JP2002528126A - 植物に除草剤抵抗性を付与するための遺伝子およびベクター - Google Patents
植物に除草剤抵抗性を付与するための遺伝子およびベクターInfo
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Abstract
Description
提出された、米国仮特許出願番号第60/106,239号の特典を請求する。
。その植物毒性から、除草剤は、望ましい植物の成長および収量をも死滅または
かなり阻害する。
psis)は、特定の除草剤に対する抵抗性を本来有するか、または、同じ作用
機序をもつ除草剤に繰返し曝露されると、抵抗性を発達させる。除草剤に抵抗性
を付与する植物遺伝子を同定、単離およびクローニングし、これらの遺伝子を使
用して、穀物などの望ましい植物を形質転換して、それらを除草剤抵抗性とする
ことが、植物生物工学研究者の目標である。
、米国特許第5,719,046号、第5,633,444号および第5,59
7,717号は、植物スルホンアミド抵抗性遺伝子、並びに、増殖がスルホンア
ミドにより阻害される植物細胞を、この遺伝子を含むベクターで形質転換する方
法を開示する。
開示する。この方法は、異種DNAを、懸濁培養液中のC型胚小麦カルスに、パ
ーティクル銃法により送達することを含む。
ルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを開示する。この特許は、アセチ
ル−CoAのカルボキシル化触媒能を有する、除草剤抵抗性ポリペプチドをコー
ドするDNA分子で、植物を形質転換することを含む、単子葉植物の除草剤抵抗
性を増加させるプロセスを開示する。この特許は、産生されたトランスジェニッ
ク植物が、アリールフェノキシプロピオネートおよびシクロヘキサンジオンなど
の除草剤に抵抗性であることをさらに開示する。
この特許は、イミダゾリノンおよびスルホンアミドなどの除草剤に抵抗性である
植物細胞系を単離するための、in vitroでの細胞培養法の使用を記載する。
の除草剤抵抗性の付与に関連して関心を集めている1つのかかる酵素は、アセト
ヒドロキシ−酸シンターゼ(「AHAS(acetohydroxy-acid synthase)」)であ
り、これはアセトラクテートシンターゼ(「ALS(acetolactate synthase)」
、E.C.4.1.3.18)としても知られる。それは植物および多くの微生
物に必須の酵素であり、大半の植物においてこの酵素は除草剤に感受性である。
AHAS酵素は、分枝鎖アミノ酸、イソロイシン、ロイシン、およびバリンの生
合成の第一段階を触媒し、その活性は、これらのアミノ酸によりアロステリック
に阻害される。AHAS活性はまた、イミダゾリノン化合物、例えば、imaz
ethapyr(PURSUIT(登録商標)、アメリカン・シアナミッド、P
arsipanny、NJ);スルホニル尿素をベースとした化合物、例えば、
スルホメツロンメチル(OUST(登録商標)、E.I.du Pont de
Nemours and Company、ウィルミントン、DE);トリア
ゾロピリミジンスルホンアミド(Broadstrike(登録商標)Dow
Elanco;Gerwickら、Pestic.Sci.29:357〜36
4、1990参照);スルファモイル尿素(Rodawayら、水稲、小麦およ
び大麦における、Ac322,140の選択的機序、Proc.Brighto
n Crop Protec.Conf.、Weeds、1993);ピリミジ
ル−オキシ−安息香酸(STABLE(登録商標)、Kumiai Chemi
cal Industry Co.、E.I.du Pont de Nemo
urs and Company)、およびスルホニルカルボキシアミド(Al
varadoら、米国特許第4,883,914号)を含む、数種類の除草剤に
より阻害される。AHAS活性の阻害により、植物は分枝アミノ酸を作成できな
くなったり、または毒性代謝物が蓄積し、それ故植物が死滅することがある。
フス菌から単離されている。米国特許第5,643,779号は、ラクトコッカ
ス属に由来するα−AHAS酵素をコードする核酸配列、および、微生物を形質
転換するためのそれを含むベクターを開示する。トランスジェニック微生物は、
増大量のAHAS酵素を産生する。
tus由来のAHASの大および小サブユニットの核酸配列を開示する。遺伝子
配列を使用して、光合成微生物を形質転換し、アミノ酸の合成のためにAHAS
酵素の産生を向上させる。
ードする遺伝子が、酵母サッカロミセス・セルビシエで同定されている。様々な
植物に由来するAHASの変異大サブユニットをコードする遺伝子も単離され、
クローニングされ、除草剤に抵抗性のトランスジェニック植物を作成するのに使
用されている。
870号および第5,378,824号は、除草剤抵抗性に関連した、変異植物
ALSタンパク質をコードする核酸断片を開示する。変異ALS大サブユニット
タンパク質は、植物に、スルホニル尿素化合物に対する除草剤抵抗性を付与する
。この変異大サブユニットタンパク質をコードする核酸断片は、通常スルホニル
尿素除草剤に感受性である植物を形質転換するために、ベクター中に使用される
。かかる形質転換から生じるトランスジェニック植物は、スルホニル尿素除草剤
に抵抗する。
された大サブユニット遺伝子および酵素を開示し、これは、植物、植物組織およ
び種子に、数個の構造的に関連していない種類の除草剤に抵抗性を付与する。こ
の特許は、AHAS活性を普通に阻害する除草剤を開示する。
。WO第96/33270号、米国特許第5,853,973号および第5,9
28,937号は、イミダゾリンなどの除草剤およびAHAS阻害除草剤に対し
て、選択的に増加した抵抗性を示すものを含む、AHAS変異体の調製のための
、構造をベースとしたモデリング法を開示する。この文書は、かかる変異体をコ
ードする単離DNA、これらのDNAを含むベクター、変異体ポリペプチドの産
生法、および特異的AHAS遺伝子変異を含む除草剤抵抗性植物を開示する。
サブユニットとして存在する。原核生物では、2つのポリペプチドである「大サ
ブユニット」および「小サブユニット」は、別々の遺伝子から発現される。I、
II、IIIと称される、全て大および小サブユニットをもつ、3つの主要なA
HAS酵素が、腸内細菌において同定されている。原核生物では、AHAS酵素
は、分枝アミノ酸生合成経路の調節酵素であることが示されており(Mifli
n,B.J.、Arch.Biochm.Biophys.146:542〜5
50、1971)、大サブユニットのみが、触媒活性を有することが観察されて
いる。微生物系に由来するAHAS酵素の研究から、2つの役割が小サブユニッ
トについて記載されている。1)小サブユニットは、イソロイシン、ロイシンま
たはバリンまたはその組合せの存在下にある場合に、触媒大サブユニットのアロ
ステリックフィードバック阻害に関与する。2)小サブユニットは、イソロイシ
ン、ロイシンまたはバリンの非存在下で、大サブユニットの活性を増強する。小
サブユニットはまた、大サブユニットの活性コンフォメーションの安定性を増加
させることが示されている(Weinstockら、J.Bacteriol.
174:5560〜5566、1992)。小サブユニットの発現はまた、大腸
菌に由来するAHASIに見られるように、大サブユニットの発現も増加できる
(Weinstockら、J.Bacteriol.174:5560〜556
6、1992)。
イシン、ロイシンまたはバリンによりフィードバック阻害できない、基底活性レ
ベルを示す。小サブユニットが、大サブユニットを含む同反応混合物に添加され
ると、大サブユニットの比活性は増加する。
物の形質転換に使用されている。557位のトリプトファンがロイシンで置換さ
れた、AHAS3大サブユニットタンパク質のAHAS変異対立遺伝子イソタイ
プは、Brassica napus細胞系に見出されている(Hattori
ら、Mol.&Gen.Genet.246:419〜425、1995)。こ
の遺伝子の変異タンパク質産物は、スルホニル尿素、イミダゾリノン、およびト
リアゾロピリジン抵抗性を細胞系に付与する。この変異対立遺伝子はまた、トラ
ンスジェニック植物に発現されると、これらの除草剤に対する抵抗性を付与する
。
子も同定されている(Planta 196:64〜68、1995)。遺伝子
のcsr1−4は、クロロスルフロン、イマザピル、およびトリアゾロピリミジ
ンに抵抗性である、動態学の変化したAHAS酵素をコードする。csr1−4
遺伝子は、植物で発現されると、添加されたL−バリンおよびL−ロイシンに応
答して、植物の生長に影響を及ぼす。
接的な証拠が全くなかった。近年、他のグループが、発現配列タグ(EST;exp
ressed sequence tag)の使用により、真核生物である植物アラビドプシスにお
いて、微生物AHAS小サブユニット遺伝子に相同的な配列を同定した。彼らは
、無作為に単離したアラビドプシスcDNA配列が、微生物系に由来するAHA
S小サブユニット配列と、配列相同性を有することを示した。それ以来、酵母お
よび紅藻などの他の真核生物に由来する、小サブユニットからのESTが記載さ
れている(Duggleby1997、Gene 190:245)。Dugg
lebyは、既知の原核生物小サブユニット遺伝子配列に相同性を有する、3つ
のEST配列(2つはアラビドプシスから、1つはコメから)を開示する。
をスクリーニングするための、Nicotiana plumbaginifo
lia由来のALS小サブユニットcDNA配列の使用を開示する。しかし、本
発明以前には、真核生物AHAS小サブユニットタンパク質の遺伝子の完全なゲ
ノム配列は決定されておらず、また、真核生物AHAS小サブユニットタンパク
質も、アラビドプシスから産生または単離されていなかった。
よびその機能的変異体をコードする、DNA配列を提供する。本発明により、ア
ラビドプシスAHAS小サブユニット遺伝子がクローニングされ、配列決定され
た。真核生物AHAS小サブユニットタンパク質をコードするDNA配列を含む
発現ベクターが、植物の形質転換用に提供される。AHASタンパク質またはタ
