DE60109740T2 - Verfahren zur vermeidung von fluoreszenzlöschung - Google Patents
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Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Die Erfindung betrifft allgemein Cyanin- und Indocyaninfarbstoffe für die Verwendung bei der Bildbildung, bei der Diagnose und in der Therapie. Insbesondere betrifft diese Erfindung Zusammensetzungen von Cyanin- und Indocyaninfarbstoffen, wobei neue carbocyclische und heterocyclische Reste in den Polyenteil der Farbstoffmoleküle mit einbezogen werden.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Verschiedene Farbstoffe, die Licht im sichtbaren und im nahen Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums absorbieren und emittieren, sind gegenwärtig in der Verwendung für verschiedene biomedizinische Anwendungen aufgrund deren Biokompatibilität, deren hoher molarer Absorptionsfähigkeit oder deren hohen Fluoreszenzquantenausbeuten. Die hohe Empfindlichkeit der optischen Modalität in Verbindung mit Farbstoffen als Kontrastmittel befindet sich auf gleicher Höhe wie die der Nuklearmedizin und erlaubt die Visualisierung von Organen und Geweben ohne den nicht wünschenswerten Effekt von ionisierender Strahlung. Cyaninfarbstoffe mit intensiver Absorption und Emission in dem nahen Infrarot(NIR)-Bereich sind insbesondere nützlich, da biologische Gewebe in diesem Bereich optisch transparent sind (B. C. Wilson, Optical properties of tissues. Encyclopedia of Human Biology, 1991, 5, 587–597). Beispielsweise wurde Indocyaningrün, das in dem NIR-Bereich absorbiert und emittiert, zum Überwachen des Herzausausstoßes, der hepatischen Funktionen und des Leberblutflusses (Y.–L. He, H. Tanigami, H. Ueyama, T. Mashimo und I. Yoshiya, Measurement of blood volume using indocyanine green measured with pulse-spectrometry: Its reproducibility and reliability. Critical Care Medicine, 1998, 26(8), 1446–1451; J. Caesar, S. Shaldon, L. Chiandussi, et al., The use of Indocyanine green in the measurement of hepatic blood flow and as a test of hepatic funktion. Clin. Sci. 1961, 21, 43–57) verwendet, und dessen funktionalisierte Derivate wurden verwendet, um Biomoleküle für diagnostische Zwecke zu konjugieren (R. B. Mujumdar, L. A. Ernst, S. R. Mujumdar, et al., Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry, 1993 4(2), 105–111; Linda G. Lee und Sam L. Woo. "N-Heteroaromatic ion and iminium ion substituted cyanine dyes for use as fluorescent labels",
US 5,453,505 ; Eric Hohenschuh, et al. "Light imaging contrast agents", WO 98/48846; Jonathan Turner, et al. "Optical diagnostic agents for the diagnosis of neurodegenerative diseases by means of near infra-red radiation", WO 98/22146; Kai Licha, et al. "In-vivo diagnostic process by near infrared radiation", WO 96/17628; Robert A. Snow, et al., Compounds, WO 98/48838). - Ein Hauptnachteil bei der Verwendung von Cyaninfarbstoffderivaten ist das Potential für hepatobilliare Toxizität, die aus der schnellen Entfernung dieser Farbstoffe durch die Leber resultiert (G. R. Cherrick, S. W. Stein, C. M. Leevy, et al., indocyanine green: Observations on its physical properties, plasma decay, and hepatic extraction. J. Clinical Investigation, 1960, 39, 592–600). Diese ist mit der Tendenz von Cyaninfarbstoffen assoziiert, Aggregate in Lösung zu bilden, welche durch Kupffer-Zellen in der Leber aufgenommen werden könnten. Verschiedene Versuche, dieses Problem zu umgehen, waren nicht sehr erfolgreich. Typischerweise wurden hydrophile Peptide, Polyethylenglycol- oder Oligosaccharidkonjugate verwendet, aber diese führten zu lang zirkulierenden Produkten, welche letztendlich durch die Leber ausgestoßen werden. Eine Hauptschwierigkeit mit gegenwärtigen Cyanin- und Indocyaninfarbstoffsystemen ist, dass sie einen limitierten Umfang in Bezug auf die Fähigkeit, große Veränderungen bei den Absorptions- und Emissionseigenschaften dieser Farbstoffe zu induzieren, anbieten. Versuche wurden gemacht, um verschiedene Heteroatome und cyclische Reste in die Polyenkette dieser Farbstoffe mit aufzunehmen (L. Strekowski, M. Lipowska und G. Patonay, Substitution reactions of a nucleofugal group in hetamethine cyanine dyes. J. Org. Chem., 1992, 57, 4578–4580; N. Narayanan und G. Patonay, A new method for the synthesis of heptamethine cyanine dyes: Synthesis of new near infrared fluorescent labels. J. Org. Chem., 1995, 60, 2391–2395; E. Fung und R. Rajagopalan, Monocyclic functional dyes for contrast enhancement on optical imaging,
