JP5148970B2 - 新規β−セリネン誘導体および当該誘導体を含むアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤 - Google Patents
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Description
本明細書中において使用される用語は、指示がない限り、当業者によって通常理解される通りの意味で用いられている。
本発明の目的物質であるβ−セリネン誘導体を製造するには、基質β−セリネンを真菌の一種であるアスペルギルス属に属するβ−セリネン誘導体産生菌またはその生体内酵素で処理し、産生された当該β−セリネン誘導体を採取すればよい。ここで言う「処理」とは、β−セリネンと菌体との接触、β−セリネンを菌体の培養培地に含有させて行う培養、発酵等の常套の微生物変換手段を含む意味で用いられており、「採取」とは、常套の分離、抽出および精製手段を含む工程を意味している。
本発明で得られるβ−セリネン誘導体は、アセチルコリンエステラーゼに対して顕著な活性抑制作用を示す。当該活性は適当なin vitroあるいはin vivo試験、例えば実施例2に記載の試験により容易に確認することができる。本発明のβ−セリネン誘導体は、好ましくは化合物17μLをアセチルコリンエステラーゼ(シグマ製)溶液(0.04ユニット/mL)に加え、25℃で5分間インキュベートし、さらに続いて75mLのATCを13μL加えて25℃で20分間インキュベートしたとき、アセチルコリンエステラーゼの活性を10%以上、好ましくは20%以上、とりわけ好ましくは30%以上阻害することができる。
β−セリネンはセロリー油(三栄源エフ・エフ・アイ製)の真空蒸留およびシリカゲルクロマトグラフィーにより調製した。
簿層クロマトグラフィー(TLC)は、シリカゲル60GF254を塗布したTLCプレート(メルク製:層厚0.25mm)を用いた。シリカゲルカラムクロマトの展開溶媒は、ヘキサン−酢酸エチル(1:1)を用いた。
赤外吸収スペクトル(IR)はパーキン・エルマー製1760X型分光器により得た。溶媒にはクロロホルムを使用した。
核磁気共鳴スペクトル(NMR)は、日本電子製FX−500(500MHz(1H)、125.65MHz(13C)を用い、TMS(1H)またはクロロホルム(13C)を内部標準とし、CDCl3で測定した。
4℃で保存されたアスペルギルス ウェンティー(NBRC8864)の胞子を、滅菌した培養培地(ショ糖1.5%、グルコース0.5%、ポリペプトン0.05%、硫酸マグネシウム(七水和物)0.05%、塩化カリウム0.05%、リン酸二カリウム0.1%、硫酸第一鉄(七水和物)0.001%、および蒸留水、pH7.2)を入れた振盪フラスコ中に植え付け、27℃で3日間培養した。
前培養したアスペルギルス ウェンティーの菌糸体を培養培地(50mLのペトリ皿中20mL)に移植し、2日間(菌糸体が培養培地の表面積の60〜80%を占めるまで)同じ条件下で培養した。アスペルギルス ウェンティーが成長した後、5mLのDMSOに溶かしたβ−セリネン〔I〕350mgを培地に加えて27℃で14日間静置培養を続けた。β−セリネンを添加しなかったアスペルギルス ウェンティー培養群(陽性対照)および培地にβ−セリネンのみを加えた群(陰性対照)をコントロールとした。
図1中、■:β−セリネン、△:化合物〔II〕である。
実施例1にて前培養したアスペルギルス ウェンティーを実施例1と同様の培地900mLに移植し、27℃で曝気条件下にて2日間攪拌培養した。アスペルギルス ウェンティーが成長した後、β−セリネン350mgを培地に添加し、14日間培養を続けた。
上記のように、β−セリネン〔I〕350mgを培地に加えて27℃で14日間静置培養を続けた後、濾過により培養液と菌糸体を分離した。培養液を塩化ナトリウムで飽和し、酢酸エチルで抽出した。さらに菌糸体を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を混ぜ、硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下に溶媒を留去し、粗抽出物411mgを得た。抽出物をヘキサン−酢酸エチル混液とシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供した。未反応のβ−セリネン213mgが回収された。化合物〔II〕51mgが単離された。
