JP2002085062A - 化学的に定義された非ポリマー性結合手プラットフォーム分子およびその複合体 - Google Patents

化学的に定義された非ポリマー性結合手プラットフォーム分子およびその複合体

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Abstract

(57)【要約】 【課題】自己免疫疾患である全身性紅斑性狼瘡（ＳＬ
Ｅ）などの病気を治療するために用いる、化学的に定義
された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子を含
む複合体を開発すること。 【解決手段】化学的に定義された非ポリマー性結合手プ
ラットフォーム分子、ならびに化学的に定義された結合
手プロセスラットフォーム分子と生物学的分子または合
成分子（ヒト狼瘡の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体に対して顕著
な結合活性を有する、少なくとも約２０塩基対の二本鎖
ポリヌクレオチドを含む）とを含む複合体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、自己免疫疾患であ
る全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ、本明細書では単に「狼
瘡」とも呼ぶ）などの病気を治療するために用いる、ポ
リヌクレオチドなどの生物学的あるいは合成分子とカッ
プリングさせた、化学的に定義された非ポリマー性の結
合手プラットフォーム分子を包含する複合体に関する。
本発明はまた化学的に定義された非ポリマー性の結合手
プラットフォーム分子自身にも関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの化合物が、生物学的に有用な分子
の担体として、免疫寛容性であるとされる複合体の調製
に用いられてきた。例えば、Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ、Ｋ
ａｔｚおよび彼等の協同研究者達は、初期の研究で「Ｄ
−ＧＬ」と呼ばれ、本明細書では「Ｄ−ＥＫ」と呼ぶＤ
−グルタミン酸／Ｄ−リジンのランダムな共重合体と、
ハプテンおよび種々の抗原との複合体を使用し、特定の
免疫寛容の誘起を研究および発表している。米国特許第
４，１９１，６６８号、および米国特許第４，２２０，
５６５号参照。
【０００３】他の研究者は、ヌクレオシドあるいはＤＮ
Ａと、他の担体との複合体を研究している。Ｂｏｒｅｌ
ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９７３） １８２：７６）
は、ＮＺＢ株の若いマウス中で、同系のマウスのＩｇＧ
−ヌクレオシド複合体が、変性ＤＮＡに対する抗体応答
を減少させる能力を評価している。別の独立した研究
で、Ｐａｒｋｅｒら（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９
７４） １１３：２９２）は、ポリ−Ｄ−リジンおよび
／あるいはシクロホスファミドと複合させた変性ＤＮＡ
の、ＮＺＢマウス中での上記の症候の進行に対する影響
を評価した。
【０００４】後の報文でＢｏｒｅｌら（Ａｎｎ． ＮＹ
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９８６） ４７５：２９
６−３０６）は、オリゴヌクレオチド−免疫グロブリン
の複合体に関して記載している。Ｂｏｒｅｌら（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９８８）８２：１９０１−
１９０７、または米国特許第４，６５０，６７５号）
は、ＤＮＡに結合させたヒト免疫グロブリンの複合体を
用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究を記載している。Ｄｉ
ｎｔｚｉｓらの米国特許第５，１２６，１３１号もま
た、担体と免疫応答に関与する分子とを含む複合体に関
する。
【０００５】他の参考文献は、非免疫性のポリマーと、
免疫原との複合体を記載している。（Ｓａｓｋｉら、Ｓ
ｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８２）１６：１９１
−２００；Ｓｅｈｏｎの、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ
（１９８２）３２：１６１−２０２；Ｗｉｌｋｉｎｓｏ
ｎらの、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：３
２６−３３１；およびＢｏｒｅｌらの、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９０）１２６：１５９−１
６８を参照。）本発明者らの、米国特許出願番号第０７
／９１４，８６９号、米国特許第５，１６２，５１５
号、および米国特許出願番号第０７／６５２，６５８号
には、Ｄ−ＥＫ、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｄ−
リジン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン、等のポリマー性の担体と、免疫グロブリンとからな
る複合体が記載されている。
【０００６】上記の従来技術を要約すると、定義の不明
確な化合物、あるいは、多くの非特異な結合部位を有す
る化合物が、複合体の結合手プラットフォーム分子とし
て使用されているに過ぎないと、本発明者らは考える。
この様な化合物の結合手、結合部位の位置、および、結
合部位の数が、予想できず、そして大きく変動するため
に、この様な化合物からなる従来技術の複合体は、再現
性良く製造し得ず、そしてその報告された活性は広い変
動範囲を示している。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述の従来技術とは対
照的に、本発明者らは、化学的に定義された非ポリマー
性の結合手プラットフォーム分子を含む複合体を開発し
た。プラットフォーム分子の価数は予め定められ、各結
合部位は生物学的あるいは合成分子の結合のために用い
得る。本発明の結合手プラットフォーム分子は、化学構
造、価数、均一性が定義され、適切な生物学的および／
あるいは合成分子と効率的に結合させるための、定義さ
れた官能基を有している。
【０００８】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は１つの
局面では、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プ
ラットフォーム分子、および、生物学的および／あるい
は化学的分子を含む複合体に関している。化学的に定義
された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子と結
合させ、本発明の複合体を形成するのに適した、生物学
的および／あるいは化学的分子の例は、炭水化物、薬
剤、脂質、リポポリサッカライド、ペプチド、タンパク
質、グリコプロテイン、一本鎖あるいは二本鎖のオリゴ
ヌクレオチドおよびそれらの化学的アナログ、免疫原の
アナログ、ハプテン、ミモトープ、アプタマー等であ
る。本発明に用いるのに適した、化学的に定義された非
ポリマー性の結合手プラットフォーム分子には、これら
にのみ限定はされないが、以下の式の生体適合性で非抗
原性の炭素ベースの化合物の誘導体が含まれる。
【０００９】
【化３】 但し、存在する場合、Ｇ[1]およびＧ[2]は各々独立し
て、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択
される１−２０００の、さらに好ましくは１−１０００
の鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数に分枝した
鎖である。
【００１０】さらに好ましくは、存在する場合、Ｇ[2]
は、ポリアルコール、ポリアミン、あるいはポリエーテ
ルから誘導される基であり、最も好ましくはＧ[2]は、
ｑが０から２０の−（ＣＨ2）q−、ｒが０から３００の
−ＣＨ2（ＣＨ2ＯＣＨ2）rＣＨ2−、および、ｓが１か
ら４、さらに好ましくはｓが３から４のＣ（ＣＨ2０Ｃ
Ｈ2ＣＨ2−）s（ＯＨ）4-sからなる群から選択される。
【００１１】Ｔ[1]として示されたｎ[1]個の部分、およ
び、Ｔ[2]として示されたｐ[2]×ｎ [2]個の部分は各々
独立して、ＮＨＲSUB（アミン）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨ
ＲSUB（ヒドラジド）、ＮＨＮＨＲSUB（ヒドラジン）、
Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボン酸）、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲESTER
（活性エステル）、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）ＲB（無水
物）、Ｃ（＝Ｏ）Ｘ（酸ハライド）、Ｓ（＝Ｏ）2Ｘ
（スルホニルハライド）、Ｃ（＝ＮＲSUB）ＯＲSUB（イ
ミデートエステル）、ＮＣＯ（イソシアネート）、ＮＣ
Ｓ（イソチオシアネート）、ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ（ハロホル
メート）、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝ＮＲSUB）ＮＨＲSUB（カ
ルボジイミド付加体）、Ｃ（＝Ｏ）Ｈ（アルデヒド）、
Ｃ（＝Ｏ）ＲB（ケトン）、ＳＨ（スルフヒドリル、あ
るいはチオール）、ＯＨ（アルコール）、Ｃ（＝Ｏ）Ｃ
Ｈ2Ｘ（ハロアセチル）、ＲALKＸ（アルキルハライ
ド）、Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲALKＸ（アルキルスルホネー
ト）、Ｒ1Ｒ2が、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）−
であるＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＲB＝Ｃ
ＲB 2（α，β−不飽和カルボニル）、ＲALK−Ｈｇ−Ｘ
（アルキル水銀）、およびＳ（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲ
B 2（α，β−不飽和スルホン）からなる群から選択され
る。
【００１２】さらに好ましくは、Ｔ[1]として示された
ｎ[1]個の部分、および、Ｔ[2]として示されたｐ[2]×
ｎ[2]個の部分は各々独立して、ＮＨＲSUB（アミン）、
Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、ＲALKＸ（アルキ
ルハライド）、Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲALKＸ（アルキルスルホ
ネート）、Ｒ1Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）
−であるＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＲB＝
ＣＲB 2（α，β−不飽和カルボニル）、ＲALK−Ｈｇ−
Ｘ（アルキル水銀）、およびＳ（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2
（α，β−不飽和スルホン）からなる群から選択され
る。
【００１３】さらにより好ましくは、Ｔ[1]として示さ
れたｎ[1]個の部分、および、Ｔ[2]として示されたｐ
[2]×ｎ[2]個の部分は各々独立して、ＮＨＲSUB（アミ
ン）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、Ｒ1Ｒ2が
−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）−であるＮＲ1Ｒ
2（マレイミド）、および、Ｃ（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲ
B 2（α，β−不飽和カルボニル）からなる群から選択さ
れる。
【００１４】最も好ましくは、Ｔ[1]として示されたｎ
[1]個の部分の全て、および、Ｔ[2]として示されたｐ
[2]×ｎ[2]個の部分の全ては、同じである。
【００１５】式中の、各Ｘは独立して、原子番号が１６
より大きく５４未満のハロゲン、あるいは他の良好な脱
離基（すなわち、この状況でハロゲンと同様に振舞う、
アルキルあるいはアルキル置換のスルホネートあるいは
スルフェート等、アリールあるいはアリール置換のスル
ホネートあるいはスルフェート等、の弱い塩基）であ
る。
【００１６】各ＲALKは独立して直鎖、分枝、あるいは
環状の（１−２０Ｃ）のアルキル基である。
【００１７】各ＲSUBは独立して、Ｈ、直鎖、分枝、あ
るいは環状の（１−２０Ｃ）のアルキル、（６−２０
Ｃ）のアリール、あるいは（７−３０Ｃ）のアルカリー
ルである。
【００１８】各ＲESTERは独立して、Ｎ−スクシンイミ
ジル、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、
テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、２，
４，５−トリクロロフェニル、２，４−ジニトロフェニ
ル、シアノメチル等、あるいは、５−クロロ，８−キノ
ロン−１−イル、１−ピペリジル、１−ベンゾトリアゾ
リル等、の様なその他の活性化基である。
【００１９】各ＲBは独立して、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ
ｉ、ＰおよびＳからなる群から選択される１−５０の原
子を含む基である。
【００２０】存在する場合、Ｌ[2]で示されるｎ[2]個の
部分は各々独立して、Ｏ、ＮＲSUBおよびＳからなる群
から選択される。
【００２１】存在する場合、Ｊ[2]で示されるｎ[2]個の
部分は各々独立して、Ｃ（＝Ｏ）およびＣ（＝Ｓ）から
なる群から選択される。
【００２２】ｎ[1]は、１から３２であり、より好まし
くはｎ[1]は２から１６であり、さらに好ましくはｎ[1]
は２から８であり、最も好ましくはｎ[1]は２から４で
ある。
【００２３】ｎ[2]×ｐ[2]の積が、１より大きくかつ３
３未満という条件で、ｎ[2]は、１から３２であり、よ
り好ましくはｎ[2]は１から１６であり、さらに好まし
くはｎ[2]は１から８であり、さらにより好ましくはｎ
[2]は１から４であり、最も好ましくはｎ[2]は１から２
である；ｐ[2]は、１から８であり、より好ましくはｐ
[2]は１から４であり、最も好ましくはｐ[2]は１から２
である。
【００２４】Ｚ[2]で示されるｎ[2]個の部分は各々独立
して、少なくともｐ[2]個の官能基のための結合部位を
アルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香
族炭素原子上に含む、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐおよび
Ｓからなる群から選択される１−２００の原子を含む基
である。
【００２５】より好ましくは、Ｚ[2]として示されたｎ
[2]個の部分の全ては、同じである。
【００２６】さらに好ましくは、Ｚ[2]として示された
ｎ[2]個の部分は各々独立して以下の群から選択される
式で記述される。
【００２７】
【化４】 但し式中、存在する場合、Ｗ[3]、Ｗ[4]、あるいはＷ
[5]として示されたｎ[2]個の部分は各々独立して、Ｃ、
Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択され
る１−１００の原子を含む基である。
【００２８】Ｙ[3]として示されたｎ[2]個の部分、Ｙ
[4]として示された２×ｎ[2]個の部分、およびＹ[5]と
して示された２×ｎ[2]個の部分は各々独立して、少な
くともｐ [2]個の官能基（Ｙ[3]の場合）、あるいは、ｐ
[2]／２個の官能基（Ｙ[4]およびＹ[5]の場合、但しｐ
[2]／２は整数である）のための結合部位をアルキル炭
素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子
上に含む、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる
群から選択される１−１００の原子を含む基である。
【００２９】より好ましくは、存在する場合、Ｗ[3]と
して示されたｎ[2]個の部分は各々独立して、ｒが１か
ら１０である、（ＣＨ2）r、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）r、ＮＲ
SUB（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）rＣＨ2ＣＨ2、およびＮＲSUB（Ｃ
Ｈ2）rＮＲSUBＣ（＝Ｏ）である。
【００３０】さらに好ましくは、Ｙ[3]で示されたｎ[2]
個の部分は各々独立して、直鎖、分枝、あるいは環状の
（１−２０Ｃ）のアルキル、（６−２０Ｃ）のアリー
ル、あるいは（７−３０Ｃ）のアルカリールである。
【００３１】最も好ましくは、Ｙ[3]で示されたｎ[2]個
の部分は各々独立して、Ｃ6Ｈ4（１，４−二置換フェニ
ル）、Ｃ6Ｈ3（１，３，５，−三置換フェニル）、およ
びｒが１から１０である（ＣＨ2）rからなる群から選択
される。
【００３２】より好ましくは、存在する場合、Ｗ[4]と
して示されたｎ[2]個の部分は各々独立して、ｒが１か
ら１０である、（ＣＨ2）rＣ（＝Ｏ）、および（Ｃ
Ｈ2）rＮＲ SUBＣ（＝Ｏ）からなる群から選択される。
【００３３】より好ましくは、Ｙ[4]として示された２
×ｎ[2]個の部分は各々独立して、ｒが１から１０、よ
り好ましくはｒが２から６で、ｑが１から１０、より好
ましくはｑが１から３である、（ＣＨ2）r、（ＣＨ2）r
ＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）q、（ＣＨ2）rＣ（＝Ｏ）
ＮＲSUB（ＣＨ2）q、（ＣＨ2）rＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（Ｃ
Ｈ2）qＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）r、（ＣＨ2）rＣ
（＝Ｏ）ＮＲSUB（ＣＨ2）qＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（Ｃ
Ｈ2）r、（ＣＨ2）rＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2ＣＨ
2Ｏ） qＣＨ2ＣＨ2、および、（ＣＨ2）rＣ（＝Ｏ）ＮＲ
SUB（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）qＣＨ2ＣＨ2からなる群から選択さ
れる。
【００３４】より好ましくは、存在する場合、Ｗ[5]で
示されたｎ[2]個の部分は各々独立して、ｒが１から１
０である、（ＣＨ2）rＣ（＝Ｏ）ＮＲSUB、および（Ｃ
Ｈ2）rＮＲSUBＣ（＝Ｏ）ＮＲSUBからなる群から選択さ
れる。
【００３５】より好ましくは、Ｙ[5]で示された２×ｎ
[2]個の部分は各々独立して、ｒが１から１０でｑが１
から１０である、（ＣＨ2）r、および（ＣＨ2）rＣ（＝
Ｏ）ＮＲSUB（ＣＨ2）qからなる群から選択される。
【００３６】狼瘡を治療するための、別の好ましい実施
態様では、複合体は、化学的に定義された非ポリマー性
の結合手プラットフォーム分子、および、該プラットフ
ォーム分子に各々結合し、そして、ヒトＳＬＥの抗ｄｓ
ＤＮＡ自己抗体に対して顕著な結合活性を有する、複数
の少なくとも約２０塩基対のポリヌクレオチド二本鎖を
含む。これらの好ましい実施態様では、ポリヌクレオチ
ド二本鎖は、実質的に長さが均一で、そして、二本鎖の
一方の一本鎖が、直接に、あるいはリンカー分子を介し
て、の何れかで結合手プラットフォーム分子と結合され
ている。一般に、合成ポリヌクレオチドをリンカー分子
と結合させ、次いで結合手プラットフォーム分子と結合
させる。一般に、鎖中のリンカー分子が結合した位置か
ら、少なくとも約２０塩基対のペンダント鎖が各鎖に形
成される様に、二本鎖の内のリンカーを含む鎖を、その
一端で、あるいは一端の近傍（即ち、約５塩基対以内）
で結合させる。次いで、第２の鎖を該第１の鎖にアニー
ルし、二本鎖を形成する。従って、本発明の複合体は、
以下の式で一般的に記述し得る：［（ＰＮ）n−リンカ
ー］m−結合手プラットフォーム分子但し式中、ｎは少
なくとも約２０で、ｍは２−８であり、ＰＮはｎ個のヌ
クレオチドを有する二本鎖ポリヌクレオチドである。
【００３７】本発明に適したリンカー分子の例は、チオ
−６炭素鎖ホスフェートであるＨＡＤの様な６個の炭素
のチオール、およびチオ−６炭素鎖ホスホロチオエート
であるＨＡＤpＳである。本発明の化学的に定義された
結合手プラットフォーム分子は、例えば、アミノ修飾し
たＰＥＧと、３，５−ビス−（ヨードアセトアミド）ベ
ンゾイルクロライド（本明細書では以降「ＩＡ−ＤＡＢ
Ａ」と呼ぶ）；３−カルボキシプロピオンアミド−Ｎ，
Ｎ−ビス−［（６’−Ｎ’−カルボベンジルオキシアミ
ノヘキシル）アセトアミド］ ４”−ニトロフェニルエ
ステル（本明細書では以降「ＢＡＨＡ」と呼ぶ）；３−
カルボキシプロピオンアミド−Ｎ，Ｎ−ビス−［（８’
−Ｎ’−カルボベンジルオキシアミノ−３’，６’，−
ジオキサオクチル）アセトアミド］ ４”−ニトロフェ
ニルエステル（本明細書では以降「ＢＡＨＡOX」と呼
ぶ）とを反応させ；あるいは、ＰＥＧ−ビス−クロロホ
ルメートと、Ｎ，Ｎ−ジ（２−［６’−Ｎ’−カルボベ
ンジルオキシアミノヘキサノアミド］エチル）アミン
（本明細書では以降「ＡＨＡＢ」と呼ぶ）とを反応させ
ることにより形成される。
【００３８】驚くべきことに、本発明の化学的に定義さ
れた、非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子と、
生物学的あるいは合成分子（非ハプテン）とからなる複
合体を用いると、従来技術に記載されているポリマー性
の担体に比べ、少なくとも約１０倍から１００倍以上の
免疫抑制という、予期されなかった結果が達成された。
例えば、本明細書に記載したように、化学的に定義され
た、非ポリマー性の結合手プラットフォーム分子を含む
本発明の複合体を用いると、従来技術に記載されている
定義の不明確な担体に比べ、少なくとも１００倍の抗−
ｄｓＤＮＡ自己抗体の免疫抑制が達成された。
【００３９】本発明のさらに別の局面は、（ａ）化学的
に定義された非ポリマー性の結合手プラットフォーム分
子と、（ｂ）二本鎖の一方の鎖の一端あるいは一端の近
傍に位置する官能基により、該結合手プラットフォーム
分子に、各々全てが結合された、複数のポリヌクレオチ
ド二本鎖とからなり、ヒトＳＬＥの免疫寛容原である、
複合体である。
【００４０】上記の複合体の薬学的組成物、および、薬
学的に許容可能な賦形剤は、本発明のさらに別の局面で
ある。
【００４１】本発明の別の局面は、治療を必要とする個
体に、有効な量の上記の複合体を投与する工程を含む、
ＳＬＥを治療する方法である。
【００４２】本発明のさらに別の局面は、有効な量の上
記の複合体を、個体に投与する工程を含む、個体中に、
免疫原に対する特異的なＢ細胞アネルギーを誘起する方
法である。
【００４３】本発明の別の局面は、有効な量の上記の複
合体を個体に投与する工程を含む、免疫原に応答して望
ましくない抗体が産生される、抗体が媒介する疾患を治
療する方法である。
【００４４】本発明の別の局面は、生物学的あるいは合
成分子を、化学的に定義された結合手プラットフォーム
分子に結合させて、複合体を形成する工程を含む、上記
の複合体を製造するための方法である。
【００４５】本発明の別の局面は、各々が少なくとも約
２０ヌクレオチドの長さで、そして、化学的に定義され
た結合手プラットフォーム分子上の官能基と反応する官
能基をその一端あるいは一端の近傍に有する、複数の一
本鎖ポリヌクレオチドを、反応させて複合体を形成する
工程、および、化学的に定義された結合手プラットフォ
ーム分子に結合された一本鎖ポリヌクレオチドと、相補
的な一本鎖ポリヌクレオチドとをアニールして、二本鎖
ＤＮＡのペンダント鎖を形成する工程を含む、上記のＳ
ＬＥを治療するための複合体の製造方法である。
【００４６】本発明のさらに別の局面は、以下の式の新
規な、化学的に定義された非ポリマー性の結合手プラッ
トフォーム分子である：
【００４７】
【化５】 但し、存在する場合、Ｇ[6]およびＧ[7]は各々独立し
て、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択
される１−２０００の、より好ましくは１−１０００
の、鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数に分枝し
た鎖である；さらに好ましくは、Ｇ[6]およびＧ[7]は各
々、ポリアルコール、ポリアミン、あるいはポリグリコ
ールから誘導される基である；最も好ましくは、Ｇ[6]
およびＧ[7]は各々、ｑが０から２０の−（ＣＨ2）
q−、ｒが０から３００の−ＣＨ2（ＣＨ2ＯＣＨ2）rＣ
Ｈ2−、およびｓが１から４の、より好ましくはｓが３
から４の、Ｃ（ＣＨ2０ＣＨ2ＣＨ2−）s（ＯＨ）4-sか
らなる群から選択される。
【００４８】Ｔ[6]として示されたｎ[6]×ｐ[6]個の部
分、および、Ｔ[7]として示されたｎ [7]×ｐ[7]個の部
分は各々独立して、ＮＨＲSUB（アミン）、Ｃ（＝Ｏ）
ＮＨＮＨＲSUB（ヒドラジド）、ＮＨＮＨＲSUB（ヒドラ
ジン）、Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボン酸）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ
ＲESTER（活性エステル）、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）ＲB
（無水物）、Ｃ（＝Ｏ）Ｘ（酸ハライド）、Ｓ（＝Ｏ）
2Ｘ（スルホニルハライド）、Ｃ（＝ＮＲSUB）ＯＲSUB
（イミデートエステル）、ＮＣＯ（イソシアネート）、
ＮＣＳ（イソチオシアネート）、ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ（ハロ
ホルメート）、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝ＮＲSUB）ＮＨＲSUB
（カルボジイミド付加体）、Ｃ（＝Ｏ）Ｈ（アルデヒ
ド）、Ｃ（＝Ｏ）ＲB（ケトン）、ＳＨ（スルフヒドリ
ル、あるいはチオール）、ＯＨ（アルコール）、Ｃ（＝
Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、ＲALKＸ（アルキルハラ
イド）、Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲALKＸ（アルキルスルホネー
ト）、Ｒ 1Ｒ2がＣ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）−であ
るＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2
（α，β−不飽和カルボニル）、ＲALK−Ｈｇ−Ｘ（ア
ルキル水銀）、およびＳ（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，
β−不飽和スルホン）からなる群から選択される。
【００４９】より好ましくは、Ｔ[6]として示されたｎ
[6]×ｐ[6]個の部分、および、Ｔ[7]として示されたｎ
[7]×ｐ[7]個の部分は各々独立して、ＮＨＲSUB（アミ
ン）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、ＲALKＸ
（アルキルハライド）、Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲALKＸ（アルキ
ルスルホネート）、Ｒ1Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ
（＝Ｏ）−であるＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、Ｃ（＝Ｏ）
ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和カルボニル）、ＲALK−
Ｈｇ−Ｘ（アルキル水銀）、およびＳ（＝Ｏ）ＣＲB＝
ＣＲB 2（α，β−不飽和スルホン）からなる群から選択
される。
【００５０】さらに好ましくは、Ｔ[6]として示された
ｎ[6]×ｐ[6]個の部分、および、Ｔ[ 7]として示された
ｎ[7]×ｐ[7]個の部分は各々独立して、ＮＨＲSUB（ア
ミン）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、Ｒ1Ｒ2
が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）−であるＮＲ1Ｒ2
（マレイミド）、Ｃ（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−
不飽和カルボニル）からなる群から選択される。
【００５１】最も好ましくは、Ｔ[6]として示されたｎ
[6]×ｐ[6]個の部分の全て、および、Ｔ[7]として示さ
れたｎ[7]×ｐ[7]個の部分の全ては、同じである。
【００５２】ここで式中、各Ｘは、独立して、原子番号
が１６から５４のハロゲン、あるいは良好な脱離基であ
る。
【００５３】各ＲALKは独立して、直鎖、分枝あるいは
環状の（１−２０Ｃ）のアルキル基である。
【００５４】各ＲSUBは独立して、Ｈ、直鎖、分枝、あ
るいは環状の（１−２０Ｃ）のアルキル、（６−２０
Ｃ）のアリール、あるいは（７−３０Ｃ）のアルカリー
ルである。
【００５５】各ＲESTERは独立して、Ｎ−スクシンイミ
ジル、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、
テトラフルオロフェニル、ペンタフルオロフェニル、
２，４，５−トリクロロフェニル、２，４−ジニトロフ
ェニル、シアノメチル等、の様なその他の活性化基であ
る。
【００５６】各ＲBは独立して、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ
ｉ、ＰおよびＳからなる群から選択される１−５０の原
子を含む基である。
【００５７】ｎ[6]×ｐ[6]の積が、１より大きくかつ３
３未満という条件で、ｎ[6]は、１から３２であり、よ
り好ましくはｎ[6]は１から１６であり、さらに好まし
くはｎ[6]は１から８であり、さらに好ましくはｎ[6]は
１から４であり、最も好ましくはｎ[6]は１から２であ
る；ｐ[6]は、１から８であり、より好ましくはｐ[6]は
１から４であり、最も好ましくはｐ[6]は１から２であ
る。
【００５８】ｎ[7]×ｐ[7]の積が、１より大きくかつ３
３未満という条件で、ｎ[7]は、１から３２であり、よ
り好ましくはｎ[7]は１から１６であり、さらに好まし
くはｎ[7]は１から８であり、さらに好ましくはｎ[7]は
１から４であり、最も好ましくはｎ[7]は１から２であ
る；ｐ[7]は、１から８であり、より好ましくはｐ[7]は
１から４であり、最も好ましくはｐ[7]は１から２であ
る。
【００５９】Ｑ[6]で示されたｎ[6]個の部分、および、
Ｑ[7]で示された２×ｎ[7]個の部分は各々独立して、少
なくともｐ[6]個の（Ｑ[6]の場合）あるいはｐ[7]／２
個の（Ｑ[7]の場合、但しｐ[7]／２は整数である）の官
能基のための結合部位をアルキル炭素原子、アルケニル
炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、Ｃ、Ｈ、
Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択される１
−１００の原子を含む基である。
【００６０】より好ましくは、Ｑ[6]として示されたｎ
[6]個の部分の全ては、同じである。
【００６１】より好ましくは、Ｑ[7]として示された２
×ｎ[7]個の部分の全ては同じである。
【００６２】より好ましくは、Ｑ[6]として示されたｎ
[6]個の部分は各々独立して、ｒが１から１０でｑが１
から１０である、ＣＨ［（ＣＨ2）r（結合部位）］2、
およびＣＨ［（ＣＨ2）rＣ（＝Ｏ）ＮＲSUB（ＣＨ2）q
（結合部位）］2からなる群から選択される。
【００６３】より好ましくは、Ｑ[7]として示された２
×ｎ[7]個の部分は各々独立して、ｒが１から１０、よ
り好ましくはｒが２から６であり、そしてｑが１から１
０、より好ましくはｑが１から３である、（ＣＨ2）r、
（ＣＨ2）rＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）q、（ＣＨ2）r
Ｃ（＝Ｏ）ＮＲSUB（ＣＨ2）q、（ＣＨ2）rＮＲSUBＣ
（＝Ｏ）（ＣＨ2）qＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）r、
（ＣＨ2）rＣ（＝Ｏ）ＮＲSUB（ＣＨ2）qＮＲSUBＣ（＝
Ｏ）（ＣＨ2）r、（ＣＨ2）rＮＲSUBＣ（＝Ｏ）（ＣＨ 2
ＣＨ2Ｏ）qＣＨ2ＣＨ2、および、（ＣＨ2）rＣ（＝Ｏ）
ＮＲSUB（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）qＣＨ2ＣＨ2からなる群から選
択される。
【００６４】
【発明の実施の形態】本明細書で使用する用語「結合手
プラットフォーム分子」は、別個の多くの生物学的およ
び／あるいは化学的な分子の結合を可能とする複数の部
位を有する、化学的に定義された、非ポリマー性の、非
免疫原性の分子を意味する。
【００６５】本明細書で使用する用語「非免疫原性」
は、前記結合手プラットフォーム分子の形容詞に用いら
