NO319084B1 - Kjemisk definerte valensplattformmolekyler, konjugater derav, farmasoytiske preparater innholdende disse, fremgangsmate for fremstilling av konjugatene, sammensetning for anvendelse ved fremstilling, samt anvendelse av en forbindelse. - Google Patents

Kjemisk definerte valensplattformmolekyler, konjugater derav, farmasoytiske preparater innholdende disse, fremgangsmate for fremstilling av konjugatene, sammensetning for anvendelse ved fremstilling, samt anvendelse av en forbindelse. Download PDF

Info

Publication number
NO319084B1
NO319084B1 NO19960952A NO960952A NO319084B1 NO 319084 B1 NO319084 B1 NO 319084B1 NO 19960952 A NO19960952 A NO 19960952A NO 960952 A NO960952 A NO 960952A NO 319084 B1 NO319084 B1 NO 319084B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
conjugate
compound
group
mmol
conjugate according
Prior art date
Application number
NO19960952A
Other languages
English (en)
Other versions
NO960952L (no
NO960952D0 (no
Inventor
Stephen M Coutts
David S Jones
Douglas Allen Livingston
Lin Yu
Original Assignee
Jolla Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/118,055 external-priority patent/US6060056A/en
Application filed by Jolla Pharma filed Critical Jolla Pharma
Publication of NO960952D0 publication Critical patent/NO960952D0/no
Publication of NO960952L publication Critical patent/NO960952L/no
Publication of NO319084B1 publication Critical patent/NO319084B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Foreliggende opprinnelse angår kjemisk definerte valensplattformmolekyler, farmasøytiske preparater inneholdende disse, fremgangsmåte for fremstilling av konjugatene og sammensetning for anvendelse ved fremstilling.
Spesielt angår oppfinnelsen konjugater omfattende kjemisk definerte valensplattformmolekyler koplet til biologiske eller syntetiske molekyler slik som polynukleotider for behandling av sykdommer slik som den autoimmune sykdommen systemisk lupus erythematosus (SLE eller "lupus").
Et antall forbindelser har blitt benyttet som bærere for biologisk anvendelige molekyler ved fremstilling av konjugater som er påstått å være tolererbare. For eksempel beskrev Benacerraf, Katz, og deres kolleger anvendelsen av konjugater av random kopolymer D-glutaminsyre/D-lysin, referert til som D-GL i tidligere litteratur (heretter D-EK) med haptener og forskjellige antigener for å indusere spesifikk immuntoleranse. Se US
patent nr. 4.191.668 og 4.220.565.
Andre forskere har studert konjugater av nukleosider eller DNA med andre bærere. Borel et al. ( Science (1973) 182:76) evaluerte evnen til isogene mus IgG-nukleosid konjugater til å redusere antistoffresponsen for denaturert DNA i unge dyr av NZB musestammen. I separate studier evaluerte Parker et al. ( J. Immunol. (1974) 113:292) effekten av denaturert DNA konjugert til poly-D-lysin og/eller cyklofosfamid på progresjonen av det ovenfomevnte syndrom i NZB mus.
I en senere artikkel ( Ann NY Acad Sei (1986) 475:296-306) beskriver Borel et al. oligonukleotid-immunoglobulin konjugater. Borel et al. ( J Clin Invest (1988) 82:1901-1907 eller US 4.650.675) har beskrevet in vitro studier ved anvendelse av konjugater av humant immunoglobulin bundet til DNA. US patent nr. 5.126.131. (Dintzis et al.) angår også konjugater omfattende bærere og molekyler involvert i immunresponser.
Andre referanser beskriver konjugater av ikke-immunogene polymerer og immunogener (Saski et al., Scand. J. Immun. (1982) 16:191-200; Sehon, Proe. Allerev (1982) 32:161-202; Wilkinson et al., J. Immunol. (987) 139:326-331, og Borel et al., J. Immunol. Methods (1990) 126:159-168.
IUS-PS 07/914.869, US patent nr. 5.162.515 og 07/652.658 blir konjugater omfattende polymere bærere slik som D-EK, polyetylenglykol, poly-D-lysin, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon og immunoglobuliner beskrevet.
Totalt synes den kjente teknikk kun å beskrive dårlige definerte kjemiske forbindelser eller forbindelser med et antall ikke spesifikke bindingsseter benyttet som valensplattformmolekyler i konjugater. Da valensen til slike forbindelser, den spesifikke plasseringen av bindingssetene og antallet bindingsseter er uforutsigbar og varierer vidt, kan konjugater ifølge kjent teknikk omfattende slike forbindelser ikke bli fremstilt reproduserbart og viser vide svingninger i deres rapporterte aktivitet.
Beskrivelse av oppfinnelsen
I motsetning til den ovenfor beskrevne teknikk, er det utviklet konjugater omfattende kjemisk definerte valensplattformmolekyler hvor valensen til plattformmolekylene er forhåndsbestemt og hvor hvert bindingssete er tilgjengelig for binding av et biologisk eller syntetisk molekyl. Valensplattformmolekyler innen rammen av foreliggende oppfinnelse er definert med hensyn til deres kjemiske struktur, valens, homogenitet og en definert kjemi som medgjørlig for effektiv konjugering med det passende biologiske og/eller syntetiske molekyl.
En side ved foreliggende oppfinnelse er således rettet mot konjugater omfattende de kjemisk definerte, valensplattformmolekyler og biologisk aktive molekyler. Eksempler på biologisk aktive molekyler som passer for konjugering til kjemisk definerte valensplattformmolekyler for å danne konjugater innen foreliggende oppfinnelse, er karbohydrater, medikamenter, lipider, lipopolysakkarider, peptider, proteiner, glykoproteiner, enkelstrengede eller dobbelstrengede oligonukleotider og kjemiske analoger derav, analoger av immunogener, haptener, mimotoper, aptamerer og lignende. Et kjemisk definert valensplattformmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved at det har har homogen molekylvekt og tilsvarer formelen: hvor G[<2>] er valgt fra gruppen bestående av
q er et heltall fra 0 til 20;
r er et heltall fra 0 til 300; og
s er et heltall fra 1 til 4;
hvor li 2! er en valgfri gruppe, som når den er til stede er uavhengig valgt fra gruppen O, NRSU<B> og S;
hvor hver jt 23 er uavhengig valgt fra gruppen C(=0) og C(=S);
hvor hver z[<2>] uavhengig er en rest omfattende 1-200 atomer valgt fra gruppen C, H, N og O, inneholdende tilknytningsseter for minst pp] funksjonelle grupper;
hvor hver av Tl^l uavhengig er valgt fra gruppen bestående av:
hvori
hver X er uavhengig F, Cl, Br, I eller en annen lett avspaltbar gruppe;
hver r<ALK> er uavhengig en lineær, forgrenet eller cyklisk alkylgruppe på l til 20 karbonatomer;
hver r<SUB> er uavhengig H, en lineær, forgrenet eller cyklisk alkylgruppe på 1 til 20 karbonatomer, en arylgruppe på 6 til 20 karbonatomer, eller en alkarylgruppe på 7 til 30 karbonatomer; og
hver R<B> er uavhengig en kjemisk enhet omfattende 1 til 50 atomer valgt fra gruppen bestående av C, H, N, O, Si, P og S;
hver RESTER er uavhengig N-suksinimidyl, p-nitrofenyl, pentafluorfenyl, pentaklorfenyl, tetrafluorfenyl, 2,4,5-triklorfenyl, 2,4-dinitrofenyl eller cyanometyl;
p[<2>] er et heltall fra 1 til 8;
n[<2>] er et heltall fra l til 32; og under den forutsetning at produktet p[<2>] x nH er større enn 1 og mindre enn 33.
Foretrukne utførelsesformer av den kjemisk definerte valensplattform er beskrevet i krav 2-18.
I en ytterligere foretrukket utførelsesform for behandling av lupus, omfatter et konjugat av et kjemisk definert valensplattformmolekyl og et flertall polynukleotid duplekser på minst 20 basepar som hver er bundet til plattformmolekylet, og som har signifikant bindingsaktivitet for humane SLE anti-dsDNA autoantistoffer. I disse foretrukne utførelsesformene er polynukleotid dupleksene hovedsakelig homogene i lengde og en streng av dupleksen er konjugert til valensplattformmolekylet enten direkte eller via et linker-molekyl. Vanligvis blir syntetiske polynukleotider koblet til et linker-molekyl før det blir koblet til et valensplattformmolekyl. Vanligvis er den linker-inneholdende strengen av dupleksen koblet ved eller nær (dvs. innen 5 basepar) en av dens ender slik at hver streng danner en utstående kjede på minst 20 basepar målt fra bindingssetet av strengen til linker-molekylet. Den andre strengen blir så annelert til den første strengen for å danne en dupleks. Således kan et konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse generelt bli beskrevet ved den følgende formel:
hvor PN = et dobbelstrenget polynukleotid med "n" nukleotider, hvor n = minst 20, og m = 2-8. Eksempler på passende linker-molekyler innen foreliggende oppfinnelse er 6 karbontioler slik som HAD, et tio-6 karbonkjede fosfat og HADpS, et tio-6 karbonkjede
fosfortioat. Kjemisk definerte valensplattformmolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse blir dannet for eksempel ved å reagere amino modifisert-PEG med 3,5-bis-(jodacetamido) benzoylklorid (heretter "IA-DABA"); 3-karboksypropionamid-N,N-bis-[(6,-N'-karbobenzyloksyaminoheksyl)acetamid] 4"-nitrofenylester (heretter "BAHA"); 3-karboksypropionamid-N,N-bis-[(8,-N'-karbobenzyloksyamino-3,,6,-dioksaoktyl)-acetamid] 4"-nitrofenylester (heretter "BAHA0X"); eller ved å reagere PEG-bis-klorformat med N)N-di(2-[6'-N'-karbobenzyloksyaminoheksanoamido]etyl)amin (heretter "AHAB") for å danne kjemisk definerte valensplattformmolekyler.
Overraskende uventede resultater på minst omkring ti ganger opp til 100 ganger økning av immunosuppresjonen blir oppnådd ved anvendelse av konjugater omfattende de kjemisk definerte valensplattformmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse og biologisk aktive molekyler (ikke-haptener) sammenlignet med polymere bærere beskrevet i tidligere teknikk. For eksempel minst en hundre ganger økning i immunosuppresjonen av anti-dsDNA autoantistoffer ble oppnådd som beskrevet her ved anvendelse av konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse omfattende kjemisk definerte valensplattformmolekyler sammenlignet med konjugater omfattende en dårlig definert bærer beskrevet i tidligere teknikk.
Dette aspekt er et konjugat av (a) et kjemisk definert valensplattformmolekyl og (b) et flertall polynukleotide duplekser som alle er bundet til valensplattformmolekylet ved en funksjonell gruppe lokalisert ved eller nær en terminal av en av strengene av dupleksen, hvor nevnte kon jugat er et humant SLE tolerogen.
Farmasøytiske sammensetninger av de ovenfor beskrevne konjugatene eller etterfølgende nevnte forbindelser og en farmasøytisk akseptabel bærer er en annen side av oppfinnelsen.
Oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for behandling av SLE hvor et individ trenger slik behandling, omfattende administrering til individet av en effektiv mengde av de ovenfor beskrevne konjugatene.
Enda et aspekt ved foreliggende oppfinnelse er at konjugatene kan anvendes for fremstilling av preparatene for indusering av spesifikk B-celle anergi til et immunogen hos et individ.
Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er at de ovenfor beskrevne konjugatene kan anvendes for fremstilling av preparatene for behandling av et individ for en antistoff-mediert patologi hvor uønskede antistoffer blir produsert som respons på et immunogen.
Et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av konjugater for behandling av SLE beskrevet ovenfor, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) binding av en multiplisitet av enkeltkjedede polynukleotider av minst ca. 20 basepar til valensplattformsmolekylet; og (b) sammensmelting av komplementære enkeltkjedede polynukleotider til de enkeltkjedede polynukleotidene konjugert til valensplattformsmolekylet for å danne nevnte duplekser.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en sammensetning for anvendelse ved dannelse av konjugater med biologisk aktive molekyler omfattende kjemisk definerte valensplattformsmolekyler ifølge krav 1 som har en homogen molekylvekt, kjennetegnet ved at nevnte plattformmolekyler omfatter forgrenende grupper, hvor valensen av nevnte plattformmolekyler er forhåndsbestemt ved antallet forgrenede grupper, hvor valensen av nevnte plattformmolekyler er to eller mer.
Enda et aspekt av foreliggende oppfinnelse er rettet mot en forbindelse kjennetegnet ved formelen
hvor r ~ 0-300; og
hver U er
hvor X = 0 eller S; og
PN er et enkelt eller dobbeltkjedet polynukleotid.
Videre angår oppfinnelsen anvendelse av ovennevnte forbindelse for fremstilling av et preparat for behandling av human systemisk lupus erytematosus.
Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er angitt i underkravene.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser anti-PN responsen hos mus primet med PN-KLH, behandlet med [(PN)20-BAHA]-EDDA, konjugat 17-11, i dosene vist, eller med saltvann som blir gitt en booster injeksjon av PN-KLH og så årelatet 5 dager senere. Sera blir testet ved 3 fortynninger ved Farr analysen ved anvendelse av radiomerket PN ved 10~<8> M og data presentert som prosentreduksjon av anti-PN antistoffer. Det var 5 mus pr. gruppe. Figur 2 viser en anti-KLH respons i mus primet med PN-KLH, behandlet med [(PN)20_ BAHAJ-EDDA, konjugat 17-11, i dosene vist, gitt en booster injeksjon av PN-KLH og så årelatet 5 dager senere. Anti-KLH antistoffer ble analysert ved enzym-linket immunosorbent analyse (ELISA). Resultatene er uttrykt som prosent av en standard pool av antisera. Det var 5 mus pr. gruppe. Figur 3 viser anti-PN responsen i mus primet med PN-KLH, behandlet med enten [(PN)16-BAHAox]-EDDA (konjugat 11-IV), [(PN)20-<B>AHAoX]-EDDA (konjugat 11-II), [(PN)24-BAHA0X]-EDDA (konjugat 11-VI) eller [(PN)32-BAHA0X]-EDDA (konjugat 11-VIII) i de viste dosene, gitt en booster injeksjon av PN-KLH og så årlatet 5 dager senere. Sera ble testet ved Farr analysen ved åanvende radiomerket PN ved 10~<8 >M. Det var 5 pr. gruppe. Figur 4 viser anti-PN responsen i mus primet med PN-KLH, behandlet med (PN)20~ HAD-AHAB-TEG, konjugat 20-11, i de viste dosene eller med kun H AD-AH AB, eller kun PN eller en blanding av hver, så boostet med PN-KLH og årelatet 5 dager senere. Sera ble testet ved Farr analysen ved anvendelse av radiomerket PN ved en en konsentrasjon på 10"^ M. Prosentreduksjonen ble beregnet og dataene er vist. Det var 5 mus pr. gruppe. Figur 5 viser anti-PN responsen i mus primet med PN-KLH, behandlet med (PN)20~ HADpS-AHAB-TEG, konjugat 20-IV, i de viste dosene, så boostet med PN-KLH og årelatet 5 dager senere. Sera ble testet ved Farr analysen ved anvendelse av radiomerket PN ved en konsentrasjon på 10'<8> M. Det var 5 mus pr. gruppe. Figurene 6A-B viser strukturen av det derivatiserte valensplattformmolekylet og linker-koblingen av polynukleotidet til plattformmolekylet for konjugatene 3-1,3-II, 11-1-11-II, 11-IV, 11-VI, 11-VIII, 17-1, 17-11, 20-1, 20-11, 20-111 og 20-IV. Figur 7 viser strukturen av det derivatiserte valensplattformmolekylet "HAD-AHAB-TEG". Figur 8 sammenligner nivået av T-celle proliferasjon indusert ved melittinpeptider. Figur 9 sammenligner nivåene av anti-melittinpeptid 2 antistoffer produsert i mus behandlet med melittinpeptid konjugat 2 versus kontrollmus behandlet formuleringsbuffer. Figur 10 sammenligner nivåene av anti-melittin antistoffer produsert i mus behandlet med melittinpeptid konjugat 2 versus kontrollmus behandlet med formuleringsbuffer. Figur 11 sammenligner nivåene av anti-melittinpeptid 2 antistoffdannende celler med mus behandlet med melittinpeptid konjugat 2 versus kontrollmus behandlet med formuleringsbuffer. Figur 12 illustrerer at melittinpeptid konjugat 4, et konjugat av peptid nr. 5 som inneholder en T-celle epitop, ikke var et tolerogen.
Figur 13 illustrerer melittinkonjugater ifølge foreliggende oppfinnelse.
Figur 14 illustrerer økningen i prosent av reduksjon i anti-dsPN antistoff oppnådd ved konjugater ifølge foreliggende oppfinnelse LJP-249A og LJP-249B som er konjugat 3-II sammenlignet med et tidligere kjent konjugat (LJP-105) omfattende D-EK og (PN)5Q. Figur 15 illustrerer undertrykking av serum sirkulerende IgG anti-DNA antistoffer i hannkjønns BXSB mus behandlet med LJP-394, konjugat 20-11. En ELISA analyse ble benyttet for å måle IgG antistoffer til (PN)5ø konjugert til D-EK. Serum fra hver av de åtte individuelle musene i hver gruppe ble analysert.
Måter for utførelse av oppfinnelsen
Som benyttet her, betyr "valensplattformmolekyl" et kjemisk definert, ikke-polymert, ikke-immunogent molekyl inneholdende seter som muliggjør binding av et diskret antall biologiske og/eller kjemiske molekyler.
"Ikke-immunogen" som blir benyttet for å beskrive valensplattformmolekylet betyr at valensplattformmolekylet hovedsakelig ikke gir noen immunrespons når administrert alene eller når administrert som plattformdel for et konjugat til et individ.
Som benyttet her, angir "individ" et medlem av en mammalsk art og omfatter mennesker, primater, mus og husdyr, slik som storfe og småfe, sportsdyr slik som hester, og kjæledyr slik som hunder og katter.
Som benyttet her, betyr uttrykket "immunogen" en kjemisk enhet som utløser en humoral immunrespons når injisert i et dyr. Immunogener har både B-celle epitoper og T-celle epitoper.
Uttrykket "analog" av et immunogen benyttes om et molekyl som (a) binder spesifikt til et antistoff til hvilket immunogenet binder spesifikt og (b) mangler T-celle epitoper. Selv om analogen normalt vil være et fragment eller derivat av immunogenet og således være av den samme kjemiske klassen som immunogenet (f.eks. er immunogenet et polypeptid og analogen et polypeptid), er kjemisk likhet ikke essensielt. Følgelig kan analogen være av en annen kjemisk klasse enn immunogenet (f.eks. kan immunogenet være et karbohydrat og analogen et polypeptid) så lenge den har de funksjonelle karakteristikker (a) og (b) ovenfor. Analogen kan være et protein, karbohydrat, lipid, lipoprotein, glykoprotein, lipopolysakkarid, nukleinsyre eller en annen kjemisk eller biologisk enhet.
En analog av et immunogen kan også omfatte en "mimotop". Uttrykket "mimotop" betyr et syntetisk molekyl som kompetitivt hemmer antistoffet fra å binde til immunogenet. Da det spesifikt binder til antistoffet, er mimotopen ansett åetterligne antigendeterminantene til immunogenet. Som en analog til et immunogen, binder en mimotop (a) spesifikt til et antistoff som immunogenet binder spesifikt til og (b) mangler T-celle epitoper.
En analog av et immunogen kan også omfatte en "aptamer". Uttrykket "aptamer" angir et syntetisk oligonukleotid som kompetitivt hemmer antistoffet fra å binde til immunogenet. Som en analog av et immunogen, binder en aptamer (a) spesifikt til et antistoff til hvilket immunogenet binder spesifikt og (b) mangler T-celle epitoper.
Som benyttet her, betyr uttrykket "B-celle anergi" manglende respons fra de B-cellene som krever T-celle hjelp for åprodusere og utskille antistoffer og omfatter, uten begrensning, klonal delesjon av umodne og/eller modne B-celler og/eller manglende evne i B-cellene til å produsere antistoffer og/eller apoptosis. "Manglende respons" betyr en terapeutisk effektiv reduksjon i den humorale responsen for et immunogen. Kvantitativt er reduksjonen (som målt ved reduksjon i antistoffproduksjon) minst 50 %, fortrinnsvis minst 75 %, og mest foretrukket 100 %.
"Antistoff betyr de antistoffer hvis produksjon er T-celle avhengig.
Valensen av et kjemisk definert valensplattformmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli forhåndsbestemt ved antallet forgreningsgrupper tilsatt til plattformmolekylet. Passende forgreningsgrupper blir typisk avledet fra diaminosyrer, triaminer og aminodisyrer. Et konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse er biologisk stabilisert; dvs. at det viser en in vivo ekskresjonshalveringstid i timer til dager til måneder for ågi terapeutisk aktivitet. De kjemisk definerte valensplattformmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse er også hovedsakelig ikke-immunogene (dvs. de viser ingen eller kun mild immunogenitet når administrert til dyr), er ikke-toksiske ved de gitte doser (dvs. de er tilstrekkelig ikke-toksiske til å være anvendelige som terapeutiske midler) og er fortrinnsvis sammensatt av en definert kjemisk struktur. De fremskaffer et ikke-immunogent, ikke-toksisk polyfunksjonelt substrat til hvilket et flertall biologiske eller syntetiske molekyler slik som polynukleotidduplekser kan bli bundet kovalent. De vil normalt ha en gjennomsnittlig molekylvekt i området fra omkring 200 til omkring 200.000, vanligvis fra omkring 200 til omkring 20.000, og er homogene sammenlignet med kjent teknikks polymerer som var blanding av forbindelser med meget variabel molekylvekt. Eksempler på spesielt foretrukne homogene valensplattformmolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er derivatiserte 2,2-etylendioksydietylamin (EDDA), trietylenglykol (TEG) og polyetylenglykoler (PEGS) som har en molekylvekt på omkring 200 til omkring 8.000.
Konjugering av et biologisk eller syntetisk molekyl til det kjemisk definerte plattformmolekylet kan bli utført på flere måter, typisk omfattende en eller flere tverrbindingsmidler og funksjonelle grupper på det biologiske eller syntetiske molekylet og valensplattformmolekylet.
De syntetiske polynukleotiddupleksene som er koblet til valensplattformmolekylet er sammensatt av minst 20 bp og fortrinnsvis 20-50 bp. Polynukleotider beskrevet her er deoksyribonukleotider hvis ikke annet er indikert og er angitt i 5' til 3' retning. Fortrinnsvis har dupleksene hovedsakelig homogen lengde; det vil si, variasjonen i lengde i populasjonen vil normalt ikke overskride omkring ±20 %, fortrinnsvis ±10%, av den gjennomsnittlige duplekslengden i basepar. De er også fortrinnsvis hovedsakelig homogene i nukleotidsammensetning; det vil si, deres basesammensetning og sekvens vil ikke variere fra dupleks til dupleks mer enn omkring 10 %. Mest foretrukket er de helt homogene i nukleotidsammensetning fra dupleks til dupleks.
Basert på sirkulær dikroin (CD) spekterfortolkning, antar dupleksene som er nyttige ifølge oppfinnelsen en B-DNA type helisk struktur. Det må forstås at det ikke er ment at oppfinnelsen er begrenset ved denne antagelsen og at dupleksene kan, ved flere etterfølgende analyser anta Z-DNA og/eller A-DNA type heliske strukturer.
Disse polynukleotiddupleksene kan bli syntetisert fra nativt DNA eller syntetisert ved kjemisk eller rekombinante teknikker. Naturlig forekommende eller rekombinant produserte dsDNA med større lengde kan bli kuttet (f. eks. enzymatisk, kjemisk eller ved mekanisk kutting) og fraksjonert (f. eks. ved agarose gel eller Sephadex kolonne) for å oppnå polynukleotider med ønsket lengde.
