JP3069359B2 - 細胞傷害因子ｏｇｄｆ―２およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、細胞傷害因子OGDF−２およびその製造法
に関するものである。

（従来の技術） マクロファ−ジまたはその株化細胞は、LPSグラム陰
性菌脂質多糖体ザイモサン等の刺激によって活性化さ
れ、プロテア−ゼ、アルキナ−ゼ、毒性酸素、腫瘍壊死
因子（以下、TNFと略記）等の細胞傷害因子を産生する
ことが知られている。これとは別に、リンホカイン、モ
ノカイン等を産生する多くの樹立細胞が報告されている
が、これらの細胞が産生する細胞産物は種々のウイルス
感染によって増産されることが知られている。

細胞株J774Aはマウス白血病由来の細胞で、貪食能、F
_cレセプタ−等の生化学的諸性質においてマクロファ−
ジ様の性状を示す細胞である。この細胞は、LPSの刺激
によってプロテア−ゼ、H₂O₂、およびTNFを産生する
［ジャパニ−ズ・ジャ−ナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン（Japan.J.Exp.Med.）56巻195〜199頁
（1986年）］。この出願の発明者（本発明者という）
は、J774A細胞をウシ白血病ウイルス（以下、BLVと略
記）持続産生FLK細胞（以下、BLV−FLKと略記）と混合
培養とすると、培養物上清の細胞傷害活性が著しく向上
すること、および刺激剤を添加しなくても傷害活性の産
生が持続することを既に報告した［応用細胞生物学研究
４巻28〜90頁および５巻９〜18頁、並びにセル・バイオ
ロジ−・インタ−ナショナル・レポ−ツ（Cell Biology
International Reports）10巻、659〜665頁（1986
年）］が、これらは培養上清の活性に関するものであ
る。その後、本発明者は、分子量約1000の細胞傷害因子
を採取した（特開平１−168278号）。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者はさらに研究を続けた結果、マクロファ−ジ
様細胞株J774Aとウシ白血病ウイルス持続産生FLK細胞の
混合系から得られたJ774A細胞（C_o−J774Aと略記）が細
胞傷害因子（OGDFと略記）を産生していることを見出し
OGDFの製造法については公開済みであるが、これらは主
にマウスの腹水中からの製造法であり、本OGDFを多量に
採取する製造法については、まだ知られていない。マウ
スを用いてOGDFを多量に採取するには、マウスのコス
ト、或いはOGDFの精製等で多くの難点がある。

本発明者は、C_o−J774A細胞をホ−ロ−ファイバ−培
養による連続多量培養を試み、さらにこの培養液からOG
DFを採取しようとして物質を採取して、この物質につき
研究を続けた結果、この物質はOGDFとは若干性状を異に
していることを見出した。得られた物質は分子量約280
の脂質分画と分子量約358の糖質分画からなる細胞傷害
因子であり、この得られた物質を細胞傷害因子OGDF−２
と名付けた。

この発明の目的は、このOGDF−２を容易に多量に製造
出来る方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） この目的の達成を図るため、この発明によれば、 マクロファ−ジ様細胞株J774Aとウシ白血病ウイルス
持続産生FLK細胞の混合系から得られたJ774A細胞の培養
により細胞傷害因子OGDF−２を得る方法において、細胞
をホ−ロ−ファイバ−内で培養し、培養液から細胞傷害
因子OGDF−２を採取することを特徴とする。

また、別の方法として、 マクロファ−ジ様細胞株J774Aとウシ白血病ウイルス
持続産生FLK細胞の混合系から得られたJ774A細胞の、ホ
−ロ−ファイバ−内での培養により培養液から細胞傷害
因子OGDF−２を得る方法において、培養物上清を親水性
有機溶媒と水を用いるかまたは親水性もしくは疎水性有
機溶媒を用いて細胞傷害因子OGDF−２を抽出することを
特徴とする。

（作用） この発明が提供する細胞傷害因子OGDF−２は下記のよ
うな性質をもつ物質である。

イ）外観：白色粉末の脂質分画と糖質分画からなり、灰
分若干を含む ロ）分子量：約280の脂質分画と約358の糖質分画（マス
スペクトル法、第１図（Ａ）及び第１図（Ｂ）参照） ハ）各種溶媒に対する溶解性：（＋は溶解性、傷害性共
に陽性を示す） メタノ−ル：＋ エタノ−ル：＋ ヘキサン：＋ クロロフォルム：− 水：＋ ニ）呈色反応：ヘキサン：エ−テル＝7:3で展開後発
色。細胞傷害は原点から5cmの位置に認められる（第２
図参照） 対称 反応または試剤 判定 コレステロ−ル ザトキス ＋ 糖 オルシノ−ル ＋ りん デットマ−レスタ− − アミノ酸 ニンヒドリン − アルデヒド・ケ 2,4−ジニトロフェニル − トン コリン ドフゲンドラフ − 親水性、疎水性の区別：疎水性 ホ）生物活性： ｉ）100μｇを約10⁵個の培養細胞（例えばXC細胞）と24
時間インキュベ−トすると、細胞をすべて死滅する。

