JP2003052366A - ケラチノサイト増殖促進剤及びケラチノサイト培養用組成物並びに創傷治癒剤 - Google Patents
ケラチノサイト増殖促進剤及びケラチノサイト培養用組成物並びに創傷治癒剤Info
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- JP2003052366A JP2003052366A JP2001244261A JP2001244261A JP2003052366A JP 2003052366 A JP2003052366 A JP 2003052366A JP 2001244261 A JP2001244261 A JP 2001244261A JP 2001244261 A JP2001244261 A JP 2001244261A JP 2003052366 A JP2003052366 A JP 2003052366A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規かつ効果の高いケラチノサイト増殖促進
剤を提供する。 【解決手段】 本発明に係るケラチノサイト増殖促進剤
は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステルであっ
て、ミコール酸、特に炭素数５０以下の低級ミコール
酸、さらに望ましくは炭素数３０〜４０のミコール酸
と、グルコース、マンノースなどの単糖類又はトレハロ
ースなど二糖類との糖エステルからなる。上記糖エステ
ルは、例えば、ロドコッカス属に属する菌、特にロドコ
ッカス菌を培養することによって得ることができ、培養
された菌体中から抽出される。こうして得られたケラチ
ノサイト増殖促進剤は、細胞増殖因子として用いられ、
細胞培養用組成物として供される。また、火傷や創傷な
どによって損傷されたヒトや動物の皮膚に適用される損
傷治癒剤として用いられる。
剤を提供する。 【解決手段】 本発明に係るケラチノサイト増殖促進剤
は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステルであっ
て、ミコール酸、特に炭素数５０以下の低級ミコール
酸、さらに望ましくは炭素数３０〜４０のミコール酸
と、グルコース、マンノースなどの単糖類又はトレハロ
ースなど二糖類との糖エステルからなる。上記糖エステ
ルは、例えば、ロドコッカス属に属する菌、特にロドコ
ッカス菌を培養することによって得ることができ、培養
された菌体中から抽出される。こうして得られたケラチ
ノサイト増殖促進剤は、細胞増殖因子として用いられ、
細胞培養用組成物として供される。また、火傷や創傷な
どによって損傷されたヒトや動物の皮膚に適用される損
傷治癒剤として用いられる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明はケラチノサイト増殖
促進剤及びケラチノサイト培養用組成物並びに創傷治癒
剤に関する。具体的には、ヒト皮膚角質層の再生促進に
寄与すると考えられているケラチノサイト増殖促進剤に
関する。
促進剤及びケラチノサイト培養用組成物並びに創傷治癒
剤に関する。具体的には、ヒト皮膚角質層の再生促進に
寄与すると考えられているケラチノサイト増殖促進剤に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ケラチノサイトの増殖促進剤として、こ
れまでにＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）やＧＭ−
ＣＳＦ（Granular Macrophage- Colony Stimulating Fa
ctor）等の因子が発見されている（Marchese C., Rubin
J., Ron D., Faggioni A., Torrisi M..R., Messina
A., Frati L., Aaronson S. A., J. Cell Physiol. 144
(2) 326-332, 1990, Braunstein S., Kaplan G., Gottl
ieb A..B., Schwartz M., Walsh G., Abalos R. M,. Fa
jardo T. T., Guido L. S., Krueger J. G., J.Invest.
Dermatol., 103 (4) 601-604, 1994, Paus R., Luftl
M., CzarnetzkiB. M., Br. J. Dermatol. 130 (2) 174-
180., 1994）。これらの因子は、ヒトや各種動物の皮膚
における創傷治癒を促進することから、創傷や火傷の治
療を目的として研究されると共に、細胞生物学実験にお
ける細胞培養の成長因子として用いられてきた。従っ
て、優れたケラチノサイト増殖促進剤やケラチノサイト
培養用組成物の提供は、医療上及び細胞生物学的実験を
行なう上では、非常に重要な位置を占めるものである。
れまでにＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）やＧＭ−
ＣＳＦ（Granular Macrophage- Colony Stimulating Fa
ctor）等の因子が発見されている（Marchese C., Rubin
J., Ron D., Faggioni A., Torrisi M..R., Messina
A., Frati L., Aaronson S. A., J. Cell Physiol. 144
(2) 326-332, 1990, Braunstein S., Kaplan G., Gottl
ieb A..B., Schwartz M., Walsh G., Abalos R. M,. Fa
jardo T. T., Guido L. S., Krueger J. G., J.Invest.