US 5,732,104 ; R. Rajagopalan und E. Fung, Delta1,6 bicyclo[4,4,0]functional dyes for contrast enhancement in optical imaging,US 5,672,333 ; R. Rajagopalan und E. Fung, Tricyclic functional dyes for contrast enhancement in optical imaging,US 5,709,845 ), aber die resultierenden Farbsysteme zeigen große Unterschiede bezüglich der Absorptions- und Emissionsmaxima, insbesondere nach 830 nm, wo photoakustische diagnostische Anwendungen sehr empfindlich sind. Sie besitzen ebenso einen prominenten hydrophoben Kern, welcher die Aufnahme durch die Leber verstärkt. Weiterhin haben die meisten Cyaninfarbstoffe nicht die Fähigkeit, Dendrimere zu bilden, welche bei biomedizinischen Anwendungen nützlich sind. - Daher gibt es einen Bedarf, neue Farbstoffe zu entwickeln, die die Farbaggregation in Lösung verhindern könnten, die prädisponiert sind, Dendrimere zu bilden, die in der Lage sind, nach 800 nm zu absorbieren oder zu emittieren, die wünschenswerte photophysikalische Eigenschaften besitzen und die mit einer gewebespezifischen Targetingfähigkeit ausgestattet sind.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Zusammensetzung, die Cyaninfarbstoffe der allgemeinen Formel 1Formel 1 umfasst, wobei a1 und b1 von 0 bis 5 variieren; W1 und X1 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -CR10R11, -O-, -NR12, -S- und -Se; Q1 ist eine Einfachbindung und ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S-, -Se- und -NR13; Y1 und Z1 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)e-NH2, -CH2-(CH2-O-CH2)f-CH2-NH2, -CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j)-CH2-CO2H; R1 und R10 bis R15 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10- Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h und i variieren von 1 bis 10; d, f und j variieren von 1 bis 100; und R2 bis R9 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, Hydroxyl, C1-C10-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Alkoxyl, Amino, C1-C10-Aminoalkyl, Cyano, Nitro und Halogen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Zusammensetzung, die Indocyaninfarbstoffe der allgemeinen Formel 2Formel 2 umfasst, wobei a2 und b2 auf dieselbe Art und Weise wie a1 und b1 definiert sind; W2 und X2 sind auf dieselbe Art und Weise wie W1 und X1 definiert; Q2 ist auf dieselbe Art und Weise wie Q1 definiert; R16 und R10 bis R15 sind auf dieselbe Weise wie R1 und R10 bis R15 definiert; Y2 ist auf dieselbe Art und Weise wie Y1 definiert; Z2 ist auf dieselbe Art und Weise wie Z1 definiert; und R17 bis R28 sind auf dieselbe Art und Weise wie R2 bis R9 definiert.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Zusammensetzung, die Cyaninfarbstoffe der allgemeinen Formel 3Formel 3 umfasst, wobei a3 und b3 auf dieselbe Art und Weise wie a1 und b1 definiert sind; W3 und X3 sind auf dieselbe Art und Weise wie W1 und X1 definiert; Y3 ist auf dieselbe Art und Weise wie Y1 definiert; Z3 ist auf dieselbe Art und Weise wie Z1 definiert; A1 ist eine Einfach- oder eine Doppelbindung; wenn A1 eine Einfachbindung ist, dann können B1 und C1 gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S-, -Se-, -P- und -NR38, und D1 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -CR39R40 und -C=O; wenn A1 eine Doppelbindung ist, dann ist B1 ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S-, -Se-, -P- und -NR38, C1 ist Stickstoff oder -CR41, und D1 ist -CR42; R29 bis R37 sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, Hydroxyl, hydrophilem Peptid, C1-C10-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Alkoxyl, Cyano, Nitro, Halogen und -NR43R44; R38 bis R42 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h und i variieren von 1 bis 10; d, f und j variieren von 1 bis 100; R43 und R44 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl oder können gemeinsam einen 5-, 6- oder 7-gliedrigen carbocyclischen Ring oder einen 5-, 6- oder 7-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, der optional ein oder mehrere Sauerstoff-, Stickstoff- oder ein Schwefelatom enthält.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Zusammensetzung, die Indocyaninfarbstoffe der allgemeinen Formel 4 umfasst, wobei a4 und b4 auf dieselbe Art und Weise wie a1 und b1 definiert sind; W4 und X4 sind auf dieselbe Art und Weise wie W1 und X1 definiert; Y4 ist auf dieselbe Art und Weise wie X1 definiert; Z4 ist auf dieselbe Art und Weise wie Z1 definiert; A2 ist auf dieselbe Art und Weise wie A1 definiert; B2, C2 und D2 sind auf dieselbe Art und Weise wie B1, C1 und D1 definiert; und R45 bis R57 sind auf dieselbe Art und Weise wie R29 bis R37 definiert.
- Formel 4
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Zusammensetzung, die Cyaninfarbstoffe der allgemeinen Formel 5Formel 5 umfasst, wobei a5 auf dieselbe Art und Weise wie a1 definiert ist; W5 und X5 sind auf dieselbe Art und Weise wie W1 und X1 definiert; Y5 ist auf dieselbe Art und Weise wie Y1 definiert; Z5 ist auf dieselbe Art und Weise wie Z1 definiert; A3 ist auf dieselbe Art und Weise wie A1 definiert; B3, C3 und D3 sind auf dieselbe Art und Weise wie B1, C1 und D1 definiert; und R58 bis R66 sind auf dieselbe Art und Weise wie R29 bis R37 definiert.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Zusammensetzung, die Cyaninfarbstoffe der allgemeinen Formel 6Formel 6 umfasst, wobei a6 auf dieselbe Art und Weise wie a1 definiert ist; W6 und X6 sind auf dieselbe Art und Weise wie W1 und X1 definiert; Y6 ist auf dieselbe Art und Weise wie Y1 definiert; Z6 ist auf dieselbe Art und Weise wie Z1 definiert; A4 ist auf dieselbe Art und Weise wie A1 definiert; B4, C4 und D4 sind auf dieselbe Art und Weise wie B1, C1 und D1 definiert; und R67 bis R79 sind auf dieselbe Art und Weise wie R29 bis R37 definiert.
- Die Erfindung betrifft ebenso das Verfahren zum Konjugieren der Farbstoffe dieser Erfindung an Peptide oder Biomoleküle durch Festphasensynthese.