ンパク質群の大および小サブユニットの両方をコードする遺伝子を含む、発現ベ
クターも提供される。ベクターは、小麦、大麦、コメ、サトウキビ、綿花、トウ
モロコシ(corn)、大豆、砂糖大根、カノーラ等を含む、単子葉および双子葉植物
などの、所望のトランスジェニック植物の産生法に使用され得る。かくして産生
されたトランスジェニック植物は、イミダゾリノンなどの特定の除草剤に対して
耐性レベルが上昇する。
を含む、DNAベクターの構築法に関する。本発明のベクターは、広範囲の植物
の形質転換に適切であり、また、AHAS大サブユニットタンパク質をコードす
るDNA配列を含むように操作し得る。
またはメイズ(トウモロコシ; maiz)に由来する遺伝子を含むベクターを使用して
、イミダゾリノン耐性植物を形質転換して、第二機序による除草剤抵抗性を増強
できる。
質をコードするDNA配列、並びに、植物において協調的に調節される発現系と
しての、AHASの大および小サブユニットのプロモーターを含む、発現ベクタ
ーが提供される。
葉AHAS小サブユニット遺伝子およびプロモーターを使用することが好ましく
あり得る。これらの遺伝子は、イミダゾリノンまたは他のAHAS阻害除草剤に
対する除草剤抵抗性を示す、トランスジェニック単子葉植物の開発を含む適用に
有用である。
ルの耐性または抵抗性を示す、トランスジェニック穀物植物の創製法に関する。
この方法は、AHAS大サブユニット遺伝子およびAHAS小サブユニット遺伝
子の除草剤抵抗性変異体を含むプラスミドベクターなどのDNA構築物を、イミ
ダゾリノンに対して通常感受性であるかまたは部分的に抵抗性である植物に導入
することを含む。一旦ベクターが、植物組織に導入されると、ベクターは植物の
内在性機序を使用して、大および小サブユニットタンパク質を発現する。外来性
のAHAS酵素の大サブユニットおよび小サブユニットの産生の増加により、植
物に、増強したイミダゾリノン抵抗性が付与される。このイミダゾリノン抵抗性
の増加は、触媒活性、安定性、分解に対する抵抗性、または、植物中の増加量の
小サブユニットタンパク質の存在下での、大サブユニットタンパク質の阻害に対
する抵抗性の増加の結果である。
ット遺伝子は、単一のプラスミド上に存在し、これは、一体として、形質転換植
物のゲノムに組込まれ、除草剤抵抗性穀物のより簡単な育種のために単一の遺伝
子座として分離する。
モーターに作動可能に連結され、それから発現される、単一の遺伝子に融合され
た、除草剤抵抗性大AHASサブユニット遺伝子および小AHASサブユニット
タンパク質遺伝子を含む。
除草剤の新規標的部位として使用したり、または、大サブユニットと組合せて使
用して、大サブユニットの推定的阻害剤をスクリーニングすることができる。
めの、スクリーニング手段として、小サブユニットDNA配列を利用する方法に
も関する。本発明のこの態様において、AHASの大および小サブユニットを同
時に発現する生物を、植物に除草剤に対する抵抗性を付与する変異についてスク
リーニングする。変異遺伝子産物を、単離して、イミダゾリノンを含む除草剤の
効果についてin vivoで試験する。次いで、変異除草剤抵抗型を単離する。
ローニングおよび配列決定に関する。配列表の配列番号1は、アラビドプシスA
HAS小サブユニットcDNAのヌクレオチド配列を含む。コードされたAHA
S小サブユニットポリペプチドの対応するアミノ酸配列は、配列表の配列番号2
に示す。アラビドプシスAHAS小サブユニット遺伝子のゲノムDNA配列は、
配列表の配列番号3に示す。
小サブユニットタンパク質をコードする、単離DNA配列に関する。特に、本発
明は、アラビドプシスなどの双子葉植物、或いはライスまたはメイズなどの単子
葉植物から得ることができる、植物AHAS小サブユニットタンパク質をコード
するDNA配列に関する。
NAベクター構築物に使用して、イミダゾリノンなどの除草剤に通常感受性であ
るかまたは部分的に抵抗性である、穀物植物を形質転換できる。形質転換後に得
られたトランスジェニック植物は、イミダゾリノンなどのAHAS阻害除草剤に
対する抵抗性の増加を示す。
胞を形質転換できる。形質転換細胞は完全な植物体へと再生でき、よって、遺伝
子が無傷植物に発現されると、トランスジェニック植物に除草剤抵抗性を付与す
る。
を形質転換し得、これにより創製された植物は、除草剤、特にイミダゾリノンに
対して増強した抵抗性を有する。AHAS小サブユニットタンパク質をコードす
るDNA配列は、植物への除草剤抵抗性の付与において、単独で、またはAHA
S酵素の大サブユニットをコードするDNA配列と組合せて、ベクター中に使用
し得る。
タンパク質をコードするDNA配列を含む、植物発現ベクターに関する。発現ベ
クターに使用する真核生物プロモーターは、アラビドプシスAHAS小サブユニ
ットプロモーターなどの、高発現レベルの植物プロモーターとする。発現ベクタ
ーに好ましくは使用するAHAS小サブユニット遺伝子配列は、アラビドプシス
小サブユニットタンパク質をコードするDNA配列である。
大サブユニットのプロモーター;真核生物AHASタンパク質の大サブユニット
をコードするDNA配列;AHASタンパク質の小サブユニットのプロモーター
;および真核生物AHASタンパク質の小サブユニットをコードするDNA配列
を含む。
物発現ベクターは、植物プロモーター、並びに、真核生物AHASタンパク質の
大サブユニットおよび小サブユニットを含む融合タンパク質をコードするDNA
配列を含む。
ブユニットプロモーター、および、アラビドプシス小サブユニットAHASタン
パク質をコードするDNA配列を含む。
ター;トランジットAHAS大サブユニットポリペプチドをコードするDNA配
列;野生型の成熟AHAS大サブユニットタンパク質または変異体をコードする
DNA配列;リンカーポリペプチド転写物をコードするDNA配列;成熟真核生
物AHAS小サブユニットタンパク質をコードするDNA配列;および植物ター
ミネーター配列を連続的に含む。この実施形態において、プロモーター、移行(t
ransit)AHAS大サブユニットタンパク質をコードするDNA配列、および、
成熟AHAS大サブユニットタンパク質をコードするDNA配列は、好ましくは
、双子葉植物、特にアラビドプシスに由来する。別に、プロモーター、移行AH
AS大サブユニットタンパク質をコードするDNA配列、および、成熟AHAS
大サブユニットタンパク質をコードするDNA配列を含み得る、植物発現ベクタ
ーは、メイズなどの単子葉植物から得られる。
ター、真核生物AHASタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを含
む融合タンパク質をコードするDNA配列を含む。
などの、遺伝子発現を増強するためのDNA配列を含む。本発明のこの態様にお
いて、植物発現ベクターは、AHAS遺伝子発現を調節するためのDNA配列を
含む。イントロン配列はまた、メイズAdh1イントロンおよびshrunke
nt−1遺伝子座由来の第一イントロンなどのイントロン由来の異種イントロン
配列であり得る。さらに、遺伝子発現を増強するためのDNA配列は、タバコモ
ザイクウイルス由来のW配列などのリーダー配列であり得る。
する。AHAS小サブユニットタンパク質は、配列表の配列番号2に対応するア
ミノ酸配列を有する。このタンパク質は、例えば、アラビドプシスから精製でき
、組成物中に使用し得る。また、この遺伝子を使用して、大腸菌などの微生物中
でアラビドプシス小サブユニットタンパク質を発現でき、大腸菌の抽出物から精
製できる。
するDNA配列を含む植物発現ベクターで形質転換することを含む、除草剤に抵
抗性のトランスジェニック植物を創製する方法に関する。
パク質の大サブユニットをコードするDNA配列を含む、第一植物発現ベクター
、並びに、第二植物発現プロモーターおよび真核生物AHASタンパク質の小サ
ブユニットをコードするDNA配列を含む第二植物発現ベクターで同時形質転換
することを含む、植物細胞に、除草剤抵抗性を付与する方法に関する。
Sタンパク質またはその変異体または変異体をコードするDNA配列で形質転換
することを含む、AHAS大サブユニットタンパク質またはその変異体または変
異体をコードする遺伝子を発現する、トランスジェニック植物の除草剤抵抗性を
増強する方法に関する。
Sタンパク質の大サブユニットの除草剤抵抗性変異体をコードする配列、並びに
真核生物AHASタンパク質の小サブユニットをコードするDNA配列を含むト
ランスジェニック植物と植物とを交雑させ;除草剤抵抗性を示す子孫植物を選択
することを含む、植物の子孫植物の除草剤抵抗性を増強する方法に関する。
子孫に関し、この植物は、イミダゾリノンおよび他の除草剤に対する抵抗性の上
昇を示す。
物AHASタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを含む融合タンパ
ク質をコードするDNA配列、並びに植物細胞で機能するターミネーター配列を
含む、植物で発現可能な遺伝子を含む、トランスジェニック植物に関する。
する方法であって、生物を除草化合物に曝露することを含み、この生物は、AH
AS小サブユニットタンパク質遺伝子を含む異種ベクターを有する。この実施形
態の別の態様において、異種ベクターは、AHAS大および小サブユニット遺伝
子を含み得る。この方法は、変異形のAHAS酵素に対する、除草剤の効果を試
験するためのスクリーニング系としても有用である。
植物AHAS遺伝子(群)中の変異を同定する方法にも関する。AHAS大また
は小サブユニット遺伝子における、酵素のフィードバック特徴を変化させる変異
を使用して、植物中のアミノ酸レベル、特に分枝鎖アミノ酸レベルを変化させる
。この方法は、AHAS酵素活性の欠損した微生物株を、変異植物AHAS小サ
ブユニット遺伝子を含むプラスミド発現ベクターで形質転換することを含む。A
HAS活性の欠失した適切な微生物株は、大腸菌MI262である。変異AHA
S大および小サブユニット遺伝子は、無作為に作成できるか、または、以前に記
載された方法を使用して(Ottら、J.Mol.Biol.263:359〜
368、1996)、タンパク質構造モデルから合理的に設計できる。一旦微生
