EP1214099A1 - Antikörper-farbstoffkonjugate gegen zielstrukturen der angiogenese zur intraoperativen tumorranddarstellung - Google Patents

Antikörper-farbstoffkonjugate gegen zielstrukturen der angiogenese zur intraoperativen tumorranddarstellung

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EP1214099A1
EP1214099A1 EP00954640A EP00954640A EP1214099A1 EP 1214099 A1 EP1214099 A1 EP 1214099A1 EP 00954640 A EP00954640 A EP 00954640A EP 00954640 A EP00954640 A EP 00954640A EP 1214099 A1 EP1214099 A1 EP 1214099A1
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EP
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antibody
dye conjugates
conjugates according
focus
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Michael Schirner
Kai Licha
Ludger Dinkelborg
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Definitions

  • the present invention relates to antibody-dye conjugates which are suitable for binding to structures of newly formed vessels and their use for the intraoperative presentation of pathological angiogenesis.
  • angiogenesis takes place in response to certain signals.
  • Angiogenesis is a process that takes place preferentially in the marginal area of a disease center. Factors are released from the center of the disease center, which diffuse to the edge region of the disease center. These factors are also known as angiogenesis stimulators. If these angiogenesis stimulators reach the healthy tissue in the edge area of a focus of the disease, they have so far not been included in the focus of the disease
  • the vessels growing out of these vascular buds form a new capillary network in the edge area of the focus of the disease. This process can always ensure an adequate supply of nutrients for the focus of the disease. It has been found to be particularly important that the growth of tumors and their metastases depends on the ability to induce angiogenesis.
  • Surgical therapy is now a standard measure for the treatment of localized areas of disease. It has gained great importance in tumor treatment. However, it has been found that, despite improved surgical techniques, the number of local recurrences is considerable, since the anatomical conditions in the human organism only rarely allow the foci of the disease to be removed over a large area. In many Organs (e.g. in the brain) must not be removed on a large scale in order to maintain healthy tissue. The risk of injury to healthy organs increases with the radical nature of the surgical procedure.
  • treatment If treatment is accurate, it would allow the focus of the disease to be completely removed and the healthy tissue to be largely protected.
  • Dyes for imaging disease sources are already known (Poon WS et al., J Neurosurgery (1992) 76: 679-686, Haglund MM et al., Neurosurgery (1996) 38: 308-317). They are preferably taken up directly by tumor cells or accumulate non-specifically in the extracellular space of the tumors. Since the mechanism of accumulation can also be demonstrated in healthy tissue, the specificity and sensitivity of the substances used is low.
  • Angiogenesis takes place preferentially in the marginal area of disease centers. By showing the angiogenesis, the border to healthy tissue can be shown.
  • Antibodies for the detection of angiogenesis in the focus of disease are already known and are used for the display of newly formed vessels in the histological tissue section, for the detection of various proteins in the focus of the disease or as carrier molecules for therapeutic substances.
  • antibodies in combination with dyes so-called antibody-dye conjugates, are not known, which can be used for the intraoperative delimitation of the focus of the disease by selective display of the edge region of a focus of the disease.
  • the object of the present invention is therefore to provide antibody-dye conjugates for intraoperative tumor border imaging.
  • the antibodies of the antibody-dye conjugates according to the invention are directed against structures which are specific for the process of angiogenesis.
  • the antibody-dye conjugates according to the invention comprise dyes which, because of their enrichment, enable them to be displayed optically.
  • the antibody-dye conjugates according to the invention are thus suitable for representing the boundary of a focus of disease, the so-called edge area, with healthy tissue by intraoperative, optical diagnostics. This makes it possible to completely remove the focus of the disease while largely protecting the healthy tissue.
  • Antibodies are known which are directed against molecules which are strongly expressed in the angiogenetically active tissue and are only expressed at a very low level in the adjacent tissue (WO 96/01653).
  • antibodies that are directed against the receptors for vascular growth factors, receptors on endothelial cells to which inflammatory mediators bind, receptors on endothelial cells to which matrix molecules bind, and matrix proteins that are specifically expressed in the formation of new vessels (Brekken et al., Cancer Res. (1998) 58: 1952-9 and Schold SC Jr et al., Invest. Radiol. (1993) 28: 488-96).
  • EDB fibronectin also known as oncofetal fibronectin, is a splice variant of fibronectin, that specifically forms around newly formed vessels in the process of angiogenesis.
  • the focus of the disease does not lead to new formation of EDB fibronectin in healthy tissue. This maintains specificity during the surgical procedure.
  • Antibodies against growth factor receptors or inflammation mediators on the endothelial cell, which are also specifically expressed in the tumor border area, can also be regenerated during the surgical procedure in healthy tissue near the focus of the disease.
  • Antibodies L19 and E8 against EDB fibronectin are particularly preferred in the inventive antibody-dye conjugate.
  • Such antibody-dye conjugates are also the subject of the present invention.
  • the known antibodies are conjugated with dyes, the accumulation of which in the tissue can be optically detected and which enables the intraoperative delimitation of the peripheral area of a disease center.
  • the advantage of the antibody-dye conjugates according to the invention is that they can be used for a selective fluorescence staining of tissues in the neoangiogenic stage.
  • the fluorescence staining is tumor-specific and provides a fluorescence signal that can be detected in a high signal-to-background ratio.
  • Antibody-dye conjugates for fluorescence imaging for the purpose of percutaneous, non-invasive tumor imaging are also known (Neri D et al., Nature Biotechnology (1997) 15: 1271-1275).
  • antibody-dye conjugates are not known which preferentially accumulate in the edge region of a focus of disease.
  • Protein-dye conjugates for intraoperative tumor imaging are also known.
  • a disadvantage of these conjugates is that in particular hypoxic and metabolically undersupplied tumor cells absorb the conjugates.
  • the tissue in the marginal area of tumors is well vascularized and the cells are adequately supplied with oxygen and nutrients, the known protein-dye conjugates are not sufficiently enriched.
  • the antibody-dye conjugates according to the invention are largely independent of the metabolic state of the focus of the disease.
  • the optical detection of the limits of a disease focus can be carried out in different ways, the detection of the dye-specific fluorescence radiation induced by appropriate excitation light is generally preferred. Depending on the emission wavelength, the fluorescence can be recorded directly macroscopically or microscopically and, if necessary, simultaneously digitally recorded by imaging detection systems and displayed on a screen.