れ、そして、前記結合手プラットフォーム分子が、単独
で個体に投与された時、または複合体のプラットフォー
ム部分として個体に投与された時に、免疫応答を実質的
に引き起こさないことを意味する。
【００６６】本明細書で使用する用語「個体」は、多く
の哺乳類の種を意味し、ヒト、霊長類、マウス、およ
び、ウシや羊の様な家畜、馬の様な競技用動物、およ
び、犬や猫の様なペット等を含む。
【００６７】本明細書で使用する用語「免疫原（ｉｍｍ
ｕｎｏｇｅｎ）」は、動物に注入した時に、液性免疫応
答を誘起する化学物質である。免疫原は、Ｂ細胞エピト
ープおよびＴ細胞エピトープの両方を有する。
【００６８】本明細書で使用する用語、免疫原の「アナ
ログ」は、（ａ）免疫原が特異的に結合する抗体に特異
的に結合し、そして（ｂ）Ｔ細胞エピトープを欠く分子
の意味である。通常は、アナログは免疫原の断片である
か誘導体であるため、免疫原と同じ化学種に属するが
（例えば、免疫原がポリペプチドで、アナログがポリペ
プチド）、化学的類似性は重要では無い。従って、上記
の（ａ）および（ｂ）の機能的特性を有するという条件
で、アナログは免疫原と異なった化学種（例えば、免疫
原が炭化水素で、アナログがポリペプチド）であり得
る。アナログは、タンパク質、炭水化物、脂質、リポプ
ロテイン、グリコプロテイン、リポポリサッカライド、
核酸、あるいは他の化学的あるいは生物学的物質であり
得る。
【００６９】免疫原のアナログには、「ミモトープ」も
また含まれ得る。本明細書で使用する用語「ミモトー
プ」は、抗体が免疫原と結合するのを競合的に妨げる、
合成分子を意味する。抗体と特異的に結合するので、ミ
モトープは、免疫原の抗原決定部位を模倣していると考
えられている。免疫原のアナログと同様に、ミモトープ
は、（ａ）免疫原が特異的に結合する抗体に特異的に結
合し、そして（ｂ）Ｔ細胞エピトープを欠く。
【００７０】免疫原のアナログには「アプタマー」もま
た含まれ得る。本明細書で使用する用語「アプタマー」
は、抗体が免疫原と結合するのを競合的に妨げる合成オ
リゴヌクレオチドを意味する。免疫原のアナログと同様
にアプタマーは、（ａ）免疫原が特異的に結合する抗体
に特異的に結合し、そして（ｂ）Ｔ細胞エピトープを欠
く。
【００７１】本明細書で使用する用語「Ｂ細胞アネルギ
ー」は、抗体の産生および分泌にＴ細胞の補助を受ける
ことを必要とするＢ細胞の応答の欠如を意味し、そし
て、これらに限定されないが、成熟および／あるいは未
成熟Ｂ細胞のクローン欠損、および／あるいは、Ｂ細胞
が抗体を産生する能力を欠如すること、および／あるい
はアポトーシスを含む。本明細書で使用する用語「応答
の欠如」は、免疫原に対する液性応答の治療的に有効な
減少を意味する。定量的表現では、（抗体産生の減少で
測定される）該減少は、少なくとも５０％、好ましくは
少なくとも７５％、そして最も好ましくは１００％であ
る。
【００７２】本明細書で使用する用語「抗体」は、その
産生が、Ｔ細胞依存性の抗体を意味する。
【００７３】本発明の化学的に定義された結合手プラッ
トフォーム分子の価数は、該プラットフォーム分子に導
入する分枝した基の数により、予め定め得る。適切な分
枝した基は、一般に、ジアミノ酸、トリアミン、および
アミノ二酸から誘導される。本発明の複合体は、生物学
的に安定である；即ち、数時間、数日、あるいは数カ月
のオーダーのｉｎ ｖｉｖｏでの排泄半減期を示し、治
療効果に寄与する。本発明の化学的に定義された結合手
プラットフォーム分子はまた、実質的に非免疫原性であ
り（即ち、動物に投与した際に免疫原性を示さない、あ
るいは穏やかな免疫原性のみを示す）、与えた投与量で
非毒性であり（即ち、治療薬として有用であるために十
分な程度に非毒性）、そして好ましくは、定義された化
学構造からなる。これらは、ポリヌクレオチド二本鎖の
様な、複数の生物学的あるいは合成分子が共有結合で結
合し得る、非免疫原性で非毒性の多官能性基質を提供す
る。これらは通常、約２００から約２００，０００の範
囲の平均分子量を有し、一般には約２００から約２０，
０００である。これらは、分子量が大きく変動する化合
物の混合物である従来技術のポリマーに比べ、均一であ
る。特に好適で均一な本発明の結合手プラットフォーム
分子の例は、約２００から８，０００の分子量を有する
誘導体化した、２，２’−エチレンジオキシジエチルア
ミン（ＥＤＤＡ）、トリエチレングリコール（ＴＥ
Ｇ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であ
る。
【００７４】生物学的あるいは合成分子の、化学的に定
義されたプラットフォーム分子への結合は、多くの方法
で行い得る。典型的には、生物学的あるいは合成分子、
および、結合手プラットフォーム分子の官能基ならび
に、１種類あるいはそれ以上の架橋剤を用いて行われ
る。
【００７５】結合手プラットフォーム分子にカップリン
グされる合成ポリヌクレオチド二本鎖は、少なくとも約
２０ｂｐ、そして好ましくは２０−５０ｂｐからなる。
本明細書に記載するポリヌクレオチドは、他にことわり
が無い限りデオキシリボヌクレオチドであり、５’から
３’方向に記載する。この二本鎖は、実質的に長さが均
一であることが好ましい；即ち、母集団中の長さの変動
が、塩基対の数で表した平均二本鎖長の約±２０％、好
ましくは±１０％を超えない。ヌクレオチド組成もま
た、実質的に均一であることが好ましい；即ち、塩基組
成および塩基配列が、各二本鎖の間で約１０％以上変動
しない。ヌクレオチド組成は、各二本鎖で完全に均一で
あることが最も好ましい。
【００７６】円二色性（ＣＤ）スペクトルの解釈に基づ
くと、本発明に有用である二本鎖は、Ｂ−ＤＮＡタイプ
の螺旋構造であると推測される。ただし、本発明がこの
推測により限定されることは意図しない。より完全な分
析に基づくならば、二本鎖は、Ｚ−ＤＮＡおよび／ある
いはＡ−ＤＮＡタイプの螺旋構造であるかも知れない。
【００７７】これらのポリヌクレオチド二本鎖は、天然
のＤＮＡから合成し得、あるいは化学的あるいは組み換
えの技法で合成し得る。天然あるいは組み換えで産生さ
れたより長鎖のｄｓＤＮＡは、消化（例えば、酵素的消
化、化学的消化、あるいは機械的剪断）され、そして、
（例えば、アガロースゲルあるいはＳｅｐｈａｄｅｘ
（登録商標）カラムで）分画されて、目的の長さのポリ
ヌクレオチドを与え得る。
【００７８】あるいは、長さが約７０塩基迄の相補的な
一本鎖ポリヌクレオチド鎖の対は、一般的な手順で、市
販されているＤＮＡ合成装置を用いて容易に調製され、
次いでアニールされて、二本鎖を形成する。より長鎖の
合成ｄｓＤＮＡは、化学的に製造した複数の短い鎖の酵
素伸張（５’−ホスホリル化し、次にライゲーションす
る）により入手し得る。
【００７９】ポリヌクレオチドは、分子クローニングに
よっても製造し得る。例えば、目的の長さと配列のポリ
ヌクレオチドは上述の様にして合成される。これらのポ
リヌクレオチドは、消化され、特定の制限酵素部位へラ
イゲーションで挿入するための適切な末端を有し得る。
これらのオリゴマーの多数の繰り返しは、縦に並んでラ
イゲートされ得、マルチコピー複製を提供し得る。得ら
れた構築物は、標準的なクローニングベクター中に挿入
し、そして該ベクターを形質転換により、適切な微生物
／細胞に導入する。形質転換体は、標準マーカーにより
確認され、そしてＤＮＡ複製に適した条件下で増殖させ
る。ポリヌクレオチドは、制限酵素での処理、および
（例えば、アガロースゲルあるいはＳｅｐｈａｄｅｘ
（登録商標）カラムによる）一般的なサイズ分画法によ
り、他の微生物／細胞のＤＮＡから単離され得る。
【００８０】あるいは、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョン（ＰＣＲ）技術により、ポリヌクレオチドを複製し
得る。Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９８５） ２３０：１３５０；Ｓａｃｋｉら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ （１９８８） ２３９：４８７、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌ １２， ｐ １４．１−
１４．３５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ （１９８９）などを参照。
【００８１】実施例に記載したアッセイにより、ＳＬＥ
抗血清に対する結合活性で、ポリヌクレオチドをスクリ
ーニングし得る。結合活性をＩ50（ヌクレオチドのモル
濃度で表した、最大の半分の阻害をもたらすポリヌクレ
オチド濃度）で表現し得る、改変したＦａｒｒアッセイ
は、好適なアッセイである。約５００ｎＭ以下、好まし
くは５０ｎＭ以下のＩ50を有するポリヌクレオチド二本
鎖は、顕著な結合活性を有するとみなされ、それゆえ
に、本発明の複合体の製造に有用である。
【００８２】ポリヌクレオチドは、その抗体結合活性が
保持される様な様式で、化学的に定義された結合手プラ
ットフォーム分子に結合される。これは、ポリヌクレオ
チドを、結合部位から鎖の自由（非結合）端までが少な
くとも約２０塩基対のペンダント鎖を形成する様に、ポ
リヌクレオチド鎖上の定められた位置で、結合手プラッ
トフォーム分子と結合させることで行われる。
【００８３】特に好適な実施態様では、本発明の複合体
のポリヌクレオチドは、その一端で、あるいは一端の近
傍でリンカー分子とカップリングされる。このリンカー
分子を、次に化学的に定義された結合手プラットフォー
ム分子とカップリングさせる。例えば以下の様にして、
定義された二本鎖ＰＮを結合手プラットフォーム分子と
結合し得る。先ず、シトシン（Ｃ）とアデノシン（Ａ）
が交互に存在する約２０の長さのヌクレオチドからなる
一本鎖を用意する。次に、トリエチレングリコールの様
な誘導体化したプラットフォーム分子上の４つの反応部
位に、ＨＡＤ（反応スキーム１１に示されるジスルフィ
ドリンカーを記載するために、トリチルまたはジメチル
ＨＡＤが一般に使用される）の様なリンカーを介して４
本のＣＡ鎖を共有結合させ得る。この結合手プラットフ
ォーム分子は、ブロモアセチルの様な基を含む様に合成
されている。この複合化の際、脱離基は硫黄で置換され
る。次に、チミジン（Ｔ）とグアノシン（Ｇ）が交互に
存在する約２０の長さのヌクレオチドからなる第二の一
本鎖ヌクレオチド鎖を、前記のＣＡ鎖とアニールさせ、
構造式：［（ＰＮ）20−リンカー］4−結合手プラット
フォーム分子の二本鎖鎖ＰＮ複合体を形成し得る。
【００８４】あるいは、他の好適な実施態様では、モル
ホリノブリッジを介して、ポリヌクレオチドの３’末端
で、このポリヌクレオチドを結合手プラットフォーム分
子にカップリングし得る。モルホリノ結合は、ポリヌク
レオチドの一方の鎖の酸化された３’末端リボースを、
誘導体化したプラットフォーム分子上のフリーのアミノ
基と縮合させ、次に、この付加体を還元性の条件に曝す
ことにより、形成される。このカップリングには、誘導
体化した結合手プラットフォーム分子が、少なくともこ
のプラットフォーム分子に結合させるポリヌクレオチド
二本鎖の数と等しい数のアミノ基を有することが必要で
ある。この様な複合体の合成は、二段階で行われる。第
一の段階は、ポリヌクレオチド二本鎖の１つの鎖を、上
記の縮合／還元反応を介して、誘導体化したプラットフ
ォーム分子にカップリングする工程である。一本鎖ポリ
ヌクレオチドを、過ヨウ素酸塩で処理し、３’末端のリ
ボース基を酸化されたリボースに変換することで、酸化
された３’末端リボースを形成する。この一本鎖ポリヌ
クレオチドを次に、ｐＨが約６．０から８．０の誘導体
化した結合手プラットフォーム分子の水溶液に、２−８
℃で徐々に加える。ポリヌクレオチドとプラットフォー
ム分子とのモル比は、全ての複合反応で一般に、約２：
１から約３０：１の範囲、通常は約２：１から約８：
１、そして、好ましくは約４：１から６：１である。こ
のことと関連して、複合体は、巨大分子の様な非常に大
きな分子量を有さないのが好ましい。特に、分子量が２
００，０００よりも大きな繰り返し単位を有する巨大分
子は、Ｔ−細胞依存性の免疫原であり得る。Ｄｉｎｔｚ
ｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８３）１３１：２１９
６；およびＪ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８９）１４３：１２
３９を参照。縮合反応の間（一般に２４−４８時間の反
応時間）あるいは後に、ナトリウムシアノボロハイドラ
イドの様な強力な還元剤を加え、モルホリノ基を形成す
る。次に、二本鎖の相補鎖をこの複合体に加え、そし
て、混合物を加熱し、そして徐冷し、両鎖をアニールさ
せる。この複合体は、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィーで精製され得る。
【００８５】上記のリボースを用いた方法に代わる１つ
の方法は、ポリヌクレオチドの上にアルデヒド基を形成
し、そして、これらの基を、プラットフォーム分子の上
の反応性官能基を介して、該ポリヌクレオチドとプラッ
トフォーム分子とをカップリングさせるために用いるこ
とである。この反応は、ポリヌクレオチドの３’あるい
は５’末端に結合させたｇｅｍ−あるいはｖｉｃｉｎａ
ｌ−ジオールは、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化してアル
デヒドとし得、これをプラットフォーム分子のアミノ官
能基と縮合し得ることを利用している。環状部分、例え
ば５−員環、にジオールが存在する場合、得られる縮合
生成物は、窒素を有するヘテロ環式化合物、例えば、６
−員のモルホリノあるいはピペリジノ環である。このイ
ミノ縮合生成物は、例えば、ソジウムボロハイドライド
あるいはソジウムシアノボロハイドライド等の適切な還
元剤で還元することで安定化し得る。ジオールが非環状
化合物の場合、得られる酸化生成物は、唯１個のアルデ
ヒド基を有し、そしてこの縮合生成物は第２アミンであ
る。
【００８６】他の方法は、アルキルアミノあるいはアル
キルスルフヒドリル基を、適切なヌクレオチドの反応
（例えば、ホスホアミダイト反応）を用いて、ポリヌク
レオチドの３’あるいは５’の何れかの末端に導入する
工程を含む。次に、この親核性基を使用して、例えば、
アルキルアミン誘導体の場合、ジメチルスベリミデート
の様な大過剰のホモ二官能性の架橋試薬と、あるいは、
アルキルスルフヒドリル誘導体の場合、例えば、ｍ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（ＭＢＳ）あるいはスクシンイミジル（４−ヨー
ドアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）等の、過
剰のヘテロ二官能性の架橋試薬と反応させ得る。過剰の
架橋試薬を除去した後に、このポリヌクレオチド誘導体
をプラットフォーム分子上のアミノ基と反応させる。あ
るいは、スルフヒドリル基は、マレイミド、あるいはα
−ハロアセチル基、あるいは他の適切なＭｉｃｈａｅｌ
付加受容体の様なプラットフォーム分子上の親電子セン
ターと反応させ得る。
【００８７】さらに別の方法では、修飾したヌクレオシ
ドを用いる。標準的なＤＮＡ合成反応を用いて、好まし
くは５’あるいは３’末端であるポリヌクレオチドの所
望の位置に、適切なデオキシヌクレオシド誘導体を組み
込み得る。次に、これらのヌクレオシド誘導体を、プラ
ットフォーム分子上のアルキルアミノ基と、特異的にか
つ直接反応させ得る。あるいは、アミン触媒のβ−脱離
の様な、上記のジアルデヒドの反応で起こる副反応は、
結合される鎖の３’末端に適切なヌクレオシド誘導体を
導入することで防ぎ得る。この例は、リボースの５’メ
チレン伸張である；即ち、５’ヒドロキシメチル基の代
わりに５’（２−ヒドロキシエチル）基を導入する。別
の方法では、ホスホネート結合あるいはホスフィネート
結合を、プラットフォーム分子と結合されるポリヌクレ
オチドの３’末端のジヌクレオチドに用いる。
【００８８】（免疫原のアナログ）抗体が媒介する疾患
に関与する免疫原は、アレルゲン、不妊症の精子、リウ
マチ熱の炭水化物複合体、新生児の溶血性疾患の赤血球
Ｒｈ／Ｄ抗原、（治療用のタンパク質、ペプチド、およ
び抗体、の様な個体にとって異物である天然の生物学的
物質を含む）生物学的薬剤等、の様な外来の（個体にと
って異物である）免疫原、あるいは、甲状腺炎（サイロ
グロブリン）、卒中（カルジオリピン）、および重症筋
無力症（アセチルコリンレセプター）、の様な自己免疫
原（自己抗原）であり得る。
【００８９】この様な免疫原のアナログは、候補分子を
スクリーニングして、これらが（ａ）免疫原に対する血
清抗体に特異的に結合するか否か、および（ｂ）Ｔ細胞
エピトープを欠いているか否か、を調べることで確認し
得る。血清抗体への特異的結合は、従来のイムノアッセ
イを用いて調べることが出来、そして、Ｔ細胞エピトー
プの存在あるいは欠如は、従来のＴ細胞活性化試験によ
り調べることが出来る。その意味で、免疫原に対する血
清抗体に「特異的に結合する」アナログは、該抗体に対
する充分なアフィニティーを有している。さらにその意
味で、Ｔ細胞エピトープの試験は、治療を意図する個体
からのＴ細胞、あるいは標的の個体集団を代表する種々
の患者からのＴ細胞を用いて、個々の目的に応じて行わ
れることも理解される。Ｔ細胞エピトープの存在あるい
は欠如は、実施例に記載されたトリチル化チミジン取り
込みアッセイを用いて調べ得る。Ｔ細胞エピトープの存
在はまた、当分野で周知の方法により、Ｔ細胞由来のリ
ンホカインの分泌を測定することで調べ得る。バックグ
ラウンド以上に、統計的に有意なチミジンの取り込みを
誘起しなかったアナログは、Ｔ細胞エピトープを欠くと
みなされる。チミジン取り込みの定量的な量は、免疫原
毎に異なり得る。一般に、約２−３未満の、さらに一般
には約１−２未満の刺激指数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
ｉｎｄｅｘ）は、Ｔ細胞エピトープの欠如を示す。
【００９０】有用なアナログを確認するための、通常の
第一段階は、スクリーニングされるべき候補の、パネル
あるいはライブラリーの調製である。例えば、タンパク
質あるいはペプチドのアナログの場合は、Ｇｅｙｓｅｎ
らの、ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａ
ｎｔｉｇｅｎｓ； Ｃｉｂａ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（１
９８６） １１９：１３１−１４９；Ｄｅｖｌｉｎ ら
のＳｃｉｅｎｃｅ（１９９０） ２４９：４０４−４０
６；Ｓｃｏｔｔらの、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０） ２
４９：３８６−３９０；およびＣｗｉｒｌａら、ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ （１９９０） ８７：６３７８−６３８２
等に記載された様な、合成技術あるいは組み換え法で製
造し得る。１つの合成方法では、各ペプチドが隣のペプ
チドと重複する様に、そして全ての鎖状のエピトープが
表現される様に、約５から３０アミノ酸のペプチドが合
成される。これは、Ｂ細胞エピトープに予測される長さ
よりも１残基少なく、カルボキシル末端およびアミノ末
端の両方を重複させることで行われる。例えば、Ｂ細胞
エピトープの最低要件が６−アミノ酸であると仮定され
るならば、各ペプチドは、５−アミノ酸で隣のペプチド
に重複しなければならない。この実施態様では、次に各
ペプチドを、動物の免疫による、あるいは患者からの何
れかの、天然の免疫原に対して製造された抗血清で、Ｂ
細胞エピトープの存在を同定するためにスクリーニング
する。次に実施例に記載した様に、抗体結合活性を有す
る分子を、Ｔ細胞エピトープの存在に関してスクリーニ
ングする。Ｔ細胞エピトープを欠く分子は、本発明のア
ナログとして有用である。
【００９１】免疫原の（単数あるいは複数の）Ｔ細胞エ
ピトープが、既知であるか、あるいは同定され得るなら
ば、候補アナログのランダムＴ細胞スクリーニングは不
要である。その場合には、その（単数あるいは複数の）
Ｔ細胞エピトープを、機能しない様に変化させ得る（例
えば、そのエピトープの１あるいはそれ以上の成分を化
学的に誘導化するかもしくは除去することで）、あるい
は、例えばペプチドの場合の様に、合成法あるいは組み
換え法等で、完全に除去し得る。
【００９２】ミモトープあるいはアプタマーは、従来の
方法で合成し得、そして、他の免疫原のアナログと同じ
方法でスクリーニングし得る。
【００９３】これらのアナログを、非免疫原性の結合手
プラットフォーム分子とカップリングし、本発明の複合
体を調製する。結合手プラットフォーム分子と、炭水化
物、脂質、リポポリサッカライド、タンパク質、グリコ
プロテイン、薬剤、および目的物のアナログの様な、生
物学的に活性な分子とからなる複合体は、本明細書で例
示する化学反応を利用して合成される。好ましい合成法
は、リンカー分子を生物学的分子上に、適切に選択され
た周知の方法で、組み込む方法である。
【００９４】アドリアマイシン（ドキソルビシン）の様
な薬剤を結合手プラットフォーム分子に結合させる場
合、糖のリング上のアミノ基が、活性エステルを含むプ
ラットフォーム分子と反応し得る。アドリアマイシンは
また、ハロアセチル化したプラットフォームと結合させ
るために、チオール基を含む様に修飾し得る（Ｋａｎｅ
ｋｏ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，２：１３３（１９９１））。
【００９５】オリゴサッカライドの様な炭水化物は、ス
ルフヒドリルを含むリンカーを含む様に修飾し得る（Ｗ
ｏｏｄ，Ｓ．Ｊ． ａｎｄ Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．、Ｂｉ
ｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３：３９
１（１９９２））。スルフヒドリル基はハロアセチル化
プラットフォームに結合させるために用いられる。ある
いは、炭水化物を酸化して、アルデヒドを生成し、これ
をＮａＣＮＢＨ3の存在下に、アミノ化プラットフォー
ムと反応させ得る。
【００９６】エタノールアミン基を含むグリコール脂質
の様な脂質は、プラットフォーム上の活性カルボキシレ
ートと反応させる。糖ユニットを含むリポポリサッカラ
イドは、酸化してアルデヒドを生成し、これをＮａＣＮ
ＢＨ3の存在下にアミノ化プラットフォームと反応させ
て、還元アミノ化により複合体を形成する。
【００９７】Ｆａｂ’抗体断片の様な別のタンパク質の
場合には、タンパク質（Ｆａｂ’）上のスルフヒドリル
基は、ハロアセチル基を介して、プラットフォームに結
合する。グリコプロテインは、イミノチオレートを用い
たチオールリンカーで修飾する。このチオールは、ハロ
アセチル基を含むプラットフォームと反応する。
【００９８】複合体が免疫寛容原として機能する能力、
および、抗体の産生を特異的に抑制する能力は、実施例
に記載したマウスのモデルで評価し得る。
【００９９】この複合体は通常、（例えば、腹腔内、筋
肉内、静脈内等）注射で投与する様に処方される。従っ
て、これらは典型的には、生理食塩水、リンゲル液、ブ
ドウ糖溶液等の様な薬学的に許容可能な水性キャリアー
と組み合わせられる。複合体は通常、処方の約０．０１
重量％から１０重量％を構成する。複合体は、ＳＬＥを
引き起こす自己抗原に対する免疫寛容を少なくとも部分
的に再確立するために充分な量で、個体に投与される。
この様な量は、本明細書では、時に「治療に有効な」量
とも呼ぶ。特定の場合の投与管理、即ち投与量、タイミ
ング、および投与回数は、特定の個体、およびその個体
の病歴により変化する。通常は、約１から１０００μｇ
複合体／Ｋｇ体重で投与される。免疫寛容の状態を達成
および／あるいは維持するためには、繰り返し投与が必
要であり得る。
【０１００】以下の実施例は、本発明、および本発明の
従来技術に対する予期されない効果をさらに説明するも
のである。これらの実施例は、本発明の範囲を制限する
ものでは無い。
【０１０１】
【実施例】（実施例１）以下の反応式は、本発明の誘導
体化した化学的に定義された結合手プラットフォーム分
子を合成する方法を説明している。この実施例では以下
の略号を使用する：ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシト
リフェニルメチル；Ｔｒ＝トリチル；Ｂｚ＝ベンゾイ
ル；Ｃｐ＝デオキシシチジンモノホスフェート；ＣＥ＝
シアノエチル；ＣＰＧ＝制御された有孔ガラス；ＤＭＦ
＝ジメチルホルムアミド；ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＣＤＩ＝カ
ルボニルジイミダゾール；Ｔｓ＝トシル（ｐ−トルエン
スルホニル）；ＤＩＰＡＴ＝ジイソプロピルアンモニウ
ムテトラアゾリド；ＴＢＤＭＳＣｌ＝ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリルクロライド；ＴＢＡＦ＝テトラブチルア
ンモニウムフルオライド；ＮＭＭＯ＝Ｎ−メチルモルホ
リンオキサイド。
【０１０２】
【化６】
【０１０３】
【化７】
【０１０４】
【化８】
【０１０５】
【化９】
【０１０６】
【化１０】
【０１０７】
【化１１】
【０１０８】
【化１２】
【０１０９】
【化１３】
【０１１０】
【化１４】
【０１１１】
【化１５】 （ＣＡ）8、（ＣＡ）10、（ＣＡ）12および（ＣＡ）16
を、ジスルフィドリンカーで修飾するために用いられる
試薬の合成を、次の反応式１１に記載する。
【０１１２】
【化１６】 （ＣＡ）25を、ｖｉｃｉｎａｌ−ジオールリンカーで修
飾するために用いられる試薬の合成を、次の反応式１２
に記載する。
【０１１３】
【化１７】
【０１１４】
【化１８】 （実施例２） （化学的に定義された結合手プラットフォーム分子の合
成） （化合物１−［３，５−ビス−（ヨードアセトアミド）
安息香酸］）ヨード酢酸無水物２．９３ｇ（８．２８ｍ
ｍｏｌ，２．２当量）をＮ2雰囲気下で室温にて３，５
−ジアミノ安息香酸５７２ｍｇ（３．７６ｍｍｏｌ）の
撹拌されたジオキサン（１９ｍＬ）懸濁液に加えた。こ
の混合物を撹拌し、２０時間ホイルで覆い、そしてＥｔ
ＯＡｃ（５０ｍＬ）と１Ｎ ＨＣｌ溶液（５０ｍＬ）と
で分けた。ＥｔＯＡｃ層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ
4で乾燥し、濾過し、そしてロータリーエバポレーター
で濃縮して、褐色の固形物３．３ｇを得た。この物質を
シリカゲルクロマトグラフィー（９４／５／１ＣＨ2Ｃ
ｌ2／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ）によって精製して、９９２
ｍｇ（５４％）の化合物１を白色の固形物として得た：
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）３．８４（ｓ，４Ｈ），７．９１
（ｓ，２Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），１０．５６
（ｓ，２Ｈ）。
【０１１５】（化合物２−［３，５−ビス−（ヨードア
セトアミド）ベンゾイルクロライド］）ＳＯＣｌ2１１
７μＬ（１．６ｍｍｏｌ，１９０ｍｇ）を３９０ｍｇ
（０．８ｍｍｏｌ）の１のＴＨＦ（３４ｍＬ）溶液に加
えた。この混合物を、全ての固形物が溶解するまで（お
よそ３０分間）Ｎ2雰囲気下で還流し、透明な赤褐色の
溶液を得た。この混合物をロータリーエバポレーターで
濃縮し、減圧下で静置して粗製の化合物２を泡状固形物
として得た。この泡状固形物を次の工程に直接用いた。
【０１１６】（化合物３−［α，ω−ビス−（Ｎ−２−
アミノエチルカルバモイル）ポリエチレングリコールの
Ｎ，Ｎ’−ビス−（３，５−ビス−（ヨードアセトアミ
ド）ベンゾイル）誘導体］）α，ω−ビス−（Ｎ−２−
アミノエチルカルバモイル）ポリエチレングリコール
（０．１６ｍｍｏｌ，３３５０ｇ／ｍｏｌ，Ｓｉｇｍ
ａ）５７０ｍｇを風袋を量ったフラスコに入れた。トル
エン（２０ｍＬ）を加え、そして共沸蒸留によって水を
除去した。残留物を減圧下で乾燥して、固形物５４９ｍ
ｇを得、そしてジイソプロピルエチルアミン８９μＬ
（０．６４ｍｍｏｌ）と共にＴＨＦ４ｍＬに溶解した。
粗製の酸クロライドを無水ＴＨＦ４ｍＬ中に溶解し、そ
してＮ2下で３０秒間かけて混合物に加えた。混合物を
室温で１６時間撹拌し、そして０．１Ｎ ＨＣｌ（２５
ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）とで分けた。水層をＣ
Ｈ2Ｃｌ2で再び抽出し、そして有機層を合わせて、Ｈ2
Ｏ２５ｍＬ、次いでＮａＨＣＯ 3溶液５０ｍＬで洗浄し
た。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして濃縮
して、橙色のオイル７８４ｍｇを得た。シリカゲルクロ
マトグラフィー（９／１ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）によ
り、無色のオイル１９０ｍｇを得た。このオイルを熱Ｅ
ｔＯＨ／Ｅｔ2Ｏから結晶化し、Ｎ2圧力下で焼結ガラス
フィルター上で集め、そして減圧下で乾燥して、１７７
ｍｇの化合物３を白色の固形物として得た：ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3）３．４０（ｂｄ ｍ，８Ｈ），３．５９（ｂ
ｄ ｓ，（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n， 他の積分値に比べ極端
に大きい積分値），３．９１（ｓ，８Ｈ），４．２１
（ｍ，４Ｈ），６．０４（ｂｄｍ，２Ｈ），７．５５
（ｂｄ ｍ，２Ｈ），７．７８（ｂｄ ｓ，４Ｈ），
８．１０（ｂｄ ｓ，２Ｈ），９．３０（ｂｄ ｍ，４
Ｈ）：ヨードアセチル測定法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８
４）１４０：６３−７１）：計算値：０．９２ｍｍｏｌ
／ｇ；実測値：０．９６ｍｍｏｌ／ｇ。
【０１１７】（化合物４−［モノ−Ｎ−カルボベンジル
オキシ−３，６−ジオキサ−１，８−ジアミノオクタ
ン］）ベンジルクロロホルメート１４．３ｍＬ（１７．
１ｇ，１００ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬ）溶
液を、１，２−ビス−（２’−アミノエトキシ）エタン
（Ｆｌｕｋａ）２９．０ｍＬ（２９．６ｇ，２００ｍｍ
ｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）溶液に、０℃で１時
間かけて滴下した。この混合物を室温で２４時間撹拌
し、そして１Ｎ ＨＣｌを水層が酸性（ｐＨ２未満）に
留まるまで加えた。水層をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬずつ）
で３回洗浄し、そして１Ｎ ＮａＯＨでｐＨが１３を越
えるまで中和した。この塩基性の水層をＣＨ2Ｃｌ2（７
５ｍＬずつ）で５回抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2層を合わせ
て、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、
１２．７ｇ（４５％）の化合物４を濃厚なオイルとして
得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） ｄ ２．８２（ｂｄ
ｓ，２Ｈ），３．３０−３．６０（ｍ，１２Ｈ），
５．１０（ｓ，２Ｈ），５．７５（ｂｄ ｓ，１Ｈ），
７．２０−７．４０（ｍ，５Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3） ｄ ４１．１，４１．８，６６．５，７０．
０，７０．２，７０．４，７３．５，１２７．９，１２
８．０，１２８．４，１３６．９，１５６．４。
【０１１８】（化合物５−［Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキ
シカルボニルイミノジ酢酸］）Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ，
Ｂ．およびＬａｚｒａｑ， Ｅ．Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８６）２７，１６８５
−１６８６による報告と同様の手順で、この化合物を調
製した。Ｅｔ3Ｎ ４７ｍＬ（３４．２ｇ，３３８ｍｍ
ｏｌ）を、イミノジ酢酸２２．０ｇ（１６９ｍｍｏｌ）
とジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート３６．８ｇ（１
６９ｍｍｏｌ）との撹拌された５０／５０ジオキサン／
Ｈ2Ｏ（１６９ｍＬ）溶液に、室温にて加えた。この混
合物を２４時間撹拌し、そして大部分のジオキサンをロ
ータリーエバポレータで除去した。この混合物を１Ｎ
ＨＣｌ（３５０ｍＬ）と５つのＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ
ずつ）とで分けた。このＥｔＯＡｃ層を合わせて、乾燥
し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、白色の固
形物を得た。ヘキサン／ＥｔＯＡｃで再結晶して、３
５．３ｇ（９０％）の化合物５を結晶として得た：ｍ．
ｐ．１３１−１３２℃融解（ｆｕｓｅｄ）；1Ｈ ＮＭ
Ｒ （ＤＭＳＯ）ｄ １．３５（ｓ，９Ｈ）， ３．８
７（ｓ，２Ｈ），３．９１（ｓ，２Ｈ），１２．６（ｂ
ｄ ｓ，２Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）ｄ ２７．
９，４９．６， ７９．６，１５４．８，１７１．２。
【０１１９】（化合物６）ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド９．９９ｇ（４８．５ｍｍｏｌ）を、４．５２ｇ
