JP2003052362A - 血管内皮細胞増殖促進剤及び血管内皮細胞培養用組成物並びに創傷治癒剤 - Google Patents
血管内皮細胞増殖促進剤及び血管内皮細胞培養用組成物並びに創傷治癒剤Info
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- JP2003052362A JP2003052362A JP2001244262A JP2001244262A JP2003052362A JP 2003052362 A JP2003052362 A JP 2003052362A JP 2001244262 A JP2001244262 A JP 2001244262A JP 2001244262 A JP2001244262 A JP 2001244262A JP 2003052362 A JP2003052362 A JP 2003052362A
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- vascular endothelial
- endothelial cell
- cell growth
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規かつ効果の高い血管内皮細胞増殖促進剤
を提供する。 【解決手段】 本発明に係る血管内皮細胞増殖促進剤
は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステルであっ
て、ミコール酸、特に炭素数５０以下の低級ミコール
酸、さらに望ましくは炭素数３０〜４０のミコール酸
と、グルコース、マンノースなどの単糖類又はトレハロ
ースなど二糖類との糖エステルからなる。上記糖エステ
ルは、例えば、ロドコッカス属に属する菌、特にロドコ
ッカス菌を培養することによって得ることができ、培養
された菌体中から抽出される。こうして得られた血管内
皮細胞増殖促進剤は、細胞増殖因子として用いられ、細
胞培養用組成物として供される。また、火傷や創傷など
によって損傷されたヒトや動物の皮膚に適用される損傷
治癒剤として用いられる。
を提供する。 【解決手段】 本発明に係る血管内皮細胞増殖促進剤
は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステルであっ
て、ミコール酸、特に炭素数５０以下の低級ミコール
酸、さらに望ましくは炭素数３０〜４０のミコール酸
と、グルコース、マンノースなどの単糖類又はトレハロ
ースなど二糖類との糖エステルからなる。上記糖エステ
ルは、例えば、ロドコッカス属に属する菌、特にロドコ
ッカス菌を培養することによって得ることができ、培養
された菌体中から抽出される。こうして得られた血管内
皮細胞増殖促進剤は、細胞増殖因子として用いられ、細
胞培養用組成物として供される。また、火傷や創傷など
によって損傷されたヒトや動物の皮膚に適用される損傷
治癒剤として用いられる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は血管内皮細胞増殖促
進剤及び血管内皮細胞培養用組成物並びに創傷治癒剤に
関する。具体的には、主としてヒト皮膚の創傷治癒を促
進に寄与すると考えられている血管内皮細胞の増殖を促
す新規な血管内皮細胞増殖促進剤に関する。
進剤及び血管内皮細胞培養用組成物並びに創傷治癒剤に
関する。具体的には、主としてヒト皮膚の創傷治癒を促
進に寄与すると考えられている血管内皮細胞の増殖を促
す新規な血管内皮細胞増殖促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】人の血管壁は年齢と共に障害を受け、そ
の障害が大きくなると、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中な
どの疾患が現われる。血管内皮細胞は、血管の内腔を覆
う単層を形成する細胞であり、この細胞の損傷、機能低
下がこれら血管に関わる疾患に関与していると考えられ
る。従って、損傷を受け、本来の機能を喪失した血管内
皮細胞の再生や機能回復を促進する血管内皮細胞増殖促
進剤の開発が望まれている。さらに、火傷や創傷の治療
には、血管の新生が必要であり、このような観点からも
血管内皮細胞増殖促進剤の開発が望まれている。
の障害が大きくなると、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中な
どの疾患が現われる。血管内皮細胞は、血管の内腔を覆
う単層を形成する細胞であり、この細胞の損傷、機能低
下がこれら血管に関わる疾患に関与していると考えられ
る。従って、損傷を受け、本来の機能を喪失した血管内
皮細胞の再生や機能回復を促進する血管内皮細胞増殖促
進剤の開発が望まれている。さらに、火傷や創傷の治療
には、血管の新生が必要であり、このような観点からも
血管内皮細胞増殖促進剤の開発が望まれている。
【０００３】このような背景から、血管内皮細胞増殖促