  • Fluorescence radiation of the spectral range 400 to 650 nm can be detected visually.
  • a wavelength of 450 to 600 nm is particularly preferred.
  • the particular advantage of using the visible range of light is that the detection of fluorescence is possible with little technical effort.
  • Excitation light which is generated by suitable lasers or laser diodes, is coupled into a light guide and guided to the area to be diagnosed via this light guide.
  • the introperative tumor edge detection is carried out by large-scale irradiation of the area.
  • the reflected excitation light is blocked by a filter (e.g. filter glasses worn by the examining person) and only the dye-specific fluorescence is observed (macroscopic observation).
  • the fluorescence can be recorded using an operating microscope (microscopic observation). Due to the low penetration depth of VIS light in
  • Tissues (a few millimeters) can be superficially localized in this way
  • New vessel formation can be detected.
  • Another advantage of the spectral range of visible light is the low penetration depth into the tissue and emission from the tissue. In this way, the detectable signal is not falsified by signals from deeper tissue parts and can be assigned precisely to the superficially visible tissue structures.
  • the present invention thus also relates to antibody-dye conjugates whose dyes induce an optical signal in the visible spectral range of the light.
  • the use of antibody-dye conjugates with dyes that absorb in the spectral range of the near infrared light (NIR; 600 - 900 nm) enables the detection of neovascularization in deeper tissue layers (up to 1 cm), since NIR is not weakly absorbed by tissue and therefore has a greater depth of tissue penetration.
  • the observation of the fluorescence is not possible visually and can be done by CCD cameras (Charge coupled device camera), which are placed over the tissue area of interest. Both macroscopic and microscopic detection is possible.
  • CCD cameras Charge coupled device camera
  • those dyes are suitable for the antibody-dye conjugates which have an absorption maximum within the spectral range from 400 to 800 nm and at least one fluorescence maximum within 500 to 900 nm.
  • the present invention also relates to antibody-dye conjugates which are characterized in that the dye is only using a defined wavelength range of visible or near-infrared light induces a fluorescence signal.
  • Antibody-dye conjugates comprising dyes with visually detectable fluorescence are, for example, those from the following classes:
  • 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-indacene such as e.g. B. Bodipy FL, Bodipy 493/503 or Bodipy 530/550 and derivatives thereof (US 4,774,339, US 5,187,288, US 5,248,782, US 5,433,896, US 5,451, 663), cyanine dyes, especially carbocyanines and merocyanines,
  • Coumarin dyes such as e.g. B. 7-amino-4-methylcoumarin, metal complexes of DTPA or tetraaza macrocycles (cyclen, pyclen) with terbium or europium or tetrapyrrole dyes, in particular porphyrins.
  • Antibody-dye conjugates comprising near-infrared dyes are, for example, those from the following classes:
  • Polymethine dyes such as dicarbocyanine, tricarbocyanine, merocyanine and
  • Rhodamine dyes phenoxazine or phenothiazine dyes
  • Tetrapyrrole dyes especially benzoporphyrins, chorines and
  • Preferred near infrared dyes in the antibody-dye conjugates are:
  • dyes in the antibody-dye conjugates from the above-mentioned classes which have one or more carboxyl groups which recede chemical activation can be coupled to amino groups of antibodies or antibody fragments.
  • Derivatives which contain maleimido or bromoalkyl radicals are also preferred, so that covalent coupling to the sulfhydryl group of the amino acid cysteine takes place.
  • dyes are preferred which have isothiocyanate groups which also react with amino groups.
  • the dyes in the antibody-dye conjugates must have high photostability and must not fade when exposed to light (photobleaching) in order to ensure a constant signal within the investigation period.
  • the present invention thus relates to antibody-dye conjugates which accumulate preferentially in the edge region of the cell tissue of a focus of disease and thus make the edge region of the focus of the disease optically representable.
  • the present invention in particular relates to antibody-dye conjugates of the general formula I.
  • ED-BFN stands for a dye from the class of the coumarins, the fluoresceins, carboxyfluoresceins, the difluorofluoresceins, the
  • Tetrabromofluoresceins Tetrabromofluoresceins, the tetraiodofluoresceins, the rhodamines, the carboxyrhodamines, the craboxyrhodols, the 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4adiaza-indacenes, the polymethine dyes or the tetrapyrrole dyes, or the terbium or europium or complexes with D complexes whose derivatives and n stands for 1 to 5 mean.
  • Antibody-dye conjugates the dye of which is a cyanine dye, a merocyanine dye, an oxonol dye, a styryl dye or a squarilium dye, are particularly preferred and therefore also an object of the present invention.
  • Antibody-dye conjugates in which the dye portion is a cyanine dye, in particular a carbocyanine, dicarbocyanine or tricarbocyanine, are particularly preferred and therefore likewise a subject of the present invention.
  • the invention thus relates in particular to those antibody-dye conjugates in which the dye - (F) n of the general formula I is a cyanine dye of the general formula II
  • R 1 and R 2 CrC 4 sulfoalkyl may be in which R 1 and R 2 CrC 4 sulfoalkyl, a saturated or unsaturated, branched or linear Ci-Cso-alkyl chain, optionally with up to
  • E 1 and E 2 independently of one another represent a hydrogen atom, C 1 -C 4 Sulfoalkyl, saturated or unsaturated, branched or straight-chain d-Cso-alkyl, which can optionally be interrupted with up to 15 oxygen atoms and / or up to 3 carbonyl groups and / or can be substituted with up to 5 hydroxyl groups,
  • R 4 represents a hydrogen atom or a fluorine-chlorine, bromine or iodine atom, b represents 2 or 3,
  • the antibody-dye conjugates according to the invention can be used either alone or in formulation as a medicament.
  • the antibody-dye conjugates are brought into the form of a pharmaceutical preparation which, in addition to the antibody-dye conjugate, is suitable for pharmaceutical, organic or inorganic inert carrier materials, such as, for example, water, gelatin, gum arabic, for enteral or parenteral administration.
  • a pharmaceutical preparation which, in addition to the antibody-dye conjugate, is suitable for pharmaceutical, organic or inorganic inert carrier materials, such as, for example, water, gelatin, gum arabic, for enteral or parenteral administration.
  • the pharmaceutical preparations can be in solid form, for example as tablets, dragees, suppositories, capsules or in liquid form, for example as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they also contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers, salts for changing the osmotic
  • Injection solutions or suspensions in particular aqueous solutions of the antibody-dye conjugates, are suitable for parenteral use.