７３（１９．４ｍｍｏｌ）の化合物５とＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド４．４６ｇ（３８．８ｍｍｏｌ）とのＴ
ＨＦ（１００ｍＬ）溶液に０℃で加えた。この混合物を
０℃で３時間撹拌し、そしてＥｔ3Ｎ ５．３９ｍＬ
（３．９２ｇ，３８．８ｍｍｏｌ）と１０．９ｇ（３
８．７ｍｍｏｌ）の化合物４とのＴＨＦ（８３ｍＬ）溶
液を加え、そしてこの混合物を５℃で１７時間撹拌し
た。混合物を濾過して固形物を除去し、そして濾液を濃
縮してオイルを得た。このオイルをＥｔＯＡｃ（４００
ｍＬ）と２つの１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍＬずつ）とで分
けた。このＥｔＯＡｃ層を１Ｎ Ｎａ2ＣＯ3 １００ｍ
Ｌずつで３回、およびブライン１００ｍＬで１回洗浄
し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、
１４．２ｇ（９６％）の化合物６を濃厚なオイルとして
得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） ｄ １．４１（ｓ，
９Ｈ），３．３０−３．７０（ｍ，２４Ｈ），３．７０
−３．９０（ｍ，４Ｈ），５．１０（ｓ，４Ｈ），５．
５０（ｂｄ ｓ，２Ｈ），７．１２（ｂｄ ｓ，１
Ｈ），７．３０−７．４０（ｍ，１０Ｈ），８．２４
（ｂｄ ｓ，１Ｈ）。
【０１２０】（化合物７）トリフルオロ酢酸２６．３ｍ
Ｌ（３８．９ｇ，１５６ｍｍｏｌ）を、１４．２ｇ（１
８．６ｍｍｏｌ）の化合物６のＣＨ2Ｃｌ2（１１１ｍ
Ｌ）溶液に加え、そしてこの混合物を室温で３時間撹拌
した。混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して粘
稠なオイルを得、そしてこのオイルをＴＨＦ９３ｍＬに
溶解した。溶液を０℃まで冷却し、そして無水コハク酸
３．７２ｇ（３７．２ｍｍｏｌ）を加え、次いでＥｔ3
Ｎ ５．１８ｍＬ（３．７６ｇ，３７．２ｍｍｏｌ）を
加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で１８時
間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして得られたオ
イルをＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍＬ）と３つのＨ2Ｏ（１０
０ｍＬずつ）とで分けた。このＣＨ2Ｃｌ2層を乾燥し
（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、オイルを得
た。このオイルを、シリカゲルのクロマトグラフィー
（９／１／０．１ ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／酢酸）で精
製して、１０．５ｇ（７４％）の化合物７を粘稠なオイ
ルとして得た；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ２．５０−
２．６０（ｍ，４Ｈ），３．３０−３．６０（ｍ，２４
Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），
５．０７（ｓ，４Ｈ），５．７７（ｂｄｓ，２Ｈ），
７．２０−７．３０（ｍ，１０Ｈ），７．９１（ｂｄ
ｓ，２Ｈ），８．８８（ｂｄ ｓ，１Ｈ）； 13Ｃ（Ｃ
ＤＣｌ3） ｄ ２７．７，２９．０，３９．４，４
１．０，５２．９，５３．８，６６．５，６９．３，６
９．８，７０．０，７０．１，１２７．８，１２８．
１，１２８．３，１３６．７，１５６．６，１６９．
１，１６９．６，１７３．３，１７４．５。
【０１２１】（化合物８−［化合物７の４−ニトロフェ
ニルエステル］）ジシクロヘキシルカルボジイミド１．
６１ｇ（７．８３ｍｍｏｌ）を、３．９８ｇ（５．２２
ｍｍｏｌ）の７と８００ｍｇ（５．７５ｍｍｏｌ）の４
−ニトロフェノールとのＣＨ2Ｃｌ2（２６ｍＬ）溶液に
０℃で加えた。この混合物をＮ2下で室温にて６４時間
撹拌した。混合物を０℃まで冷却し、ＨＯＡｃ １ｍＬ
を加え、そしてこの混合物を０℃で２時間保った。この
固形物を濾過により除去し、そして濾液を濃縮した。こ
の残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（グラジエン
ト、９１／８／１〜８４／１５／１ ＣＨ2Ｃｌ2／ＩＰ
Ａ／ＨＯＡｃ）で精製して、２．５８ｇ（５６％）の化
合物８を粘稠なオイルとして得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3） ｄ ２．６６（ｔ，２Ｈ），２．８４（ｔ，
２Ｈ），３．３２−３．６８（ｍ，２４Ｈ），３．９０
（ｂｄ ｓ，２Ｈ），４．０１（ｂｄｓ，２Ｈ），５．
０６（ｓ，４Ｈ），５．５８（ｂｄ ｍ，２Ｈ），６．
９１（ｂｄ ｍ，１Ｈ），７．２７（ｄ，２Ｈ），７．
３３（ｓ，１０Ｈ），８．２３（ｄ，２Ｈ），９．０１
（ｂｄ ｍ，１Ｈ）。
【０１２２】（化合物１０−［４−ニトロフェニルブロ
モアセテート］）ジシクロヘキシルカルボジイミド９．
２８ｇ（４５ｍｍｏｌ）を、ブロモ酢酸５．０ｇ（３
５．９ｍｍｏｌ）と４−ニトロフェノール８．５０ｇ
（６１．１ｍｍｏｌ）との撹拌されたＥｔＯＡｃ（１８
０ｍＬ）溶液に０℃で加えた。この混合物を５℃で１６
時間撹拌し、そして酢酸１ｍＬを加えた。この混合物を
室温で２０分間撹拌し、次いで２０分間冷凍機中に置い
た。この固形物質を濾過によって除去し、そしてこの濾
液を濃縮して、粘稠なオイルを得、そしてＥｔ2Ｏ／ヘ
キサンから結晶化して、７．７３ｇ（８３％）の化合物
１０を薄片として得た：ｍ．ｐ．８６−８７℃；ＴＬＣ
Ｒｆ＝０．６３（５０／５０／１ヘキサン／ＥｔＯＡ
ｃ／ＨＯＡｃ）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） ｄ ４．
１３（ｓ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，２
Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，２Ｈ）；13Ｃ Ｎ
ＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２４．９，１２２．１，１２
５．３，１５５．５，１６４．９；分析値：Ｃ8Ｈ6Ｂｒ
ＮＯ4に対する計算値：Ｃ，３６．９５；Ｈ，２．３
３；Ｎ，５．３９．実測値：Ｃ，３７．２４；Ｈ，２．
３３；Ｎ，５．４２。
【０１２３】（化合物９）ＮａＨＣＯ3３００ｍｇ
（３．５７ｍｍｏｌ）、次いで２，２1−（エチレンジ
オキシ）−ジエチルアミン（Ｆｌｕｋａ）１６２ｍｇ
（１．０９ｍｍｏｌ）を、２．３７ｇ（２．６８ｍｍｏ
ｌ）の化合物８のジオキサン（１５ｍＬ）とＨ2Ｏ（８
ｍＬ）との溶液に加えた。この混合物を室温で２４時間
撹拌し、そして減圧下で濃縮して、元の容量のおよそ１
／２とした。濃縮物をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）と飽和Ｎ
ａＨＣＯ3溶液（４０ｍＬ）とで分けた。このＣＨ2Ｃｌ
2層を次に０．５Ｎ ＨＣｌずつで２回洗浄した。この
ＣＨ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（Ｍ
ｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、２．８ｇのオイ
ルを得た。この粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラ
フィー（３／６／１／ＣＨ2Ｃｌ2／ＴＨＦ／ＭｅＯＨ）
で精製して、９４０ｍｇ（５９％）の化合物９をオイル
として得た：ＴＬＣ Ｒf＝０．２１（３／６／１ＣＨ2
Ｃｌ2／ＴＨＦ／ＭｅＯＨ）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3） ｄ ２．４５（ｍ，４Ｈ），２．５９（ｍ，４
Ｈ），３．２５−３．５５（ｍ，６０Ｈ），３．８７
（ｓ，４Ｈ），４．０５（ｓ，４Ｈ），５．０７（ｓ，
８Ｈ），５．６２（ｂｄ ｓ，４Ｈ），６．７８（ｂｄ
ｓ，２Ｈ），７．３４（ｂｄ ｓ，２０Ｈ），８．５
６（ｂｄ ｓ，２Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ
２８．１，３０．３，３１．１，３９．４，４１．
１，５２．９，５３．９，６６．５，６９．４，６９．
７，６９．９，７０．２，１２５．３，１２７．８，１
２８．３，１３６．８，１５６．５，１６８．８，１６
９．４，１７２．１，１７３．５。
【０１２４】（化合物３４）１０％Ｐｄカーボン１１０
ｍｇを、２８１ｍｇ（０．１７５ｍｍｏｌ）の化合物９
のＥｔＯＨ（５ｍＬ）とシクロヘキセン（２ｍＬ）との
溶液に窒素下で加え、そして得られる混合物を窒素下で
２時間還流した。冷却時、この混合物をケイソウ土を通
して濾過し、そして減圧下で濃縮して、１７０ｍｇ（９
２％）の化合物３４をオイルとして得た。このオイル
は、精製せずに次の工程で直接用いた； 1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．４５（ｍ，４Ｈ），２．５３
（ｍ，４Ｈ），２．６２（ｍ，４Ｈ），２．８６（ｍ，
８Ｈ），３．４２−３．６０（ｍ，５２Ｈ），４．００
（ｓ，４Ｈ），４．１４（ｓ，４Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ 3）ｄ ２８．２，３０．３，３１．１，３
９．４，４１．１，４６．５，４８．６，５２．９，５
３．８，６９．４，６９．７，７０．２，７２．４，１
６８．９，１６９．５，１７２．３，１７３．８。
【０１２５】（化合物１１）ＮａＨＣＯ3１２８ｍｇ
（１．４ｍｍｏｌ）および２００ｍｇ（０．８５ｍｍｏ
ｌ）の化合物１０を１６５ｍｇ（０．１５５ｍｍｏｌ）
の化合物３４のジオキサン（６ｍＬ）とＨ2Ｏ（３ｍ
Ｌ）との溶液に加えた。得られた混合物を室温で２４時
間撹拌し、そして減圧下で濃縮した。この濃縮物をＳｅ
ｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−１０（ＭｅＯＨ）のクロ
マトグラフィーで精製して、１１４ｍｇ（４６％）の化
合物１１を粘稠なオイルとして得た。分析試料を分取用
ＨＰＬＣ（Ｃ18；グラジエント１５／８５／０．１〜３
０／７０／０．１ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2０／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ，５
０分，２２５ｎｍ）で調製した：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）ｄ ２．５８（ｍ，４Ｈ），２．６５（ｍ，４
Ｈ），３．４３−３．６２（ｍ，６０Ｈ），３．９２
（ｓ，８Ｈ），４．０３（ｓ，４Ｈ），４．１６（ｓ，
４Ｈ）；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ（相対強度）ＭＮａ＋１
６０５（１００），ＭＨ＋１５７９（１），１５８１
（５），１５８３（７），１５８５（６），１５８７
（２）。
【０１２６】（化合物１２−［モノ−Ｎ−カルボベンジ
ルオキシ−１，６−ジアミノヘキサン］）ベンジルクロ
ロホルメート２１ｍＬ（２５．７ｇ，１５０ｍｍｏｌ）
のジオキサン（２００ｍＬ）溶液を、１，６−ヘキサン
ジアミン１７．４９ｇ（１５０ｍｍｏｌ）とＫＨＣＯ3
１９．５８ｇ（１９６ｍｍｏｌ）とのジオキサン（１０
０ｍＬ）とＨ2Ｏ（３００ｍＬ）との撹拌された溶液に
０℃で滴下した。この混合物を室温で１８時間撹拌し、
次いで０℃まで冷却した。この混合物を１２Ｎ ＨＣｌ
で酸性化し、そしてＥｔ2Ｏ１００ｍＬずつで２回抽出
した。水層を１０ＮＮａＯＨで中和し、そしてＥｔ2Ｏ
１００ｍＬずつで８回抽出した。この塩基性の抽出物を
合わせて、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、そして濃縮して、
５．０３ｇ（１３％）の粗製の化合物１２を半固形の残
留物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）ｄ１．２２
−１．５１（ｍ，８Ｈ），２．５４（ｔ，２Ｈ），３．
０２（ｄ ｏｆ ｔ，２Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），
７．３０−７．４８（ｍ，５Ｈ）。
【０１２７】（化合物１３）ジシクロヘキシルカルボジ
イミド９１８ｍｇ（４．４５ｍｍｏｌ）を、４１７ｍｇ
（１．７８ｍｍｏｌ）の化合物５とＮＨＳ４０９ｍｇ
（３．５６ｍｍｏｌ）とのＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に０
℃で加えた。この混合物を０℃で４．５時間撹拌し、そ
して１．０２ｇ（４．０８ｍｍｏｌ）の化合物１２のＴ
ＨＦ（４ｍＬ）溶液を加えた。この混合物をＮ2下で５
℃にて１８時間撹拌した。この濃縮物をＥｔＯＡｃ（３
０ｍＬ）と２つの１Ｎ ＨＣｌ（３０ｍＬずつ）とで分
けた。ＥｔＯＡｃ層を合わせて、Ｈ2Ｏ（３０ｍＬ）お
よび飽和ＮａＨＣＯ3溶液（３０ｍＬ）で連続して洗浄
し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、
粘稠な残留物１．４８ｇを得た。シリカゲルのクロマト
グラフィー（５／９５ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製す
ることにより、１．０４ｇ（８４％）の化合物１３を粘
着性の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ3）
ｄ １．３３（ｍ，８Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），
１．５１（ｍ，８Ｈ），３．１８（ｍ，４Ｈ），３．２
６（ｍ，４Ｈ），３．８１（ｓ，２Ｈ），３．８５
（ｓ，２Ｈ），４．９０（ｂｄ ｓ，２Ｈ），５．１０
（ｓ，４Ｈ），６．８１（ｂｄ ｓ，１Ｈ），７．２８
−７．４０（ｍ，１０Ｈ），８．０５（ｂｄ ｓ，１
Ｈ）。
【０１２８】（化合物１４）トリフルオロ酢酸１４．９
ｍＬを、５．１６ｇ（７．４５ｍｍｏｌ）の化合物１３
のＣＨ2Ｃｌ2（１４．９ｍＬ）溶液に加え、そして得ら
れた混合物を室温で３時間撹拌した。この混合物を減圧
下で濃縮し、そしてＴＨＦ５７ｍＬに再び溶解した。こ
の混合物にＥｔ3Ｎ２．０７ｍＬ（１．５１ｇ，１４．
９ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物に無水コハク酸１．
５ｇ（１４．９ｍｍｏｌ）を加え、次いでこの混合物を
１８時間撹拌した。混合物を１Ｎ ＨＣｌ（７５ｍＬ）
と４つのＣＨ2Ｃｌ2（７５ｍＬずつ）とで分けた。ＣＨ
2Ｃｌ2層を合わせて、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、
そして濃縮して、固形物を得た。ＣＨ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡ
ｃ／ヘキサンから結晶化して、３．８４ｇ（７４％）の
化合物１４を白色の固形物として得た：ｍ．ｐ．１２２
℃；1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）ｄ１．３２（ｍ，８
Ｈ），１．４８（ｍ，８Ｈ），２．５６（ｍ，４Ｈ），
３．１０（ｔ，４Ｈ），３．２３（ｍ，４Ｈ），４．０
０（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｓ，２Ｈ），５．０５
（ｓ，４Ｈ），７．３３（ｍ，１０Ｈ）。
【０１２９】（化合物１５−［化合物１４の４−ニトロ
フェニルエステル］）ジシクロヘキシルカルボジイミド
８８７ｍｇ（４．３０ｍｍｏｌ）を、２．０ｇ（２．８
７ｍｍｏｌ）の化合物１４と４−ニトロフェノール４３
８ｍｇ（３．１５ｍｍｏｌ）とのＴＨＦ（１５ｍＬ）溶
液に０℃で加えた。この混合物を室温にして、１８時間
撹拌し、次いで０℃まで冷却した。次いで、酢酸２００
μＬを加え、そしてこの混合物を０℃で１時間撹拌し
た。この固形物を濾過によって除去し、そして濾液を濃
縮してオイルを得た。シリカゲルのクロマトグラフィー
（９２／８ＣＨ2Ｃｌ2／ＩＰＡ）によって精製し、そし
て得られた固形物をＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンから再結晶し
て、１．５２ｇ（６４％）の化合物１５を白色の固形物
として得た：ｍ．ｐ．６５−６８℃；1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3）ｄ １．３０（ｍ，８Ｈ），１．４７（ｍ，
８Ｈ），２．７１（ｔ，２Ｈ），２．９０（ｔ，２
Ｈ），３．１７（ｍ，４Ｈ），３．２５（ｍ，４Ｈ），
３．９２（ｓ，２Ｈ），４．０８（ｓ，２Ｈ），４．８
６（ｂｄ ｔ，１Ｈ），４．９５（ｂｄｔ，１Ｈ），
５，０９（ｓ，４Ｈ），６．２８（ｂｄ ｔ，１Ｈ），
７．２３（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｍ，１
０Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），８．９５
（ｂｄ ｔ，１Ｈ）。
【０１３０】（化合物１６）８３０ｍｇ（０．９９ｍｍ
ｏｌ）の化合物１５のジオキサン（７．５ｍＬ）溶液
を、２，２1−（エチレンジオキシ）−ジエチルアミン
（Ｆｌｕｋａ）５８μＬ（５９ｍｇ，０．４０ｍｍｏ
ｌ）とＮａＨＣＯ3１１１ｍｇ（１．３１ｍｍｏｌ）と
のＨ2Ｏ（７．５ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を室
温で１８時間撹拌した。混合物を１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍ
Ｌ）とＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）とで分けた。ＣＨ2Ｃｌ2
層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、
粘稠なオイル１．２８ｇを得た。シリカゲルクロマトグ
ラフィー（８４／１５／１ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＨＯ
Ａｃ）によって精製することにより、６７０ｍｇの化合
物１６をロウ質の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3）ｄ １．３２（ｍ，１６Ｈ），１．４９
（ｍ，１６Ｈ），２．４６（ｍ，４Ｈ），２．５８
（ｍ，４Ｈ），３．１０−３．２３（ｍ，１６Ｈ），
３．３４（ｍ，４Ｈ），３．４８（ｍ，４Ｈ），３．５
３（ｓ，４Ｈ），３．８５（ｓ，４Ｈ），４．０２
（ｓ，４Ｈ），５．０５（ｓ，８Ｈ），５．０７（重複
する ｂｄ ｔ，２Ｈ），５．１５（ｂｄ ｔ，２
Ｈ），７．３０（ｍ，２０Ｈ），７．４０（ｂｄ ｔ，
２Ｈ），８．６０（ｂｄ ｔ，２Ｈ）。
【０１３１】（化合物３５）６１３ｍｇ（０．４１ｍｍ
ｏｌ）の化合物１６のＥｔＯＨ（２０．３ｍＬ）とシク
ロヘキセン（１０．１ｍＬ）との溶液を撹拌し、そして
窒素でパージした。１０％Ｐｄカーボン（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ）２０ｍｇを加え、そしてこの混合物を８５℃の油浴
で１．５時間加熱した。冷却時、この混合物を５０／５
０Ｈ2Ｏ／アセトンを用いてケイソウ土を通して濾過し
て、フラスコおよびフィルターをリンスした。この濾液
を減圧下で濃縮して、４４８ｍｇ（１１４％）の化合物
３５をロウ質の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ
2Ｏ） ｄ １．３９（ｍ，１６Ｈ），１．５９（ｍ，
１６Ｈ），２．５７（ｔ，４Ｈ），２．６５（ｔ，４
Ｈ），２．８８（ｔ，８Ｈ），３．２３（ｔ，４Ｈ），
３．２９（ｔ，４Ｈ），３．４２（ｔ，４Ｈ），３．６
５（ｔ，４Ｈ），３．７１（ｓ，４Ｈ），４．０６
（ｓ，４Ｈ），４．３０（ｓ，４Ｈ）。
【０１３２】（化合物１７）ＮａＨＣＯ3５４６ｍｇ
（６．５０ｍｍｏｌ）を、４４５ｍｇ（０．４０６ｍｍ
ｏｌ）の化合物３５のＨ2Ｏ（９．５ｍＬ）溶液に加え
た。得られた混合物に、８３８ｍｇ（３．２５ｍｍｏ
ｌ）の化合物１０のジオキサン（１４．４ｍＬ）溶液を
加えた。この混合物を室温で７時間撹拌し、そして０．
１Ｎ Ｈ2ＳＯ4（５０ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）
とで分けた。ＣＨ2Ｃｌ2層を廃棄し、そして水層をＣＨ
2Ｃｌ2５０ｍＬずつで２回、９／１ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯ
Ｈ５０ｍＬずつで２回、４／１ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ５
０ｍＬで１回、および３／２ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ５０
ｍＬで１回抽出した。抽出物を合わせて、乾燥し（Ｎａ
2ＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、固形物２８２ｍｇ
を得た。ＥｔＯＨ／ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ2Ｏから結晶化す
ることにより、１４３ｍｇ（２４％）の化合物１７を白
色の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／Ｍｅ
ＯＨ） ｄ １．３３（ｍ，１６Ｈ），１．５５（ｍ，
１６Ｈ），２．５５（ｍ，８Ｈ），３．２１（ｍ，１６
Ｈ），３．３９（ｍ，４Ｈ），３．５５（ｍ，４Ｈ），
３．８１（ｓ，８Ｈ），３．９５（ｓ，４Ｈ），４．１
２（ｓ，４Ｈ）．分析値：Ｃ54Ｈ94Ｎ 12０14Ｂｒ4に対
する計算値：Ｃ，４４．５７；Ｈ，６．５１；Ｎ，１
１．５５；Ｂｒ，２１．９７．実測値：Ｃ，４５．８
５；Ｈ，６．４９；Ｎ，１１．３７；Ｂｒ，１９．９
０。
【０１３３】（化合物１８−［１，５−ビス（Ｎ−カル
ボベンジルオキシ−６−アミノヘキサノアミド）−３−
アザペンタン］）カルボニルジイミダゾール３．０９ｇ
（１９．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ−カルボベンジルオキシ−
６−アミノヘキサン酸５．０５ｇ（１９．０ｍｍｏｌ）
のＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）溶液に室温で加えた。この混
合物を１５時間撹拌し、次いでジエチレントリアミン
１．０２ｍＬ（９８２ｍｇ，９．５２ｍｍｏｌ）を加
え、次いでＥｔ3Ｎ２．６５ｍＬ（１．９３ｇ，１９．
０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を４時間撹拌
し、そして固形の生成物を濾過により集めた。再結晶
（ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）により、４．２７ｇ（７５
％）の化合物１８を微細粒固形物として得た：ｍ．ｐ．
１３２−１３３℃；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ １．
３３（ｍ，４Ｈ），１．５２（ｍ，４Ｈ），１．６４
（ｍ，４Ｈ），２．１８（ｔ，４Ｈ），２．７３（ｔ，
４Ｈ），３．１６（ｍ，４Ｈ），３．３５（ｍ，４
Ｈ），４．９６（ｂｄ ｓ，２Ｈ），５．０９（ｓ，４
Ｈ），６．１３（ｂｄｓ，２Ｈ），７．３３（ｓ，１０
Ｈ）；分析値：Ｃ32Ｈ47Ｎ5０6に対する計算値：Ｃ，６
４．２９；Ｈ，７．５０；Ｎ，１１．７２．実測値：
Ｃ，６３．５４；Ｈ，７．７５；Ｎ，１１．９１。
【０１３４】（化合物１９）トリエチレングリコール−
ビス−クロロホルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ）６５７μＬ
（８８０ｍｇ，３．２ｍｍｏｌ）を、４．８６ｇ（８．
１ｍｍｏｌ）の化合物１８のピリジン（１６２ｍＬ）溶
液に２０℃の水浴中で加えた。この混合物は直ちに沈澱
物を形成した。この混合物を１６時間撹拌し、そして得
られた濁った黄色の溶液を減圧下で濃縮した。濃縮物を
ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）と２つの１Ｎ ＨＣｌ（１５
０ｍＬずつ）とで分けた（水層が確実に酸性となるよう
にした）。水層を合わせて、２番目のＥｔＯＡｃ（１５
０ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ層を合わせて、乾燥し
（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮した。得られた残
留物を結晶化して（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＣＨＣ
ｌ3）、１．９２ｇ（４３％）の化合物１９を微黄色の
微細な結晶として得た：ｍ．ｐ．８６−９１℃；1ＨＮ
ＭＲ（ＣＤＣｌ3）１．３１（ｍ，８Ｈ），１．５２
（ｍ，８Ｈ），１．６２（ｍ，８Ｈ），２．２０（ｍ，
８Ｈ），３．２０（ｍ，８Ｈ），３．３９（ｓ，１６
Ｈ），３．６２（ｓ，４Ｈ），３．６８（ｍ，４Ｈ），
４．２６（ｍ，４Ｈ），５．０８（ｓ，８Ｈ），５．３
２（ｂｄ ｓ，４Ｈ），７．３１（ｂｄｓ，４Ｈ），
７．３７（ｓ，２０Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
ｄ ２５．１，２６．２，２６．４，２９．６，３
６．０，３６．２，３８．５，３８．８，４０．８，６
４．５，６６．４，６９．１，７０．３，１２８．０，
１２８．４，１３６．７，１５６．５，１５６．９，１
７３．６；分析値：Ｃ72Ｈ104Ｎ1 0０18に対する計算
値：Ｃ，６１．８７；Ｈ，７．５０；Ｎ，１０．０２．
実測値：Ｃ，６１．６８；Ｈ，７．６３；Ｎ，９．９
５。
【０１３５】（化合物３６）シクロヘキセン３．５ｍＬ
を、８００ｍｇ（０．５７ｍｍｏｌ）の化合物１９の無
水ＥｔＯＨ（５ｍＬ）溶液に加えた。この溶液を窒素下
で静置し、１０％Ｐｄカーボン５００ｍｇを加え、そし
て得られた混合物を２時間撹拌しながら還流した。冷却
時、混合物をケイソウ土を通して濾過し、そして濃縮し
て、５００ｍｇ（１００％）の化合物３６をオイルとし
て得た：1Ｈ ＮＭＲ （５０／５０ ＣＤＣｌ3／ＣＤ
3ＯＤ）ｄ １．２１（ｍ，８Ｈ），１．４９（ｍ，８
Ｈ），１．６２（ｍ，８Ｈ），２．１９（ｔ，Ｊ＝７．
４Ｈｚ，８Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，８
Ｈ），３．３６（ｂｄ ｓ，１６Ｈ），３．６７（ｓ，
４Ｈ），３．７１（ｍ，４Ｈ），４．２１（ｍ，４
Ｈ）。
【０１３６】（化合物２０）ＮａＨＣＯ3３．９ｇ（４
６．４ｍｍｏｌ）を５．０ｇ（５．８ｍｍｏｌ）の化合
物３６のジオキサン（３７．５ｍＬ）とＨ2Ｏ（１２．
５ｍＬ）との溶液に加えた。この混合物を氷浴中で０℃
まで冷却し、そして４−ニトロフェニルブロモアセテー
ト（化合物１０）８．７ｇ（３４．８ｍｍｏｌ）を加え
た。この混合物を０℃で１時間撹拌し、そして１Ｎ Ｈ
2ＳＯ4５０ｍＬを穏やかに加えた。混合物をＥｔＯＡｃ
（５０ｍＬずつ）で３回抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を
廃棄し、そして水層を２０／８０ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2
（５０ｍＬずつ）で６回抽出した。ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃ
ｌ2層を合わせて、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そ
して濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー
（ステップグラジエント９／１ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ次
いで８５／１５／５ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＴＨＦ）で
精製して、３．６２ｇ（４６％）の化合物２０を白色の
固形物として得た：ｍ．ｐ．６６．０−７０．５℃。分
析試料を分取用ＨＰＬＣ（Ｃ18逆相カラム、グラジエン
ト２５／７５／０．１〜３５／６５／０．１ＣＨ3ＣＮ
／Ｈ2Ｏ／ＣＦ 3ＣＯ2Ｈ５０分間にわたって、２２５ｎ
ｍ）で調製して、透明のオイルを得た。このオイルを減
圧下で静置して白色の固形物を得た：ｍ．ｐ．８７−８
９℃；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） ｄ １．３５（ｍ，
８Ｈ），１．５５（ｍ，８Ｈ），１．６４（ｍ，８
Ｈ），２．２６（ｍ，８Ｈ），３．２８（ｍ，８Ｈ），
３．４２（ｂｄ ｓ，１６Ｈ），３．６６（ｓ，４
Ｈ），３．７０（ｍ，４Ｈ），３．８９（ｓ，８Ｈ），
４．１９（ｍ，４Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
ｄ２５．１，２６．２，２８．８，２９．０，３８．
５，３９．１，４０．０，４７．８，４８．３，６４．
７，６９．１，７０．３，１５７．０，１６６．３，１
７４．９；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ（相対強度）ＭＨ＋
［１３４１（２５），１３４３（６０），１３４５（７
０），１３４７（５６），１３４９（２１）］，７０
５．６（１００）；分析値：Ｃ48Ｈ84Ｎ10Ｏ14Ｂｒ4に
対する計算値：Ｃ，４２．８６；Ｈ，６．２９；Ｎ，
９．２７；Ｂｒ，２３．７７．実測値：Ｃ，４２．１
５；Ｈ，６．２８；Ｎ，９．８７；Ｂｒ，２５．３３。
【０１３７】（化合物２１−［テトラキス−（２−シア
ノエトキシメチル）メタン］）報告された方法（Ｂｒｕ
ｓｏｎ，Ｈ．Ａ．，米国特許第２，４０１６０７号；１
９４６年６月４日）と同様にして、この化合物を調製し
た。アクリロニトリル２７．３ｍＬ（２１．８ｇ，４１
１ｍｍｏｌ）を、ペンタエリスリトール８．０ｇ（５
８．８ｍｍｏｌ）と４０％水酸化ベンジルトリメチルア
ンモニウム水溶液１．７６ｍＬとの撹拌されたＨ2Ｏ
（５０ｍＬ）溶液に加えた。還流冷却器を備え付け、そ
して混合物をＮ2雰囲気下で撹拌しながら、４０℃で１
６時間、次いで６０℃で２４時間加熱した。冷却時、混
合物を濃ＨＣｌ １ｍＬで酸性化し、そして分液ロート
に移した。底に沈澱したオイルを集め、そして水層をＣ
Ｈ2Ｃｌ2 ４０ｍＬずつで３回抽出した。オイルおよび
合わせた抽出物を、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そ
して濃縮して、オイル２３．５ｇを得た。ビスシアノエ
チルエーテルを、クーゲルロール（Ｋｈｕｇｅｌｒｈｏ
ｒ）蒸留によって、１１０℃で０．２５ｔｏｒｒで除去
した。ポット残留物をＨ2Ｏ１Ｌから結晶化して８．４
３ｇ（４１％）の化合物２１を白色の針状結晶として得
た：ｍ．ｐ．４２．５℃［（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ
ｅｓ １９９１，２４，１４４３−１４４４．）には３
９−４０℃と報告されている］；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）ｄ２．６１（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，８Ｈ），３．５０
（ｓ，８Ｈ），３．６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，８Ｈ）。
【０１３８】（化合物２２−［テトラキス−（２−カル
ボキシエトキシメチル）メタン］）５．０ｇ（１４．３
５ｍｍｏｌ）の化合物２１の濃ＨＣｌ（２１．５ｍＬ）
溶液を７５℃で３時間撹拌した。この間、白色の沈澱が
生成した。減圧下でＨＣｌ水溶液を除去し、そして混合
物をＨ2Ｏ（２５ｍＬずつ）から２回濃縮した。得られ
た固形物質９．６８ｇを、水酸化物の形態のＤＯＷ−１
−Ｘ２樹脂床１６．５ｃｍを含有する内径４５ｍｍのカ
ラム上に装填し、そしてカラムをＨ2Ｏ２００ｍＬ、次
いで１Ｎ ＨＣｌで溶出した。ＴＬＣ（８０／２０／１
ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／ＨＯＡｃ）で示される、生成物を含
有する画分を濃縮して、１．２１ｇ（２１％）の２２を
オイルとして得た：1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）ｄ ２．４６
（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，８Ｈ），３．２２（ｓ，８Ｈ），
３．５５（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，８Ｈ）。
【０１３９】（化合物２３）塩化チオニル３．７１ｍＬ
（６．０６ｇ，５０．８ｍｍｏｌ）を、１．１２ｇ
（２．８５ｍｍｏｌ）の化合物２２のＴＨＦ（７．０ｍ
Ｌ）溶液に加えた。この混合物を室温で３時間撹拌し、
そして溶媒を減圧下で除去した。粗製の酸クロライドを
ＴＨＦ（７ｍＬ）に溶解した。次いで、この溶液にＥｔ
3Ｎ２．１２ｍＬ（１．５４ｇ，１５．２４ｍｍｏｌ）
を加えた。この混合物をＮ2下で撹拌し、そして０℃ま
で冷却した。３．６０ｇ（１２．７４ｍｍｏｌ）の化合
物４のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を１分間かけて加えた。冷
却浴を除去し、そして混合物を室温で５．５時間撹拌
し、次いで、１Ｎ ＨＣｌ（２５ｍＬ）と４つのＥｔＯ
Ａｃ（２５ｍＬずつ）とで分けた。ＥｔＯＡｃ層を合わ
