MXPA02002639A - Conjugados de colorante y anticuerpo para estructuras diana angiogenicas, para la visualizacion intraoperativa del borde de tumores. - Google Patents
Conjugados de colorante y anticuerpo para estructuras diana angiogenicas, para la visualizacion intraoperativa del borde de tumores.Info
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Abstract
Conjugados de anticuerpo y colorante adecuados para ligar vasos de nueva formacion a estructuras y su uso para la visualizacion intraoperativa de angiogenesis patologica.
Description
CONJUGADOS DE COLORANTE Y ANTICUERPO PARA ESTRUCTURAS DIANA ANGIOGÉNICAS, PARA LA VISUALIZACION INTRAOPERA IVA DEL BORDE DE TUMORES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con conjugados de colorante y anticuerpo que son adecuados para enlazarse a estructuras de vasos de nueva formación, y a su uso para la visualización intraoperativa de la angiogénesis patológica. Con algunas excepciones, en el organismo adulto no tiene lugar la formación de nuevos vasos (por ejemplo, el ciclo de mujeres en edad de gestación) . Sin embargo es posible observar la nueva formación de vasos en muchas enfermedades. Al proceso de la nueva formación de vasos que tiene lugar allí se le llama angiogénesis, y se desarrolla como respuesta a determinadas señales. La angiogénesis es un proceso que preferiblemente se desarrolla en el área del borde de un foco de enfermedad. Desde el centro del foco de la enfermedad se liberan factores que se difunden a la área del borde del foco de la enfermedad. Estos factores también se llaman estimuladores de la angiogénesis. Si estos estimuladores del angiogénesis llegan al tejido sano en el área del borde del foco de la enfermedad, los vasos previamente no integrados al foco de la enfermedad se estimulan para formar nuevos brotes vasculares. Estos vasos que se extienden desde estos brotes vasculares forman una nueva red vascular capilar en el área del borde del foco de la enfermedad. Mediante este proceso se puede siempre asegurar un suministro adecuado de nutrientes para el foco de la enfermedad. Se ha comprobado que es particularmente importante que el crecimiento de tumores y sus metástasis depende de la habilidad de inducir la angiogénesis. La terapia quirúrgica es ahora una medida estándar para tratar focos de enfermedad localizados. Ha adquirido gran importancia en el caso del tratamiento de tumores. Sin embargo resulta que a pesar del perfeccionamiento de las técnicas de cirugía es considerable el numero de recurrencias locales en virtud de que las condiciones anatómicas del organismo humano solo rara vez permiten una remoción a gran escala del foco de la enfermedad. En muchos órganos (por ejemplo, en el cerebro) se debe eliminar la remoción a gran escala para obtener tejido sano. El riesgo de lesionar órganos sanos se incrementa con el grado de radicalidad de la intervención quirúrgica. Los estudios histológicos del área del borde del tumor después de haberse completado la remoción del tumor por cirugía muestran, sin embargo, que un numero considerable de tumores no se puede remover por completo y que en el cuerpo permanecen radicales del tumor. A partir de estos radicales de tumor puede brotar crecimiento de tumor adicional y también la metástasis del tumor. Un proceso que indicara exactamente los límites de un proceso de enfermedad con respecto al tejido sano durante el tratamiento quirúrgico permitiría la remoción total del foco de la enfermedad y dejar sin afectar el tejido sano en gran medida. Los colorantes para la visualización de focos de enfermedad ya se conocen (Poon, W. S. et al., J. Neurosurgery (1992) 76: 679-686, Haglund, M. M. et al., Neurosurgery (1996) 38: 308-317). Preferiblemente se remueven directamente de las células tumorales o se acumulan en forma no específica en el espacio extracelular de los tumores. Puesto que el mecanismo se puede detectar en la concentración incluso en el tejido sano, la especificidad y la sensibilidad de las sustancias que se usan es baja. A la fecha no se conocen compuestos que se pueden usar para el delineamiento intraoperativo