  • Surfactant auxiliaries such as salts of bile acids or animal or vegetable phospholipids, but also mixtures thereof and liposomes or their components can also be used as carrier systems.
  • the dosage of the antibody-dye conjugates may vary depending on the route of administration, age and weight of the patient, type and severity of the disease to be treated and similar factors.
  • the applicable dose of the antibody-dye conjugates for the detection of the border areas is 0.5-1000 mg, preferably 50-200 mg, the dose being increased once single dose or divided into 2 or more daily doses.
  • the invention thus also relates to pharmaceutical compositions which comprise one or more antibody-dye conjugates for the intraoperative presentation of the marginal areas of a focus of disease, the pharmaceutical compositions being used either alone or in a mixture with suitable solvents, buffers and / or carriers.
  • the antibody-dye conjugates according to the invention are used in the surgical treatment of angiogenesis-dependent diseases, such as malignant tumors and their metastases, benign tumors, precancerous tissue changes, endometriosis, hemangiomas, and extrauterine pregnancies.
  • angiogenesis-dependent diseases such as malignant tumors and their metastases, benign tumors, precancerous tissue changes, endometriosis, hemangiomas, and extrauterine pregnancies.
  • the present invention also relates to the use of the antibody-dye conjugates and agents for the intraoperative imaging of foci of disease, in particular for the microscopic and macroscopic, intraoperative imaging of the peripheral areas of a focal point of the disease, and the use of the antibody-dye conjugates for the preparation of an agent for surgical treatments of angiogenesis-dependent Diseases such as malignant tumors and their metastases, benign tumors, precancerous tissue changes, endometriosis, hemangiomas and extrauterine pregnancies.
  • angiogenesis-dependent Diseases such as malignant tumors and their metastases, benign tumors, precancerous tissue changes, endometriosis, hemangiomas and extrauterine pregnancies.
  • the dyes are prepared by methods known from the literature. Suitable dyes for the production of the antibody-dye conjugates are dyes carboxyl groups or isothiocyanate groups for covalent Coupling to amino groups of the antibody. Are particularly preferred here
  • Cyanine dyes (Mujumdar SR et al. (1996) 7: 356-362; Flanagan JH et al.
  • the dyes with carboxyl groups are first activated by conversion into a reactive ester (e.g. N-hydroxysuccinimide ester) according to methods known per se. Dyes with isothiocyanate groups can be used directly.
  • the reactive derivatives are then reacted with the antibody in buffer solution or mixtures of organic solvent (e.g. dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO)) and buffer solution. A 3 to 100-fold molar excess of dye is used. After the reaction has ended, the unreacted portion is separated off by ultrafiltration and / or chromatography.
  • a reactive ester e.g. N-hydroxysuccinimide ester
  • Dyes with isothiocyanate groups can be used directly.
  • the reactive derivatives are then reacted with the antibody in buffer solution or mixtures of organic solvent (e.g. dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO)) and buffer solution. A 3 to 100-fold molar excess of
  • Bis-1, 1 '- (4-sulfobutyl) indocarbocyanin-5-carboxylic acid is prepared starting from 1- (4-sulfobutyl) -2,3,3-trimethyl-3H-indolenine and 1- (4-sulfobutyl) -2,3,3-trimethyl-5-carboxy-3fV-indolenine (Cytometry 10, 11-19, 1989, Talanta 39, 505-510, 1992) based on methods known from the literature.
  • the antibody L19 (1 mg in 1 ml sodium acetate buffer 50 mM, pH 8.2) is mixed with N-hydroxysuccinimide ester (75 ⁇ mol of a solution of 4 mg / ml in DMSO) and stirred for 2 hours at room temperature. Purification is carried out by gel filtration over PD10 cartridges (Pharmacia) and concentration using Centricon-10 tubes (Amicon) to obtain a solution of approx. 1 mg / ml antibody.
  • the imaging properties of the compounds according to the invention were investigated in vivo after injection in tumor-bearing nude mice.
  • 0.1 ⁇ mol / kg to 2 ⁇ mol / kg of the substance is administered intravenously and the accumulation in the tumor region is observed over a period of 0 to 48 hours.
  • the fluorescence of the substances is induced by irradiating the animals with light of the appropriate wavelength, which is generated monochromatically with a laser (diode laser, solid-state laser) or is filtered out from the polychromatic emission of an Hg or Xe lamp.
  • an increased fluorescence signal compared to normal tissue could be detected after 4 hours on the basis of whole-body fluorescence images.
  • the fluorescence can be assigned to the peripheral areas of the tumor. Microscopic assessment of tumor sections reveals an increased fluorescence, which correlates with blood vessels in the area around the tumor.

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Abstract

Es werden Antikörper-Farbstoffkonjugate, die geeignet sind an Strukturen neugebildeter Gefässe zu binden und deren Verwendung zur intraoperativen Darstellung der pathologischen Angiogenese beschrieben.

Description

Antikörper-Farbstoffkonjugate gegen Zielstrukturen der Angiogenese zur intraoperativen Tumorranddarstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper-Farbstoffkonjugate, die geeignet sind an Strukturen neugebildeter Gefäße zu binden und deren Verwendung zur intraoperativen Darstellung der pathologischen Angiogenese.
Im erwachsenen Organismus findet bis auf wenige Ausnahmen (z. B. der Zyklus der gebärfähigen Frau) keine Neubildung von Gefäßen statt. Die Neubildung von Gefäßen ist jedoch bei vielen Erkrankungen zu beobachten. Der hier stattfindende Prozeß der Gefäßneubildung wird als Angiogenese bezeichnet und findet als Antwort auf bestimmte Signale statt.
Die Angiogenese ist ein Prozeß, der im Randbereich eines Krankheitsherdes bevorzugt stattfindet. Aus dem Zentrum des Krankheitsherdes werden Faktoren freigesetzt, die zum Randbereich des Krankheitsherdes diffundieren. Diese Faktoren werden auch als Angiogenesestimulatoren bezeichnet. Erreichen diese Angiogenesestimulatoren das gesunde Gewebe im Randbereich eines Krankheitsherdes, werden bisher nicht in den Krankheitsherd einbezogene
Gefäße stimuliert, neue Gefäßknospen zu bilden. Die von diesen Gefäßknospen auswachsenden Gefäße bilden ein neues Kapillargefäßnetz im Randbereich des Krankheitsherdes. Durch diesen Prozeß kann immer eine adäquate Nährstoffversorgung für den Krankheitsherd sichergestellt werden. Als besonders wichtig hat sich herausgestellt, daß das Wachstum von Tumoren und deren Metastasen von der Fähigkeit abhängt, die Angiogenese zu induzieren.