- Die Erfindung betrifft ebenso das Verfahren zum Vorbeugen von Fluoreszenzquenching. Es ist bekannt, dass Cyaninfarbstoffe allgemein Aggregate in wässrigen Medien bilden, was zu Fluoreszenzquenching führt. Wir haben beobachtet, dass in Fällen, wo die Gegenwart eines hydrophoben Kerns in den Farbstoffen zu Fluoreszenzquenching führte, die Hinzufügung eines biokompatiblen organischen Lösungsmittels wie 1–50 Dimethylsulfoxid (DMSO) die Fluoreszenz dadurch wiederherstellte, dass die Aggregation vermieden wurde und eine in vivo-Organvisualisierung erlaubt wurde.
- DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Die neuen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die Farbstoffe der Formeln 1 bis 6 umfassen, bieten signifikante Vorteile gegenüber denen, die gegenwärtig im Stand der Technik beschrieben sind. Wie in den Schemata 1–6 illustriert, wurden diese Farbstoffe entworfen, um eine Aggregation in Lösung dadurch zu vermeiden, dass intramolekular und intermolekular geordnete hydrophobe Wechselwirkungen vermieden werden. Sie haben ebenso viele Anhaftungsorte zur Vereinfachung der Bildung von Dendrimeren, die proximal an dem Chromophor des Farbstoffs angrenzen. Die Gegenwart von einem festen und ausgedehnten Chromophor-Backbone verstärkt die Fluoreszenzquantenausbeute und erweitert die maximale Absorption auf über 800 nm hinaus. Die Konjugation von Biomolekülen an diese Farbstoffe ist leicht erhältlich. Sie sind nützlich bei verschiedenen biomedizinischen Anwendungen, einschließlich tomographischer Bildbildung von Organen; Aufzeichnen von Organfunktionen; Koronarangiographie; Fluoreszenzendoskopie; Detektion, Bildbildung und Therapie von Tumoren; lasergeführter Operation, photoakustischen Verfahren und Sonofluoreszenzverfahren; und Ähnlichem; sind aber nicht darauf beschränkt. Spezifische Ausführungsformen, die geeignet sind, einige der vorher erwähnten biomedizinischen Anwendungen zu erreichen, sind hierunter angegeben.
- In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Farbstoffe der Erfindung für optische tomographische, endoskopische, photoakustische und Sonofluoreszenzanwendungen und für die Detektion und Behandlung von Tumoren und anderen Abnormitäten nützlich.
- In einem weiteren Aspekt der Erfindung sind die Farbstoffe der Erfindung bei der lokalisierten Therapie nützlich.
- In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung sind die Farbstoffe der Erfindung zur Detektion der Gegenwart von Tumoren und anderen Abnormitäten dadurch nützlich, dass das Profil der Reinigung der Farbstoffe aus dem Blut überwacht wird.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Farbstoffe bei der laserunterstützt geführten Operation zur Detektion von Mikrometastasen von Tumoren nach einer Laparoskopie nützlich.
- In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung sind die Farbstoffbiokonjugate der Farbstoffe dieser Erfindung nützlich bei der Diagnose von atherosklerotischen Plaques und Blutverklumpungen.
- Die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung werden gemäß den Verfahren hergestellt, die im Stand der Technik gut bekannt sind, und sind in den Schemata 1–5 dargestellt, und deren Verwendung bei der Synthese von Biokonjugaten ist in Schema 6 dargestellt.
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- In einer bevorzugten Ausführungsform haben die Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel 1, wobei a1 und b1 von 0 bis 3 variieren; Q1 ist eine Einfachbindung; R1 bis R9 sind Wasserstoffe; W1 und X1 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -C(CH3)2, C((CH2)zzOH)CH3, C((CH2)zzOH)2, C((CH2)zzCO2H)CH3, C((CH2)zzCO2H)2, C(CH2)zzNH2)CH3, C(CH2)zzNH2)2, C((CH2)zzNRppRpz)CH3 und C((CH2)zzNRppRpz)2; Y1 und Z1 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; Rpp und Rpz können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; R14 und R15 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h, i und zz variieren von 1 bis 5; und d, f und j variieren von 1 bis 100.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel 2, wobei a2 und b2 von 0 bis 3 variieren; Q2 ist eine Einfachbindung; R16 bis R28 sind Wasserstoffe; W2 und X2 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -C(CH3)2, C((CH2)zzOH)CH3, C((CH2)zzOH)2, C((CH2)zzCO2H)CH3, C((CH2)zzCO2H)2, C((CH2)zzNH2)CH3, C((CH2)zzNH2)2, C((CH2)zzNRppRpz)CH3 und C((CH2)zzNRppRpz)2; Y2 und Z2 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; Rpp und Rpz können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; R14 und R15 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, Cl-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h, i und zz variieren von 1 bis 5; und d, f und j variieren von 1 bis 100.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel 3, wobei a3 und b3 von 0 bis 3 variieren; A1 ist eine Einfachbindung; B1 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; C1 ist -CH2 oder -C=O; D1 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; R29 ist ein Wasserstoff, ein Halogenatom, ein Saccharid oder ein hydrophiles Peptid; R30 bis R37 sind Wasserstoffe; R38 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; W3 und X3 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -C(CH3)2, C((CH2)zzOH)CH3, C((CH2)zzOH)2, C((CH2)zzCO2H)CH3, C((CH2)zzCO2H)2, C((CH2)zzNH2)CH3, C((CH2)zzNH2)2, C((CH2)zzNRppRpz)CH3 und C((CH2)zzNRppRpz)2; Y3 und Z3 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; Rpp und Rpz können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; R14 und R15 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h, i und zz variieren von 1 bis 5; und d, f und j variieren von 1 bis 100.