物株が形質転換されると、1または2つで、3つではない分枝鎖アミノ酸の存在
下で、最小培地中でスクリーニングし、次いで、最小培地中で増殖する微生物株
を同定する。
を使用して、植物または細菌細胞に取込むことができる。植物を形質転換された
植物細胞から成長させ、第二世代植物を、トランスジェニック植物の種子から得
ることができる。別に、植物の形質転換用のベクターは、発現可能なAHAS小
サブユニットタンパク質遺伝子を含む、組換え植物ウイルスベクターであり得る
。この実施形態において、ウイルスベクターは、標的穀物植物を全体的に感染で
き、宿主のゲノムを破壊することなく、宿主植物中でAHAS小サブユニットタ
ンパク質を発現できる。
る。本発明のこの態様において、AHAS小サブユニットプロモーター配列を使
用して、異種ポリペプチドを発現できる。別に、AHAS小および大サブユニッ
トプロモーターはまた、協調的に調節された遺伝子系として使用して、異種マル
チサブユニットタンパク質を発現、または単一遺伝子を過剰発現できる。
GenBankでP_12197と称される、推定シロイナズナ(Arabidopsis thaliana)の小サブユニットタンパク質のEST配列を使用して、完全なAHA
S小サブユニット遺伝子をクローニングした。合成ポリメラーゼ連鎖反応(PC
R)プライマーを、GenBankに寄託されたAHAS小サブユニットEST
配列に対応する、アラビドプシスの推定AHAS小サブユニットDNA配列に対
応するように特別に設計した。プライマーは、標準的な技法を使用して合成した
(米国特許第4,683,202号;Sambrookら、分子クローニング第
2版、コールドスプリングハーバー)。
した。EST配列から設計したプライマーは、アラビドプシスcDNA断片を増
幅できた。この断片を、標準的な技法を使用して、インビトロゲンTAベクター
(インビトロゲン製造番号K2000−01)にクローニングした。このクロー
ンは、pDGR102と命名され、EST配列の一部を含む450塩基対断片に
相当した。
ラリーから断片を増幅した。これにより、AHAS小サブユニット遺伝子がライ
ブラリーに存在することが確認された。pDGR102内に特異的な正鎖プライ
マー、およびλ:yesファージミドベクターにハイブリッドする逆プライマー
を使用して、小サブユニット遺伝子の3’ハーフを示す断片を、鋳型源としてア
ラビドプシス全cDNAライブラリーを使用して、PCRにより増幅した。この
約800塩基の産物を、インビトロゲンTAベクター(インビトロゲン、製造番
号K2000−01)にクローニングし、クローンpDGR106と命名した。
クローンpDGR106も配列決定され、その翻訳されたアミノ酸配列により、
断片は、既知の原核生物小サブユニット遺伝子配列に対する相同性により、小サ
ブユニット遺伝子の3’半分を示すことが確認された。この断片は、停止コドン
および3’フランキングポリA尾部を含んだ。
ト遺伝子の5’領域および3’ハーフをそれぞれ示すことが判明し、そのDNA
配列は、約188bp重複した。重複領域に位置する独特なSspI制限酵素部
位を使用して、切断し、共に断片を結合し、ほぼ全長のAHAS小サブユニット
遺伝子を再構築した(N末端遺伝子の一部は依然として欠失していた)。得られ
たクローンはpDGR115とラベルした。
号18374−058)、アラビドプシスAHAS小サブユニット遺伝子の5’
末端のシークエンスを完了した。pDGR115配列から設計されたプライマー
を使用して、小サブユニット遺伝子をクローニングし、その5’末端まで配列を
伸長した。アラビドプシス実生から抽出した全RNAを鋳型として使用した。配
列は、650塩基対伸長され、N末端メチオニン残基の推定開始コドンを同定し
た。確立された全長配列を使用して、全長cDNAクローンを作成した。
ビドプシスゲノムλライブラリーのスクリーニングにより得られた。ライブラリ
ーをスクリーニングするために、380bpのプローブを、5’領域の小サブユ
ニットcDNA位配列のPCR増幅により作成した。PCR産物は、プライマー
;5’−CAGAGATCATGTGGCTAGTTGA−3’(配列表の配列
番号4)および5’−GAGCGTCGAGAATACGATGTAC−3’(
配列表の配列番号5)の使用により得られた。380塩基対のPCR産物を、イ
ンビトロゲンTAクローニングベクターにクローニングした。プローブを標識す
るために、PCR挿入断片を、EcoRIで切出し、ランダムにプライムするこ
とにより、α−32PdCTPで標識した。ライブラリーのスクリーニングは、慣
用的な方法により、ナイロン膜上で実施した。プローブにハイブリッドしたλフ
ァージを同定および単離した。λファージDNAを抽出し、SalIで消化し、
断片をpUC19にクローニングした。小サブユニットcDNA配列に特異的な
プライマーを、様々なクローニングSalIゲノム断片と共に、シークエンス反
応に使用し、小サブユニット遺伝子を含むクローンを同定した。5.6kbのS
alI断片内にAHAS小サブユニット配列を含むクローンを同定し、これは、
図1のpMSg6プラスミド内に示す。プロモーター領域、移行配列、小サブユ
ニット遺伝子の成熟コード配列、イントロン、および、翻訳ターミネーターを、
4.9kbのゲノム断片を配列決定することにより同定した。
。小サブユニット遺伝子のcDNAは、491アミノ酸のポリペプチドをコード
する。
地図である。図2に示したように、および配列表の配列番号3を参照すると、こ
の遺伝子は、ヌクレオチド番号1〜ヌクレオチド757番目におよぶプロモータ
ーを含む。遺伝子の開始コドンは、ヌクレオチド758〜760番目に対応する
。遺伝子は、11のイントロンおよび12のエキソンを含む。エキソン1は、ヌ
クレオチド758〜ヌクレオチド1006番目におよぶ。イントロン1は、ヌク
レオチド1007〜ヌクレオチド1084番目におよぶ。エキソン2は、ヌクレ
オチド1085〜ヌクレオチド1300番目におよぶ。イントロン2は、ヌクレ
オチド1301〜ヌクレオチド1455番目におよぶ。エキソン3は、ヌクレオ
チド1456〜ヌクレオチド1534番目におよぶ。イントロン3は、ヌクレオ
チド1535〜ヌクレオチド1659番目におよぶ。エキソン4は、ヌクレオチ
ド1660〜ヌクレオチド1731番目におよぶ。イントロン4は、ヌクレオチ
ド1732〜ヌクレオチド2236番目におよぶ。エキソン5は、ヌクレオチド
2237〜ヌクレオチド2320番目におよぶ。イントロン5は、ヌクレオチド
2321〜ヌクレオチド2486番目におよぶ。エキソン6は、ヌクレオチド2
487〜ヌクレオチド2640番目におよぶ。イントロン6は、ヌクレオチド2
641〜ヌクレオチド2910番目におよぶ。エキソン7は、ヌクレオチド29
11〜ヌクレオチド2998番目におよぶ。イントロン7は、ヌクレオチド29
99〜ヌクレオチド3284番目におよぶ。エキソン8は、ヌクレオチド328
5〜ヌクレオチド3389番目におよぶ。イントロン8は、ヌクレオチド339
0〜ヌクレオチド3470番目におよぶ。エキソン9は、ヌクレオチド3471
〜ヌクレオチド3592番目におよぶ。イントロン9は、ヌクレオチド3593
〜ヌクレオチド3891番目におよぶ。エキソン10は、ヌクレオチド3892
〜ヌクレオチド4042番目におよぶ。イントロン10は、ヌクレオチド404
3〜ヌクレオチド4285番目におよぶ。エキソン11は、ヌクレオチド428
6〜ヌクレオチド4351番目におよぶ。イントロン11は、ヌクレオチド43
52〜ヌクレオチド4647番目におよぶ。エキソン12は、ヌクレオチド46
48から、ヌクレオチド4737番目の停止コドンにおよぶ。転写ターミネータ
ーは、ヌクレオチド4737番目の停止コドンとヌクレオチド4895の間のD
NA区分に位置する。
トタンパク質のアミノ酸配列は、原核生物由来のAHAS小サブユニットタンパ
ク質のアミノ酸配列に高い相同性を有する。相同性は、原核生物のAHAS小サ
ブユニット配列の保存領域において特に高い。例として、本発明のアラビドプシ
スAHAS小サブユニット遺伝子配列は、枯草菌の小サブユニット遺伝子の配列
に対して、42.5%の配列同一性を示した。これにより、ゲノムクローンのD
NA配列は、アラビドプシスAHAS小サブユニットの配列であることが示され
た。
enbankEST配列の位置を示す。両方のEST配列が、以前に、微生物A
HAS小サブユニット遺伝子に対して相同性を有すると同定され、これにより、
アラビドプシスに2つのイソ酵素が存在することが示唆された。P_12197
からのEST配列を使用して、本発明のAHAS小サブユニットcDNAおよび
ゲノムクローンをクローニングした。完了したAHAS配列の解析により、この
遺伝子は、既知のAHAS小サブユニットに相同性を有する、2つの反復アミノ
酸配列をコードすることが示された。AHAS遺伝子配列は、単一のポリペプチ
ド内に直列に並んでいる。AHAS小サブユニット遺伝子配列を、元の2つのE
STと比較した後に、2つのESTは、同じ遺伝子の一部であり、各々が、各反
復配列内の類似領域に対応すると決定された。
ニングに使用した。アラビドプシスゲノムライブラリー−アラビドプシスゲノム
ライブラリーは、クロンテックから得た。
異体を含む、AHAS小サブユニット遺伝子を含むDNA分子を、適切な向きで
および正しい読み枠内の適切な異種発現ベクター系に挿入できる。プラスミド、
バクテリオファージウイルスおよび他の修飾ウイルスなどの数多くのベクター系
を、本発明の実践に使用できる。適切なプラスミドベクターは、pBR322、
pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pBI122、pKC37、p
KC101およびTAクローニングベクターを含むがこれに限定されない。λg
t10、λgt11およびシャロン4などのウイルスベクターも使用できる。
ターの構築 本発明において、AHAS小サブユニットcDNA配列を、ファルマシアから
得た、pGEX−2TまたはpGEX−4T−2大腸菌発現ベクターに挿入した
。AHAS小サブユニット遺伝子配列を含む、5つの異なるDNA断片を、pG
EX−2TまたはpGEX−4T−2発現ベクターにクローニングした。これら