de focos de enfermedad mediante la visualización selectiva del área del borde de un foco de enfermedad. La angiogénesis preferiblemente tiene lugar en el área del borde de los focos de enfermedad. Mediante la visualización de la angiogénesis se puede visualizar el límite con el tejido sano. Los anticuerpos para detectar la angiogénesis en el foco de la enfermedad ya son conocidos y se usan para visualizar vasos de reciente formación en la sección histológica del tejido, para detectar varias proteínas en el foco de la enfermedad o como moléculas portadoras para sustancias terapéuticas. Sin embargo no se conocen anticuerpos en combinación con colorantes, llamados conjugados de anticuerpo y colorante, que se pueden usar para el delineamiento intraoperativo del foco de la enfermedad mediante visualización selectiva del área del borde de un foco de la enfermedad. Por consiguiente es el objeto de esta invención preparar conjugados de anticuerpo y colorante para la visualización intraoperativa de bordes de tumores. Los anticuerpos de los conjugados de anticuerpo y colorante de conformidad con la invención se dirigen contra estructuras que son específicas para el proceso del angiogénesis. Los conjugados de anticuerpo y colorante de conformidad con la invención comprenden colorantes que permiten una visualización óptica mediante su concentración. Puesto que la angiogénesis se hace mas fuerte en el área del borde del foco de la enfermedad resulta allí en la máxima señal óptica. Los conjugados de anticuerpo y colorante de conformidad con la invención son adecuados para visualizar los límites de un foco de enfermedad, lo que se conoce como el área del borde, para el tejido sano mediante diagnóstico óptico intraoperativo. En consecuencia resulta posible remover completamente el foco de la enfermedad dejando el tejido sano en gran medida sin afectar. Se conocen anticuerpos dirigidos contra moléculas que se expresan fuertemente en tejido angiogénicamente activo y que se expresan solo a un muy bajo nivel en el tejido adyacente (WO 96/01653) . Son de especial interés en los conjugados de anticuerpo y colorante los anticuerpos dirigidos contra receptores para factores de crecimiento vascular, receptores en células endoteliales a los cuales se enlazan los mediadores de inflamaciones, receptores en células endoteliales a los cuales se enlazan moléculas matriz y proteínas matriz que se expresan específicamente en la formación de vasos nuevos (Brekken et al., Cáncer Res. (1998) 58: 1952-9 y Schold, S. C. Jr . et al., Invest. Radiol. (1993) 28: 488-96). Se prefieren los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se dirigen contra la proteína matriz fibronectina EDB. La fibronectina EDB (EDBFN) también conocida como fibronectina oncofetal es una variante de corte de la fibronectina que específicamente forma vasos de reciente formación en el proceso de la angiogénesis. La ventaja especial de los anticuerpos contra la fibronectina EDB consiste en que no resulta en una nueva formación de fibronectina EDB en el tejido sano debido a lesión intraoperativa durante la remoción del foco de la enfermedad. En conexión con esto se conserva la especificidad durante la intervención quirúrgica. Sin embargo, los anticuerpos contra receptores de factor de crecimiento o mediadores de inflamación en las células endoteliales que también se expresan específicamente en el área del borde del tumor se pueden formar nuevamente durante la intervención quirúrgica incluso en el tejido sano próximo al foco de la enfermedad. En el conjugado de anticuerpo-colorante de conformidad con la invención se prefieren especialmente los anticuerpos L19 y E8 contra la fibronectina EDB (Viti, F., et al., Cáncer Res. (1999) 59: 347-352). Estos conjugados de anticuerpo y colorante también son objeto de esta invención. Los anticuerpos conocidos se conjugan con colorantes cuya concentración en el tejido se puede detectar ópticamente y permite el delineamiento intraoperativo del área del borde de un foco de enfermedad. La ventaja de los conjugados de anticuerpo y colorante de conformidad