Alternativt, kan par av komplementære enkelstrengede polynukleotidkjeder på opp til omkring 70 baser lengde bli preparert ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige DNA syntetisatorer og så annelert for å danne duplekser ved konvensjonelle prosedyrer. Syntetiske dsDNA av større lengde kan bli oppnådd ved enzymatisk forlenging (5<1->fosforilering fulgt av ligering) av de kjemisk produserte kortere kjeder.
Polynukleotidene kan også bli fremstilt ved molekylær kloning. For eksempel blir polynukleotider av en ønsket lengde og sekvens syntetisert som ovenfor. Disse polynukleotidene kan være utformet for å ha passende termini for ligering inn i spesifikke restriksjonsseter. Multiple gjentagelser av disse oligomerene kan bli ligert etter hverandre for å gi en flerkopi replikasjon. Det resulterende konstruktet blir satt inn i en standard kloningsvektor og vektoren blir introdusert inn i en passende mikro-organisme/celletransformasjon. Transformanter blir identifisert ved standard markører og blir dyrket under betingelser som favoriserer DNA replikasjon. Polynukleotidene kan bli isolert fra cellens/mikroorganismens øvrige DNA ved behandling med restriksjonsenzymer og konvensjonell størrelsesfraksjonering (f.eks. agarose gel,
Sephadex kolonne).
Alternativt kan polynukleotidene bli replikert ved polymerase kjedereaksjon (PCR) teknologi. Saiki, R.K., et al., Science (1985) 230:1350; Sacki, et al., Science (1988) 239:487: Sambrook, et al., In Molecular Cloning Techniques: A Laboratory Manual, bind 12, s. 14.1-14.35 Cold Spring Harbor Press (1989).
Polynukleotider kan bli undersøkt for bindingsaktivitet med SLE antisera ved analyser beskrevet i eksemplene. Modifisert Farr analyse hvor bindingsaktiviteten kan bli uttrykt som I50 (polynukleotidkonsentrasjon i molare nukleotider resulterer i halvmaksimal hemming) er en foretrukket analyse. Polynukleotidduplekser med en I50 på mindre enn omkring 500 nM, fortrinnsvis mindre enn 50 nM, blir bedømt å ha signifikant bindingsaktivitet og er derfor anvendelig i fremstilling av konjugatene ifølge oppfinnelsen.
Polynukleotidene blir konjugert til det kjemisk definerte valensplattformolekylet på en måte som konserverer deres antistoff bindingsaktivitet. Dette blir gjort ved konjugering av polynukleotidet til valensplattformmolekylet ved et forhåndsbestemt sete på polynukleotidkjeden slik at polynukleotidet danner en utstående kjede på minst 20 basepar målt fra konjugeringssetet til den frie (ikke festede) enden av kjeden.
I en bestemt foretrukket utførelsesform blir polynukleotidene ifølge oppfinnelsens konjugater koblet til et linker-molekyl ved eller nær en av deres ender. Linker-molekylet blir så koblet til det kjemisk definerte valensplattformmolekylet. For eksempel kan et definert dobbelstrenget PN bli konjugert til et valensplattformmolekyl ved først å fremskaffe en enkel kjede omfattende omkring 20 alternerende cytosin (C) og adenosin (A) nukleotider. Fire CA kjeder kan så kovalent bli konjugert gjennom linkere slik som HAD (trityl eller dimetyl HAD blir generelt benyttet for å beskrive disulfid-linkerne illustrert i reaksjonsskjema 11) til fire reaktive seter på et derivatisert plattformmolekyl slik som trietylenglykol. Valensplattformmolekylet blir syntetisert til å inkludere en gruppe slik som bromoacetyl. Under konjugeringen blir en avspaltbar gruppe erstattet av svovel. En andre enkel nukleotidkjede omfattende omkring 20 alternerende lymidin (T) og guanosin (G) nukleotider kan så bli annelert til CA strengen for å danne et dobbelstrenget PN konjugat med formelen [(PN^o-linkertø-valensplattformmolekyl.
Alternativt, i en annen foretrukket utførelsesform, kan polynukleotidet bli koblet til det derivatiserte valensplattformmolekylet ved 3' enden av polynukleotidet via en morfolinobro dannet ved kondensering av en oksidert 3' terminal ribose på en av strengene på polynukleotidet med en fri aminogruppe på det derivatiserte plattformmolekylet og så utsette adduktet for reduksjonsbetingelser for å danne en morfolinbinding. Slik kobling krever at det derivatiserte plattformmolekylet har minst et likt antall aminogrupper som antallet polynukleotidduplekser som skal bli bundet til plattformmolekylet. Syntesen av et slikt konjugat blir utført i to trinn. Det første trinnet er kobling av en streng av polynukleotiddupleksen til det derivatiserte plattformmolekylet via kondenseirngs/reduksjonsreaksjonen beskrevet ovenfor. Den oksiderte 3' terminale ribosen blir så dannet på den enkle polynukleotidstrengen ved behandling av strengen med periodat for å omdanne 3' terminal ribosegruppe til en oksidert ribosegruppe. Det enkelstrengede polynukleotidet blir så tilsatt sakte til en vandig oppløsning av det derivatiserte plattformmolekylet med en pH på omkring 6,0 til 8,0 ved 2-8°C. Det molare forholdet av polynukleotid til plattformmolekyl i alle konjugatstrategiene vil normalt være i området fra omkring 2:1 til omkring 30:1, vanligvis omkring 2:1 til omkring 8:1 og foretrukket omkring 4:1 til 6:1. Hva dette angår, er det foretrukket at konjugat et ikke har en altfor stor molekylvekt, da store molekyler, spesielt de med repeterende enheter, på molekylvekt > 200.000 kan være T-uavhengige immunogener. Se Dintzis et al., J. Immun. (1983) 131:2196 og J. Immun.
(1989) 143:1239. Under eller etter kondenseringsreaksjonen (normalt en reaksjonstid på 24 til 48 timer) blir et sterkt reduksjonsmiddel, slik som natriumcyanoborhydrid, tilsatt for å danne morfolingruppen. Den komplementære strengen av dupleksen blir så tilsatt til konjugatet og blandingen blir oppvarmet og sakte avkjølet for at strengen skal annelere. Konjugatet kan bli renset ved gel filtreringskromatografi.
Et alternativ til ribosestrategien er dannelse av aldehydfunksjonaliteter på polynukleotidene og anvendelse av disse funksjonalitet ene for å koble polynukleotidet til plattformmolekylet via reaktive funksjonelle grupper på dette. Det kan bli tatt fordel av det faktum at gem, vicinale dioler, bundet til 3' eller 5' ender av polynukleotidet, kan bli oksidert med natriumperiodat for å gi aldehyder som kan kondensere med funksjonelle aminogrupper på plattformmolekylet. Når diolene er i et ringsystem, f.eks. en femledds ring, blir det resulterende kondensasjonsproduktet en heterocyklisk ring inneholdende nitrogen, f.eks. en seksledds morfolin- eller piperidinring. Iminokondenseringsproduktet blir stabilisert ved reduksjon med et passende reduksjonsmiddel; f.eks. natriumborhydrid eller natriumcyanoborhydrid. Når diolet er acyklisk, inneholder det resulterende oksidasjonsproduktet kun et aldehyd og kondensasjonsproduktet er et sekundært amin.
En annen prosedyre omfatter innføring av alkylamino eller alkylsulfhydrylgrupper på enten 3' eller 5' endene av polynukleotidet ved passende nukleotidkjemi, f.eks. fosfor-amiditt kjemi. De nukleofile gruppene kan så bli benyttet for å reagere et stort overskudd av homobifunksjonelt tverrbindingsmiddel, f.eks. dimetylsuberimidat, for alkylaminderivater, eller et overskudd av heterobifunksjonelt tverrbindingsmiddel, f.eks. m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester (MBS) eller succinimidyl (4-jodacetyl) aminobenzoat (SIAB), for alkylsulfhydrylderivatene. Straks overskuddet av tverrbindingsmiddel blir fjernet, blir de polynukleotide derivatene reagert med aminogrupper på plattformmolekylet. Alternativt kan sulfhydrylgruppen bli reagert med et elektrofilt senter på plattformen, slik som en maleimid eller _-haloacetyl gruppe eller en annen passende Michael akseptor.
Enda en strategi benytter modifiserte nukleosider. Passende deoksynukleosidderivater kan bli innlemmet ved standard DNA syntesekjemi, ved ønskede posisjoner i polynukleotidet, fortrinnsvis i 5' eller 3' endene. Disse nukleosidderivatene kan så bli reagert spesifikt og direkte med alkylaminogrupper på plattformmolekylet. Alternativt kan sidereaksjoner sett ved den ovenfor beskrevne dialdehydkjemien, slik som aminkatalysert beta-eliminering, bli omgått ved anvendelse av passende nukleosidderivater som 3' terminal av kjeden som skal festes. Et eksempel på dette er 5' metylenforlenging av ribose; dvs. en 5' (2-hydroksyetyl)-gruppe istedenfor en 5' hydroksymetylgruppe. Et alternativ er anvendelse av en fosfonat eller fosfinat binding for det 3' terminale dinukleotidet av polynukleotidet som skal festes til plattformmolekylet.
Analoger av immunogener
Immunogener som er involvert i antistoff-medierte patologier kan være eksterne (fremmede for individet) immunogener slik som allergener, sperma assosiert med infertilitet, reumatisk feber karbohydratkompleks, RBC Rh/D antigen assosiert med hemolytisk sykdom hos nyfødte, biologiske medikamenter, inkludert native biologiske stoffer som er fremmed for individet slik som terapeutiske proteiner, peptider og antistoffer og lignende eller selv-immunogener (autoimmunogener) slik som de forbundet med thyroiditis (thyroglobulin), slag (cardiolipin) og myasthenia gravis (acetylcholin reseptor).
Analoger til slike immunogener kan bli identifisert ved screening av kandidatmolekyler for å bestemme om de (a) binder spesifikt til serum antistoffer for immunogenet og (b) mangler T-celle epitoper. Spesifikke antigener for serum antistoffer kan bli bestemt ved anvendelse av konvensjonelle immunoanalyser og nærværet eller fraværet av T-celle epitoper kan bli bestemt ved konvensjonelle T-celle aktiveringsanalyser. Hva dette angår, viser en analog som "binder spesifikt" til serum antistoffer for immunogenet en passende affinitet for dette. Videre hva dette angår, må det bli forstått at testing for T-celle epitoper blir utført på en individ-til-individ basis som anvendelse av T-celler tatt fra den aktuelle mottaker eller fra forskjellige pasienter som representerer målpopulasjonen av mottakere. Nærværet eller fraværet av T-celle epitoper kan bli bestemt ved anvendelse av analysen med tritiert tymidininnlemming som beskrevet i eksemplene. Nærværet av T-celle epitoper kan også bli bestemt ved måling av sekresjon av T-celleavledede lymfokiner ved metoder som er velkjente i teknikken. Analoger som ikke induserer statistisk signifikant innlemming av tymidin over bakgrunnen blir bedømt åmangle T-celle epitoper. Det må vurderes at kvantitativ mengde av tymidininnlemming kan variere med immunogenet. Typisk er en stimuleringsindeks lavere enn omkring 2-3, vanligvis omkring 1-2, indikativ på en mangel på T-celle epitoper.
Et normalt førstetrinn i identifisering av nyttige analoger er åfremstille et panel eller et
bibliotek av kandidater som skal undersøkes. For eksempel, for protein eller peptidana-loger, kan biblioteker bli fremstilt ved syntetiske eller rekombinante teknikker slik som de beskrevet av Geysen et al. i Synthetic Pe<p>tides as Anti<g>ens: Ciba Symposium (1986) 119:131-149; Devlin et al., Science (1990) 249:404-406: Scott et al., Science (1990) 249:386-390; and Cwirla et al., PNAS USA (1990) 87:6378-6382.1 en synteseteknikk blir peptider omkring 5 til 30 aminosyrer syntetisert på en slik måte at hvert peptid overlapper det neste og alle lineære epitoper er representert. Dette blir oppnådd ved overlapping av både karboksyl og amino termini ved en rest mindre enn det forventet for en B-celle epitop. For eksempel, hvis det antatte minimumbehov for en B-celle epitop er seks aminosyrer, så må hvert peptid overlappe det naboliggende peptid med fem aminosyrer. I den utførelsesformen blir hvert peptid undersøkt mot antisera produsert mot native immunogener, enten ved immunisering av dyr eller for pasienter, for åidentifisere nærværet av B-celle epitoper. Disse molekylene med antistoff bindingsaktivitet blir så analysert for nærvær av T-celle epitoper som beskrevet i eksemplene. Molekyler som mangler T-celle epitoper er nyttige som analoger ifølge oppfinnelsen.
Dersom T-celle epitopen(e) til et immunogen er kjent eller kan bli identifisert, er random T-celle analyse av aktuelle analoger ikke nødvendig. I slike tilfeller kan T-celle epitopen(e) bli endret (f.eks. ved kjemisk derivatisering, eller eliminering av en eller flere komponenter av epitopen) for å gjøre dem inoperative eller bli eliminert fullstendig, slik som for eksempel for peptider ved syntetiske eller rekombinante prosedyrer.
Mimotoper og aptamerer blir syntetisert ved konvensjonelle fremgangsmåter og blir analysert på samme måte som andre analoger av immunogener.
Analogene blir koblet til et ikke-immunogent valensplattformmolekyl for å fremstille konjugatene ifølge oppfinnelsen. Konjugater omfattende valensplattformmolekyler og biologisk aktive molekyler slik som karbohydrater, lipider, lipopolysakkarider, proteiner, glykoproteiner, medikamenter og analoger av interesse blir syntetisert ved anvendelse av kjemien eksemplifisert her. En foretrukket fremgangsmåte for syntese er åinnlemme et linker-molekyl på det biologiske molekylet ved velkjente fremgangsmåter valgt fra tilfelle til tilfelle.
Ved konjugering av medikamenter slik som adriamycin (doxorubicin) til et valensplattformmolekyl, kan aminogruppen på sukkerringen reagere med plattformmolekyler inneholdende aktive estere. Adriamycin kan også bli modifisert til åinneholde tiolgrupper for konjugering til en haloacetylert plattform (Kaneko, T., et al., Bioconiueate Chemistrv. 2:133 (1991)).
Karbohydrater slik som oligosakkarider kan bli modifisert til åinneholde en sulfhydryl-inneholdende linker (Wood, S.J. og Wetzel, R., Bioconiueate Chemistrv. 3:391 (1992)). Sulfhydrylgruppen blir benyttet for konjugering til en haloacetylert plattform. Alternativt kan karbohydrater bli oksidert for ågenerere aldehyder som blir reagert med aminoplattformer i nærvær av NaCNBH3 for å danne konjugater.
Lipider slik som glykolipider inneholdende en etanolamingruppe blir reagert med et aktivert karboksylat på plattformen. Lipopolysakkarider inneholdende sukkerenheter blir oksydert for ågenerere aldehyder som blir reagert i nærvær av NaCNBH3 med aminoplattformer for å danne konjugater ved reduktiv aminering.
Tilfeller med ytterligere proteiner slik som Fab<1> antistoff fragmenter, blir sulfhydrylgrupper på proteinet (Fab') konjugert til en plattform via haloacetylgrupper. Glykoproteiner blir modifisert med en tiol-linker ved anvendelse av iminotiolat. Tiolet reagerer med plattformer inneholdende haloacetylgrupper.
Evnen til konjugater til å virke som tolerogener og spesifikt undertrykke produksjon av antistoffer kan bli evaluert i den murine modell beskrevet i eksemplene.
Konjugatene vil normalt bli formulert for administrering ved injeksjon (f.eks. intraperitonealt, intramuskulært, intravenøst osv.). Følgelig kan de typisk bli kombinert med farmasøytisk akseptable vandige bærere slik som salin, Ringers oppløsning, dekstroseoppløsning og lignende. Konjugatet vil normalt utgjøre omkring 0,01 til 10 vekt-% av formuleringen. Konjugatet blir administrert til et individ i en mengde som er tilstrekkelig i det minste delvis til åreetablere toleransen for autoantigenene som forårsaker SLE. Slike mengder er noen ganger her referert til som "terapeutisk effektive" mengder. Bestemt doseringsregime, dvs. dose, tid og repetisjon, vil avhenge av det bestemte individet, og individets medisinske historie. Normalt vil omkring 1 til 1000 ug konjugat/kg kroppsvekt bli gitt. Repetitive administrasjoner kan være nødvendig for å oppnå og/eller opprettholde en tilstand ved immuntoleranse.
De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen og det overraskende ved den i forhold til kjent teknikk.
Eksempel 1
Følgende reaksjonsskjema illustrerer fremgangsmåten for syntetisering av derivatiserte kjemisk definerte valensplattformmolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse. I disse eksemplene er: DMTr = 4,4'-dimetoksytrimetylfenyl; Tr = trityl; Bz = benzoyl; Cp = deoksycytidin monofosfat, CE = cyanoetyl; CPG = kontrollert poreglass, DMF = dimetylformamid, DCC = dicykloheksylkarbodiimid, TFA - trifluoreddiksyre, CDI = karbonyldiimidazol, Ts = tosyl (para-toluen sulfonyl), DIPAT = diisopropyl ammoniumtetraazolid, TBDMSC1 = tertbutyl dimetylsilylklorid, TBAF = tetrabutyl ammoniumfluorid, NMMO = N-metylmorfolinoksid.
Reaksionsskjema 1
Reaks. 1onssk. 1ema 2
Reakslonssklema 3
Reaks. 1onssk. 1ema 4
Reaks. ionssklema 5
Reaks. ionssk. 1ema 6
Reaksjonssk. jerna 7 ppfllfs^onsskjema 8
Reaks. 1onssk. 1ema 9
Reaksjonsskjema 10
Syntese av reagenser benyttet for å modifisere (CA)8, (CA^rj»
(CA)12 °S (CA)l6 med disulfid-linkere er beskrevet i Reaksjonsskjema 11 nedenfor:
Reaks. ionssk. 1ema 11
Syntese av et reagens anvendt for å modifisere. (CA)25 med vicinale diol-linkere er beskrevet i Reaksjonsskjema 12 nedenfor:
Reaks. ionssk. 1ema 12
Reaks. 1onssk. 1ema 13
Eksempel 2
Syntese av kjemisk definerte valensplattformmolekyler
Forbindelse 1 - r3, 5- bis-( iodacetamido) benzosvrel: 2,93 g (8,28 mmol, 2,2 eq) jodeddiksyre anhydrid ble tilsatt til en omrørt suspensjon av 572 mg (3,76 mmol) 3,5-diaminobenzosyre i 19 ml dioksan ved romtemperatur under N2 atmosfære. Blandingen ble omrørt, dekket med plast i 20 timer og skilt mellom 50 ml EtOAc og 50 ml IN HC1 oppløsning. EtOAc-laget ble vasket med saltvann, tørket over MgSC«4, filtrert, og konsentrert på en rotasjonsdamper for å gi 3,3 g lysebrunt faststoff. Materialet ble renset ved silikagel kromatografi (94/5/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc) for å gi 992 mg (54 %) av forbindelse l som et hvitt faststoff: NMR (DMSO) 3,84 (s, 4H), 7,91 (s, 2H), 8,14 (s, 1H), 10,56 (s, 2H).
Forbindelse 2 - [ 3. 5- bis-( jodacetamido) benzoylkloridl:
117 ul (1,6 mmol, 190 mg) SOCI2 ble tilsatt til en oppløsning av 390 mg (0,8 mmol) av 1 i 34 ml THF. Blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløpskjøling under N2 atmosfære inntil alt faststoffet var oppløst (omkring 30 minutter) for å gi en klar rødbrun oppløsning. Blandingen ble konsentrert på en rotasjonsfordamper og plassert under vakuum for å gi rå forbindelse 2 som et skumaktig faststoff som ble benyttet direkte i neste trinn.
Forbindelse 3 - fN, N'- bis-( 3, 5- bis( iodacetamido) benzoyQ derivat av ,--bis-(N-2-aminoetylkarbamovDpolvetvlenglykol]: 570 mg _,—bis-(N-2-aminoetylkarbamoyl)polyetylenglykol (0,16 mmol, 3350 g/mol, Sigma) ble plassert i en tarert flaske. Toluen (20 ml) ble tilsatt og vann ble fjernet ved azeotrop destillering. Resten ble tørket under vakuum for å gi 549 mg faststoff og oppløst i 4 ml THF med 89 fil (0,64 mmol) diisopropyletylamin. Det rå syrekloridet ble oppløst i 4 ml vannfri THF og tilsatt til blandingen over 30 sekunder under N2. Blandingen ble omrørt i 16 timer ved romtemperatur og skilt mellom 25 ml 0,1 N HC1 og 25 ml CH2Cl2. Det vandige laget ble igjen ekstrahert med CH2C12 og de organiske lagene ble slått sammen, vasket med 25 ml H20, fulgt av 50 ml NaHC03 oppløsning. De organiske lagene ble tørket med Na2SC<4, filtrert og konsentrert for å gi 784 mg oransje olje. Silikagel kromatografi (9/1 CH2Cl2/MeOH) ga 190 mg fargeløs olje som ble krystallisert fra varm EtOH/Et20, oppsamlet på et sintret glassfilter under N2 trykk, og tørket under vakuum for å gi 177 mg av forbindelse 3 som et hvitt faststoff: NMR (CDCI3) 3,40 (bd m, 8H), 3,59 (bd s, (CH2CH20)n, integral for stort til åintegrere i forhold til andre integraler), 3,91 (s, 8H), 4,21 (m, 4H), 6,04 (bd m, 2H), 7,55 (bd m, 2H) 7,78 (bd s, 4H) 8,10 (bd s 2H), 9,30 (bd m, 4H): jodacetyl bestemmelse ( European Journal of Biochemistrv (1984) 140:63-71): Beregnet, 0,92 mmol)g; funnet 0,96 mmol/g.
Forbindelse 4 - [ Mono- N- karbobenzyloksv- 3. 6- dioksa- 1. 8- diaminooktan'|: En oppløsning av 14,3 ml (17,1 g, 100 mmol) benzylklorformat i 200 ml CH2CI2 ble tilsatt dråpevis over 1 times periode til en oppløsning av 29,0 ml (29,6 g, 200 mmol) 1,2-bis-(2'-aminoetyoksy)etan (Fluka) i 100 ml CH2Cl2 ved 0°. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 24 timer og 1 N HC1 ble tilsatt inntil det vandige laget forble surt (pH mindre enn 2). Det vandige laget ble vasket med tre 50 ml porsjoner CH2CI2 og nøytralisert med IN NaOH inntil pH var over 13. Det basiske vandige laget ble ekstrahert med 75 ml porsjoner CH2CI2. De sammenslåtte CH2CI2 lagene ble tørket (MgSC>4), filtrert og konsentrert for å gi 12,7 g (45 %) av forbindelse 4 som en tykk olje: <!>H NMR (CDCI3) d 2,82 (bd s, 2H), 3,30-3,60 (m, 12H), 5,10 (s, 2H), 5,75 (bd s, 1H), 7,20-7,40 (m, 5H); <13>C NMR (CDCI3) d 41,1,41,8,66,5, 70,0, 70,2, 70,4,73,5,
127,9,128,0,128,4,136,9,156,4.
Forbindelse 5 - [ N- tert- butvloksvkarbonvliminodieddiksvre]:
Denne forbindelsen ble fremstilt ved en prosedyre tilsvarende til den rapportert av Garrigues, B. og Lazraq, E.M. Tetrahedron Letters (1986) 27, 1685-1686. 47 ml (34,2 g, 338 mmol) Et3N ble tilsatt til en omrørt oppløsning av 22,0 g (169 mmol) iminodieddiksyre og 36,8 g (169 mmol) di-tert butyldikarbonat i 169 ml 50/50 dioksan/H20 vet* romtemperatur. Blandingen ble omrørt i 24 timer og det meste av dioksanen ble fjernet ved rotasjonsavdamping. Blandingen ble skilt mellom 350 ml IN HC1 og fem 100 ml porsjoner EtOAc. De kombinerte EtOAc lagene ble tørket (MgSC>4), filtrert og konsentrert for å gi et hvitt faststoff. Rekrystallisering fra heksan/EtOAc ga 35,3 g (90 %) av forbindelse 5 som krystaller: smp. 131-132° fusert;
<*>H NMR (DMSO) d 1,35 (s, 9H), 3,87 (s, 2H), 3,91 (s, 2H), 12,6 (bd s, 2H); <l3>C NMR (DMSO) d 27,9,49,6, 79,6,154,8,171,2.