のクローンを、F1、F2、F3、pHUWE82、およびpHUWE83と称
し、これらは全て、発現ベクター内に含まれるコード配列の量が異なる。プラス
ミドF1、F2およびF3は、pGEX−4T−2大腸菌発現ベクターにAHA
S小サブユニットcDNAを含み、以下の例2により詳細に記載する。プラスミ
ドpHUWE82およびpHUWE83中のAHAS小サブユニットcDNAは
、pGEX−2R大腸菌発現ベクターにクローニングした。pHUWE82ベク
ターは、ほぼ全長のアラビドプシスASAS小サブユニット遺伝子を含んだ(最
初の3つのアミノ酸は含まない)。pHUWE83は、推定トランジット配列を
含まない小サブユニット遺伝子を発現するように操作した(最初の98のアミノ
酸は含まない)。プラスミドpHUWE82およびpHUWE83の地図は、そ
れぞれ図3および4に示す。小サブユニット遺伝子の変形が、グルタチオントラ
ンスフェラーゼ/AHAS小サブユニット融合タンパク質として大腸菌に発現さ
れる。融合タンパク質をアフィニティー精製した後、それぞれのタンパク質をト
ロンビンで切断する。5つのアミノ酸のトロンビン切断部位、すなわち、Leu
−Val−Pro−Arg−Gly−Ser−(配列表の配列番号6)の取込み
、および、プロテアーゼ開裂位置のために、追加のグリシンおよびセリン残基が
、小サブユニットタンパク質のN末端上に維持される。得られたpHUWE82
由来のAHAS小サブユニットタンパク質は、N末端配列Gly−Ser−Il
e−Ser−Val−Ser(配列表の配列番号7;最初の3つのアミノ酸Me
t−Ala−Alaは、ベクターに取込まれなかった)を有し、pHUWE83
由来のタンパク質は、N末端配列Gly−Ser−Met−Ile−Asn−A
rg(配列表の配列番号8;最初の98のアミノ酸は、ベクターに取込まれなか
った)を有する。pHUWE82およびpHUWE83の両方において、N末端
配列アミノ酸Gly−Ser−は、トロンビン開裂部位の残りである。
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用して任意のベクターに挿入する。ベクターの選択は、好ましい形質転換技法お
よび形質転換する標的植物種に依存する。好ましい実施形態において、AHAS
小サブユニット遺伝子は、高発現レベルの植物プロモーターの後にクローニング
でき、次いで、この構築物を、すでにトランスジェニックである植物に、または
、大サブユニットタンパク質の除草剤抵抗性変異対立遺伝子で形質転換すべき植
物に導入できる。このように、除草剤抵抗性遺伝子の効力は、大サブユニットタ
ンパク質の安定化または活性化により増強し得る。この方法は、任意の植物種に
適用し得るが、重要な穀物に適用された場合に最も利点がある。
分野に記載されている。例えば、外来DNAを、腫瘍誘導性(Ti)プラスミド
ベクターを使用して植物に導入できる。外来DNA送達に利用される他の方法は
、PEG媒介プロトプラスト形質転換、電気穿孔法、マイクロインジェクション
ホイスカー、および直接的DNA取込みのための微粒子銃すなわちマイクロプロ
ジェクタイル衝撃の使用を含む。前記方法は当分野で公知である。(Vasil
らの米国特許第5,405,765号;Bilangら(1991)Gene1
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sbach編)Academic出版社(1988)および植物分子生物学の方
法(SchulerおよびZielinski編)Academic出版社(1
989)。形質転換法は、形質転換すべき植物細胞、使用するベクターの安定性
、遺伝子産物の発現レベルおよび他のパラメータに依存する。
えば、切断短縮配列、ヌクレオチド置換または他の修飾を使用し得る。遺伝子発
現を増強させるためのDNA配列は、植物発現ベクターにも使用し得る。これら
は、メイズAdh1のイントロン、イントロン1遺伝子(Callisら、Ge
nes and Development1:1183〜1200、1987)
、およびリーダー配列、タバコモザイクウイルス(TMV)由来の(W−配列)
、メイズChlorotic Mottleウイルスおよびアルファルファモザ
イクウイルスを含む(Gallieら、Nucleic Acid Res.1
5:8693〜8711、1987およびSkuzeskiら、Plant M
olec.Biol.15:65〜79、1990)。メイズのshrunke
nt−1遺伝子座からの第一イントロンが、キメラ遺伝子構築物における遺伝子
の発現を増加させることが示された。米国特許第5,424,412号および第
5,593,874号は、遺伝子発現構築物における特定のイントロンの使用を
開示し、Gallieら(Plant Physiol.106:929〜93
9、1994)はまた、イントロンが、組織特異的な遺伝子発現の調節に有用で
あることを示した。AHAS小サブユニット遺伝子発現をさらに増強または最適
化するために、本発明の植物発現ベクターはまた、マトリックス付着領域(MA
R)を含むDNA配列も含み得る。次いで、かかる修飾発現系で形質転換された
植物細胞は、AHAS小サブユニット遺伝子の過剰発現または構成的発現を示し
得る。
ためには、プロモーターが発現ベクター中に存在しなければならない。使用する
宿主細胞系に応じて、多くの適切なプロモーターのいずれか1つを使用できる。
適切なプロモーターは、ユビキチン、nosプロモーター、小サブユニットリブ
ロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、小サブユニットクロロフ
ィルA/B結合ポリペプチドプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの3
5Sプロモーター、AHAS大および小サブユニットプロモーター、(OCS)
3MAS、並びに植物および植物ウイルスから単離されたプロモーターを含む、
高発現レベルの植物プロモーターとする。C.E.Vallejosら、「RR
NA(45S)に相同的な配列を含むDNA制限断片、主要なクロロフィルA/B
結合ポリペプチドおよびリブロース二リン酸カルボキシラーゼ遺伝子の、トマト
ゲノムにおける位置」Genetics112:93〜105(1986)。植
物の形質転換に適切な別のプロモーターは、アクチンプロモーターである。本発
明の好ましいプロモーターは、AHAS小サブユニット遺伝子配列と共に使用す
るためのAHAS小サブユニットプロモーターである。次いで、発現ベクターを
使用して植物細胞を形質転換できる。形質転換に適した他の植物組織は、葉組織
、根組織、分裂組織、カルスなどの培養植物細胞、およびプロトプラストを含む
。
て、AHAS小サブユニット遺伝子の転写に使用するプロモーターは、強力な植
物プロモーターとする。植物中のAHAS小サブユニット遺伝子の天然プロモー
ターを、トランスジェニック植物におけるAHAS小サブユニットタンパク質遺
伝子の発現に使用し得る。小サブユニット遺伝子プロモーターはまた、異種遺伝
子を発現するためにベクターで使用できる。AHAS小サブユニットプロモータ
ーは、AHAS大サブユニット遺伝子のプロモーターと共にベクターで使用でき
る。これらのプロモーターは、単一の多量体タンパク質の2つのサブユニットを
コードする2つの遺伝子の転写を駆動するが、これは、協調的に調節されたプロ
モーターとして使用し得る。例えば、両方のプロモーターが、特定の時間または
分裂組織などの特定の組織で同時にアップレギュレートされ得る。2つの異なる
が、同時に活性であるプロモーターの利点は、それらが同時抑制されにくいこと
である。同時抑制は、類似した配列をもつ2つの遺伝子が、形質転換生物内に存
在する場合に起こり得る。同時抑制は、同レベルの遺伝子の発現のサイレンシン
グを引き起こす。
ターは、類似配列間の組換えを受け得、よって一方または両方の遺伝子が不活性
化される。同時調節される異なるプロモーターの使用により、組換えの問題なく
、2つの遺伝子の発現が可能となり得、多量体タンパク質の発現が容易となり得
る。
できる。第一に、大および小サブユニット遺伝子は、互いに協奏的に物理的に接
触して作用するポリペプチドをコードし、2つの遺伝子は、発現時に協調的に調
節され得る。大および小サブユニットプロモーターの両方を有することにより、
他の多量体タンパク質の発現、または2つの異なるプロモーターからの同じ遺伝
子の過剰発現が可能となり得る。これは、同じプロモーターで2つの遺伝子を発
現することにより、相同的プロモーター配列の組換えに起因する問題が引き起こ
され得ることから、有利である。2つの異なる遺伝子を使用する場合、多量体タ
ンパク質の遺伝子は、同時にまたは同じ組織で発現されないだろう。協調的に調
節されているが、異種であるプロモーターは、これらの問題を克服する。
調節を解明する手段が提供される。これらのプロモーターは、レベルの協調、組
織特異性、サブユニット遺伝子の協調の決定について試験するために、リポータ
ー遺伝子にライゲートできる。
組織で発現されるように、小サブユニット遺伝子をそれ自体のプロモーター上で
発現することが有利である。
各プロモーターに共通であり得る調節因子を解析および単離する手段が提供され
る。前記因子は、AHAS大および小サブユニットプロモーターの両方からの発
現を調節する、転写因子を含む。プロモーター配列はまた、2つの遺伝子の協調
的調節に関与し得る、共通のモチーフを有し得る。さらに、小サブユニットゲノ
ムクローンでのイントロンの役割は、2つのプロモーターの同時調節に関与し得
る。2つのプロモーターおよびイントロンは、我々に、プロモーターの協調的調
節の機序を解明する手段を提供する。
する。イントロンは、遺伝子発現を調節することが示されている。例えば、メイ
ズAdh1イントロン1は、メイズにおいて、リポーター遺伝子の発現を有意に
増加させる(Callisら、1987、Genes&Development
1:1183〜1200、コールドスプリングハーバーラボラトリーによる、I
SSN0890〜9369/87)。メイズのshrunkent−1遺伝子座