Dermatol., 103 (4) 601-604, 1994, Paus R., Luftl
M., CzarnetzkiB. M., Br. J. Dermatol. 130 (2) 174-
180., 1994）。これらの因子は、ヒトや各種動物の皮膚
における創傷治癒を促進することから、創傷や火傷の治
療を目的として研究されると共に、細胞生物学実験にお
ける細胞培養の成長因子として用いられてきた。従っ
て、優れたケラチノサイト増殖促進剤やケラチノサイト
培養用組成物の提供は、医療上及び細胞生物学的実験を
行なう上では、非常に重要な位置を占めるものである。
【０００３】また、ケラチノサイトは、培地中のＣａ濃
度の影響を受けて分化する性質を有するために、ケラチ
ノサイトの細胞培養には通常Ｃａイオン濃度を調整した
培地が使用される。この細胞培養用培地には、ＭＥＭ培
地（Minimun Essential Medium）やＤ−ＭＥＭ培地（Du
lbecco's Modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ１６４
０、ＢＭＥ培地（Basal Medium Eagle）等の基本培地を
基本として、これら培地中のＣａ濃度を調整すると共
に、上記ＥＧＦやＧＭ−ＣＳＦ、ハイドロコーチゾン、
インスリン、血清などの各種細胞増殖（成長）因子を添
加した培地が用いられる。
度の影響を受けて分化する性質を有するために、ケラチ
ノサイトの細胞培養には通常Ｃａイオン濃度を調整した
培地が使用される。この細胞培養用培地には、ＭＥＭ培
地（Minimun Essential Medium）やＤ−ＭＥＭ培地（Du
lbecco's Modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ１６４
０、ＢＭＥ培地（Basal Medium Eagle）等の基本培地を
基本として、これら培地中のＣａ濃度を調整すると共
に、上記ＥＧＦやＧＭ−ＣＳＦ、ハイドロコーチゾン、
インスリン、血清などの各種細胞増殖（成長）因子を添
加した培地が用いられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記因
子を入手するにあたっては、厳密な細胞培養条件の他、
高度な遺伝子操作技術や精製技術などを必要とし、さら
に簡便な入手のための研究が続けられてはいるものの、
未だ十分なものではなかった。従って、入手容易な新規
かつ効果的なケラチノサイト増殖促進因子が望まれてい
るところである。
子を入手するにあたっては、厳密な細胞培養条件の他、
高度な遺伝子操作技術や精製技術などを必要とし、さら
に簡便な入手のための研究が続けられてはいるものの、
未だ十分なものではなかった。従って、入手容易な新規
かつ効果的なケラチノサイト増殖促進因子が望まれてい
るところである。
【０００５】また、これらの培地においては、Ｃａ濃度
を調整するのみならず、培養細胞種に応じて上記因子を
２種３種と適宜組み合わて用いる必要があった。このよ
うに、従来の細胞培養用培地はその調整が非常に面倒な
ものであり、必須の構成成分であるＥＧＦなどの各種因
子の入手が困難なこともあって高価なものとなってい
た。
を調整するのみならず、培養細胞種に応じて上記因子を
２種３種と適宜組み合わて用いる必要があった。このよ
うに、従来の細胞培養用培地はその調整が非常に面倒な
ものであり、必須の構成成分であるＥＧＦなどの各種因
子の入手が困難なこともあって高価なものとなってい
た。
【０００６】一方、本発明者らは、ロドコッカス属に属
する菌から抽出分離された糖エステル、特にミコール酸
との糖エステルが皮膚保湿効果に有効であることを見い
出し、特許出願（特開平９−２５５５４９号公報参照）
しているが、この糖エステルがケラチノサイト増殖促進
剤を有することについては未だ知られてはいなかった。
する菌から抽出分離された糖エステル、特にミコール酸
との糖エステルが皮膚保湿効果に有効であることを見い
出し、特許出願（特開平９−２５５５４９号公報参照）
しているが、この糖エステルがケラチノサイト増殖促進
剤を有することについては未だ知られてはいなかった。
【０００７】そこで、本発明者らは上記目的を達成すべ
く鋭意研究を重ねた結果、上記単糖類又は二糖類と脂肪
酸との糖エステルが優れたケラチノサイト増殖促進作用
を有すると共に、培地中に添加すると共に培地中Ｃａ濃
度の調整を行うことによりケラチノサイトの培養が行え
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
く鋭意研究を重ねた結果、上記単糖類又は二糖類と脂肪
酸との糖エステルが優れたケラチノサイト増殖促進作用
を有すると共に、培地中に添加すると共に培地中Ｃａ濃
度の調整を行うことによりケラチノサイトの培養が行え