Forbindelse 6. 9.99 g (48,5 mmol) dicykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til en oppløsning av 4,52 g 73 (19,4 mmol) av forbindelse 5 og 4,46 g (38,8 mmol) N-hydroksysuccinimid i 100 ml THF ved 0°. Blandingen ble omrørt i 3 timer ved 0°C, og en oppløsning av 5,39 ml (3,92 g, 38,8 mmol) Et3N og 10,9 g (38,7 mmol) av forbindelse 4 i 83 ml THF ble tilsatt, og blandingen ble omrørt ved 5°C i 17 timer. Blandingen ble filtrert for å fjerne faststoff, og filtratet ble konsentrert til en olje som ble skilt mellom 400 ml EtOAc og to 100 ml porsjoner IN HC1. EtOAc-laget ble vasket med tre 100 ml porsjoner IN Na2C03,100 ml saltvann, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi 14,2 g (96 %) av forbindelse 6 som en tykk olje; <l>H NMR (CDCI3) d 1,41 (s, 9H), 3,30-3,70 (m, 24H), 3,70-3,90 (m, 4H), 5,10 (s, 4H), 5,50 (bd s, 2H), 7,12 (bd s, 1H), 7,30-7,40 (m, 10H), 8,24 (bd s, 1H).
Forbindelse 7. 26,3 ml (38,9 g, 156 mmol) trifluoreddiksyre ble tilsatt til en oppløsning av 14,2 g (18,6 mmol) av forbindelse 6 i 111 ml CH2CI2 og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen ble konsentrert i rotasjonsfordamper for å gi en viskøs olje, og oljen ble oppløst i 93 ml THF. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og 3,72 g (37,2 mmol) ravsyre anhydrid ble tilsatt fulgt av 5,18 ml (3,76 g, 37,2 mmol) Et3N. Avkjølingsbadet ble fjernet, og blandingen ble omrørt i 18 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk, og den resulterende oljen ble skilt mellom 300 ml CH2CI2 og tre 100 ml porsjoner H20. CH2Cl2-laget ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi en olje som ble renset ved kromatografi på silikagel (9/1/0,1 EtOAc/MeOH/eddiksyre) for å gi 10,5 g (74 %) av forbindelse 7 som en viskøs olje; <l>H NMR (CDCI3) d 2,50-2,60 (m, 4H), 3,30-3,60 (m, 24H), 3,88 (s, 2H), 4,03 (s, 2H), 5,07 (s, 4H), 5,77 (bd s, 2H), 7,20-7,30 (m 10H), 7,91 (bd s, 2H), 8,88 (bd s, 1H); <!3>C (CDCI3) d 27,7, 29,0, 39,4,41,0, 52,9,53,8,66,5, 69,3,69,8, 70,0, 70,1,127,8,128,1,128,3,136,7,156,6,169,1,169,6,173,3,174,5.
Forbindelse 8 - [ 4- nitrofenylester av forbindelse 71: 1,61 g (7,83 mmol) dicykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til en oppløsning av 3,98 g (5,22 mmol) av 7 og 800 mg (5,75 mmol) 4-nitrofenol i 26 ml CH2C12 ved 0°. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur under N2 i 64 timer. Blandingen ble avkjølt til 0°, 1 ml HOAc ble tilsatt, og blandingen ble holdt ved 0° i 2 timer. Faststoffet ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble konsentrert. Resten ble renset ved silikagel kromatografi (gradient, 91/8/1 til 84/15/1 CH2Cl2/IPA/HOAc) for å gi 2,58 g (56 %) av forbindelse 8 som en viskøs olje: <]>H NMR (CDCI3) d 2,66 (t, 2H), 2,84 (t, 2H), 3,32-3,68 (m, 24H), 3,90 (bd s, 2H), 4,01 (bd s, 2H), 5,06 (s, 4H), 5,58 (bd m, 2H), 6,91 (bd m, 1H), 7,27 (d, 2H), 7,33 (s, 10H), 8,23 (d, 2H), 9,01 (bd m, 1H).
Forbindelse 10 - [ 4- nitrofenylbrornacetat]: 9,28 g (45 mmol) dicykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til en omrørt oppløsning av 5,0 g (35,9 mmol) bromeddiksyre og 8,50 g (61,1 mmol) 4-nitrofenol i 180 ml EtOAc ved 0°. Blandingen ble omrørt i 16 timer ved 5° og 1 ml eddiksyre ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 20 minutter ved romtemperatur og så plassert i en fryser i 20 minutter. Faststoffet ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert til en viskøs olje og krystallisert fra Et20/heksan for å gi 7,73 g (83 %) av forbindelse K) som flak: smp. 86-87°; TLC Rf = 0,63 (50/50/1 heksan/EtOAc/HOAc); <i>H NMR (CDCI3) d 4,13 (s, 2H), 7,36 (d, J=12 Hz, 2H), 8,32 (d, J=12 Hz, 2H); ™ C NMR (CDCI3) d 24,9,122,1, 125,3,155,5 164,9; analytisk beregnet for Cg^BrNC^: C, 36,95; H, 2,33; N, 5,39. Funnet: C, 37,24; H, 2,33; N, 5,42.
Forbindelse 9: 300 mg (3,57 mmol) NaHCC>3, fulgt av 162 mg (1,09 mmol) 2,2j-(etylendioksy)-dietylamin (Fluka), ble tilsatt til en oppløsning av 2,37 g (2,68 mmol) av forbindelse 8 i 15 ml dioksan og 8 ml H2O. Blandingen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur og konsentrert under vakuum til omkring halve dets opprinnelige volum. Konsentratet ble skilt mellom 40 ml CH2CI2 og 40 ml mettet NaHCC«3 oppløsning. CH2Cl2-laget ble vasket to ganger med 40 ml 0,5 N HC1. CH2Cl2-laget ble vasket med mettet NaCl oppløsning, tørket (MgSC«4), filtrert og konsentrert for å gi 2,8 g av en olje. Råproduktet ble renset ved silikagel kromatografi (3/6/1 CH2Cl2/THF/MeOH) for å gi 940 mg (59 %) av forbindelse 9 som en olje: TLC Rf = 0,21 (3/6/1 CH2Cl2/THF/MeOH); <*>H NMR (CDCI3) d 2,45 (m, 4H), 2,59 (m, 4H), 3,25-3,55 (m, 60H), 3,87 (s, 4H), 4,05 (s, 4H), 5,07 (s, 8H), 5,62 (bd s, 4H), 6,78 (bd s, 2H), 7,34 (bd s, 20H), 8,56 (bd s, 2H); <13>C NMR (CDCI3) d 28,1, 30,3, 31,1, 39,4, 41,1, 52,9, 53,9, 66,5,69,4,69,7, 69,9,70,2, 125,3,127,8,128,3, 136,8,156,5,168,8,169,4,172,1, 173,5.
Forbindelse 34: 110 mg av 10 % Pd på karbon ble tilsatt til en oppløsning av 281 mg (0,175 mmol) av forbindelse 9 i 5 ml EtOH og 2 ml cykloheksen under nitrogen og den resulterende blandingen ble oppvarmet ved tilbakeløpskjøling under nitrogen i 2 timer. Når avkjølt, ble blandingen filtrert gjennom diatomer jord og konsentrert under vakuum for å gi 170 mg (92 %) av forbindelse 34 som en olje som ble benyttet direkte i neste trinn uten rensing; <*>H NMR (CDCI3) d 2,45 (m, 4H) 2,53 (m, 4H), 2,62 (m, 4H), 2,86 (m, 8H), 3,42-3,60 (m, 52H), 4,00 (s, 4H), 4,14 (s, 4H); ™ C NMR (CDCI3) d 28,2, 30,3, 31,1, 39,4,41,1,46,5,48,6, 52,9, 53,8, 69,4, 69,7, 70,2, 72,4, 168,9, 169,5, 172,3, 173,8.
Forbindelse 11: 128 mg (1,4 mmol) NaHCC<3 og 200 mg (0,85 mmol) av forbindelse 10 ble tilsatt til en oppløsning av 165 mg (0,155 mmol) av forbindelse 34 i 6 ml dioksan og 3 ml H2O. Den resulterende blandingen ble omrørt i 24 timer ved romtemperatur og konsentrert under vakuum. Konsentratet ble renset ved kromatografi på Sephadex G-10 (MeOH) for å gi 114 mg (46 %) av forbindelse U som en viskøs olje. En analytisk prøve ble fremstilt ved preparativ HPLC ( C\ s; gradient 15/85/0,1 til 30/70/0,1 CH3CN/H2O/CF3CC7H, 50 minutter, 225 nm): <!>H NMR (CDCI3) d 2,58 (m, 4H), 2,65 (m, 4H), 3,43-3,62 (m, 60H), 3,92, (s, 8H), 4,03 (s, 4H), 4,16 (s, 4H); MS (FAB) m/e (relativ intensitet) MNa+ 1605 (100), MH+ 1579 (1), 1581 (5), 1583 (7), 1585 (6), 1587 (2).
Forbindelse 12 - fMono- N- karbobenzyloksv- 1. 6- diaminoheksanl:
En oppløsning av 21 ml (25,7 g, 150 mmol) benzylklorformat i 200 ml dioksan ble tilsatt dråpevis til en omrørt oppløsning av 17,49 g (150 mmol) 1,6-heksandiamin og 19,58 g (196 mmol) KHCO3 i 100 ml dioksan og 300 ml H20 ved 0°. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer og så avkjølt til 0°. Blandingen ble surgjort med 12 N HC1 og ekstrahert med to 100 ml porsjoner Et20. Det vandige laget ble nøytralisert med 10 N NaOH og ekstrahert med åtte 100 ml porsjoner Et20. De basiske ekstraktene ble kombinert, tørket (Na2S04), og konsentrert for å gi 5,03 g (13 %) av rå forbindelse 12 som en halvfast rest: <l>H NMR (DMSO) d 1,22-1,51 (m, 8H), 2,54 (t, 2H), 3,02 (d av t, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,30-7,48 (m, 5H).
Forbindelse 13: 918 mg (4,45 mmol) dicykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til en oppløsning av 417 mg (1,78 mmol) av forbindelse 5 og 409 mg (3,56 mmol) NHS i 15 ml THF ved 0°. Blandingen ble omrørt ved 0° i 4,5 timer og en oppløsning av 1,02 g (4,08 mmol) av forbindelse 12 i 4 ml THF ble tilsatt. Blandingen ble omrørt under N2 ved 5° i 18 timer. Konsentratet ble skilt mellom 30 ml EtOAc og to 30 ml porsjoner IN HC1. De kombinerte EtOAc-lagene ble vasket i rekkefølge med 30 ml H20 og 30 ml mettet NaHC03 oppløsning, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi 1,48 g viskøs rest. Rensing ved kromatografi på silikagel (5/95 MeOH/CH2Cl2) ga 1,04 g (84 %) av forbindelse 13 som en klebrig faststoff: <!>H NMR (CDCI3) d 1,33 (m, 8H), 1,43 (s, 9H), 1,51 (m, 8H), 3,18 (m, 4H), 3,26 (m, 4H), 3,81 (s, 2H), 3,85 (s, 2H), 4,90 (bd s, 2H), 5,10 (s, 4H), 6,81 (bd s, 1H), 7,28-7,40 (m, 10H), 8,05 (bd s, 1H).
Forbindelse 14: 14,9 ml trifluoreddiksyre ble tilsatt til en oppløsning av 5,16 g (7,45 mmol) av forbindelse J_3 i 14,9 ml CH2C12 og den resulterende blandingen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Blandingen ble konsentrert under vakuum og gjenoppløst i 57 ml THF. 2,07 ml (1,51 g, 14,9 mmol) Et3N ble tilsatt til blandingen. 1,5 g (14,9 mmol) ravsyre anhydrid ble tilsatt til blandingen og blandingen ble så omrørt i 18 timer. Blandingen ble skilt mellom 75 ml IN HC1 og fire 75 ml porsjoner CH2C12. De kombinerte CH2Cl2-lagene ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi et faststoff. Krystallisering fra CH2Cl2/EtOAc/heksan ga 3,84 g (74 %) av forbindelse 14 som et hvitt faststoff: smp. 122°; <!>h NMR (MeOH) d 1,32 (m, 8H), 1,48 (m, 8H), 2,56 (m, 4H), 3,10 (t, 4H), 3,23 (m, 4H), 4,00 (s, 2H), 4,18 (s, 2H), 5,05 (s, 4H), 7,33 (m, 10H).
Forbindelse 15 - r4- nitrofenvlester av forbindelse 141:
887 mg (4,30 mmol) dicykloheksylkarbodiimideo ble tilsatt til en oppløsning av 2,0 g (2,87 mmol) av forbindelse 14 og 438 mg (3,15 mmol) 4-nitrofenol i 15 ml THF ved 0°. Blandingen ble oppvarmet til romtemperatur, omrørt i 18 timer, og så avkjølt til 0°. 200 ul eddiksyre ble så tilsatt og blandingen ble omrørt ved 0° i 1 time. Faststoffet ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert til en olje. Rensing ved kromatografi på silikagel (92/8 CH2CI2/IPA) og rekrystallisering av det resulterende faststoff fra CH2Cl2/heksan ga 1,52 g (64 %) av forbindelse 15 som et hvitt faststoff: smp. 65-68°; <i>H NMR (CDCI3) d 1,30 (m, 8H), 1,47 (m, 8H), 2,71 (t, 2H), 2,90 (t, 2H), 3,17 (m, 4H), 3,25 (m, 4H), 3,92 (s, 2H), 4,08 (s, 2H), 4,86 (bd t, 1H), 4,95 (bd t, 1H), 5,09 (s, 4H), 6,28 (bd t, 1H), 7,23 (d, J=9 Hz, 2H), 7,32 (m, 10H), 8,22 (d, J=9 Hz, 2H), 8,95 (bd t, 1H).
Forbindelse 16: En oppløsning av 830 mg (0,99 mmol) av forbindelse 15 i 7,5 ml dioksan ble tilsatt til en oppløsning av 58 ul (59 mg, 0,40 mmol) 2,2<1->(etylendioksy)-dietylamin (Fluka) og 111 mg (1,31 mmol) NaHCC>3 i 7,5 ml H2O. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Blandingen ble skilt mellom 50 ml IN HC1 og 50 ml CH2CI2. CH2Cl2-laget ble tørket (Na2SC-4), filtrert og konsentrert for å gi 1,28 g viskøs olje. Rensing ved silikagel kromatografi (84/15/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc) ga 670 mg av forbindelse 16 som et voksaktig faststoff: <l>H NMR (CDCI3) d 1,32 (m, 16H), 1,49 (m, 16H), 2,46 (m, 4H), 2,58 (m, 4H), 3,10-3,23 (m, 16H), 3,34 (m, 4H), 3,48 (m, 4H), 3,53 (s, 4H), 3,85 (s, 4H), 4,02 (s, 4H), 5,05 (s, 8H), 5,07 underliggende bd t, 2H), 5,15 (bd t, 2H), 7,30 (m, 20H), 7,40 (bd t, 2H), 8,60 (bd t, 2H).
Forbindelse 35: En oppløsning av 613 mg (0,41 mmol) av forbindelse 16 i 20,3 ml EtOH og 10,1 ml cykloheksen ble omrørt og spylt med nitrogen. 20 mg 10 % Pd på karbon (Aldrich) ble tilsatt og blandingen ble oppvarmet i et 85° oljebad i 1,5 time. Når avkjølt, ble blandingen filtrert gjennom diatomer jord ved anvendelse av 50/50 H20/aceton for å rense flasken og filteret. Filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi 448 mg (114 %) av forbindelse 35 som et voksaktig faststoff: lB NMR (D2O) d 1,39 (m, 16H), 1,59 (m, 16H), 2,57 (t, 4H), 2,65 (t, 4H), 2,88 (t, 8H), 3,23 (t, 4H), 3,29 (t, 4H), 3,42 (t, 4H), 3,65 (t, 4H), 3,71 (s, 4H), 4,06 (s, 4H), 4,30 (s, 4H).
Forbindelse 17: 546 mg (6,50 mmol) NaHCC*3 ble tilsatt til en oppløsning av 445 mg (0,406 mmol) av forbindelse 35 i 9,5 ml H2O. En oppløsning av 838 mg (3,25 mmol) av forbindelse 10 i 14,4 ml dioksan ble tilsatt til den resulterende blandingen. Blandingen ble omrørt i 7 timer ved romtemperatur og skilt mellom 50 ml 0,1 N H2SO4 og 50 ml CH2CI2. CH2Cl2-laget ble kastet, og det vandige laget ble ekstrahert med to 50 ml porsjoner av CH2CI2, to 50 ml porsjoner av 9/1 CH2Cl2/MeOH, 50 ml av 4/1 CH2Cl2/MeOH og 50 ml av 3/2 CH2Cl2/MeOH. Ekstraktene ble slått sammen og tørket (Na2S04), filtrert og konsenntrert for å gi 282 mg faststoff. Krystallisering fra EtOH/EtOAc/Et20 ga 143 mg (24 %) av forbindelse 17 som et hvitt faststoff: <*>H NMR (CDCl3/MeOH) d 1,33 (m, 16H), 1,55 (m, 16H), 2,55 (m, 8H), 3,21 (m, 16H) 3,39 (m, 4H), 3,55 (m, 4H), 3,81 (s, 8H), 3,95 (s, 4H), 4,12 (s, 4H). Analytisk beregnet for C54H94Ni20i4Br4: C, 44,57; H, 6,51; N, 11,55; Br, 21,97. Funnet: C, 45,85; H, 6,49; N, 11,37; Br, 19,90.
Forbindelse 18 - f 1. 5- bisfN- karbobenzvloksv- 6- aminoheksanoamidoV3- azapentanl: 3,09 g (19,0 mmol) karbonyldiimidazol ble tilsatt til en oppløsning av 5,05 g (19,0 mmol) N-karbobenzyloksy-6-aminoheksansyre i 25 ml EtOAc ved romtemperatur. Blandingen ble omrørt i 15 timer og 1,02 ml (982 mg, 9,52 mmol) dietylentriamin ble så tilsatt fulgt av 2,65 ml (1,93 g, 19,0 mmol) Et3N. Den resulterende blandingen ble omrørt i 4 rimer, og det faste produktet ble oppsamlet ved filtrering. Rekrystallisering (MeOH/EtOAc) ga 4,27 g (75 %) av forbindelse 18 som et fint komaktig faststoff: smp. 132-133°; <!>h NMR (CDCI3) d 1,33 (m, 4H), 1,52 (m, 4H), 1,64 (m, 4H), 2,18 (t, 4H), 2,73 (t, 4H), 3,16 (m, 4H), 3,35 (m, 4H), 4,96 (bd s, 2H), 5,09 (s, 4H), 6,13 (bd s, 2H), 7,33 (s, 10H); analytisk beregnet for C32<H>47N506: C, 64,29; H, 7,50; N, 11,72. Funnet: C, 63,54; H. 7,75; N, 11,91.
Forbindelse 19: 657 ul (880 mg, 3,2 mmol) trietylenglykol-bis-klorformat (Aldrich) ble tilsatt til en oppløsning av 4,86 g (8,1 mmol) av forbindelse 18 i 162 ml pyridin i et 20° vannbad. Blandingen dannet umiddelbart en utfelling. Blandingen ble omrørt i 16 timer og den resulterende uklare gule oppløsningen ble konsentrert under vakuum. Konsentratet ble skilt mellom 150 ml EtOAc og to 150 ml porsjoner IN HC1 (mens det ble passet på at det vandige laget var surt). Det vandige laget ble kombinert og ekstrahert med en andre 150 ml porsjon EtOAc. EtOAc-lagene ble slått sammen, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert. Den resulterende resten ble krystallisert (EtOAc/heksan/CHCl3) for ågi 1,92 g (43 %) av forbindelse 19 som fine gulfargede krystaller: smp. 86-91°; <i>H NMR (CDCI3) 1,31 (m, 8H), 1,52 (m, 8H), 1,62 (m, 8H), 2,20 (m, 8H), 3,20 (m, 8H), 3,39 (s, 16H), 3,62 (s, 4H), 3,68 (m, 4H), 4,26 (m, 4H), 5,08 (s, 8H), 5,32 (bd s, 4H), 7,31 (bd s, 4H) 7,37 (s, 20H); <13>C NMR (CDCI3) d 25,1, 26,2, 26,4, 29,6, 36,0, 36,2, 38,5, 38,8,40,8, 64,5, 66,4, 69,1, 70,3, 128,0, 128,4, 136,7, 156,5,156,9, 173,6; analytisk beregnet for C72H104N1oOi8: C, 61,87; H, 7,50; N, 10,02. Funnet: C, 61,68; H, 7,63; N, 9,95.
Forbindelse 36: 3,5 ml cykloheksan ble tilsatt til en oppløsning av 800 mg (0,57 mmol) av forbindelse 19 i 5 ml absolutt EtOH. Oppløsningen ble plassert under nitrogen, 500 mg 10 % Pd på karbon ble tilsatt, og den resulterende blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling under omrøring i 2 timer. Når kald, ble blandingen filtrert gjennom di atomer jord og konsentrert for å gi 500 mg (100 %) av forbindelse 36 som en olje: <!>H NMR (50/50 CDCI3/CD3OD) d 1,21 (m, 8H), 1,49 (m, 8H), 1,62 (m, 8H), 2,19 (t, J=7,4 Hz, 8H), 2,67 (t, J=7,4 Hz, 8H), 3,36 (bd s, 16H), 3,67 (s, 4H), 3,71 (m, 4H), 4,21 (m, 4H).
Forbindelse 20: 3,9 g (46,4 mmol) NaHC03 ble tilsatt til en oppløsning av 5,0 g (5,8 mmol) av forbindelse 36 i 37,5 ml dioksan og 12,5 ml H20. Blandingen ble avkjølt til 0° på et isbad og 8,7 g (34,8 mmol) 4-nitrofenylbromacetat, forbindelse 10, ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 0° i 1 time og 50 ml IN H2S04 ble sakte tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med tre 50 ml porsjoner EtOAc. EtOAc-ekstraktene ble kastet og det vandige laget ble ekstrahert med seks 50 ml porsjoner av 20/80 MeOH/CH2Cl2. De sammenslåtte MeOH/CH2Cl2 lagene ble tørket (NaS04), filtrert og konsentrert. Resten ble renset ved silikagel kromatografi (trinngradient 9/1 CH2Cl2/MeOH så 85/15/5 CH2Cl2/MeOH/THF) for å gi 3,62 g (46%) av forbindelse 20 som et hvitt faststoff: smeltepunkt 66,0-70,5°. En analytisk prøve ble fremstilt ved preparativ HPLC (Ci8 reversert fase kolonne, gradient 25/75/0,1 til 35/65/0,1 CH3CN/H20/CF3C02H i 50 minutter, 225 nm) for å gi en klar olje som ble fast ved å stå under vakuum for å gi et hvitt faststoff: smeltepunkt 87-89; <!>h NMR (CDC13) d 1,35 (m, 8H), 1,55 (m, 8H), 1,64 (m, 8H), 2,26 (m, 8H), 3,28 (m, 8H), 3,42 (bd s, 16H), 3,66 (s, 4H), 3,70 (m, 4H),
3,89 (s, 8H), 4,19 (m, 4H); <13>C NMR (CDCI3) d 25,1,26,2,28,8,29,0, 38,5, 39,1,40,0, 47,8, 48,3, 64,7,69,1, 70,3,157,0,166,3,174,9; MS (FAB) m/e (relativ intensitet) MH+
[1341(25), 1343(60), 1345(70), 1347(56), 1349(21)], 705,6(100); analytisk beregnet for C48H84NioOi4Br4: C, 42,86; H, 6,29; N, 9,27; Br, 23,77. Funnet: C, 42,15; H, 6,28;
N, 9,87; Br, 25,33.