Die chirurgische Therapie ist heute eine Standardmaßnahme zur Behandlung von lokalisierten Krankheitsherden. Große Bedeutung hat sie bei der Tumorbehandlung erlangt. Es hat sich aber herausgestellt, daß trotz verbesserter chirurgischer Techniken die Zahl der lokalen Rezidive beträchtlich ist, da die anatomischen Gegebenheiten im menschlichen Organismus nur selten eine großräumige Entfernung der Krankheitsherde zulassen. In vielen Organen (z. B. im Gehirn) muß auf ein großräumiges Entfernen verzichtet werden, um gesundes Gewebe zu erhalten. Das Risiko der Verletzung gesunder Organe steigt mit der Radikalität des chirurgischen Eingriffs.
Histologische Untersuchungen des Tumorrandbereiches nach erfolgter chirurgischer Tumorentfernung haben jedoch gezeigt, daß eine Vielzahl von Tumoren nicht vollständig entfernt werden können und Tumorreste im Körper verbleiben. Von diesen Tumorresten kann weiteres Tumorwachstum und auch die Tumormetastasierung ausgehen. Ein Verfahren, daß die Grenzen eines Krankheitsprozesses zum gesunden Gewebe während der chirurgischen
Behandlung exakt darstellt, würde es erlauben, Krankheitsherde vollständig zu entfernen und das gesunde Gewebe weitgehend zu schonen.
Farbstoffe zur Darstellung von Krankheitsherden sind bereits bekannt (Poon WS et al., J Neurosurgery (1992) 76: 679-686, Haglund MM et al., Neurosurgery (1996) 38: 308-317). Sie werden vorzugsweise von Tumorzellen direkt aufgenommen oder reichern sich unspezifisch im extrazellulären Raum der Tumoren an. Da der Mechanismus der Anreicherung auch im gesunden Gewebe nachweisbar ist, ist die Spezifität und Empfindlichkeit der verwendeten Substanzen gering.
Verbindungen, die für die intraoperative Abgrenzung der Krankheitsherde durch selektive Darstellung des Randbereiches eines Krankheitsherdes verwendet werden können, sind bisher nicht bekannt.
Die Angiogenese findet im Randbereich von Krankheitsherden bevorzugt statt. Durch Darstellung der Angiogenese kann die Grenze zum gesunden Gewebe dargestellt werden. Antikörper zum Nachweis der Angiogenese im Krankheitsherd sind bereits bekannt und werden zur Darstellung von neugebildeten Gefäßen im histologischen Gewebeschnitt, zum Nachweis verschiedener Proteine im Krankheitsherd oder als Trägermoleküle für therapeutische Substanzen verwendet. Nicht bekannt sind jedoch Antikörper in Kombination mit Farbstoffen, sogenannte Antikörper-Farbstoffkonjugate, die für die intraoperative Abgrenzung der Krankheitsherde durch selektive Darstellung des Randbereichs eines Krankheitsherdes zum Einsatz kommen können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Antikörper-Farbstoffkonjugate für die intraoperative Tumorranddarstellung bereitszustellen. Die Antikörper der erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate sind gegen Strukturen gerichtet, die spezifisch für den Prozeß der Angiogenese sind. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate umfassen Farbstoffe, die durch ihre Anreicherung eine optisch Darzustellung ermöglichen.
Da die Angiogenese im Randbereich eines Krankheitsherdes am stärksten ausgebildet ist, kommt es hier zum größten optischen Signal. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate sind somit geeignet, die Grenze eines Krankheitsherdes, den sogenannten Randbereich, zum gesunden Gewebe durch intraoperative, optische Diagnostik darzustellen. Hierdurch wird es ermöglicht, den Krankheitsherd bei weitgehender Schonung des gesunden Gewebes vollständig zu entfernen.
Es sind Antikörper bekannt, die gegen Moleküle gerichtet sind, die im angiogenetisch aktiven Gewebe stark exprimiert und im angrenzenden Gewebe nur auf sehr geringem Niveau exprimiert sind (WO 96/01653).
Von besonderem Interesse in den Antikörper-Farbstoffkonjugaten sind Antikörper, die gegen die Rezeptoren für vaskuläre Wachstumsfaktoren gerichtet sind, Rezeptoren auf Endothelzellen, an die Entzündungsmediatoren binden, Rezeptoren auf Endothelzellen, an die Matrixmoleküle binden und Matrixproteine, die spezifisch bei der Gefäßneubildung exprimiert werden (Brekken et al., Cancer Res. (1998) 58: 1952-9 und Schold SC Jr et al., Invest. Radiol. (1993) 28: 488-96).
Bevorzugt sind Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen das Matrixprotein EDB-Fibronektin gerichtet sind. EDB-Fibronektin (EDBFN), auch als onkofetales Fibronektin bekannt, ist eine Splicevariante des Fibronektins, das sich spezifisch um neugebildete Gefäße im Prozeß der Angiogenese bildet.
Der besondere Vorteil von Antikörpern gegen das EDB-Fibronektin besteht darin, daß es durch intraoperative Verwundung bei der Entfernung des
Krankheitsherdes zu keiner Neubildung des EDB-Fibronektins im gesunden Gewebe kommt. Hierdurch bleibt die Spezifität während des chirurgischen Eingriffs erhalten. Antikörper gegen Wachstumsfaktorrezeptoren oder Entzündungsmediatoren auf der Endothelzelle, die ebenfalls spezifisch im Tumorrandbereich exprimiert werden, können aber während des chirurgischen Eingriffs auch im gesunden Gewebe in der Nähe des Krankheitsherdes neugebildet werden.
Besonders bevorzugt im erfinderischen Antikörper-Farbstoffkonjugat sind die Antikörper L19 und E8 gegen das EDB-Fibronektin (Viti F et al, Cancer Res (1999) 59: 347-352). Solche Antikörper-Farbstoffkonjugate sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die bekannten Antikörper werden mit Farbstoffen konjugiert, deren Anreicherung im Gewebe optisch detektiert werden kann und die intraoperativen Abgrenzung des Randbezirkes eines Krankheitsherdes ermöglicht.