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明に係るケラチノサ
イト増殖促進剤は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エ
ステルからなることを特徴としている。
イト増殖促進剤は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エ
ステルからなることを特徴としている。
【０００９】本発明においては、前記脂肪酸がミコール
酸である糖エステルが好ましく、特に炭素数が３０〜４
０である脂肪酸が望ましく用いられる。
酸である糖エステルが好ましく、特に炭素数が３０〜４
０である脂肪酸が望ましく用いられる。
【００１０】また、本発明に係るケラチノサイト増殖促
進剤は、上記の糖エステルを含む抗酸菌より抽出された
菌体抽出物からなることを特徴としている。
進剤は、上記の糖エステルを含む抗酸菌より抽出された
菌体抽出物からなることを特徴としている。
【００１１】さらに、本発明に係るケラチノサイト培養
用組成物及び創傷治癒剤はそれぞれ上記本発明に係るケ
ラチノサイト増殖促進剤を含むことを特徴としている。
用組成物及び創傷治癒剤はそれぞれ上記本発明に係るケ
ラチノサイト増殖促進剤を含むことを特徴としている。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明に係るケラチノサイト増殖
促進剤は、単糖類若しくは２糖類との糖エステルからな
ることを特徴としている。当該糖エステルは、脂肪酸の
カルボン酸残基と糖のアルコール残基とがエステル結合
したものであって、脂肪酸１分子あるいは２分子以上の
脂肪酸が糖にエステル結合したものである。
促進剤は、単糖類若しくは２糖類との糖エステルからな
ることを特徴としている。当該糖エステルは、脂肪酸の
カルボン酸残基と糖のアルコール残基とがエステル結合
したものであって、脂肪酸１分子あるいは２分子以上の
脂肪酸が糖にエステル結合したものである。
【００１３】上記脂肪酸としては、主として、例えばコ
リネバクテリウム属、ノカルジア属又はミコバクテリウ
ム属、ロドコッカス属に代表される各種の抗酸菌が産生
する脂肪酸が挙げられ、特に、その中でも、次の式１で
示されるミコール酸が好適である。
リネバクテリウム属、ノカルジア属又はミコバクテリウ
ム属、ロドコッカス属に代表される各種の抗酸菌が産生
する脂肪酸が挙げられ、特に、その中でも、次の式１で
示されるミコール酸が好適である。
【００１４】
【式１】
【００１５】ここにおいて、式１中、ＲｍおよびＲｎは
それぞれアルキル残基を示すが、ＲｍおよびＲｎは、い
ずれも直鎖状又は分岐状のいずれであっても良い。また
Ｒｍ、Ｒｎはそれぞれ不飽和結合、望ましくは２重結合
を有しているものがよく、通常のアルキル残基よりも広
い概念である。
それぞれアルキル残基を示すが、ＲｍおよびＲｎは、い
ずれも直鎖状又は分岐状のいずれであっても良い。また
Ｒｍ、Ｒｎはそれぞれ不飽和結合、望ましくは２重結合
を有しているものがよく、通常のアルキル残基よりも広
い概念である。
【００１６】また、本発明におけるミコール酸はその総
炭素数が３０〜４０であるものが好ましく、総炭素数が
５０を越えると毒性が増強される恐れがある。
炭素数が３０〜４０であるものが好ましく、総炭素数が
５０を越えると毒性が増強される恐れがある。
【００１７】また、当該ミコール酸とエステル結合する
糖としては、グルコース、マンノース、フルクトースな
どの単糖類、あるいは、スクロース、トレハロースをは
じめとする各種の二糖類が挙げられる。これらの糖は、
アルドース、ケトースのいずれでもよく、また、鎖状あ
るいは環状構造のいずれの構造をしていてもよい。従っ
て、本発明に係る糖エステルとしては、例えば、トレハ
ロース−６，６′−ジミコレート、トレハロース−６−
モノミコレート、グルコース−６−モノミコレート、マ
ンノース−６−ミコレート、フルクトース−６−ミコレ
ートが挙げられる。
糖としては、グルコース、マンノース、フルクトースな
どの単糖類、あるいは、スクロース、トレハロースをは
じめとする各種の二糖類が挙げられる。これらの糖は、
アルドース、ケトースのいずれでもよく、また、鎖状あ
るいは環状構造のいずれの構造をしていてもよい。従っ
て、本発明に係る糖エステルとしては、例えば、トレハ
ロース−６，６′−ジミコレート、トレハロース−６−
モノミコレート、グルコース−６−モノミコレート、マ
ンノース−６−ミコレート、フルクトース−６−ミコレ
ートが挙げられる。
【００１８】本発明に係る糖エステル、主としてミコー
ル酸糖エステルは上記抗酸菌、例えば、ロドコッカス属
に属する菌、特にロドコッカス菌を培養することによっ
て得ることができる。当該化合物は主として菌体中に生
成されるので、培養された菌体から抽出することによっ
て得ることができる。
ル酸糖エステルは上記抗酸菌、例えば、ロドコッカス属