Forbindelse 21 - rTetrakis-( 2- cvanoetoksymetvO metanl:
Denne forbindelsen ble fremstilt hovedsakelig etter den rapporterte metoden (Bruson, H.A., US patent 2.401607; 4. juni 1946). 27,3 ml (21,8 g, 411 mmol) akrylonitril ble tilsatt til en omrørt oppløsning av 8,0 g (58,8 mmol) pentaerytritol og 1,76 ml av en 40 % vandig oppløsning av benzyltrimetylammoniumhydroksid i 50 ml H20. En tilbakeløpskjølingskondensator ble fastgjort og blandingen ble oppvarmet under N2 atmosfære under omrøring ved 40° i 16 timer og så ved 60° i 24 timer. Når kald, ble blandingen surgjort med 1 ml konsentrert HC1 og ført til en skilletrakt. Oljen som satte seg på bunnen ble oppsamlet, og den vandige fasen ble ekstrahert med tre 40 ml porsjoner CH2CI2. Oljen og de kombinerte ekstraktene ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi 23,5 g olje. Biscyanoetyleter ble fjernet ved kulerør destillasjon ved 110° og 0,25 torr. Resten i kolben ble krystallisert fra 11H20 for å gi 8,43 g (41 %) av forbindelse 21 som hvite nåler: smp. 42,5° [Rapportert ( Macromolecules 1991,24, 1443-1444.) 39-40°]; <!>H NMR (CDCI3) d 2,61 (t, J=6Hz, 8H), 3,50 (s, 8H), 3,6 (t, J=6 Hz, 8H).
Forbindelse 22 - rTetrakis-( 2- karboksvetoksvmetyl) metan]:
En oppløsning av 5,0 g (14,35 mmol) av forbindelse 21 i 21,5 ml konsentrert HC1 ble o mrørt ved 75° i 3 timer; under denne tiden ble det dannet en hvit utfelling. Det vandige HC1 ble fjernet under vakuum, og blandingen ble konsentrert to ganger fra 25 ml H2O. Det resulterende 9,68 g faste materialet ble satt på en 45 mm indre diameter kolonne inneholdende 16,5 cm bakking av DOW-1-X2 resin i hydroksidform, og kolonnen ble eluert med 200 ml H20 fulgt av IN HC1. Fraksjoner inneholdende produkt, som vist ved TLC (80/20/1 CH3CN/H20/H0Ac), ble konsentrert for å gi 1,21 g (21 %) av 22 som en olje: ^HNMR (D20) d 2,46 (t, J=6Hz, 8H), 3,22 (s, 8H), 3,55 (t, J=6 Hz, 8H).
Forbindelse 23: 3,71 ml (6,06 g, 50,8 mmol) tionylklorid ble tilsatt til en oppløsning av 1,12 g (2,85 mmol) av forbindelse 22 i 7,0 ml THF. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer og oppløsningsmidlene ble fjernet under vakuum. Det rå syrekloridet ble oppløst i 7 ml THF. 2,12 ml (1,54 g, 15,24 mmol) Et3N ble så tilsatt til oppløsningen. Blandingen ble omrørt under N2 og avkjølt til 0°. En oppløsning av 3,60 g (12,74 mmol) av forbindelse 4 i 5 ml THF ble tilsatt over en 1 minutts periode. Avkjølingsbadet ble fjernet, og blandingen ble omrørt i 5,5 timer ved romtemperatur og så skilt mellom 25 ml IN HC1 og fire 25 ml porsjoner EtOAc. EtOAc-lagene ble slått sammen, vasket med saltvann, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi 3,46 g viskøs olje. Rensing ved kromatografi på silikagel (95/5 CH2Cl2/MeOH) ga 1,26 g (30 %) av forbindelse 23 som en viskøs olje: <l>H NMR (CDCI3) d 2,40 (t, 8H), 3,29 (s, 8H), 3,35 (m, 16H), 3,48-3,77 (m, 48H), 5,12 (s, 8H), 5,60 (bd, 4H), 6,85 (bd, 4H), 7,34 (s, 20H).
Forbindelse 37: 4,0 ml cykloheksen og 83 mg 10 % Pd på karbon ble til satt til en oppløsning av 142 mg (0,093 mmol) av forbindelse 23 i 8,4 ml EtOH under N2.
Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling under omrøring i et 90° oljebad i 3
timer og, når kald, filtrert gjennom diatomer jord ved anvendelse av CH2CI2 for å vaske filteret og flasken. Filtratet ble konsentrert for å gi 70 mg (78 %) av forbindelse 37 som en olje: <l>H NMR (CDCI3) d 2,90 (t, 8H), 3,33 (s, 8H), 3,45 (t, 8H), 3,52-3,73 (m, 48H).
Forbindelse 24: 40 mg (0,48 mmol) NaHCC>3 og 104 mg (0,40 mmol) av forbindelse 10 ble tilsatt til en oppløsning av 70 mg (0,098 mmol) av forbindelse 37 i 2 ml dioksan og 0,67 ml H2O. Blandingen ble omrørt i 17 timer ved romtemperatur og 0,5 ml IN H2SO4 ble tilsatt, for å bringe pH til 4. Blandingen ble konsentrert, og konsentratet ble renset ved kromatografi på G-I0 Sephadex (MeOH). Fraksjoner inneholdende produktet ble konsentrert under vakuum for å gi 91 mg olje. Rensing av 36 mg av råproduktet ved HPLC (Cig, gradient 20/80/0,1 til 35/65/0,1 CH3CN/H2O/CF3CO2H) ga 19 mg (44 %) av forbindelse 24 som en olje: <l>R NMR (CDCI3) d 2,50 (t, 8H), 3,31 (s, 8H), 3,36-3,72 (m, 56H), 3,91 (s, 8H); ™ C NMR (CDCI3) d 28,8,36,5, 39,7,40,0, 67,2, 69,3, 69,5, 70,3,166,6, 173,0. MS (FAB) m/e (relativ intensitet) MH<+> [1425(15), 1427(63), 1429(75), 1431(64), 1433(12)], 577(100).
Forbindelse 25a - [ Bis- tolsylat av PEG335q1: 6,47 ml av pyridin ble tilsatt til en oppløsning av 16,75 g (5,0 mmol) polyetylenglykol (J.T. Baker, gjennomsnittlig molekylvekt 3350 g pr. mol) som hadde blitt tørket ved azeotrop destillasjon (toluen) i 40 ml CH2CI2. Oppløsningen ble plassert under nitrogen og avkjølt til 0°. En oppløsning av 7,63 g (40 mmol) tosylklorid i 40 ml CH2CI2 ble tilsatt over en 25 minutters periode. Avkjølingsbadet ble fjernet og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Blandingen ble ristet med 80 ml IN HC1 og CH2Cl2-laget som inneholdt emulsjoner ble vasket med 100 ml H2O. CH2Cl2-laget ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert. Resten ble krystallisert fra CH2Cl2/Et20 for å gi 16,82 g (92 %) av forbindelse 25 som et hvitt faststoff: <*>H NMR (CDCI3) d 2,50 (s, 6H), 3,48 (t, J=5 Hz, 4H), 3,55-3,77 (m, mer enn 600H, integral for stort til å være nøyaktig), 3,83 (t, J=5 Hz, 4H), 7,44 (d, J=7 Hz, 4H) 7,94 (d, J=7 Hz, 4H).
Forbindelse 26a - Diazido- PEG335Q: En oppløsning av 10,83 g (2,96 mmol) av forbindelse 25a og 1,92 g (29,6 mmol) NaN3 i 30 ml DMF ble oppvarmet under N2 i et 120° oljebad i 3 timer. Når kald, ble blandingen skilt mellom 100 ml H2O og 100 ml CH2CI2. CH2Cl2-laget ble fortynnet til 200 ml med CH2CI2 og vasket med 100 ml IN HC1, tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert. Det rresulterende voksaktige faststoffet ble krystallisert (CH2Cl2/Et20), og det resulterende faststoffet ble ytterligere renset ved kromatografi på silikagel (gradient 98/2 til 95/5 C^C^/MeOH) for å gi 4,75 g (47 %) av forbindelse 26a som et voksaktig faststoff: TLC Rf 0,41 (9/1 CH2CI2); <l>H NMR (CDCI3) d 3,35 (t, J=5 Hz, 4H), 3,44 (t, J=5 Hz, 2H), 3,54-3,77 (m, omkring 300 H, integral for stort til å være nøyaktig), 3,79 (t, J=5 Hz, 2H).
Forbindelse 27a - rPiamino- PEG^nl: 473 mg 10 % Pd på karbon (Aldrich) ble tilsatt til en oppløsning av 4,75 g (1,39 mmol) av forbindelse 26a i 140 ml EtOH. Blandingen ble ristet under 414 kPa H2 i 30 timer. Da reaksjonen var fullstendig (TLC, 9/1 CH2Cl2/MeOH), ble ytterligere 473 mg 10% Pd på karbon tilsatt og blandingen ble ristet under 414 kPa H2 i ytterligere 5 timer. Blandingen ble så filtrert gjennom diatomer jord, konsentrert under vakuum, og konsentratet ble krystallisert (CH2C12/Et20) for å gi 4,03 g (86 %) av forbindelse 27a som et hvitt faststoff: <t>ø NMR (CDCI3) d 2,92 (t, 4H) 3,49 (t, 2H), 3,66 (t, 4H), 3,67 (m, omkring 300H, integral for stort til åvære nøyaktig), 3,86 (t, 2H).
Forbindelse 28 - fN- hvdroksvsuccinimidylester av forbindelse 71: 596 mg (2,89 mmol) dicykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til en oppløsning av 1,84 g (2,41 mmol) av forbindelse 7 og 278 mg (2,41 mmol) av NHS i 12 ml THF ved 0° under N2. Avkjølingsbadet ble fjernet, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. 250 ul eddiksyre ble tilsatt til blandingen. Omrøringen ble fortsatt ved romtemperatur i 1 time. Blandingen ble så plassert i en fryser i 2 timer. Faststoffet ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble konsentrert for å gi 2,27 g (110 %) av råforbindelsen 28 som en viskøs olje. Forbindelsen 28 var vanskelig å rense uten dekomponering, så den ble benyttet direkte til acylat diamino-PEG.
Forbindelse 29a: En oppløsning av 900 mg (1,05 mmol) av forbindelse 28 i 4,68 ml dioksan ble tilsatt til en oppløsning av 877 mg (0,26 mmol) av forbindelse 27a og 176 mg (2,10 mmol) NaHC03 i 3,12 ml H2O ved 0°. Blandingen ble omrørt i 2 timer og så skilt mellom 25 ml IN HC1 og to 25 ml porsjoner CH2CI2. De sammenslåtte CH2C12-lagene ble tørket (NaS04), filtrert og konsentrert for å gi en viskøs olje. Rensing ved silikagel kromatografi (gradient, 95/5 til 87/13 C^C^/MeOH) ga 695 mg (55 %) av forbindelse 29a som et voksaktig faststoff: <]>H NMR (CDCI3) d 2,55 (bd, 8H), 3,39 (m, 16H), 3,44-3,72 (m, omkring 432H, integral for stort til å være nøyaktig), 3,89 (s, 4H), 4,03 (s, 4H), 5,09 (s, 8H), 7,36 (s, 20H).
Forbindelse 38a: 7,1 ml cykloheksen ble tilsatt til en oppløsning av 688 mg (0,142 mmol) av forbindelse 29a i 14,2 ml EtOH under N2. 284 mg 10 % Pd på karbon ble tilsatt og den resulterende blandingen ble kokt med tilbakeløpskjøling i 2 timer. Når kald, ble blandingen filtrert gjennom diatomer jord med EtOH, og filtratet ble konsentrert under vakuum for å gi 550 mg (90 %) av forbindelse 38a som et voksaktig faststoff: <!>H NMR (CDC13) d 2,58 (m, 8H), 2,93 (m, 8H), 3,38-376 (m, omkring 550H), 4,00 (s, 4H), 4,13 (s} 4H).
Forbindelse 30a: En oppløsning av 268 mg (1,04 mmol) av forbindelse 10 i 4,65 ml dioksan ble tilsatt til en oppløsning av 550 mg (0,13 mmol) av forbindelse 38a og 175 mg (2,08 mmol) NaHCC>3 i 3,11 ml H2O ved 0°. Blandingen ble omrørt i 20 timer og skilt mellom 50 ml IN H2SO4 og to 50 ml porsjoner CH2C12. De sammenslåtte CH2Cl2-lagene ble tørket (Na2SC<4), filtrert og konsentrert til en olje. Rensing ved G-10 Sephadex kromatografi (MeOH) ga et amorft faststoff som ble krystallisert (EtOH/Et20) for å gi 378 mg (61 %) av forbindelse 30a som et hvitt faststoff: lU NMR (CDCI3) d 2,59 (bd s, 8H), 3,38-3,82 (m, omkring 500H, integral for stort til å være nøyaktig), 3,88 (s, 8H), 3,98 (s, 4H), 4,10 (s, 4H); bromacetyl bestemmelse ( European Journal of Biochemistrv. 1984, 140, 63-71): Beregnet, 0,84 mmol/g; funnet, 0,50 mmol/g.
Forbindelse 25b - TBis- tosvlat av PEGgoppl: 2,3 ml (16,5 mmol) trietylamin, fulgt av 3,15 g (16,5 mmol) TsCl, ble tilsatt til en oppløsning av 12,0 g (1,5 mmol) PEGsøOO (Aldrich, gjennomsnittlig molekylvekt 8000 g/mmol) som hadde blitt tørket ved azeotrop destillering (toluen) i 30 ml CH2CI2. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer og ekstrahert med fire 50 ml porsjoner IN HC1 fulgt av 50 ml mettet NaCl oppløsning. Ch2Cl2-laget ble tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert under vakuum for å gi et voksaktig faststoff. Rekrystallisering (CH2Cl2/Et20) ga 11,0 g (92 %) av forbindelse 25b som et hvitt faststoff: ^HNMR (CDCI3) d 2,38 (s, 6H), 3,40-3,89 (m, omkring 800H, integral for stort til å være nøyaktig), 4,14 (m, 4H), 7,34 (d, J=8,2 Hz, 4H), 7,79 (d, J=8,2 Hz, 4H).
Forbindelse 26b - rDiazido- PEGgrjopl: 1,86 g (28,6 mmol) NaN3 ble tilsatt til en oppløsning av 10,8 g (1,3 mmol) av forbindelse 25b i 30 ml tørr DMF. Blandingen ble oppvarmet under N2 ved 120° i 2,5 timer. Når kald, ble blandingen skilt mellom 240 ml CH2CI2 og tre 50 ml porsjoner av 0,5 N HC1. CH2Cl2-laget ble vasket med 50 ml mettet NaCl oppløsning, tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert for å gi et faststoff. Rensing ved kromatografi på silikagel (gradient 2/98 til 6/94 MeOH/CH2Cl2) og rekrystallisering av det rensede produktet (MeOH/Et20) ga 6,95 (66 %) av forbindelse 26a som et hvitt faststoff: TLC (Rf = 0,33, 12/88 MeOH/CH2Cl2); <!>H NMR (CDCI3) 3,39-3,86 (m).
Forbindelse 27b - rDiamino- PEGgppnl: En oppløsning av 6,9 g (0,86 mmol) av forbindelse 26b i 150 ml MeOH mettet med ammoniakk ble spylt med nitrogen. 1,5 g 10 % Pd/C ble tilsatt og blandingen ble ristet under 448 kPa H2. Etter 20 timer indikerte TLC analyse at reaksjonen var ufullstendig. Som et resultat ble 200 mg 10 % Pd/C tilsatt og risting under 448 kPa H2 ble fortsatt ytterligere 20 timer. Blandingen ble filtrert gjennom diatomer jord og filtratet ble konsentrert under vakuum. Det resulterende voksaktige faststoffet ble rekrystallisert (MeOH/Et20) for å gi 6,0 g (89 %) av forbindelse 27b som et hvitt faststoff: <!>H NMR (CDCI3) d 2,96 (t, J=5,l Hz, 4H), 3,40-3,89 (m, omkring 700H, integral for stort til å være nøyaktig).
Forbindelse 29b: 221 mg (2,63 mmol) NaHCC>3 ble tilsatt til en oppløsning av 3,0 g (0,375 mmol) av forbindelse 27b i 10 ml vann og 3 ml dioksan. 1,3 g (1,51 mmol) av forbindelse 28 oppløst i 10 ml dioksan ble så tilsatt. Blandingen ble omrørt i 24 timer og så ble 40 ml 0,5 N HC1 tilsatt. Blandingen ble ekstrahert med fire 25 ml porsjoner CH2C12. De sammenslåtte CH2Cl2-lagene ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert til en olje. Krystallisering fra MeOH/Et20 ga 2,0 g (58 %) av forbindelse 29b: <l>H NMR (CDCI3) d 2,52 (m, 8H), 3,40-3,64 (m, omkring 700H, integral for stort til å være nøyaktig), 3,89 (s, 4H), 4,02 (s, 4H), 5,09 (s, 8H), 7,35 (s, 20H).
Forbindelse 38b: 123 mg 10 % Pd/C ble tilsatt til en oppløsning av 600 mg (0,063 mmol) av forbindelse 29b i 5 ml absolutt EtOH og 2,5 ml cykloheksen under nitrogen. Denne blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling under nitrogen i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom diatomer jord og avdampet for å gi 549 mg (97 %) av forbindelse 38b som et hvitt faststoff: <l>H NMR (CDCI3) d 2,58 (m, 8H), 2,90 (m, 8H), 3,39-3,70 (m, omkring 700H, integral for stort til å være nøyaktig), 4,05 (s, 4H),4,15(s,4H).
Forbindelse 30b: 100 mg (1,2 mmol) NaHC03 fulgt av 84 mg (0,32 mmol) av forbindelse 10 ble tilsatt til en oppløsning av 529 mg (0,059 mmol) av forbindelse 38b i 2 ml dioksan og 5 ml vann. Etter omrøring i 12 timer ble reaksjonsblandingen surgjort med IN H2SO4 og ekstrahert med fire 40 ml porsjoner CHCI3. De sammenslåtte CHCl3-lagene ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi 503 mg halvfast rest. Resten ble renset ved kromatografi på G-I0 Sephadex (MeOH) og krystallisert (MeOH/Et20/heksan) for å gi 215 mg (39 %) av forbindelse 30b som et hvitt faststoff: <l>H NMR (CDCI3) d 2,58 (m, 8H), 3,35-3,70 (m, omkring 700H, integral for stort til å være nøyaktig), 3,89 (s, 8H), 4,01 (s, 4H), 4,16 (s, 4H); bromacetyl bestemmelse ( European Journal of Biochemistrv 1984, 140. 63-71): Beregnet, 0,42 mmol/g; funnet 0,27 mmol/g.
Forbindelse 31 - rPEG335 Q- bis- klorformatl: To dråper tørr pyridin, fulgt av 125 mg (0,418 mmol) trifosgen, ble tilsatt til en oppløsning av 1,0 g (0,249 mmol) polyetylenglykol (J.T. Baker, gjennomsnittlig molekylvekt 3350 g pr. mol) som hadde blitt tørket ved azeotrop destillasjon (toluen) i 12 ml CH2CI2. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 20 timer og oppløsningsmidlet ble avdampet under vakuum for å gi 1,0 g (100 %) av forbindelse 31 som et hvitt faststoff: ^HNMR (CDCI3) d 3,40-3,65 (m, omkring 300H, integral for stort til å være nøyaktig), 3,77 (m, 4H), 4,46 (m, 4H). Forbindelse 32: En oppløsning av 1,0 g (0,25 mmol) av forbindelse 31 i 12 ml 5:1 CH2Cl2/dioksan ble tilsatt dråpevis til en 50° oppløsning av 600 mg (1,0 mmol) av forbindelse 18 i 10 ml dioksan og 1,5 ml pyridin. Den resulterende uklare oppløsningen ble omrørt i 72 timer. 25 ml CH2Cl2 ble tilsatt og blandingen ble så filtrert. Filtratet ble avdampet og den halvfaste resten ble renset ved kromatografi på G-I0 Sephadex. Det resulterende faststoffet ble krystallisert (CH2Cl2/Et20) for å gi 829 mg (75 %) av forbindelse 32 som et svakt gult faststoff: <*>H NMR (CDCI3) d 1,30 (m, 8H), 1,40 (m, 8H), 1,61 (m, 8H), 2,18 (m, 8H), 3,17 (m, 8H), 3,40 (m, 16H), 3,62 (m, omkring 300H, integral for stort til å være nøyaktig), 4,15 (m, 4H), 5,07 (s, 8H)} 7,33 (rn, 20H).
Forbindelse 39: 100 mg 10 % Pd/C ble tilsatt til en oppløsning av 300 mg (0,065 mmol) av forbindelse 32 i 5 ml absolutt EtOH og 2 ml cykloheksen under nitrogen. Denne blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling under nitrogen i 2 timer. Blandingen ble avdampet gjennom diatomer jord og oppløsningsmidlet avdampet for å gi 237 mg (90 %) av forbindelse 39 som et hvitt faststoff: <*>H NMR (CDCI3) d 1,37 (m, 8H), 1,48 (m, 8H), 1,65 (m, 8H), 2,21 (m, 8H), 2,50 (m, 8H), 3,39 (m, 16H), 3,64 (m, omkring 300H, integral for stort til å være nøyaktig), 4,19 (m, 4H).
Forbindelse 33: 125 mg (0,67 mmol) NaHC03 og 115 mg (0,44 mmol) av forbindelse 10 ble tilsatt til en oppløsning av 225 mg (0,055 mmol) av 39 i 5 ml dioksan og 5 ml vann. Den resulterende gule oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 12 timer. Oppløsningen ble så ekstrahert med tre 30 ml porsjoner CH2Cl2. Det vandige laget ble surgjort med IN H2SO4 og ekstrahert med tre 30 ml porsjoner CH2CI2. De sammenslåtte CH2Cl2-lagene ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi en gul olje. Rensing ved kromatografi på G-10 Sephadex (MeOH) og rekrystallisering av den resulterende oljen (EtOH/Et20) ga 182 mg (73 %) av forbindelse 33 som et hvitt faststoff: <!>h NMR (CDCI3) d 1,35 (m, 8H), 1,55 (m, 8H), 1,65 (m, 8H), 2,22 (m, 8H), 3,28 (m, 8H), 3,42 (m, 16H), 3,50-364 (m, omkring 300H, integral for stort til åvære nøyaktig), 3,87 (s, 8H), 4,18 (m, 4H); bromacetyl bestemmelse ( European Journal of Biochemistr<y> 1984, 140, 63-71): Beregnet, 0,87 mmol/g; funnet, 0,73 mmol/g. Analytisk beregnet for Cioir^OgyNioBr^ C, 50,84; H, 8,33; N, 3,09; Br, 7,05. Funnet: C, 51,98; H, 8,34; N, 2,45; Br, 10,19.
Forbindelse 40 - K- nitrofenyljodacetat]: 5,15 g (25 mmol) dicykloheksylkarbodiimid og 2,92 g (2,92 mmol) 4-nitrofenol i 100 ml EtOAc ble tilsatt til en 0° oppløsning av 3,72 g (20 mmol) jodeddiksyre. Blandingen ble omrørt ved 0° i 1 time og ved romtemperatur i 2 timer. Faststoffet ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble konsentrert under vakuum. Det resulterende gule faststoffet ble rekrystallisert (EtOAc/heksan/spor HOAc) for å gi 4,82 g (78 %) av forbindelse 40 som et gulbrunt faststoff: <!>H NMR (CDC13) d 4,00 (s, 2H), 7,39 (d, 2H), 8,40 (m, 2H).