進剤の研究が行われており、例えば、ＦＧＦ（fibrobla
st growth factor）、ＶＰＦ／ＶＥＦＧ（vascular per
meability factor / vascular endothelial growth fac
tor）、ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）
などが血管内皮細胞増殖促進活性を有することが報告さ
れている（Gospodarowicz D. J. Invest. Dermatol. 93
(2 Suppl) 39S-47S,1989. Burke P.A., Lehmann-Bruin
sma K., Powell J.S., Biochem. Biophys. Res. Commu
m. 207 (1) 348-354, 1995, Battegay E.J., Rupp J.,
Iruela-Arispe L., Sage E.H., Pech M., J. Cell Bio
l., 125 (4) 917-928, 1994.）。
進剤の研究が行われており、例えば、ＦＧＦ（fibrobla
st growth factor）、ＶＰＦ／ＶＥＦＧ（vascular per
meability factor / vascular endothelial growth fac
tor）、ＰＤＧＦ（platelet-derived growth factor）
などが血管内皮細胞増殖促進活性を有することが報告さ
れている（Gospodarowicz D. J. Invest. Dermatol. 93
(2 Suppl) 39S-47S,1989. Burke P.A., Lehmann-Bruin
sma K., Powell J.S., Biochem. Biophys. Res. Commu
m. 207 (1) 348-354, 1995, Battegay E.J., Rupp J.,
Iruela-Arispe L., Sage E.H., Pech M., J. Cell Bio
l., 125 (4) 917-928, 1994.）。
【０００４】また、血管内皮細胞を培養する場合、ＭＥ
Ｍ培地（Minimun Essential Medium）やＤ−ＭＥＭ培地
（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等の基礎培地
に、血清及び上記のＦＧＦ、ＶＰＦ／ＶＥＦＧ、ハイド
ロコーチゾン、ヘパリン、ｃＡＭＰなどの各種細胞増殖
（成長）因子を添加した培地が用いられる。
Ｍ培地（Minimun Essential Medium）やＤ−ＭＥＭ培地
（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等の基礎培地
に、血清及び上記のＦＧＦ、ＶＰＦ／ＶＥＦＧ、ハイド
ロコーチゾン、ヘパリン、ｃＡＭＰなどの各種細胞増殖
（成長）因子を添加した培地が用いられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記因
子を入手するにあたっては、厳密な細胞培養条件の他、
高度な遺伝子操作技術や精製技術などを必要とし、さら
に簡便な入手のための研究が続けられてはいるものの、
未だ十分なものではなかった。従って、入手容易な新規
かつ効果的な血管内皮細胞増殖因子が望まれているとこ
ろである。
子を入手するにあたっては、厳密な細胞培養条件の他、
高度な遺伝子操作技術や精製技術などを必要とし、さら
に簡便な入手のための研究が続けられてはいるものの、
未だ十分なものではなかった。従って、入手容易な新規
かつ効果的な血管内皮細胞増殖因子が望まれているとこ
ろである。
【０００６】また、これらの培地においては、培養細胞
種に応じて上記因子を２種３種と適宜組み合わて用いる
必要があった。このように、従来の細胞培養用培地では
その調整が非常に面倒なものであり、必須の構成成分で
あるＦＧＦやＶＰＦ／ＶＥＦＧ、ＥＧＦなどの各種因子
の入手が困難なこともあって高価なものとなっていた。
種に応じて上記因子を２種３種と適宜組み合わて用いる
必要があった。このように、従来の細胞培養用培地では
その調整が非常に面倒なものであり、必須の構成成分で
あるＦＧＦやＶＰＦ／ＶＥＦＧ、ＥＧＦなどの各種因子
の入手が困難なこともあって高価なものとなっていた。
【０００７】一方、本発明者らは、ロドコッカス属に属
する菌から抽出分離された糖エステル、特にミコール酸
との糖エステルが皮膚保湿効果に有効であることを見い
出し、特許出願（特開平９−２５５５４９号公報参照）
しているが、この糖エステルが血管内皮細胞増殖促進剤
を有することについては未だ知られてはいなかった。
する菌から抽出分離された糖エステル、特にミコール酸
との糖エステルが皮膚保湿効果に有効であることを見い
出し、特許出願（特開平９−２５５５４９号公報参照）
しているが、この糖エステルが血管内皮細胞増殖促進剤
を有することについては未だ知られてはいなかった。