ii）熱安定性:100℃、20分間で安定。

iii）酸・アルカリ安定性:pH11およびpH2で10分間処理
すると不活性化。

ヘ）GC/MSスペクトル（第９図（Ａ）〜（Ｄ）） ト）紫外線吸収スペクトル 特に特徴的な肩はなし（第６図） チ）元素分析： 糖部:C％1.21、Ｈ％0.37、Ｎ％0.00、Ashe0.0534mg
（1.7875mg） 糖質分画:C％10.93％、Ｈ％2.50、Ｎ％0.53、Ashe0.108
0mg（2.02822mg） 上記のように、OGDF−２は細胞傷害活性を有するの
で、抗腫瘍活性剤として有用である。

上記細胞傷害物質OGDF−２の製造法の好ましい実施態
様を示すと、次の通りである。

J774A細胞は、ラルフ等［ネイチャ−（Nature）257巻
393〜394頁（1975年）］によって樹立されたマウス由来
マクロファ−ジ様細胞であり、ATCCから入手できる（寄
託番号ATCC−TIB67）。この細胞は、ダルベッコMEM培地
に10％ウシ胎子血清、ストレプトマイシン（100U/m
l）、ペニシリン（μg/ml）およびフアンギゾン（1.0μ
g/ml）を加えた培地（以下、Ｄ−MEMと略称）を用い、
５％CO₂中37℃で培養し、３〜４日目毎に継代するのが
適当である。

BLV−FLK［ビブリオグラフイア・ヘマトジカ（Bibl.H
aematol.）43巻360〜362頁（1975年）］は、本発明者は
保存している。この細胞は、Ｄ−MEMで培養し、0.1％ト
リプシンを用いて５〜７日毎に継続して維持するのが適
当である。

この細胞C_o−J774Aは昭和62年12月23日に微生物工業
技術研究所に寄託した（寄託番号FERM−Ｐ−9787号）。

Ｊ−774、BLV−FLKおよびC_o−J774Aは、上記のように
して入手できる。

OGDF−２は、ホ−ロ−ファイバ−内にて培養した得た
培養液からも得られるし、また試験管内で培養して得た
培養液またはその凍結乾燥物からも得られる。

OGDF−２の採取は、例えば次のようにして行なう。上
記の培養液をとり、例えば遠心分離により細胞を培養液
とを分離すると、OGDF−２は培養液に含まれる。この培
養液上清または濾液に例えばメタノ−ルのような親水性
有機溶媒を大過剰、例えば３〜10倍量、通常４〜５倍量
加えて混合し、遠心分離のような固液分離手段で蛋白成
分と非蛋白成分を分けると、OGDF−２は非蛋白成分に含
まれる。この分画をカラムクロマトグラフィ−のような
分画手段により分画してOGDF−２を分離する。例えば、
上記非蛋白分画からメタノ−ルを除去し、親水性有機溶
媒と水を用いて溶解し、例えば40％メタノ−ル溶液のよ
うな溶液を調製し、適当な分離用カラム、例えばODSカ
ラムに適用し、親水性有機溶媒−水の勾配（好ましくは
直線勾配）、例えば40〜100％メタノ−ルグラジエント
で溶離すると、OGDF−２は有機溶媒高比率分画、例えば
80％メタノ−ル分画に含まれる。OGDF−２は、この分画
から例えば凍結乾燥により溶媒を除去することにより得
られる。このように操作すると、比活性は約100倍程度
に上昇する。また親水性有機溶媒（メタノ−ル、アセト
ン等）もしくは疎水性有機溶媒（ヘキサン、酢酸エチル
等）を用いて抽出するのが適当な場合もある。一方、OG
DF−２は同様の手法によって培養液からも得られる。す
なわち、培養液を凍結乾燥した後60％のメタノ−ルを加
えて溶出すると、活性はメタノ−ル分画に含まれる。そ
の性状は前記の通りであり、蛋白分画に含まれるTNF
（分子量40000〜60000の糖蛋白）とは明らかに異なる糖
脂質様物質である。