Forbindelse 41: 103 mg (1,22 mmol) NaHC03, fulgt av 211 mg (0,692 mmol) av forbindelse 40 ble tilsatt til en oppløsning av 110 mg (0,104 mmol) av forbindelse 34 i 5 ml dioksan og 5 ml H2O. Blandingen ble omrørt i 18 timer og så konsentrert under vakuum. Rensing ved kromatografi på Sephadex (MeOH) ga 140 mg (87 %) av forbindelse 41 som en olje. Et analytisk prøve ble fremstilt ved preparativ HPLC (Ci8, gradient 20/80/0,1 til 25/75/0,1 CH3CN/H20/TFA i 60 minutter, 225 nm): <l>HNMR (CDCI3) d 2,59 (m, 4H), 2,65 (m, 4H), 3,44-3,62 (m, 60H), 3,77 (s, 4H), 3,78 (s, 4H), 4,02 (s, 4H), 4,21 (s, 4H).
Forbindelse 42: 145 mg (0,935 mmol) N-metoksykarbonylmaleimid ble tilsatt under kraftig omrøring til en oppløsning av 171 mg (0,161 mmol) av forbindelse 34 i 8 ml dioksan, 2 ml mettet NaHC03 oppløsning og 2 ml H20 ved 0° ( The Practice of Pe<p>tide Synthesis. M. Bodansky og A. Bodansky, Springer-Verlag, New York, 1984, side 29-31. Keller, O., Rudinger, J. Heiv. Chim. Acta 1975, 58, 531.) Etter 15 minutter ble 25 ml dioksan tilsatt, avkjølingsbadet fjernet, og omrøringen fortsatte i 45 minutter ved romtemperatur. Blandingen ble ekstrahert med to 30 ml porsjoner CHCI3 og de sammenslåtte CHCl3-lagene ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert til en olje. Rensing ved kromatografi på G-I0 Sephadex (MeOH) ga 103 mg (45 %) av forbindelse 42 som en olje. En analytisk prøve ble fremstilt ved preparativ HPLC (Ci8, gradient 20/80/0,1 til 25/75/0,1 CH3CN/H2O/TFA i 65 minutter, 225 nm) for å gi en olje: <l>R NMR (CDCI3) d 2,57 (m, 4H), 2,67 (m, 4H), 3,42-3,65 (m, 52H), 3,72 (m, 8H), 4,03 (s, 4H), 4,17 (s, 4H), 6,74 (s, 4H), 6,75 (s, 4H).
Forbindelse 43 - [ Hydroksymetyl- tris- f2- cvanoetoksvmetyl) metan]: 0,30 g (5,41 mmol) KOH, fulgt av 23 ml (18,6 g, 350 mmol) akrylonitril, ble tilsatt til en oppløsning av 6,8 g (50 mmol) pentaerytritol i 50 ml H2O. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer, surgjort med 1,5 ml konsentrert HC1 oppløsning og ekstrahert med to 50 ml porsjoner CH2CI2. De sammenslåtte CH2Cl2-lagene ble tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi 16,97 g væske. Rensing ved kromatografi på silikagel (EtOAc) ga 8,49 g (51 %) av forbindelse 43 som en viskøs olje: TLC, Rf = 0,15 (EtOAc); <!>H NMR (CDCI3) d 2,62 (t, 6H), 3,54 (s, 6H), 3,68 (t, 6H), 3,70 (s, 2H).
Forbindelse 44 - [ Hydroksymetvl- tris-( 2- karboksymetvletoksymetvB metan: 78 ml av en mettet oppløsning av HC1 i MeOH ble tilsatt til 5,45 g (15,6 mmol) av forbindelse 43. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 1 time og, når kald, skilt mellom 100 ml H2O og fire 100 ml porsjoner Et20. De sammenslåtte Et20-lagene ble vasket suksessivt med 100 ml mettet NaHC03 oppløsning og 100 ml mettet NaCl oppløsning, tørket (MgSOij), filtrert og konsentrert for å gi 4,74 g viskøs olje. Rensing ved kromatografi på silikagel ga 3,05 g (50 %) av forbindelse 44 som en olje: TLC, Rf= 0,27 (80/20 EtOAc/heksan); ^H NMR (CDCI3) d 2,58 (t, 6H), 3,43 (s, 6H), 3,61 (s, 2H), 3,69 (t, 6H), 3,70 (s, 9H); <13>C NMR (CDCI3) d 34,8,44,9, 51,6,65,2, 66,9, 71,0,
172,1.
Forbindelse 45: En blanding av 560 mg (1,4 mmol) av forbindelse 44 og 1,69 g (6,0 mmol) av forbindelse 4 ble oppvarmet under nitrogen ved 150° i 4 timer. Blandingen ble skilt mellom 50 ml EtOAc og 25 ml IN HC1, og HCl-laget ble ekstrahert med 25 ml CH2CI2. Sammenslåtte EtOAc og CH2C12 ekstrakter ble vasket med mettet NaHC03 oppløsning, tørket (K2CO3), filtrert og konsentrert til en viskøs rest. Rensing ved kromatografi på silikagel (gradient 95/5 til 90/10 CH2Cl2/MeOH) ga 300 mg (19 %) av forbindelse 45 som en viskøs olje: TLC, Rf = 0,24 (90/10 CH2Cl2/MeOH); <1>h NMR (CDCI3) d 2,40 (t, 6H), 3,38 (s, 6H), 3,39-3,48 (m, 12H), 3,52-3,67 (m, 32H), 5,13 (s, 6H), 5,62 (bd s, 3H), 6,80 (bd s, 3H), 7,40 (s, 15H).
Forbindelse 46: 104 mg av 10 % Pd/C ble tilsatt til en oppløsning av 308 mg (0,269 mmol) av forbindelse 45 i 10,4 ml EtOH og 5,2 ml cykloheksen under nitrogen. En tilbakeløpskjøler ble forbundet og blandingen ble oppvarmet i et 85° oljebad i 1,5 time. Når kald, ble blandingen filtrert gjennom diatomer jord og filtratet ble konsentrert for å gi 177 mg rest. Resten ble delvis oppløst i 5,98 ml dioksan. Den resulterende blandingen ble tilsatt til 386 mg (1,49 mmol) av forbindelse 10 fulgt av en oppløsning av 251 mg (2,99 mol) NaHC03 i 3,99 ml H2O. Den resulterende blandingen ble omrørt under nitrogen i 18 timer og skilt mellom 25 ml IN HC1 og tre 25 ml porsjoner CH2C12- Den vandige fasen ble ekstrahert med tre 25 ml porsjoner 3/1 CH2Cl2/MeOH og tre 25 ml porsjoner 1/1 CH2Cl2/MeOH. De første to CH2CI2 ekstraktene ble kastet og de gjenværende ekstraktene ble slått sammen, tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert for å gi 102 mg av en viskøs olje. Rensing ved HPLC ( C\g, 23/77/0,1 CH3CN/H2O/CF3CO2H, 234 nm deteksjon) ga 43 mg (14 %) av forbindelse 46 som en viskøs olje: <l>H NMR (CDCI3) d 2,48 (t, 6H), 3,40 (s, 6H), 3,44-3,54 (m, 14H), 3,56-3,62 (m, 12H), 3,63 (s, 12H), 3,67 (t, 6H), 3,91 (s, 6H), 6,90 (t, 3H), 7,10 (t, 3H); MS (FAB) m/e (relativ intensitet) MH<+> [1103(17), 1105(42), 1107(41), 1109(18)], MNa<+>
[1125(38), 1127(100), 1129(99), 1131(39)].
Forbindelse 47 - S-( 6- hvdroksvheksvl) isotiuroniumk1orid:
11,1 g (146 mmol) tiourea ble tilsatt til en oppløsning av 16,6 ml (20,0 g, 146 mmol) 6-klorheksanol i 49 ml etanol og blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 24 timer. Blandingen ble avkjølt til 0° og produktet ble krystallisert. Krystallene ble oppsamlet ved vakummfiltrering og tørket for å gi 28,4 g (92 %) av forbindelse 47 som et hvitt faststoff: smp. 122-124°; <*>H-NMR (DMSO) 1,40 (m, 4H), 1,65 (m, 2H), 3,21 (t, 2H), 3,41 (t, 2H), 9,27 og 9,33 (overlappende brede singleter, 4H); analytisk beregnet for C7H17CIN2OS: C, 39,51; H, 8,06; N, 13,17; S, 15,07. Funnet: C, 39,69; H, 8,00; N, 13,01; S, 15,16.
Forbindelse 48 - 6- merkaptoheksan- l- ol: 9,25 g NaOH pellets ble tilsatt til en oppløsning av 17,8 mg (83,6 mmol) av forbindelse 47 i 120 ml H2O og 120 ml EtOH. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 4 timer. Blandingen ble forsiktig konsentrert til omkring 75 ml og konsentratet ble renset ved vakuumdestillasjon for å gi 7,4 g (66 %) av forbindelse 48: kokepunkt 95-105° @ 5 mm Hg; * H NMR (CDCI3) 1,41 (m, 9H), 2,59 (dt, 2H), 3,69 (t med underliggende bred s, 3H); <13>C NMR (CDCI3) d 24,5, 25,2,28,0, 32,5, 33,9, 62,7; analytisk beregnet for C6H14OS: C, 53,68, H, 10,51; S, 23,89. Funnet: C, 53,35; H, 10,72; S, 23,60.
Forbindelse 49 - Bis-( 6- hydroksvheksvl) disulfid: En oppløsning av 4,02 g (15,8 mmol) 12 i 90 ml MeOH ble tilsatt dråpevis over en periode på 10 minutter til en oppløsning av 4,26 g (31,7 mmol) av forbindelse 48 i 10 ml MeOH og 13,7 ml (9,97 g, 98,5 mmol) Et3N under N2 atmosfære og avkjølt i et isbad. Avkjølingsbadet ble fjernet og blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 4 timer. Blandingen ble konsentrert på rotasjonsfordamper og renset ved silikagel kromatografi (1:1 heksan/EtOAc) for å gi 3,12 g (73 %) av forbindelse 49 som et blekt gult faststoff: TLC Rf. 18 (1:1 heksan/EtOAc); smp. 38-48°; lU NMR (CDCI3) 1,15-2,20 (m, 16H), 2,73 (t, 4H), 3,70 (t, 4H); analytisk beregnet for C12H26S2O2: C, 54,09; H, 9,84; S, 24,06. Funnet: C, 54,85; H, 9,86; S, 24,11.
Forbindelse 50 - Mono- 0-( 4^ 4"- dimetoksytrifenvlmetvlVbis-( 6-hydroksyheksyBdisulfid: 3,97g(11,7mmol)4,4-dimetoksytrifenylmetylkloridble tilsatt til en oppløsning av 3,12 g (11,7 mmol) av forbindelse 49 og 45 ml pyridin. Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 16 timer. Det meste av pyridinet ble fjernet ved rotasjonsfordamping og resten ble skilt mellom 100 ml mettet NaHCC«3 oppløsning og 100 ml EtOAc. EtOAc-laget ble vasket med 50 ml mettet NaCl oppløsning, tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert til en olje. Rensing ved silikagel kromatografi (9:1 CJ^C^/EtOAc) ga 2,84 g (43 %) av forbindelse 50 som en viskøs olje: TLC Rf .35 (9:1 CH2Cl2/EtOAc); <*>H NMR (CDC13) 1,41 (m, 8H), 1,65 (m, 8H), 2,70 (to overlappende tripletter, 4H), 3,08 (t, 2H), 3,65 (t, 2H), 3,81 (s, 6H), 6,85 (d, 4H), 7,32 (m, 7H), 7,47 (d, 2H); HRMS (FAB, M+), beregnet for C33H4404S2: 568,2681.
Funnet: 568,2665.
Forbindelse 51 - 0- ri4-( 4,. 4"- dimetoksvtrifenvlmetoksv)- 7. 8- ditiotetradecvll- 0- f2-cvanoetvl)- N. N- diisopropylfosforamidit: 458 mg (1,52 mmol) 0-cyanoetyl-N,N,N',N'-tetra-isopropylfosfordiamidit i 0,5 ml CH2C12 ble tilsatt til en oppløsning av 771 mg (1,36 mmol) av forbindelse 50 og 116 mg (0,68 mmol) diisopropylammonium tetrazolid i 6,8 ml CH2CI2 under N2 atmosfære. Blandingen ble omrørt i 4 timer og skilt mellom 25 ml NaHC03 og 3 x 25 ml CH2CI2. De sammenslåtte CH2Cl2-lagene ble vasket med mettet NaCl oppløsning, tørket (Na2C03), filtret og konsentrert til en olje. Rensing ved filtrering gjennom en 5,1 cm (2") plugg av basisk alumina i en 25 mm kolonne, eluert med 9:1 CH2Cl2/Et3N ga 831 mg (80 %) av forbindelse 5J_ som en viskøs olje: <l>H NMR (CDCI3) d 1,25 (m, 12H), 1,45 (m, 8H), 1,70 (m, 8H), 2,72 (m, 6H), 3,09 (t, 2H), 3,65 (m, 4H), 3,87 (s, 6H)} 3,91 (m, 2H), 6,89 (d, 4H), 7,35 (m, 7H), 7,49 (d, 2H); <31>P NMR (CDCI3 med 15 % H3PO4 indre standard) 147,69; HRMS (FAB, MH+) beregnet for C42H62N205PS2 769,3839, funnet 769,3853.
Forbindelse 52 - Tritvl- HAD alkohol: 60 g (0,21 mol) tritylklorid ble tilsatt til en oppløsning av 57 g (0,21 mol) av forbindelse 49 og 60 ml pyridin. Denne blandingen ble omrørt ved 100°C i 19 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og filtrert. Filtratet ble fortynnet med 300 ml metylenklorid og ekstrahert ved 200 ml mettet natriumbikarbonat. Det organiske laget ble tørket over Na2S04, filtrert og konsentrert til en olje. Rensing ved silikagel kromatografi (gradient 9:1 heksan:etylacetat 3:1 heksanxtylacetat) ga 55 g av forbindelse 52 (50 %): <!>H NMR (CDCI3) _ 1,38 (m, 8H), 1,63 (m, 8H), 2,66 (m, 4H), 3,04 (t, 2H), 3,62 (t, 2H), 7,25 (m, 9H), 7,42 (m, 6H). HRMS (FAB, M+) beregnet for C31H40O2S 508,2470, funnet 508,2482.
Forbindelse 53 - Trit<y>l HAD fosforamidit: Til en oppløsning av 10 g (19,7 mmol) av forbindelse 52 og 6,3 ml (36,2 mmol) diisopropyletylamin i 90 ml metylenklorid ved 0°C under argon ble sakte tilsatt 4,5 ml (20,2 mmol) 2-cyanoetyl-N,N-diisopropylklorfosforamidit. Etter omrøring i 90 minutter ble reaksjonsblandingen ekstrahert to ganger med 100 ml mettet natriumbikarbonat. Metylenkloridoppløsningen ble tørket over Na2SC<4, filtrert og konsentrert til en olje. Rensing ved basisk alumina kromatografi (75:24:1, heksan:etylacetat:trietylamin) ga 11,3 g (81 %) av forbindelse 53 som en olje: <l>H NMR (CDCI3) _ 1,18 (m, 12H), 1,37 (m, 8H), 1,62 (m, 8H), 2,6 (m, 6H), 3,04 (t, 2H), 3,60 (m, 4H), 3,82 (m, 2H), 7,26 (m, 6H), 7,44 (m, 9H). HRMS (FAB, MH+) beregnet for C4oH58N203PS2 709,3626, funnet 709,3621.
Forbindelse 54 - 0-( tert- butyldimetvlsilvlV5- heksenol:
15,66 g (230 mmol) imidazol og 20,0 g (130 mmol) tert-butyldimetylsilylklorid ble tilsatt til en oppløsning av 12,47 ml (10,4 g, 104 mmol) 5-heksen-l-ol i 104 ml DMF. Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 4 timer og skilt mellom 200 ml EtOAc og 100 ml mettet NaHC03 oppløsning. EtOAc-laget ble vasket med 100 ml mettet NaHC03 oppløsning, 100 ml mettet NaCl oppløsning, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert til et volum på omkring 100 ml. Destillasjon under vakuum ga 70,07 g (90 %) av forbindelse 54: kp- 130-143° @ 100 mm Hg; <l>H NMR (CDCI3) 0,11 (s, 6H), 0,95 (s, 9H), 1,48 (m, 2H), 1,57 (m, 2H), 2,11 (dt, 2H), 3,66 (t, 2H), 5,03 (m, 2H), 5,86 (m, 1H); <13>c NMR (CDCI3) -5,25, 18,40,25,21, 26,01, 32,35,33,60,63,09,114,40, 138,92; analytisk beregnet for Ci2H260Si: C, 67,22; H, 12,22. Funnet: C, 66,96; H, 12,16.
Forbindelse 55 - l- 0- ftert- butvldimetvlsilvl)- 1. 5. 6- heksantriol: Til en oppløsning av 9,86 g (46,0 mmol) av forbindelse 54 i 92 ml aceton ble det tilsatt en oppløsning av 6,46 g (55,2 mmol) N-metylmorfoholinoksid i 23 ml H2O. Til blandingen ble det tilsatt 443 (il av en 2,5 % oppløsning av OSO4 i tert-butylalkohol (360 mg oppløsning, 9,0 mg OSO4, 35 umol) og 50 ul 30 % H2O2. Blandingen ble omrørt i 16 timer og en oppløsning av 474 mg natriumditionit i 14 ml H20 ble tilsatt. Etter ytterligere 0,5 time ble blandingen filtrert gjennom celitt. Filtratet ble tørket med MgS04 og filtrert gjennom 2,5 cm (1") silikagel i en 150 ml Buchner trakt ved anvendelse av 250 ml porsjoner EtOAc for åeluere. Fraksjoner inneholdende produkt ble konsentrert for å gi 11,0 g (96 %) av 55 som en viskøs olje: TLC Rf 0,2 (1:1 heksan/EtOAc); <]>H NMR (CDCI3) 0,05 (s, 6H), 0,89 (s, 9H), 1,25 (m, 4H), 1,55 (m, 2H), 3,41 (dd, 2H), 3,62 (t, 2H), 3,71 (m, 1H); <13>C NMR(CDC13) -5,23, 18,42,21,91,26,02, 32,68, 32,81,63,16, 66,74, 72,24; HRMS (FAB, MH+), beregnet for C^^oX^Si: 249,1886. Funnet: 249,1889.
Forbindelse 56 - 5. 6- fbis- 0- benzoyB- l- 0- ftert- butvldimetvlsilvl)- 1. 5. 6- heksantriol: 6,18 ml (7,48 g, 53,2 mmol) benzoylklorid ble tilsatt til en oppløsning av 5,29 g (21,3 mmol) av 55 i 106 ml pyridin. Blandingen ble omrørt i 18 timer og konsentrert på rotasjonsfordamper. Blandingen ble skilt mellom 100 ml kald IN HC1 og 100 ml EtOAc. pH til det vandige laget ble sjekket for å sikre at det var surt. EtOAc-Iaget ble vasket suksessivt med 100 ml H20 og 100 ml mettet NaCl, tørket (MgSOij), filtrert og konsentrert for å gi 10,33 g (99 %) av forbindelse 56 som en viskøs gul olje: TLC Rf 0,45 (1:4 EtOAc/heksan); <1>h NMR (CDCI3) d 0,05 (s, 6H), 0,88 (s, 9H), 1,59 (m, 4H), 1,85 (m, 2H), 3,14 (t, 2H), 4,49 (dd, 1H), 4,59 (dd, 1H), 5,54 (m, 1H), 7,45 (m, 4H), 7,58 (m, 2H), 8,05 (m, 4H).
Forbindelse 57 - 5. 6-( bis- 0- benzoviyi. 5. 6- heksantriol:
10,7 ml (10,7 mmol) IN tetrabutylammoniumfluorid i THF ble tilsatt til en oppløsning av 2,62 g (5,36 mmol) av forbindelse 56 i 10,9 ml THF. Blandingen ble omrørt i 16 timer. Blandingen ble skilt mellom 25 ml mettet NaHC03 oppløsning og 3 x 25 ml EtOAc. De sammenslåtte EtOAc-ekstraktene ble vasket med mettet NaCl oppløsning, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert til en viskøs olje som ble renset ved silikagel kromatografi (1:1 heksan/EtOAc) for å gi 823 mg (41 %) av forbindelse 57 som en viskøs olje; Rf 0,14 (1:1 heksan/EtOAc); <J>H NMR (CDCI3) d 1,58 (m, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 3,68 (t, 2H), 4,52 (dd, 1H), 4,62 (dd, 1H), 5,56 (m, 1H), 7,46 (m, 4H), 7,58 (m, 2H), 8,05 (m, 4H); <13>c NMR (CDCI3) d 22,08, 31,20, 31,30,32,88, 62,92,66,17, 72,63,128,93,130,19,130,57,133,62,166,72,166,86; HRMS (FAB MH+), beregnet for C20H23O5; 343,1545. Funnet: 343,1553.
Forbindelse 58 - Q- r5. 6- fbis- 0- benzoyloksy)- heksvll- 0- f2- cvanoetvl)- N. N-diiso<p>ropvlfosforamidit: En oppløsning av 989 mg (3,28 mmol) O-cyanoetyl-N}N,N^N'-tetraisopropylfosfordiamidit i 2,0 ml CH2CI2 ble tilsatt til en oppløsning av 1,02 g (2,98 mmol) av forbindelse 57 og 255 mg (1,49 mmol) diisopropylammonium tetrazolid (fremstilt ved blanding av acetonitriloppløsninger av diisopropylamin og tetrazol i et ett-til-ett molart forhold og konsentrering til et hvitt faststoff) i 14,9 ml CH2C12. Blandingen ble omrørt i 4 timer og så skilt mellom 25 ml CH2C12 og 25 ml avkjølt mettet NaHCC«3 oppløsning. Cr^Ctø-laget ble vasket med mettet NaCl oppløsning, tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert. Rensing ved filtrering gjennom en 5,1 cm (2") plugg basisk alumina i en 25 mm kolonne, eluering med 9:1 EtOAc/Et3N, ga 1,5 g (93%) av forbindelse 58 som en viskøs olje: <l>H NMR (CDCI3) d 1,19 (m, 12H), 1,62 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 1,90 (m, 2H), 2,62 (dd, 2H), 3,53-3,92 (m, 6H), 4,53 (dd, 1H), 4,62 (dd, 1H), 5,58 (m, 1H), 7,48 (m, 4H), 7,60 (m, 2H), 8,09 (m, 4H); <31>p NMR (CDCI3) med 15 % H3PO4 intern standard) d 148,2; HRMS (FAB, MH+), beregnet for C29H40O6N2P 543,2624. Funnet, 543,2619.
Forbindelse 59 - r4( iodacetamido) benzosyre: Denne forbindelsen ble fremstilt som beskrevet av Weltman, J.K., 1983 Biotechni<q>ues 1:148-152. Kort ble 708 mg (2,0 mmol) jodeddiksyre anhydrid tilsatt til en oppløsning av 137 mg (1,0 mmol) para-aminobenzosyre i 10 ml dioksan. Blandingen ble omrørt i mørke i 18 timer og skilt mellom 25 ml H2O og 25 ml EtOAc. EtOAc-laget ble vasket med mettet NaCl oppløsning, tørket (MgS04), filtrert og konsentrert for å gi 797 mg av ferskenfarget faststoff. Rekrystallisering fra heksan/EtOAc ga 221 mg (72 %) 4-(jodacetamido)benzosyre som et hvitt faststoff: smp. 220-230°; lK NMR (CDCI3) d 3,86 (s, 2H), 7,68 (d, 2H), 7,91 (d, 2H), 10,60 (s, 1H).