に属する菌、特にロドコッカス菌を培養することによっ
て得ることができる。当該化合物は主として菌体中に生
成されるので、培養された菌体から抽出することによっ
て得ることができる。
【００１９】その際の培養方法としては、従来から用い
られている公知の合成培地及び天然培地を用いることが
でき、特にロドコッカス属に属する微生物の培養に用い
られる培地であれば、すべての培地が使用できる。
られている公知の合成培地及び天然培地を用いることが
でき、特にロドコッカス属に属する微生物の培養に用い
られる培地であれば、すべての培地が使用できる。
【００２０】例えば生育炭素源としては、グルコース、
フルクトース、マンノースなどの単糖類を用いることが
できる。また窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝
酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィーブリカー等の有機窒素化合物が利用できる。また無
機塩としてナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、
マグネシウム、マンガン、リン酸等を、さらに成長因子
として、各種ビタミン、アミノ酸類又はそれらを豊富に
含む酵母エキスを適宜加えることにしてもよい。
フルクトース、マンノースなどの単糖類を用いることが
できる。また窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝
酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィーブリカー等の有機窒素化合物が利用できる。また無
機塩としてナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、
マグネシウム、マンガン、リン酸等を、さらに成長因子
として、各種ビタミン、アミノ酸類又はそれらを豊富に
含む酵母エキスを適宜加えることにしてもよい。
【００２１】培地のｐＨは５〜９、特に７〜７.５が至
適範囲であり、培養温度は１０〜４０℃、特に３０〜４
０℃が適している。培養は液体培養又は固体培養で好気
的条件下に行うことが好ましい。培養時間は、通常３〜
１４日程度とするのが適当である。
適範囲であり、培養温度は１０〜４０℃、特に３０〜４
０℃が適している。培養は液体培養又は固体培養で好気
的条件下に行うことが好ましい。培養時間は、通常３〜
１４日程度とするのが適当である。
【００２２】こうして得られる菌体からミコール酸糖エ
ステルを得るには、菌体成分を採取する通常の方法を用
いればよい。例えば、培養液を遠心分離して集菌したの
ち、有機溶媒を加えて溶媒抽出する。例えば、用いられ
る有機溶媒としては、クロロホルムとメタノールの混液
や、クロロホルムとメタノール・アセトンの混液など、
クロロホルムなどの疎水性溶媒やメタノールやアセトン
などの親水性溶媒とを混合したもの、あるいはこれらの
疎水性溶媒や親水性溶媒を適宜組み合わせて用いるとよ
い。
ステルを得るには、菌体成分を採取する通常の方法を用
いればよい。例えば、培養液を遠心分離して集菌したの
ち、有機溶媒を加えて溶媒抽出する。例えば、用いられ
る有機溶媒としては、クロロホルムとメタノールの混液
や、クロロホルムとメタノール・アセトンの混液など、
クロロホルムなどの疎水性溶媒やメタノールやアセトン
などの親水性溶媒とを混合したもの、あるいはこれらの
疎水性溶媒や親水性溶媒を適宜組み合わせて用いるとよ
い。
【００２３】次に抽出した菌体成分をシリカゲルやモレ
キュラシーブなどに吸着させ、その後、先に述べたよう
な溶媒で溶出して、さらに精製を加える。そして、溶媒
に対する溶解度差やイオン結合力の差などを利用し、そ
れぞれ単独の方法で又は２つ以上の方法を適当に組み合
わせて、さらには同様の操作を数回繰り返すことによ
り、ミコール酸糖エステルを、炭素数が異なるミコール
酸糖エステルの混合物ではあるが、ほぼ純粋な物質とし
て分離精製できる。
キュラシーブなどに吸着させ、その後、先に述べたよう
な溶媒で溶出して、さらに精製を加える。そして、溶媒
に対する溶解度差やイオン結合力の差などを利用し、そ
れぞれ単独の方法で又は２つ以上の方法を適当に組み合
わせて、さらには同様の操作を数回繰り返すことによ
り、ミコール酸糖エステルを、炭素数が異なるミコール
酸糖エステルの混合物ではあるが、ほぼ純粋な物質とし
て分離精製できる。
【００２４】こうして精製されたミコール酸糖エステル
は、通常、エタノールなどの適当な溶媒に溶解したり適
当な賦形剤や基剤中に混合して、本発明に係る血管内皮
細胞増殖促進剤として用いられる。また、溶媒などに溶
解することなくそのまま血管内皮細胞増殖促進剤として
も用いることもできる。例えば、得られたケラチノサイ
ト増殖促進剤を、従来から公知である種々の基本培地、