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate besteht nun darin, daß diese für eine selektive Fluoreszenzanfärbung von Geweben in neoangiogenetischem Stadium zur Anwendung kommen können. Die Fluoreszenzanfärbung ist tumorspezifisch und liefert ein Fluoreszenzsignal, daß in hohem Signal-zu-Untergrund-Verhältnis detektiert werden kann.
Es sind auch Antikörper-Farbstoffkonjugate für die Fluoreszenzbildgebung zum Zwecke der perkutanen, nicht-invasiven Tumordarstellung bekannt (Neri D et al., Nature Biotechnology (1997) 15: 1271-1275).
Nicht bekannt jedoch sind Antikörper-Farbstoffkonjugate, die sich im Randbereich eines Krankheitsherdes bevorzugt anreichern. Es sind auch Protein-Farbstoffkonjugate zur intraoperativen Tumordarstellung bekannt.
Nachteilig an diesen Konjugaten ist, daß insbesondere hypoxische als auch metabolisch unterversorgte Tumorzellen die Konjugate aufnehmen. Da das Gewebe im Randbereich von Tumoren aber gut vaskularisiert ist und hierdurch die Zellen ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt sind, gelingt gerade hierdurch keine ausreichende Anreicherung der bekannten Protein- Farbstoffkonjugate.
Dagegen sind die erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate von dem metabolischen Zustand des Krankheitsherdes weitgehend unabhängig.
Obwohl die optische Erfassung der Grenzen eines Krankheitsherdes auf unterschiedliche Weise erfolgen kann, wird generell die Erfassung der durch entsprechendes Anregungslicht induzierten, farbstoffspezifischen Fluoreszenzstrahlung bevorzugt. Je nach Emissionswellenlänge kann dabei die Fluoreszenz direkt makroskopisch oder mikroskopisch visuell erfaßt werden und gegebenenfalls dabei gleichzeitig durch bildgebende Detektionssysteme digital aufgezeichnet und auf einem Bildschirm dargestellt werden.
Visuell erfaßbar ist Fluoreszenzstrahlung des Spektralbereiches 400 bis 650 nm. Besonders bevorzugt ist eine Wellenlänge von 450 bis 600 nm. Der besondere Vorteil der Verwendung des sichtbaren Bereiches des Lichtes besteht darin, daß die Detektion der Fluoreszenz durch geringen technischen Aufwand möglich ist. Anregungslicht, das durch geeignete Laser oder Laserdioden erzeugt wird, wird in einen Lichtleiter eingekoppelt und über diesen an das zu diagnostizierende Areal herangeführt. Die Durchführung der introperativen Tumorranderkennung erfolgt durch großflächige Bestrahlung des Areals. Durch einen Filter (z. B. eine Filterbrille, die durch die untersuchende Person getragen wird) wird das reflektierte Anregungslicht abgeblockt und nur die farbstoffspezifische Fluoreszenz beobachtet (makroskopische Beobachtung). Alternativ kann die Erfassung der Fluoreszenz durch ein Operationsmikroskop erfolgen (mikroskopische Beobachtung). Durch die geringe Eindringtiefe von VIS-Licht in
Gewebe (wenige Millimeter) können auf diese Weise oberflächlich lokalisierte
Gefäßneubildungen erfaßt werden.
Ein weitererer Vorteil des Spektralbereiches des sichtbaren Lichtes besteht in der geringen Eindringtiefe in das Gewebe und Emission aus dem Gewebe. Hierduch wird das detektierbare Signal nicht durch Signale aus tieferen Gewebsanteilen verfälscht und kann den oberflächlich sichtbaren Gewebsstrukturen genau zugeordnet werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Antikörper- Farbstoffkonjugate, deren Farbstoffe im sichtbaren Spektralbereich des Lichtes ein optisches Signal induzieren. Die Verwendung von Antikörper-Farbstoffkonjugaten mit Farbstoffen, die im Spektralbereich des Nahinfrarotlichtes (NIR; 600 - 900 nm) absorbieren, ermöglicht dagegen die Erkennung von Gefäßneubildung in tieferen Gewebeschichten (bis zu 1 cm), da NIR- icht schwächer von Gewebe absorbiert wird und daher eine größere Gewebeeindringtiefe besitzt. Die Beobachtung der Fluoreszenz ist visuell nicht möglich und kann durch CCD- Kameras (Charge coupled device-Kamera) erfolgen, die über dem interessierenden Gewebeareal plaziert sind. Sowohl die makroskopische als auch mikroskopische Erfassung ist möglich. Der Vorteil der Verwendung von Farbstoffen in den Antikörper-Farbstoffkonjugaten, die im NIR-Spektralbereich absorbieren und fluoreszieren, kommt dann zum tragen, wenn eine Beurteilung verdeckter Areale (z. B. durch Blut) erforderlich ist.
Aus photophysikalischer Sicht sind für die Antikörper-Farbstoffkonjugate solche Farbstoffe geeignet, die ein Absorptionsmaximum innerhalb des Spektralbereiches von 400 bis 800 nm und mindestens ein Fluoreszenzmaximum innerhalb 500 bis 900 nm besitzen.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Antikörper- Farbstoffkonjugate, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Farbstoff erst unter Verwendung eines definierten Wellenlängenbereiches des sichtbaren oder nahinfraroten Lichtes ein Fluoreszenzsignal induziert.
Antikörper-Farbstoffkonjugate umfassend Farbstoffe mit visuell erfaßbarer Fluoreszenz, sind beispielsweise solche aus folgenden Klassen:
Fluorescein, Fluorescein-isothiocyanat, Carboxyfluorescein oder Calcein, Tetrabromfluoresceine oder Eosine, Tetraiodfluoresceine oder Erythrosine, Difluorofluorescein, wie z. B. Oregon Green™ 488, Oregon Green™ 500 oder Oregon Green™ 514, Carboxyrhodol (Rhodol Green™)-Farbstoffe (US 5,227,487; US 5,442,045), Carboxyrhodamin-Farbstoffe (z. B. Rhodamine Green™ Dyes) (US 5,366,860),
4,4-Difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-indacene, wie z. B. Bodipy FL, Bodipy 493/503 oder Bodipy 530/550 und Derivate davon (US 4,774,339, US 5,187,288, US 5,248,782, US 5,433,896, US 5,451 ,663), Cyaninfarbstoffe, insbesondere Carbocyanine und Merocyanine,
Coumarinfarbstoffe, wie z. B. 7-Amino-4-methylcoumarin, Metallkomplexe von DTPA oder Tetraaza-macrozyclen (Cyclen, Pyclen) mit Terbium oder Europium oder Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesondere Porphyrine.