Forbindelse 60 - [ 4- f jodacetamidolbenzovlderivat av bis- fN- 2-aminoetylkarbamovDpolvetvlen<g>lvkol: 188 mg (0,909 mmol)
dicykloheksylkarbodiimid ble tilsatt til en oppløsning av 185 mg (0,606 mmol) 4-(jodacetamido)benzosyre og 406 mg (0,121 mmol) _,-bis-(N-2-aminoetylkarbamoyl)polyetylenglykol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., tørket ved azeotrop destillasjon med toluen) i 2 ml THF. Blandingen ble omrørt i 2 timer og så ble seks dråper eddiksyre tilsatt. 10 ml CH2CI2 ble tilsatt og blandingen ble holdt i en fryser i 30 minutter. Blandingen ble filtrert for åfjerne faststoff og filtratet ble konsentrert til en viskøs rest. Rensing ved silikagel kromatografi (gradient 99/1 til 96/4 CH2Cl2/MeOH) ga et faststoff som ble finfordelt med MeOH for å gi 292 mg av et kremfarget faststoff: <*>H (CDCI3) 3,48 (m, 8H), 3,63 (bd s, (CH2CH20)n, integral for stort til å integrere), 3,98 (s, 4H), 4,18 (bd m, 4H), 5,91 (bd m, 2H), 7,48 (bd m, 2H), 7,76 (d, 4H), 7,88 (d, 4H), 9,38 (bd m, 2H): jodacetyl bestemmelse f European Journal ofBiochemistrv 1984, 140,63-71): Beregnet, 0,46 mmol/g; funnet 0,37 mmol/g.
Eksempel 3
Fremstilling av aktiverte valensplattformmolekyler og konju<g>ater
Det er mange måter å danne konjugater av biologiske eller syntetiske molekyler og valensplattformmolekyler. En helt spesifikk metode anvender en tiol bundet til det biologiske eller syntetiske molekylet for å reagere nukleofilt med en reaktiv "tiofilisk" gruppe på valensplattformmolekylet for ådanne en tioeterbinding, men andre kombinasjoner av reaktive grupper på plattformmolekylet og på det biologiske eller syntetiske molekylet kan også bli benyttet for å binde biologiske eller syntetiske molekyler kovalent til et valensplattformmolekyl. Tabell 1 inneholder et antall kombinasjoner av gjensidig reaktive grupper. Preferansen av en gitt fremgangsmåte er bestemt av naturen til det biologiske eller syntetiske molekylet (oppløselighet, nærvær av andre reaktive grupper, osv.).
De følgende eksempler illustrerer hvordan forskjellige valensplattformmolekyler kan bli syntetisert og konjugert med biologiske eller syntetiske molekyler. Disse eksemplene viser hvordan peptider og oligonukleotider kan bli konjugert til valensplattformmolekyler ved anvendelse av noen av de gjensidig reaktive gruppene i Tabell 1.1 tillegg til peptider og oligonukleotider kan andre biologisk aktive molekyler (proteiner, medikamenter, osv.) også bli konjugert til valensplattformmolekyler.
Kombi nas . ion 1: Tiol på plattform - Tiofil på ligand Reaks. 1onssk. 1ema 14
Forbindelse A: Forbindelse 36 (861 mg, 1,0 mmol) og 252 mg (3,0 mmol) NaHCC>3 blir oppløst i 20 ml 1/1 dioksan/FtøO. Blandingen blir avkjølt til 0°, og en oppløsning av 1,16 g (5,0 mmol) N-succinimidyl-S-acetyltioacetat (Prochem Inc.) i 40 ml dioksan blir tilsatt til den omrørte blandingen. Etter 1 time blir blandingen ekstrahert med CH2CI2. De sammenslåtte ekstraktene blir tørket (MgSC>4), filtrert og konsentrert. Råproduktet blir renset ved silikagel kromatografi for å gi A.
Forbindelse B - Plattform med fire tiol<g>rupper. En oppløsning av 732 mg (0,55 mmol) A i 7,3 ml DMSO blir tilsatt til 55 ml heliumgjennomboblet pH 10,100 mM natriumkarbonat, 10 mM NH2OH buffer. Blandingen blir holdt under N2 og omrørt i 1 time for åoppnå en omkring 10 nM oppløsning av tetra-tiol plattform B.
Forbindelse X - Bromacet<y>lert peptid: Et peptid blir syntetisert med standard fast fase metoder på en Wang (p-alkoksybenzyl) resin ved anvendelse av FMOC kjemi. FMOC beskyttede aminogrupper blir tilsatt sekvensielt til aminoterminalen. Det endelige trinnet omfatter kobling av N-bromacetylaminokaproinsyre. De beskyttende gruppene blir fjernet, og peptidet blir fjernet fra resinen med trifluoreddiksyre for å gi X som blir renset ved preparativ reversfase HPLC.
Peptid - Plattformkonjugat. C. Til en omkring 10 mmol oppløsning av tetratiol plattform B, i pH 10 buffer, blir det tilsatt et overskudd av en oppløsning av bromacetylert peptid, X, i DMSO. Peptidkonjugatet, C, blir renset ved preparativ reversfase HPLC.
Kombinasjon 2: Amin på plattform - Aktivert karboksylat på peptid
Reaksionsskiema 15
Forbindelse Y - Peptid med aktivert karboksylat. Et peptid blir syntetisert med standard fastfase metoder på en Wang (p-alkoksybenzyl) resin, ved anvendelse av TFA stabile beskyttende grupper (benzylester på karboksylgrupper og CBZ på aminogrupper). Aminosyrerester blir tilsatt sekvensielt til aminoterminalen. Peptidet blir fjernet fra resinen med TFA for å gi et peptid med en fri karboksylgruppe på karboksyterminalen og alle de andre karboksylene og aminene blokkert. Det beskyttede peptid, Y, blir renset ved reversfase HPLC.
Peptid - Plattformkoniu<g>at. D. Forbindelse Y (0,3 mmol) blir oppløst i 1 ml DMF, og til oppløsningen blir det tilsatt 0,3 mmol diisopropylkarbodiimid og 0,3 mmol HOBT. Oppløsningen blir tilsatt til en oppløsning av 0,025 mmol tetraamino plattform, 36, i 1 ml DMF. Når fullstendig, blir DMF fjernet under vakuum for ågi et rått fullstendig beskyttet konjugat. Konjugatet blir oppløst i MeOH, og oppløsningen blir plassert i et Parr hydrogeneringsapparat med 100 mg 10 % Pd/C pr. gram konjugat. Blandingen blir ristet under 414 kPa H2, og det beskyttede konjugatet, D, blir renset ved preparativ reversfase HPLC.
Kombinasjon 3: Amin på plattform - Aldeh<y>d på oligonukleotid
Reaksjonssk jerna 16
Oligonukleotid - Plattformkonjugat. E. En 500 ul mengde (100 umol) av en 200 mM oppløsning av NaI04 blir tilsatt til en oppløsning av 1,0 g (400 mg i full lengde, 25 umol) ACT-modifisert (CA)25 i 19,5 ml H20 ved 0° i mørke. Blandingen blir holdt ved 0° i 40 minutter, og 50 ml EtOH blir tilsatt. Blandingen blir holdt ved -20° i 30 minutter og sentrifugert i 5 minutter ved 2000 omdr/min. Supematanten blir kastet, og pelleten blir tørket under vakuum. Pelleten blir oppløst i 3,3 ml H20, og til den resulterende oppløsning blir det tilsatt en oppløsning av 4,3 mg (0,005 mmol) 36 i 2,0 ml med pH 8,0 100 mM natriumborat. Til den resulterende oppløsningen blir det tilsatt 250 ul (50 umol) av en 200 mM oppløsning av pyridin-boran kompleks i MeOH, og blandingen blir holdt ved 37° i 4 dager. Konjugatet, E, kan bli renset ved ionbytte kromatografi.
Kombinasjon 4: Aktivert karboksvlat på plattform - Amin på ligand Reaksionsskiema 17
Forbindelse F - Plattform med fire karboksvlsvregrupper.
Ravsyre anhydrid (1,0 g, 10 mmol) blir tilsatt til en oppløsning av 861 mg (1,0 mmol) 36 og 252 mg (3,0 mmol) NaHC03 i 20 ml 1/1 dioksan/H20, og blandingen blir omrørt i 16 timer ved romtemperatur. Blandingen blir surgjort med IN HC1 og konsentrert. Konsentratet blir renset ved silikagel kromatografi for å gi F.
Forbindelse G - Plattform med fire N- succinimidvlestere.
En oppløsning av 126 mg (0,1 mmol) F og 46 mg (0,4 mmol) N-succinimidyl i 5 ml vannfri THF blir fremstilt. Blandingen blir avkjølt til 0° og 103 mg (0,5 mmol) dicykloheksylkarbodiimid blir tilsatt. Blandingen blir omrørt mens den far komme til romtemperatur over flere timer. Faststoffene blir fjernet ved filtrering, og filtratet blir konsentrert for ågi G som kan bli renset ved silikagel kromatografi.
Forbindelse Z - Peptid med aminogruppe. Et peptid blir syntetisert med standard fastfase metoder på en Wang (p-alkoksybenzyl) resin. Lysin _-aminer er beskyttet som CBZ grupper. Aminosyrerester blir tilsatt sekvensielt til aminoterminalen ved anvendelse av FMOC kjemi. Den siste resten er N-FMOC-aminokaproinsyre. Etter spalting fra harpiksen med trifluoreddiksyre blir FMOC gruppen fjernet med piperidin for ågi et peptid med en fri amin-linker. Peptidet, Z, blir renset ved reversfase HPLC.
Peptid - Plattformkonjugat. H. En oppløsning av 0,05 mmol Z og 0,1 mmol Et3N i 1 ml DMF blir fremstilt. Til oppløsningen blir det tilsatt en oppløsning av 16,5 mg (0,01 mmol) G i 1 ml DMF. Blandingen blir omrørt inntil reaksjonen er fullstendig. For åfjeme beskyttende grupper, blir konjugatet oppløst i MeOH, og oppløsningen blir plassert i et Parr hydrogeneringsapparat med 100 mg 10 % Pd/C pr. gram konjugat. Blandingen blir ristet under 414 kPa H2, og det beskyttede konjugat, H, blir renset ved preparativ reversfase HPLC.
Kombinasjon 5: Isotiocvanat på plattform - Amin på ligand
Forbindelse 1 - Plattform med fire isotiocyanater.
Tiofosgen (381 ul, 575 mg, 5,0 mmol) blir tilsatt til en oppløsning av 861 mg (1,0 mmol) 36 i 10 ml THF, og blandingen blir omrørt ved romtemperatur inntil den er fullstendig ifølge TLC. Blandingen blir skilt mellom metylenklorid og en oppløsning av 5 % NaHC03. Ekstraktene blir tørket (MgS04), filtrert og konsentrert. Produktet, I, blir renset ved silikagel kromatografi.
Peptid - Plattformkonjugat. J. En oppløsning av 0,05 mmol Z og 0,1 mmol Et3N i 1 ml DMF blir fremstilt. Til oppløsningen blir det tilsatt en oppløsning av 10,3 mg (0,01 mmol) I i 1 ml DMF. Blandingen blir omrørt inntil reaksjonen er fullstendig. For åfjeme beskyttende grupper, blir konjugatet oppløst i MeOH, og oppløsningen blir plassert i et Parr hydrogeneirngsapparat med 100 mg 10 % Pd/C pr. gram konjugat. Blandingen blir ristet under 414 kPa H2, og det avbeskyttede konjugatet, J, blir renset ved preparativ reversfase HPLC.
Kombinasjon 6: Kloroformat på plattform - Amin på ligand Reaksjonsskiema 19
Forbindelse K - Plattform med fire h<y>droksvl<g>rupper. En oppløsning av 205 ul (275 mg, 1 mmol) trietylenglykol bis-kloroformat i 5 ml CH2CI2 blir tilsatt til en oppløsning av 497 ul (525 mg, 5 mmol) dietanolamin og 696 ul (506 mg, 5 mmol) Et3N i 5 ml CH2Cl2 ved 0°. Blandingen blir oppvarmet til romtemperatur og omrørt inntil fullstendig ifølge TLC. Blandingen blir konsentrert og produktet, K, blir isolert ved silikagel kromatografi.
Forbindelse L - Plattform med kloroformaterupper.
Pyridin (100 ul) fulgt av 1,19 g (4 mmol) trifosgen blir tilsatt til en oppløsning av 412 mg (1 mmol) K i 20 ml CH2CI2. Blandingen blir omrørt ved romtemperatur i 20 timer, og oppløsningsmidlet blir avdampet under vakuum for å gi forbindelse L.
Peptid - Plattformkonju<g>at, M. En oppløsning av 1 mmol Z i 10 ml pyridin blir tilsatt til en oppløsning av 132 mg (0,2 mmol) L i 5 ml 1/1 THF/pyridin. Blandingen blir omrørt inntil reaksjonen er fullstendig. Oppløsningsmidler blir fjernet under vakuum. For åfjerne beskyttende grupper, blir konjugatet oppløst i MeOH, og oppløsningen blir plassert i et Parr hydrogeneringsapparat med 100 mg 10 % Pd/C pr. gram konjugat. Blandingen blir ristet under 414 kPa H2, og det avbeskyttede konjugatet, M, blir renset ved preparativ reversfase HPLC.
Eksempel 4
Syntese av konjugater omfattende to forskjellige biologiske molek<y>ler
Det kan være nyttig å konjugere mer enn en type biologisk aktiv gruppe til et plattformmolekyl. Dette eksemplet beskriver fremstillingen av en plattform inneholdende to maleimidgrupper, som reagerer med et tiol-inneholdende peptid, og to aktiverte estergrupper, som reagerer med et medikament inneholdende et friamin. Det resulterende konjugatet inneholder to peptider og to medikamentmolekyler som vist i Skjema 20.
Fremstilling av heteroaktivert valensplattformmolekyl, benz<y>l 6- aminokaproattosylat salt. K: En blanding av 32 mmol 6-aminokaproinsyre, 51 mmol p-toluensulfonsyre, og 40 mmol benzylalkohol i 60 ml toluen blir oppvarmet med tilbakeløpskjøling ved anvendelse av en Dean-Stark felle for å fjerne vann. Når reaksjonen er fullstendig, blir blandingen avkjølt, og produktet blir utfelt. Faststoffet blir oppsamlet ved filtrering og rekrystallisert fra EtOH/Et20 for å gi forbindelse K.
Forbindelse L: Dicykloheksylkarbodiimid (2 ekvalenter) blir tilsatt til en oppløsning av 1 ekvalent av forbindelse 5 og 2 ekvalenter av N-hydroksysuccinimid i THF. Blandingen blir omrørt i 4 timer og 2,2 ekvalenter av forbindelse K blir tilsatt. Blandingen blir omrørt inntil reaksjonen er fullstendig ifølge TLC. Blandingen blir filtrert og konsentrert. Produktet blir renset ved silikagel kromatografi.
Forbindelse M: Forbindelse L blir behandlet med trifluoreddiksyre i CH2CI2- Når reaksjonen er fullstendig, blir blandingen konsentrert under vakuum for å gi forbindelse M som trifluoracetatsaltet.
Forbindelse N: Forbindelse 6 (Skjema 2) blir behandlet med trifluoreddiksyre i CH2C12- Når reaksjonen er fullstendig, blir blandingen konsentrert under vakuum for å gi forbindelse N som trifluoracetatsaltet.
Forbindelse O: 3,2 mmol trietylenglykol bis-kloroformat blir tilsatt til en oppløsning av 4 mmol av forbindelse M og 4 mmol av forbindelse Ni 162 ml pyridin i et 20° vannbad. Blandingen blir omrørt inntil fullstendig ved TLC og konsentrert under vakuum. Konsentratet blir oppløst i CH2CI2 og vasket i rekkefølge med IN HCL oppløsning, 5 % NaHCC«3 oppløsning og mettet NaCl oppløsning. CH2Cl2-laget blir tørket (MgS04), filtrert og konsentrert. Konsentratet blir oppløst i 10 ml EtOH og 10 ml IM NaOH blir tilsatt. Blandingen blir omrørt i flere timer, inntil det ikke synes åskje noen ytterligere reaksjon ifølge TLC. Blandingen blir surgjort til pH 1 med IN HC1 og ekstrahert med CH2CI2. CH2Cl2-laget blir tørket (MgS04), filtrert og konsentrert. Produktet, O, blir isolert ved silikagel kromatografi.
Forbindelse P: Forbindelse O blir oppløst i EtOH og hydrogenert i en Parr rister med 100 mg 10 % palladium på karbon pr. gram O. Reaksjonen blir overvåket ved hjelp av TLC. Når reaksjonen er fullstendig, blir katalysatoren fjernet ved filtrering, og blandingen blir konsentrert for ågi forbindelse P.
Forbindelse O: 3 mmol N-metoksykarbonylmaleimid blir tilsatt til en oppløsning av 1 mmol forbindelse P i 20 ml dioksan og 5 ml mettet NaHC03 ved 0°. Blandingen blir omrørt i en time, surgjort med IN HC1 og ekstrahert med CH2CI2. CH2Cl2*laget blir tørket (MgS04), filtrert og konsentrert, og produktet blir renset ved silikagel kromatografi for å gi O.
Forbindelse R: 2 mmol DCC blir tilsatt til en oppløsning av 1 mmol O og 2 mmol p-nitrofenol i CH2CI2 og blandingen blir omrørt i 16 timer. Faststoffet blir fjernet ved filtrering, og filtratet blir konsentrert og renset ved silikagel kromatografi for å gi R.
Konjugat med to peptider og to medikamentmolekvler. forbindelse S: Et overskudd av to ekvalenter av tiol-inneholdende peptid blir tilsatt til en oppløsning av 1 ekvalent av heteroaktivert plattform, R, i pH 7,5 fosfatbuffer. Blandingen blir omrørt i 1 time, og overskudd av to ekvalenter av amin-inneholdende medikament blir tilsatt. Konjugatet, S, blir isolert ved reversfase HPLC eller ionbytte kromatografi eller en kombinasjon av begge.
Eksempel 5
Syntese oe test av konjugatet 3- II
Reaksjonsskiema 21
Fremstilling av DMTr- 5'- modifisert ( CA)in
Polynukleotidet d-[DMTr-(bzCp (CE) bzA)i0] ble fremstilt på en Milligen 8800 Prep Scale DNA syntetisator (se Figur 6A) ifølge produsentens protokoll for DNA fosforamiditsyntese. Syntesen ble utført på 10 g DMTr-d-bza-CPG støtte med en nukleosidlast på 30,0 umol/g. Den endelige DMTr blokkerende gruppen ble fjernet ved anvendelse av maskinprotokollen. Milligen aktivatoroppløsning, katalog nr. MBS 5040 (45 ml) og 0,385 g av forbindelse 51 (se Reaksjonsskjema 11) ble tilsatt reaksjonen og suspensjonen ble blandet i 8 minutter ved argonsprudling. Blandingen ble oksidert ved vanlig maskinprotokoll og det støttebundne polynukleotidet ble oppsamlet ved filtrering, lufttørket og behandlet med 100 ml konsentrert ammoniakk i 16 timer ved 55°C. Når kald, ble blandingen filtrert gjennom et Gelman 10u polypropylenfilter. Filteret ble vasket med 200 ml 2 mM NaCl justert til pH 12 med NaOH. Filtratet ble så satt på en Amicon kromatografikolonne (0,45 x 9,4 cm, 150 ml) som hadde blitt pakket med Q-Sepharose (Pharmacia) ekvilibrert først med 3M NaCl og så med 2 mM NaCl, pH 12. Kolonnen ble eluert med 500 ml av en lineær gradient (2 mM NaCl, pH 12 til ml 1,3 M NaCl, pH 12), så vasket med 1,3 M MaCl, pH 12 inntil alt UV-absorberende materiale var borte. Fraksjoner som absorberte ved 260 nm ble ytterligere analysert ved polyakrylamid elektroforese og de inneholdende rent produkt ble oppsamlet. Det oppsamlede (120 ml) ble behandlet med 240 ml kald isopropanol og lagret i 30 minutter ved -20°C. Utfellingen ble oppsamlet ved sentrifugering i en Sorvall RC 3B sentrifuge ved anvendelse av en modell H-600A rotor i 15 minutter ved 3000 omdr/min og 4°C for å gi DMTr-5'-modifisert (CA)iq (14946 A26O enheter, 498 mg, 62,2 uM, 20 % basert på 300 umol CPG nukleosid.)
Syntese av en Tr- 5'- modifisert ( CA)in
Reaksjonsskjema 22
Syntesen av Tr-5'-modifisert (CA)i 0 ble utført som beskrevet ovenfor for syntese av DMTr-5'-modifisert (CA)iø (fremstilt som beskrevet i Reaksjonsskjema 11) ved å benytte forbindelse 53 i stedet for forbindelse 51.
Konjugering av DMTr- 5' modifisert polynukleotider til forbindelse 3 ( IA- DABA- PEG.
Reaksjonsskjema 11 - Fremstilling av konjugat 3- 1
I konjugeringsprosedyren som følger ble alle de benyttede oppløsningene og bufferne grundig gjennomboblet med helium og alle reaksjonskar ble spylt med argon før anvendelse. En oppløsning av 11.568 A26O enheter (48,2 umol, forutsatt molar ekstinksjon ved 260 nm = 240.000) av det DMTr-5'-modifiserte (CA) 10 i 7,7 ml vann ble behandlet med 1 ml 0,1 M NaHC03 og 210 (il (876 umol, 18 ganger molart overskudd) tributylfosfin i 0,5 time ved romtemperatur. Suspensjonen ble ristet fra tid til annen. Suspensjonen ble behandlet med 0,8 ml 3M NaCl og 16 ml kald isopropanol. Etter 30 minutter ved -20°C, ble materialet sentrifugert ved 3000 omdr/min i 20 minutter. Pelleten ble igjen oppløst i 2 ml vann, 0,2 ml 3M NaCl, behandlet med 4 ml isopropanol og resentrifugert. Pelleten ble kort tørket under vakuum og oppløst i 2,8 ml vann og 1 ml 0,1 N NaHC03 som hadde blitt gjennomboblet med helium. 6,7 mg av forbindelse 3 (IA-DABA-PEG) ble tilsatt, og blandingen ble holdt i 16 timer ved romtemperatur i mørke. Reaksjonsblandingen i det endelige volum på 6 ml ble satt på en 5 x 91 (1800 Ml) Pharmacia kolonne som hadde blitt pakket med Sephacryl 200
(Pharmacia). Kolonnen ble eluert med 0,5 M NaCl, 0,1 M natriumborat, pH 8,3. En peristaltisk pumpe ble benyttet og satt for å gi en strømningshastighet på omkring 2 ml pr. minutt, og fraksjoner på 15 ml ble oppsamlet. Absorbansen til fraksjonene ved 260 nm ble målt. Fraksjonene ble også analysert ved polyakrylamid gel elektroforese og de inneholdende rent konjugat ble oppsamlet.
Hybridisering av konjugat 3- 1 - Fremstilling av konjugat 3- II
De oppsamlede fraksjonene ovenfor inneholdt 726 A26O enheter. Den ekvalente mengden (TG) 10 ble tilsatt og røret ble oppvarmet ved 90°C i ti minutter og så avkjølt til romtemperatur i 1,5 time. En lik mengde isopropanol ble tilsatt og blandingen ble holdt i 3 timer ved -20°C. Etter sentrifugering ved 3000 omdr/min i 20 minutter ble pelleten oppløst i 0,15 M NaCl, 0,01 M natriumcitrat, pH 6,8. 53 mg av hybridet ble oppnådd. En mengde av materialet ble fortynnet i bufferen ovenfor og smeltetemperaturen til dupleksen ble bestemt i et Carey 3E spektrofotometer. Materialet hadde en Tm på 73,4°C og 24,3 % hyperkromositet. En 10 A26O enhets mengde av produktet ble annelert med overskudd (TG) 10 som beskrevet ovenfor. Dette så vel som ikke-annelert konjugat og en (TG)]0 standard ble analysert ved gelfiltrering HPLC på en Shodex Protein KW 8025 kolonne på et Rainin HPLC instrument. Kolonnen ble eluert isokratisk med 0,05 M NaH2P04, pH 6,5, 0,5 M NaCl. Kjøretiden var 12 minutter. Produktet hadde en retensjonstid på 6,9 minutter og (TG) 10 på 9,2 minutter. Sammenligning av arealet under toppene viste at 98,09 % av produktet var dobbelstrenget DNA. Konjugatet blir representert ved strukturen benevnt "Konjugat 3-II" i Figur 6A.