con la invención consiste ahora en el lecho de que estos últimos se pueden usar para una tinción fluorescente selectiva de tejidos en una etapa neoangiogénica. La tinción fluorescente es específica del tumor y produce una señal de fluorescencia que se puede detectar con una alta relación de señal a fondo (ruido) . Los conjugados de anticuerpo y colorante para proporcionar imágenes de fluorescencia también se conoce para los propósitos de visualización de tumores percutáneos no invasibles (Neri, D. et al., Nature Biotechnology (1997) 15: 1271-1275) . Sin embargo, no se conocen conjugados de anticuerpo y colorante que con preferencia se acumulan en el área del borde de un foco de enfermedad. También se conoce conjugados de proteína y colorante para la visualización intraoperativa de tumores. La desventaja con respecto a estos conjugados es que son especialmente las células tumorales hipóxicas y metabolicamente mal nutridas las que absorben los conjugados. Sin embargo, como el tejido en el área del borde de los tumores está bien vascularizado, y en este contexto las células están adecuadamente surtidas de oxígeno y nutrientes, es por esta razón que no es posible la acumulación adecuada de los conjugados de proteína y colorante conocidos. Sin embargo, los conjugados de anticuerpo y colorante de conformidad con la invención son en gran medida independientes del estado metabólico del foco de la enfermedad. Aunque la detección óptica de los límites de un foco de enfermedad se puede llevar a cabo de diferentes maneras, en general se prefiere la detección de la radiación fluorescente específica del colorante inducida por un estimulo de luz correspondiente. En función de la longitud de onda de emisión en este caso la fluorescencia se puede detectar visualmente en forma directa macroscópica o microscópica, y opcionalmente ser simultáneamente registrada digitalmente mediante sistemas de detección de imagen y visualizada en una pantalla. La radiación de fluorescencia en el rango del espectro de 400 a 650 nm es visualmente detectable. Se prefiere particularmente una longitud de onda de 450 a 600 nm. La ventaja especial del uso del rango de luz visible consiste en el hecho de que permite la detección de fluorescencia mediante un reducido gasto técnico. La luz estimulante que se produce mediante láser o diodos láser adecuados se acopla a una guía de luz de fibra óptica y es introducida por esta última al área a ser diagnosticada. La implementación de la detección intraoperativa del borde del tumor se lleva a cabo mediante radiación a gran escala del área. La luz estimulante reflejada se bloquea mediante un filtro (por ejemplo, un par de lentes filtrantes que lleva puestos la persona que hace el estudio) y solo se observa la fluorescencia específica del colorante (observación macroscópica) . Como una alternativa la detección de la fluorescencia se puede llevar a cabo mediante un microscopio operativo (observación microscópica) . Mediante la poca profundidad de penetración de la luz VIS en el tejido (unos cuantos milímetros) se pueden detectar de esta manera nuevas formaciones vasculares localizadas en la superficie. Otra ventaja del rango del espectro de la luz visible existe por la poca profundidad de penetración en el tejido y de emisión del tejido. Consecuentemente la señal detectable no es distorsionada por señales de porciones mas profundas del tejido y se puede asignar específicamente a las estructuras de tejido que son visibles en la superficie. Por consiguiente también son objeto de esta invención los conjugados de anticuerpo y colorante cuyos colorantes inducen una señal óptica en el rango del espectro de luz visible. El uso de conjugados de anticuerpo y colorante con colorantes que absorben en el rango del espectro de luz infrarrojo próximo (NIR por sus siglas en inglés; 600-900 nm) permite sin embargo la detección de nueva formación vascular en capas mas profundas del tejido (hasta 1 cm) , puesto que la luz en la gama infrarroja próxima es absorbida mas débilmente por el tejido y por consiguiente tiene una mayor profundidad de penetración al