せ、ブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過
し、そして濃縮して、粘稠なオイル３．４６ｇを得た。
シリカゲルのクロマトグラフィー（９５／５ＣＨ2Ｃｌ2
／ＭｅＯＨ）によって精製することにより、１．２６ｇ
（３０％）の化合物２３を粘稠なオイルとして得た：1
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．４０（ｔ，８Ｈ），
３．２９（ｓ，８Ｈ），３．３５（ｍ，１６Ｈ），３．
４８−３．７７（ｍ，４８Ｈ），５．１２（ｓ，８
Ｈ），５．６０（ｂｄ，４Ｈ），６．８５（ｂｄ，４
Ｈ），７．３４（ｓ，２０Ｈ）。
【０１４０】（化合物３７）シクロヘキセン４．０ｍＬ
および１０％Ｐｄカーボン８３ｍｇを、Ｎ2下で、１４
２ｍｇ（０．０９３ｍｍｏｌ）の化合物２３のＥｔＯＨ
（８．４ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を９０℃の油
浴で３時間撹拌しながら還流し、そして、冷却時、ケイ
ソウ土を通して濾過してＣＨ2Ｃｌ2を用いてフィルター
およびフラスコを洗浄した。濾液を濃縮して７０ｍｇ
（７８％）の化合物３７をオイルとして得た：1Ｈ Ｎ
ＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．９０（ｔ，８Ｈ），３．３
３（ｓ，８Ｈ），３．４５（ｔ，８Ｈ），３．５２−
３．７３（ｍ，４８Ｈ）。
【０１４１】（化合物２４）ＮａＨＣＯ3４０ｍｇ
（０．４８ｍｍｏｌ）および１０４ｍｇ（０．４０ｍｍ
ｏｌ）の化合物１０を、７０ｍｇ（０．０９８ｍｍｏ
ｌ）の化合物３７のジオキサン（２ｍＬ）とＨ2Ｏ
（０．６７ｍＬ）との溶液に加えた。この混合物を室温
で１７時間撹拌し、そして１Ｎ Ｈ2ＳＯ4０．５ｍＬを
加え、ｐＨを４にする。混合物を濃縮し、そして濃縮物
をＧ−１０Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）（ＭｅＯＨ）
のクロマトグラフィーで精製した。生成物を含有する画
分を減圧下で濃縮してオイル９１ｍｇを得た。ＨＰＬＣ
（Ｃ18，グラジエント２０／８０／０．１〜３５／６５
／０．１ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ）によって粗
製の生成物３６ｍｇを精製することにより、１９ｍｇ
（４４％）の化合物２４をオイルとして得た：1Ｈ Ｎ
ＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．５０（ｔ，８Ｈ），３．３
１（ｓ，８Ｈ），３．３６−３．７２（ｍ，５６Ｈ），
３．９１（ｓ，８Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ
２８．８，３６．５，３９．７，４０．０，６７．
２，６９．３，６９．５，７０．３，１６６．６，１７
３．０．ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ（相対強度）ＭＨ+［１
４２５（１５），１４２７（６３），１４２９（７
５），１４３１（６４），１４３３（１２）］，５７７
（１００）。
【０１４２】（化合物２５ａ−［ＰＥＧ3350のビス−ト
シレート］）ピリジン６．４７ｍＬを、共沸蒸留（トル
エン）によって乾燥したポリエチレングリコール（Ｊ．
Ｔ．Ｂａｋｅｒ、平均分子量１モルあたり３３５０ｇ）
１６．７５ｇ（５．０ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2４０ｍＬ
中の溶液に加えた。溶液を窒素下で静置し、そして０℃
まで冷却した。塩化トシル７．６３ｇ（４０ｍｍｏｌ）
のＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）溶液を２５分間かけて加え
た。冷却浴を除去し、そして混合物を室温で１６時間撹
拌した。混合物を１Ｎ ＨＣｌ８０ｍＬと共に振盪し、
そしてエマルジョンを含有するＣＨ2Ｃｌ2層をＨ2Ｏ１
００ｍＬで洗浄した。ＣＨ2Ｃｌ2層を、乾燥し（ＭｇＳ
Ｏ4）、濾過し、そして濃縮した。この残留物をＣＨ2Ｃ
ｌ2／Ｅｔ2Ｏから結晶化して、１６．８２ｇ（９２％）
の化合物２５ａを白色の固形物として得た：1Ｈ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．５０（ｓ，６Ｈ），３．４８
（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，４Ｈ），３．５５−３．７７（ｍ，
６００Ｈより大きい，大きすぎて正確ではない積分
値），３．８３（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，４Ｈ），７．４４
（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝７Ｈ
ｚ，４Ｈ）。
【０１４３】（化合物２６ａ−［ジアジド−ＰＥ
Ｇ3350］）１０．８３ｇ（２．９６ｍｍｏｌ）の化合物
２５ａとＮａＮ3１．９２ｇ（２９．６ｍｍｏｌ）との
ＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液を、Ｎ2下で、１２０℃の油浴
中で３時間加熱した。冷却時、この混合物をＨ2Ｏ（１
００ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）とで分けた。Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2層をＣＨ2Ｃｌ2を用いて２００ｍＬまで希釈
し、そして１Ｎ ＨＣｌ１００ｍＬで洗浄し、乾燥し
（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして濃縮した。得られたロ
ウ質の固形物を再結晶（ＣＨ2Ｃｌ2／Ｅｔ2Ｏ）し、そ
して得られた固形物をシリカゲルのクロマトグラフィー
（グラジエント９８／２〜９５／５ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯ
Ｈ）でさらに精製して、４．７５ｇ（４７％）の化合物
２６ａをロウ質の固形物として得た：ＴＬＣ Ｒｆ０．
４１（９／１ ＣＨ2Ｃｌ2）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）ｄ ３．３５（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，４Ｈ），３．４
４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ），３．５４−３．７７
（ｍ，およそ３００Ｈ，大きすぎて正確ではない積分
値），３．７９（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１４４】（化合物２７ａ−［ジアミノ−ＰＥ
Ｇ3350］）１０％Ｐｄカーボン（Ａｌｄｒｉｃｈ）４７
３ｍｇを、４．７５ｇ（１．３９ｍｍｏｌ）の化合物２
６ａのＥｔＯＨ（１４０ｍＬ）溶液に加えた。この混合
物を６０ｐｓｉのＨ2下で３０時間振盪した。反応が不
完全であった（ＴＬＣ，９／１ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）
ため、さらに１０％Ｐｄカーボン４７３ｍｇを加え、そ
してこの混合物を６０ｐｓｉのＨ2下でさらに５時間振
盪した。次いで、混合物をケイソウ土を通して濾過し、
減圧下で濃縮し、そして濃縮物を結晶化して（ＣＨ2Ｃ
ｌ2／Ｅｔ2Ｏ）、４．０３ｇ（８６％）の化合物２７ａ
を白色の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
ｄ ２．９２（ｔ，４Ｈ），３．４９（ｔ，２Ｈ），
３．６６（ｔ，４Ｈ），３．６７（ｍ，およそ３００
Ｈ，大きすぎて正確ではない積分値），３．８６（ｔ，
２Ｈ）。
【０１４５】（化合物２８−［化合物７のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミジルエステル］）ジシクロヘキシルカル
ボジイミド５９６ｍｇ（２．８９ｍｍｏｌ）を、１．８
４ｇ（２．４１ｍｍｏｌ）の化合物７とＮＨＳ２７８ｍ
ｇ（２．４１ｍｍｏｌ）とのＴＨＦ（１２ｍＬ）溶液に
Ｎ2下０℃で加えた。冷却浴を除去し、そして混合物を
室温で１６時間撹拌した。この混合物に酢酸２５０μＬ
を加えた。室温で１時間撹拌を続けた。次いで、混合物
を冷凍機中に２時間静置した。固形物を濾過によって除
去し、そして濾液を濃縮して、２．２７ｇ（１１０％）
の粗製の化合物２８を粘稠なオイルとして得た。化合物
２８を分解しないように精製することは困難であったの
で、この化合物２８は、ジアミノ−ＰＥＧをアシル化す
るために直接用いた。
【０１４６】（化合物２９ａ）９００ｍｇ（１．０５ｍ
ｍｏｌ）の化合物２８のジオキサン（４．６８ｍＬ）溶
液を、８７７ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）の化合物２７ａ
とＮａＨＣＯ3１７６ｍｇ（２．１０ｍｍｏｌ）とのＨ2
Ｏ（３．１２ｍＬ）溶液に０℃で加えた。この混合物を
２時間撹拌し、次いで１Ｎ ＨＣｌ（２５ｍＬ）と２つ
のＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬずつ）とで分けた。ＣＨ2Ｃｌ2
層を合わせて、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして
濃縮して、粘稠なオイルを得た。シリカゲルクロマトグ
ラフィー（グラジエント，９５／５〜８７／１３ＣＨ2
Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）によって精製することにより、６９
５ｍｇ（５５％）の化合物２９ａをロウ質の固形物とし
て得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） ｄ ２．５５（ｂ
ｄ，８Ｈ），３．３９（ｍ，１６Ｈ），３．４４−３．
７２（ｍ，およそ４３２Ｈ，大きすぎて正確ではない積
分値），３．８９（ｓ，４Ｈ），４．０３（ｓ，４
Ｈ），５．０９（ｓ，８Ｈ），７．３６（ｓ，２０
Ｈ）。
【０１４７】（化合物３８ａ）シクロヘキセン７．１ｍ
Ｌを、６８８ｍｇ（０．１４２ｍｍｏｌ）の化合物２９
ａのＥｔＯＨ（１４．２ｍＬ）溶液にＮ2下で加えた。
１０％Ｐｄカーボン２８４ｍｇを加え、そして得られた
混合物を２時間還流した。冷却時、混合物をケイソウ土
を通してＥｔＯＨで濾過し、そして濾液を減圧下で濃縮
して５５０ｍｇ（９０％）の化合物３８ａをロウ質の固
形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．５
８（ｍ，８Ｈ），２．９３（ｍ，８Ｈ），３．３８−
３．７６（ｍ，およそ５５０Ｈ），４．００（ｓ，４
Ｈ），４．１３（ｓ，４Ｈ）。
【０１４８】（化合物３０ａ）２６８ｍｇ（１．０４ｍ
ｍｏｌ）の化合物１０のジオキサン（４．６５ｍＬ）溶
液を、５５０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）の化合物３８ａ
とＮａＨＣＯ3１７５ｍｇ（２．０８ｍｍｏｌ）とのＨ2
Ｏ（３．１１ｍＬ）溶液に０℃で加えた。この混合物を
２０時間撹拌し、そして１Ｎ Ｈ2ＳＯ4（５０ｍＬ）と
２つのＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬずつ）とで分けた。ＣＨ2
Ｃｌ2層を合わせて、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、
そして濃縮して、オイルを得た。Ｇ−１０Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ（登録商標）クロマトグラフィー（ＭｅＯＨ）で精
製することにより、非晶質の固形物を得た。この固形物
を結晶化して（ＥｔＯＨ／Ｅｔ2Ｏ）、３７８ｍｇ（６
１％）の化合物３０ａを白色の固形物として得た：1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ２．５９（ｂｄ ｓ，８
Ｈ），３．３８−３．８２（ｍ，およそ５００Ｈ，大き
すぎて正確ではない積分値），３．８８（ｓ，８Ｈ），
３．９８（ｓ，４Ｈ），４．１０（ｓ，４Ｈ）；ブロモ
アセチル測定法（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４，１４０，
６３−７１）：計算値，０．８４ｍｍｏｌ／ｇ；実測
値，０．５０ｍｍｏｌ／ｇ。
【０１４９】（化合物２５ｂ−［ＰＥＧ8000のビス−ト
シレート］）トリエチルアミン２．３ｍＬ（１６．５ｍ
ｍｏｌ）、次いでＴｓＣｌ３．１５ｇ（１６．５ｍｍｏ
ｌ）を、共沸蒸留（トルエン）によって乾燥したＰＥＧ
8000（Ａｌｄｒｉｃｈ、平均分子量８０００ｇ／ｍｍｏ
ｌ）１２．０ｇ（１．５ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2３０ｍ
Ｌ中の溶液に加えた。この混合物を室温で１８時間撹拌
し、そして１Ｎ ＨＣｌ（５０ｍＬずつ）で４回、次い
で飽和ＮａＣｌ溶液（５０ｍＬ）で１回抽出した。ＣＨ
2Ｃｌ2層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして減圧
下で濃縮して、ロウ質の固形物を得た。再結晶（ＣＨ2
Ｃｌ2／Ｅｔ2Ｏ）により、１１．０ｇ（９２％）の化合
物２５ｂを白色の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3）ｄ ２．３８（ｓ，６Ｈ），３．４０−３．
８９（ｍ，およそ８００Ｈ，大きすぎて正確ではない積
分値），４．１４（ｍ，４Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝
８．２Ｈｚ，４Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，
４Ｈ）。
【０１５０】（化合物２６ｂ−［ジアジド−ＰＥ
Ｇ8000］）ＮａＮ3１．８６ｇ（２８．６ｍｍｏｌ）
を、１０．８ｇ（１．３ｍｍｏｌ）の化合物２５ｂの乾
燥ＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物をＮ2
下で１２０℃にて２．５時間加熱した。冷却時、この混
合物をＣＨ2Ｃｌ2（２４０ｍＬ）と３つの０．５Ｎ Ｈ
Ｃｌ（５０ｍＬずつ）とで分けた。ＣＨ2Ｃｌ2層を飽和
ＮａＣｌ溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2Ｓ
Ｏ4）、濾過し、そして濃縮して、固形物を得た。シリ
カゲルのクロマトグラフィー（グラジエント２／９８〜
６／９４ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）で精製し、そして精製
した生成物を再結晶（ＭｅＯＨ／Ｅｔ2Ｏ）することに
より、６．９５ｇ（６６％）の化合物２６ａを白色の固
形物として得た：ＴＬＣ（Ｒｆ＝０．３３，１２／８８
ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
３．３９−３．８６（ｍ）。
【０１５１】（化合物２７ｂ−［ジアミノ−ＰＥ
Ｇ8000］）６．９ｇ（０．８６ｍｍｏｌ）の化合物２６
ｂのアンモニアで飽和したＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）溶液
を窒素でパージした。１０％Ｐｄカーボン１．５ｇを加
え、そしてこの混合物を６５ｐｓｉのＨ2下で振盪し
た。２０時間後、ＴＬＣ分析により、反応が不完全であ
ることが示された。結果として、１０％Ｐｄカーボン２
００ｍｇを加え、そして６５ｐｓｉのＨ2下でさらに２
０時間振盪を続けた。この混合物をケイソウ土を通して
濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。得られたロウ質の固
形物を再結晶して（ＭｅＯＨ／Ｅｔ2Ｏ）、６．０ｇ
（８９％）の化合物２７ｂを白色の固形物として得た：
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．９６（ｔ，Ｊ＝５．
１Ｈｚ，４Ｈ），３．４０−３．８９（ｍ，およそ７０
０Ｈ，大きすぎて正確ではない積分値）。
【０１５２】（化合物２９ｂ）ＮａＨＣＯ3２２１ｍｇ
（２．６３ｍｍｏｌ）を、３．０ｇ（０．３７５ｍｍｏ
ｌ）の化合物２７ｂの水（１０ｍＬ）とジオキサン（３
ｍＬ）との溶液に加えた。次いで、ジオキサン（１０ｍ
Ｌ）に溶解した１．３ｇ（１．５１ｍｍｏｌ）の化合物
２８を加えた。この混合物を２４時間撹拌し、次いで
０．５Ｎ ＨＣｌ（４０ｍＬ）を加えた。この混合物を
ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬずつ）で４回抽出した。ＣＨ2Ｃ
ｌ2層を合わせて、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そし
て濃縮して、オイルを得た。ＭｅＯＨ／Ｅｔ2Ｏから結
晶化することにより、２．０ｇ（５８％）の化合物２９
ｂを得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．５２
（ｍ，８Ｈ），３．４０−３．６４（ｍ，およそ７００
Ｈ，大きすぎて正確ではない積分値），３．８９（ｓ，
４Ｈ），４．０２（ｓ，４Ｈ），５．０９（ｓ，８
Ｈ），７．３５（ｓ，２０Ｈ）。
【０１５３】（化合物３８ｂ）１０％Ｐｄカーボン１２
３ｍｇを、６００ｍｇ（０．０６３ｍｍｏｌ）の化合物
２９ｂの無水ＥｔＯＨ（５ｍＬ）とシクロヘキセン
（２．５ｍＬ）との溶液に、窒素下で加えた。この混合
物を窒素下で２時間還流した。この反応混合物をケイソ
ウ土を通して濾過し、エバポレートして５４９ｍｇ（９
７％）の化合物３８ｂを白色の固形物として得た：1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．５８（ｍ，８Ｈ），
２．９０（ｍ，８Ｈ），３．３９−３．７０（ｍ，およ
そ７００Ｈ，大きすぎて正確ではない積分値），４．０
５（ｓ，４Ｈ），４．１５（ｓ，４Ｈ）。
【０１５４】（化合物３０ｂ）ＮａＨＣＯ3１００ｍｇ
（１．２ｍｍｏｌ）、次いで８４ｍｇ（０．３２ｍｍｏ
ｌ）の化合物１０を、５２９ｍｇ（０．０５９ｍｍｏ
ｌ）の化合物３８ｂのジオキサン（２ｍＬ）と水（５ｍ
Ｌ）との溶液に加えた。１２時間撹拌後、この反応物を
１Ｎ Ｈ2ＳＯ4で酸性化し、そしてＣＨＣｌ3（４０ｍ
Ｌずつ）で４回抽出した。ＣＨＣｌ3層を合わせて、乾
燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮して、５０３
ｍｇの半固形の残留物を得た。この残留物を、Ｇ−１０
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）のクロマトグラフィー
（ＭｅＯＨ）で精製し、そして結晶化して（ＭｅＯＨ／
Ｅｔ2Ｏ／ヘキサン）、２１５ｍｇ（３９％）の化合物
３０ｂを白色の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3）ｄ ２．５８（ｍ，８Ｈ），３．３５−３．７
０（ｍ，およそ７００Ｈ，大きすぎて正確ではない積分
値），３．８９（ｓ，８Ｈ），４．０１（ｓ，４Ｈ），
４．１６（ｓ，４Ｈ）；ブロモアセチル測定法（Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１９８４，１４０，６３−７１）：計算値，
０．４２ｍｍｏｌ／ｇ；実測値，０．２７ｍｍｏｌ／
ｇ。
【０１５５】（化合物３１−［ＰＥＧ3350−ビス−クロ
ロホルメート］）乾燥ピリジン２滴、次いでトリホスゲ
ン１２５ｍｇ（０．４１８ｍｍｏｌ）を、共沸蒸留（ト
ルエン）によって乾燥したポリエチレングリコール
（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、平均分子量１モルあたり３３５
０ｇ）１．０ｇ（０．２４９ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2１
２ｍＬ中の溶液に加えた。この混合物を室温で２０時間
撹拌し、そして溶媒を減圧下でエバポレートして１．０
ｇ（１００％）の化合物３１を白色の固形物として得
た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ３．４０−３．６５
（ｍ，およそ３００Ｈ，大きすぎて正確ではない積分
値），３．７７（ｍ，４Ｈ），４．４６（ｍ，４Ｈ）。
【０１５６】（化合物３２）１．０ｇ（０．２５ｍｍｏ
ｌ）の化合物３１の５：１ＣＨ2Ｃｌ2／ジオキサン（１
２ｍＬ）溶液を、６００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）の化合
物１８のジオキサン（１０ｍＬ）とピリジン（１．５ｍ
Ｌ）との５０℃の溶液に滴下した。得られた濁った溶液
を７２時間撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）を加え、
次いでこの混合物を濾過した。濾液をエバポレートし、
そして半固形の残留物を、Ｇ−１０Ｓｅｐｈａｄｅｘ
（登録商標）のクロマトグラフィーで精製した。得られ
た固形物を結晶化して（ＣＨ2Ｃｌ2／Ｅｔ2Ｏ）、８２
９ｍｇ（７５％）の化合物３２を微黄色の固形物として
得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ １．３０（ｍ，８
Ｈ），１．４０（ｍ，８Ｈ），１．６１（ｍ，８Ｈ），
２．１８（ｍ，８Ｈ），３．１７（ｍ，８Ｈ），３．４
０（ｍ，１６Ｈ），３．６２（ｍ，およそ３００Ｈ，大
きすぎて正確ではない積分値），４．１５（ｍ，４
Ｈ），５．０７（ｓ，８Ｈ），７．３３（ｍ，２０
Ｈ）。
【０１５７】（化合物３９）１０％Ｐｄカーボン１００
ｍｇを、３００ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）の化合物３
２の無水ＥｔＯＨ（５ｍＬ）とシクロヘキセン（２ｍ
Ｌ）との溶液に窒素下で加えた。この混合物を窒素下で
２時間還流した。この混合物をケイソウ土を通して濾過
し、溶媒をエバポレートして２３７ｍｇ（９０％）の化
合物３９を白色の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｌ3）ｄ １．３７（ｍ，８Ｈ），１．４８（ｍ，
８Ｈ），１．６５（ｍ，８Ｈ），２．２１（ｍ，８
Ｈ），２．５０（ｍ，８Ｈ），３．３９（ｍ，１６
Ｈ），３．６４（ｍ，およそ３００Ｈ，大きすぎて正確
ではない積分値），４．１９（ｍ，４Ｈ）。
【０１５８】（化合物３３）ＮａＨＣＯ3１２５ｍｇ
（０．６７ｍｍｏｌ）および１１５ｍｇ（０．４４ｍｍ
ｏｌ）の化合物１０を、２２５ｍｇ（０．０５５ｍｍｏ
ｌ）の３９のジオキサン（５ｍＬ）と水（５ｍＬ）との
溶液に加えた。得られた黄色の溶液を室温で１２時間撹
拌した。次いで、この溶液をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬず
つ）で３回抽出した。水層を１Ｎ Ｈ2ＳＯ4で酸性化
し、そしてＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬずつ）で３回抽出し
た。ＣＨ2Ｃｌ2層を合わせて、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、
濾過し、そして濃縮して、黄色のオイルを得た。Ｇ−１
０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）のクロマトグラフィ
ー（ＭｅＯＨ）で精製し、そして得られたオイルを再結
晶して（ＥｔＯＨ／Ｅｔ2Ｏ）、１８２ｍｇ（７３％）
の化合物３３を白色の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3）ｄ １．３５（ｍ，８Ｈ），１．５５
（ｍ，８Ｈ），１．６５（ｍ，８Ｈ），２．２２（ｍ，
８Ｈ），３．２８（ｍ，８Ｈ），３．４２（ｍ，１６
Ｈ），３．５０−３．６４（ｍ，およそ３００Ｈ，大き
すぎて正確ではない積分値），３．８７（ｓ，８Ｈ），
４．１８（ｍ，４Ｈ）；ブロモアセチル測定法（Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１９８４，１４０，６３−７１）：計算値，
０．８７ｍｍｏｌ／ｇ；実測値，０．７３ｍｍｏｌ／
ｇ．分析値：Ｃ191Ｈ375Ｏ87Ｎ10Ｂｒ4に対する計算
値：Ｃ，５０．８４；Ｈ，８．３３；Ｎ，３．０９；Ｂ
ｒ，７．０５．実測値：Ｃ，５１．９８；Ｈ，８．３
４；Ｎ，２．４５；Ｂｒ，１０．１９。
【０１５９】（化合物４０−［４−ニトロフェニルヨー
ドアセテート］）ジシクロヘキシルカルボジイミド５．
１５ｇ（２５ｍｍｏｌ）と４−ニトロフェノール２．９
２ｇ（２．９２ｍｍｏｌ）とのＥｔＯＡｃ（１００ｍ
Ｌ）溶液を、ヨード酢酸３．７２ｇ（２０ｍｍｏｌ）の
０℃の溶液に加えた。この混合物を０℃で１時間、およ
び室温で２時間撹拌した。固形物を濾過によって除去
し、そして濾液を減圧下で濃縮した。得られた黄色の固
形物を再結晶して（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／痕跡量のＨ
ＯＡｃ）、４．８２ｇ（７８％）の化合物４０を黄褐色
の固形物として得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ
４．００（ｓ，２Ｈ），７．３９（ｄ，２Ｈ），８．４
０（ｍ，２Ｈ）。
【０１６０】（化合物４１）ＮａＨＣＯ3１０３ｍｇ
（１．２２ｍｍｏｌ）、次いで２１１ｍｇ（０．６９２
ｍｍｏｌ）の化合物４０を、１１０ｍｇ（０．１０４ｍ
ｍｏｌ）の化合物３４のジオキサン（５ｍＬ）とＨ2Ｏ
（５ｍＬ）との溶液に加えた。この混合物を１８時間撹
拌し、次いで減圧下で濃縮した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登
録商標）のクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ）で精製する
ことにより、１４０ｍｇ（８７％）の化合物４１をオイ
ルとして得た。分析試料を分取用ＨＰＬＣ（Ｃ18，グラ
ジエント２０／８０／０．１〜２５／７５／０．１ＣＨ
3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／ＴＦＡ６０分間にわたって、２２５ｎ
ｍ）で調製した：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．５
９（ｍ，４Ｈ），２．６５（ｍ，４Ｈ），３．４４−
３．６２（ｍ，６０Ｈ），３．７７（ｓ，４Ｈ），３．
７８（ｓ，４Ｈ），４．０２（ｓ，４Ｈ），４．２１
（ｓ，４Ｈ）。
【０１６１】（化合物４２）Ｎ−メトキシカルボニルマ
レイミド１４５ｍｇ（０．９３５ｍｍｏｌ）を、１７１
ｍｇ（０．１６１ｍｍｏｌ）の化合物３４のジオキサン
（８ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ3溶液（２ｍＬ）とＨ2Ｏ
（２ｍＬ）との溶液に０℃で、勢いよく撹拌しながら加
えた（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙおよび
Ａ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，ニューヨーク，１９８４，２９−３１頁．Ｋｅｌｌ
ｅｒ，Ｏ．，Ｒｕｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉ
ｍ，Ａｃｔａ１９７５，５８，５３１．）。１５分後、
ジオキサン２５ｍＬを加え、冷却浴を除去し、そして室
温で４５分間撹拌を続けた。この混合物をＣＨＣｌ
3（３０ｍＬずつ）で２回抽出し、そしてＣＨＣｌ3層を
合わせて、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮
して、オイルを得た。Ｇ−１０Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録
商標）のクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ）で精製するこ
とにより、１０３ｍｇ（４５％）の化合物４２をオイル
として得た。分析試料を分取用ＨＰＬＣ（Ｃ18，グラジ
エント２０／８０／０．１〜２５／７５／０．１ＣＨ3
ＣＮ／Ｈ2Ｏ／ＴＦＡ６５分間にわたって、２２５ｎ
ｍ）で調製してオイルを得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）ｄ ２．５７（ｍ，４Ｈ），２．６７（ｍ，４
Ｈ），３．４２−３．６５（ｍ，５２Ｈ），３．７２
（ｍ，８Ｈ），４．０３（ｓ，４Ｈ），４．１７（ｓ，
４Ｈ），６．７４（ｓ，４Ｈ），６．７５（ｓ，４
Ｈ）。
【０１６２】（化合物４３−［ヒドロキシメチル−トリ
ス−（２−シアノエトキシメチル）メタン］）ＫＯＨ
０．３０ｇ（５．４１ｍｍｏｌ）、次いでアクリロニト
リル２３ｍＬ（１８．６ｇ，３５０ｍｍｏｌ）を、ペン
タエリスリトール６．８ｇ（５０ｍｍｏｌ）のＨ2Ｏ
（５０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を室温で１６時
間撹拌し、濃ＨＣｌ溶液１．５ｍＬで酸性化し、そして
ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬずつ）で２回抽出した。このＣＨ
2Ｃｌ2層を合わせて、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、
そして濃縮して、１６．９７ｇの液体を得た。シリカゲ
ルのクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）で精製すること
により、８．４９ｇ（５１％）の化合物４３を粘稠なオ
イルとして得た：ＴＬＣ，Ｒｆ＝０．１５（ＥｔＯＡ
ｃ）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．６２（ｔ，６
Ｈ），３．５４（ｓ，６Ｈ），３．６８（ｔ，６Ｈ），
３．７０（ｓ，２Ｈ）。
【０１６３】（化合物４４−［ヒドロキシメチル−トリ
ス−（２−カルボキシメチルエトキシメチル）メタ
ン］）ＨＣｌで飽和したＭｅＯＨ溶液７８ｍＬを、５．
４５ｇ（１５．６ｍｍｏｌ）の化合物４３に加えた。こ
の混合物を１時間還流状態で加熱し、そして冷却時、Ｈ
2Ｏ（１００ｍＬ）と４つのＥｔ2Ｏ（１００ｍＬずつ）
とで分けた。Ｅｔ2Ｏ層を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ3溶
液（１００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ溶液（１００ｍ
Ｌ）で順次洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そ
して濃縮して、４．７４ｇの粘稠な液体を得た。シリカ
ゲルのクロマトグラフィーで精製することにより、３．
０５ｇ（５０％）の化合物４４をオイルとして得た：Ｔ
ＬＣ，Ｒｆ＝０．２７（８０／２０ＥｔＯＡｃ／ヘキサ
ン）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．５８（ｔ，６
Ｈ），３．４３（ｓ，６Ｈ），３．６１（ｓ，２Ｈ），
３．６９（ｔ，６Ｈ），３．７０（ｓ，９Ｈ）；13Ｃ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ３４．８，４４．９，５１．
６，６５．２，６６．９，７１．０，１７２．１。
【０１６４】（化合物４５）５６０ｍｇ（１．４ｍｍｏ
ｌ）の化合物４４と１．６９ｇ（６．０ｍｍｏｌ）の化
合物４との混合物を、１５０℃で４時間窒素下で加熱し
た。この混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）と１Ｎ ＨＣ
ｌ（２５ｍＬ）とに分け、そしてＨＣｌ層をＣＨ2Ｃｌ2
（２５ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃおよびＣＨ2Ｃｌ2
の抽出層を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、
乾燥し（Ｋ2ＣＯ3）、濾過し、そして濃縮して、粘稠な
残留物を得た。シリカゲルのクロマトグラフィー（グラ
ジエント９５／５〜９０／１０ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）
で精製することにより、３００ｍｇ（１９％）の化合物
４５を粘稠なオイルとして得た：ＴＬＣ，Ｒｆ＝０．２
４（９０／１０ ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）；1Ｈ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．４０（ｔ，６Ｈ），３．３８
（ｓ，６Ｈ），３．３９−３．４８（ｍ，１２Ｈ），
３．５２−３．６７（ｍ，３２Ｈ），５．１３（ｓ，６
Ｈ），５．６２（ｂｄｓ，３Ｈ），６．８０（ｂｄ
ｓ，３Ｈ），７．４０（ｓ，１５Ｈ）。
【０１６５】（化合物４６）１０％Ｐｄカーボン１０４
ｍｇを、３０８ｍｇ（０．２６９ｍｍｏｌ）の化合物４
５のＥｔＯＨ（１０．４ｍＬ）とシクロヘキセン（５．
２ｍＬ）との溶液に窒素下で加えた。還流冷却器を取り
付け、そしてこの混合物を８５℃の油浴中で１．５時間
加熱した。冷却時、この混合物をケイソウ土を通して濾
過し、そして濾液を濃縮して１７７ｍｇの残留物を得
た。この残留物をジオキサン５．９８ｍＬに一部溶解し
た。得られた混合物を、３８６ｍｇ（１．４９ｍｍｏ
ｌ）の化合物１０に加え、次いでこれをＮａＨＣＯ3２
５１ｍｇ（２．９９ｍｍｏｌ）のＨ2Ｏ（３．９９ｍ
Ｌ）溶液に加えた。得られた混合物を窒素下で１８時間
撹拌し、そして１Ｎ ＨＣｌ（２５ｍＬ）と３つのＣＨ
2Ｃｌ2（２５ｍＬずつ）とで分けた。水層を３／１ＣＨ