例えば、上記のＭＥＭ培地（Minimun Essential Mediu
m）やＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Eagle Med
ium）、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＭＥ培地（Basal Medium
Eagle）等に添加して使用することにより、培地中のＣ
ａ濃度を調整するのみでヒトや動物のケラチノサイトを
培養できる。つまり、ケラチノサイトの培養に必要な細
胞増殖因子（cell growth factor）であるＥＧＦやＧＭ
−ＣＳＦ、インシュリン、ソマトメディン等の代替因子
として利用でき、ケラチノサイト培養用組成物の一構成
成分として利用される。この場合、ミコール酸糖エステ
ルとして、ミコール酸糖エステルの構成によっても異な
るが、使用培地中に概ね０．０５〜５μｇ／mlで使用さ
れる。もちろん、本発明の目的を達成する限りにおい
て、この範囲に限定されるものではない。また、上記の
基本培地から作成された平板培地などの表面に、エタノ
ールなどの適当な溶媒で溶解されたケラチノサイト増殖
促進剤を塗布して用いることもできる。
は、通常、エタノールなどの適当な溶媒に溶解したり適
当な賦形剤や基剤中に混合して、本発明に係る血管内皮
細胞増殖促進剤として用いられる。また、溶媒などに溶
解することなくそのまま血管内皮細胞増殖促進剤として
も用いることもできる。例えば、得られたケラチノサイ
ト増殖促進剤を、従来から公知である種々の基本培地、
例えば、上記のＭＥＭ培地（Minimun Essential Mediu
m）やＤ−ＭＥＭ培地（Dulbecco's Modified Eagle Med
ium）、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＭＥ培地（Basal Medium
Eagle）等に添加して使用することにより、培地中のＣ
ａ濃度を調整するのみでヒトや動物のケラチノサイトを
培養できる。つまり、ケラチノサイトの培養に必要な細
胞増殖因子（cell growth factor）であるＥＧＦやＧＭ
−ＣＳＦ、インシュリン、ソマトメディン等の代替因子
として利用でき、ケラチノサイト培養用組成物の一構成
成分として利用される。この場合、ミコール酸糖エステ
ルとして、ミコール酸糖エステルの構成によっても異な
るが、使用培地中に概ね０．０５〜５μｇ／mlで使用さ
れる。もちろん、本発明の目的を達成する限りにおい
て、この範囲に限定されるものではない。また、上記の
基本培地から作成された平板培地などの表面に、エタノ
ールなどの適当な溶媒で溶解されたケラチノサイト増殖
促進剤を塗布して用いることもできる。
【００２５】さらに、当該ケラチノサイト増殖促進剤
は、創傷治癒剤として火傷や創傷を負ったヒトや動物の
皮膚に適用することによって、火傷や創傷の治癒が促進
され、早期の回復を望むことができる。この創傷治癒剤
は、外用剤として皮膚に適用可能な剤型として適用さ
れ、その剤型は特に限定されるものではない。例えば、
外用クリーム剤や外用液剤、ローション剤、パップ剤な
どとして適用できる。この場合も、上記添加量を目安に
して使用されるが、適宜増減されるものである。
は、創傷治癒剤として火傷や創傷を負ったヒトや動物の
皮膚に適用することによって、火傷や創傷の治癒が促進
され、早期の回復を望むことができる。この創傷治癒剤
は、外用剤として皮膚に適用可能な剤型として適用さ
れ、その剤型は特に限定されるものではない。例えば、
外用クリーム剤や外用液剤、ローション剤、パップ剤な
どとして適用できる。この場合も、上記添加量を目安に
して使用されるが、適宜増減されるものである。
【００２６】
【実施例】次に、以下の実施例に基づいて本発明につい
て詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定
されるものでないのは言うまでもない。
て詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定
されるものでないのは言うまでもない。
【００２７】（実施例１）
〔菌体の培養〕ロドコッカス菌(Rhodococcus sp.4306)
を１白金耳採り、ｐＨ７.５に調整した以下に示す組成
の培養用ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地２００ｍｌに植菌し、３
７℃で５〜７日間振とう培養法によって前培養した。こ
の前培養菌液１０〜５０ｍl(前培養菌液の菌体濃度によ
り液量を適宜調整する。)を同じ組成のＰＹＧ（Ｍ、
Ｆ）培地１.５lに加え、３７℃で５〜７日間本培養し