の第一イントロンも、キメラ遺伝子構築物において発現を増加させることが示さ
れている。米国特許第5,424,412号および第5,593,874号は、
遺伝子発現の調節における特定のイントロンの使用を開示する。
Gallieら(Plant Physiol.106:929〜939)は、
イントロンによる遺伝子発現の増強は細胞型に依存することを示した。それ故、
AHAS小サブユニット遺伝子イントロンを使用して、特定の組織型に特に重点
的に遺伝子を発現できる。
発現されるように、小サブユニット遺伝子をその全てのイントロンと共に発現す
ることが有利である。
ポリグリシン(ポリGly)などのリンカーポリペプチドをコードする転写物を
介して、大サブユニットに翻訳的に連結している。リンカーポリペプチドの繋ぎ
の長さは変化する。リンカーポリペプチドの繋ぎに関する2つのAHASサブユ
ニットの位置は、大サブユニット転移配列、次いで、大サブユニット成熟コード
配列、リンカーポリペプチド転写物、および小サブユニット成熟コード配列であ
る。選択的位置づけは、大および小サブユニットの成熟コード配列を、小サブユ
ニットトランジット配列を用いて、リンカーポリペプチド転写物の回りでスイッ
チすることを含む。
ット間の会合が緩いことが大腸菌酵素を用いて示された。大腸菌において、各サ
ブユニットについて10-7Mの濃度で、大サブユニットはα2β2活性ホロ酵素と
して半分しか会合していないと推定された(Sellaら、1993、J.Ba
cteriology175:5339〜5343)。最大の活性は、モル過剰
のAHAS小サブユニットタンパク質で達成される。AHAS酵素は、両方のサ
ブユニットが会合した場合に、最も安定で活性であると決定されたので(Wei
nstockら、1992、J.Bacteriology、174:5560
〜5566、Sellaら、1993、J.Bacteriology175:
5339〜5343)、高度に活性で安定な酵素を、2つのサブユニットを1つ
のポリペプチドに融合することにより作成し得る。繋がれたポリペプチドは、適
切に機能することが示されている。Gilbertらは、大腸菌において2つの
繋がれたオリゴ糖合成酵素を発現させ、機能的で、in vitroで安定で、可溶性で
ある酵素を製造した(Gilbertら、Nature Biotechnol
ogy16:769〜772、1998)。
ニットの両方の発現はまた、トランスジェニック除草剤抵抗性穀物の産生に利点
を有する。単一の遺伝子を使用して、植物を形質転換し、育種して穀物系を得る
ことは、2つ以上の遺伝子を使用する場合よりも簡単でより利点がある。
プロモーターの指令下で、大サブユニットの直ぐ下流の植物ベクターに位置する
。別に、AHASの小および大サブユニット遺伝子を分離して、単一の構築物内
の異なるプロモーターの指令下に置くことができる。
において、AHASの大および小サブユニットの両方が、単一のプラスミド構築
物中の、別々のプロモーターの制御下に配置される。これにより、別々の実体と
して両方の遺伝子を発現できるが、直列型は、植物子孫においては単一遺伝子座
として作動する。
2方向に遺伝子を発現できる、二官能性プロモーターである。このプロモーター
を使用すると、遺伝子転写は、ベクターの他方の鎖にコードされた遺伝子上でお
よび逆方向に開始できる。それ故、AHASの大および小サブユニット遺伝子は
、単一のプロモーターから発現できる。
ー構築物が作成され、各々、異なるプロモーターの指令下の、大または小サブユ
ニットを含む。このアプローチは植物が二重に形質転換されることを必要とする
。
含むべきである。遺伝子転写の正しい終結および転写物のポリアデニル化のため
に、植物発現カセットに使用される様々な転写ターミネーターが知られている。
本発明に使用する転写因子は、CaMV35Sターミネーター、ノパリンシンタ
ーゼターミネーター、エンドウbcsターミネーター、tmlターミネーター、
AHAS大および小サブユニットターミネーターを含む。これらのターミネータ
ーは、単子葉植物および双子葉植物形質転換の両方に使用するためのベクターに
使用できる。
これは遺伝子に融合でき、従って発現ベクターに融合できる)を導入することに
より達成される。遺伝子産物のアミノ末端に対応するシグナル配列(Comai
ら、J.Biol.Chem.263:15104〜15109、1988参照
)を、遺伝子の5’末端上流に融合する。本発明のAHAS小サブユニットタン
パク質は、シグナル配列を有することが判明し、それ故、このシグナル配列は、
本発明のベクターに使用できる。本発明に使用する他のシグナル配列も既知であ
り、例えば、AHAS大または小サブユニット、CABタンパク質、EPSPシ
ンターゼ、GS2タンパク質等由来のcDNAの5’末端からのものである(C
heng&Jogendorf、J.Biol.Chem.268:2363〜
2367、1993)。
るのに使用できる。前記細菌の適切な種は、アグロバクテリウム・チュメファシ
エンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む。アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス(例えば、LBA4404またはEHA105株)は、植物の
形質転換能が公知であるため、特に有用である。
的に活性な粒子を、植物組織および細胞に推進することを含む。米国特許第4,
945,050号;第5,036,006号;および第5,100,792号(
これは全て、Sanfordら)は、この技法を開示する。要約すると、この手
順は、不活性または生物学的に活性な粒子を、細胞に、細胞の外表面を通過する
に効果的な条件下で推進して、ベクターを細胞の内部に取込むことを含む。不活
性粒子を使用する場合、粒子を、所望の遺伝子を含むベクターでコーティングす
ることによりベクターを細胞に導入できる。別法として、ベクターが、粒子の後
に細胞に運ばれるように、標的細胞をベクターで囲むことができる。乾燥酵母細
胞、乾燥細菌、またはバクテリオファージを含む、他の生物学的に活性な粒子は
(各々所望のDNAを含む)、植物細胞組織に推進できる。さらに、本発明のベ
クターは、標準的な技法を使用して、色素体形質転換法への使用に適するように
構築できる。
を含む、多種多様な植物細胞に除草剤抵抗性を付与するのに使用できる。遺伝子
は、これらの広い分類内に該当する任意の植物細胞に挿入できるが、コメ、小麦
、大麦、ライ麦、トウモロコシ、人参、サトウキビ、タバコ、豆、エンドウ、大
豆、砂糖大根、およびカノーラなどの、穀物植物細胞に特に有用である。
に使用できる。形質転換細胞は完全な植物体へと再生でき、よって、AHAS小
サブユニット遺伝子は、無傷トランスジェニック植物に除草剤抵抗性を付与また
は増強する。上記に示したように、発現系は、除草剤抵抗性遺伝子が、連続的ま
たは構成的に発現されるように修飾できる。
使用:AHAS大および小サブユニットの両方の遺伝子を含むプラスミドを構築
できる。このように、2つの遺伝子は、単一の遺伝子座として分離し、除草剤抵
抗性穀物の育種はより簡単になる。別に、大および小サブユニットを、単一プロ
モーターから発現される単一遺伝子に融合できる。融合タンパク質は、上昇した
レベルの活性および除草剤抵抗性を有する。AHASの大サブユニットは、野生
型配列であるか(抵抗性が、独立または融合した小サブユニットの存在下で付与
される場合)、または変異大サブユニットであり得、それ自体に除草剤に対する
幾らかの抵抗性レベルを有する。小サブユニットの存在は、1)大サブユニット
の活性を増強し、2)大サブユニットの除草剤抵抗性を増強し、3)in vivoで
発現されると、酵素の安定性を増加させ、そして、4)大サブユニットの分解に
対する抵抗性を増加させる。小サブユニットは、このように、イミダゾリノンま
たは他の除草剤に対する植物/穀物の抵抗性を上昇させる。抵抗性の上昇により
、形質転換植物/穀物に対する植物毒性を引き起こすことなく、除草剤を適用し
、および/またはその雑草制御安全率を増加することができる。理想的には、付
与された抵抗性は、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジン等の他のAHAS阻
害除草剤に対する抵抗性を増加させることなく、またはより低い程度で増加させ
ることにより、イミダゾリノンおよび他の種類の除草剤に対する抵抗性を上昇さ
せる。
を添加することにより、除草剤抵抗性を増強することに関する追加の態様 多くの場合において、タンパク質の変異は、不安定性を引き起こし得、活性を
減少させ得、分解する傾向が高いことが示されている。除草剤抵抗性AHAS遺
伝子、特に植物に由来するものは、一般に、除草剤による阻害に対する抵抗性を
付与する変異を含む。これは、これらのタンパク質の安定化、活性の維持、分解
に対する抵抗性において、重要度が高い。小サブユニット遺伝子が大サブユニッ
ト遺伝子に伴うことにより、これらの感受性領域を補助し得る。
、マルチサブユニットタンパク質のサブユニットは、優先的に分解し得る。これ
は、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼの大および小サブユ
ニットで示されている(Spreitzerら、Proc.Natl.Acad
.Sci.USA82:5460〜5464)。AHASの大サブユニット遺伝
子が形質転換され、相補的小サブユニットを有さない穀物で発現されるか、また
は小サブユニット遺伝子の発現レベルを超えた高いレベルで発現される場合、大
サブユニットタンパク質は、不安定で優先的に分解し得る。これにより、除草剤
抵抗性レベルは低くなる。
つの大サブユニットのイソ酵素および3つの小サブユニットのイソ酵素を有する
。各大サブユニットのイソ酵素は、特異的に、唯1つの小サブユニットイソ酵素
と会合するが、全てのサブユニットが同じ生物で発現される(Weinstoc
kら、1992、J.Bacteriology、174:5560〜5566
)。この特異性により、大サブユニットが、小サブユニットのとは異なる生物ま
たはイソ酵素対に由来する場合、内在性AHAS小サブユニットタンパク質は、