tejido. La observación de la fluorescencia es visualmente imposible y se puede efectuar mediante cámaras CCD (charge-coupled device camera según se conoce en inglés) que se colocan sobre el área de tejido de interés. Son posibles tanto la detección macroscópica como la microscópica. La ventaja de usar en los conjugados de anticuerpo y colorante los colorantes que absorben y emiten fluorescencia en el rango del espectro infrarrojo próximo entra entonces en función si se requiere una evaluación de áreas enmascaradas (por ejemplo, por sangre) . Desde el punto de vista fotofisiológico son adecuados para los conjugados de anticuerpo y colorante aquellos colorantes que tienen un máximo de absorción dentro del rango del espectro de 400 a 800 nm y un mínimo de un máximo de fluorescencia dentro de 500 a 900 nm. Son objetos de esta invención también los conjugados de anticuerpo y colorante que se caracterizan en que el colorante induce una señal de fluorescencia solamente con el uso de un rango definido de longitud de onda de la luz visible o infrarroja próxima. Los conjugados de anticuerpo y colorante que comprenden colorantes con fluorescencia visualmente detectable son, por ejemplo, aquellos de las siguientes clases : fluoresceina, flúoresceina-isotiocianato, carboxifluoresceina o calceina, tetrabromofluoresceinas o eosinas, tetrayodofluoresceinas o eritrosinas, difluorfluoresceina, tal como, por ejemplo,
Oregon Green® 488, Oregon Green® 500 u Oregon Green® 514, colorantes de carboxirodolita (Oregon Green®) (US 5,227,487; US 5,442,045), colorantes de carboxirodamina
(por ejemplo, colorantes Rhodamine Green®) (US 5,366,860),
4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-indaceno, tal como, por ejemplo, Bodipy FL, Bodipy 493/503 o Bodipy 530/550 y sus derivados (US 4,774,339, US 5,187,288, US 5,248,782, US 5,433,896 y US 5,451,663), colorantes de cianina, en particular carbocianinas y merocianinas, colorantes de cumarina, tales como, por ejemplo, 7-amino-4-metilcumarina, complejos metálicos de DTPA o tetraatzamacrocicleno (cicleno, picleno) con colorantes de terbio o europio o tetrapirrolo, en particular forfriñas. Los conjugados de anticuerpo-colorante que comprenden colorantes del infrarrojo próximo son, por ejemplo, aquellos de las siguientes clases: colorantes de polimetina, tales como colorantes de dicarbocianina, tricarbocianina, merocianina y oxonio (WO 96/17628) , colorantes de rodamina colorantes de fenoxacina o fenotiacina, colorantes de tetrapirrolo, especialmente benzoporfirinas, corinas y ftalocianinas . Los colorantes del infrarrojo próximo que se prefieren en los conjugados de anticuerpo-colorante son los colorantes de cianina con máximos de absorción de entre 700 y 800 nm, en particular indodi y indotricarbocianinas . En los conjugados de anticuerpo y colorante se prefieren en general los colorantes de las clases precedentemente mencionadas que tienen uno o mas grupos carboxilo que están acoplados a grupos amino de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo después de la activación química. También se prefieren aquellos derivados que contienen radicales maleimido o bromoalquilo, de manera que se lleva a cabo un acoplamiento covalente al grupo sulfhidrilo de la cisteina del aminoácido. Adicionalmente se prefieren colorantes que tienen grupos de isotiocianato que también reaccionan con grupos amino. Además, los colorantes en los conjugados de anticuerpo y colorante deben tener una alta fotoestabilidad y no se decoloran expuestos a la irradiación con luz (photobleaching según se conoce en inglés) para asegurar una señal constante dentro del período de estudio. Por consiguiente son objetos de esta invención los conjugados de anticuerpo y colorante que preferiblemente se acumulan en el área del borde del tejido celular de un foco de enfermedad y de esta manera vuelven ópticamente detectable el área del borde del foco de la enfermedad. En particular son objetos de esta invención los conjugados de anticuerpo y colorante de fórmula general I B-(F)n (I) en la que B representa un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con elevado enlace a ED-BFN, F representa un colorante de la clase de las cumarinas, flúoresceinas, carboxifluoresceinas, difluorofluoresceinas, tetrabromofluoresceinas, tetayodofluoresceinas, rodaminas, carboxirodaminas, carboxirodolitas, 4, 4-difluoro-4-bora-3a, a-diaza- indacenos, colorantes de polimetina o colorantes tetrapirrolos o los complejos de terbio o europio con