た。 〔ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地の組成〕 ・ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製） ０.５w/w％ ・ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ製） ０.５w/w％ ・糖(Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製) １w/w％ ただし、糖にはＤ（＋）−グルコース以外にも 、Ｄ
（＋）−マンノース、Ｄ（−）−フルクトースを用いる
こともできる。
を１白金耳採り、ｐＨ７.５に調整した以下に示す組成
の培養用ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地２００ｍｌに植菌し、３
７℃で５〜７日間振とう培養法によって前培養した。こ
の前培養菌液１０〜５０ｍl(前培養菌液の菌体濃度によ
り液量を適宜調整する。)を同じ組成のＰＹＧ（Ｍ、
Ｆ）培地１.５lに加え、３７℃で５〜７日間本培養し
た。 〔ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地の組成〕 ・ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製） ０.５w/w％ ・ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ製） ０.５w/w％ ・糖(Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製) １w/w％ ただし、糖にはＤ（＋）−グルコース以外にも 、Ｄ
（＋）−マンノース、Ｄ（−）−フルクトースを用いる
こともできる。
【００２８】〔ミコール酸糖エステルの抽出精製〕上記
で得られた培養菌液を７５００ｒｐｍで３０分間遠心分
離し、菌体を集菌した。次に集菌された菌体を、クロロ
ホルムとメタノールの混液(容量比で２：１)を加え、超
音波ホモジナイザーにて１５分間超音波処理を行った。
この処理した溶液を分液ロートに移し、水を加えて２層
に分離させ有機溶媒層を分取する。そして、分取した溶
媒をエバポレーターにて濃縮し、脂質成分を得た。
で得られた培養菌液を７５００ｒｐｍで３０分間遠心分
離し、菌体を集菌した。次に集菌された菌体を、クロロ
ホルムとメタノールの混液(容量比で２：１)を加え、超
音波ホモジナイザーにて１５分間超音波処理を行った。
この処理した溶液を分液ロートに移し、水を加えて２層
に分離させ有機溶媒層を分取する。そして、分取した溶
媒をエバポレーターにて濃縮し、脂質成分を得た。
【００２９】さらに、この脂質成分を薄層クロマトグラ
フィーにより展開して分離精製した。つまり、脂質成分
を少量のクロロホルムなどの適当な溶媒に溶かし、シリ
カゲルからなる分取用薄層板(UNIPLATE SILICA GEL G M
ERCK社製)上にスポットした。そして、クロロホルムと
メタノール、アセトン、酢酸混液（容量比９０：１０：
６：１）にて展開した。次に、この薄層板上で分離され
た各脂質部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルをそれ
ぞれガラスカラムに充填して、クロロホルムとメタノー
ルの混液で溶出し、各脂質が薄層クロマトグラム上で、
単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に、エバポ
レータで溶媒を留去して、トレハロース−６，６′−ジ
ミコレート、トレハロース−６−モノミコレート、グル
コース−６−モノミコレート、マンノース−６−ミコレ
ート、フルクトース−６−ミコレートを得た。これらの
詳細な構造については、上記特開平９−２５５５４９号
公報を参照されたい。
フィーにより展開して分離精製した。つまり、脂質成分
を少量のクロロホルムなどの適当な溶媒に溶かし、シリ
カゲルからなる分取用薄層板(UNIPLATE SILICA GEL G M
ERCK社製)上にスポットした。そして、クロロホルムと
メタノール、アセトン、酢酸混液（容量比９０：１０：
６：１）にて展開した。次に、この薄層板上で分離され
た各脂質部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルをそれ
ぞれガラスカラムに充填して、クロロホルムとメタノー
ルの混液で溶出し、各脂質が薄層クロマトグラム上で、
単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に、エバポ
レータで溶媒を留去して、トレハロース−６，６′−ジ
ミコレート、トレハロース−６−モノミコレート、グル
コース−６−モノミコレート、マンノース−６−ミコレ
ート、フルクトース−６−ミコレートを得た。これらの
詳細な構造については、上記特開平９−２５５５４９号
公報を参照されたい。