導入されたAHAS大サブユニットの活性を安定化または増強することができな
いことが示唆される。これは、除草剤抵抗性の目的において、同じ生物およびイ
ソ酵素対に由来する大および小サブユニット遺伝子の両方の導入における重要性
を与える。小サブユニット遺伝子の発現は、これらの問題を改良し得る。
、形質転換植物細胞および組織の選択マーカーとしても使用できる。任意の目的
の遺伝子を、AHAS大および小サブユニット遺伝子を含むベクターに取込むこ
とができる。ベクターを、AHAS阻害除草剤に感受性の植物細胞または組織に
導入できる。これらのベクターを含む形質転換体は、標準的な技法を使用して、
除草剤の存在下で選択できる。
genスピンミニプレップキット(50)(QIAgen製造番号27104)
および標準的な手順を使用して実施した。λDNA単離のために、QIAgen
λミジキット(25)(QIAgen製造番号12543)を製造業者のプロト
コルに従って使用した。TAクローニングにおいて、インビトロゲンオリジナル
TAクローニングキット(インビトロゲン製造番号K2000−01)を使用し
、標準的なプロトコルを実施した。
化したpUC19と混合した。フェノールで抽出した後、挿入断片を、1μlの
DNAリガーゼ(4単位/mL)の添加によりpUC19とライゲートし、17
℃で一晩インキュベートした。
の5’RACE系であり、ギブコ/BRL(製造番号18374−058)から
得た。反応は、製造業者により提供された標準的な手順に従って実施した。
リーを、製造業者により供給されたプロトコルに記載された、30,000プラ
ーク/150mmプレートの密度で塗布した。アマシャム核酸転写膜ハイボンド
(登録商標)N+(ディスク:0.137直径、除去等級:0.45μm)を使
用した。ナイロン転写膜を、注意してプレート表面に置き、膜および寒天に、無
菌針を使用して印をつけた。第一膜を3分後に除去し、二重膜を、プレート表面
に置き、8分後に除去した。膜を、コロニー面を上にして、変性緩衝液(0.5
N NaOH、1.5N NaCl)中に浸漬した吸着ろ紙のパッド上に5分間
置き、次いで、各膜を、コロニー面を上にして、中和溶液(1MトリスHCl、
1.5N NaCl)に浸漬した吸着ろ紙のパッド上に5分間置いた。膜を簡潔
に、2×SSC中で洗浄し、乾燥ろ紙に転写した。サンプルをUV架橋により膜
に固定し、80℃で1時間真空で焼き固めた。次いで、膜を、50%ホルムアミ
ド、2×SSC、5×デンハード溶液、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)
、0.05mg/ml変性サケ精子DNA、および0.05%NaPPiを含む
緩衝液中で、42℃で、2時間、プレハイブリダイズした。DNAを制限酵素で
消化し、1%アガロースゲル上で分画した。AHAS小サブユニット遺伝子を含
むDNA断片を、QIAクイックゲル抽出キット(50)(QIAgen製造番
号28704)を使用して精製した。ギブコ/BRLライフテクノロジーズラン
ダムプライマーDNA標識システム(製造番号18187−013)を使用して
、以下の修飾を行いDNAを標識した。125ngのプローブDNAを、マイク
ロ遠心チューブ中の55μlの蒸留水に溶かし、沸騰水浴中で5分間加熱するこ
とにより変性させ、氷上で直ちに冷却した。次いで、dATP、dGTP、dT
TP、[α−32P]dCTPおよびクレノウ酵素を、変性DNAに加え、混合物
を25℃で1時間インキュベートした。1容量のホルムアミドを混合物に加え、
反応液を65℃で30分間加熱した。標識DNAを含む反応液を、プレハイブリ
ダイゼーション溶液に加え、膜を、42℃で20時間、ゆっくりと振盪しながら
ハイブリッドさせた。ハイブリダイゼーション後、膜を、2回、0.1%SDS
を含む0.4×SSC緩衝液中で室温で10分間洗浄し、次いで、1回、0.1
%SDSを含む0.2×SSC緩衝液中で65℃で30分間洗浄した。膜をX線
フィルムに一晩露光させた。二重膜上のDNAプローブにハイブリッドしたDN
Aを含むプラークは陽性の結果を示し、これらのプラークを単離した。手順は、
単一の単離物が回収されるまで二回繰返した。
I PRISM DNAシークエンスキットを使用して実施した。エタノール沈
降後、DNAを、ABI PRISM鋳型抑制試薬に溶かし、90℃で5分間変
性させた。次いで、サンプルをABI310シークエンサーにのせた。
(pAC786)AHAS大サブユニット遺伝子を、ファルマシアの大腸菌発現
ベクターpGEX−4T−2に構築した。グルタチオントランスフェラーゼ/A
HAS大サブユニット融合タンパク質を発現するように遺伝子を、上記したプラ
スミドpHUWE82およびpHUWE83について記載したのと同じように構
築して、精製を補助した。5アミノ酸プロテアーゼ開裂部位が、2つのタンパク
質の接合部にコードされ、よって精製後にそれらを切断して分離できる。アラビ
ドプシスAHAS小サブユニット遺伝子のcDNA配列を含む、3つのベクター
構築物を、pGEX−4T−2発現ベクターを使用して作成した。これらは、F
1、F2およびF3と称され、3つ全てが、遺伝子内に含まれるペプチド配列の
量が異なっていた。F1プラスミドのAHAScDNAによりコードされるペプ
チドのN末端アミノ酸配列は、Gly−Ser−Pro−Lys−Ile−Al
a−Leu−Arg−(配列表の配列番号9)である。プラスミドF2のAHA
ScDNAによりコードされるペプチドのN末端アミノ酸配列は、Gly−Se
r−Leu−Asp−Ala−His−Trp−(配列表の配列番号10)であ
る。F3プラスミドのAHAScDNAによりコードされるペプチドのN末端ア
ミノ酸配列は、Gly−Ser−Val−Glu−Pro−Phe−Phe−(
配列表の配列番号11)である。全3つのペプチドのN末端Gly−Ser−は
、トロンビン開裂の残りである。
pAC774およびpAC786、並びに、小サブユニットプラスミドF1、F
2およびF3で形質転換した。細胞を氷上で解凍した。1μlの1:5希釈のプ
ラスミドDNAを、75μlの細胞に加え、次いで、氷上に30分間置いた。細
胞に42℃の水浴中で90秒間熱ショックを与え、次いで、氷上に2分間置いた
。800μlのルリア−ベルタニ培地(LB)を、形質転換細胞を含む各チュー
ブに加え、次いで、これを37℃の振盪器中で1時間増殖させた。細胞を2分間
遠心分離にかけ、過剰の培地を吸引した。細胞ペレットを、100μlのLBに
再懸濁し、100μgのカルベニシリンを含むLB上に一晩37℃で塗布した。
単一のコロニーを、375μg/mlのカルベニシリンを含む50mlのLB培
地中に接種し、一晩37℃の振盪器中で増殖させた。700μlのアリコートを
取り出し、300μlの50%グリセロール中に加え、次いで、液体窒素中で凍
結させ、細胞ストック用に−80℃で維持した。
菌の50mlの一晩培養液を、2%グルコース、375μg/mlカルベニシリ
ンと共に、1リットルの2×YTに接種した。細胞を、5時間、37℃の振盪器
/インキュベーター中で増殖させ、次いで、0.1mM IPTGを用いて誘導
し、次いで、さらに2.5時間30℃の振盪器に入れた。細胞を、JA10ロー
ター中で8000rpmで4℃で10分間遠心分離により収集した。細胞を精製
まで−20℃でペレットとして保存した。
M NaCl、16mM Na2HPO4、4mM NaH2PO4)、pH7.3
に再懸濁し(SmithおよびJohnson、Gene67:31〜40、1
998)、100μg/mlのリゾザイムを加えた。懸濁液を、5mMジチオト
レイトールに調整した。トリトンX−100を、20%トリトンX−100のM
TPBS溶液の添加により、最終濃度1%となるまで加えた。細胞を穏やかに3
0℃で15分間振盪させ、次いで、4℃まで氷上で冷却し、マイクロチッププロ
ーブ、負荷サイクル70%、マイクロチップパルサーの最大のアウトプットコン
トロールを使用して、8〜10秒間超音波処理した。超音波処理したものを、2
回、J20ローター中で、17,000rpm、4℃、10分間で遠心分離し、
不溶性物質を除去した。溶解液を150mg(乾燥重量)のグルタチオンアガロ
ース(MTPBS中で平衡化し水和した)に加え、30分間4℃で逆にした。ア
ガロースを500rpmで5分間の遠心分離により静置させ、洗浄液のA280が
、MTPBSのそれと一致するまで、遠心分離サイクルを反復することにより氷
冷MTPBSで洗浄した。アガロースを、溶出のために適切なカラムに移した。
融合タンパク質を、50mMトリス−HCl、5mM還元グルタチオンで溶出し
、1ml画分とした。各画分のA280をタンパク質含量について調べ、適切な画
分(A280>0.100)をプールした。プールしたサンプルに、タンパク質溶
液1mlあたり5単位のウシトロンビンを加えた。サンプルをMTPBS、3m
Mジチオトレイトールに対して15時間室温で透析し、融合タンパク質のタンパ
ク質分解的開裂およびトリス−HClおよび還元グルタチオンの除去を可能とし
た。透析したサンプルを、さらに2回、平衡化グルタチオンアガロースに通過さ
せて、開裂GSTタンパク質を除去し、非切断融合タンパク質を除去した。精製
サンプルを、0.02%アジ化ナトリウムの存在下または非存在下、4℃で保存
した。
胞を集めるために使用したのと同じような方法で収集した。1リットルの培養液
からの細胞ペレットを、10mlのSTE(150mM NaCl、10mMト
リス−HCl、pH8.0、1mM EDTA)に再懸濁し、次いで、100μ
g/mlのリゾザイムを加えた。これを15分間氷上に置いた。ジチオトレイト
ールを5mMまで加え、N−ラウロイルサルコシンを、STEの10%ストック
液から最終濃度1.5%となるまで加えた。細胞に10秒間ボルテックスをかけ
た。溶解液を氷上で8〜10秒間、マイクロチッププローブ、負荷サイクル70
%、マイクロチップパルサーの最大のアウトプットコントロールを使用して、8
〜10秒間超音波処理した。超音波処理したものを、2回、JA20ローター中
で、4℃で、17,000rpmで10分間遠心分離し、不溶性物質を除去した
。上清を200mg(乾燥重量)のグルタチオンアガロース(MTPBS中で平