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel 4, wobei a4 und b4 von 0 bis 3 variieren; A2 ist eine Einfach- oder eine Doppelbindung; B2 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; C2 ist -CH2 oder -C=O; D2 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; R38 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; R45 ist ein Wasserstoff, ein Halogenatom, ein Saccharid oder ein hydrophiles Peptid; R46 bis R57 sind Wasserstoffe; W4 und X4 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -C(CH3)2, C((CH2)zzOH)CH3, C((CH2)zzOH)2, C((CH2)zzCO2H)CH3, C((CH2)zzCO2H)2, C((CH2)zzNH2)CH3, C((CH2)zzNH2)2, C((CH2)zzNRppRpz)CH3 und C((CH2)zzNRppRpz)2; Y4 und Z4 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; Rpp und Rpz können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; R14 und R15 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h, i und zz variieren von 1 bis 5; und d, f und j variieren von 1 bis 100.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel 5, wobei a5 von 0 bis 3 variiert; A3 ist eine Einfach- oder eine Doppelbindung; B3 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; C3 ist -CH2 oder -C=O; D3 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; R38 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; R58 ist ein Wasserstoff, ein Halogenatom, ein Saccharid oder ein hydrophiles Peptid; R59 bis R66 sind Wasserstoffe; W5 und X5 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -C(CH3)2, C((CH2)zzOH)CH3, C((CH2)zzOH)2 C((CH2)zzCO2H)CH3, C((CH2)zzCO2H)2, C((CH2)zzNH2)CH3, C((CH2)zzNH2)2, C((CH2)zzNRppRpz)CH3 und C((CH2)zzNRppRpz)2; Y5 und Z5 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; Rpp und Rpz können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; R14 und R15 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h, i und zz variieren von 1 bis 5; und d, f und j variieren von 1 bis 100.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Farbstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung die allgemeine Formel 6, wobei a6 von 0 bis 3 variiert; A4 ist eine Einfach- oder eine Doppelbindung; B4 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; C4 ist -CH2 oder -C=O; D4 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S- und -NR38; R38 ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; R67 ist ein Wasserstoff, ein Halogenatom, ein Saccharid oder ein hydrophiles Pepid; R68 bis R79 sind Wasserstoffe; W6 und X6 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -C(CH3)2, C((CH2)zzOH)CH3, C((CH2)zzOH)2, C((CH2)zzCO2H)CH3, C((CH2)zzCO2H)2, C((CH2)zzNH2)CH3, C((CH2)zzNH2)2, C((CH2)zzNRppRpz)CH3 und C((CH2)zzNRppRpz)2; Y6 und Z6 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; Rpp und Rpz können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH-O-CH2)j-CH2-CO2H; R14 und R15 können gleich oder unterschiedlich sein und sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h, i und zz variieren von 1 bis 5; und d, f und j variieren von 1 bis 100.
- Die Zusammensetzungen der Erfindung können als diagnostische Zusammensetzungen für die enterale oder parenterale Verabreichung formuliert werden. Diese Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge des Farbstoffs zusammen mit konventionellen pharmazeutischen Trägern und Hilfsstoffen, die für die Art der Verabreichung, die vorgesehen ist, angemessen sind. Beispielsweise enthalten parenterale Formulierungen vorteilhafterweise eine sterile wässrige Lösung oder Suspension des Farbstoffs der Erfindung. Parenterale Zusammensetzungen können direkt injiziert oder mit einer großen Menge parenteraler Zusammensetzung für die systemische Verabreichung vermischt werden. Solche Lösungen können auch pharmazeutisch akzeptable Puffer und optional Elektrolyte wie Natriumchlorid enthalten.
- Formulierungen für die enterale Verabreichung können weit variieren, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Im Allgemeinen sind solche Formulierungen Flüssigkeiten, welche eine wirksame Menge des Farbstoffs in wässriger Lösung oder in Suspension enthalten. Solche enteralen Zusammensetzungen können optional Puffer, oberflächenaktive Stoffe, thixotrope Mittel und Ähnliches enthalten. Zusammensetzungen für die orale Verabreichung können ebenso geschmacksbildende Mittel und andere Inhaltsstoffe zum Verstärken von deren organoleptischen Qualitäten enthalten.
- Die diagnostischen Zusammensetzungen werden in Dosen verabreicht, die wirksam darin sind, die gewünschte Verstärkung zu erzielen. Solche Dosen können breit variieren, abhängig von dem bestimmten Farbstoff, der verwendet wird, den Organen oder Geweben, welche Gegenstand der bildbildenden Verfahren sind, der Bildbildungsausrüstung, die verwendet wird, und Ähnlichem.
- Die diagnostischen Zusammensetzungen der Erfindung werden auf konventionelle Art und Weise verwendet. Die Zusammensetzungen können einem Patienten verabreicht werden, typischerweise einem warmblütigen Tier, entweder systemisch oder lokal an das Organ oder an das Gewebe, von dem Bilder aufgenommen werden sollen, und der Patient wird dann der bildbildenden Prozedur ausgesetzt.
- Eine Kombination des Obigen stellt eine wichtige Herangehensweise an die Synthese und Verwendung von neuen Cyanin- und Indocyaninfarbstoffen mit einer Vielfalt von photophysikalischen und chemischen Eigenschaften dar. Die Farbstoffe dieser Erfindung sind neu und sind für biomedizinische Anwendungen nützlich. Die vorliegende Erfindung wird weiterhin detailliert in den folgenden Beispielen beschrieben, welche zum Zwecke der Illustration angeboten werden und welche nicht dafür vorgesehen sind, den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken. Verlässliche computerbasierende Verfahren für die Vorhersage der Absorptionsmaxima von einigen Farbstoffen wurden ebenso etabliert. Standardverfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, oder Techniken, die spezifisch hierunter beschrieben werden, werden verwendet.