【００３０】次にこうして得られたミコール酸糖エステ
ルのうち、トレハロースー６，６´−ジミコレート（以
下ＴＤＭと称する。）について、正常ヒト表皮角化細胞
を用いた細胞増殖試験を行った。
ルのうち、トレハロースー６，６´−ジミコレート（以
下ＴＤＭと称する。）について、正常ヒト表皮角化細胞
を用いた細胞増殖試験を行った。
【００３１】〔正常ヒト表皮角化細胞増殖能〕正常ヒト
表皮角化細胞（倉敷紡績製）を、HuMedia−ＫＧ２培地
（倉敷紡績製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2存在下で
５〜７日間培養し、サブコンフルエントになったところ
で細胞増殖試験に用いた。細胞増殖試験は、９６wellマ
イクロプレートに、２.５×１０3cells／wellの密度で
正常ヒト表皮角化細胞を播種し、HuMedia−ＫＢ２培地
（倉敷紡績製）に抗菌剤（ゲンタマイシン５０μｇ／ml
及びアンフォテリシンＢ５０nｇ／ml）を添加した培地
に表１に示す量のＴＤＭ（１well当たり）を添加して、
６日間培養した。そして、培養開始３日経過後及び６日
経過後にcell中の細胞数を計測した。細胞数は、cell c
ounting kit（同仁化学製）を用いて、４５０ｎｍにお
ける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、予め
作成したおいた検量線によって求めた。その結果を表１
に示す。なお、表１には、ＴＤＭを加えない培地（コン
トロール）を１００とした場合における増殖率（％）で
示した。また、培養に使用したHuMdia−ＫＧ２培地中及
びHuMdia−ＫＢ２培地中のＣａ濃度はそれぞれ０.１５m
mol／mlであった。
表皮角化細胞（倉敷紡績製）を、HuMedia−ＫＧ２培地
（倉敷紡績製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2存在下で
５〜７日間培養し、サブコンフルエントになったところ
で細胞増殖試験に用いた。細胞増殖試験は、９６wellマ
イクロプレートに、２.５×１０3cells／wellの密度で
正常ヒト表皮角化細胞を播種し、HuMedia−ＫＢ２培地
（倉敷紡績製）に抗菌剤（ゲンタマイシン５０μｇ／ml
及びアンフォテリシンＢ５０nｇ／ml）を添加した培地
に表１に示す量のＴＤＭ（１well当たり）を添加して、
６日間培養した。そして、培養開始３日経過後及び６日
経過後にcell中の細胞数を計測した。細胞数は、cell c
ounting kit（同仁化学製）を用いて、４５０ｎｍにお
ける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、予め
作成したおいた検量線によって求めた。その結果を表１
に示す。なお、表１には、ＴＤＭを加えない培地（コン
トロール）を１００とした場合における増殖率（％）で
示した。また、培養に使用したHuMdia−ＫＧ２培地中及
びHuMdia−ＫＢ２培地中のＣａ濃度はそれぞれ０.１５m
mol／mlであった。
【００３２】
【表１】
【００３３】表１から分かるように、ＴＤＭを培地１we
ll当たり０．０１〜１μｇ（濃度換算０．０５〜５μｇ
／ｍｌ相当量）添加した場合に、細胞増殖促進効果が認
められた。
ll当たり０．０１〜１μｇ（濃度換算０．０５〜５μｇ
／ｍｌ相当量）添加した場合に、細胞増殖促進効果が認
められた。
【００３４】
【発明の効果】本発明のケラチノサイト増殖促進剤は、
一般細菌の培養と同様にして培養できる抗酸菌から容易
に入手でき、火傷や創傷などのヒトや動物の皮膚損傷に
対する治療薬の実用化に大きく貢献できる。特に、ＥＦ
ＧやＧＭ−ＣＳＦなどの入手困難である増殖因子の代用
として用いることができ、ＭＥＭ培地やＤ−ＭＥＭ培地
などの基本培地に添加して、培地中のＣａ濃度を調整す
るだけで細胞培養が行える。このように、本発明によれ
ば、新規かつ有効なケラチノサイト増殖促進剤並びにケ
ラチノサイト培養用組成物を容易かつ安価に提供でき
る。
一般細菌の培養と同様にして培養できる抗酸菌から容易
に入手でき、火傷や創傷などのヒトや動物の皮膚損傷に
対する治療薬の実用化に大きく貢献できる。特に、ＥＦ
ＧやＧＭ−ＣＳＦなどの入手困難である増殖因子の代用
として用いることができ、ＭＥＭ培地やＤ−ＭＥＭ培地
などの基本培地に添加して、培地中のＣａ濃度を調整す
るだけで細胞培養が行える。このように、本発明によれ
ば、新規かつ有効なケラチノサイト増殖促進剤並びにケ
ラチノサイト培養用組成物を容易かつ安価に提供でき
る。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
//(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 畑 智奈
大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号