【０００８】そこで、本発明者らは上記目的を達成すべ
く鋭意研究を重ねた結果、上記単糖類又は二糖類と脂肪
酸との糖エステルが優れた血管内皮細胞増殖促進作用を
有すると共に、培地中当該糖エステルを添加することに
より血管内皮細胞の培養を行えることを見い出し、本発
明を完成するに至った。
く鋭意研究を重ねた結果、上記単糖類又は二糖類と脂肪
酸との糖エステルが優れた血管内皮細胞増殖促進作用を
有すると共に、培地中当該糖エステルを添加することに
より血管内皮細胞の培養を行えることを見い出し、本発
明を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明に係る血管内皮細
胞増殖促進剤は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エス
テルからなることを特徴としている。
胞増殖促進剤は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エス
テルからなることを特徴としている。
【００１０】本発明においては、前記脂肪酸がミコール
酸である糖エステルが好ましく、特に炭素数が３０〜４
０である脂肪酸が望ましく用いられる。
酸である糖エステルが好ましく、特に炭素数が３０〜４
０である脂肪酸が望ましく用いられる。
【００１１】また、本発明に係る血管内皮細胞増殖促進
剤は、上記の糖エステルを含む抗酸菌より抽出された菌
体抽出物からなることを特徴としている。
剤は、上記の糖エステルを含む抗酸菌より抽出された菌
体抽出物からなることを特徴としている。
【００１２】さらに、本発明に係る血管内皮細胞培養用
組成物及び創傷治癒剤はそれぞれ、上記本発明に係る血
管内皮細胞増殖促進剤を含むことを特徴としている。
組成物及び創傷治癒剤はそれぞれ、上記本発明に係る血
管内皮細胞増殖促進剤を含むことを特徴としている。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明に係る血管内皮細胞増殖促
進剤は、単糖類若しくは２糖類との糖エステルからなる
ことを特徴としている。当該糖エステルは、脂肪酸のカ
ルボン酸残基と糖のアルコール残基とがエステル結合し
たものであって、脂肪酸１分子あるいは２分子以上の脂
肪酸が糖にエステル結合したものである。
進剤は、単糖類若しくは２糖類との糖エステルからなる
ことを特徴としている。当該糖エステルは、脂肪酸のカ
ルボン酸残基と糖のアルコール残基とがエステル結合し
たものであって、脂肪酸１分子あるいは２分子以上の脂
肪酸が糖にエステル結合したものである。
【００１４】上記脂肪酸としては、主として、例えばコ
リネバクテリウム属、ノカルジア属又はミコバクテリウ
ム属、ロドコッカス属に代表される各種の抗酸菌が産生
する脂肪酸が挙げられ、特に、その中でも、次の式１で
示されるミコール酸が好適である。
リネバクテリウム属、ノカルジア属又はミコバクテリウ
ム属、ロドコッカス属に代表される各種の抗酸菌が産生
する脂肪酸が挙げられ、特に、その中でも、次の式１で
示されるミコール酸が好適である。
【００１５】
【式１】
【００１６】ここにおいて、式１中、ＲｍおよびＲｎは
それぞれアルキル残基を示すが、ＲｍおよびＲｎは、い
ずれも直鎖状又は分岐状のいずれであっても良い。また
Ｒｍ、Ｒｎはそれぞれ不飽和結合、望ましくは２重結合
を有しているものがよく、通常のアルキル残基よりも広
い概念である。
それぞれアルキル残基を示すが、ＲｍおよびＲｎは、い
ずれも直鎖状又は分岐状のいずれであっても良い。また
Ｒｍ、Ｒｎはそれぞれ不飽和結合、望ましくは２重結合
を有しているものがよく、通常のアルキル残基よりも広
い概念である。
【００１７】また、本発明におけるミコール酸はその総
炭素数が３０〜４０であるものが好ましく、総炭素数が
５０を越えると毒性が増強される恐れがある。
炭素数が３０〜４０であるものが好ましく、総炭素数が
５０を越えると毒性が増強される恐れがある。
【００１８】また、当該ミコール酸とエステル結合する
糖としては、グルコース、マンノース、フルクトースな
どの単糖類、あるいは、スクロース、トレハロースをは
じめとする各種の二糖類が挙げられる。これらの糖は、
アルドース、ケトースのいずれでもよく、また、鎖状あ
るいは環状構造のいずれの構造をしていてもよい。従っ
て、本発明に係る糖エステルとしては、例えば、トレハ
ロース−６，６′−ジミコレート、トレハロース−６−
モノミコレート、グルコース−６−モノミコレート、マ
ンノース−６−ミコレート、フルクトース−６−ミコレ
ートが挙げられる。
糖としては、グルコース、マンノース、フルクトースな
どの単糖類、あるいは、スクロース、トレハロースをは
じめとする各種の二糖類が挙げられる。これらの糖は、
アルドース、ケトースのいずれでもよく、また、鎖状あ
るいは環状構造のいずれの構造をしていてもよい。従っ
て、本発明に係る糖エステルとしては、例えば、トレハ
ロース−６，６′−ジミコレート、トレハロース−６−
