１ ビス−１，１′−（４−スルホブチル）インドカルボシアニン−５−カルボン酸 −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 文献に知られている方法に類似した方法で、１−（４−スルホブチル）−２，
３，３−トリメチル−３Ｈ−インドレニン及び１−（４−スルホブチル）−２，
３，３−トリメチル−５−カルボキシ−３Ｈ−インドレニンから開始して、ビス
−１，１′−（４−スルホブチル）インドカルボシアニン−５−カルボン酸の生
産を行う（Cytometry 10, 11-19, 1989, Talanta 39, 505-510, 1992）。

【００４１】 これをＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換するために、各々の場合
で、０．１mmolの色素（６７mg／１０ml ＤＭＦ）を、０．５mmolのＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と混合し、
そして室温で２４時間撹拌する。５０mlのエーテルを加えた後、沈殿した固体を
濾過して除き、各々小量のＤＤＦ中で２回再度溶解し、そしてエーテルにより沈
殿させ、最後に真空中で乾燥する（収率８９％）。

【００４２】抗体−色素結合物の生産 ビス−１，１′−（４−スルホブチル）インドカルボシアニンとＬ１９抗体との 結合物の生産 抗体Ｌ１９（１mg／１ml酢酸ナトリウム緩衝剤５０mmol、pH８．２）をＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル（４mg／ml ＤＭＳＯ溶液で７５μmol)と混合
して、室温で２時間撹拌する。ＰＤ１０カートリッジ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上
でのゲル濾過により精製を行い、そしてセントリコン１０チューブ（Ａｍｉｃｏ
ｎ）を用いて濃縮を行い、そして約１mg／mlの抗体溶液を得る。 吸光極大：５５５nm 蛍光極大：５８２nm

【００４３】 下記の実施例では、本発明の抗体−色素結合物の生物学的有用性を、限定する
ことなく、説明する。適用実施例１ 腫瘍を有するヌードマウスにおけるインビボ蛍光画像化及びその腫瘍組織におけ るエキソビボ顕微鏡検査 本発明の化合物の画像化特性を、腫瘍を有するヌードマウスへの注射後にイン
ビボで調べた。このために、０．１〜２μmol ／kgの当該物質を静脈内に投与し
、そして０〜４８時間の期間で腫瘍領域への濃縮化を観察する。

【００４４】 レーザー（半導体レーザー、固相レーザー）により単色光として作られた、あ
るいはＨｇ又はＸｅランプの多色光放射からフィルターで選別された対応する波
長の光をその動物に照射することにより、当該物質の蛍光を発生させる。生産の
実施例１に記載した化合物の場合、試験動物を刺激するために励起光として、Ｎ
ｄ：ＹＡＧレーザーに由来する波長５４０nmの光を用い、５８０nm超の波長での
蛍光放射を増幅型ＣＣＤカメラにより検出し、そして全身の蛍光画像を得る。平
行して、その蛍光を視覚的及び写真的に検出する。その腫瘍材料から切片を用意
し、顕微鏡で検査する（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡、Ｃｙ３フィルタ
ーセット付き）。

【００４５】 生産の実施例に記載した抗体−色素結合物を１μmol ／kgの量でＦ９テラトカ
ルシノーマを有するヌードマウスに注射した後、４時間後に、全身蛍光画像にお
いて正常組織に比べて強い蛍光シグナルを検出することができた。 この腫瘍の皮膚及び最外組織層を調製した後、その蛍光を、この腫瘍の周縁領
域に見い出すことができる。腫瘍切片を顕微鏡で評価することにより、腫瘍の周
縁領域内の血管に相関するより強い蛍光が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ディンケルボルク，ルドガー ドイツ連邦共和国，デー−13465 ベルリ ン，オルトビンシュトラーセ ７ Ｆターム(参考） 4C085 HH13 JJ02 KA03 KA40 KB55 KB56 KB57 LL18