株式会社クラブコスメチックス内
(72)発明者 中山 美紀
大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号
株式会社クラブコスメチックス内
(72)発明者 加藤 敬香
大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号
株式会社クラブコスメチックス内
Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BB10 BB15 BB28
CA44
4C086 AA01 AA02 EA03 MA01 MA04
MA17 MA22 MA28 MA32 MA63
NA14 ZA89 ZB22
4C087 AA01 AA02 BC17 CA11 CA37
MA17 MA22 MA28 MA32 MA63
NA14 ZA89 ZB22
Claims (6)
- 【請求項１】 単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステ
ルからなることを特徴とするケラチノサイト増殖促進
剤。 - 【請求項２】 前記脂肪酸がミコール酸であることを特
徴とする請求項１記載のケラチノサイト増殖促進剤。 - 【請求項３】 前記脂肪酸の炭素数が３０〜４０である
ことを特徴とする請求項１又は２の何れかに記載のケラ
チノサイト増殖促進剤。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３の何れかに記載の糖
エステルを含む抗酸菌より抽出された菌体抽出物からな
ることを特徴とするケラチノサイト増殖促進剤。 - 【請求項５】 請求項１〜４の何れかに記載のケラチノ
サイト増殖促進剤を含むことを特徴とするケラチノサイ
ト培養用組成物。 - 【請求項６】 請求項１〜４の何れかに記載のケラチノ
サイト増殖促進剤を含むことを特徴とする創傷治癒剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001244261A JP2003052366A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | ケラチノサイト増殖促進剤及びケラチノサイト培養用組成物並びに創傷治癒剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001244261A JP2003052366A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | ケラチノサイト増殖促進剤及びケラチノサイト培養用組成物並びに創傷治癒剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003052366A true JP2003052366A (ja) | 2003-02-25 |
Family
ID=19074224
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001244261A Pending JP2003052366A (ja) | 2001-08-10 | 2001-08-10 | ケラチノサイト増殖促進剤及びケラチノサイト培養用組成物並びに創傷治癒剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003052366A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020216281A1 (zh) * | 2019-04-24 | 2020-10-29 | 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
-
2001
- 2001-08-10 JP JP2001244261A patent/JP2003052366A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020216281A1 (zh) * | 2019-04-24 | 2020-10-29 | 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
| CN112218647A (zh) * | 2019-04-24 | 2021-01-12 | 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
| CN112218647B (zh) * | 2019-04-24 | 2023-07-04 | 辽宁天安生物制药股份有限公司 | 赤红球菌产品在治疗热损伤中的用途 |
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