衡化し水和した)に加え、20分間4℃で逆にした。アガロースを、500rp
mで5分間遠心分離して静置させ、上清を吸引した。アガロースを、洗浄液のA 280 が、MTPBSのそれと等しくなるまで、遠心分離サイクルを反復すること
により氷冷MTPBSで洗浄した。アガロースを、溶出のために適切なカラムに
移した。融合タンパク質を、50mMトリス−HCl(pH8.0)、10mM
還元グルタチオン、5mMジチオトレイトール、および2%N−オクチルグルコ
シドで溶出し、1ml画分を集めた。各画分の280nmの吸光度を調べ、適切
な画分(A280>0.100)をプールした。サンプルを、MTPBS、3mM
ジチオトレイトールに対して15時間4℃で透析し、還元グルタチオン、トリス
−HCl、およびN−オクチルグルコシドを除去した。SDSを、1%のH2O
中ストック溶液から0.005%となるまで加えた。タンパク質溶液1mlあた
り5単位のウシトロンビンを加え、サンプルを、室温で30〜45分間穏やかに
振盪し、融合タンパク質のタンパク質分解的開裂を可能にした。次いで、サンプ
ルを直ちに、Etractiゲル−D洗浄アフィニティーカラム(ピアス)に通
過させ、SDSを除去した。切断サンプルを4℃で貯蔵するか、または2回、再
平衡グルタチオンアガロースを通過させて、GSTおよび非切断融合タンパク質
を除去した。精製サンプルを4℃で保存した。
間置き、タンパク質を沈降させた。次いで、アリコートを10分間4℃で高速遠
心分離し、沈降物をペレット化した。ペレットを等量の3%(w/v)炭酸ナト
リウム、0.1N NaOHに再懸濁した。ピアスBCAタンパク質アッセイを
使用して、タンパク質溶液の濃度を決定した。ウシ血清アルブミンを、3%炭酸
ナトリウム、0.1N NaOH中で調製した。
88)に記載されたものを僅かに修飾して実施した。AHAS活性を、1×AH
ASアッセイ緩衝液(50mM HEPES(pH7.0)、100mMピルベ
ート、10mM MgCl2、1mM TPP、および50μM FAD)中で
アッセイした。1×アッセイ緩衝液の最終濃度は、2×アッセイ緩衝液中に抽出
された酵素の希釈により、または、酵素を添加して、最終濃度1×AHASアッ
セイ緩衝液を作成することにより得られた。imazethapyrおよび関連
した対照を含む全アッセイは、50%DMSO溶液として混合物をアッセイする
ために、imazethapyrの添加により、最終濃度5%のDMSOを含ん
だ。アッセイは、250μLの最終容量で37℃でマイクロタイタープレート中
で実施した。
イトール(DTT)の、AHAS大サブユニット酵素活性に対する効果を測定し
た。実験は、3mM DTTの存在下または非存在下で、大サブユニットの精製
タンパク質溶液中で実施した。アッセイは上記のように実施した。結果は図5お
よび6に示す。図5から分かるように、図6と比較して、AHAS大サブユニッ
トの触媒活性は、DTTにより劇的に増強される。さらに、DTTの非存在下で
、大サブユニット活性は、4日間の期間におよび分解した(図6)。アラビドプ
シス大サブユニットは、3mM DTTの存在下で、1ヶ月の期間、4℃で貯蔵
した場合に非常に安定であることが判明した。
β−メルカプトエタノールよりも良好に、酵素を、安定化および活性化するよう
であった。DTTによる酵素の活性化のために、小サブユニット酵素によるAH
AS大サブユニット酵素の活性化を検討する全ての実験は、DTTまたは他のス
ルフヒドリル還元剤の非存在下で、または3mMの一定濃度のDTTで実施した
。
的であるかを決定するために、ウシ血清アルブミンの効果を試験する、別の非特
異的な対照も実施した。一定量の大サブユニットに、漸増量の0.25mg/m
lのBSA溶液を加えた。結果は図7に示す。図7から分かるように、BSAの
試験サンプルへの添加により、AHASの大サブユニットタンパク質の触媒活性
の、有意でははないが、僅かな、プラトー増加が引き起こされた。
サブユニットタンパク質を使用した。アラビドプシスに由来するAHAS小サブ
ユニット遺伝子を含むプラスミドF1を、大腸菌で発現させ、部分的に精製した
。サンプルのタンパク質濃度を決定し、漸増濃度のアリコートを一定量の精製ア
ラビドプシス大サブユニットに加えた。
ビドプシスAHAS大サブユニットの活性化を示す。AHASアッセイは、上記
のように実施し、図8に示した結果は、小サブユニットタンパク質が、触媒大サ
ブユニットの酵素活性のレベルを増強することを示す。AHASの大サブユニッ
トタンパク質の活性化は、野生型大サブユニットおよび大サブユニットの除草剤
抵抗性変異体の両方で示される。
置換変異、メチオニンをヒスチジンにより置換)を使用した。図9に示した結果
は、大サブユニットの除草剤抵抗形の酵素活性も増強されることを示す。
、植物形質転換ベクターpHUWE67を以下のように構築した。アラビドプシ
スAHAS小サブユニット遺伝子(pMSg6)の5.6kbゲノム断片を含む
、図1に示したpUC19ベクターをSalIで切断した。プロモーターおよび
イントロンを含む、全アラビドプシスAHAS小サブユニット遺伝子(図2参照
)を含む5.6kb断片を、アガロースゲル電気泳動によりベクターから分離し
た。断片をアガロースゲルから切出し、QIAクイックゲル抽出キット(製造番
号28706)を使用して、製造業者により提供された手順に従って精製した。
アグロバクテリウムをベースとした形質転換ベクターのpBIN19をSalI
で切断した。ベクターを、フェノール:クロロホルム抽出により精製した。精製
したベクターを、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して脱リン酸化し、フ
ェノール:クロロホルムで再抽出した。ベクターおよびゲノム挿入断片をライゲ
ートし、構築物を含むライゲート混液を使用して、大腸菌DH5α株を形質転換
した。大腸菌をカナマイシンプレート上で選択し、プラスミドを、形質転換大腸
菌から抽出した。ベクター構築物を、PCR産物を作成し、産物を、例1に記載
したシークエンス手順を使用してシークエンスすることにより確認した。従って
、pHUWE67(図10)と称されるベクターは、pBIN19プラスミドに
融合した、AHASプロモーター、オープンリーディングフレーム(ORF)お
よび3’−ターミネーターを含む、AHASゲノムDNAを含む、5.6kb断
片を含む。このベクター構築物は、標準的な技法を使用して、アグロバクテリウ
ムをベースとした植物の形質転換に使用する。
順に従って、上記のベクターpHUWE67と同じように構築する。図11A〜
11Eにおいて、ベクターは、AHAS小サブユニットcDNA、断片、ゲノム
断片または変異体を含み得る。図11Bにおいて、ベクターはさらに、遺伝子挿
入断片の上流に作動可能に連結されたAHAS小サブユニットプロモーターを含
む。この実施形態において、アラビドプシス小サブユニット遺伝子はターミネー
ターを含む。
ット遺伝子を含み、大サブユニット遺伝子は、小サブユニット遺伝子の下流にあ
る。両方の遺伝子が、遺伝子挿入断片の上流に位置する、AHAS小サブユニッ
トプロモーターにより調節される。AHAS大サブユニット遺伝子は、除草剤抵
抗性変異対立遺伝子である。
、大および小サブユニット遺伝子を含む。転写終結シグナルは、AHAS小サブ
ユニットターミネーターにより提供される。AHAS大サブユニット遺伝子は、
イミダゾリノンなどの除草剤に対する抵抗性を付与する。
このベクターには、AHAS大および小サブユニット遺伝子は、構築物中で位置
が逆である。この例でのAHAS大サブユニット遺伝子は、小サブユニット遺伝
子の上流にある。AHAS大サブユニット遺伝子は、除草剤抵抗性変異対立遺伝
子である。
法に従って、相同的AHAS小サブユニット遺伝子配列を、コメ、メイズ、小麦
、大麦等の様々な植物種から得ることができる。それ故、これらのAHAS小サ
ブユニット遺伝子配列はまた、植物を形質転換するための本発明のベクターおよ
び方法にも有用である。
含む、pUCプラスミド植物発現ベクター構築物を示す。
ット遺伝子を含む、本発明のプラスミド発現ベクターpHUWE82を示す。
ラビドプシスAHAS小サブユニット遺伝子を含む、本発明のプラスミド発現ベ
クターpHUWE83を示す。
)の存在下で、アラビドプシスAHAS酵素の大AHASサブユニットタンパク
質のin vitro活性および安定性を示す、棒グラフである。
S酵素の大サブユニットタンパク質のin vitro活性を示す、棒グラフである。
スAHAS酵素の大サブユニットタンパク質のin vitro活性を示すグラフである
。
素の野生型大サブユニットタンパク質のin vitro活性を示すグラフである。
草剤抵抗性変異体(Met124His)大サブユニットアラビドプシスAHA
Sタンパク質のin vitro活性を示すグラフである。
断片を含む、本発明の植物形質転換ベクターpHUWE67である。
Claims (64)
- 【請求項1】 真核生物アセトヒドロキシ酸シンテターゼ、すなわちAHA
Sの小サブユニットタンパク質をコードする単離DNA配列。 - 【請求項2】 配列表の配列番号1に示される請求項1のDNA配列。
- 【請求項3】 配列表の配列番号3に示される請求項1のDNA配列。
- 【請求項4】 植物AHAS小サブユニットタンパク質をコードする請求項
1のDNA配列。 - 【請求項5】 双子葉植物のAHAS小サブユニットタンパク質をコードす
る請求項4のDNA配列。 - 【請求項6】 アラビドプシス由来のAHAS小サブユニットタンパク質を
コードする請求項5のDNA配列。 - 【請求項7】 単子葉植物のAHAS小サブユニットタンパク質をコードす
る請求項4のDNA配列。 - 【請求項8】 コメまたはメイズ由来のAHAS小サブユニットタンパク質
をコードする請求項7のDNA配列。 - 【請求項9】 植物細胞で発現可能なプロモーターと、真核生物AHAS小
サブユニットタンパク質をコードするDNA配列とを含む植物発現ベクター。 - 【請求項10】 プロモーターは、高い発現レベルの植物プロモーターであ
る請求項9の発現ベクター。 - 【請求項11】 プロモーターは、アラビドプシスのAHAS小サブユニッ