Antikörper-Farbstoffkonjugate umfassend Nahinfrarotfarbstoffe, sind beispielsweise solche aus folgenden Klassen:
Polymethinfarbstoffe, wie Dicarbocyanin-, Tricarbocyanin-, Merocyanin- und
Oxonolfarbstoffe (WO 96/ 17628),
Rhodaminfarbstoffe, Phenoxazin- oder Phenothiazinfarbstoffe,
Tetrapyrrolfarbstoffe, insbesondere Benzoporphyrine, Chorine und
Phthalocyanine.
Bevorzugte Nahinfrarotfarbstoffe in den Antikörper-Farbstoffkonjugaten sind die
Cyaninfarbstoffe mit Absorptionsmaxima zwischen 700 und 800 nm, insbesondere Indodi- und Indotricarbocyanine.
Generell bevorzugt sind Farbstoffe in den Antikörper-Farbstoffkonjugaten aus o. g. Klassen, die eine oder mehrere Carboxylgruppen besitzen, weiche nach chemischer Aktivierung an Aminogruppen von Antikörpern oder Antikörperfragmenten gekoppelt werden. Auch sind solche Derivate bevorzugt, die Maleimido- oder Bromalkylreste enthalten, so daß eine kovalente Kopplung an die Sulfhydrylgruppe der Aminosäure Cystein erfolgt. Weiterhin sind Farbstoffe bevorzugt, die Isothiocyanat-Gruppen besitzen, welche ebenfalls mit Aminogruppen reagieren.
Darüber hinaus müssen die Farbstoffe in den Antikörper-Farbstoffkonjugaten eine hohe Photostabilität besitzen und unter Bestrahlung mit Licht nicht ausbleichen (Photobleaching), um innerhalb des Untersuchungszeitraums ein konstantes Signal zu gewährleisten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Antikörper- Farbstoffkonjugate, die sich im Randbereich des Zellgewebes eines Krankheitsherdes bevorzugt anreichern und damit den Randbereich des Krankheitsherdes optisch darstellbar machen.
Insbesondere Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Antikörper- Farbstoffkonjugate der allgemeinen Formel I
B-(F)n (I), in der B für einen Antikörper oder ein Antikörperfragment mit hoher Bindung an
ED-BFN steht, F für einen Farbstoff aus der Klasse der Coumarine, der Fluoresceine, Carboxyfluoresceine, der Difluorofluoresceine, der
Tetrabromfluoresceine, der Tetraiodfluoresceine, der Rhodamine, der Carboxyrhodamine, der Craboxyrhodole, der 4,4-Difluoro-4-bora-3a, 4a- diaza-indacene, der Polymethinfarbstoffe oder der Tetrapyrrolfarbstoffe, oder der Terbium- oder Europiumkomplexe mit DTPA oder Cyclen und dessen Derivaten steht und n für 1 bis 5 steht, bedeuten. Besonders bevorzugt und damit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Antikörper-Farbstoffkonjugate, deren Farbstoff ein Cyaninfarbstoff, ein Merocyaninfarbstoff, ein Oxonolfarbstoff, ein Styrylfarbstoff oder ein Squariliumfarbstoff ist.
Insbesondere bevorzugt und damit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Antikörper-Farbstoffkonjugate, in denen der Farbstoffanteil ein Cyaninfarbstoff, insbesondere ein Carbocyanin, Dicarbocyanin oder Tricarbocyanin ist.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere solche Antikörper-Farbstoffkonjugate, in denen der Farbstoff -(F)n der allgemeinen Formel I ein Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel II
ist, in der
D für einen Rest III oder IV
steht, wobei die mit einem Stern markierte Position die
Verknüpfungsstelle mit dem
Rest B bedeutet, und
B für die Gruppe V, VI, VII, VIII oder IX
V VI VII VIII IX
stehen kann, in denen R1 und R2 CrC4-Sulfoalkyl, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder lineare Ci-Cso-Alkylkette bedeutet, die gegebenfalls mit bis zu
15 Sauerstoffatomen, und/oder mit bis zu 3 Carbonylgruppen, und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, R3 für die Gruppe -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1, -NHCONHE1,
-NE1E2, -OE1, -OS03E1, -S03E1, -S02NHE1 oder -E1 steht, wobei E1 und E2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, C1-C4- Sulfoalkyl, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder geradkettiges d-Cso-Alkyl steht, das gegebenfalls mit bis zu 15 Sauerstoffatomen, und/oder bis zu 3 Carbonylgruppen unterbrochen, und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann,
R4 für ein Wasserstoffatom oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder lodatom steht, b für 2 oder 3 steht,
X für Sauerstoff, Schwefel oder die Gruppe =C(CH3)2 oder - (CH=CH)- steht, und L für eine direkte Bindung oder einen Linker, der eine geradkettige oder verzweigte Kohlenstoffkette mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen, welche mit einer oder mehreren -OH, -COOH, SO3-Gruppen substituiert, und/ oder gegebenenfalls ein oder mehrfach durch eine -O-, -S-, -CO-, -CS-.-CONH-, -NHCO-, -NHCSNH-, -SO2-, P04 — oder eine -NH-Gruppen oder einen Arylring unterbrochen sein kann, steht. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate können entweder alleine oder in Formulierung als Arzneimittel zur Anwendung kommen.
Zur Verwendung der Antikörper-Farbstoffkonjugate als Arzneimittel werden diese in die Form eines pharmazeutischen Präparats gebracht, das neben dem Antikörper-Farbstoffkonjugat für die enterale oder parenterale Applikation geeignete pharmazeutische, organische oder anorganische inerte Trägermaterialien, wie zum Beispiel, Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Polyalkylenglykole usw. enthält. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Suppositorien, Kapseln oder in flüssiger Form, zum Beispiel als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls enthalten sie darüber hinaus Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel oder Emulgatoren, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer.
Für die parenterale Anwendung sind Injektionslösungen oder Suspensionen, insbesondere wässrige Lösungen der Antikörper-Farbstoffkonjugate geeignet.