モノミコレート、グルコース−６−モノミコレート、マ
ンノース−６−ミコレート、フルクトース−６−ミコレ
ートが挙げられる。
【００１９】本発明に係る糖エステル、主としてミコー
ル酸糖エステルは上記抗酸菌、例えば、ロドコッカス属
に属する菌、特にロドコッカス菌を培養することによっ
て得ることができる。当該化合物は主として菌体中に生
成されるので、培養された菌体から抽出することによっ
て得ることができる。
ル酸糖エステルは上記抗酸菌、例えば、ロドコッカス属
に属する菌、特にロドコッカス菌を培養することによっ
て得ることができる。当該化合物は主として菌体中に生
成されるので、培養された菌体から抽出することによっ
て得ることができる。
【００２０】その際の培養方法としては、従来から用い
られている公知の合成培地及び天然培地を用いることが
でき、特にロドコッカス属に属する微生物の培養に用い
られる培地であれば、すべての培地が使用できる。
られている公知の合成培地及び天然培地を用いることが
でき、特にロドコッカス属に属する微生物の培養に用い
られる培地であれば、すべての培地が使用できる。
【００２１】例えば生育炭素源としては、グルコース、
フルクトース、マンノースなどの単糖類を用いることが
できる。また窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝
酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィーブリカー等の有機窒素化合物が利用できる。また無
機塩としてナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、
マグネシウム、マンガン、リン酸等を、さらに成長因子
として、各種ビタミン、アミノ酸類又はそれらを豊富に
含む酵母エキスを適宜加えることにしてもよい。
フルクトース、マンノースなどの単糖類を用いることが
できる。また窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝
酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィーブリカー等の有機窒素化合物が利用できる。また無
機塩としてナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、
マグネシウム、マンガン、リン酸等を、さらに成長因子
として、各種ビタミン、アミノ酸類又はそれらを豊富に
含む酵母エキスを適宜加えることにしてもよい。
【００２２】培地のｐＨは５〜９、特に７〜７.５が至
適範囲であり、培養温度は１０〜４０℃、特に３０〜４
０℃が適している。培養は液体培養又は固体培養で好気
的条件下に行うことが好ましい。培養時間は、通常３〜
１４日程度とするのが適当である。
適範囲であり、培養温度は１０〜４０℃、特に３０〜４
０℃が適している。培養は液体培養又は固体培養で好気
的条件下に行うことが好ましい。培養時間は、通常３〜
１４日程度とするのが適当である。
【００２３】こうして得られる菌体からミコール酸糖エ
ステルを得るには、菌体成分を採取する通常の方法を用
いればよい。例えば、培養液を遠心分離して集菌したの
ち、有機溶媒を加えて溶媒抽出する。例えば、用いられ
る有機溶媒としては、クロロホルムとメタノールの混液
や、クロロホルムとメタノール・アセトンの混液など、
クロロホルムなどの疎水性溶媒やメタノールやアセトン
などの親水性溶媒とを混合したもの、あるいはこれらの
疎水性溶媒や親水性溶媒を適宜組み合わせて用いるとよ
い。
ステルを得るには、菌体成分を採取する通常の方法を用
いればよい。例えば、培養液を遠心分離して集菌したの
ち、有機溶媒を加えて溶媒抽出する。例えば、用いられ
る有機溶媒としては、クロロホルムとメタノールの混液
や、クロロホルムとメタノール・アセトンの混液など、
クロロホルムなどの疎水性溶媒やメタノールやアセトン
などの親水性溶媒とを混合したもの、あるいはこれらの
疎水性溶媒や親水性溶媒を適宜組み合わせて用いるとよ
い。
【００２４】次に抽出した菌体成分をシリカゲルやモレ
キュラシーブなどに吸着させ、その後、先に述べたよう
な溶媒で溶出して、さらに精製を加える。そして、溶媒
に対する溶解度差やイオン結合力の差などを利用し、そ
れぞれ単独の方法で又は２つ以上の方法を適当に組み合
わせて、さらには同様の操作を数回繰り返すことによ
り、ミコール酸糖エステルを、炭素数が異なるミコール
酸糖エステルの混合物ではあるが、ほぼ純粋な物質とし
て分離精製できる。
キュラシーブなどに吸着させ、その後、先に述べたよう
な溶媒で溶出して、さらに精製を加える。そして、溶媒
に対する溶解度差やイオン結合力の差などを利用し、そ
れぞれ単独の方法で又は２つ以上の方法を適当に組み合
わせて、さらには同様の操作を数回繰り返すことによ
り、ミコール酸糖エステルを、炭素数が異なるミコール
酸糖エステルの混合物ではあるが、ほぼ純粋な物質とし
て分離精製できる。