トプロモーターである請求項9の植物発現ベクター。 - 【請求項12】 DNA配列は、アラビドプシスの小サブユニットタンパク
質をコードする請求項11の植物発現ベクター。 - 【請求項13】 植物細胞で発現可能な第二のプロモーターと、真核生物A
HAS大サブユニットタンパク質をコードするDNA配列とをさらに含む請求項
9の植物発現ベクター。 - 【請求項14】 大サブユニットプロモーターと、真核生物AHAS大サブ
ユニットタンパク質をコードするDNA配列とが、双子葉植物に由来する請求項
13の植物発現ベクター。 - 【請求項15】 双子葉植物は、アラビドプシスである請求項14の植物発
現ベクター。 - 【請求項16】 DNA配列は、除草剤に抵抗性である変異体AHAS大サ
ブユニットタンパク質をコードする請求項13の植物発現ベクター。 - 【請求項17】 アラビドプシスDNA配列は、イミダゾリノン除草剤に抵
抗性である変異体アラビドプシスのAHAS大サブユニットタンパク質をコード
する請求項16の植物発現ベクター。 - 【請求項18】 プロモーターおよびDNA配列は、双子葉植物に由来する
請求項13の植物発現ベクター。 - 【請求項19】 プロモーターおよびDNA配列は、単子葉植物に由来する
請求項13の植物発現ベクター。 - 【請求項20】 DNA配列は、コメまたはメイズに由来する請求項19の
植物発現ベクター。 - 【請求項21】 プロモーターと、AHASタンパク質の大サブユニットお
よび小サブユニットを含む融合タンパク質をコードするDNA配列とを含んでな
る、植物においてAHAS遺伝子を発現させるための植物発現ベクター。 - 【請求項22】 AHASタンパク質の小サブユニットをコードするDNA
配列は、真核生物に由来する請求項21の植物発現ベクター。 - 【請求項23】 プロモーターおよびDNA配列は、アラビドプシスに由来
する請求項22の植物発現ベクター。 - 【請求項24】 植物細胞で発現可能なプロモーターと、移行AHAS大サ
ブユニットポリペプチドをコードするDNA配列と、成熟AHAS大サブユニッ
トタンパク質をコードするDNA配列と、リンカーポリペプチドをコードするD
NA配列と、真核生物AHAS小サブニットタンパク質をコードするDNA配列
と、植物ターミネーター配列とを連続して含む植物発現ベクター。 - 【請求項25】 植物細胞で発現可能なプロモーターと、移行AHAS小サ
ブユニットポリペプチドをコードするDNA配列と、AHAS小サブユニットタ
ンパク質をコードするDNA配列と、リンカーポリペプチドをコードするDNA
配列と、AHAS大サブユニットポリペプチドをコードするDNA配列と、植物
ターミネーターとを連続して含む植物発現ベクター。 - 【請求項26】 プロモーターと、移行AHAS大サブユニットタンパク質
をコードするDNA配列と、成熟AHAS大サブユニットタンパク質をコードす
るDNA配列とが、双子葉植物に由来する請求項24または25の植物発現ベク
ター。 - 【請求項27】 プロモーターと、移行AHAS大サブユニットタンパク質
をコードするDNA配列と、成熟AHAS大サブユニットタンパク質をコードす
るDNA配列とが、アラビドプシスに由来する請求項24または25の植物発現
ベクター。 - 【請求項28】 プロモーターと、移行AHAS大サブユニットタンパク質
をコードするDNA配列と、成熟AHAS大サブユニットタンパク質をコードす
るDNA配列とが、単子葉植物に由来する請求項24または25の植物発現ベク
ター。 - 【請求項29】 プロモーターと、移行AHAS大サブユニットタンパク質
をコードするDNA配列と、成熟AHAS大サブユニットタンパク質をコードす
るDNA配列とが、コメまたはメイズに由来する請求項24または25の植物発
現ベクター。 - 【請求項30】 単離された真核生物のAHAS小サブユニットタンパク質
。 - 【請求項31】 配列表の配列番号2に対応するアミノ酸配列を有する請求
項30のタンパク質。 - 【請求項32】 精製された真核生物のAHAS小サブユニットタンパク質
を含む組成物。 - 【請求項33】 AHAS小サブユニットタンパク質は、アラビドプシスの
AHAS小サブユニットタンパク質である請求項32の組成物。 - 【請求項34】 除草剤に抵抗性であるトランスジェニック植物を作成する
方法であって、真核生物のAHAS小サブユニットタンパク質をコードするDN
A配列を含む植物発現ベクターにより、植物を形質転換することを含む方法。 - 【請求項35】 発現ベクターは、高い発現レベルの植物プロモーターと、
真核生物のAHAS大サブユニットタンパク質をコードするDNA配列とをさら
に含む請求項34の方法。 - 【請求項36】 プロモーターは、真核生物のAHAS小サブユニットプロ
モーターであり、大サブユニットDNA配列は、真核生物のAHAS大サブユニ
ットタンパク質の除草剤抵抗性変異体をコードする請求項35の方法。 - 【請求項37】 プロモーターと、AHAS大サブユニットタンパク質をコ
ードするDNA配列とが、アラビドプシスに由来する請求項36の方法。 - 【請求項38】 植物細胞に除草剤抵抗性を付与する方法であって、第一の
植物発現プロモーター、およびAHASタンパク質の大サブユニットをコードす
るDNA配列を含む第一の植物発現ベクターと、第二の植物発現プロモーター、
および真核生物AHASタンパク質の小サブユニットをコードするDNA配列を
含む第二の植物発現ベクターとにより、植物細胞を同時形質転換することを含む
方法。 - 【請求項39】 請求項38の方法により産生された植物細胞。
- 【請求項40】 AHAS大サブユニットタンパク質をコードする遺伝子を
発現するトランスジェニック植物の除草剤抵抗性を増強する方法であって、真核
生物の小サブユニットAHASタンパク質をコードするDNA配列によりトラン
スジェニック植物を形質転換することを含む方法。 - 【請求項41】 請求項40の方法により産生されたトランスジェニック植
物。 - 【請求項42】 請求項40の方法により産生されたトランスジェニック植
物であって、前記植物は、他のAHAS阻害除草剤と比較してイミダゾリノン除
草剤に高い抵抗性を示すトランスジェニック植物。 - 【請求項43】 他のAHAS阻害除草剤は、スルホニル尿素、トリアゾロ
ピリミジン、ピリミジル−オキシ−安息香酸、スルファモイル尿素およびスルホ
ニルカルボキシアミドからなる群から選択される請求項42のトランスジェニッ
ク植物。 - 【請求項44】 植物の子孫植物における除草剤抵抗性を増強する方法であ
って、遺伝的相補体が真核生物のAHASタンパク質の大サブユニットの除草剤
抵抗性変異体をコードする配列、および真核生物AHASタンパク質の小サブユ
ニットをコードするDNA配列を含むトランスジェニック植物と、植物とを交雑
させるステップと、除草剤抵抗性を示す子孫植物を選択するステップとを含む方
法。 - 【請求項45】 植物とトランスジェニック植物との交雑は、有性生殖によ
り達成される請求項44の方法。 - 【請求項46】 請求項44の方法により産生された子孫植物。
- 【請求項47】 遺伝的相補体は、真核生物小サブユニットAHASタンパ
ク質をコードするDNA配列を含む請求項44の子孫植物。 - 【請求項48】 遺伝的相補体が、真核生物AHASタンパク質の大サブユ
ニットの除草剤抵抗性変異体をコードするDNA配列と、真核生物AHASタン
パク質の小サブユニットをコードするDNA配列とを含む請求項44の植物の除
草剤抵抗性派生的植物。 - 【請求項49】 請求項48の植物の派生物であり、イミダゾリノン除草剤
に耐性を示す植物。 - 【請求項50】 遺伝的相補体は、植物において発現するためのプロモータ
ーと、真核生物のAHASタンパク質の大サブユニットおよび小サブユニットを
含む融合タンパク質をコードするDNA配列と、植物細胞で機能するターミネー
ター配列とを含む、植物において発現可能な遺伝子を含むトランスジェニック植
物。 - 【請求項51】 遺伝的相補体は、真核生物の小サブユニットAHASタン
パク質をコードするDNA配列を含む請求項49の植物の植物派生物。 - 【請求項52】 双子葉植物である請求項46または47のトランスジェニ
ック植物。 - 【請求項53】 単子葉植物である請求項46または47のトランスジェニ
ック植物。 - 【請求項54】 除草剤に抵抗性を付与する植物AHAS遺伝子の変異を同
定する方法であって、AHAS小サブユニットタンパク質遺伝子を含む異種ベク
ターを有する生物を、除草化合物に曝露することを含む方法。 - 【請求項55】 ベクターは、AHAS大サブユニットタンパク質遺伝子を
さらに含む請求項54の方法。 - 【請求項56】 AHAS小サブユニット遺伝子は、アラビドプシスに由来
するDNA配列を有する請求項54の方法。 - 【請求項57】 AHAS酵素活性に影響を及ぼす除草剤を同定するための
スクリーニング法であって、AHAS小サブユニットタンパク質遺伝子を含む異
種発現ベクターを有する生物を、化合物に曝露するステップと、除草剤の効果を
決定するステップとを含む方法。 - 【請求項58】 AHAS酵素のアロステリックフィードバック阻害を変化
させる変異を同定するためのスクリーニング法であって、 AHAS酵素活性の欠損した微生物株を、変異植物AHAS小サブユニット遺
伝子を含むプラスミド発現ベクターにより形質転換するステップと、 1または2つの分枝鎖アミノ酸の存在下で、最小培地中で微生物株をスクリー
ニングするステップと、 前記培地中で増殖する微生物株を同定するステップと を含む方法。 - 【請求項59】 配列番号3のヌクレオチド配列1〜757番目を含む単離
されたDNA配列。 - 【請求項60】 請求項59の単離されたDNA配列を含む異種植物発現ベ
クター。 - 【請求項61】 異種DNA配列を含む請求項60に記載の植物発現ベクタ
ー。 - 【請求項62】 請求項61の発現ベクターにより植物細胞を形質転換する
ことを含む植物細胞中で異種DNA配列を発現させる方法。 - 【請求項63】 請求項59のDNA配列を含む組換え植物細胞。
- 【請求項64】 請求項62の組換え植物細胞。
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