DTPA o cicleno y sus derivados, y n representa 1 a 5. Se prefieren especialmente y por consiguiente también son objetos de esta invención los conjugados de anticuerpo y colorante cuyo colorante es un colorante de cianina, un colorante de merocianina, un colorante de oxonio, un colorante de estirilo o un colorante de escuarilio. Se prefieren especialmente y por consiguiente también son objetos de esta invención los conjugados de anticuerpo y colorante en los que la porción de colorante es un colorante de cianina, en particular carbocianina, dicarbocianina o tricarbocianina . Por consiguiente la invención se refiere en particular a aquellos conjugados de anticuerpo y colorante en los cuales el colorante -(F)n de fórmula general I es un colorante de cianina de fórmula general II
en la que D representa un radical III o IV
siendo que la posición que se marca con una estrella significa el punto de interfaz con el radical B y puede representar el grupo V, VI, VII, VIII o IX
en los que R1 y R2 significan sulfoalquilo-C!-C4, una cadena de alquilo-Cx-Cso saturada o insaturada, ramificada o lineal, la cual opcionalmente puede estar sustituida con hasta 15 átomos de oxígeno y/o con hasta 3 grupos carbonilo y/o con hasta 5 grupos hidroxi, R3 representa el grupo -C00E1, -CONE^2, -NHCOE1, -NHCONHE1, - NE^2, -OE1, -OSOsE1, -S03Ex, -SO?NHE1 O -E1, siendo que E1 y E2 independientes uno de otro representa un átomo de hidrógeno, sulfoalquilo-C?-C , alquilo-Ci-Cso saturado o insaturado, ramificado o lineal que opcionalmente puede estar interrumpido con hasta 15 átomos de oxígeno y/o hasta 3 grupos carbonilo y/o puede estar sustituido con hasta 5 grupos hidroxi, R4 representa un átomo de hidrógeno o un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo, b representa 2 ó 3, X e Y representa oxígeno, azufre o el grupo =C(CH3)2 o - (CH=CH)-y L representa un enlace directo o un agente de enlace que es una cadena de carbono lineal o ramificada con hasta 20 átomos de carbono que puede estar sustituida con uno o varios grupos -OH, -COOH, S03 y/o opcionalmente puede estar interrumpido en uno o varios sitios por un grupo -O-, -S-, -CO-, -CS-, -CONH-, -NHCO-, -NHCSNH-, -S02-, -P04- o -NH o por un anillo arilo. Los conjugados de anticuerpo-colorante de conformidad con la invención se pueden usar ya sea solos o en formulación como agentes farmacéuticos. Para usar los conjugados de anticuerpo-colorante como agentes farmacéuticos estos últimos se llevan a la forma de una preparación farmacéutica que en adición al conjugado de anticuerpo y colorante contiene medios farmacéuticos inertes orgánicos o inorgánicos que son adecuados para la administración entérica o parenteral, tales como, por ejemplo, agua, gelatina, goma arábiga, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites de origen vegetal, polialquilenoglicoles, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden estar presentes en forma sólida, por ejemplo como tabletas, tabletas recubiertas, supositorios, cápsulas o en forma líquida, por ejemplo como soluciones, suspensiones o emulsiones. Opcionalmente contienen además coadyuvantes tales como preservativos, estabilizadores, agentes tensioactivos o agentes emulsionantes, sales para alterar la presión osmótica o reguladores . Para el uso parenteral son adecuadas las soluciones o suspensiones inyectables, en particular la solución acuosa de conjugados de anticuerpo y colorante. Como sistemas de vehículo se pueden usar auxiliares tensioactivos como sales de ácidos biliares o fosfolípidos de origen animal o vegetal, pero también mezclas de ellos así como liposomas o sus componentes. Para el uso oral, en particular tabletas, son adecuadas las tabletas recubiertas o cápsulas