【００２５】こうして精製されたミコール酸糖エステル
は、通常、エタノールなどの適当な溶媒に溶解したり適
当な賦形剤や基剤中に混合して、本発明に係る血管内皮
細胞増殖促進剤として用いられる。また、溶媒などに溶
解することなくそのまま血管内皮細胞増殖促進剤として
も用いることもできる。例えば、得られた血管内皮細胞
増殖促進剤を、従来から公知である種々の基本培地、例
えば、上記のＭＥＭ培地（Minimun Essential Medium）
やＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Eagle Mediu
m）、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＭＥ培地（Basal Medium Ea
gle）等に血清と併用することにより、ヒトや動物の血
管内皮細胞を培養できる。つまり、ＥＦＧやＦＧＦ、Ｖ
ＰＦ／ＶＥＦＧ、ハイドロコーチゾン、ヘパリン、ｃＡ
ＭＰなどに取って代わるものとして、血管内皮細胞の培
養に必要な細胞増殖因子（cell growth factor）として
利用できる。この場合、ミコール酸糖エステルとして、
ミコール酸糖エステルの構成によっても異なるが、使用
培地中に概ね０．０５〜５００μｇ／mlで使用される。
もちろん、本発明の目的を達成する限りにおいて、この
範囲に限定されるものではない。また、上記の基本培地
から作成された平板培地などの表面に、適当な溶媒で溶
解された血管内皮細胞増殖促進剤を塗布して用いること
もできる。
は、通常、エタノールなどの適当な溶媒に溶解したり適
当な賦形剤や基剤中に混合して、本発明に係る血管内皮
細胞増殖促進剤として用いられる。また、溶媒などに溶
解することなくそのまま血管内皮細胞増殖促進剤として
も用いることもできる。例えば、得られた血管内皮細胞
増殖促進剤を、従来から公知である種々の基本培地、例
えば、上記のＭＥＭ培地（Minimun Essential Medium）
やＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Eagle Mediu
m）、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＭＥ培地（Basal Medium Ea
gle）等に血清と併用することにより、ヒトや動物の血
管内皮細胞を培養できる。つまり、ＥＦＧやＦＧＦ、Ｖ
ＰＦ／ＶＥＦＧ、ハイドロコーチゾン、ヘパリン、ｃＡ
ＭＰなどに取って代わるものとして、血管内皮細胞の培
養に必要な細胞増殖因子（cell growth factor）として
利用できる。この場合、ミコール酸糖エステルとして、
ミコール酸糖エステルの構成によっても異なるが、使用
培地中に概ね０．０５〜５００μｇ／mlで使用される。
もちろん、本発明の目的を達成する限りにおいて、この
範囲に限定されるものではない。また、上記の基本培地
から作成された平板培地などの表面に、適当な溶媒で溶
解された血管内皮細胞増殖促進剤を塗布して用いること
もできる。
【００２６】さらに、当該血管内皮細胞増殖促進剤は、
創傷治癒剤として火傷や創傷を負ったヒトや動物の皮膚
に適用することによって、創傷部位の毛細血管の再生を
促し、火傷や創傷の治癒が促進され、早期の回復を望む
ことができる。この創傷治癒剤は、外用剤として皮膚に
適用可能な剤型として適用され、その剤型は特に限定さ
れるものではない。例えば、外用クリーム剤や外用液
剤、ローション剤、パップ剤などとして適用できる。こ
の場合も、上記添加量を目安にして使用されるが、適宜
増減されるものである。
創傷治癒剤として火傷や創傷を負ったヒトや動物の皮膚
に適用することによって、創傷部位の毛細血管の再生を
促し、火傷や創傷の治癒が促進され、早期の回復を望む
ことができる。この創傷治癒剤は、外用剤として皮膚に
適用可能な剤型として適用され、その剤型は特に限定さ
れるものではない。例えば、外用クリーム剤や外用液
剤、ローション剤、パップ剤などとして適用できる。こ
の場合も、上記添加量を目安にして使用されるが、適宜
増減されるものである。
【００２７】
【実施例】次に、以下の実施例に基づいて本発明につい
て詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定
されるものでないのは言うまでもない。
て詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定
されるものでないのは言うまでもない。
【００２８】（実施例１）
〔菌体の培養〕ロドコッカス菌(Rhodococcus sp.4306)
を１白金耳採り、ｐＨ７.５に調整した以下に示す組成
の培養用ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地２００ｍｌに植菌し、３
７℃で５〜７日間振とう培養法によって前培養した。こ
の前培養菌液１０〜５０ｍl(前培養菌液の菌体濃度によ
り液量を適宜調整する。)を同じ組成のＰＹＧ（Ｍ、