2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（２５ｍＬずつ）で３回および１／１
ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（２５ｍＬずつ）で３回抽出し
た。最初の２回分のＣＨ2Ｃｌ2抽出物を廃棄し、そして
残りの抽出物を合わせて、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過
し、そして濃縮して、１０２ｍｇの粘稠なオイルを得
た。ＨＰＬＣで（Ｃ18，２３／７７／０．１ＣＨ3ＣＮ
／Ｈ2Ｏ／ＣＦ3ＣＯ2Ｈ，２３４ｎｍ検出）で精製する
ことにより、４３ｍｇ（１４％）の化合物４６を粘稠な
オイルとして得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２．
４８（ｔ，６Ｈ），３．４０（ｓ，６Ｈ），３．４４−
３．５４（ｍ，１４Ｈ），３．５６−３．６２（ｍ，１
２Ｈ），３．６３（ｓ，１２Ｈ），３．６７（ｔ，６
Ｈ），３．９１（ｓ，６Ｈ），６．９０（ｔ，３Ｈ），
７．１０（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｅ（相対強
度）ＭＨ+［１１０３（１７），１１０５（４２），１
１０７（４１），１１０９（１８）］，ＭＮａ+［１１
２５（３８），１１２７（１００），１１２９（９
９），１１３１（３９）］。
【０１６６】（化合物４７−［Ｓ−（６−ヒドロキシヘ
キシル）イソチオウロニウムクロライド］）チオ尿素１
１．１ｇ（１４６ｍｍｏｌ）を６−クロロヘキサノール
１６．６ｍＬ（２０．０ｇ，１４６ｍｍｏｌ）のエタノ
ール（４９ｍＬ）溶液に加え、そしてこの混合物を２４
時間還流した。混合物を０℃まで冷却し、そして生成物
を結晶化した。この結晶を減圧濾過によって集め、そし
て乾燥して、２８．４ｇ（９２％）の化合物４７を白色
の固形物として得た：ｍｐ１２２−１２４℃；1ＨＮＭ
Ｒ（ＤＭＳＯ）ｄ １．４０（ｍ，４Ｈ），１．６５
（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｔ，２Ｈ），３．４１（ｔ，
２Ｈ），９．２７および９．３３（重複した広幅シング
レット，４Ｈ）；分析値：Ｃ7Ｈ17ＣｌＮ2ＯＳに対する
計算値：Ｃ，３９．５１；Ｈ，８．０６；Ｎ，１３．１
７；Ｓ，１５．０７．実測値：Ｃ，３９．６９；Ｈ，
８．００；Ｎ，１３．０１；Ｓ，１５．１６。
【０１６７】（化合物４８−［６−メルカプトヘキサン
−１−オール］）ＮａＯＨのペレット９．２５ｇを、１
７．８ｍｇ（８３．６ｍｍｏｌ）の化合物４７のＨ2Ｏ
（１２０ｍＬ）とＥｔＯＨ（１２０ｍＬ）との溶液に加
えた。この混合物を４時間還流した。混合物をおよそ７
５ｍＬになるまで注意深く濃縮し、そして濃縮物を減圧
蒸留によって精製して、７．４ｇ（６６％）の化合物４
８を得た：ｂｐ９５−１０５℃（５ｍｍＨｇ）；1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）１．４１（ｍ，９Ｈ），２．５９
（ｄｔ，２Ｈ），３．６９（ｂｒｄ ｓと重複したｔ，
３Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ２４．５，２
５．２，２８．０，３２．５，３３．９，６２．７；分
析値：Ｃ6Ｈ14ＯＳに対する計算値：Ｃ，５３．６８；
Ｈ，１０．５１；Ｓ，２３．８９．実測値：Ｃ，５３．
３５；Ｈ，１０．７２；Ｓ，２３．６０。
【０１６８】（化合物４９−［ビス−（６−ヒドロキシ
ヘキシル）ジスルフィド］）Ｉ2４．０２ｇ（１５．８
ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（９０ｍＬ）溶液を、４．２６ｇ
（３１．７ｍｍｏｌ）の化合物４８のＭｅＯＨ（１０ｍ
Ｌ）とＥｔ3Ｎ（１３．７ｍＬ（９．９７ｇ，９８．５
ｍｍｏｌ））との溶液にＮ2雰囲気下で１０分間かけて
滴下し、そして氷浴で冷却した。冷却浴を除去し、そし
て混合物を雰囲気温度で４時間撹拌した。この混合物を
ロータリーエバポレーターで濃縮し、そしてシリカゲル
クロマトグラフィー（１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で
精製して、３．１２ｇ（７３％）の化合物４９を淡黄色
の固形物として得た：ＴＬＣＲf０．１８（１：１ヘキ
サン／ＥｔＯＡｃ）；ｍｐ３８−４８℃；1Ｈ ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3）１．１５−２．２０（ｍ，１６Ｈ），
２．７３（ｔ，４Ｈ），３．７０（ｔ，４Ｈ）；分析
値：Ｃ12Ｈ26Ｓ2０2に対する計算値：Ｃ，５４．０９；
Ｈ，９．８４；Ｓ，２４．０６．実測値：Ｃ，５４．８
５，Ｈ，９．８６；Ｓ，２４．１１。
【０１６９】（化合物５０−［モノ−Ｏ−（４’，４”
−ジメトキシトリフェニルメチル）−ビス−（６−ヒド
ロキシヘキシル）ジスルフィド］）４，４’−ジメトキ
シトリフェニルメチルクロライド３．９７ｇ（１１．７
ｍｍｏｌ）を、３．１２ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）の化合
物４９のピリジン（４５ｍＬ）溶液に加えた。この混合
物を雰囲気温度で１６時間撹拌した。大部分のピリジン
をロータリーエバポレーターで除去し、そして残留物を
飽和ＮａＨＣＯ3溶液（１００ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１
００ｍＬ）とで分けた。ＥｔＯＡｃ層を飽和ＮａＣｌ溶
液５０ｍＬで洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、
そして濃縮して、オイルを得た。シリカゲルクロマトグ
ラフィー（９：１ＣＨ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡｃ）で精製する
ことにより、２．８４ｇ（４３％）の化合物５０を粘稠
なオイルとして得た：ＴＬＣ Ｒf０．３５（９：１Ｃ
Ｈ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡｃ）；1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）１．
４１（ｍ，８Ｈ）．１．６５（ｍ，８Ｈ），２．７０
（２つの重複したトリプレット，４Ｈ），３．０８
（ｔ，２Ｈ），３．６５（ｔ，２Ｈ），３．８１（ｓ，
６Ｈ），６．８５（ｄ，４Ｈ），７．３２（ｍ，７
Ｈ），７．４７（ｄ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，Ｍ
＋），Ｃ33Ｈ44０4Ｓ2に対する計算値：５６８．２６８
１．実測値：５６８．２６６５。
【０１７０】（化合物５１−［Ｏ−［１４−（４’，
４”−ジメトキシトリフェニルメトキシ）−７，８−ジ
チオテトラデシル］−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］）Ｏ−シアノ
エチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ−イソプロピルホ
スホロジアミダイト４５８ｍｇ（１．５２ｍｍｏｌ）の
ＣＨ2Ｃｌ2（０．５ｍＬ）溶液を、７７１ｍｇ（１．３
６ｍｍｏｌ）の化合物５０とジイソプロピルアンモニウ
ムテトラゾリド１１６ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）のＣＨ
2Ｃｌ2（６．８ｍＬ）溶液にＮ2雰囲気下で加えた。混
合物を４時間撹拌し、そしてＮａＨＣＯ3（２５ｍＬ）
とＣＨ2Ｃｌ2（３×２５ｍＬ）とで分けた。ＣＨ2Ｃｌ2
層を合わせて、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎ
ａ2ＣＯ3）、濾過し、そして濃縮して、オイルを得た。
２５ｍｍカラム中の塩基性のアルミナ（２”プラグ）を
通して濾過し、９：１ ＣＨ2Ｃｌ2／Ｅｔ3Ｎで溶出す
ることによって精製して、８３１ｍｇ（８０％）の化合
物５１を粘稠なオイルとして得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3）ｄ １．２５（ｍ，１２Ｈ），１．４５（ｍ，
８Ｈ），１．７０（ｍ，８Ｈ），２．７２（ｍ，６
Ｈ），３．０９（ｔ，２Ｈ），３．６５（ｍ，４Ｈ），
３．８７（ｓ，６Ｈ），３．９１（ｍ，２Ｈ），６．８
９（ｄ，４Ｈ），７．３５（ｍ，７Ｈ），７．４９
（ｄ，２Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（１５％Ｈ3ＰＯ4を内部標
準として有するＣＤＣｌ3）１４７．６９；ＨＲＭＳ
（ＦＡＢ，ＭＨ＋），Ｃ42Ｈ62Ｎ2Ｏ5ＰＳ2に対する計
算値：７６９．３８３９，実測値：７６９．３８５３。
【０１７１】（化合物５２−［トリチル−ＨＡＤアルコ
ール］）塩化トリチル６０ｇ（０．２１ｍｏｌ）を、５
７ｇ（０．２１ｍｏｌ）の化合物４９のピリジン（６０
ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を１００℃で１９時間
撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、そして濾
過した。濾液を塩化メチレン３００ｍＬで希釈し、そし
て飽和炭酸水素ナトリウム２００ｍＬで抽出した。有機
層を、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして濃縮して、
オイルを得た。シリカゲルクロマトグラフィー（グラジ
エント９：１ヘキサン：酢酸エチル〜３：１ヘキサン：
酢酸エチル）で精製することにより、５５ｇ（５０％）
の化合物５２を得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．
３８（ｍ，８Ｈ），１．６３（ｍ，８Ｈ），２．６６
（ｍ，４Ｈ），３．０４（ｔ，２Ｈ），３．６２（ｔ，
２Ｈ），７．２５（ｍ，９Ｈ），７．４２（ｍ，６
Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，Ｍ＋），Ｃ31Ｈ40Ｏ2Ｓに対
する計算値：５０８．２４７０、実測値：５０８．２４
８２。
【０１７２】（化合物５３−［トリチル ＨＡＤ ホス
ホロアミダイト］）１０ｇ（１９．７ｍｍｏｌ）の化合
物５２とジイソプロピルエチルアミン６．３ｍＬ（３
６．２ｍｍｏｌ）との塩化メチレン（９０ｍＬ）溶液
に、アルゴン下で０℃にて、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト４．５ｍＬ
（２０．２ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。この混合物
を９０分間撹拌した後、反応混合物を飽和重炭酸水素ナ
トリウム１００ｍＬずつで２回抽出した。この塩化メチ
レン溶液を、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして濃縮
して、オイルを得た。塩基性アルミナクロマトグラフィ
ー（７５：２：１，ヘキサン：酢酸エチル：トリエチル
アミン）で精製することにより、１１．３ｇ（８１％）
の化合物５３をオイルとして得た：1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ3）δ １．１８（ｍ，１２Ｈ），１．３７（ｍ，
８Ｈ），１．６２（ｍ，８Ｈ），２．６（ｍ，６Ｈ），
３．０４（ｔ，２Ｈ），３．６０（ｍ，４Ｈ），３．８
２（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｍ，６Ｈ），７．４４
（ｍ，９Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，ＭＨ＋），Ｃ40Ｈ58
Ｎ2Ｏ3ＰＳ2に対する計算値：７０９．３６２６、実測
値：７０９．３６２１。
【０１７３】（化合物５４−［Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチル
ジメチルシリル）−５−ヘキセノール］）イミダゾール
１５．６６ｇ（２３０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジ
メチルシリルクロライド２０．０ｇ（１３０ｍｍｏｌ）
を、５−ヘキセン−１−オール１２．４７ｍＬ（１０．
４ｇ，１０４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０４ｍＬ）溶液に
加えた。この混合物を雰囲気温度で４時間撹拌し、そし
てＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ3溶液
（１００ｍＬ）とで分けた。ＥｔＯＡｃ層を飽和ＮａＨ
ＣＯ3溶液１００ｍＬ、飽和ＮａＣｌ溶液１００ｍＬで
洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、そして濃縮し
て、およそ容量１００ｍＬとした。減圧下で蒸留するこ
とにより、７０．０７ｇ（９０％）の化合物５４を得
た：ｂｐ１３０−１４３℃（１００ｍｍＨｇ）；1Ｈ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）０．１１（ｓ，６Ｈ），０．９５
（ｓ，９Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｍ，
２Ｈ），２．１１（ｄｔ，２Ｈ），３．６６（ｔ，２
Ｈ），５．０３（ｍ，２Ｈ），５．８６（ｍ，１Ｈ）；
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）−５．２５，１８．４０，
２５．２１，２６．０１，３２．３５，３３．６０，６
３．０９，１１４．４０，１３８．９２；分析値：Ｃ12
Ｈ26ＯＳｉに対する計算値：Ｃ，６７．２２；Ｈ，１
２．２２．実測値：Ｃ，６６．９６；Ｈ，１２．１６。
【０１７４】（化合物５５−［１−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブ
チルジメチルシリル）−１，５，６−ヘキサントリオー
ル］）９．８６ｇ（４６．０ｍｍｏｌ）の化合物５４の
アセトン（９２ｍＬ）溶液に、Ｎ−メチルモルホリンオ
キサイド６．４６ｇ（５５．２ｍｍｏｌ）のＨ2Ｏ（２
３ｍＬ）溶液を加えた。この混合物に、２．５％のＯｓ
Ｏ4のｔｅｒｔ−ブチルアルコール溶液４４３μｌ（溶
液３６０ｍｇ，ＯｓＯ4９．０ｍｇ，３５μｍｏｌ）お
よび３０％Ｈ2Ｏ2５０μＬを加えた。この混合物を１６
時間撹拌し、そして亜ジチオ酸ナトリウム４７４ｍｇの
Ｈ2Ｏ（１４ｍＬ）溶液を加えた。さらに０．５時間
後、この混合物をセライトを通して濾過した。濾液をＭ
ｇＳＯ4で乾燥し、１５０ｍＬのブフナーロート中の
１”のシリカゲルを通して濾過し、ＥｔＯＡｃ２５０ｍ
Ｌずつを用いて溶出した。生成物を含有する画分を濃縮
して、１１．０ｇ（９６％）の５５を粘稠なオイルとし
て得た：ＴＬＣ Ｒf ０．２（１：１ヘキサン／Ｅｔ
ＯＡｃ）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）０．０５（ｓ，６
Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），１．２５（ｍ，４Ｈ），
１．５５（ｍ，２Ｈ），３．４１（ｄｄ，２Ｈ），３．
６２（ｔ，２Ｈ），３．７１（ｍ，１Ｈ）；13Ｃ ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣｌ3）−５．２３，１８．４２，２１．９
１，２６．０２，３２．６８，３２．８１，６３．１
６，６６．７４，７２．２４；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，ＭＨ
＋），Ｃ12Ｈ29Ｏ3Ｓｉに対する計算値：２４９．１８
８６。実測値：２４９．１８８９。
【０１７５】（化合物５６−［５，６−（ビス−Ｏ−ベ
ンゾイル）−１−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリ
ル）−１，５，６−ヘキサントリオール］）塩化ベンゾ
イル６．１８ｍＬ（７．４８ｇ，５３．２ｍｍｏｌ）
を、５．２９ｇ（２１．３ｍｍｏｌ）の５５のピリジン
（１０６ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を１８時間撹
拌し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮した。混
合物を冷１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１
００ｍＬ）とで分けた。水層のｐＨを調べて、確実に酸
性にした。ＥｔＯＡｃ層をＨ2Ｏ１００ｍＬおよび飽和
ＮａＣｌ１００ｍＬで順次洗浄し、乾燥し（ＭｇＳ
Ｏ4）、濾過し、そして濃縮して、１０．３３ｇ（９９
％）の化合物５６を粘稠な黄色のオイルとして得た：Ｔ
ＬＣ Ｒf０．４５（１：４ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）；1
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ 3）ｄ０．０５（ｓ，６Ｈ），
０．８８（ｓ，９Ｈ），１．５９（ｍ，４Ｈ），１．８
５（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｔ，２Ｈ），４．４９（ｄ
ｄ，１Ｈ），４．５９（ｄｄ，１Ｈ），５．５４（ｍ，
１Ｈ），７．４５（ｍ，４Ｈ），７．５８（ｍ，２
Ｈ），８．０５（ｍ，４Ｈ）。
【０１７６】（化合物５７−［５，６−（ビス−Ｏ−ベ
ンゾイル）−１，５，６−ヘキサントリオール］）１Ｎ
フッ化テトラブチルアンモニウム１０．７ｍＬ（１０．
７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を、２．６２ｇ（５．３６ｍ
ｍｏｌ）の５６のＴＨＦ（１０．９ｍＬ）溶液に加え
た。この混合物を１６時間撹拌した。混合物を飽和Ｎａ
ＨＣＯ3溶液（２５ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（３×２５ｍ
Ｌ）とで分けた。ＥｔＯＡｃ抽出物を合わせて、飽和Ｎ
ａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、
そして濃縮して、粘稠なオイルを得た。このオイルをシ
リカゲルクロマトグラフィー（１：１ ヘキサン／Ｅｔ
ＯＡｃ）で精製して、８２３ｍｇ（４１％）の化合物５
７を粘稠なオイルとして得た：Ｒf ０．１４（１：１
ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ
１．５８（ｍ，２Ｈ），１．６８（ｍ，２Ｈ），１．
８８（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｔ，２Ｈ），４．５２
（ｄｄ，１Ｈ），４．６２（ｄｄ，１Ｈ），５．５６
（ｍ，１Ｈ），７．４６（ｍ，４Ｈ），７．５８（ｍ，
２Ｈ），８．０５（ｍ，４Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3）ｄ ２２．０８，３１．２０，３１．３０，３
２．８８，６２．９２，６６．１７，７２．６３，１２
８．９３，１３０．１９，１３０．５７，１３３．６
２，１６６．７２，１６６．８６；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ，
ＭＨ＋），Ｃ20Ｈ23Ｏ5に対する計算値：３４３．１５
４５。実測値：３４３．１５５３。
【０１７７】（化合物５８−［Ｏ−［５，６−（ビス−
Ｏ−ベンゾイルオキシ）−ヘキシル］−Ｏ−（２−シア
ノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイ
ト］）Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
イソプロピルホスホロジアミダイト９８９ｍｇ（３．２
８ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（２．０ｍＬ）溶液を、１．
０２ｇ（２．９８ｍｍｏｌ）の５７とジイソプロピルア
ンモニウムテトラゾリド２５５ｍｇ（１．４９ｍｍｏ
ｌ）（ジイソプロピルアミンのアセトニトリル溶液とテ
トラゾールとを１：１のモル比で混合し、そして濃縮し
て、白色の固形物として調製した）とのＣＨ2Ｃｌ2（１
４．９ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を４時間撹拌
し、次いでＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）と冷飽和ＮａＨＣＯ
3溶液（２５ｍＬ）とで分けた。ＣＨ2Ｃｌ2層を飽和Ｎ
ａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、
そして濃縮した。２５ｍｍカラム中の塩基性のアルミナ
（２”プラグ）を通して濾過し、９：１ＥｔＯＡｃ／Ｅ
ｔ3Ｎで溶出することにより精製して、１．５ｇ（９３
％）の化合物５８を粘稠なオイルとして得た：1Ｈ Ｎ
ＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ １．１９（ｍ，１２Ｈ），１．
６２（ｍ，２Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ），１．９０
（ｍ，２Ｈ），２．６２（ｄｄ，２Ｈ），３．５３−
３．９２（ｍ，６Ｈ），４．５３（ｄｄ，１Ｈ），４．
６２（ｄｄ，１Ｈ），５．５８（ｍ，１Ｈ），７．４８
（ｍ，４Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），８．０９（ｍ，
４Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（１５％Ｈ3ＰＯ4を内部標準とし
て有するＣＤＣｌ3）ｄ１４８．２；ＨＲＭＳ（ＦＡ
Ｂ，ＭＨ＋），Ｃ29Ｈ40Ｏ6Ｎ2Ｐに対する計算値：５４
３．２６２４。実測値：５４３．２６１９。
【０１７８】（化合物５９−［４（ヨードアセトアミ
ド）安息香酸］）Ｗｅｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｋ．，１９８３
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１：１４８−１５２に記載
のようにして、この化合物を調製した。簡単に述べる
と、ヨード酢酸無水物７０８ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）
を、パラアミノ安息香酸１３７ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）
のジオキサン（１０ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を
暗所で１８時間撹拌し、そしてＨ2Ｏ（２５ｍＬ）とＥ
ｔＯＡｃ（２５ｍＬ）とで分けた。ＥｔＯＡｃ層を飽和
ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過
し、そして濃縮して、桃色の固形物７９７ｍｇを得た。
ヘキサン／ＥｔＯＡｃから再結晶することにより、４−
（ヨードアセトアミド）安息香酸２２１ｍｇ（７２％）
を白色の固形物として得た：ｍｐ２２０−２３０℃；1
Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）ｄ ３．８６（ｓ，２Ｈ），
７．６８（ｄ，２Ｈ），７．９１（ｄ，２Ｈ），１０．
６０（ｓ，１Ｈ）。
【０１７９】（化合物６０−［α，ω−ビス−（Ｎ−２
−アミノエチルカルバモイル）ポリエチレングリコール
の４−（ヨードアセトアミド）ベンゾイル誘導体］）ジ
シクロヘキシルカルボジイミド１８８ｍｇ（０．９０９
ｍｍｏｌ）を、４−（ヨードアセトアミド）安息香酸１
８５ｍｇ（０．６０６ｍｍｏｌ）とα，ω−ビス−（Ｎ
−２−アミノエチルカルバモイル）ポリエチレングリコ
ール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．，トルエンとの共沸蒸留により乾
燥）４０６ｍｇ（０．１２１ｍｍｏｌ）とのＴＨＦ（２
ｍＬ）溶液に加えた。この混合物を２時間撹拌し、次い
で酢酸６滴を加えた。ＣＨ2Ｃｌ2１０ｍＬを加え、そし
て混合物を３０分間冷凍機中に置いた。混合物を濾過し
て固形物を除去し、そして濾液を濃縮して粘稠な残留物
を得た。シリカゲルクロマトグラフィー（グラジエント
９９／１〜９６／４ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）で精製する
ことにより、固形物を得た。この固形物をＭｅＯＨを用
いて粉砕して微黄白色の固形物２９２ｍｇを得た：1Ｈ
（ＣＤＣｌ3）３．４８（ｍ，８Ｈ），３．６３（ｂｄ
ｓ，（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n，大きすぎて積分不可能），
３．９８（ｓ，４Ｈ），４．１８（ｂｄ ｍ，４Ｈ），
５．９１（ｂｄ ｍ，２Ｈ），７．４８（ｂｄ ｍ，２
Ｈ），７．７６（ｄ，４Ｈ），７．８８（ｄ，４Ｈ），
９．３８（ｂｄ ｍ，２Ｈ）：ヨードアセチル測定法
（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８４，１４０，６３−７１）：
計算値，０．４６ｍｍｏｌ／ｇ；実測値，０．３７ｍｍ
ｏｌ／ｇ。
【０１８０】（実施例３） （活性結合手プラットフォーム分子および複合体の調
製）生物学的分子または合成分子と、結合手プラットフ
ォーム分子との複合体を形成する方法は、多数ある。特
定の方法には、生物学的分子または合成分子に結合した
チオールを用いて、結合手プラットフォーム分子上の反
応性の「チオフィリック（イオウ親和性）」基と求核反
応させて、チオエーテル結合を形成させる方法がある
が、プラットフォーム分子上の反応基と、生物学的分子
または合成分子上の反応基との他の組合せも、生物学的
分子または合成分子を結合手プラットフォーム分子に共
有結合的に結合させるために用いられ得る。表１に、相
互反応基のいくつかの組合せを挙げる。与えられる方法
のうちどれが優先的に行われるかは、生物学的分子また
は合成分子の性質（溶解度、他の反応性基の存在など）
により決定される。
【０１８１】
【表１】 以下に記載の実施例は、種々の結合手プラットフォーム
分子の合成方法、および上記分子と生物学的分子または
合成分子とを複合体化する方法を例示する。これらの実
施例は、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが、表１中
の相互反応基を用いて結合手プラットフォーム分子と複
合体化する方法を示している。ペプチドおよびオリゴヌ
クレオチドの他に、他の生物学的活性分子（タンパク
質、薬剤など）もまた、結合手プラットフォーム分子と
複合体化し得る。
【０１８２】（組合せ１：プラットフォームのチオール
−リガンドのチオフィリック基）
【０１８３】
【化１９】 （化合物Ａ）化合物３６（８６１ｍｇ、１．０ｍｍｏ
ｌ）およびＮａＨＣＯ3２５２ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）
を、１／１ジオキサン／Ｈ2Ｏ２０ｍＬに溶解する。混
合物を０℃に冷却し、そしてＮ−スクシンイミジル−Ｓ
−アセチルチオアセテート（Ｐｒｏｃｈｅｍ Ｉｎ
ｃ．）１．１６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）のジオキサン（４
０ｍＬ）溶液を、この混合物を撹拌しながら加える。１
時間後、この混合物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出する。抽出物全
量をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮する。粗生成物
をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ａを得
る。
【０１８４】（化合物Ｂ−４つのチオール基を有するプ
ラットフォーム）Ａ ７３２ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）
のＤＭＳＯ（７．３ｍＬ）溶液を、ヘリウムを吹き込ん
だｐＨ１０の緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、１０
ｍＭ ＮＨ2ＯＨ）５５ｍＬに加える。この混合物をＮ2
ガス下におき、１時間撹拌して、約１０ｍＭのテトラチ
オールプラットフォームＢの溶液を得る。
【０１８５】（化合物Ｘ−ブロモアセチル化ペプチド）
ＦＭＯＣ化学法を用いて、Ｗａｎｇ（ｐ−アルコキシベ
ンジル）樹脂上で、標準固相法によりペプチドを合成す
る。ＦＭＯＣで保護されたアミノ酸を、アミノ末端に順
次加える。最終工程は、Ｎ−ブロモアセチルアミノカプ
ロン酸の結合を包含する。保護基を除去し、ペプチドを
トリフルオロ酢酸で樹脂から取り外して、Ｘを得、これ
を調製用逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【０１８６】（ペプチド−プラットフォーム複合体、
Ｃ）テトラチオールプラットフォームＢの約１０ｍｍｏ
ｌ溶液（ｐＨ１０の緩衝液中）に、ブロモアセチル化ペ
プチドＸのＤＭＳＯ溶液の過剰量を加える。ペプチド複
合体Ｃを調製用逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【０１８７】（組合せ２：プラットフォームのアミン−
ペプチドの活性カルボキシレート）
【０１８８】
【化２０】 （化合物Ｙ−活性カルボキシレートを有するペプチド）
ＴＦＡに安定な保護基（カルボキシル基にはベンジルエ
ステル、アミノ基にはＣＢＺ）を用いて、Ｗａｎｇ（ｐ
−アルコキシベンジル）樹脂上で標準固相法によりペプ
チドを合成する。アミノ末端に、アミノ酸残基を順次加
える。ペプチドをＴＦＡにより樹脂から取り外すことに
より、カルボキシ末端に１つの遊離カルボキシル基を有
し、他の全てのカルボキシルおよびアミンがブロックさ
れているペプチドを得る。保護されたペプチドＹを、逆
相ＨＰＬＣにより精製する。
【０１８９】（ペプチド−プラットフォーム複合体Ｄ）
化合物Ｙ（０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１ｍＬに溶解し、
この溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド０．３ｍｍ
ｏｌおよびＨＯＢＴ０．３ｍｍｏｌを加える。この溶液
を、テトラアミノプラットフォーム３６ ０．０２５ｍ
ｍｏｌのＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に加える。反応が完了す
ると、ＤＭＦを減圧下で除去し、粗製の完全に保護され
た複合体を得る。この複合体をＭｅＯＨに溶解し、そし
てこの溶液を複合体１グラム当り１００ｍｇの１０％Ｐ
ｄ／Ｃと共にＰａｒｒ水素添加装置中に置く。混合物を
６０ｐｓｉ Ｈ2下において振とうし、そして脱保護さ
れた複合体Ｄを調製用逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【０１９０】（組合せ３：プラットフォームのアミン−
オリゴヌクレオチドのアルデヒド）
【０１９１】
【化２１】 （オリゴヌクレオチド−プラットフォーム複合体Ｅ）Ｎ
ａＩＯ4（２００ｍＭ）溶液の５００μＬアリコート
（１００μｍｏｌ）を、ＡＣＴ改変（ＣＡ）25 １．０
ｇ（全長４００ｍｇ、２５μｍｏｌ）のＨ2Ｏ（１９．
５ｍＬ）溶液に、暗所で、０℃で加える。この混合物を
０℃で４０分間おき、ＥｔＯＨ５０ｍＬを加えた。この
混合物を−２０℃で３０分間おき、２０００ＲＰＭで５
分間遠心分離する。上澄みを捨て、残ったペレットを減
圧下で乾燥する。このペレットを、Ｈ2Ｏ３．３ｍＬに
溶解し、得られた溶液に、４．３ｍｇ（０．００５ｍｍ
ｏｌ）の３６を１００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．
０）２．０ｍＬに溶かした溶液を加える。得られた溶液
に、ピリジン−ボラン複合体の２００ｍＭ溶液（ＭｅＯ
Ｈ溶液）の２５０μＬ（５０μｍｏｌ）を加え、この混
合物を３７℃で４日間おく。この複合体Ｅは、イオン交
換クロマトグラフィーで精製し得る。
【０１９２】（組合せ４：プラットフォームの活性カル
ボキシレート−リガンドのアミン）
【０１９３】
【化２２】 （化合物Ｆ−４つのカルボン酸基を有するプラットフォ
ーム）無水コハク酸（１．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、３
６ ８６１ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ3
２５２ｍｇ（３．０ｍｍｏｌ）を１／１ジオキサン／Ｈ
2Ｏ２０ｍＬに溶かした溶液に加え、この混合物を室温
で１６時間撹拌する。混合物を１Ｎ ＨＣｌで酸性化
し、濃縮する。この濃縮物をシリカゲルクロマトグラフ
ィーにより精製し、Ｆを得る。
【０１９４】（化合物Ｇ−４つのＮ−スクシンイミジル
エステルを有するプラットフォーム）Ｆ １２６ｍｇ
（０．１ｍｍｏｌ）およびＮ−スクシンイミド４６ｍｇ
（０．４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を調製
する。混合物を０℃に冷却し、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド１０３ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を加える。この
混合物が室温になるまで、数時間撹拌する。濾過により
固形物を除去し、濾液を濃縮してＧを得る。このＧは、
シリカゲルクロマトグラフィーで精製し得る。
【０１９５】（化合物Ｚ−アミノ基を有するペプチド）
Ｗａｎｇ（ｐ−アルコキシベンジル）樹脂上で標準固相