con vehículos de talco y/o hidrocarburos o aglutinantes, tales como, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz o patata. La aplicación también se puede efectuar en una forma líquida, tal como, por ejemplo, jugo al cual opcionalmente se le adiciona un edulcorante . La dosificación de los conjugados de anticuerpo y colorante puede variar en función del método de administración, edad y peso del paciente, tipo y gravedad de la enfermedad a ser tratada y factores similares. La dosis aplicable de conjugados de anticuerpo y colorante para detectar áreas límite es de 0.5-1000 mg, preferiblemente 500-200 mg, siendo que la dosis se puede dar como una dosis única a ser administrada una vez o dividida en dos o mas dosis diarias. Las formulaciones y formas precedentemente descritas de administración también son objetos de esta invención . Por consiguiente la invención también se refiere a agentes farmacéuticos que comprenden uno o varios conjugados de anticuerpo y colorante para la visualización intraoperativa de las áreas del borde de un foco de enfermedad, en donde los agentes farmacéuticos se usan ya sea solos o en una mezcla con solventes, reguladores y/o vehículos adecuados. Los conjugados de anticuerpo y colorante de conformidad con la invención se usan en el tratamiento quirúrgico de enfermedades dependientes de la angiogénesis, tales como tumores malignos o metástasis de los mismos, tumores benignos, cambios de tejido precancerosos, endometriosis, hemangiomas y embarazos ectópicos. También es objeto de esta invención el uso de los conjugados de anticuerpo y colorante y los agentes para la visualización intraoperativa de focos de enfermedad, especialmente para la visualización intraoperativa microscópica y macroscópica de áreas del borde de un foco de enfermedad, así como también el uso de los conjugados de anticuerpo y colorante para la producción de un agente para tratamientos quirúrgicos de enfermedades dependientes de 1 angiogénesis, tales como tumores malignos o metástasis de los mismos, tumores benignos, cambios de tejido precancerosos, endometriosis, hemangiomas y embarazos ectópicos . Producción de los colorantes La producción de los colorantes se lleva a cabo de acuerdo a métodos que se conocen en la literatura. Los colorantes adecuados para la producción de los conjugados de anticuerpo y colorante son colorantes de los grupos de carboxilo o los grupos de isotiocianato para el acoplamiento covalente a grupos amino del anticuerpo. En este caso se prefieren particularmente los colorantes de cianina (Mujumdar, S. R. et al. (1996) 7: 356-362; Flanagan, J. H. et al. (1997) 8: 751-756 y Licha, K. et al (1996) Proc SPIE Vol. 2927, 192-198). Los colorantes con colorantes con grupos carboxilo se activan primero mediante la conversión a un éster reactivo (por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimida) de acuerdo a métodos conocidos en la técnica. Los colorantes con grupos de isotiocianato se pueden usar directamente. Los derivados reactivos se hacen entonces reaccionar en una solución reguladora o mezclas de solvente orgánico (por ejemplo, dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO) ) y solución reguladora con el anticuerpo. En este caso se usa un exceso molar del colorante de 3 a 100 veces. La porción sin reaccionar se separa por ultrafiltración y/o cromatografía después de haber terminado la reacción. El siguiente colorante también se produce mediante un método similar: Ejemplo de producción 1 Ester de N-hidroxisuccinimida del ácido bis-l,l'-(4-sulfobutil) indocarbocianina-5-carboxílico La producción de este ácido bis-l,l'-(4-sulfobutil) indocarbocianina-5-carboxílico se lleva a cabo a partir de 1- (4-sulfobutil) -2, 3, 3-trimetil-3H-indolenina y
1- (4-sulfobutil) -2, 3, 3-trimetil-5-carboxi-3H-indolenina