Eksempel 6
Fremstilling av PN- KLH konjugat
PN-KLH konjugatet ble fremstilt ifølge skjemaet nedenfor:
Syntese av ACT- modifisert ( CAI25
Forbindelse 58 ble koblet til (CA)25 som det endelige trinn i automatisert syntese under innlemmelse av elementene av en acyklisk triolgruppe (ACT). 49 sekvensielle trinn ble utført ved anvendelse av alternerende dC og dA fosforamiditter ved start med 10 g DMT-d-BzA-CPG støtte med en nukleosidlast på 30 umol/g. DMTr-blokkerende gruppe ble fjernet fra det resulterende d-[DMTr-(BzCp(CE)BzA)25], og 40 ml aktivatoroppløsning (Milligen, kat. nr. MBS 5040) og 800 mg av forbindelse 58 ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Suspensjonen ble blandet i 8 minutter ved argon-gjennombobling og utsatt for konvensjonelt oksidasjonstrinn. Støttebundede polynukleotider ble fjernet fra reaksjonskaret, lufttørket og behandlet med 100 ml konsentrert ammoniakk i 40 timer ved 55°. Når kald, ble blandingen filtrert gjennom et Gelman 10 um polypropylenfilter og filtratet ble renset ved konvensjonell ionbyttekromatografi. Fraksjoner som absorberte ved 260 nm ble ytterligere analysert ved polyakrylamid gel elektroforese og de inneholdende rent produkt ble slått sammen og utfelt med isopropanol for å gi 510 mg (31,9 umol, 10 %) av det ACT-modifiserte (CA)25.
Syntese av enkelstrenget PN- KLH konjugat
Til en oppløsning av 100 mg (2,5 umol) NaICvt-behandlet, ACT-modifisert (CA)25 i 1,33 ml 50 mM natriumborat pH 8,0 ble det tilsatt 31,3 mg (0,208 umol) KLH og 2,0 mg (31,8 umol) pyridinborat. Blandingen ble holdt ved 37°C i 72 timer, og produktet ble renset ved kromatografi på S-200.
Hybridisering av enkelstrenget PN- KLH konjugat med ( TG)25
Den ekvalente mengden (TG)25 ble tilsatt til det enkelstrengede PN-KLH konjugatet og røret ble oppvarmet til 90°C i ti minutter og så avkjølt til romtemperatur over en og en halv time. Utfelling med isopropylalkohol ga 53 mg produkt, PN-KLH; Tm (0,15 M NaCl, 0,01 M natriumcitrat, pH 6,8) 73,4°, 31,1 % hyperkromositet; 98 % dobbelstrenget som bestemt ved HPLC sammenligning med standard omfattende prøve annelert med overskudd av (TG)]n, ikke-annelert konjugat og ikke-annelert (TG)i ø
(Shodex Protein KW 8025 kolonne, 0,05 M NaH2PC>4, pH 6,5,0,5 M NaCl). Dette konjugatet kan bli representert ved formelen
(ved antagelse av en molekylvekt på 10^ for KLH) og er betegnet "PN-KLH".
Test av konju<g>at 3- II som et tolerogen
Konjugat 3-II ble tested for dets evne til toleranse hos mus som hadde blitt immunisert med den immunogene form av polynukleotidet, PN-KLH.
Materialer og metoder
Mus: C57BL/6 hunnkjønnsmus, 6 uker gamle, ble anskaffet fra Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Musene ble holdt og stelt ved metoder godkjent av NIH.
Immuniserin<g>: Musene ble primet, ifølge metoden til Iverson f Assav for in vivo Ado<p>tive Immune Res<p>onse i Handbook of Experimental Immunology, bind 2 Cellular Immunology. red. D.M. Weir, L.A. Herzenberg, C. Blackwell og A. Herzenberg, 4. utg., Blackwell Scientific Publications, Oxford) ved injisering av musene i.p. med 100 jig PN-KLH presipitert på alum med 2x10^ formalinfikserte pertussis organismer som et hjelpestoff. Musene ble boostet med 50 ug PN-KLH i saltvann, i.p.
Koblin<g> av PN til SRBC: Sheep Red Blood Cells (SRBC) i Alsevers ble anskaffet fra Colorado Serum Co., Denver, CO, og benyttet innen to uker. SRBC ble belagt med (CA)25:(TG)25 (en 50 mer av CA:GT) ved fremgangsmåten ifølge Kipp og Miller ("Preparation of Protein-Conjugated Red Blood Cells with ECDI (Modification)" i Selected Methods in Cellular Immunolog<y>, (1980), red. B.B. Mishell og S.M. Shiigi, W.H. Freeman and Co., San Francisco, s. 103). Kort ble SRBC vasket 4 ganger med kaldt saltvann, blandet med 2 mg (CA)25:(TG)25 koblet til D-EK i 0,35 M mannitol, 0,01 M NaCl inneholdende 10 mg karbodiimid og inkubert i 30 minutter ved 4°C. Det belagte SRBC ble vasket to ganger med kald balansert saltoppløsning og resuspendert til 10% (v/v).
Plakkanalyse: Antallet anti-PN plakkdannende celler (pfc) ble bestemt ved anvendelse av Cunningham-teknikken (Marbrook, J., "Liquid Matrix (Slide Method)", i Selected Methods in Cellular Immunology. (1980), red. B.B. Mishell og S.M. Shiigi, W.H. Freeman and Co., San Francisco, s. 86). Antallet IgG pfc ble bestemt ved eliminering av IgM plakk ved anvendelse av kanin og anti-mus IgG som beskrevet av Henry ("Estimation of IgG responses by Elimination of IgM Plaques" i Selected Methods in Cellular Immunolo<gy>. (1980), red. B.B. Mishell og S.M. Shiigi, W.H. Freeman and Co., San Francisco, s. 91). Kort ble milt høstet og enkelcelle suspensjoner ble fremstilt i balansert saltoppløsning (BSS). Marsvin-serum ble tilsatt til polynukleotidbelagte SRBC for å gi en endelig fortynning på 1:9 marsvin-serum, og nok kanin anti-mus IgG ble tilsatt for å gi en endelig fortynning på 1:100 kanin anti-mus IgG. Like volum av SRBC-blandingen og fortynnede miltceller ble blandet i mikrotiterbrønner og overført til Cunningham kammere. Hver milt ble testet individuelt og i triplikat. Kantene av kammeme ble forseglet med parafin og kammerne ble inkubert ved 37°C i 1 time. Antallet plakk ble funnet ved å betrakte kammeme under et invertert mikroskop.
Resultater
Mus ble primet med PN-KLH presipitert på alum med pertussis som et hjelpestoff (A&P) og syv uker senere delt i grupper på 3 mus hver. Musene ble behandlet i.p. med dobling av fortynninger av PN-DABA-PEG, konjugat 3-II, fem dager senere ble alle musene, inkludert kontrollen, boostet med 50 ug PN-KLH i saltvann, i.p. Fire dager senere ble milten høstet og antall IgG pfc bestemt. Som vist i Tabell 2, viste alle dosene av konjugat 3-II en signifikant reduksjon i antall pfc sammenlignet med kontrollgruppen.
Eksempel 7
Preparering og testing av konjugat 20- 11
Konjugering av Tr- 5' modifisert ( CA)i q til valensplattformmolekyl 20 - Preparering av enkelstrenget konjugat 20- 1
969 ul (789 mg, 3,89 mmol) tri-n-butylfosfin ble tilsatt til en oppløsning av 918 mg (0,14 mmol) Tr-5'-modifisert (CA)i ø i 30 ml H2O under argonatmosfære. Blandingen
ble omrørt i 1 time og så ble 2,4 ml av en 3M NaCl oppløsning fulgt av 42 ml isopropanol som hadde blitt gjennomboblet med helium for åfjeme oksygen. Blandingen ble plassert i en fryser ved -20°C i 1 time og så sentrifugert ved 3000 omdr/min i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet og oljeresten ble oppløst i 15,5 ml heliumgjennomboblet H20.1,24 ml 3M NaCl og 21,7 ml heliumgjennomboblet isopropanol ble tilsatt til blandingen. Den resulterende blandingen ble plassert i en fryser ved -20°C i 1 time og sentrifugert ved 3000 omdr/min i 20 minutter. Den oljeaktige pelleten ble tørket under vakuum i 18 timer for ågi et faststoff. Faststoffet ble oppløst i 6 ml heliumgjennomboblet H2O for å gi et totalvolum på 6,4 ml. Mengden DNA var 863 mg ifølge UV-absorbans ved 260 nm (0,033 mg pr. enhet absorbans i pH 7,5 fosfatbufret saltvann). Oppløsningen ble overført til en 50 ml trehalset flaske under argon. En hals på flasken hadde et argoninnløp mens de andre to halsene var korket. Det totale volumet ble justert til 7,7 ml med H20 0,87 ml heliumgjennomboblet IM natriumfosfatbuffer, pH 7,8, og 0,97 ml MeOH. 1,9 ml (33,63 mg, 0,025 mmol) av en 17,7 mg/ml oppløsning av forbindelse 20 i Me OH ble tilsatt til blandingen. Den resulterende blandingen ble omrørt under argon i 20 timer og så fortynnet til 100 ml med en oppløsning omfattende 0,1 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,5, og 10 % MeOH. Rensing ble utført ved kromatografi på Fractogel (ekvilibrering: 0,1 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,5, 10% MeOH: elueringsgradient 0,5 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,5, 10 % MeOH til 0,8 NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,5, 10 %
MeOH). Fraksjoner inneholdende rent konjugat 20- 1 ifølge HPLC og polyakrylamid gel elektroforese ble oppsamlet i 232 ml eluent. Produktet og salter ble utfelt ved tilsetning av et like volum isopropanol og plassering av det samme i en fryser ved -20°C i 1 time. Dialysen mot H2O (2 x 100 vol) ga 335 mg konjugat 2JM (32 ml 10,47 mg/ml, 0,033 mg/absorbansenhet ved 260 nm, antatt).
Annelering av konjugat 20- 1 med ( TG)i q for å danne dobbelstrenget konjugat 20- 11 150 mg (14,33 ml 10,47 mg/ml basert på 0,033 mg/absorbansenhet ved 260 nm) av konjugat 20- 1 og 157,5 mg (1,50 ml 104,6 mg/ml basert på 0,033 mg/absorbansenhet ved 260 nm) av (TG) 10 ble plassert i et 50 ml polypropylen sentrifugerør. Konsentrasjonen ble justert til 15 mg/ml ved tilsetning av 2,0 ml pH 7,2 10X PBS og 2,17 ml H2O. Blandingen ble plassert i et 90°C vannbad og avkjølt til romtemperatur over 1,5 time. Konsentrasjonen ble bestemt å være 17,7 mg/ml ved absorbans ved 260 nm (0,050 mg/absorbansenhet); transisjon smeltetemperatur 67,5°C; hyperkromositet 27 %; osmolalitet 346; pH 7,2. For endelig formulering av konjugat 20- 11 ble oppløsningen fortynnet til en endelig konsentrasjon på 12,7 mg/ml og en osmolalitet på 299 ved tilsetning av 7,23 ml av pH 7,2 V2 X PBS og filtrering gjennom et 0,22 u filter.
Alternativ konjugering av Tr- 5'- modifisert f CA)] Q-2 Q* preparering av enkelstrenget konjugat 2Q- I
10 ekvalenter tri-n-butylfosfinble tilsatt til en 10mg/ml oppløsning av Tr-5-modifisert (CA) 10 i 100 mM pH 5 natriumacetat gjennomboblet med He. Blandingen ble omrørt i 1 time og utfelt med 1,4 volumer isopropylalkohol (IPA). Blandingen ble plassert i en fryser ved -20°C i 1 time og sentrifugert ved 3000 omdr/min i 20 minutter. Supernatanten ble fjernet og pelleten ble oppløst i 10 mg/ml i He-gjennomboblet IPA. Blandingen ble plassert i fryseren ved -20°C i 1 time og sentrifugert ved 3000 omdr/min i 20 minutter. Pelleten ble tørket under vakuum i 18 timer for å gi et faststoff. En 50 mg/ml oppløsning av faststoff ble fremstilt i He-gjennomboblet 100 mM pH 10 natriumboratbuffer. 0,25 ekvalenter av forbindelse 20 som en 40 mg/ml oppløsning i 9/1 MeOH/H20 ble tilsatt til blandingen. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3-20 timer og fortynnet (0,1 M NaCl, 0,05 natriumfosfat, pH 7,5,10 % MeOH). Rensing ble utført ved kromatografi på Factogel (ekvilibrering; 0,1 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,5,10 % MeOH: elueringsgradient; 0,5 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat, pH 7,5,10 % MeOH til 0,8 M NaCl, 0,05 natriumfosfat, pH 7,5,10 % MeOH). Fraksjoner inneholdende rent 20- 1 ifølge HPLC og polyakrylamid gel elektroforese ble oppsamlet. Produktet og salter ble utfelt ved tilsetning av et like volum IPA og henstand i fryser ved -20°C i 1 time. Dialysen mot H20 (2X10 vol) ga 20- 1.
Alternativ annelering av 20- 1 med ( TG)i q.2Q for å danne dobbelstrenget konjugat 20- 11 Metoden er hovedsakelig den samme som beskrevet ovenfor bortsett fra at annelering er gjort ved 70°C i stedet for 90°C.
Andre alternative konjugering av Tr- 5'- modifisert ( CA)i0-20-
Preparering av enkelstrenget konjugat 20- 1
4,8 ml tri-n-butylfosfin ble tilsatt til en oppløsning av 7,75 g Tr-5'-modifisert (CA)iq i 104 ml Ar gjennomboblet 100 mM pH 5 natriumacetat under N2- Blandingen ble omrørt i 1 time og så utfelt med 232,5 ml IPA. Blandingen ble plassert i en fryser i - 20°C i 1,5 time, sentrifugert ved 3000 omdr/min i 20 minutter og så frosset ved -20°C i 24 timer. Supernatanten ble fjernet og pelleten ble oppløst i 170 ml He gjennomboblet 0,3 M NaCl oppløsning. Blandingen ble igjen utfelt med 232 ml Ar gjennomboblet IPA. Blandingen ble så plassert i en fryser ved -20°C i 2 timer, sentrifugert ved 3000 omdr/min i 20 minutter og så ved -20°C i 11 timer. Supernatanten ble dekantert og pelleten ble tørket under vakuum i 12 timer for å gi et faststoff. En oppløsning av faststoffet ble preparert i 100 ml Ar gjennomboblet 100 mM pH 10 natriumboratbuffer.
406 mg av forbindelse 20 som en oppløsning i 4,4 ml 9/1 MeOH/H20 ble tilsatt til blandingen. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Produktblandingen inneholdt 62 % av 20- 1 ifølge høytrykks ionkromatografi, Waters Gen Pak Fax kolonne (100 X 4 mm), 60°C, lineær gradient fra 65%A/35%B til 18%A/82%B; A=0,05 M NaH2P04, pH 7,5,1 mM EDTA, 10 % MeOH (v/v); B=0,05 M NaH2P04, pH 7,5,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 % MeOH (v/v), eluert ved 19,5 minutter.
Test av konjugat 20- 11 og ikke- konjugerte kontroller
C57BL/6 mus ble immunisert med PN-KLH og A&P. Etter tre uker ble grupper på 5 mus pr. gruppe behandlet med enten forskjellige doser konjugat 20-11 eller 4,5 nM HAD-AHAB-TEG (linker, HAD, forbundet til derivatisert valensplattformmolekyl, AHAB-TEG, se Figur 7), eller 18 nM (4 X 4,5) (CA)i0:(TG)io, eller en blanding av 4,5 nM HAD-AHAB-TEG pluss 18 nM (CA)in:(TG)io, i.p.; og en gruppe ble ikke behandlet. Gruppene ble gitt booster injeksjoner og sera ble oppsamlet og analysert som beskrevet i Eksempel 6. Prosent reduksjon av anti-PN respons er vist i Figur 4. Anti-KLH responser av disse musene var normale og ikke signifikant forskjellige fra de vist i Figur 2. Resultatene viser klart at anti-PN respons ikke ble påvirket av (i) valensplattformmolekylet alene, (ii) PN alene, eller (iii) en blanding av de to. PN må være koblet til det ikke-immunogene valensplattformmolekylet for åindusere toleranse.
Konjugat 20- 11 forårsaker en reduksjon i antallet PN- spesifikke antistoffproduserende celler
C57B1/6 mus ble immunisert med PN-KLH, A&P. Etter tre uker ble grupper på 3 mus pr. gruppe behandlet med forskjellige doser av konjugat 20-11, i.p.; en gruppe ble ikke behandlet. Etter fem dager ble alle musene gitt en booster injeksjon av PN-KLH i saltvann, i.p., og så 4 dager senere ble deres milt høstet og analysert for antall PN-spesifikke, IgG-produserende celler ved anvendelse av hemolyttisk plakkanalyse. Resultatene vist i Figur 3 viser klart at dette konjugatet reduserte antallet PN-spesifikke IgG-produserende celler.
Eksem pel 8
Test av konjugater som tolerogener
Test av konjugat 17- II som et tolerogen
C57BL/6 mus ble immunisert med PN-KLH, A&P. Tre uker senere ble grupper på 5 mus pr. gruppe behandlet med forskjellige doser av konjugat 17-11 intraperitonealt, (i.p.), og en gruppe ble ikke behandlet. Fem dager senere ble alle musene gitt en booster injeksjon av PN-KLH i saltvann, i.p., og 7 dager senere ble musene blodtappet. Sera ble analysert for anti-PN antistoff ved Farr analysen ved en PN-konsentrasjon på 10"^M. Prosentreduksjon av anti-PN respons er vist i Figur 1. Sera ble også analysert for anti-KLH antistoffer ved anvendelse av en ELISA analyse. Resultatene, uttrykt som prosent av anti-KLH sammenlignet med en standard oppsamling av anti-KLH sera, er vist i Figur 2. Dataene i Figur 1 viser at dette konjugatet reduserer anti-PN responsen. Anti-KLH (plattformmolekyl) respons hos alle musene er normal (se Figur 2).
Test av forskjellige av de 11 seriene konjugater som tolerogener
Grupper av tre C57BL/6 mus/gruppe ble immunisert med PN-KLH, A&P. Etter tre uker ble to grupper behandlet med 3 forskjellige doser av enten konjugat 11-IV, konjugat 11-II, konjugat 11-VI eller konjugat 11-VIII, i.p., en gruppe ble ikke behandlet. Disse konjugatene er beskrevet i Figurene 6A-B og ble fremstilt ifølge metoden beskrevet i Eksempel 7 ovenfor. Fem dager senere ble alle musene gitt en booster injeksjon av PN-KLH i saltvann, i.p., og 7 dager senere ble musene blodtappet. Sera ble analysert for anti-PN antistoff ved Farr analysen ved en PN-konsentrasjon på 10"^M. Resultatene som viser prosentreduksjonen i anti-PN respons er vist i Figur 3. Anti-KLH responsene i disse musene er ikke signifikant forskjellige fra responsene vist i Figur 2. Alle fire konjugatene reduserer signifikant anti-PN responsen ved alle de testede dosene.
Konjugat 1 l- II forårsaker en reduksjon i antall PN- spesifikke antistoffproduserende celler
C57B1/6 mus ble immunisert med PN-KLH, A&P. Etter tre uker ble grupper på 3 mus pr. gruppe behandlet med forskjellige doser konjugat 1 l-II, i.p., en gruppe ble ikke behandlet. Fem dager senere ble alle musene gitt en booster injeksjon av PN-KLH i saltvann, i.p.; og 4 dager senere ble deres milt tatt ut og analysert for antall PN-spesifikke, IgG-produserende celler ved anvendelse av den hemolyttiske plakkanalysen. Resultatene av dette eksperimentet med forskjellige doser konjugat 1 l-II er vist i Tabell 4. Disse resultatene viser klart at dette konjugatet reduserer antallet PN-spesifikke IgG-produserende og at reduksjonen i antistofftiter ikke var på grunn av klaringen av serum antistoff bundet til konjugat.
Eksempel 9
Preparering av HADpS- fCAlip - Konjugat 20- IV
Et modifisert polynukleotid med et fosfortioat som knytter linkeren til 5' enden ble preparert. Syntesen av twentymeren, (CA)iq> og tilsetning av HAD linkeren til polynukleotidet ble utført ifølge metoden i Eksempel 5 bortsett fra det følgende. I det endelige oksidasjonstrinnet ble jodoppløsningen erstattet med en 0,05 M oppløsning av 3H-l,2-benzoditiol-3-on 1,1 dioksid (Glen Research, Sterling, VA) i acetonitril. Sulfonisering ble utført ifølge produsentens instruksjoner. Ammoniakkbehandling og rensing ble utført som i Eksempel 5. Konjugering av polynukleotidet til AHAB-TEG valensplattformen ble utført ifølge metodene i Eksempel 5.
Testing av konjugat 20- IV som et tolerogen
Da 5' fosfat på PN kan være utsatt for en enzymatisk degradering, ble et av oksygenmolekylene på det terminale fosfatet erstattet av svovel, derfor navnet HADpS. C57BL/6 mus ble immunisert med PN-KLH, A&P. Etter tre uker ble grupper på 5 mus pr. gruppe behandlet med forskjellige doser av konjugat 20-IV, i.p.; en gruppe ble ikke behandlet. Gruppene ble gitt booster injeksjoner og sera ble oppsamlet og analysert som beskrevet ovenfor. Resultatene som viser prosentreduksjon i anti-PN respons er vist i Figur 5. Anti-KLH responser av disse mus (data ikke vist) var normale og var ikke signifikant forskjellige fra de vist i Figur 2. Disse resultatene viser at dette konjugatet signifikant reduserer anti-PN responsen.
Konju<g>at 20- IV forårsaker en reduksjon i antall PN- spesifikke antistoffproduserende celler
C57B1/6 mus ble immunisert med PN-KLH, A&P. Etter tre uker ble grupper på 3 mus/gruppe behandlet med forskjellige doser av konjugat 20-IV, i.p.; en gruppe ble ikke behandlet. Etter fem dager ble alle musene gitt en booster injeksjon av PN-KLH i saltvann, i.p., og 4 dager senere ble deres milt høstet og analysert for antall PN-spesifikke, IgG-produserende celler ved anvendelse av den hemolyttiske plakkanalysen. Resultatene, vist i Tabell 5, viser at dette konjugatet reduserte antallet PN-spesifikke IgG-produserende celler.
Eksempel 10
Behandling av BXSB mus med LJP 394. koniugat 20- 11
Mus behandling protokoll
Seks til ni uker gamle hannkjønns BXSB mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me) ble huset ved La Jolla Pharmaceuticars anlegg. For og vann ble gitt ad libitum. Dyrene ble hvilt en uke før anvendelse. Initielle blodprøver og vekter ble registrert før den første konjugatbehandlingen. Konjugatbehandling ble initiert ved 7 til 9 ukers alder og ble administrert intravenøst to ganger ukentlig fra dag 59 til dag 150. Dyrene ble blodtappet periodisk og deres anti-DNA antistofftitere ble bestemt.
Analyse for IgG anti- DNA antistoffbroduksjon
En serumprøve tatt fra hver mus ble analysert for nærvær av anti-DNA antistoff ved ELISA. Falcon Probind 96 brønners mikrotitrerings analyseplater (Becton Dickerson, Oxnard, CA) ble belagt med 100 ul/brønn av (PN)5Q-D-EK (en kopolymer av D-glutaminsyre og D-lysin) ved en konsentrasjon på 50 ug/ml over natten ved 4°C. Platene ble vasket to ganger med PBS uten kalsium og magnesium og 0,05 % Tween 20
(vaskebuffer) ved anvendelse av en M96V platevasker (ICN Biomedical, Inc., Irvine, CA). Plater ble blokkert i 1 time ved romtemperatur i PBS inneholdende 1 % gelatin
(Norland Products, Inc., New Brunswick, NJ) og 0,05 % Tween 20. Plater ble vasket to ganger med vaskebuffer før tilsetning av serumprøver eller standarder. Serumprøver og standard ble preparert i en fortynner inneholdende PBS med 1 % gelatin, 0,05 % Tween 20 og 10 % geiteserum. Plater ble inkubert med serumprøver i 60 til 90 minutter ved 37°C og så ble brønnene vasket fire ganger med vaskebuffer. Biotinylert geite-antimus IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ble fortynnet 1/1000 i blokkeringsoppløsning inneholdende 10 % geiteserum. Platene ble inkubert i 1 time ved 37°C og vasket fire ganger. Substratet, OPD (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ble tilsatt. Platene ble inkubert i mørke inntil den høyeste lesningen av den høyeste standarden var omkring 1 OD enhet ved en ELISA plateleser ved OD 450 nm (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). Reaksjonen ble stoppet med 50 ul 3M HC1 og platene ble lest ved 490 nm. Det positive referanseserum ble inkludert i hver mikrotitreirngsplate og de positive brønnene fra hver analyse var innen det sensitive området til referansekurven 95 % av tiden. Etter noen blodtappinger overskred noen positive prøver referansekurven. Imidlertid var den mest fortynnede museserumprøven innen området for referansekurven. Ingen signifikant binding ble observert ved normalt kontroll negativt serum. Resultatene er vist i Figur 15.