Als Trägersysteme können auch grenzflächenaktive Hilfsstoffe wie Salze der Gallensäuren oder tierische oder pflanzliche Phospholipide, aber auch Mischungen davon sowie Liposome oder deren Bestandteile verwendet werden. Für die orale Anwendung sind insbesondere Tabletten, Dragees oder Kapseln mit Talkum und/oder Kohlenwasserstoffträger oder -binder, wie zum Beispiel Lactose, Mais- oder Kartoffelstärke, geeignet. Die Anwendung kann auch in flüssiger Form erfolgen, wie zum Beispiel als Saft, dem gegebenenfalls ein Süßstoff beigefügt ist.
Die Dosierung der Antikörper-Farbstoffkonjugate kann je nach Verabfolgungsweg, Alter und Gewicht des Patienten, Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung und ähnlichen Faktoren variieren. Die anwendbare Dosis der Antikörper-Farbstoffkonjugate zur Erkennung der Grenzbereiche beträgt 0,5-1000 mg, vorzugsweise 50-200 mg, wobei die Dosis als einmal zu verabreichende Einzeldosis oder unterteilt in 2 oder mehreren Tagesdosen gegeben werden kann.
Die oben beschrieben Formulierungen und Darreichungsformen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Somit betrifft die Erfindung auch pharmazeutische Mittel, die ein oder merere Antikörper-Farbstoffkonjugate umfassen, zur intraoperativen Darstellung der Randbereiche eines Krankheitsherdes, wobei die pharmazeutischen Mittel entweder alleine oder in Mischung mit geeigneten Lösungsmitteln, Puffern und/ oder Trägerstoffen zur Anwendung kommen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate kommen bei der chirurgischen Behandlung von angiogeneseabhängigen Erkrankungen, wie malignen Tumoren und deren Metastasen, benignen Tumoren, präkanzeröse Gewebsveränderungen, Endometriose, Hämangiomen, extrauterinen Schwangerschaften zum Einsatz.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Antikörper-Farbstoffkonjugate und Mittel zur intraoperative Darstellung von Krankheitsherden, insbesondere zur mikro- und makroskopischen, intraoperativen Darstellung der Randbereiche eines Krankheitsherdes, sowie die Verwendung der Antikörper-Farbstoffkonjugate zur Herstellung eines Mittels für chirurgische Behandlungen von angiogeneseabhängigen Erkrankungen, wie malignen Tumoren und deren Metastasen, benignen Tumoren, präkanzeröse Gewebsveränderungen, Endometriose, Hämangiomen und extrauterinen Schwangerschaften.
Herstellung der Farbstoffe
Die Herstellung der Farbstoffe erfolgt nach literaturbekannten Methoden. Geeignete Farbstoffe für die Herstellung der Antikörper-Farbstoffkonjugate sind Farbstoffe Carboxylgruppen oder Isothiocyanatgruppen zur kovalenten Kopplung an Aminogruppen des Antikörpers. Besonders bevorzugt sind hierbei
Cyaninfarbstoffe (Mujumdar SR et al. (1996) 7: 356-362; Flanagan JH et al.
(1997) 8: 751-756 und Licha K et al. (1996) Proc SPIE Vol 2927, 192-198).
Die Farbstoffe mit Carboxylgruppen werden zunächst durch Überführung in einen reaktiven Ester (z. B. N-Hydroxysuccinimidester) nach an sich bekannten Methoden aktiviert. Farbstoffe mit Isothiocyanatgruppen können direkt eingesetzt werden. Die reaktiven Derivate werden dann in Pufferlösung oder Gemischen aus organischem Lösungsmittel (z. B. Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO)) und Pufferlösung mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht. Dabei wird ein 3 bis 100-facher molarer Überschuß an Farbstoff verwendet. Der nicht reagierte Anteil wird nach beendeter Reaktion durch Ultrafiltration und/oder Chromatographie abgetrennt.
In analoger Verfahrensweise wird auch folgender Farbstoff hergestellt:
Herstellungsbeispiel 1
Bis-1.1'-(4-sulfobutvπindocarbocvanin-5-carbonsäure-N-hvdroxysuccinimidester
Die Herstellung von Bis-1 ,1'-(4-sulfobutyl)indocarbocyanin-5-carbonsäure erfolgt ausgehend von 1-(4-Sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolenin und 1-(4- Sulfobutyl)-2,3,3-trimethyl-5-carboxy-3fV-indolenin (Cytometry 10, 11-19, 1989, Talanta 39, 505-510, 1992) in Anlehnung an literaturbekannte Methoden. Zur Überführung in den N-Hydroxysuccinimidester wird 0,1 mmol Farbstoff (67 mg in 10 ml DMF) mit jeweils 0,5 mmol N-Hydroxysuccinimid und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) versetzt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 50 ml Ether wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert, erneut je zweimal in wenig DDF gelöst und mit Ether gefällt und schließlich im Vakuum getrocknet (Ausbeute 89%). Herstellung des Antikörper-Farbstoffkonjugats
Herstellung eines Bis-1.1'-(4-sulfobutyl)indocarbocvanin-Koniuαates mit L19- Antikörper
Der Antikörper L19 (1 mg in 1 ml Natriumacetat-Puffer 50 mM, pH 8,2)) wird mit N-Hydroxysuccinimidester (75 μmol einer Lösung von 4 mg/ml in DMSO) versetzt und 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufreinigung erfolgt mittels Gelfiltration über PD10-Kartuschen (Pharmacia) und Aufkonzentration mittels Centricon-10 tubes (Amicon) unter Erhalt einer Lösung von ca. 1 mg/ml Antikörper.
Absorptionsmaximum: 555 nm Fluoreszenzmaximum: 582 nm.
Das nachfolgenden Beispiel erläutern die biologische Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Antikörper-Farbstoffkonjugate ohne diese auf die Anwendungsbeispiele zu beschränken.