(Cytometry 10, 11-19, 1989, Talanta 39, 505-510, 1992) de una manera similar a los métodos que se conocen en la literatura. Para la conversión al éster de N-hidroxisuccinimida se mezclan 0.1 mmol del colorante (67 mg en 10 ml de DMF) en cada caso con 0.5 mmol de N-hidroxisuccinimida y diciciohexilcarbodiimida (DCC) y se agita durante 24 horas a la temperatura ambiente. Después de que se agregan 50 ml de éter el sólido que se precipita se separa por filtración, se disuelve nuevamente dos veces cada vez en un poco de DDF y se precipita con éter y finalmente se seca al vacío (rendimiento 89%) . Producción del conjugado de anticuerpo-colorante
Producción de un conjugado de bis-1, 1 '- (4-sulfobutil) -indocarbocianina con un anticuerpo L19 El anticuerpo L19 (1 mg en 1 ml de regulador de acetato de sodio (50 mmol, pH 8.2)) se mezcla con el éster de N-hidroxisuccinimida (75 µmol de una solución de 4 mg/ml en DMSO) y se agita durante 2 horas a la temperatura ambiente. La purificación se efectúa usando filtración por gel en cartuchos PD10 (Pharmacia) y la concentración se efectúa utilizando tubos centricon-10 (Amicon) con lo que se obtiene una solución de aproximadamente 1 mg/ml de anticuerpo . Máximo de absorción: 555 nm Máximo de fluorescencia: 582 nm. El siguiente ejemplo explica la utilidad biológica de los conjugados de anticuerpo y colorante de conformidad con la invención sin limitarlos a esta aplicación ejemplar. Aplicación ejemplar 1 Reproducción de imagen fluorescente in vivo de ratones desnudos portadores de tumores y examen microscópico ex-vivo del tejido tumoral Las propiedades de formación de imagen de los compuestos de conformidad con la invención se examinaron in vivo después de inyectarlos en ratones desnudos portadores de tumores. Para este propósito se administraron en forma intravenosa 0.1 µmol/kg a 2 µmol/kg de la sustancia y se observó la concentración en la región del tumor por un período de 0 a 48 horas. La fluorescencia de las sustancias se induce mediante irradiación de los animales con luz de una longitud de onda correspondiente, la cual se produce monocromática con un láser (diodo láser, láser de estado sólido) o se filtra a través de un filtro a partir de la emisión policromática de una lámpara de Hg o Xe . En el caso del compuesto que se describe en el ejemplo de producción 1 se usa la luz de un láser de Nd:YAG de 540 nm de longitud de onda para excitar la estimulación del animal de prueba, y la radiación de fluorescencia a una longitud de onda de >580 nm se detecta mediante una cámara CCD intensificada en tanto que se obtienen imágenes fluorescentes de cuerpo completo. De manera paralela la fluorescencia se detecta visual y fotográficamente. Se preparan secciones del material del tumor y se estudian mediante microscopio (microscopio Zeiss Axiovert con conjunto de filtros Cy3) .
Después de la inyección de 1 µmol/kg del conjugado de anticuerpo y colorante en ratones desnudos portadores del teratocarcinoma F9 mencionado en el ejemplo de producción fue posible detectar después de cuatro horas un incremento de la señal fluorescente en comparación con el tejido normal en base a las imágenes fluorescentes de cuerpo entero. Después de la preparación de la piel y las capas de tejido superiores del tumor, la fluorescencia se puede asociar a las áreas del borde del tumor. La evaluación microscópica de las secciones del tumor produce una fluorescencia elevada que se correlaciona con vasos sanguíneos del área del borde del tumor.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES 1. Conjugados de anticuerpo y colorante que se concentran preferiblemente en el área del borde del tejido celular de un foco de enfermedad y mediante ello permiten visualizar el área del borde del foco de la enfermedad, caracterizados porque el colorante es un compuesto de fórmula general I B-(F)n (I) en la que B representa un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con elevado enlace a la fibronectina EDB, F representa un colorante de la clase de las cumarinas, fluoresceinas, carboxifluoresceinas, difluorofluoresceinas, tetrabromofluoresceinas, tetayodofluoresceinas, rodaminas, carboxirodaminas, carboxirodolitas, 4, 4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza- indacenos, colorantes de polimetina o colorantes tetrapirrolos o los complejos de terbio o europio con DTPA o cicleno y sus derivados, y n representa 1 a 5.