Ｆ）培地１.５lに加え、３７℃で５〜７日間本培養し
た。 〔ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地の組成〕 ・ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製） ０.５w/w％ ・ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ製） ０.５w/w％ ・糖(Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製) １w/w％ ただし、糖にはＤ（＋）−グルコース以外にも 、Ｄ
（＋）−マンノース、Ｄ（−）−フルクトースを用いる
こともできる。
を１白金耳採り、ｐＨ７.５に調整した以下に示す組成
の培養用ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地２００ｍｌに植菌し、３
７℃で５〜７日間振とう培養法によって前培養した。こ
の前培養菌液１０〜５０ｍl(前培養菌液の菌体濃度によ
り液量を適宜調整する。)を同じ組成のＰＹＧ（Ｍ、
Ｆ）培地１.５lに加え、３７℃で５〜７日間本培養し
た。 〔ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地の組成〕 ・ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製） ０.５w/w％ ・ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ製） ０.５w/w％ ・糖(Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製) １w/w％ ただし、糖にはＤ（＋）−グルコース以外にも 、Ｄ
（＋）−マンノース、Ｄ（−）−フルクトースを用いる
こともできる。
【００２９】〔ミコール酸糖エステルの抽出精製〕上記
で得られた培養菌液を７５００ｒｐｍで３０分間遠心分
離し、菌体を集菌した。次に集菌された菌体を、クロロ
ホルムとメタノールの混液(容量比で２：１)を加え、超
音波ホモジナイザーにて１５分間超音波処理を行った。
この処理した溶液を分液ロートに移し、水を加えて２層
に分離させ有機溶媒層を分取する。そして、分取した溶
媒をエバポレーターにて濃縮し、脂質成分を得た。
で得られた培養菌液を７５００ｒｐｍで３０分間遠心分
離し、菌体を集菌した。次に集菌された菌体を、クロロ
ホルムとメタノールの混液(容量比で２：１)を加え、超
音波ホモジナイザーにて１５分間超音波処理を行った。
この処理した溶液を分液ロートに移し、水を加えて２層
に分離させ有機溶媒層を分取する。そして、分取した溶
媒をエバポレーターにて濃縮し、脂質成分を得た。
【００３０】さらに、この脂質成分を薄層クロマトグラ
フィーにより展開して分離精製した。つまり、脂質成分
を少量のクロロホルムなどの適当な溶媒に溶かし、シリ
カゲルからなる分取用薄層板(UNIPLATE SILICA GEL G M
ERCK社製)上にスポットした。そして、クロロホルムと
メタノール、アセトン、酢酸混液（容量比９０：１０：
６：１）にて展開した。次に、この薄層板上で分離され
た各脂質部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルをそれ
ぞれガラスカラムに充填して、クロロホルムとメタノー
ルの混液で溶出し、各脂質が薄層クロマトグラム上で、
単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に、エバポ
レータで溶媒を留去して、トレハロース−６，６′−ジ
ミコレート、トレハロース−６−モノミコレート、グル
コース−６−モノミコレート、マンノース−６−ミコレ
ート、フルクトース−６−ミコレートを得た。これらの
詳細な構造については、上記特開平９−２５５５４９号
公報を参照されたい。
フィーにより展開して分離精製した。つまり、脂質成分
を少量のクロロホルムなどの適当な溶媒に溶かし、シリ
カゲルからなる分取用薄層板(UNIPLATE SILICA GEL G M
ERCK社製)上にスポットした。そして、クロロホルムと
メタノール、アセトン、酢酸混液（容量比９０：１０：
６：１）にて展開した。次に、この薄層板上で分離され
た各脂質部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルをそれ
ぞれガラスカラムに充填して、クロロホルムとメタノー
ルの混液で溶出し、各脂質が薄層クロマトグラム上で、
単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に、エバポ
レータで溶媒を留去して、トレハロース−６，６′−ジ
ミコレート、トレハロース−６−モノミコレート、グル
コース−６−モノミコレート、マンノース−６−ミコレ
ート、フルクトース−６−ミコレートを得た。これらの