Anwendungsbeispiel 1
In-vivo-Fluoreszenzbildgebung an tumortragenden Nacktmäusen und mikroskopische Ex-vivo-Untersuchung des Tumorgewebes
Die bildgebenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in vivo nach Injektion in tumortragenden Nacktmäusen untersucht. Dazu wird 0,1 μmol/kg bis 2 μmol/kg der Substanz intravenös appliziert und die Anreicherung in der Tumorregion in einem Zeitraum von 0 bis 48 Stunden beobachtet. Die Fluoreszenz der Substanzen wird durch Bestrahlung der Tiere mit Licht entsprechender Wellenlänge, das mit einem Laser (Diodenlaser, Festkörperlaser) monochromatisch erzeugt wird oder durch Filter aus der polychromatischen Emission einer Hg- oder Xe-Lampe herausgefiltert wird, induziert. Im Fall der im Herstellungsbeispiel 1 beschriebenen Verbindung wird aus einem Nd:YAG Laser Licht der Wellenlänge 540 nm zur Anregung zur Ausleuchtung des Versuchstieres verwendet und die Fluoreszenzstrahlung bei einer Wellenlänge von >580 nm durch eine intensivierte CCD-Kamera unter Erhalt von Ganzkörperfluoreszenzaufnahmen detektiert. Parallel wird die Fluoreszenz visuell und photographisch erfasst. Aus dem Tumormaterial werden Schnitte angefertigt und mikroskopisch untersucht (Zeiss Axiovert Mikroskop mit Cy3-Filtersatz).
Nach Injektion von 1 μmol/kg des im Herstellungsbeispiel genannten Antikörper- Farbstoffkonjugates in F9-Teratokarzinomtragenden Nacktmäusen konnte nach 4 h ein erhöhtes Fluoreszenzsignai im Vergleich zu Normalgewebe anhand von Ganzkörperfluoreszenzaufnahmen detektiert werden. Nach Präparation der Haut und der obersten Gewebeschichten des Tumors kann die Fluoreszenz den Randbereichen des Tumors zugeordnet werden. Die mikroskopische Beurteilung von Tumorschnitten ergibt eine erhöhte Fluoreszenz, die mit Blutgefäßen des Tumorrandbereiches korreliert.

Claims

Patentansprüche
1. Antikörper-Farbstoffkonjugate, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich im Randbereich des Zellgewebes eines Krankheitsherdes bevorzugt anreichern und damit den Randbereich des Krankheitsherdes optisch darstellbar machen.
2. Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß Anspruch 1 , der allgemeinen Formel I
B-(F)n (I), in der
B für einen Antikörper oder ein Antikörperfragment mit hoher Bindung an EDB-Fibronektin steht, F für einen Farbstoff aus der Klasse der Coumarine, der
Fluoresceine, Carboxyfluoresceine, der Difluorofluoresceine, der Tetrabromfluoresceine, der Tetraiodfluoresceine, der Rhodamine, der Carboxyrhodamine, der Craboxyrhodole, der 4,4-Difluoro-4- bora-3a,4a-diaza-indacene, der Polymethinfarbstoffe oder der Tetrapyrrolfarbstoffe, oder der Terbium- oder Europiumkomplexe mit DTPA oder Cyclen und dessen Derivaten steht und n für 1 bis 5 steht, bedeuten.
3. Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein Cyaninfarbstoff, ein Merocyaninfarbstoff, ein Oxonolfarbstoff, ein Styrylfarbstoff oder ein Squariliumfarbstoff ist.
4. Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein Cyaninfarbstoff wie Carbocyanin, Dicarbocyanin oder Tricarbocyanin ist. Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff -(F)n der allgemeinen Formel I ein Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel II
ist, in der
D für einen Rest III oder IV
steht, wobei die mit einem Stern markierte Position die
Verknüpfungsstelle mit dem
Rest B bedeutet, und
B für die Gruppe V, VI, VII, VIII oder IX
V VI VII VIII IX
stehen kann, in denen R1 und R2 d-C4-Sulfoalkyl, eine gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder lineare Ci-Cso-Alkylkette bedeutet, die gegebenfalls mit bis zu 15 Sauerstoffatomen, und/oder mit bis zu 3 Carbonylgruppen, und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann, R3 für die Gruppe -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1,
-NHCONHE1, -NE1E2, -OE1, -OSO3E1 , -SO3E1, -S02NHE1 oder -E1 steht, wobei E1 und E2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoff atom, C1-C4-
Sulfoalkyl, gesättigtes oder ungesättigtes, verzweigtes oder geradkettiges Cι-C5o-Alkyl steht, das gegebenfalls mit bis zu 15 Sauerstoffatomen, und/oder bis zu 3 Carbonylgruppen unterbrochen, und/oder mit bis zu 5 Hydroxygruppen substituiert sein kann,
R4 für ein Wasserstoffatom oder ein Fluor- Chlor, Brom- oder lodatom steht, b für 2 oder 3 steht,
X für Sauerstoff, Schwefel oder die Gruppe =C(CH3)2 oder -(CH=CH)- steht, und L für eine direkte Bindung oder einen Linker, der eine geradkettige oder verzweigte Kohlenstoff kette mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen, welche mit einer oder mehreren -OH, - COOH, Sθ3-Gruppen substituiert, und/ oder gegebenenfalls ein oder mehrfach durch eine -O-, -S-, -CO-, -CS-, -CONH-, -NHCO-, -NHCSNH-, -SO2-, PO4 _oder eine -NH-Gruppen oder einen Arylring unterbrochen sein kann, steht.
6. Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper die Antikörper L19 und E8 verwendet werden.
7. Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff im sichtbaren Spektralbereich des
Lichtes ein optisches Signal induziert.
8. Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff erst unter Verwendung eines definierten Wellenlängenbereiches des sichtbaren oder nahinfraroten Lichtes ein Fluoreszenzsignal induziert.
9. Pharmazeutisches Mittel, umfassend ein oder merere Antikörper- Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, zur intraoperativen Darstellung der Randbereiche eines Krankheitsherdes.
10. Pharmazeutisches Mittel gemäß Anspruch 9, in Mischung mit geeigneten Lösungsmitteln, Puffern und/ oder Trägerstoffen.
11. Verwendung der Antikörper-Farbstoffkonjugate und Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 zur intraoperative Darstellung von Krankheitsherden.
12. Verwendung der Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 zur intraoperativen Darstellung der Randbereiche eines Krankheitsherdes.
13. Verwendung der Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 10 zur mikro- und makroskopischen, intraoperative Darstellung der Randbereiche eines Krankheitsherdes.
14. Verwendung der Antikörper-Farbstoffkonjugate gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung eines Mittels zur chirurgischen Behandlung von angiogeneseabhängigen Erkrankungen, wie malignen Tumoren und deren Metastasen, benignen Tumoren, präkanzeröse Gewebsveränderungen, Endometriose, Hämangiomen und extrauterinen Schwangerschaften.
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