- BEISPIEL 1
- Synthese eines Bis(ethylcarboxymethyl)indocyaninfarbstoffes
- (Schema 1, R1, R2 = fusioniertes Phenyl; A = CH2, n = 1 und R = R' = CO2H)
- Eine Mischung aus 1,1,2-Trimethyl-[2H]-Benz[e]indol (9,1 g, 43,58 mmol) und 3-Brompropansäure (10,0 g, 65,37 mmol) in 1,2-Dichlorbenzol (40 ml) wurde bei 110°C für 12 Stunden erhitzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der erhaltene rote Rückstand wurde filtriert und mit einer Mischung aus Acetonitril:Diethylether (1:1) gewaschen. Der erhaltene Feststoff wurde unter Vakuum getrocknet, um 10 g (64%) eines hellbraunen Pulvers zu erhalten. Ein Teil dieses Feststoffs (6,0 g, 16,56 mmol) Glutaconaldehyddianilmonohydrochlorid (2,36 g, 8,28 mmol) und Natriumacetattrihydrat (2,93 g, 21,53 mmol) in Ethanol (150 ml) wurden unter Rückfluss 90 Minuten erhitzt. Nach dem Verdampfenlassen des Lösungsmittels wurden 40 ml einer 2 N wässrigen HCl zu dem Rückstand hinzugefügt, und die Mischung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde dekantiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis der Überstand nahezu farblos wurde. Etwa 5 ml einer Mischung aus Wasser:Acetonitril (3:2) wurden zu dem Feststoffrückstand hinzugegeben und lyophilisiert, um 2 g dunkelgrüne Flocken zu erhalten. Die Reinheit der Verbindung wurde durch 1H-NMR und LC-Massenspektrometrie etabliert.
- BEISPIEL 2
- Synthese von Bis(pentylcarboxymethyl)indocyanin-farbstoff
- (Schema 1, R1, R2 = fusioniertes Phenyl; A = CH2, n = 4 und R = R' = CO2H)
- Eine Mischung aus 1,1,2-Trimethyl-[1H]-benz[e]indol (20 g, 95,6 mmol) und 6-Bromhexansäure (28,1 g, 144,1 mmol) in 1,2-Dichlorbenzol (250 ml) wurde bei 110°C für 12 Stunden erhitzt. Die grüne Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und ein braunes Feststoffpräzipitat, das sich gebildet hatte, wurde durch Filtration gesammelt. Nach dem Waschen des Feststoffs mit 1,2-Dichlorbenzol und Diethylether wurde das erhaltene braune Pulver (24 g, 64%) unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Ein Teil dieses Feststoffs (4,0 g; 9,8 mmol), Glutaconaldehyddianilmonohydrochlorid (1,4 g, 5 mmol) und Natriumacetattrihydrat (1,8 g, 12,9 mmol) in Ethanol (80 ml) wurde für 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurden 20 ml einer 2 N wässrigen HCl zu dem Rückstand hinzugefügt, und die Mischung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde dekantiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt, bis der Überstand nahezu farblos war. Etwa 5 ml einer Mischung aus Wasser:Acetonitril (3:2) wurden zu dem Feststoffrückstand hinzugefügt und lyophilisiert, um 2 g dunkelgrüne Flocken zu erhalten. Die Reinheit der Verbindung wurde durch 1H-NMR und LC-Massenspektrometrie etabliert.
- BEISPIEL 3
- Synthese von Bisethylcarboxymethylindocyaninfarbstoff
- (Schema 1, R1 = R2 = H; A = CH2, n = 1 und R = R' = CO2H)
- Diese Verbindung wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, außer dass 1,1,2-Trimethylindol als Ausgangsmaterial verwendet wurde.
- BEISPIEL 4
- Synthese von Bis(hexaethylenglycolcarboxymethyl)indocyaninfarbstoff
- (Schema 1, R1 = R2 = fusioniertes Phenyl; A = CH2OCH2, n = 6 und R = R' = CO2H)
- Diese Verbindung wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, außer dass ω-Bromhexaoxyethylenglycolpropiolsäure anstelle von Brompropansäure verwendet wurde, und die Reaktion wurde in 1,2-Dimethoxypropan ausgeführt.
- BEISPIEL 5
- Synthese von Bisethylcarboxymethylindocyaninfarbstoff
- (Schema 2, R1 = R2 = fusioniertes Phenyl; A = CH2 und n = 0)
- Eine Lösung aus 50 ml Dimethylformamid und Benzylbromacetat (16,0 g, 70 mmol) wurde in einer 100-ml-Dreihalsflasche gerührt. Der Feststoff Kaliumbicarbonat (7,8 g, 78 mmol) wurde hinzugefügt. Die Flasche wurde mit Argon gespült und mit einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Zu der Rührmischung wurde tropfenweise eine Lösung aus Ethanolamin (1,9 g, 31 mmol) und 4 ml Dimethylformamid über 5 Minuten hinzugefügt. Nachdem die Addition vollständig war, wurde die Mischung 1 Stunde bei 0°C gerührt. Das Eisbad wurde entfernt, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzungsmischung wurde zwischen 100 ml Methylenchlorid und 100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung partitioniert. Die Schichten wurden getrennt, und die Methylenchloridschicht wurde nochmals mit 100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die kombinierten wässrigen Phasen wurden zweimal mit 25 ml Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten Methylenchloridphasen wurden mit 100 ml Lauge gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wurde mit einem Aspirationsvakuum bei ca. 35°C entfernt, und das verbleibende Dimethylformamid wurde mit einem Vakuum bei etwa 45°C entfernt. Das Rohmaterial wurde an einer Vakuumlinie über Nacht bei Raumtemperatur belassen.