法によりペプチドを合成する。リジンε−アミンをＣＢ
Ｚ基として保護する。ＦＭＯＣ化学法を用いて、アミノ
末端に、アミノ酸残基を順次加える。加える最後の残基
は、Ｎ−ＦＭＯＣ−アミノカプロン酸である。トリフル
オロ酢酸で樹脂から切断した後、ＦＭＯＣ基をピペリジ
ンにより脱離し、遊離アミンリンカーを有するペプチド
を得る。このペプチドＺを、逆相ＨＰＬＣにより精製す
る。
【０１９６】（ペプチド−プラットフォーム複合体Ｈ）
Ｚ ０．０５ｍｍｏｌおよびＥｔ3Ｎ０．１ｍｍｏｌの
ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を調製する。この溶液に、Ｇ １
６．５ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）溶
液を加える。この混合物を、反応が完了するまで撹拌す
る。保護基を除去するために、この複合体をＭｅＯＨに
溶解し、そしてこの溶液を複合体１グラム当り１００ｍ
ｇの１０％Ｐｄ／Ｃと共にＰａｒｒ水素添加装置中に置
く。混合物を６０ｐｓｉ Ｈ2下において振とうし、脱
保護された複合体Ｈを調製用逆相ＨＰＬＣにより精製す
る。
【０１９７】（組合せ５：プラットフォームのイソチオ
シアネート−リガンドのアミン）
【０１９８】
【化２３】 （化合物Ｉ−４つのイソチオシアネートを有するプラッ
トフォーム）チオホスゲン（３８１μＬ、５７５ｍｇ、
５．０ｍｍｏｌ）を、３６ ８６１ｍｇ（１．０ｍｍｏ
ｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に加え、この混合物を、
室温で、ＴＬＣによって反応が完了したことが確認され
るまで撹拌する。この混合物を、塩化メチレンと５％Ｎ
ａＨＣＯ3溶液との間で分ける。この抽出物をＭｇＳＯ4
で乾燥し、濾過し、濃縮する。生成物Ｉをシリカゲルク
ロマトグラフィーにより精製する。
【０１９９】（ペプチド−プラットフォーム複合体Ｊ）
Ｚ ０．０５ｍｍｏｌおよびＥｔ3Ｎ ０．１ｍｍｏｌ
のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を調製する。この溶液に、Ｉ
１０．３ｍｇ（０．０１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）
溶液を加える。この混合物を、反応が完了するまで撹拌
する。保護基を脱離させるために、この複合体をＭｅＯ
Ｈに溶解し、そしてこの溶液を複合体１グラム当り１０
０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃと共にＰａｒｒ水素添加装置中
に置く。混合物を６０ｐｓｉ Ｈ2下において振とう
し、脱保護された複合体Ｊを調製用逆相ＨＰＬＣにより
精製する。
【０２００】（組合せ６：プラットフォームのクロロホ
ルメート−リガンドのアミン）
【０２０１】
【化２４】 （化合物Ｋ−４つのヒドロキシル基を有するプラットフ
ォーム）トリエチレングリコールビス−クロロホルメー
ト２０５μＬ（２７５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2
（５ｍＬ）溶液を、ジエタノールアミン４９７μＬ（５
２５ｍｇ、５ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ６９６μＬ（５
０６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）溶液
に、０℃で加える。この混合物を室温になるまで温め、
ＴＬＣにより反応が完了したことが示されるまで、これ
を撹拌する。この混合物を濃縮し、生成物Ｋをシリカゲ
ルクロマトグラフィーにより分離する。
【０２０２】（化合物Ｌ−クロロホルメート基を有する
プラットフォーム）ピリジン（１００μＬ）、次いでト
リホスゲン１．１９ｇ（４ｍｍｏｌ）を、Ｋ ４１２ｍ
ｇ（１ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）溶液に加え
る。この混合物を、室温で２０時間撹拌し、溶媒を減圧
下でエバポレートして、化合物Ｌを得る。
【０２０３】（ペプチド−プラットフォーム複合体Ｍ）
Ｚ １ｍｍｏｌのピリジン（１０ｍＬ）溶液を、Ｌ １
３２ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）の１／１ ＴＨＦ／ピリジ
ン（５ｍＬ）溶液に加える。この混合物を、反応が完了
するまで撹拌する。溶媒を減圧下で除去する。保護基を
脱離するために、この複合体をＭｅＯＨに溶解し、そし
てこの溶液を複合体１グラム当り１００ｍｇの１０％Ｐ
ｄ／Ｃと共にＰａｒｒ水素添加装置中に置く。混合物を
６０ｐｓｉ Ｈ2下において振とうし、脱保護された複
合体Ｍを調製用逆相ＨＰＬＣにより精製する。
【０２０４】（実施例４） （２つの異なる生物学的分子を含有する複合体の合成）
１種類よりも多くの生物学的活性基をプラットフォーム
分子に複合体化することが有用であり得る。本実施例
は、２つのマレイミド基（チオール含有ペプチドと反応
する）および２つの活性化エステル基（遊離アミンを含
有する薬剤と反応する）を含有するプラットフォームの
調製を記載している。得られる複合体は、スキーム２０
に示されるように、２つのペプチドおよび２つの薬剤分
子を含有する。
【０２０５】（ヘテロ活性結合手プラットフォーム分子
ベンジル６−アミノカプロン酸トシル酸塩Ｋの調製）６
−アミノカプロン酸３２ｍｍｏｌ、ｐ−トルエンスルホ
ン酸５１ｍｍｏｌ、およびベンジルアルコール４０ｍｍ
ｏｌの混合物のトルエン（６０ｍＬ）溶液を、Ｄｅａｎ
−Ｓｔａｒｋトラップを用いて還流し、水を除去する。
反応が完了すると、混合物を冷却し、生成物を沈澱させ
る。濾過により固形物を集め、ＥｔＯＨ／Ｅｔ2０から
再結晶化し、化合物Ｋを得る。
【０２０６】（化合物Ｌ）ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（２当量）を、１当量の化合物５および２当量のＮ
−ヒドロキシスクシンイミドのＴＨＦ溶液に加える。こ
の混合物を４時間撹拌し、化合物Ｋを２．２当量で加え
る。ＴＬＣにより反応が完了したことが示されるまで、
この混合物を撹拌する。この混合物を濾過し、濃縮す
る。生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製
する。
【０２０７】（化合物Ｍ）化合物ＬをＣＨ2Ｃｌ2で希釈
したトリフルオロ酢酸で処理する。反応が完了すると、
混合物を減圧下で濃縮し、トリフルオロ酢酸塩として化
合物Ｍを得る。
【０２０８】（化合物Ｎ）化合物６（スキーム２）をＣ
Ｈ2Ｃｌ2で希釈したトリフルオロ酢酸で処理する。反応
が完了すると、混合物を減圧下で濃縮し、トリフルオロ
酢酸塩として化合物Ｎを得る。
【０２０９】（化合物Ｏ）トリエチレングリコールビス
−クロロクロロホルメート３．２ｍｍｏｌを、化合物Ｍ
４ｍｍｏｌおよび化合物Ｎ ４ｍｍｏｌのピリジン
（１６２ｍＬ）溶液に、２０℃水浴中で加える。この混
合物をＴＬＣによって反応が完了したことが示されるま
で撹拌し、減圧下で濃縮する。この濃縮物をＣＨ2Ｃｌ2
に溶解し、続けて１Ｎ ＨＣｌ溶液、５％ＮａＨＣＯ3
溶液、および飽和ＮａＣｌ溶液の順で洗浄する。ＣＨ2
Ｃｌ2層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮する。この
濃縮物をＥｔＯＨ１０ｍＬに溶解し、１Ｍ ＮａＯＨ１
０ｍＬを加える。ＴＬＣにより反応がさらに起こらない
ことが示されるまで、この混合物を数時間撹拌する。混
合物を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ１にまで酸性化し、ＣＨ2Ｃ
ｌ2で抽出する。ＣＨ2Ｃｌ2層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾
過し、濃縮する。生成物Ｏをシリカゲルクロマトグラフ
ィーにより分離する。
【０２１０】（化合物Ｐ）化合物ＯをＥｔＯＨに溶解
し、そしてＰａｒｒ振とう装置中でＯ １グラム当り１
００ｍｇの１０％パラジウムカーボンで水素添加する。
ＴＬＣにより、反応の完了を確認する。反応が完了する
と、濾過により触媒を除去し、そして混合物を濃縮し
て、化合物Ｐを得る。
【０２１１】（化合物Ｑ）Ｎ−メトキシカルボニルマレ
イミド３ｍｍｏｌを、化合物Ｐ １ｍｍｏｌをジオキサ
ン２０ｍＬおよび飽和ＮａＨＣＯ3５ｍＬに溶かした溶
液に、０℃で加える。この混合物を１時間撹拌し、１Ｎ
ＨＣｌで酸性化し、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出する。ＣＨ2Ｃ
ｌ2層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、濃縮し、そして生
成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、Ｑ
を得る。
【０２１２】（化合物Ｒ）ＤＣＣ ２ｍｍｏｌを、Ｑ
１ｍｍｏｌおよびｐ−ニトロフェノール２ｍｍｏｌのＣ
Ｈ2Ｃｌ2溶液に加え、混合物を１６時間撹拌する。濾過
により固形物を除去し、濾液を濃縮し、シリカゲルクロ
マトグラフィーにより精製してＲを得る。
【０２１３】（２つのペプチドおよび２つの薬剤分子を
有する複合体、化合物Ｓ）チオール含有ペプチド２当量
余りを、ヘテロ活性化プラットフォームＲ １当量のｐ
Ｈ７．５リン酸緩衝液溶液に加える。混合物を１時間撹
拌し、アミン含有薬剤２当量余りを加える。この複合体
Ｓを、逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィ
ー、またはそれらの組合せにより単離する。
【０２１４】
【化２５】 （実施例５） （複合体３−ＩＩの合成および試験）
【０２１５】
【化２６】 （ＤＭＴｒ−５’−改変（ＣＡ）10の調製）ポリヌクレ
オチドｄ−［ＤＭＴｒ−（ｂｚＣｐ（ＣＥ）ｂｚ
Ａ）10］を、ＤＮＡホスホルアミダイト合成のための製
造者のプロトコルに従い、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ８８００
Ｐｒｅｐ Ｓｃａｌｅ ＤＮＡ合成機で調製した（図
６Ａ参照）。この合成は、３０．０μｍｏｌ／ｇでヌク
レオシドをローディングした、１０ｇのＤＭＴｒ−ｄ−
ｂｚＡ−ＣＰＧ支持体上で行った。最後のＤＭＴｒブロ
ック基を、機械的プロトコルを用いて除去した。Ｍｉｌ
ｌｉｇｅｎ活性化剤溶液（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＢＳ５０４
０）４５ｍＬおよび化合物５１（反応スキーム１１参
照） ０．３８５ｇを反応系に加え、この懸濁液をアル
ゴン吹き込みにより８分間混合した。混合物を通常の機
械プロトコルにより酸化し、支持体に結合したポリヌク
レオチドを濾過により採集し、空気乾燥し、そして濃ア
ンモニア１００ｍＬで１６時間、５５℃で処理した。温
度が下がると、混合物をＧｅｌｍａｎ１０μポリプロピ
レンフィルターを通して濾過した。ＮａＯＨでｐＨ１２
に調整した２ｍＭ ＮａＣｌ２００ｍＬで、フィルター
を洗浄した。次いで、濾液を、初めに３Ｍ ＮａＣｌ
で、次いで２ｍＭ ＮａＣｌでｐＨ１２に平衡化された
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填
したＡｍｉｃｏｎクロマトグラフィーカラム（０．４５
×９．４ｃｍ、１５０ｍＬ）に通した。カラムを直線グ
ラジエント（２ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１２から１．３Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ１２まで）５００ｍＬで溶出し、次い
で全てのＵ．Ｖ．吸光物質が現れるまで１．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ１２）で洗浄した。２６０ｎｍ吸光画分をポ
リアクリルアミド電気泳動によりさらに分析し、純粋生
成物を含有する画分をプールする。このプール（１２０
ｍＬ）を冷イソプロパノール２４０ｍＬで処理し、−２
０℃で３０分間保持した。モデルＨ−６０００Ａロータ
ーを用いるＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ ３Ｂ遠心分離器で、
３０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離を行い、これ
により沈澱物を採集し、ＤＭＴｒ−５’−改変（ＣＡ）
10（１４９４６ Ａ260ユニット、４９８ｍｇ、６２．
２μＭ、２０％（３００μＭ ＣＰＧヌクレオシドに基
づく））を得た。
【０２１６】（Ｔｒ−５’−改変（ＣＡ）10の合成）
【０２１７】
【化２７】 Ｔｒ−５’−改変（ＣＡ）10の合成を、化合物５１を化
合物５３（反応スキーム１１に記載のように調製）に置
き換えることにより、ＤＭＴｒ−５’−改変（ＣＡ）10
の合成のための上記の記載と同様にして行った。
【０２１８】（ＤＭＴｒ−５’−改変ポリヌクレオチド
と化合物３（ＩＡ−ＤＡＢＡ−ＰＥＧ、反応スキーム
１）との複合体化−複合体３−Ｉの調製）以下に示す複
合体化の手順において、用いられる全ての緩衝液および
溶液に充分なヘリウムを吹き込み、全ての反応容器を使
用前にアルゴンでパージした。ＤＭＴｒ−５’−改変
（ＣＡ）10の１１，５６８ Ａ260 ユニット（４８．
２μｍｏｌ、２６０ｎｍでの推定モル吸光度＝２４０，
０００）の水（７．７ｍＬ）溶液を、０．１Ｍ ＮａＨ
ＣＯ3 １ｍＬおよびトリブチルホスフィン２１０μＬ
（８７６μｍｏｌ、１８倍過剰モル）を用いて、室温で
０．５時間処理した。この懸濁液をときどき振とうし
た。懸濁液を３Ｍ ＮａＣｌ ０．８ｍＬおよび冷イソ
プロパノール１６ｍＬで処理した。−２０℃で３０分お
いた後、この物質を３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離
した。得られたペレットを水２ｍＬ、３ＭＮａＣｌ
０．２ｍＬに再び溶解し、イソプロパノール４ｍＬで処
理し、再び遠心分離した。ペレットを減圧下で短時間乾
燥し、ヘリウムを吹き込んだ水２．８ｍＬおよび０．１
Ｎ ＮａＨＣＯ3 １ｍＬ中に溶解した。化合物３（Ｉ
Ａ−ＤＡＢＡ−ＰＥＧ）６．７ｍｇを加え、この混合物
を暗所に室温で１６時間おいた。最終容量６ｍＬの反応
混合物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ２００（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）を詰めた５×９１（１８００Ｍｌ）Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａカラムに通した。カラムを０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）で溶出し
た。ペリスタポンプを用い、流速が約２ｍＬ／分になる
ように設定し、１５ｍｌの画分を集めた。この画分の２
６０ｎｍでの吸光度を測定した。さらに、この画分をポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、純粋な複合体
を含む画分をプールした。
【０２１９】（複合体３−Ｉのハイブリダイゼーション
−複合体３−ＩＩの調製）上記プールした画分は７２６
Ａ260ユニットを含む画分であった。当量の（ＴＧ）
10を加え、チューブを９０℃で１０分間加熱し、次いで
１．５時間かけて室温にまで冷却した。等量のイソプロ
パノールを加え、この混合物を−２０℃で３時間おい
た。３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、ペレッ
トを０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍクエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．８）に溶解した。５３ｍｇのハイブリッ
ドを得た。この物質の一部を上記緩衝液で希釈し、二重
らせんの融解温度をＣａｒｅｙ ３Ｅ分光光度計で測定
した。この物質は、そのＴｍが７３．４℃であり、濃色
性は２４．３％であった。生成物の１０ Ａ260 ユニ
ットの部分を、上記に記載のように過剰の（ＴＧ）10で
アニールした。この物質と同様に非アニール複合体およ
び（ＴＧ）10標準物とを、Ｒａｉｎｉｎ ＨＰＬＣ装置
を用いＳｈｏｄｅｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＫＷ ８０２５
カラムでゲルパーミエーションＨＰＬＣにより分析し
た。カラムを、０．０５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．
５）、０．５Ｍ ＮａＣｌでイソクラティックに溶出し
た。溶出時間は１２分であった。生成物の保持時間は
６．９分であり、（ＴＧ）10は９．２分であった。ピー
ク面積の比較により、この生成物の９８．０９％が二本
鎖ＤＮＡであることが示された。この複合体は、図６Ａ
の「複合体３−ＩＩ」を示す構造により表される。
【０２２０】（実施例６） （ＰＮ−ＫＬＨ複合体の調製）ＰＮ−ＫＬＨ複合体を、
以下に示すスキームによって調製した：
【０２２１】
【化２８】 （ＡＣＴ−改変（ＣＡ）25の合成）自動化合成の最終工
程として、非環式トリオール部分（ＡＣＴ）を導入し
て、化合物５８を（ＣＡ）25に結合した。３０μｍｏｌ
／ｇでヌクレオシドをローディングした、１０ｇのＤＭ
Ｔ−ｄ−ＢｚＡ−ＣＰＧ支持体より出発して、４９の逐
次工程を、ｄＣおよびｄＡのホスホルアミダイドを交互
に用いて行った。得られたｄ−［ＤＭＴｒ−（ＢｚＣｐ
（ＣＥ）ＢｚＡ）25］からＤＭＴｒブロック基を除去
し、そして活性化剤溶液（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ、Ｃａｔ．
Ｎｏ．ＭＢＳ５０４０）４０ｍＬおよび化合物５８ ８
００ｍｇを反応混合物に加えた。懸濁液をアルゴン吹き
込みにより８分間混合し、そして通常の酸化工程を行っ
た。支持体に結合したポリヌクレオチドを反応容器から
取り出し、空気乾燥し、そして濃アンモニア１００ｍＬ
で４０時間、５５℃で処理した。温度が下がると、混合
物をＧｅｌｍａｎ １０μｍポリプロピレンフィルター
を通して濾過し、次いで、濾液を通常のイオン交換クロ
マトグラフィーにより精製した。２６０ｎｍに吸収を示
す画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動によりさらに
分析し、純粋な生成物を含有する画分を合わせて、イソ
プロパノールで沈澱させ、ＡＣＴ−改変（ＣＡ）25 ５
１０ｍｇ（３１．９μｍｏｌ、１０％）を得た。
【０２２２】（一本鎖ＰＮ−ＫＬＨ複合体の合成）Ｎａ
ＩＯ4処理したＡＣＴ−改変（ＣＡ）25 １００ｍｇ
（２．５μｍｏｌ）を５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ
８．０）１．３３ｍＬに溶かした溶液に、ＫＬＨ ３
１．３ｍｇ（０．２０８μｍｏｌ）およびピリジン−ボ
ラン２．０ｍｇ（３１．８μｍｏｌ）を加えた。この混
合物を３７℃で７２時間おき、生成物をＳ−２００での
クロマトグラフィーにより精製した。
【０２２３】（一本鎖ＰＮ−ＫＬＨ複合体の（ＴＧ）25
とのハイブリダイゼーション）当量の（ＴＧ）25を、一
本鎖ＰＮ−ＫＬＨ複合体に加え、チューブを９０℃で１
０分間加熱し、次いで１．５時間かけて室温にまで冷却
した。イソプロピルアルコールで沈澱させ、５３ｍｇの
生成物、ＰＮ−ＫＬＨを得た；Ｔｍ（０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）７
３．４℃、３１．１％濃色性；過剰の（ＴＧ）10でアニ
ールしたサンプル、非アニール複合体、および非アニー
ル（ＴＧ）10からなる標準物質に対するＨＰＬＣでの比
較により、９８％が二本鎖であることが確認された（Ｓ
ｈｏｄｅｘ ＰｒｏｔｅｉｎＫＷ ８０２５カラム、
０．０５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．５、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ）。この複合体は以下の式で表し得ＫＬＨ−［Ｎ
Ｈ（ＣＨ2）5ＯＰＯ2・Ｏ−（ＣＡ）25：（ＴＧ）25］
-5（ＫＬＨの分子量は１０5であると推定される）、
「ＰＮ−ＫＬＨ」と称される。
【０２２４】（免疫寛容原としての複合体３−ＩＩの試
験）複合体３−ＩＩを、免疫原の形態のポリヌクレオチ
ドであるＰＮ−ＫＬＨにより免疫化したマウスに免疫寛
容を起こさせる能力について試験した。
【０２２５】（材料および方法）マウス：Ｃ５７ＢＬ／
６の雌マウス（６週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購
入した。マウスは、ＮＩＨで承認された方法により飼育
した。
【０２２６】免疫処置：Ｉｖｅｒｓｏｎの方法（Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ、第２巻のＣｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ、（Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ、Ｌ．Ａ．Ｈｅｒ
ｚｅｎｂｅｒｇ、Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、およびＡ．
Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ編、第４版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、
Ｏｘｆｏｒｄ）中のＡｓｓａｙ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖ
ｏ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓ
ｅ）に従って、ミョウバン沈降させたＰＮ−ＫＬＨ １
００μｇと、アジュバントとしてホルマリン固定百日咳
菌２×１０9とを、マウスの腹腔内に注射することによ
り、マウスを初回免疫した。このマウスを、生理食塩水
に溶かした５０μｇのＰＮ−ＫＬＨでブーストした（腹
腔内）。
【０２２７】ＰＮのＳＲＢＣへの結合：ヒツジ赤血球細
胞（ＳＲＢＣ）のオルシーバー溶液をＣｏｌｏｒａｄｏ
Ｓｅｒｕｍ Ｃｏ．（Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）から購入
し、２週間以内に用いた。このＳＲＢＣを、Ｋｉｐｐお
よびＭｉｌｌｅｒの方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ、（１９８０）、Ｂ．Ｂ．ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳ．
Ｍ． Ｓｈｉｉｇｉ編、 Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍｅｎ
ａｎｄ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１０
３ページの「タンパク質複合赤血球細胞のＥＣＤＩを用
いる調製（改変）」）により、（ＣＡ）25：（ＴＧ）25
（ＣＡ：ＧＴからなる５０マー）で被覆した。簡単に言
えば、ＳＲＢＣを冷生理食塩水で４回洗浄し、カルボジ
イミド１０ｍｇを含む０．０１Ｍ ＮａＣｌ、０．３５
Ｍマンニトール中のＤ−ＥＫ結合（ＣＡ）25：（ＴＧ）
25 ２ｍｇと混合し、４℃で３０分間インキュベートし
た。被覆ＳＲＢＣを冷平衡塩類溶液で２回洗浄し、１０
％（ｖ／ｖ）に再懸濁した。
【０２２８】プラークアッセイ：抗ＰＮプラーク形成細
胞（ｐｆｃ）の数を、カニンガム法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ、（１９８０）、Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ
およびＳ．Ｍ． Ｓｈｉｉｇｉ編、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅ
ｍｅｎ ａｎｄ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ）、８６ページの、Ｍａｒｂｒｏｏｋ， Ｊ．、「液
体マトリックス（スライド法）」）を用いて測定した。
ＩｇＧ ｐｆｃの数を、Ｈｅｎｒｙによる記載（Ｓｅｌ
ｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１９８０）、Ｂ．Ｂ．Ｍｉ
ｓｈｅｌｌおよびＳ．Ｍ． Ｓｈｉｉｇｉ編、 Ｗ．
Ｈ． ＦｒｅｅｍｅｎおよびＣｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎ
ｃｉｓｃｏ、９１ページの「ＩｇＭプラークの除去によ
るＩｇＧ応答の評価」）に基づき、ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇを用いてＩｇＭプラークを除去することにより測定し
た。簡単に言えば、脾臓を採取し、単細胞懸濁液を平衡
塩類溶液（ＢＳＳ）中で調製した。ギニアピッグ血清を
ポリヌクレオチド被覆ＳＲＢＣに加えて、最終希釈物が
１：９ギニアピッグ血清となるようにし、そして充分量
のウサギ抗マウスＩｇＧを加えて、最終希釈物が１：１
００ウサギ抗マウスＩｇＧとなるようにした。ＳＲＢＣ
混合物と希釈脾臓細胞とを、マイクロタイターウェル中
で等量で混合し、カニンガムチャンバーに移した。各脾
臓を個別に３回試験した。チャンバーの端をパラフィン
で封じ、チャンバーを３７℃で１時間インキュベートし
た。プラークの数を、倒立顕微鏡下でチャンバーを観察
して数えた。
【０２２９】（結果）アジュバントとしての百日咳（Ａ
＆Ｐ）と一緒にミョウバン沈降ＰＮ−ＫＬＨでマウスを
初回免疫し、７週間後に各グループ３匹ずつに分けた。
このマウスを、ＰＮ−ＤＡＢＡ−ＰＥＧ、すなわち複合
体３−ＩＩの２倍ずつ濃度を変化させた希釈液で処理し
（腹腔内）、５日後コントロールを含めてすべてのマウ
スを、生理食塩水に入れたＰＮ−ＫＬＨ５０μｇでブー
ストした（腹腔内）。４日後、脾臓を採取し、ＩｇＧ
ｐｆｃの数を測定した。表２に示されるように、複合体
３−ＩＩを投与した試験体は、ｐｆｃの数がコントロー
ルグループに比較して顕著な減少を示した。
【０２３０】
【表２】 （実施例７） （複合体２０−ＩＩの調製および試験） （Ｔｒ−５’−改変（ＣＡ）10の結合手プラットフォー
ム分子２０への複合体化−一本鎖複合体２０−Ｉの調
製）トリ−ｎ−ブチルホスフィン９６９μＬ（７８９ｍ
ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）を、Ｔｒ−５’−改変（ＣＡ）
10 ９１８ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）のＨ2Ｏ（３０ｍ
Ｌ）溶液にアルゴンガス下で加えた。この混合物を１時
間撹拌し、次いで３Ｍ ＮａＣｌ溶液２．４ｍＬを加
え、次にヘリウムを吹き込んで酸素をパージしたイソプ
ロパノール４２ｍＬを加えた。混合物を冷凍機中に−２
０℃で１時間おき、次いで３０００ｒｐｍで３０分間遠
心分離した。上澄みを除去し、油状の残留物を、ヘリウ
ムを吹き込んだＨ2Ｏ１５．５ｍＬに溶解した。３Ｍ
ＮａＣｌ１．２４ｍＬおよびヘリウムを吹き込んだイソ
プロパノール２１．７ｍＬを、混合物に加えた。次い
で、得られた混合物を冷凍機中に−２０℃で１時間お
き、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られた
油状のペレットを減圧下で１８時間乾燥して、固形物を
得た。この固形物を、ヘリウムを吹き込んだＨ2Ｏ６ｍ
Ｌに溶解し、全容量は６．４ｍＬとなった。２６０ｎｍ
でのＵＶ吸光度測定により、ＤＮＡ量は８６３ｍｇであ
った（ｐＨ７．５食塩加リン酸緩衝液での、吸光単位当
り０．０３３ｍｇ）。この溶液を、５０ｍＬ三口フラス
コにアルゴンガス下で移した。フラスコの１つの口をア
ルゴンガスの導入口とし、他の２つには栓をした。ヘリ
ウムを吹き込んだ１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．８）０．８７ｍＬとＭｅＯＨ ０．９７ｍＬとＨ2
Ｏとを加えて、全容量を７．７ｍＬに調整した。化合物
２０の１７．７ｍｇ／ｍＬ ＭｅＯＨ溶液１．９ｍＬ
（３３．６３ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を、混合物に
加えた。得られた混合物を、アルゴンガス下で２０時間
撹拌し、次いで０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ リン
酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、および１０％ＭｅＯＨを
含有する溶液で１００ｍＬに希釈した。精製は、Ｆｒａ
ｃｔｏｇｅｌRでのクロマトグラフィーにより行った
（平衡：０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ リン酸ナト
リウム、ｐＨ７．５、１０％ＭｅＯＨ：溶離グラジエン
ト ０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ リン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７．５、１０％ＭｅＯＨから０．８Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１０
％ＭｅＯＨまで）。ＨＰＬＣおよびポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により示される、純粋な複合体２０−Ｉを
含む画分を、２３２ｍＬの溶離液中に集めた。等量のイ
ソプロパノールを加え、これを冷凍機中に−２０℃で１
時間おくことにより、生成物および塩を沈澱させた。Ｈ
2Ｏに対して透析し（２×１００ ｖｏｌ）、３３５ｍ
ｇの複合体２０−Ｉ（１０．４７ｍｇ／ｍＬで３２ｍ
Ｌ、０．０３３ｍｇ／吸光単位（２６０ｎｍ）、推定）
を得た。
【０２３１】（二本鎖複合体２０−ＩＩを形成するため
の、複合体２０−Ｉと（ＴＧ）10とのアニーリング）複
合体２０−Ｉ １５０ｍｇ（０．０３３ｍｇ／吸光単位
（２６０ｎｍ）に基づき、１０．４７ｍｇ／ｍＬで１
４．３３ｍＬ）および（ＴＧ）10 １５７．５ｍｇ
（０．０３３ｍｇ／吸光単位（２６０ｎｍ）に基づき、
１０４．６ｍｇ／ｍＬで１．５０ｍＬ）を、５０ｍＬポ
リプロピレン遠心管に入れた。ｐＨ７．２１０×ＰＢＳ
を２．０ｍＬおよびＨ2Ｏを２．１７ｍＬ加えることに
より、濃度を１５ｍｇ／ｍＬに調整した。混合物を、９
０℃湯浴中におき、そして１．５時間かけて室温にまで
冷却した。濃度は、２６０ｎｍの吸光度（０．０５０ｍ
ｇ／吸光単位）により、１７．７ｍｇ／ｍＬであると確
認された；転移融解温度 ６７．５℃；濃色性 ２７
％；重量オスモル濃度３４６；ｐＨ７．２であった。複
合体２０−ＩＩの最終の処方のために、ｐＨ７．２ １
／２ × ＰＢＳを７．２３ｍＬ加え、０．２２μフィ
ルターを通して濾過することにより、溶液を最終濃度１
２．７ｍｇ／ｍＬおよび重量オスモル濃度２９９に希釈
した。
【０２３２】（Ｔｒ−５’−改変（ＣＡ）10-20の別の
複合体化、一本鎖複合体２０−Ｉの調製）１０当量のト
リ−ｎ−ブチルホスフィンを、Ｔｒ−５’−改変（Ｃ
Ａ）10をＨｅ吹き込み１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５）に溶かした１０ｍｇ／ｍＬ溶液に加える。この混合
物を１時間撹拌し、次いで１．４倍量のイソプロピルア
ルコール（ＩＰＡ）で沈澱させる。混合物を冷凍機中に
−２０℃で１時間おき、次いで３０００ｒｐｍで２０分
間遠心分離する。上澄みを除去し、ペレットを、ヘリウ
ムを吹き込んだＩＰＡに１０ｍｇ／ｍＬで溶解する。混
合物を冷凍機中に−２０℃で１時間おき、次いで３００
０ｒｐｍで２０分間遠心分離する。ペレットを減圧下で
１８時間乾燥し、固形物を得る。この固形物の５０ｍｇ
／ｍＬ溶液を、ヘリウムを吹き込んだ１００ｍＭホウ酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中で調製する。９／１
ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ中の４０ｍｇ／ｍＬ溶液として、０．
２５当量の化合物２０を、この混合物に加える。この混
合物を室温で３〜２０時間撹拌し、希釈する（０．１Ｍ
ＮａＣｌ、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．
５）、１０％ＭｅＯＨ）。Ｆａｃｔｏｇｅｌのクロマト
グラフィーにより精製を行う。（平衡；０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１
０％ＭｅＯＨ：溶離グラジエント； ０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１０
％ＭｅＯＨから０．８Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ リン
酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１０％ＭｅＯＨまで）。Ｈ
ＰＬＣおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動により示
される、純粋な２０−Ｉを含む画分を集めた。等量のＩ
ＰＡを加え、これを冷凍機中に−２０℃で１時間おくこ
とにより、生成物および塩を沈澱させる。Ｈ2Ｏに対し
て透析し（２×１０ ｖｏｌ）、２０−Ｉを得る。
【０２３３】（二本鎖複合体２０−ＩＩを形成するため
の、２０−Ｉの（ＴＧ）10-20による別のアニーリン
グ）アニーリングを９０℃で行う代わりに７０℃で行っ