（実施例） 以下、この発明を実施例により説明する。

実施例１（細胞培養液によるOGDF−２の採取） ホ−ロ−ファイバ−培養システムとC_o−J774細胞培養 本実験では、培養装置:Bio Pro（グレ−スJapanの商
品名）にミニビタファイバ−を取付けて行なった。すな
わち、培地Ｄ−MEMの2.8を培地貯蔵庫に注入し、38℃
に保温し、流速30ml/分の割合でチュ−ブ内を循環させ
ておき、予め培養フラスコで培養したC_o−J774細胞（10
⁷）を注入し、PHをCO₂で7.2に自動制御して培養を行な
った。以降、グルコ−ス消費が100mg/dl以下になった時
点で培養液を交換し、培養を継続させた。採取した培養
液は凍結保存し、以降のOGDFの採取に用いた。

C_o−J774細胞をホ−ロ−ファイバ−（Bio Pro:ミニビ
タファイバ−）にて７〜14日連続培養した培養液約2600
mlを凍結乾燥して約35gを得た。これの10gに10倍量の60
％メタノ−ルを加え十分混合した後−夜−30℃に保存し
た。しかる後、3000rpm10分遠心してその上清を採取す
ると活性は上清に認められた。これを約３倍に濃縮した
後、バイオビ−ズ（Bio Bead）カラムに入れて60％メタ
ノ−ルで溶出し、試験管当り約8mlづつ採取すると活性
は２〜４本の間に認められた（第３図）。これを約10ml
に濃縮してさらにキ−ゼゲル（Kiesegel）60（Merk）カ
ラムに入れ60％メタノ−ルで溶出し、試験管当り25mlづ
つ採取すると活性は５〜７本に認められた（第４図）。
これを濃縮して湿重量約1000mg採取した。

実施例２（OGDF−２の精製と結晶） 実施例１で得た活性分画（５〜７）（第４図）を60メ
タノ−ルに溶解した。これを透析チュ−ブに入れ外液を
60％メタノ−ルで透析を行なった。透析液を濃縮すると
活性は外液に認められた。この外液を蒸留水に溶解した
後、EDTA−2Naを入れると結晶化し沈澱した。この結晶
を遠心によって採取した。これに蒸留水を入れ、1N NaO
Hを添加すると溶解した。活性はこの分画に認められ
た。

実施例３（細胞傷害活性、熱安定性及び酸安定性） 24ウェルマルチプレ−トに培養継代中のXC細胞（10⁵/
ml）をウェル当り1mlづつ添加し、37℃で24時間培養を
行なった。次に実施例１で得た５〜７分画の物質をml当
り100μｇ含むように培養液で調製した。傷害試験は上
記培養細胞の旧培地を除去した後にこの1mlを添加し、3
7℃に４日間培養して行なった。その活性は物質を添加
しなかった時の細胞の増殖と比較して行ない（ギムザ染
色）、細胞傷害活性の100％は全ての細胞を殺すことを
意味する。両物質共100μｇ添加で１日以内に100％死滅
させた。

実施例１で得たNo6分画の40μを３μNaOHおよび
５μHClを添加してPH11、PH2とし10分間放置した後、
５μHClおよび３μNaOHを添加して中性とし、これ
をXCに添加して傷害性を検討したところ、活性は著明に
低下した。

実施例４（OGDF−２の特性） 実施例１で得た活性分画（第４図）をシリカゲル（Wa
coge1−B5）を用いた薄層クロマトグラフィ−を行なっ
た。各分画の約10μをスポットし、メタノ−ル、クロ
ロホルム、水、或いはヘキサン（70）エチルエ−テル
（30）の溶媒で展開した後、各試験で発色させた。その
成績は第２図に示した。活性の認められる分画には脂
質、糖に反応陽性を示した。

実施例２で結晶化した物質をNaOHで溶解させた成分を
分析したところ、リピド（0.5％）、糖（0.1％）からな
り蛋白は検出されなかった。

また、実施例１で得たNo6画分の濃縮物をクロロホル
ムを添加して、クロロホルム溶出部と残渣部を得た。こ
の両分画を実施例５で示したXC細胞に添加して傷害性を
検討したところ、活性は消失した。ただ、クロロホルム
分画には添加３日後に弱い傷害が認められたにすぎなか
った。

実施例５（OGDF−２と２−３の物質の比較） OGDF−２と培地或いは血清中の２〜３の含有物につい
て細胞傷害活性、物性について比較した。

１）システィン−塩酸塩 ：培地中に含まれるシスティン−塩酸塩の高濃度を実
施例３で述べたように培養細胞に添加して傷害性を検討
した。しかし、著明な傷害活性は認められなかった。ま
た、顕微鏡下での結晶の様相は、OGDF−２のそれと異に
していた。