- Das Rohmaterial von oben wurde in 100 ml Methylenchlorid bei Raumtemperatur gelöst. Triphenylphosphin (8,91 g, 34 mmol) wurde hinzugefügt und unter Rühren gelöst. Eine Argonspülung wurde begonnen, und die Mischung wurde bei 0°C mit einem Eisbad gekühlt. Das N-Bromsuccinimid (6,05 g, 34 mmol) wurde portionsweise über 2 Minuten hinzugefügt. Die Mischung wurde 1,5 Stunden bei 0°C gerührt. Das Methylenchlorid wurde mit Vakuum entfernt und ergab ein lila Öl. Dieses Öl wurde mit 200 ml Ether unter konstantem Rühren per Hand trituriert. Während dieser Zeit wurde das Öl sehr dick. Die Etherlösung wurde dekantiert und das Öl wurde mit 100 ml Ether trituriert. Die Etherlösung wurde dekantiert und das Öl wurde nochmals mit einer 100-ml-Portion Ether trituriert. Der Ether wurde dekantiert, und die kombinierten Etherlösungen wurden 2 Stunden stehen gelassen, um zu erlauben, dass das Triphenylphosphinoxid kristallisiert. Die Etherlösung wurde von den Kristallen dekantiert und der Feststoff wurde mit 100 ml Ether gewaschen. Das Volumen der kombinierten Etherextrakte wurde mit Vakuum reduziert, bis ein Volumen von etwa 25 ml erhalten wurde. Dieses wurde über Nacht bei 0°C stehen gelassen. Ether (10 ml) wurde zu der kalten Mischung hinzugefügt, welche gemischt wurde, um den Feststoff zu suspendieren. Die Mischung wurde durch eine Säule mit 45 g Silicagel perkoliert und mit Ether eluiert, wobei 75-ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen, die das Produkt durch TLC enthielten, wurden gepoolt, und der Ether wurde per Vakuum entfernt. Dies ergab 10,1 g des Rohprodukts. Das Material wurde auf Silicagel mit Hexan Flashchromatographiert, wobei auf 9:1 Hexan:Ether gewechselt wurde. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden gepoolt, und die Lösungsmittel wurden per Vakuum entfernt. Dies ergab 7,4 g (57% Ausbeute) reines Produkt.
- Eine Mischung aus 10% Palladium auf Kohlenstoff (1 g) und eine Lösung des Benzylesters (10 g) in 150 ml Methanol wurden bei 25 psi für 2 Stunden hydriert. Die Mischung wurde über Celit gefiltert, und der Rückstand wurde mit Methanol gewaschen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, um ein viskoses Öl in quantitativer Ausbeute zu ergeben.
- Die Umsetzung des Bromids mit 1,1,2-Trimethyl-[1H]-benz[e]indol wurde wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt.
- BEISPIEL 6
- Bis(ethylcarboxymethyldihydroxyl)indocyaninfarbstoff
- (Schema 3)
- Die Hydroxyindolverbindung wird durch Literaturverfahren hergestellt (P. L. Southwick, J. G. Cairns, L. A. Ernst und A. S. Waggoner; One pot Fischer synthesis of (2,3,3-trimethyl-3-H-indol-5-yl)-acetic acid derivatives as intermediates for fluorescent biolabels. Org. Prep. Proced. Int. Briefs, 1988, 20(3), 279–284). Die Umsetzung von p-Carboxymethylphenylhydrazinhydrochlorid (30 mmol, 1 Äquiv.) und 1,1-Bis(hydroxymethyl)propanon (45 mmol, 1,5 Äquiv.) in Essigsäure (50 ml) bei Raumtemperatur für 30 Minuten und bei Rückfluss für 1 Stunde ergibt (3,3-Dihydroxymethyl-2-methyl-3-H-indol-5-yl)-essigsäure als Feststoffrückstand. Die Umsetzung von 3-Brompropyl-N,N-bis(carboxymethyl)amin, welches hergestellt wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit dem Intermediat Indol und anschließender Umsetzung des Indolintermediats mit Glutaconaldehyddianilmonohydrochlorid (siehe Beispiel 1), ergibt das gewünschte Produkt.
- BEISPIEL 7
- Synthese von Bis(propylcarboxymethyl)indocyanin-farbstoff
- (Schema 4)
- Das Intermediat 2-Chlor-1-formyl-hydroxymethylencyclohexan wurde hergestellt, wie in in der Literatur beschrieben (G. A. Reynolds und K. H. Drexhage, Stable heptamethine pyrylium dyes that absorb in the infrared. J. Org. Chem., 1977, 42(5), 885–888. Gleiche Volumina (jeweils 40 ml) Dimethylformamid (DMF) und Dichlormethan wurden vermischt, und die Lösung wurde auf –10°C in einem Aceton-Trockeneisbad abgekühlt. Unter Argonatmosphäre wurde Phosphoroxychlorid (40 ml) in Dichlormethan tropfenweise zu der kalten DMF-Lösung hinzugefügt. Die resultierende Lösung ließ man auf Raumtemperatur erwärmen und erhitzte sie 6 Stunden lang unter Rückfluss. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Mischung in eiskaltes Wasser gegossen und bei 4°C 12 Stunden lang gelagert. Nach der Filtration wurden etwa 8 g gelbes Pulver erhalten. Die Kondensation des cyclischen Dialdehyds mit dem Indolintermediat wird ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Weiterhin wird die Funktionalisierung des Farbstoffs mit Bis(isopropyliden)acetal-geschütztem Monosaccharid durch das Verfahren, das in der Literatur beschrieben ist (J. H. Flanagan, C. V. Owens, S. E. Romero, et al., Near infrared heavy-atom-modified fluorescent dyes for base-calling in DNA-sequencing application using temporal discrimination. Anal. Chem., 1998, 70(13), 2676–2684), ausgeführt.