詳細な構造については、上記特開平９−２５５５４９号
公報を参照されたい。
【００３１】次にこうして得られたミコール酸糖エステ
ルのうち、トレハロースー６，６´−ジミコレート（以
下ＴＤＭと称する。）について、ヒト血管内皮細胞を用
いた細胞増殖試験を行った。
ルのうち、トレハロースー６，６´−ジミコレート（以
下ＴＤＭと称する。）について、ヒト血管内皮細胞を用
いた細胞増殖試験を行った。
【００３２】〔正常ヒト微小血管内皮細胞増殖能〕正常
ヒト微小血管内皮細胞（倉敷紡績製）を、HuMedia−Ｍ
ｖＧ培地（倉敷紡績製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2
存在下で５〜７日間培養し、サブコンフルエントになっ
たところで細胞増殖試験に用いた。細胞増殖試験は、９
６wellマイクロプレートに、１×１０3cells／wellの密
度で正常ヒト微小血管内皮細胞を播種し、HuMedia−Ｅ
Ｂ２培地（倉敷紡績製）に抗菌剤（ゲンタマイシン５０
μｇ／ml及びアンフォテリシンＢ５０nｇ／ml）、５％
ＦＢＳを添加した培地に表１に示す量のＴＤＭ（１well
当たり）を添加して、７日間培養した。そして、培養開
始３日経過後、５日経過後及び７日経過後にcell中の細
胞数を計測した。細胞数は、cell counting kit（同仁
化学製）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度をマイク
ロプレートリーダーで測定し、予め作成したおいた検量
線によって求めた。その結果を表１に示す。なお、表１
には、ＴＤＭを加えない培地（コントロール）を１００
とした場合における増殖率で示した。
ヒト微小血管内皮細胞（倉敷紡績製）を、HuMedia−Ｍ
ｖＧ培地（倉敷紡績製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2
存在下で５〜７日間培養し、サブコンフルエントになっ
たところで細胞増殖試験に用いた。細胞増殖試験は、９
６wellマイクロプレートに、１×１０3cells／wellの密
度で正常ヒト微小血管内皮細胞を播種し、HuMedia−Ｅ
Ｂ２培地（倉敷紡績製）に抗菌剤（ゲンタマイシン５０
μｇ／ml及びアンフォテリシンＢ５０nｇ／ml）、５％
ＦＢＳを添加した培地に表１に示す量のＴＤＭ（１well
当たり）を添加して、７日間培養した。そして、培養開
始３日経過後、５日経過後及び７日経過後にcell中の細
胞数を計測した。細胞数は、cell counting kit（同仁
化学製）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度をマイク
ロプレートリーダーで測定し、予め作成したおいた検量
線によって求めた。その結果を表１に示す。なお、表１
には、ＴＤＭを加えない培地（コントロール）を１００
とした場合における増殖率で示した。
【００３３】
【表１】
【００３４】表１から分かるように、ＴＤＭを培地１we
ll当たり０．０１〜１００μｇ（濃度換算０．０５〜５
００μｇ／ｍｌ相当量）添加した場合に、血管内皮細胞
増殖促進効果が認められた。
ll当たり０．０１〜１００μｇ（濃度換算０．０５〜５
００μｇ／ｍｌ相当量）添加した場合に、血管内皮細胞
増殖促進効果が認められた。
【００３５】
【発明の効果】本発明の血管内皮細胞増殖促進剤は、一
般細菌の培養と同様にして培養できる抗酸菌から容易に
入手でき、火傷や創傷などのヒトや動物の皮膚損傷に対
する治療薬の実用化に大きく貢献できる。特に、ＥＦＧ
やＶＰＦ／ＶＥＧＦなどの入手困難である増殖因子の代
用品として用いられ、ＭＥＭ培地やＤ−ＭＥＭ培地など
の基本培地に血清と共に添加して、血管内皮細胞の培養
が行える。このように、本発明によれば、新規かつ有効
な血管内皮細胞増殖促進剤並びに血管内皮細胞培養用組
成物を容易かつ安価に提供できる。
般細菌の培養と同様にして培養できる抗酸菌から容易に
入手でき、火傷や創傷などのヒトや動物の皮膚損傷に対
する治療薬の実用化に大きく貢献できる。特に、ＥＦＧ
やＶＰＦ／ＶＥＧＦなどの入手困難である増殖因子の代
用品として用いられ、ＭＥＭ培地やＤ−ＭＥＭ培地など
の基本培地に血清と共に添加して、血管内皮細胞の培養
が行える。このように、本発明によれば、新規かつ有効
な血管内皮細胞増殖促進剤並びに血管内皮細胞培養用組
成物を容易かつ安価に提供できる。
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フロントページの続き
(72)発明者 畑 智奈
大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号
株式会社クラブコスメチックス内
(72)発明者 中山 美紀
大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号
株式会社クラブコスメチックス内
(72)発明者 加藤 敬香