２）γ−リノレンサン、リノレンサン ：γ−リノレンサン、リノレンサンを実施例３で述べ
たように培養細胞に添加して傷害性を検討した。しか
し、傷害活性は認められなかった。また、これらのマス
スペクトル分析はOGDF−２のそれと異にしていた。

実施例６（C_o−J774細胞のホ−ロ−ファイバ−培養によ
るグルコ−スの消費） ミニビタファイバ−内を培養液で洗浄した後に新しい
細胞を2.4×10⁷（生存率94％）個注入して実験を行なっ
た。この実験のグルコ−ス消費成績を第12図に示す。

尚、グルコ−ス濃度が100mg/dl以下になった時点で培
地を交換した。図中、曲線Ｉはグルコ−ス濃度、曲線II
は培養後のグルコ−ス総消費量を示す。

（発明の効果） この発明ではホ−ロ−ファイバ−を用いて細胞の培養
を行なうので、容易に多量のOGDF−２を培養することが
出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）〜（Ｃ）は、この発明の細胞傷害因子OGDF
−２の分子量を測定するためのマススペクトルの結果を
示す図であって、 第１図（Ａ）は、実施例１で得た培養液のOGDF−２のEI
デ−タを示す図、 第１図（Ｂ）は、実施例１で得た培養液のOGDF−２のポ
ジのデ−タを示す図、 第１図（Ｃ）は、実施例１で得た培養液のOGDF−２のネ
ガのデ−タを示す図、 第２図は、この発明の細胞傷害因子OGDF−２の薄膜クロ
マトグラフィ−で展開後発色反応にかけた結果を示す
図、 第３図および第４図は、それぞれ、活性デ−タを示す
図、 第５図は、実施例１においてこの発明の細胞傷害因子OG
DF−２の核磁気共鳴スペクトルを示す図、 第６図は、この発明の細胞傷害因子OGDF−２の紫外線吸
収スペクトルを示す図、 第７図は、実施例１においてこの発明の細胞傷害因子OG
DF−２の細胞傷害活性と添加量の関係を示すグラフ、 第８図は、マススペクトル法によるγ−リノレン酸のEI
デ−タを示す図、 第９図（Ａ）〜（Ｄ）は、結晶化した細胞傷害因子のGC
/MS（グルコ−スまたはマンノ−ス）の成績を示し、 第９図（Ａ）は、TICの成績:4.951脂質 12.583糖 13.528糖 を示す図、 第９図（Ｂ）は、4.963のScanを示す図、 第９図（Ｃ）は、12.585のScanを示す図、 第９図（Ｄ）は、13.522のScanを示す図、 第10図は、細胞傷害因子OGDF−２の赤外線吸収スペクト
ルを示す図、 第11図は、細胞傷害因子の加水分解後の遊離脂肪酸組成
を示すガスクロマトグラフィ−図、 第12図は、C_o−J774細胞のホ−ロ−ファイバ−培養によ
るグルコ−スの消費を示す図である。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の性質を有する細胞傷害因子OGDF−
   ２。 ａ由来：マクロファージ様細胞株J774Aとウシ白血病ウ
   イルス持続産生FLK細胞の混合系から得られたCo−J774A
   細胞の培養液より分離 ｂ外観：白色粉末の脂質分画と糖質分画からなり、灰分
   若干を含む ｃ分子量：約280の脂質分画と約358の糖質分画 ｄ熱安定性:100℃、20分において安定 ｅ酸・アルカリ安定性:pH11およびpH2において10分間処
   理すると不活性化 ｆ生物活性:100μｇを約10⁵の培養細胞（例えばXC細
   胞）と24時間インキュベートすると、細胞をすべて死滅
   させる
2. 【請求項２】請求項１に記載の細胞傷害因子OGDF−２を
   製造するにあたり、 マクロファージ様細胞株J774Aとウシ白血病ウイルス持
   続産生FLK細胞の混合系から得られたCo−J774A細胞をホ
   ーローファイバー内で培養し、培養液から前記細胞傷害
   因子OGDF−２を採取することからなる方法。
3. 【請求項３】請求項１に記載の細胞傷害因子OGDF−２を
   製造するにあたり、 マクロファージ様細胞株J774Aとウシ白血病ウイルス持
   続産生FLK細胞の混合系から得られたCo−J774A細胞をホ
   ーローファイバー内で培養し、培養液から前記細胞傷害
   因子OGDF−２を得る方法であって、 培養物上清を親水性有機溶媒と水を用いるかまたは親水
   性もしくは疎水性有機溶媒を用いて前記細胞傷害因子OG
   DF−２を抽出することからなる方法。