- BEISPIEL 8
- Synthese von Bis(ethylcarboxymethyl)indocyaninfarbstoff
- (Schema 5)
- Diese Farbstoffe werden, wie in Experiment 7 beschrieben, hergestellt. Diese Farbstoffe absorbieren im Infrarotbereich. Das typische Beispiel, das in Schema 5 gezeigt ist, hat ein geschätztes Absorptionsmaximum bei 1036 nm.
- BEISPIEL 9
- Synthese von Peptiden
- Das hierunter beschriebene Verfahren ist für die Synthese von Octreotat. Andere Peptide wurden in einigen Fällen durch ein ähnliches Verfahren mit geringfügigen Modifikationen hergestellt. Diese Peptide wurden verwendet, um die Einfachheit der Verwendung der Farbstoffe dieser Erfindung zur Herstellung von Biokonjugaten zu illustrieren.
- Das Octapeptid wurde durch eine automatisierte Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung eines kommerziellen Peptidsynthesizers von Applied Biosystems (Modell 432A SYNERGY Peptide Synthesizer) hergestellt. Die erste Peptid-Cartridge enthielt Wang-Harz, vorbeladen mit Fmoc-Thr auf einer 25-μmol-Skala. Die anschließenden Cartridges enthielten Fmoc-geschützte Aminosäuren mit Seitenkettenschutzgruppen für die folgenden Aminosäuren: Cys(Acm), Thr(t-Bu), Lys(Boc), Trp(Boc) und Tyr(t-Bu). Die Aminosäure-Cartridges wurden auf dem Peptidsynthesizer angeordnet, und das Produkt wurde von der C-terminalen Position zur N-terminalen Position synthetisiert. Die Kopplungsumsetzung wurde mit 75 μmol der geschützten Aminosäuren in der Gegenwart von 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluor-phosphat (HBTU)/N-hydroxybenzotriazol (HOBt) ausgeführt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde mit 20% Piperidin in Dimethylformamid entfernt. Nachdem die Synthese abgeschlossen war, wurde die Thiolgruppe mit Thalliumtrifluoracetat cyclisiert, und das Produkt wurde von dem Feststoffträger mit einer Spaltmischung, die Trifluoressigsäure (85%): Wasser (5%): Phenol (5%): Thioanisol (5%) enthielt, für 6 Stunden abgespalten. Das Peptid wurde mit t-Butylmethylether präzipitiert und mit einer Mischung aus Wasser:Acetonitril (2:3) lyophilisiert. Das Peptid wurde durch HPLC aufgereinigt und mit LC/MS analysiert. Die Aminosäuresequenz von Octreotat ist: D-Phe-Cys'-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys'-Thr, wobei Cys' die Gegenwart einer intramolekularen Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinaminosäuren anzeigt.
- Octreotid wurde durch das gleiche Verfahren hergestellt: D-Phe-Cys'-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys'-Thr-OH, wobei Cys' die Gegenwart einer intramolekularen Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinaminosäuren darstellt.
- Bombesinanaloga wurden durch das gleiche Verfahren hergestellt, außer dass die Cyclisierung mit Thalliumtrifluoracetat nicht erforderlich war. Seitenkettenentschützung und Spaltung von dem Harz wurde mit jeweils 50 μl Ethandithiol, Thioanisol und Wasser und 850 μl Trifluoressigsäure ausgeführt. Zwei Analoga wurden hergestellt: Gly-Ser-Gly-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 und Gly-Asp-Gly-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2.
- Cholecystokininoctapeptidanaloga wurden hergestellt, wie für Octreotat beschrieben, ohne den Cyclisierungsschritt. Drei Analoga wurden hergestellt: Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met- Asp-Phe-NH2; Asp-Tyr-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2; D-Asp-Tyr-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2.
- Neurotensinanalogon wurde hergestellt, wie für Octreotat beschrieben, ohne den Cyclisierungsschritt: D-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu.
- BEISPIEL 10
- Synthese von Peptid-Farbstoffkonjugaten
- Das hierunter beschriebene Verfahren ist für die Synthese von Octreotatkonjugaten, aber ein ähnliches Verfahren wird für die Synthese von anderen Peptid-Farbstoffkonjugaten verwendet.