化合物〔II〕、(2S,6R,9S,10S)−2,11,13−トリヒドロキシ−β−セリネン構造は以下のMS、IR、およびNMRデータから決定した。
化合物〔II〕([α]D 23.1 +23.7°(c=1.00,CHCl3))は、11位炭素のシングルアイソマーとして得られた。〔II〕のHR−EIMS(高分解能電子衝撃型四重極質量分析法)では、m/z値254.1895、分子式C15H26O3であった。
化合物〔II〕のIRスペクトルでは、水酸基(3355cm−1)の存在が示された。
1H−NMRではイソプロペニル基のオレフィン性プロトンのシグナルは観察されなかった。1H−NMRおよび13C−NMRでは、2級アルコールの存在が示された(δH3.87(1H,dddd,J=4.8,4.8,11.4,11.5Hz);δC67.9(CH))および11,13−ジオール(δH3.41,3.46(each 1H,d,J=10.8 Hz);δC68.5(CH2),74.7(C))。
化合物〔II〕は、二次元NMR(HMBC:heteronuclear multiple bond correlation)スペクトルの帰属において、(i)H−1/C−2,C−8とC−10、(ii)H−3/C−2,C−4とC−14、(iii)H−12/C−6,C−11とC−13、(iv)H−14/C−3,C−4とC−9の間に相関シグナルが観察された。化合物〔II〕の2位の炭素の配位は、H−2/H−1とH−15間のNOEsスペクトルの解析よりS体であると確認された(図2)。これらのデータから、化合物〔II〕の構造は新規化合物である(2S,6R,9S,10S)−2,11,13−トリヒドロキシ−β−セリネンであると決定した。11位の炭素の立体配置は維持されていた。
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性はEllmanらの分光光度法(G.L.Ellman, K.D.Courtney, V.Andres Jr., R.M.Featherstone, (1961), Biochem.Pharmacol., 7, 88-95)により測定した。17μLの化合物〔I〕または化合物〔II〕(エチルアルコール溶液)、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶かした0.01Mのイールマン試薬(DTNB:東京化成製)33μL、アセチルコリンエステラーゼ(シグマ製)167μL(0.04units/mL、0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)に溶解)、および0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)800μLを試験管に加え、25℃で5分間インキュベートした。その後、75mMのアセチルチオコリン アイオダイド(ATC:東京化成製)13μLを加え、25℃で20分間インキュベートした。吸光光度計により475nmの吸光度を測定した。化合物を含まない対照試験は、非酵素的加水分解のためにブランクにより補正された。各測定は少なくとも3回繰り返した。アセチルコリンエステラーゼ阻害活性は以下の式により決定した。
アセチルコリンエステラーゼ阻害活性(%)=[(A−B)/(Cp−Cn]×100
A:試料(化合物〔I〕または化合物〔II〕、DTNB、アセチルコリンエステラーゼ、0.1Mリン酸緩衝液、およびATC)の吸光度
B:ブランク(化合物〔I〕、化合物〔II〕または((-)-プレゴン)、DTNB、および0.1Mリン酸緩衝液)の吸光度
Cp:陽性対照(エチルアルコール、DTNB、アセチルコリンエステラーゼ、および0.1Mリン酸緩衝液)の吸光度
Cn:陰性対照(エチルアルコール、DTNB、および0.1Mリン酸緩衝液)の吸 光度
結果を表2に示す。
△ 化合物〔II〕
Claims (6)
- アセチルコリンエステラーゼ活性阻害作用を有する、請求項1に記載の誘導体。
- 請求項1に記載のβ−セリネン誘導体を有効成分として含有するアセチルコリンエステラーゼ活性阻害剤。
- β−セリネン誘導体を生産する能力を有するアスペルギルス属に属する微生物がアスペルギルス ウェンティーである、請求項4に記載の製造方法。
- アスペルギルス ウェンティーが寄託番号NBRC8864の株種である、請求項5に記載の製造方法。
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