大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号
株式会社クラブコスメチックス内
Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BB09 BB15 BB16
BB28 BB34 CA44
4C086 EA03 MA01 NA14 ZA89 ZB22
Claims (6)
- 【請求項１】 単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステ
ルからなることを特徴とする血管内皮細胞増殖促進剤。 - 【請求項２】 前記脂肪酸がミコール酸であることを特
徴とする請求項１記載の血管内皮細胞増殖促進剤。 - 【請求項３】 前記脂肪酸の炭素数が３０〜４０である
ことを特徴とする請求項１又は２の何れかに記載の血管
内皮細胞増殖促進剤。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３の何れかに記載の糖
エステルを含む抗酸菌より抽出された菌体抽出物からな
ることを特徴とする血管内皮細胞増殖促進剤。 - 【請求項５】 請求項１〜４の何れかに記載の血管内皮
細胞増殖促進剤を含むことを特徴とする血管内皮細胞培
養用組成物。 - 【請求項６】 請求項１〜４の何れかに記載の血管内皮
細胞増殖促進剤を含むことを特徴とする創傷治癒剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001244262A JP2003052362A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | 血管内皮細胞増殖促進剤及び血管内皮細胞培養用組成物並びに創傷治癒剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001244262A JP2003052362A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | 血管内皮細胞増殖促進剤及び血管内皮細胞培養用組成物並びに創傷治癒剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003052362A true JP2003052362A (ja) | 2003-02-25 |
Family
ID=19074225
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001244262A Pending JP2003052362A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | 血管内皮細胞増殖促進剤及び血管内皮細胞培養用組成物並びに創傷治癒剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003052362A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105612114A (zh) * | 2013-10-11 | 2016-05-25 | Tgw机械有限公司 | 具有基本上对称纵向延伸的电导体的传送设备 |
| WO2020216281A1 (zh) * | 2019-04-24 | 2020-10-29 | 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
-
2001
- 2001-08-10 JP JP2001244262A patent/JP2003052362A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105612114A (zh) * | 2013-10-11 | 2016-05-25 | Tgw机械有限公司 | 具有基本上对称纵向延伸的电导体的传送设备 |
| CN105612114B (zh) * | 2013-10-11 | 2018-01-09 | Tgw机械有限公司 | 具有基本上对称纵向延伸的电导体的传送设备 |
| WO2020216281A1 (zh) * | 2019-04-24 | 2020-10-29 | 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
| CN112218647A (zh) * | 2019-04-24 | 2021-01-12 | 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
| CN112218647B (zh) * | 2019-04-24 | 2023-07-04 | 辽宁天安生物制药股份有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
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