- Das Octreotat wurde hergestellt, wie in Beispiel 6 beschrieben, aber das Peptid wurde nicht von dem Feststoffträger abgespalten, und die N-terminale Fmoc-Gruppe des Phe wurde erhalten. Die Thiolgruppe wurde mit Thalliumtrifluoracetat cyclisiert, und das Phe wurde entschützt, um die freie Aminogruppe freizulegen. Bisethylcarboxymethylindocyaninfarbstoff (53 mg, 75 μmol) wurde zu einem Aktivierungsreagens hinzugefügt, das eine 0,2-M-Lösung von HBTU/HOBt in DMSO (375 μl) und eine 0,2-M-Lösung von Diisopropylethylamin in DMSO (375 μl) enthielt. Die Aktivierung war in etwa 30 Minuten vollständig, und das harzgebundene Peptid (25 μmol) wurde zu dem Farbstoff hinzugefügt. Die Kopplungsumsetzung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden ausgeführt. Die Mischung wurde gefiltert, und der Feststoffrückstand wurde mit DMF, Acetonitril und THF gewaschen. Nach dem Trocknen des grünen Rückstands wurde das Peptid von dem Harz gespalten, und die Seitenkettenschutzgruppen wurden mit einer Mischung aus 85% Trifluoressigsäure, 2,5% Wasser, 2,5% Thioanisol und 2,5% Phenol entfernt. Das Harz wurde abfiltriert, und kalter t-Butylmethylether (MTBE) wurde verwendet, um das Farbstoffpeptidkonjugat zu präzipitieren, welches in einer Mischung aus Acetonitril:Wasser (2:3) gelöst und lyophilisiert wurde. Das Produkt wurde durch HPLC aufgereinigt, um den Monooctreotat-Bisethylcarboxymethylindocyanin-farbstoff (Cytat 1, 80%) und den Bisoctreotat-Bisethylcarboxymethylindocyaninfarbstofff (Cytat 2, 20%) zu erhalten. Das Monooctreotatkonjugat kann fast ausschließlich (> 95%) über das Biskonjugat durch Reduzieren der Reaktionszeit auf 2 Stunden erhalten werden. Jedoch führt dies ebenso zu einer unvollständigen Umsetzung, und das freie Octreotat muss gründlich von dem Farbstoffkonjugat getrennt werden, um eine Sättigung der Rezeptoren durch das nicht farbstoffkonjugierte Peptid zu vermeiden.
- Der Octreotat-Bispentylcarboxymethylindocyanin-farbstoff wurde hergestellt, wie oben beschrieben, mit einigen Modifikationen. Bispentylcarboxymethylindocyaninfarbstoff (60 mg, 75 μmol) wurde zu einem Aktivierungsreagens, bestehend aus einer 0,2-M-Lösung aus HBTU/HOBt in DMSO (400 μl) und einer 0,2-M-Lösung aus Diisopropylethylamin in DMSO (400 μl), gegeben. Die Aktivierung war in etwa 30 Minuten abgeschlossen, und das harzgebundene Peptid (25 μmol) wurde zu dem Farbstoff hinzugefügt. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang ausgeführt. Die Mischung wurde filtriert, und der Feststoffrückstand wurde mit DMF, Acetonitril und THF gewaschen. Nach dem Trocknen des grünen Rückstands wurde das Peptid von dem Harz abgespalten, und die Seitenkettenschutzgruppen wurden mit einer Mischung aus 85% Trifluoressigsäure, 2,5% Wasser, 2,5% Thioanisol und 2,5% Phenol entfernt. Das Harz wurde abfiltriert und kalter t-Butylmethylether (MTBE) wurde verwendet, um das Farbstoff-Peptidkonjugat zu präzipitieren, welches in einer Mischung aus Acetonitril:Wasser (2:3) gelöst und lyophilisiert wurde. Das Produkt wurde durch HPLC aufgereinigt, um Octreotat-1,1,2-trimethyl-[1H]-benz[e]indolpropansäurekonjugat (10%), Monooctreotat-Bispentylcarboxymethylindocyaninfarbstoff (Cytat 3, 60%) und Bisoctreotat-Bispentylcarboxymethylindocyaninfarbstoff (Cytat 4, 30%) zu erhalten.
- Während die Erfindung mit Bezugnahme auf die Details von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurde, ist zu verstehen, dass die Offenbarung eher als illustrativ und nicht in einem limitierenden Sinn auszulegen ist, da zugestanden werden wird, dass Fachleuten Modifikationen leicht einfallen können, diese aber sich im Geist der Erfindung und in dem Umfang der angehängten Ansprüche befinden.
- SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (2)
- Ein Verfahren zum Vermeiden von Fluoreszenzquenchen in vivo oder in vitro durch Hinzufügen von einem bis zu fünfzig Prozent biokompatibler organischer Lösungsmittel zu diagnostischen oder therapeutischen Formulierungen oder Zusammensetzungen, umfassend einen Cyaninfarbstoff der allgemeinen Formel:wobei a1 und b1 von 0 bis 5 variieren; W1 und X1 gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus -CR10R11, -O-, -NR12, -S- und -Se; Q1 eine Einfachbindung ist oder ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus -O-, -S-, -Se- und -NR13; Y1 und Z1 gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus -(CH2)c-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)d-CH2-CO2H, -(CH2)e-NH2, -CH2-(CH2-O-CH2)f-CH2-NH2, -(CH2)g-N(R14)-(CH2)h-CO2H und -(CH2)i-N(R15)-CH2-(CH2-O-CH2)j-CH2-CO2H; R1 und [TEXT FEHLT] R15 gleich oder unterschiedlich sein können und [TEXT FEHLT] werden aus der Gruppe, bestehend aus -Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, C1-C10-Alkoxyl, C1-C10-Polyalkoxyalkyl, -CH2(CH2-O-CH2)c-CH2-OH, C1-C20-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Polyhydroxyaryl, -(CH2)d-CO2H, -CH2-(CH2-O-CH2)e-CH2-CO2H, -(CH2)f-NH2 und -CH2-(CH2-O-CH2)g-CH2-NH2; c, e, g, h und i von 1 bis 10 variieren; d, f und j von 1 bis 100 variieren; und R2 bis R9 gleich oder unterschiedlich sein können und ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C1-C10-Alkyl, C1-C10-Aryl, Hydroxyl, C1-C10-Polyhydroxyalkyl, C1-C10-Alkoxyl, Amino, C1-C10-Aminoalkyl, Cyano, Nitro und Halogen.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Farbstoffmolekül in einem Medium gelöst wird, das von einem bis zu fünfzig Prozent Dimethylsulfoxid (DMSO) umfaßt.
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