たこと以外は、上記方法と実質的に同一である。
【０２３４】（Ｔｒ−５’−改変（ＣＡ）10-20のさら
に別の複合体化、一本鎖複合体２０−Ｉの調製）トリ−
ｎ−ブチルホスフィン４．８ｍＬを、Ａｒ吹き込み１０
０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）１０４ｍＬに７．７５
ｇのＴｒ−５’−改変（ＣＡ）10を溶かした溶液にＮ2
下で加えた。この混合物を１時間撹拌し、次いでＩＰＡ
２３２．５ｍＬで沈澱させた。混合物を冷凍機中に−
２０℃で１．５時間おき、次いで３０００ｒｐｍで２０
分間遠心分離し、そして−２０℃で２４時間おいて凍ら
せた。上澄みを除去し、ペレットをＨｅ吹き込み０．３
Ｍ ＮａＣｌ溶液１７０ｍＬに溶解した。混合物をＡｒ
吹き込みＩＰＡ ２３２ｍＬで再び沈澱させた。次いで
混合物を冷凍機中に−２０℃で２時間おき、３０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離し、そして−２０℃で１１時間
おいた。上澄みを除去し、ペレットを減圧下で１２時間
乾燥し、固形物を得た。この固形物の溶液を、Ａｒ吹き
込み１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）１
１０ｍＬ中で調製した。９／１ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（４．
４ｍＬ）溶液として、４０６ｍｇの化合物２０を、この
混合物に加えた。この混合物を室温で２時間撹拌した。
得られた混合物は、高圧イオンクロマトグラフィーによ
り６２％の２０−Ｉを含有していることが示された。こ
のクロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ｇｅｎ Ｐａ
ｋ Ｆａｘ カラム（１００×４ ｍｍ）、６０℃、直
線グラジエント ６５％Ａ／３５％Ｂから１８％Ａ／８
２％Ｂ；Ａ＝０．０５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）；Ｂ＝
０．０５Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）で行
い、２０−Ｉは１９．５分で溶出した。
【０２３５】（複合体２０−ＩＩおよび非複合体コント
ロールの試験）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＰＮ−ＫＬＨ
およびＡ＆Ｐで免疫化した。３週間後、マウス５匹／グ
ループのグループに、それぞれ種々の投与量の複合体２
０−ＩＩ、または４．５ｎＭ ＨＡＤ−ＡＨＡＢ−ＴＥ
Ｇ（誘導体化した結合手プラットフォーム分子、ＡＨＡ
Ｂ−ＴＥＧにリンカーＨＡＤを接続、図７参照）、また
は１８ｎＭ（４×４．５）（ＣＡ）10：（ＴＧ）10、ま
たは４．５ｎＭ ＨＡＤ−ＡＨＡＢ−ＴＥＧと１８ｎＭ
（ＣＡ）10：（ＴＧ）10との混合物を腹腔内投与した；
そして、１つのグループには処理を行わなかった。各グ
ループに注射してブーストし、血清を採集して、実施例
６に記載のアッセイを行った。抗ＰＮ応答の減少（百分
率で表示）を図４に示す。これらのマウスの抗ＫＬＨ応
答は普通であり、図２に示される抗ＫＬＨ応答とは顕著
に異なるものではなかった。本実施例の結果から、抗Ｐ
Ｎ応答は、（ｉ）結合手プラットフォーム分子のみ、
（ｉｉ）ＰＮのみ、または（ｉｉｉ）この２つの混合物
によって影響されなかったことが明らかである。ＰＮ
は、免疫寛容を誘導するためには、非免疫原の結合手プ
ラットフォーム分子と結合されなければならない。
【０２３６】（複合体２０−ＩＩがＰＮ特異性抗体産生
細胞の数の減少をもたらすこと）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス
を、ＰＮ−ＫＬＨおよびＡ＆Ｐで免疫化した。３週間
後、マウス３匹／グループのグループを、種々の投与量
の複合体２０−ＩＩで、それぞれ腹腔内投与した；そし
て、１つのグループには処理を行わなかった。 ５日
後、全てのマウスに、生理食塩水に入れたＰＮ−ＫＬＨ
を腹腔内注射してブーストし、次いで４日後、それらの
脾臓を採取し、溶血プラークアッセイを用いて、ＰＮ特
異性のＩｇＧ産生細胞の数についてアッセイした。結果
を表３に示す。この結果から、この複合体によって、Ｐ
Ｎ特異性ＩｇＧ産生細胞の数が減少したことが明らかで
ある。
【０２３７】
【表３】 （実施例８） （複合体の免疫寛容原としての試験） （複合体１７−ＩＩの免疫寛容原としての試験）Ｃ５７
ＢＬ／６マウスを、ＰＮ−ＫＬＨおよびＡ＆Ｐで免疫化
した。３週間後、マウス５匹／グループのグループに、
種々の投与量の複合体１７−ＩＩを、それぞれ腹腔内
（ｉ．ｐ．）投与した；そして、１つのグループには処
理を行わなかった。５日後、全てのマウスに、生理食塩
水に入れたＰＮ−ＫＬＨを腹腔内注射してブーストし、
７日後、このマウスの採血を行った。血清を、ＰＮ濃度
１０ -8ＭでＦａｒｒアッセイにより抗ＰＮ抗体について
分析した。抗ＰＮ応答の減少（百分率表示）を図１に示
す。また、この血清を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗
ＫＬＨ抗体についても分析した。この結果を、抗ＫＬＨ
血清の標準プールに比較した抗ＫＬＨの百分率として表
し、図２に示す。図１中のデータにより、この複合体が
抗ＰＮ応答を低減したことが示される。これらのマウス
はすべて、抗ＫＬＨ（プラットフォーム分子）応答は普
通であった（図２参照）。
【０２３８】（種々の１１シリーズの複合体の免疫寛容
原としての試験）Ｃ５７ＢＬ／６マウス／グループのグ
ループ３つを、ＰＮ−ＫＬＨおよびＡ＆Ｐで免疫化し
た。３週間後、２つのグループに対し、それぞれ３つの
異なる投与量の複合体１１−ＩＶ、複合体１１−ＩＩ、
複合体１１−ＶＩ、または複合体１１−ＶＩＩＩを腹腔
内投与し、１つのグループには処理を行わなかった。こ
れらの複合体は、図６Ａ−Ｂに記載されており、上記の
実施例７の方法に従って調製した。５日後、全てのマウ
スに、生理食塩水に入れたＰＮ−ＫＬＨを腹腔内注射し
てブーストし、７日後、このマウスの採血を行った。血
清を、ＰＮ濃度１０-8ＭでＦａｒｒアッセイにより抗Ｐ
Ｎ抗体について分析した。抗ＰＮ応答の減少（百分率表
示）を示す結果を図３に示す。これらのマウスの抗ＫＬ
Ｈ応答は、図２に示される抗ＫＬＨ応答と顕著に異なる
ものではなかった。４つの複合体は全て、試験した全て
の投与量で、抗ＰＮ応答を顕著に減少させた。
【０２３９】（複合体１１−ＩＩがＰＮ特異性抗体産生
細胞の数の減少をもたらすこと）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス
を、ＰＮ−ＫＬＨおよびＡ＆Ｐで免疫化した。３週間
後、マウス３匹／グループのグループに対し、種々の投
与量の複合体１１−ＩＩを腹腔内投与し、１つのグルー
プには処理を行わなかった。５日後、全てのマウスに、
生理食塩水に入れたＰＮ−ＫＬＨを腹腔内注射してブー
ストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プ
ラークアッセイを用いて、ＰＮ特異性のＩｇＧ産生細胞
の数についてアッセイした。種々の投与量の複合体１１
−ＩＩによる実験の結果を表４に示す。この結果から、
この複合体により、ＰＮ特異性ＩｇＧ産生細胞の数が減
少し、そして抗体力価の減少は、複合体に結合した血清
抗体のクリアランスによるものではないことが明らかで
ある。
【０２４０】
【表４】 （実施例９） （ＨＡＤｐＳ−（ＣＡ）10−複合体２０−ＩＶの調製）
５’末端にリンカーを結合するホスホロチオエートを有
する改変ポリヌクレオチドを調製した。２０マーの（Ｃ
Ａ）10の合成およびＨＡＤリンカーのポリヌクレオチド
への付加を、以下に記載することを除いて、実施例５の
方法に従って行った。最終の酸化工程において、ヨウ素
溶液を、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン
１，１ ジオキシド（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）の０．０５Ｍアセトニトリル
溶液に置き換えた。イオウ化処理は、製造者の指示に従
って行った。アンモニア処理および精製は、実施例５と
同様にして行った。ポリヌクレオチドのＡＨＡＢ−ＴＥ
Ｇ結合手プラットフォームへの複合体化は、実施例５の
方法に従って行った。
【０２４１】（複合体２０−ＩＶの免疫寛容原としての
試験）ＰＮの５’ホスフェートは酵素分解を受け易いの
で、末端ホスフェートの酸素分子のうち１つをイオウで
置換した（従って、ＨＡＤpＳという名とする）。Ｃ５
７ＢＬ／６マウスを、ＰＮ−ＫＬＨおよびＡ＆Ｐで免疫
化した。３週間後、マウス５匹／グループのグループ
を、種々の投与量の複合体２０−ＩＶで腹腔内投与し、
１つのグループには処理を行わなかった。グループにブ
ースター注射を行い、血清を採集して、上記のアッセイ
を行った。抗ＰＮ応答の減少（百分率表示）を示す結果
を図５に示す。これらのマウスの抗ＫＬＨ応答（データ
は示さず）は普通であり、図２に示される抗ＫＬＨ応答
と顕著に異なるものではなかった。これらの結果は、こ
の複合体が抗ＰＮ応答を顕著に減少させたことを示す。
【０２４２】（複合体２０−ＩＶがＰＮ特異性抗体産生
細胞の数の減少をもたらすこと）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス
を、ＰＮ−ＫＬＨおよびＡ＆Ｐで免疫化した。３週間
後、マウス３匹／グループのグループに対し、種々の投
与量の複合体２０−ＩＶを腹腔内投与し、１つのグルー
プには処理を行わなかった。５日後、全てのマウスに、
生理食塩水に入れたＰＮ−ＫＬＨを腹腔内注射してブー
ストし、次いで４日後、それらの脾臓を採取し、溶血プ
ラークアッセイを用いて、ＰＮ特異性のＩｇＧ産生細胞
の数についてアッセイした。この結果を表５に示す。こ
の結果から、この複合体により、ＰＮ特異性ＩｇＧ産生
細胞の数が減少したことが明らかである。
【０２４３】
【表５】 （実施例１０） （ＬＪＰ３９４、複合体２０−ＩＩでのＢＸＳＢマウス
の処理） （マウス処理プロトコル）６〜９週齢の雄ＢＸＳＢマウ
ス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ
Ｈａｒｂｏｒ， Ｍｅ）をＬａ Ｊｏｌｌａ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌの施設で飼育した。食物および水
は随意に与えた。実験に使用する前に、動物を１週間休
ませた。最初の複合体処理を行う前に、初期の血液サン
プルを得、そして初期体重を測定した。複合体の処理は
７〜９週齢で開始し、５９日目から１５０日目まで１週
間に２回静脈内投与を行った。動物の採血を定期的に行
い、その抗ＤＮＡ抗体力価を決定した。
【０２４４】（ＩｇＧ抗ＤＮＡ抗体産生に対するアッセ
イ）各マウスから得た血清サンプルを、抗ＤＮＡ抗体の
存在をＥＬＩＳＡにより評価した。Ｆａｌｃｏｎ Ｐｒ
ｏｂｉｎｄ ９６ウェルマイクロタイトレーションアッ
セイプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ，
Ｏｘｎａｒｄ， ＣＡ）を、５０μｇ／ｍＬの濃度の
（ＰＮ）50−Ｄ−ＥＫ（Ｄ−グルタミン酸およびＤ−リ
ジンのコポリマー）１００μＬ／ウェルで、４℃で一晩
被覆した。このプレートを、カルシウムおよびマグネシ
ウムを含有しないＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０（洗浄緩衝液）で、Ｍ９６Ｖ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈ
ｅｒ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｉｒ
ｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて２回洗浄した。プレートを、
１％ゼラチン（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を含有す
るＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０により、室
温で１時間遮断した。血清サンプルまたは標準物を加え
る前に、プレートを洗浄緩衝液で２回洗浄した。血清サ
ンプルおよび標準物を、１％ゼラチンを有するＰＢＳ、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０、および１０％ヤギ血清を
含む希釈液として調製した。プレートを３７℃で６０〜
９０分間、血清サンプルを用いてインキュベートし、次
いでウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。ビオチニル化
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、１０％ヤギ血清
を含む遮断溶液で１／１０００に希釈した。プレートを
３７℃で１時間インキュベートし、４回洗浄した。基質
となるＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を加えた。ＯＤ ４５０
ｎｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダーにより最も高い標
準物の最高読み取り値が約１ ＯＤユニットになるま
で、プレートを暗所中でインキュベートした（Ｂｉｏ−
Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｉｎｏｏｓｋ
ｉ，ＶＴ）。反応を３Ｍ ＨＣｌ５０μＬで中断し、プ
レートを４９０ｎｍで読み取った。各マイクロタイトレ
ーションプレートにはリファレンスの陽性血清が含まれ
ており、各アッセイからの陽性ウェルはこのリファレン
スの時間曲線の９５％範囲内の感度であった。後に採血
した血液では、陽性サンプルのいくつかがリファレンス
カーブを超過した。しかし、ほとんどの希釈マウス血清
サンプルは、リファレンスカーブ範囲内にあった。正常
のコントロール陰性血清による、顕著な結合は観察され
なかった。結果を図１５に示す。
【０２４５】（実施例１１） （メリチンペプチドおよび複合体の調製）メリチン分子
は、２６のアミノ酸からなり、ミツバチ毒の主成分の１
つである。ミツバチ毒感受性個体の３分の１は、メリチ
ン特異性抗体を有する。メリチンは、数種のマウス系統
（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＡＦ１）では、高い免疫原性を有す
る。応答マウス系統のメリチン特異性抗体の多く（＞８
０％）は、メリチンのＣ末端の７つのペプチドであるＢ
細胞エピトープに結合する。
【０２４６】（メリチン）
【０２４７】
【化２９】 （Ｔ細胞を刺激するメリチンペプチド）
【０２４８】
【化３０】 （ペプチド合成）メリチンペプチドは、グリシン樹脂
（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ＃ＳＧ５１３
０）あるいはその等価物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ
Ｔｅｃｈ、２５００ Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ
Ｒｏａｄ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）上で標準的な
Ｆｍｏｃ化学法により合成した。各結合工程では、２．
３Ｍ過剰のアミノ酸誘導体を用いた。結合の完了は、ブ
ロモフェノールブルーでモニターし、ニンヒドリンで確
認した。
【０２４９】（複合体に用いられるメリチンペプチド）
【０２５０】
【化３１】 ペプチドをチオエーテル結合により結合手プラットフォ
ーム分子に結合させるために必要なので、システインを
加えた。ペプチドを、合成後に逆相ＨＰＬＣにより精製
し、凍結乾燥により乾燥した。次いで、適度な量のペプ
チドを、各複合体化に対して秤量した。
【０２５１】（予め形成されたジスルフィド結合の還元
（トリブチルホスフィン法））全ての緩衝液にヘリウム
を吹き込んだ。ペプチドを、最少容量（約１０〜２０ｍ
ｇ／ｍＬ）の０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．２
５）に溶解した。０．７Ｍトリブチルホスフィン（ＴＢ
Ｐ；ＭＷ＝２０２．３２ｇ／モル；ｄ−０．８１２ｇ／
ｍＬ）の１ｍＬ溶液は、ＴＢＰ １７４．４μＬをイソ
プロパノール（ｉＰｒＯＨ）８２５．６μＬに加えるこ
とにより調製した。次いで、上記のように調製したペプ
チド溶液に、ＴＢＰを（１：１）の当量で加え、充分に
混合し、次いで時々撹拌してＴＢＰを溶液中に溶解およ
び／または分散させながら、３０分から１時間反応させ
た。ＨＰＬＣにより、還元が完了したことを確認した。
【０２５２】（結合手プラットフォーム分子＃３または
＃６０へのペプチドの複合体化）全ての緩衝液にヘリウ
ムを吹き込んだ。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘
導体＃３または＃６０を、最少容量（約２０ｍｇ／ｍ
Ｌ）の０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．２５）に溶
解した。ＰＥＧ誘導体のヨードアセチル基当り、約３当
量のペプチドを用いた。ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢ
Ａ）−ＰＥＧ（ヨードアセチル基２個；ＭＷ＝約４１０
０ｇ／モル）では、ＰＡＢＡ−ＰＥＧ各当量について６
当量のペプチドを用いた。ジアミノ安息香酸（ＤＡＢ
Ａ）−ＰＥＧ（ヨードアセチル基４個；ＭＷ＝約４３０
０ｇ／モル）では、ＤＡＢＡ−ＰＥＧ各当量について１
２当量のペプチドを用いた。還元したペプチド溶液にＰ
ＥＧ溶液を加え、暗所で少なくとも１時間反応させた。
ペプチド複合体を調製用ＨＰＬＣで精製した。プールお
よび凍結乾燥を行う前に、１５％トリシンゲルを用いる
電気泳動により画分を確認した。
【０２５３】
【表６】 （マウスリンパ節増殖アッセイ）雌のＢａｌｂ／ｃマウ
ス（６〜８週齢；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）を得て、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ動物施設
で、国立衛生研究所のガイドラインに従って飼育した。
食物および水は随意に与えた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）
に入れたメリチン分子５０μｇで、各後ろ足の裏に免疫
処置した。７日後、膝窩リンパ節を無菌状態で採取し
た。５０メッシュふるいスクリーンを通して細胞を細か
くすることにより、リンパ節を穏やかに分離した。単細
胞懸濁物を、グルタミン、ペニシリン、およびストレプ
トマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）中で洗浄
した。丸底９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇマイクロタイトレ
ーションプレートの４つ組のウェル中で、１０％ウシ胎
児血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ培地において、５
×１０5個の細胞を、１０、１．０、または０．１μｇ
／ｍＬの、メリチンまたはメリチンペプチドで培養し
た。陽性コントロールウェルにおける細胞を、１００ま
たは５０Ｕ／ｍＬのネズミインターロイキン２（ＩＬ−
２）、１μｇ／ｍＬのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）
で培養した。陰性コントロールウェルは、ＲＰＭ−１６
４０および１０％ＦＣＳ中にリンパ節細胞を有した。細
胞を、５％ＣＯ2の３７℃インキュベーター中で、４日
間培養した。各ウェルを、１μＣｉの［3Ｈ］チミジン
（ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ Ｍ
ｅｓａ、ＣＡ）で、さらに１８時間パルスした。半自動
式細胞捕集器（Ｓｃａｔｒｏｎ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖ
Ａ）により、グラスファイバーフィルターマット上に、
細胞を集めた。［3Ｈ］チミジンの取り込みを、液体シ
ンチレーションにより測定した。結果は、１分間当りの
平均カウントで表した。
【０２５４】（インビボプロトコル）Ｂａｌｂ／ｃマウ
スを、ＣＦＡ中のメリチン４μｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）
に投与することにより、初回免疫した。１カ月後、潜在
免疫寛容原または調合緩衝液を腹腔内投与した。３日
後、全てのマウスに対して、不完全フロイントアジュバ
ント（ＩＣＦ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に入れたメリチン４
μｇの腹腔内注射を行った。１０日後に、１００〜２０
０μＬの血液を、後眼窩静脈叢から採集した。血清サン
プルを、抗ペプチドまたは抗メリチンＩｇＧ抗体につい
てアッセイした。
【０２５５】（ＩｇＧ抗メリチンまたは全抗メリチン抗
体に対するアッセイ）個々のマウスの血清サンプルにつ
いて、連続して、抗メリチン抗体の存在についてＥＬＩ
ＳＡにより評価した。Ｆａｌｃｏｎ Ｐｒｏｂｉｎｄ
９６ウェルマイクロタイトレーションプレートを、食塩
加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）に入れたメリ
チンまたはメリチンペプチド１０μｇ／ｍＬにより、４
℃で一晩、予備被覆した。このプレートを、ＰＢＳ、
０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、および１％ゼラチン（Ｎ
ｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ
Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）を含有する洗浄溶液で２回
洗浄した。プレートを、５％ゼラチンを含有するＰＢＳ
２００μＬにより、３７℃で１時間遮断した。血清サ
ンプルを、５％ゼラチンを含有するＰＢＳの希釈液とし
て調製した。サンプルを、１：１００から１：１０００
に希釈して試験した。３７℃で１時間インキュベートし
た後、プレートを４回洗浄した。エキストラアビジン
（ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ）パーオキシダーゼ（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ）を、５％ゼラチンを含有するＰＢＳで１：１００
０で希釈した。このプレートを、３７℃で３０分間イン
キュベートし、次いで５回洗浄した。ウェルをο−フェ
ニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により、暗所
で１５〜３０分間発色させ、反応を３Ｍ ＨＣｌで中断
した。光学濃度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダー
（Ｂｉｏ−ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏ
ｏｓｋｉ、ＶＴ）上で４５０ｎｍで測定した。
【０２５６】（抗体産生細胞アッセイ）セルロースマイ
クロタイトレーションプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
Ｃｏ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、ＩｇＧ抗体（ＥＬ
ＩＳＡ）アッセイについて上記で示したように調製し
た。しかし、上記ＩｇＧ抗体アッセイで血清サンプルを
ウェルに加える時点で、脾臓細胞（５×１０5／ウェ
ル）を血清の代わりに加え、一晩インキュベートした。
ＥＬＩＳＡアッセイの残りの工程は、上記と同様にして
行った。
【０２５７】（Ｔ細胞エピトープ）メリチンで感作した
マウスから得たＴ細胞は、全メリチン分子およびＣ末端
メリチンペプチド３、４、および５に応答して、Ｔ細胞
増殖を示した（図８）。しかし、Ｃ末端ペプチド１およ
び２は、顕著なＴ細胞増殖を誘導しなかった。メリチン
ペプチド２および５をＰＥＧに複合体化した。メリチン
ペプチド２と同様に、メリチンペプチド２のＰＥＧ複合
体もまた、顕著なＴ細胞増殖を誘導しなかった。
【０２５８】（メリチンで初回免疫しブーストしたマウ
スを免疫寛容にするメリチン複合体化ペプチドによる実
験）上記のようにして調製された複合体（１０ｍｇ／ｋ
ｇ、２００μｇ／マウス）で処理したマウスは、調合緩
衝液で処理したコントロールＢａｌｂ／ｃマウスに比較
して、顕著に低いレベルの抗メリチンペプチド２抗体を
有し（図９）、そしてまた低いレベルの抗メリチン抗体
を有していた（図１０）。緩衝液コントロールまたは上
記の複合体で処理したマウス由来の脾臓細胞を、抗メリ
チン抗体または抗メリチンペプチド２抗体を産生する抗
体産生細胞の能力について、可溶性ＥＬＩＳＡアッセイ
での測定によりアッセイした。図１１に示すように、複
合体２で処理したグループにおける抗メリチンペプチド
２抗体産生細胞のレベルは、調合緩衝液を投与したコン
トロールグループにおけるレベルよりも、顕著に低い値
であった。複合体４（Ｔ細胞エピトープを含むペプチド
５の複合体）で処理したマウスは、処理マウスにおいて
ペプチド５に対する抗体の力価を低下させなかった。従
って、Ｔ細胞エピトープを含む複合体は、免疫寛容原で
はない（図１２）。事実、応答を低下させるよりもむし
ろ、抗ペプチド抗体のレベルはわずかに上昇し得る。
【０２５９】（実施例１２） （メリチンで初回免疫しブーストしたマウスを免疫寛容
にするメリチンペプチド複合体によるさらなる実験）雌
のＣ５７ＢＬ／６マウス（５〜８週齢）をＴｈｅ Ｊａ
ｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂ
ｏｒ、ＭＥから購入した。国立衛生研究所のガイドライ
ンに従って、動物を維持し、取り扱った。
【０２６０】（免疫処置プロトコル）ミョウバン沈降メ
リチン５μｇおよびアジュバントとして百日咳菌（Ｂ．
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ、Ｌａ
ｎｓｉｎｇ、ＭＩ）２×１０9を含む腹腔内注射により
マウスを初回免疫した。このマウスに対し、ＰＢＳに入
れたメリチン５μｇを腹腔内投与してブーストした。
【０２６１】（ｐｆｃアッセイ）ヒツジ赤血球細胞（Ｓ
ＲＢＣ）（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏ．、Ｄ
ｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を、カルボジイミドを
用いてメリチンペプチド２と複合体化した。新鮮ＳＲＢ
Ｃ（２週齢未満）を、冷生理食塩水で４回およびマンニ
トール（０．３５Ｍマンニトール、０．０１Ｍ ＮａＣ
ｌ）で１回洗浄した。このＳＲＢＣを、１０％（ｖ／
ｖ）濃度となるようにマンニトール中に懸濁した。メリ
チンペプチド＃３ ３０μｇを含有するマンニトール１
００μＬを、１０％ＳＲＢＣの１ｍＬアリコートに加
え、次いでこれを氷中で１０分間インキュベートした。
次いで、１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド ＨＣｌ （ＥＤＣＩ）の１００
ｍｇ／ｍＬ溶液１００μＬを加えて、氷中で３０分間イ
ンキュベートした。ＳＲＢＣを平衡塩類溶液（ＢＳＳ）
（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｉｒ
ｖｉｎｅ、ＣＡ）で２回洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）にな
るように再懸濁した。凍結乾燥ギニアピッグ補体（ＧＩ
ＢＣＯ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）をＢＳＳで再構成
し、次いでＢＳＳで１：３に希釈した。希釈ギニアピッ
グ補体１ｍＬを複合体化ＳＲＢＣ３ｍＬに加えた。ウサ
ギ抗マウスＩｇＧを加え、ウサギ抗血清の１：１００の
最終希釈液を得た。この濃度は、ＩｇＧ ｐｆｃの最大
数を増加させる一方、全てのＩｇＭ ｐｆｃを阻害する
ように予め決定した。この補体／抗マウスＩｇＧ／ＳＲ
ＢＣ懸濁液と、１匹のマウスから採取したマウス脾臓細
胞の細胞懸濁液とを、等量で混合した。混合物を各５０
μＬずつ、カニンガムスライドのチャンバー（スライド
当り３チャンバー）に移した。次いで、端をパラフィン
で封じ、３７℃で１時間インキュベートした。チャンバ
ー当りのプラークの数を、解剖顕微鏡を用いて数えた。
コントロールとして非複合体化ＳＲＢＣを用いた、各脾
臓懸濁液のアッセイを行った。生細胞の数を、各脾臓細
胞懸濁液において測定した。脾臓細胞１０6個当りのｐ
ｆｃの数を各チャンバーについて測定し、３つ組の平均
を算出した。非複合体化ＳＲＢＣでのｐｆｃ数を複合体
化ＳＲＢＣでのｐｆｃ数から引いて、ペプチド特異性ｐ
ｆｃの数を測定した。
【０２６２】（ｐｆｃ測定のための最適時間の決定）マ
ウスをメリチンで初回免疫した。感作マウスのグループ
（グループ当りマウス３匹）を、２、４、６、および８
日目にメリチンでブーストした。１０日目に、マウスを
殺し、それらの脾臓を採取した。細胞懸濁液を調製し、
ペプチド特異性ｐｆｃの数の測定のためにアッセイし
た。ｐｆｃの最適数は、６日後メリチンブーストで得ら
れた。
【０２６３】（ＰＥＧ複合体でのペプチドの方向が免疫
寛容を誘導する複合体の能力に影響しないこと）ＰＥＧ
複合体のペプチド方向が、免疫寛容を誘導する複合体の
能力に影響するかどうかを決定するために、２つの異な
る免疫寛容原を構成した。ペプチドを、そのＣ末端を通
じて、結合手プラットフォーム分子３に共有結合させ、
メリチン複合体３を生成した。メリチンで初回免疫した
マウスのグループ（３／グループ）を、複合体または生
理食塩水で腹腔内処理した。５日後、未処理コントロー
ルグループを含めた全てのマウスを、メリチン５μｐで
ブーストした。６日後、マウスを殺し、それらの脾臓を
採取し、ペプチド特異性ｐｆｃの数を測定した。表８に
示すように、両方向共に、親タンパク質メリチンで初回
免疫しブーストしたマウスにおいて、ペプチド特異性ｐ
ｆｃ／１０6脾臓細胞の数を減少させる効果があった。
【０２６４】
【表７】 （ＰＥＧ複合体当りのペプチド数が免疫寛容を誘導する
複合体の能力に影響すること）ＰＥＧ分子に対してのペ
プチドの比率が重要であるかどうかを決定するために、
３つの異なる複合体（ＰＥＧ複合体当りのペプチド数が
それぞれ異なる）を構成した。複合体１は、ＰＥＧ複合
体当り２個のペプチドのみを有した。別の複合体は、Ｐ
ＥＧ複合体当り４個のペプチドを有した（複合体２）。
３番目の複合体は、ＰＥＧ複合体当り８個のペプチドを
有した（複合体５）。メリチンで初回免疫したマウスの
グループ（３／グループ）を、異なる複合体または生理
食塩水で腹腔内処理した。５日後、未処理コントロール
グループを含めた全てのマウスを、メリチン５μｇでブ
ーストした。６日後、マウスを殺し、それらの脾臓を採
取し、ペプチド特異性ｐｆｃの数を測定した。表８に示
すように、複合体１（ＰＥＧ分子当り２個のペプチドを
含む）は、親タンパク質メリチンで初回免疫しブースト
したマウスにおいて、ペプチド特異性ｐｆｃ／１０6脾
臓細胞の数を減少させるのに有効ではなかった。この結
果は、メリチン複合体２および５は、ともに免疫寛容原
として有効であったことをしめす。しかし、複合体５
（８個のペプチドを含む）は、複合体２（結合手プラッ
トフォーム分子当り４個のペプチドを含む）よりも少な
い投与量で有効であった。
【０２６５】
【表８】 ポリヌクレオチド化学、複合体化学、免疫学、および関
連分野の当業者に明らかである、本発明の実施のための
上記態様の改変は、添付した特許請求の範囲の範囲内に
あることが意図される。
【０２６６】
【発明の効果】本発明は、自己免疫疾患である全身性紅
斑性狼瘡（ＳＬＥ）などの病気を治療するために用い
る、ポリヌクレオチドなどの生物学的あるいは合成分子
とカップリングさせた、化学的に定義された非ポリマー
性の結合手プラットフォーム分子およびその複合体を提
供し、この本発明の複合体を用いると、例えば、従来技
術に記載される定義の不明確なポリマー性の担体に比
べ、少なくとも約１０倍から１００倍以上の免疫抑制と
いう、予想されなかった驚くべき効果が達成される。
【０２６７】具体的には、本発明によれば以下が提供さ
れる： （１）（ａ）生物学的分子あるいは合成分子と反応し
た、（ｂ）以下の式の化学的に定義された非ポリマー性
結合手プラットフォーム分子、を含む、複合体：
【０２６８】
【化３２】 但し、存在する場合、Ｇ[1]およびＧ[2]は各々独立し
て、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択
される１−２０００の鎖状原子を含む、直鎖、分枝ある
いは複数に分枝した鎖である；Ｔ[1]として示されたｎ
[1]個の部分、および、Ｔ[2]として示されたｐ[2]×ｎ
[2]個の部分は各々独立して、−ＮＨＲSUB（アミン）、
−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨＲ SUB（ヒドラジド）、−ＮＨＮ
ＨＲSUB（ヒドラジン）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボン
酸）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲESTER（活性エステル）、−Ｃ
（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）ＲB（無水物）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ