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 病巣細胞組織の周縁領域中に優先的に集積することによって
   、その病巣の周縁領域を光学的に検出可能にすることを特徴とする、抗体−色素
   結合物。
2. 【請求項２】 一般式Ｉ： Ｂ−（Ｆ）ｎ （Ｉ） （前記式中 ＢはＥＤＢ−フィブロネクチンに対して高結合性の抗体又は抗体断片を表し、 Ｆはクマリン、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、ジフルオロフル
   オレセイン、テトラブロモフルオレセイン、テトラヨードフルオレセイン、ロー
   ダミン、カルボキシローダミン、カルボキシロードル（ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄ
   ｏｌｓ）、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−インダセン、
   ポリメチン色素若しくはテトラピロール色素、又はＤＴＰＡ若しくはサイクレン
   及びその誘導体のテルビウム若しくはユウロピウム錯体の群から選択される色素
   を表し、そして ｎは１〜５を表す） で表せる、請求項１に記載の抗体−色素結合物。
3. 【請求項３】 前記色素がシアニン色素、メロシアニン色素、オキソノール
   色素、スチリル色素又はスクアリリウム色素である、請求項１又は２に記載の抗
   体−色素結合物。
4. 【請求項４】 前記色素がシアニン色素、例えばカルボシアニン、ジカルボ
   シアニン又はトリカルボシアニンである、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体
   −色素結合物。
5. 【請求項５】 一般式Ｉの色素成分（Ｆ）ｎが一般式II： 【化１】 （前記式中 Ｄは基III 又はIV： 【化２】 を表し、ただし星印で示した位置が基Ｂとの境界部位であり、 Ｂは基Ｖ，VI，VII ，VIII又はIX： 【化３】 を表し、ただし Ｒ¹ 及びＲ² はＣ₁ −Ｃ₄ スルホアルキル、飽和又は不飽和の分鎖状又は直鎖
   状Ｃ₁ −Ｃ₅₀アルキル鎖を表し、これは、場合により１５個以下の酸素原子、及
   び／又は３個以下のカルボニル基、及び／又は５個以下の水酸基により置換され
   てよく、 Ｒ³ は基−ＣＯＯＥ¹ ，−ＣＯＮＥ¹ Ｅ² ，−ＮＨＣＯＥ¹ ，−ＮＨＣＯＮＨ
   Ｅ¹ ，−ＮＥ¹ Ｅ² ，−ＯＥ¹ ，−ＯＳＯ₃ Ｅ¹ ，−ＳＯ₃ Ｅ¹ ，−ＳＯ₂ ＮＨ
   Ｅ¹ 又は−Ｅ¹ を表し、ただし Ｅ¹ 及びＥ² は互いに無関係に水素原子、Ｃ₁ −Ｃ₄ スルホアルキル、飽和又
   は不飽和の分鎖状又は直鎖状のＣ₁ −Ｃ₅₀アルキルを表し、これは、場合により
   １５個以下の酸素原子、及び／又は３個以下のカルボニル基により仲介されてよ
   く、及び／又は５個以下の水酸基によって置換されてよく、 Ｒ⁴ は水素原子、又はフッ素、塩素、臭素若しくはヨウ素原子を表し、 ｂは２又は３であり、 Ｘは酸素、イオウ又は基＝Ｃ（ＣＨ₃ ）₂ 若しくは−（ＣＨ＝ＣＨ）−を表し
   、そして Ｌは直接的な結合、又は炭素原子数２０個以下の直鎖状若しくは分鎖状の炭素
   鎖であるリンカーを表し、これは、１又は複数の−ＯＨ，−ＣＯＯＨ又はＳＯ₃
   基により置換されてよく、及び／又は場合により１又は複数の位置で−Ｏ−，−
   Ｓ−，−ＣＯ−，−ＣＳ−，−ＣＯＮＨ−，−ＮＨＣＯ−，−ＮＨＣＳＮＨ−，
   −ＳＯ₂ −，ＰＯ₄ −又は−ＮＨ基又はアリール環により仲介されてよい） で表せるシアニン色素である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体−色素結合
   物。
6. 【請求項６】 抗体として抗体Ｌ１９又はＥ８を用いる、請求項１〜５のい
   ずれかに記載の抗体−色素結合物。
7. 【請求項７】 前記色素が、可視スペクトル領域の光の中で光学的シグナル
   を発する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体−色素結合物。
8. 【請求項８】 前記色素が、可視光又は近赤外線の一定の波長域の使用によ
   ってのみ蛍光シグナルを発する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体−色素結
   合物。
9. 【請求項９】 手術中に病巣の周縁領域を視覚化するための、請求項１〜８
   のいずれかに記載の１又は複数の抗体−色素結合物を含んでなる医薬剤。
10. 【請求項１０】 適当な溶媒、緩衝剤及び／又は賦形剤と混合した形の、請
    求項９に記載の医薬剤。
11. 【請求項１１】 手術中に病巣を視覚化するための、請求項１〜１０のいず
    れかに記載の抗体−色素結合物又は医薬剤の使用。
12. 【請求項１２】 手術中に病巣の周縁領域を視覚化するための、請求項１〜
    １０のいずれかに記載の抗体−色素結合物の使用。
13. 【請求項１３】 手術中に病巣の周縁領域を顕微鏡的又は肉眼的に視覚化す
    るための、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体−色素結合物の使用。
14. 【請求項１４】 血管新生に依存する疾患、例えば悪性腫瘍及びその転移、
    良性腫瘍、前ガン性組織変化、子宮内膜症、血管腫及び異所性妊娠の外科的治療
    に用いる薬剤の生産のための、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体−色素結合
    物の使用。