- 2. Conjugados de anticuerpo y colorante según la reivindicación 1, caracterizados porque el colorante es un colorante de cianina, un colorante de meroc?anina, un colorante de oxonio, un colorante de estirilo o un colorante de escuarilio.
- 3. Conjugados de anticuerpo y colorante según la reivindicación 1, caracterizados porque el colorante es un colorante de cianina como carbocianina, dicarbocianina o tricarbocianina .
- 4. Conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizados porque el colorante -(F)n de fórmula general I es un colorante de cianina de fórmula general II en la que D representa un radical III o IV siendo que la posición que se marca con una estrella significa el punto de interfaz con el radical B y puede representar el grupo V, VI, VII, VIII o IX en los que Rx y R2 significan sulfoalquilo-C?-C4, una cadena de alquilo-Ci-Cso saturada o insaturada, ramificada o lineal, la cual opcionalmente puede estar sustituida con hasta 15 átomos de oxígeno y/o con hasta 3 grupos carbonilo y/o con hasta 5 grupos hidroxi, R3 representa el grupo -COOE1, -CONExE2, -NHCOE1, -NHCONHE1, - NEXE2, -OE1, -OSOTÍE1, -SOSE1, -SO^HE1 O -E1, siendo que E1 y E2 independientes uno de otro representa un átomo de hidrógeno, sulfoalquilo-C?-C , alquilo-C?-C50 saturado o insaturado, ramificado o lineal que opcionalmente puede estar interrumpido con hasta 15 átomos de oxígeno y/o hasta 3 grupos carbonilo y/o puede estar sustituido con hasta 5 grupos hidroxi, R4 representa un átomo de hidrógeno o un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo, b representa 2 ó 3, X e Y representa oxígeno, azufre o el grupo =C(CH3)2 o - (CH=CH)-y L representa un enlace directo o un agente de enlace que es una cadena de carbono lineal o ramificada con hasta 20 átomos de carbono que puede estar sustituida con uno o varios grupos -OH, -COOH, S03 y/o opcionalmente puede estar interrumpido en uno o varios sitios por un grupo -O-, -S-, -CO-, -CS-, -CONH-, -NHCO-, -NHCSNH-, -S02-, -P04- o -NH o por un anillo arilo.
- 5. Conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque como anticuerpos se usan los anticuerpos L19 y E8.
- 6. Conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados porque el colorante induce una señal óptica en la gama del espectro visible de la luz.
- 7. Conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizados porque el colorante induce una señal fluorescente solo al usar una determinada gama de longitud de onda de la luz visible o infrarroja próxima.
- 8. Agente farmacéutico que comprende uno o varios conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 7 para la visualización intraoperativa del área del borde de un foco de enfermedad.
- 9. Agente farmacéutico según la reivindicación 8, en mezcla con solventes, reguladores y/o vehículos adecuados.
- 10. Uso de los conjugados de anticuerpo y colorante y los agentes según las reivindicaciones 1 a 9 para la visualización intraoperativa de focos de enfermedad.
- 11. Uso de los conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 9 para la visualización intraoperativa de las áreas del borde de un foco de -enfermedad.
- 12. Uso de los conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 9 para la visualización intraoperativa micro y macroscópica de las áreas del borde de un foco de enfermedad.
- 13. Uso de los conjugados de anticuerpo y colorante según las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un agente para el tratamiento quirúrgico de enfermedades dependientes de la angiogénesis, como tumores malignos, sus metástasis, tumores benignos, cambios precancerosos en los tejidos, endometriosis, hemangiomas y embarazos extrauterinos.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA | Abandonment or withdrawal |