（酸ハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｘ（スルホニルハライ
ド）、−Ｃ（＝ＮＲSUB）ＯＲSUB（イミデートエステ
ル）、−ＮＣＯ（イソシアネート）、−ＮＣＳ（イソチ
オシアネート）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ（ハロホルメー
ト）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝ＮＲSUB）ＮＨＲSUB（カル
ボジイミド付加体）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ（アルデヒド）、
−Ｃ（＝Ｏ）ＲB（ケトン）、−ＳＨ（スルフヒドリ
ル、あるいはチオール）、−ＯＨ（アルコール）、−Ｃ
（＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、−ＲALKＸ（アルキ
ルハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲA LKＸ（アルキルスル
ホネート）、Ｒ1Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝
Ｏ）−である、−ＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、−Ｃ（＝
Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和カルボニル）、−
ＲALK−Ｈｇ−Ｘ（アルキル水銀）、および−Ｓ（＝
Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和スルホン）からな
る群から選択される；ここで、各Ｘは独立して、原子番
号が１６より大きくかつ５４未満のハロゲン、あるいは
他の良好な脱離基である；各ＲALKは独立して、直鎖、
分枝、あるいは環状の（１−２０Ｃ）のアルキル基であ
る；各ＲSUBは独立して、Ｈ、直鎖、分枝、あるいは環
状の（１−２０Ｃ）のアルキル、（６−２０Ｃ）のアリ
ール、あるいは（７−３０Ｃ）のアルキルアリールであ
る；各ＲESTERは独立して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジル、ｐ−ニトロフェノキシ、ペンタフルオロフェノ
キシ、あるいはその他の活性化基である；各ＲBは独立
して、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群か
ら選択される１−５０の原子を含む基である；存在する
場合、Ｌ[2]で示されるｎ[2]個の部分は各々独立して、
Ｏ、ＮＲSUBおよびＳからなる群から選択される；存在
する場合、Ｊ[2]で示されるｎ[2]個の部分は各々独立し
て、Ｃ（＝Ｏ）およびＣ（＝Ｓ）からなる群から選択さ
れる；ｎ[1]は、１から３２である；ｎ[2]×ｐ[2]の積
が、１より大きくかつ３３未満という条件で、ｎ
[2]は、１から３２である；ｐ[2]は、１から８である；
Ｚ[2]で示されるｎ[2]個の部分は各々独立して、少なく
ともｐ[2]個の官能基のための結合部位をアルキル炭素
原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上
に含む、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群
から選択される１−２００の原子を含む基である。 （２）前記生物学的分子が、前記結合手プラットフォー
ム分子に各々結合した、少なくとも約２０塩基対の二本
鎖ポリヌクレオチドを含み、該二本鎖の各々が、ヒト全
身性紅斑性狼瘡の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体に対して顕著な
結合活性を有する、項（１）に記載の複合体。 （３）前記生物学的あるいは合成分子が、炭水化物、脂
質、リポポリサッカライド、ペプチド、タンパク質、グ
リコプロテイン、一本鎖あるいは二本鎖のオリゴヌクレ
オチド、ハプテン、あるいは、ミモトープ、アプタマー
の様なこれらの化学的アナログ、からなる群から選択さ
れる、項（１）に記載の複合体。 （４）前記生物学的あるいは合成分子が、免疫原のアナ
ログである、項（１）に記載の複合体、但し、（ａ）該
アナログは、該免疫原が特異的に結合するＢ細胞に、特
異的に結合し、そして（ｂ）該複合体はＴ細胞のエピト
ープを欠いている。 （５）前記結合手プラットフォーム分子が、ＤＡＢＡ、
ＢＡＨＡ、ＢＡＨＡOX、およびＡＨＡＢからなる群から
選択される試薬により誘導された、項（１）に記載の複
合体。 （６）前記二本鎖を、リンカー分子が、前記結合手プラ
ットフォーム分子に結合させた、項（２）に記載の複合
体。 （７）前記リンカー分子が、ＨＡＤおよびＨＡＤpＳか
らなる群から選択される、項（６）に記載の複合体。 （８）前記二本鎖の長さが、実質的に均一である、項
（２）に記載の複合体。 （９）前記二本鎖のヌクレオチド組成が、実質的に均一
である、項（２）に記載の複合体。 （１０）前記二本鎖の長さが、２０から５０塩基対であ
る、項（２）に記載の複合体。 （１１）前記二本鎖が、その端部あるいはその近傍で、
前記結合手プラットフォーム分子に結合した、項（２）
に記載の複合体。 （１２）前記複合体が、ヒト全身性紅斑性狼瘡の免疫寛
容原である、項（２）に記載の複合体。 （１３）前記ポリヌクレオチド二本鎖が、Ｂ−ＤＮＡタ
イプの螺旋構造を有し、そして、ヒト全身性紅斑性狼瘡
の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体に対して顕著な結合活性を有す
る、項（２）に記載の複合体。 （１４）薬学的に許容可能で注射可能な賦形剤と共に処
方された、項（２）に記載の複合体を含む、狼瘡の治療
のための薬学的組成物。 （１５）治療を必要とする個体に、治療に有効な量の項
（１４）に記載の組成物を投与する工程を含む、狼瘡を
患った個体を治療する方法。 （１６）以下の工程を含む、項（２）に記載の複合体を
製造するための方法： （ａ）各々が少なくとも約２０塩基対の複数の一本鎖ポ
リヌクレオチドを、前記結合手プラットフォーム分子上
に結合させる工程；および（ｂ）相補的な一本鎖ポリヌ
クレオチドを、結合手プラットフォーム分子に結合した
該一本鎖ポリヌクレオチドとアニールさせ、前記二本鎖
を形成する工程。 （１７）薬学的に許容可能なキャリアーと組合わされ
た、治療に有効な量の項（２）に記載の複合体を含む、
抗体が媒介する疾患の治療のための薬学的組成物。 （１８）有効な量の項（１７）に記載の複合体を、個体
に投与する工程を含む、免疫原に対して特異的なＢ細胞
アネルギーを個体中に誘起する方法。 （１９）治療に有効な量の項（１７）に記載の複合体
を、個体に投与する工程を含む、免疫原に対する応答で
望ましくない抗体が産生される、抗体が媒介する疾患を
有する個体を治療する方法。 （２０）以下の工程を含む、項（２）に記載の複合体を
製造する方法： （ａ）Ｔ細胞のエピトープを欠いている前記免疫原のア
ナログを、化学的に定義された前記結合手プラットフォ
ーム分子と共有結合させ、複合体を形成する工程；およ
び（ｂ）該複合体を反応混合物中から回収する工程。 （２１）以下の式の化学的に定義された非ポリマー性結
合手プラットフォーム分子：
【０２６９】
【化３３】 但し、存在する場合、Ｇ[6]およびＧ[7]は各々独立し
て、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択
される１−２０００の鎖状原子を含む、直鎖、分枝ある
いは複数に分枝した鎖である；Ｔ[6]として示されたｎ
[6]×ｐ[6]個の部分、および、Ｔ[7]として示されたｎ
[7]×ｐ[7]個の部分は各々独立して、−ＮＨＲSUB（ア
ミン）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨＲSUB（ヒドラジド）、
−ＮＨＮＨＲSUB（ヒドラジン）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ
（カルボン酸）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲESTER（活性エステ
ル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）ＲB（無水物）、−Ｃ
（＝Ｏ）Ｘ（酸ハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｘ（スルホ
ニルハライド）、−Ｃ（＝ＮＲSUB）ＯＲSUB（イミデー
トエステル）、−ＮＣＯ（イソシアネート）、−ＮＣＳ
（イソチオシアネート）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ（ハロホル
メート）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝ＮＲSUB）ＮＨＲ
SUB（カルボジイミド付加体）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ（アル
デヒド）、−Ｃ（＝Ｏ）ＲB（ケトン）、−ＳＨ（スル
フヒドリル、あるいはチオール）、−ＯＨ（アルコー
ル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、−ＲALK
Ｘ（アルキルハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲALKＸ（ア
ルキルスルホネート）、Ｒ1Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝Ｃ
ＨＣ（＝Ｏ）−である−ＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、−Ｃ
（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和カルボニ
ル）、−ＲALK−Ｈｇ−Ｘ（アルキル水銀）、および−
Ｓ（＝Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和スルホン）
からなる群から選択される；ここで、各Ｘは独立して、
原子番号が１６より大きくかつ５４未満のハロゲン、あ
るいは他の良好な脱離基である；各ＲALKは独立して、
直鎖、分枝、あるいは環状の（１−２０Ｃ）のアルキル
基である；各ＲSUBは独立して、Ｈ、直鎖、分枝、ある
いは環状の（１−２０Ｃ）のアルキル、（１−２０Ｃ）
のアリール、あるいは（１−３０Ｃ）のアルキルアリー
ルである；各ＲESTERは独立して、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミジル、ｐ−ニトロフェノキシ、ペンタフルオロ
フェノキシ、あるいはその他の活性化基である；各ＲB
は独立して、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからな
る群から選択される１−５０の原子を含む基である；ｎ
[6]×ｐ[6]の積が、１より大きくかつ３３未満という条
件で、ｎ[6]は、１から３２である；ｐ[6]は、１から８
である；ｎ[7]×ｐ[7]の積が、１より大きくかつ３３未
満という条件で、ｎ[7]は、１から３２である；ｐ
[7]は、２、４、６あるいは８である；Ｑ[6]で示された
ｎ[6]個の部分、および、Ｑ[7]で示された２×ｎ[7]個
の部分は各々独立して、少なくともｐ[6]個の（Ｑ[6]の
場合）あるいはｐ[7]／２個の（Ｑ[7]の場合、但しｐ
[7]／２は整数である）の官能基のための結合部位をア
ルキル炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族
炭素原子上に含む、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳ
からなる群から選択される１−１００の原子を含む基で
ある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＮ−ＫＬＨで初回免疫し、図に示し
た投与量の［（ＰＮ）20−ＢＡＨＡ］−ＥＤＤＡ（複合
体１７−ＩＩ）または生理食塩水で処理し、ＰＮ−ＫＬ
Ｈのブースター注射を行い、そして５日後に採血したマ
ウスの、抗−ＰＮ応答を示している。３つの希釈系列の
血清を、１０-8 Ｍで放射標識したＰＮを用いたＦａｒ
ｒアッセイで試験し、そしてデータは抗−ＰＮ抗体の減
少百分率で表した。１グループには、５匹のマウスを用
いた。
【図２】図２は、ＰＮ−ＫＬＨで初回免疫し、図に示し
た投与量の［（ＰＮ）20−ＢＡＨＡ］−ＥＤＤＡ（複合
体１７−ＩＩ）で処理し、ＰＮ−ＫＬＨのブースター注
射を行い、そして５日後に採血したマウスの、抗−ＫＬ
Ｈ応答を示している。抗−ＫＬＨ抗体を、酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で調べた。結果を、抗血清
の標準プールの百分率で表した。１グループには、５匹
のマウスを用いた。
【図３】図３は、ＰＮ−ＫＬＨで初回免疫し、図に示し
た投与量の［（ＰＮ）16−ＢＡＨＡOX］−ＥＤＤＡ（複
合体１１−ＩＶ）、［（ＰＮ）20−ＢＡＨＡOX］−ＥＤ
ＤＡ（複合体１１−ＩＩ）、［（ＰＮ）24−ＢＡＨ
ＡOX］−ＥＤＤＡ（複合体１１−ＶＩ）、あるいは
［（ＰＮ）32−ＢＡＨＡOX］−ＥＤＤＡ（複合体１１−
ＶＩＩＩ）の何れかで処理し、ＰＮ−ＫＬＨのブースタ
ー注射を行い、そして５日後に採血したマウスの、抗−
ＰＮ応答を示している。血清を、１０-8 Ｍで放射標識
したＰＮを用いたＦａｒｒアッセイで試験した。１グル
ープには、５匹のマウスを用いた。
【図４】図４は、ＰＮ−ＫＬＨで初回免疫し、図に示し
た投与量の（ＰＮ）20−ＨＡＤ−ＡＨＡＢ−ＴＥＧ（複
合体２０−ＩＩ）で、あるいはＨＡＤ−ＡＨＡＢのみ
で、あるいはＰＮのみまたは各々の混合物で、処理し、
次いでＰＮ−ＫＬＨでブースターし、そして５日後に採
血したマウスの、抗−ＰＮ応答を示している。血清を、
１０-8 Ｍの濃度で放射標識したＰＮを用いたＦａｒｒ
アッセイで試験した。減少率百分率を計算し、このデー
タを示した。１グループには、５匹のマウスを用いた。
【図５】図５は、ＰＮ−ＫＬＨで初回免疫し、図に示し
た投与量の（ＰＮ）20−ＨＡＤ pＳ−ＡＨＡＢ−ＴＥＧ
（複合体２０−ＩＶ）で処理し、次いでＰＮ−ＫＬＨで
ブースターし、そして５日後に採血したマウスの、抗−
ＰＮ応答を示している。血清を、１０-8 Ｍの濃度で放
射標識したＰＮを用いたＦａｒｒアッセイで試験した。
１グループには、５匹のマウスを用いた。
【図６】図６Ａ−Ｂは、複合体３−Ｉ、３−ＩＩ、１１
−Ｉ、１１−ＩＩ、１１−ＩＶ、１１−ＶＩ、１１−Ｖ
ＩＩＩ、１７−Ｉ、１７−ＩＩ、２０−Ｉ、２０−Ｉ
Ｉ、２０−ＩＩＩ、および２０−ＩＶのための、誘導体
化した結合手プラットフォーム分子、および、ポリヌク
レオチドを該結合手プラットフォーム分子と結合するリ
ンカーの構造を示している。
【図７】図７は、誘導体化した結合手プラットフォーム
分子「ＨＡＤ−ＡＨＡＢ−ＴＥＧ」の構造を示してい
る。
【図８】図８はメリチンペプチド類で誘起したＴ細胞増
殖のレベルを比較している。
【図９】図９は、メリチンペプチド複合体２で処理した
マウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中とで産生
された、抗−（メリチンペプチド２）抗体のレベルを比
較している。
【図１０】図１０は、メリチンペプチド複合体２で処理
したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中とで
産生された、抗−（メリチン）抗体のレベルを比較して
いる。
【図１１】図１１は、メリチンペプチド複合体２で処理
したマウスと、調合緩衝液で処理した対照マウス中と
の、抗−（メリチンペプチド２）抗体−産生細胞のレベ
ルを比較している。
【図１２】図１２は、Ｔ細胞エピトープを含むペプチド
＃５の複合体であるメリチンペプチド複合体４が、免疫
寛容原ではないことを図示している。
【図１３】図１３は、本発明に含まれるメリチン複合体
を図示している。
【図１４】図１４は、本発明の複合体（ＬＪＰ−２４９
ＡおよびＬＪＰ−２４９Ｂ（複合体３−ＩＩ））で達成
された、抗−ｄｓＰＮ抗体の減少百分率の増加と、Ｄ−
ＥＫおよび（ＰＮ）50を含む従来技術の複合体（ＬＪＰ
−１０５）でのそれとの比較を図示している。
【図１５】図１５は、複合体ＬＪＰ−３９４、複合体２
０−ＩＩで処理した雄のＢＸＳＢマウスの循環血清中の
抗−ＤＮＡ ＩｇＧ抗体の抑制を示している。ＥＬＩＳ
Ａアッセイで、Ｄ−ＥＫに結合させた（ＰＮ）50に対す
るＩｇＧ抗体を測定した。各グループの各８個体のマウ
スからの血清を個々にアッセイした。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年９月６日（２００１．９．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/435 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/435 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 スティーブン エム．カウツ アメリカ合衆国 カリフォルニア 62067, ランチョ サンタ フェ，ランチョ ディ エグエノ ロード 6151 (72)発明者 デイビッド エス．ジョーンズ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92127, サンディエゴ，フロリンド ロード 11265 (72)発明者 ダグラス アレン リビングストーン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122, サンディエゴ，フィオレ テラス ナンバ ー 115 5260 (72)発明者 リン ユ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122, サンディエゴ，ロンバード プレイス 8933，アパートメント 228 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 HA14 4C076 AA11 AA16 BB11 CC07 DD52 FF04 4C084 AA13 MA05 NA13 NA14 ZA891 ZB081 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA03 MA05 NA03 NA13 ZB08 4H045 AA10 AA20 AA30 BA18 BA50 BA54 CA51 DA83 EA22 FA33 FA81 GA21

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）生物学的分子あるいは合成分子と反
    応した、（ｂ）以下の式の化学的に定義された非ポリマ
    ー性結合手プラットフォーム分子、を含む、複合体： 【化１】 但し、 存在する場合、Ｇ[1]およびＧ[2]は各々独立して、Ｃ、
    Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択される１
    −２０００の鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数
    に分枝した鎖である；Ｔ[1]として示されたｎ[1]個の部
    分、および、Ｔ[2]として示されたｐ[2]×ｎ [2]個の部
    分は各々独立して、−ＮＨＲSUB（アミン）、−Ｃ（＝
    Ｏ）ＮＨＮＨＲ SUB（ヒドラジド）、−ＮＨＮＨＲ
    SUB（ヒドラジン）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボン
    酸）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲESTER（活性エステル）、−Ｃ
    （＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）ＲB（無水物）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ
    （酸ハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｘ（スルホニルハライ
    ド）、−Ｃ（＝ＮＲSUB）ＯＲSUB（イミデートエステ
    ル）、−ＮＣＯ（イソシアネート）、−ＮＣＳ（イソチ
    オシアネート）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ（ハロホルメー
    ト）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝ＮＲSUB）ＮＨＲSUB（カル
    ボジイミド付加体）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ（アルデヒド）、
    −Ｃ（＝Ｏ）ＲB（ケトン）、−ＳＨ（スルフヒドリ
    ル、あるいはチオール）、−ＯＨ（アルコール）、−Ｃ
    （＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、−ＲALKＸ（アルキ
    ルハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲA LKＸ（アルキルスル
    ホネート）、Ｒ1Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝
    Ｏ）−である、−ＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、−Ｃ（＝
    Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和カルボニル）、−
    ＲALK−Ｈｇ−Ｘ（アルキル水銀）、および−Ｓ（＝
    Ｏ）ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和スルホン）からな
    る群から選択される；ここで、 各Ｘは独立して、原子番号が１６より大きくかつ５４未
    満のハロゲン、あるいは他の良好な脱離基である；各Ｒ
    ALKは独立して、直鎖、分枝、あるいは環状の（１−２
    ０Ｃ）のアルキル基である；各ＲSUBは独立して、Ｈ、
    直鎖、分枝、あるいは環状の（１−２０Ｃ）のアルキ
    ル、（６−２０Ｃ）のアリール、あるいは（７−３０
    Ｃ）のアルキルアリールである；各ＲESTERは独立し
    て、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ｐ−ニトロフェ
    ノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、あるいはその他の
    活性化基である；各ＲBは独立して、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、
    Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択される１−５０の
    原子を含む基である；存在する場合、Ｌ[2]で示される
    ｎ[2]個の部分は各々独立して、Ｏ、ＮＲSUBおよびＳか
    らなる群から選択される；存在する場合、Ｊ[2]で示さ
    れるｎ[2]個の部分は各々独立して、Ｃ（＝Ｏ）および
    Ｃ（＝Ｓ）からなる群から選択される；ｎ[1]は、１か
    ら３２である；ｎ[2]×ｐ[2]の積が、１より大きくかつ
    ３３未満という条件で、 ｎ[2]は、１から３２である；ｐ[2]は、１から８であ
    る；Ｚ[2]で示されるｎ[2]個の部分は各々独立して、少
    なくともｐ[2]個の官能基のための結合部位をアルキル
    炭素原子、アルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原
    子上に含む、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからな
    る群から選択される１−２００の原子を含む基である。
  2. 【請求項２】前記生物学的分子が、前記結合手プラット
    フォーム分子に各々結合した、少なくとも約２０塩基対
    の二本鎖ポリヌクレオチドを含み、該二本鎖の各々が、
    ヒト全身性紅斑性狼瘡の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体に対して
    顕著な結合活性を有する、請求項１に記載の複合体。
  3. 【請求項３】前記生物学的あるいは合成分子が、炭水化
    物、脂質、リポポリサッカライド、ペプチド、タンパク
    質、グリコプロテイン、一本鎖あるいは二本鎖のオリゴ
    ヌクレオチド、ハプテン、あるいは、ミモトープ、アプ
    タマーの様なこれらの化学的アナログ、からなる群から
    選択される、請求項１に記載の複合体。
  4. 【請求項４】前記生物学的あるいは合成分子が、免疫原
    のアナログである、請求項１に記載の複合体、但し、 （ａ）該アナログは、該免疫原が特異的に結合するＢ細
    胞に、特異的に結合し、そして（ｂ）該複合体はＴ細胞
    のエピトープを欠いている。
  5. 【請求項５】前記結合手プラットフォーム分子が、ＤＡ
    ＢＡ、ＢＡＨＡ、ＢＡＨＡOX、およびＡＨＡＢからなる
    群から選択される試薬により誘導された、請求項１に記
    載の複合体。
  6. 【請求項６】前記二本鎖を、リンカー分子が、前記結合
    手プラットフォーム分子に結合させた、請求項２に記載
    の複合体。
  7. 【請求項７】前記リンカー分子が、ＨＡＤおよびＨＡＤ
    pＳからなる群から選択される、請求項６に記載の複合
    体。
  8. 【請求項８】前記二本鎖の長さが、実質的に均一であ
    る、請求項２に記載の複合体。
  9. 【請求項９】前記二本鎖のヌクレオチド組成が、実質的
    に均一である、請求項２に記載の複合体。
  10. 【請求項１０】前記二本鎖の長さが、２０から５０塩基
    対である、請求項２に記載の複合体。
  11. 【請求項１１】前記二本鎖が、その端部あるいはその近
    傍で、前記結合手プラットフォーム分子に結合した、請
    求項２に記載の複合体。
  12. 【請求項１２】前記複合体が、ヒト全身性紅斑性狼瘡の
    免疫寛容原である、請求項２に記載の複合体。
  13. 【請求項１３】前記ポリヌクレオチド二本鎖が、Ｂ−Ｄ
    ＮＡタイプの螺旋構造を有し、そして、ヒト全身性紅斑
    性狼瘡の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体に対して顕著な結合活性
    を有する、請求項２に記載の複合体。
  14. 【請求項１４】薬学的に許容可能で注射可能な賦形剤と
    共に処方された、請求項２に記載の複合体を含む、狼瘡
    の治療のための薬学的組成物。
  15. 【請求項１５】治療を必要とする個体に、治療に有効な
    量の請求項１４に記載の組成物を投与する工程を含む、
    狼瘡を患った個体を治療する方法。
  16. 【請求項１６】以下の工程を含む、請求項２に記載の複
    合体を製造するための方法： （ａ）各々が少なくとも約２０塩基対の複数の一本鎖ポ
    リヌクレオチドを、前記結合手プラットフォーム分子上
    に結合させる工程；および（ｂ）相補的な一本鎖ポリヌ
    クレオチドを、結合手プラットフォーム分子に結合した
    該一本鎖ポリヌクレオチドとアニールさせ、前記二本鎖
    を形成する工程。
  17. 【請求項１７】薬学的に許容可能なキャリアーと組合わ
    された、治療に有効な量の請求項２に記載の複合体を含
    む、抗体が媒介する疾患の治療のための薬学的組成物。
  18. 【請求項１８】有効な量の請求項１７に記載の複合体
    を、個体に投与する工程を含む、免疫原に対して特異的
    なＢ細胞アネルギーを個体中に誘起する方法。
  19. 【請求項１９】治療に有効な量の請求項１７に記載の複
    合体を、個体に投与する工程を含む、免疫原に対する応
    答で望ましくない抗体が産生される、抗体が媒介する疾
    患を有する個体を治療する方法。
  20. 【請求項２０】以下の工程を含む、請求項２に記載の複
    合体を製造する方法： （ａ）Ｔ細胞のエピトープを欠いている前記免疫原のア
    ナログを、化学的に定義された前記結合手プラットフォ
    ーム分子と共有結合させ、複合体を形成する工程；およ
    び（ｂ）該複合体を反応混合物中から回収する工程。
  21. 【請求項２１】以下の式の化学的に定義された非ポリマ
    ー性結合手プラットフォーム分子： 【化２】 但し、 存在する場合、Ｇ[6]およびＧ[7]は各々独立して、Ｃ、
    Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択される１
    −２０００の鎖状原子を含む、直鎖、分枝あるいは複数
    に分枝した鎖である；Ｔ[6]として示されたｎ[6]×ｐ
    [6]個の部分、および、Ｔ[7]として示されたｎ [7]×ｐ
    [7]個の部分は各々独立して、−ＮＨＲSUB（アミン）、
    −Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＮＨＲSUB（ヒドラジド）、−ＮＨＮ
    ＨＲSUB（ヒドラジン）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボン
    酸）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲESTER（活性エステル）、−Ｃ
    （＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）ＲB（無水物）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ
    （酸ハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｘ（スルホニルハライ
    ド）、−Ｃ（＝ＮＲSUB）ＯＲSUB（イミデートエステ
    ル）、−ＮＣＯ（イソシアネート）、−ＮＣＳ（イソチ
    オシアネート）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｘ（ハロホルメー
    ト）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝ＮＲSUB）ＮＨＲSUB（カル
    ボジイミド付加体）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ（アルデヒド）、
    −Ｃ（＝Ｏ）ＲB（ケトン）、−ＳＨ（スルフヒドリ
    ル、あるいはチオール）、−ＯＨ（アルコール）、−Ｃ
    （＝Ｏ）ＣＨ2Ｘ（ハロアセチル）、−ＲALKＸ（アルキ
    ルハライド）、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲALKＸ（アルキルスル
    ホネート）、Ｒ1Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝
    Ｏ）−である−ＮＲ1Ｒ2（マレイミド）、−Ｃ（＝Ｏ）
    ＣＲB＝ＣＲB 2（α，β−不飽和カルボニル）、−ＲALK
    −Ｈｇ−Ｘ（アルキル水銀）、および−Ｓ（＝Ｏ）ＣＲ
    B＝ＣＲB 2（α，β−不飽和スルホン）からなる群から
    選択される；ここで、 各Ｘは独立して、原子番号が１６より大きくかつ５４未
    満のハロゲン、あるいは他の良好な脱離基である；各Ｒ
    ALKは独立して、直鎖、分枝、あるいは環状の（１−２
    ０Ｃ）のアルキル基である；各ＲSUBは独立して、Ｈ、
    直鎖、分枝、あるいは環状の（１−２０Ｃ）のアルキ
    ル、（１−２０Ｃ）のアリール、あるいは（１−３０
    Ｃ）のアルキルアリールである；各ＲESTERは独立し
    て、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ｐ−ニトロフェ
    ノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、あるいはその他の
    活性化基である；各ＲBは独立して、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、
    Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択される１−５０の
    原子を含む基である；ｎ[6]×ｐ[6]の積が、１より大き
    くかつ３３未満という条件で、 ｎ[6]は、１から３２である；ｐ[6]は、１から８であ
    る；ｎ[7]×ｐ[7]の積が、１より大きくかつ３３未満と
    いう条件で、 ｎ[7]は、１から３２である；ｐ[7]は、２、４、６ある
    いは８である；Ｑ[6]で示されたｎ[6]個の部分、およ
    び、Ｑ[7]で示された２×ｎ[7]個の部分は各々独立し
    て、少なくともｐ[6]個の（Ｑ[6]の場合）あるいはｐ
    [7]／２個の（Ｑ[7]の場合、但しｐ[7]／２は整数であ
    る）の官能基のための結合部位をアルキル炭素原子、ア
    ルケニル炭素原子、あるいは芳香族炭素原子上に含む、
    Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択
    される１−１００の原子を含む基である。
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