Eksempel 11
Preparering av melittin peptider og konju<g>ater
Melittinmolekylet, sammensatt av 26 aminosyrer, er en av hovedkomponentene i bigift. En tredjedel av bigiftsensitive individer har melittinspesifikke antistoffer. Melittin er høyt immunogent hos noen musestammer (Balb/c, CAF1). Majoriteten (>80 %) av melittinspesifikke antistoffer hos de responderende musestammene binder en B-celle epitop som er det c-terminale heptapeptidet i melittin.
Melittin
Melittinpeptider for T- celle stimulering
Peptidsvntese
Melittinpeptider ble syntetisert ved anvendelse av standard Fmoc kjemiteknikker på en glycinharpiks (Advanced ChemTech nr.SG5130 eller ekvalent Advanced ChemTech, 2500 Seventh Street Road, Louisville, KY) ved anvendelse av 2,3 M overskudd aminosyrederivater for hvert koblingstrinn. Fullførelse av koblingen ble overvåket med bromfenolblått og bekreftet med ninhydrin.
Melittin<p>e<p>tider benyttet i konjugeringer
Et cystein ble tilsatt som nødvendig for kobling av visse peptider via en tioeterbinding til valensplattformmolekylet. Peptider ble renset ved revers fase HPLC etter syntese og lyofilisert til tørrhet. Den passende mengde peptid ble så veid opp for hver konjugering.
Reduksjon av forhåndsdannede disulfidbindinger:
( Tributvlfosfin metode")
Alle buffere ble gjennomboblet med helium. Peptidet ble oppløst i et minimalt volum
(omkring 10 til 20 mg/ml) 0,05 M NE1HCO3 (pH 8,25). En 1 ml oppløsning av 0,7 M tributvlfosfin (TBP; MW = 202,32 g/mol; d - 0,812 g/ml) ble fremstilt ved tilsetning av 174,4 ul TBP til 825,6 ul isopropanol (iPrOH). Så ble 1:1 ekvalenter TBP tilsatt til peptidoppløsningen fremstilt som beskrevet ovenfor, blandet godt, og tillatt åreagere 30 minutter til 1 time med leilighetsvis blanding for å holde TBP oppløst og/eller dispergert i oppløsningen. Fullstendig reduksjon ble bekreftet ved HPLC.
Konjugering av peptider til valensplattformmolekyl nr. 3 eller nr. 60:
Alle bufferne ble gjennomboblet med helium. Polyetylenglykol (PEG) derivat nr.3 eller nr.60 ble oppløst i et minimalt volum (omkring 20 mg/ml) 0,05 M NaHCC«3 (pH 8,25). Omkring 3 ekvalenter peptid ble benyttet pr. jodacetylgruppe på PEG-derivatet. For para-aminobenzosyre (PABA)-PEG; 2 jodacetylgrupper; MW = omkring 4100 g/mol; ble 6 ekvalenter peptid benyttet for hver ekvalent PABA-PEG. For diaminobenzosyre (DABA)-PEG; 4 jodacetylgrupper; MW = omkring 4300 g/mol; ble 12 ekvalenter peptid benyttet for hver ekvalent DABA-PEG. PEG-oppløsningen ble tilsatt til den reduserte peptidoppløsningen og tillatt å reagere minst en time i mørke. Peptidkonjugatet ble renset ved preparativ HPLC. Før oppsamling og lyofilisering ble fraksjoner sjekket ved elektroforese ved anvendelse av 15 % trikingel.
Munne lymfenode prolifereringsanalyser.
Hunnkjønns Balb/c mus (6-8 uker gamle; Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) ble skaffet og holdt ved La Jolla Pharmaceutical's dyrestall ifølge retningslinjene til National Institutes of Health. For og vann ble gitt ad libitum. Balb/c mus ble immunisert i hver bakre fotpute med 50 ug melittinmolekyl i Complete Freund's Adjuvant (CFA)
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Popliteale lymfenoder ble høstet aseptisk syv dager senere. Lymfenoder ble forsiktig dissosiert ved å drive cellene gjennom en 50 mesh sikt. Enkel cellesuspensjon ble vasket i RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine CA) inneholdende glutamin, penicillin og streptomycin. 5 x 10^ celler i RPMI medium tilsatt 10 % føtalt bovint serum (FCS) i kvadruplikate brønner i rundbunnede 96-brønners Corning mikrotitreringsplater ble dyrket med melittin eller et melittinpeptid ved 10,1,0 eller 0,1 ug/ml. Celler i positive kontrollbrønner ble dyrket med murin interleukin 2 (IL-2) ved 100 eller 50 U/ml, PHA (phytohemagglutinin) ved 1 ug/ml. De negative kontrollbrønnene inneholdt lymfenodeceller i RPM-1640 og 10 % FCS. Cellene ble dyrket i 4 dager i en 37°C inkubator med 5 % CO2. Hver brønn ble pulsert med 1 uCi [<3>H]tymidin (ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA) i ytterligere 18 timer. Celler ble høstet på glassfiberfiltermatte ved anvendelse av en semiautomatisk cellehøster (Scatron, Sterling, VA). Innlemmelse av [<3>H]tymidin ble bestemt ved væske scintillasjonstelling. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlige tellinger pr. minutt.
In vivo protokoller
Balb/c mus ble primet intraperitonealt (i.p.) med 4 ug melittin i CFA. En måned senere ble det potensielle tolerogen eller formuleringsbuffer administrert i.p. Tre dagere senere mottok alle musene en i.p. injeksjon av 4 ug melittin i Incomplete Freund's Adjuvant (ICF) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). 100 til 200 ul blod ble oppsamlet fra den retro-orbitale venous plexus 10 dager senere. Serumprøver ble analysert for anti-peptid eller anti-melittin IgG antistoffer.
Analyse for IgG anti- melittin eller totalt anti- melittin antistoff
En individuell mus' serumprøve ble analysert serielt for nærvær av anti-melittin antistoffer ved ELISA. Falcon Probind 96-brønners mikrotitreringsplater ble forhåndsbelagt med 10 ug/ml melittin eller melittinpeptid i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,2, over natten ved 4°C. Platene ble vasket to ganger med en vaskeoppløsning inneholdende PBS, 0,02 % Tween-20 og 1 % gelatin (Norland Products Inc., New Brunswick, NJ). Plater ble blokkert med 200 ul PBS inneholdende 5 % gelatin i 1 time ved 37°. Serumprøver ble preparert i en fortynner av PBS inneholdende 5 % gelatin. Prøver ble testet med fortynninger av 1:100 til 1:1000. Etter 1 time inkubering ved 37°C ble platene vasket fire ganger. ExtraAvidin peroksidase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ble fortynnet 1:1000 i PBS inneholdende 5 % gelatin. Platene ble inkubert i 30 minutter ved 37°C og så vasket fem ganger. Brønner ble utviklet med o-fenylendiamin (OPD) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i mørke i 15-30 minutter, reaksjonen ble stoppet med 3 M HC1.
Den optiske densiteten (OD) ble bestemt ved 450 nm på en mikrotiterplateleser (Bio-tek Instruments, Winooski, VT).
Antistoff dannelse celleanalyse
Cellulose mikrotiterplater (Millipore Co., Bedford, MA) ble preparert som indikert ovenfor for IgG antistoff (ELISA) analysen. Imidlertid, ved det punkt i analysen hvor serumprøvene ble tilsatt til brønnene, ble miltceller (5 x lO^/brønn) tilsatt istedenfor serum, og inkubert over natten. Resten av ELISA-analysen ble utført som indikert ovenfor.
T- celle epitoper
T-celler fra mus primet med melittin viste T-celle proliferering som respons på det hele melittinmolekyl og på C-terminale melittinpeptider 3, 4 og 5 (Figur 8). Imidlertid induserte C-terminale peptider 1 og 2 ingen signifikant T-celle proliferering. Melittinpeptider 2 og 5 ble konjugert til PEG. Som melittinpeptid 2, induserte ikke PEG-konjugatet av melittinpeptid 2 noen signifikant T-celle proliferering.
Studier ved anvendelse av melittinkoniugerte peptider for åtolerisere mus primet og boostet med melittin
Mus behandlet med konjugatet fremstilt som beskrevet ovenfor (10 mg/kg, 200 ug/mus) hadde signifikant lavere nivåer av anti-melittinpeptid 2 antistoffer (Figur 9) og også lavere nivåer av anti-melittin antistoffer (Figur 10) sammenlignet med kontroll Balb/c mus behandlet med formuleringsbuffer. Miltceller fra mus behandlet med bufferkontroll eller konjugat ble analysert for evnen til antistoffdannende celler å produsere anti-melittin eller anti-melittinpeptid 2 antistoffer som målt i en oppløselig ELISA analyse. Som vist i Figur 11, var nivåene av anti-melittinpeptid 2 antistoffdannende celler i konjugat 2 behandlingsgruppen signifikant lavere enn de i kontrollgruppen som ble administrert formuleringsbuffer. Mus behandlet med konjugat 4, et konjugat av peptid 5 som inneholder en T-celle epitop, reduserte ikke titeren av antistoffer for peptid 5 i behandlede mus. Konjugatet inneholdende en T-celle epitop var således ikke et tolerogen (Figur 12). Faktisk, heller enn åredusere responsen, kan nivåene av anti-peptid antistoff ha blitt øket svakt.
Eksempel 12
Ytterli<g>ere studier ved anvendelse av melittinpeptidkonjugater for å tolerisere mus primet og boostet med melittin
Hunnkjønns C57BL/6 mus, alder 5 til 8 uker, ble anskaffet fra Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Dyrene ble holdt og behandlet ifølge retningslinjene til National Institutes ofHealth.
Immuniseringsprotokoll
Mus ble primet ved en i.p. injeksjon inneholdende 5 ug melittin utfelt på alum og 2 x 1Q<9> B. pertussis (Michigan Department of Public Health, Lansing, MI) som et hjelpestoff. Musene ble boostet med 5 ug melittin, i.p., i PBS.
pfc analyse
Sheep Red Blood Cells (SRBC) (Colorado Serum Co., Denver, Colorado) ble konjugert med melittinpeptid 2 ved anvendelse av karbodiimid. Friske SRBC (mindre enn 2 uker gamle) ble vasket fire ganger med kaldt saltvann og en gang med mannitol (0,35 M mannitol, 0,01 M NaCl). SRBC ble suspendert i mannitol til en konsentrasjon på 10 %
(v/v). 100 ul mannitol inneholdende 30 ug melittinpeptid nr.3 ble tilsatt til 1 ml prøver av 10 % SRBC som hadde blitt inkubert på is i 10 minutter. 100 ul av en 100 mg/ml oppløsning av l-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid HC1 (EDCI) ble tilsatt og inkubert på is i 30 minutter. SRBC ble vasket to ganger med Balanced Salt Solution (BSS) (Irvine Scientific Co., Irvine, CA) og resuspendert til 10 % (v/v). Lyofilisert marsvin-komplement (GIBCO, New York, NY) ble rekonstituert med BSS og så fortynnet 1:3 med BSS. En ml av det fortynnede marsvinkomplementet ble tilsatt til 3 ml konjugert SRBC. Kanin antimus IgG ble tilsatt for å gi en endelig fortynning på 1:100 av kanin antiserumet. Denne konsentrasjonen var forhåndsbestemt til å hemme all IgM pfc under opprettholdelse av det maksimale antallet IgG pfc. Et likt volum av denne komplement/antimus IgG/SRBC suspensjon ble blandet med en cellesuspensjon av mus miltceller tatt fra en enkelt mus. 50 ul av hver blanding ble overført til kammerne til et Cunningham slide (tre kammere pr. slide). Kantene ble forseglet med parafin og inkubert i 37°C i en time. Antallet plakk pr. kammer ble talt ved hjelp av et dissekeringsmikroskop. Hver miltsuspensjon ble også analysert ved anvendelse av ikke-konjugert SRBC som en kontroll. Antallet levedyktige celler i hver miltcellesuspensjon ble bestemt. Antallet pfc pr. 10^ miltceller ble bestemt for hvert kammer og gjennom-
snittet av triplikatene beregnet. Antallet pfc for ikke-konjugerte SRBC ble trukket fra antallet pfc for konjugert SRBC for å bestemme antallet peptid-spesifikke pfc.
Bestemmelse av optimal tid for måling av pfc
Mus ble primet med melittin. Grupper (3 mus pr. gruppe) av primede mus ble boostet med melittin på dagene 2,4, 6 og 8. På dag 10 ble musene avlivet og deres milt høstet. Cellesuspensjoner ble fremstilt og antallet peptid-spesifikke pfc bestemt. Det optimale antallet pfc ble oppnådd 6 dager etter boosting med melittin.
Orienteringen av peptidet på PEG- konjugatet påvirker ikke konjugatets evne til å indusere toleranse
To forskjellige tolerogener ble konstruert for å bestemme om orienteringen av peptidet på PEG-konjugatet påvirker dets evne til å indusere toleranse. Peptidet ble kovalent bundet til valensplattformmolekylet 3 gjennom dets C-terminale ende for åfremstille melittinkonjugatet 3. Grupper (3/gruppe) av mus primet med melittin ble behandlet i.p. med konjugater eller med saltvann. Fem dager senere ble alle musene, inkludert den ikke-behandlede kontrollgruppen, boostet med 5 up melittin. Seks dagere senere ble musene avlivet, deres milt høstet og antallet peptid-spesifikke pfc bestemt. Som illustrert i Tabell 8, var begge orienteringer effektive for reduksjon av antallet peptid-spesifikke pfc/lO^ miltceller hos mus primet og boostet med moderproteinet melittin.
Tabell 7
Orientering av peptidet på PEG-konjugatet påvirker ikke konjugatets evne til å indusere toleranse.
Peptid-spesifikke
Melittin pfc pr. \ Qfi miltceller
konjugat nr. ug/ mus ( Gjennomsnitt og S. D.) % reduksjon
3 1000 ug 386 (85) 86,8%
500 ug 489 (en mus) 83,3%
250 ug 957 (298) 67,3 % 2 1000 ug 546 (160) 81,3%
500 ug 866,6 (235) 70,4%
250 ug 1280 (en mus) 56,2%
Ingen Ingen 2924 (164)
Antallet peptider pr. PEG koniueat påvirker konjugatets evne til å indusere toleranse Tre forskjellige konjugater, hver med et forskjellig antall peptider pr. PEG konjugat, ble konstruert for å bestemme om forholdet av peptider til PEG molekyl var viktig. Konjugat 1 hadde kun to peptider pr. PEG konjugat. En annen hadde fire peptider pr. PEG konjugat (konjugat 2). Den tredje hadde åtte peptider pr. PEG konjugat (konjugat 5). Grupper (3/gruppe) av mus primet med melittin ble behandlet, i.p., med forskjellige konjugater eller saltvann. Fem dager senere ble alle musene, inkludert ikke-behandlet kontrollgruppe, boosted med 5 ug melittin. Seks dager senere ble musene avlivet, deres milt høstet og antallet peptid-spesifikke pfc bestemt. Som vist i Tabell 8, var konjugat 1, inneholdende to peptider pr. PEG molekyl, ikke effektiv i å redusere antallet peptid-spesifikke pfc/10^ miltceller i mus primet og boostet med moderproteinet melittin. Resultatene viser at både melittin-konjugat 2 og 5 var effektive som tolerogener; imidlertid var konjugat 5, som inneholdt 8 peptider, effektiv ved en lavere dose enn konjugat 2 som inneholdt fire peptider pr. valensplattformmolekyl.

Claims (83)

1. Kjemisk definert valensplattformmolekyl, karakterisert ved at det har homogen molekylvekt og tilsvarer formelen: hvor G[<2>] er valgt fra gruppen bestående av q er et heltall fra 0 til 20; r er et heltall fra 0 til 300; og s er et heltall fra 1 til 4; hvor L[<2>] er en valgfri gruppe, som når den er til stede er uavhengig valgt fra gruppen O, NRSUB og S; hvor hver jlXI er uavhengig valgt fra gruppen C(=0) og C(=S); hvor hver z[<2>] uavhengig er en rest omfattende 1-200 atomer valgt fra gruppen C, H, N og O, inneholdende tilknytningsseter for minst p[<2>] funksjonelle grupper; hvor hver av T[<2>] uavhengig er valgt fra gruppen bestående av: hvori hver X er uavhengig F, Cl, Br, I eller en annen lett avspaltbar gruppe; hver R<ALK> er uavhengig en lineær, forgrenet eller cyklisk alkylgruppe på 1 til 20 karbonatomer; hver R<SUB> er uavhengig H, en lineær, forgrenet eller cyklisk alkylgruppe på 1 til 20 karbonatomer, en arylgruppe på 6 til 20 karbonatomer, eller en alkarylgruppe på 7 til 30 karbonatomer; og hver R<B> er uavhengig en kjemisk enhet omfattende 1 til 50 atomer valgt fra gruppen bestående av C, H, N, O, Si, P og S; hver RESTER er uavhengig N-suksinimidyl, p-nitrofenyl, pentafluorfenyl, pentaklorfenyl, tetrafluorfenyl, 2,4,5-triklorfenyl, 2,4-dinitrofenyl eller cyanometyl; pP] er et heltall fra 1 til 8;
n[<2>] er et heltall fra 1 til 32; og under den forutsetning at produktet p[<2>] x nP] er større enn 1 og mindre enn 33.
2. Kjemisk definert valensplattform ifølge kravl, karakterisert v e d at strukturen lJ2]^2]-zPl(TP])p[2] er valgt fra gruppen bestående av:
3. Kjemisk definert valensplattform ifølge krav log 2, karakterisert ved at hver av enhetene vist som Tt2l er uavhengig valgt fra gruppen bestående av:
4. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1-3, karakterisert ved at s er 3 eller 4.
5. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1-4, karakterisert ved at alle enhetene vist som t[<2>] er identiske.
6. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1-5, karakterisert ved at nP] er 1 til 16.
7. Kjemisk definert valensplattform ifølge krav 6, karakterisert v e d at nt<2>] er 1 til 8.
8. Kjemisk definert valensplattform ifølge krav 6, karakterisert v e d at nP] er 1 til 4.
9. Kjemisk definert valensplattform ifølge krav 6, karakterisert v e d at nt<2>] er 1 til 2.
10. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1-9, karakterisert ved at p[<2>] er 1 til 4.
11. Kjemisk definert valensplattform ifølge krav 10, karakterisert v e d at pt<2>] er 1 til 2.
12. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1-11, karakterisert ved at alle nt<2>] enhetene er vist som Z[<2>] er identiske.
13. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1 eller 3-12, karakterisert ved at Gt<2>] er -CH2-(CH2OCH2)rCH2- og r = 0-300.
14. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1-12, karakterisert ved atTt2] er-RALKX.
15. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av krav 1, karakterisert ved at valensplattformmolekylet er av formel
16. Kjemisk definert valensplattform ifølge krav 1 eller 3-12, karakterisert ved at gruppen representert ved Z<[21->(T[21)P[2] er av formelen: formelen: W<[>3]_Y13]_ ( Tl\[ 2] hvor W<[3]> er en valgfri gruppe som hvis den er tilstede uavhengig er valgt blant (CH2)V, (CH2C<H>20)v, NR<SUB>(CH2CH20)vCH2CH2 og NR<SUB> (CH2)VNR<SUB> C(=0); Y<[3]> er uavhengig valgt blant fenyl-l,4-diradikal, fenyl-l,3,5-triradikal og (CH2)V; og ver 1 til 10.
17. Kjemisk definert valensplattform ifølge krav 1 eller 3-12, karakterisert ved at gruppen representert ved Z<[2]->(T<[2]>)P[2] er av formelen: Wl*- N-{ Y[ 4\ Tl\[ 2] t2} hvor W<I4]> er en valgfri gruppe, som hvis den er til stede uavhengig er valgt blant (CH2)vC(<=>0) og (CH2)vNR<SUB>C(=0); Y<[4]> er uavhengig valgt blant (CH2)V, (CH2)vNRSUBC(=0)(CH2)„ (CH2)vC(=0=NRSUB(CH2)t, (CH2)vNRSUBC(=0)(CH2)tNRSUBC(=0)(CH2)v, (CH2)vC(=0=NR<SUB>(CH2)tNR<SUB>C(=0)(C<H>2)v, (CH2)vNRSUBC(=0)(CH2CH20)t(CH2CH2) og (CH2)vC(=0)NR<SUB>(CH2<C>H20)t(CH2CH2); v er uavhengig valgt blant 1 til 10 eller fortrinnsvis 2 til 6; og t er uavhengig valgt blant 1 til 10 fortrinnsvis 1 til 3.
18. Kjemisk definert valensplattform ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 3-12, karakterisert ved at gruppen representert ved Z<[2]->(T<[Z]>)p[2] er av formelen: W[5]-CH-{Y[5]- (T[21)p[2]/2},hvor W<[5]> er en valgfri gruppe som hvis den er til stede uavhengig er valgt blant (CH2)vC(=0)NR<SUB> og (CH2)vNR<SUB>C(=0)NRSUB;Y<[5]> er uavhengig valgt blant (CH2)V og (CH2)vC(=0)NR<SUB>(CH2)v; og ver 1 til 10.
19. Konjugat av (a) biologisk aktive molekyler, og (b) et kjemisk definert valensplattformsmolekyl ifølge et hvilket som helst av krav 1 til 18.
20. Konjugat ifølge kra vi 9, karakterisert ved at konjugatet er av formelen [(PN)n-linker]m-valensplattformmolekyl, de biologisk aktive molekylene er polynukleotidduplekser med "n" nukleotider, som representert ved (PN)n; n er minst 20, og m er 2-8.
21. Konjugat ifølge krav 20, karakterisert ved at linkeren er en 6 karbontiol.
22. Konjugat ifølge krav 21, karakterisert ved at linkeren er et tio-6 karbonkjede-fosfat
23. Konjugat ifølge krav 19, karakterisert ved at de biologisk aktive molekylene omfatter polynukleotidduplekser av minst ca. 20 basepar, idet dupleksene hver har en signifikant bindingsaktivitet for humant systemiske lupus erytematosus anti-dsDNA antistoffer.
24. Konjugat ifølge krav 19, karakterisert ved at de biologisk aktive molekylene er valgt fra gruppen bestående av: karbohydrater, lipider, lipopolysakkarider, peptider, proteiner, glykoproteiner, enkelt-kjedede oligonukleotider, dobbelt-kjedede oligonukleotider, haptener og analoger derav, innbefattende mimotoper og aptamerer eller blandinger derav.
25. Konjugat ifølge krav 19, karakterisert ved at de biologisk aktive molekylene er analoger av immunogener hvor (a) analogen binder spesifikt til B-celler til hvilke immunogene binder spesifikt, og (b) analoget mangler en T-celle-epitop.
26. Konjugat ifølge krav 19, karakterisert ved at valensplattformsmolekylet er derivatisert ved hjelp av et reagens valgt fra gruppen bestående av DABA, BAHA, BAHAqX og AHAB.
27. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at et linkermolekyl kobler dupleksene til valensplattformsmolekylene.
28. Konjugat ifølge krav 27, karakterisert ved at linkermolekylet er valgt fra gruppen bestående av HAD og HADpS.
29. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at dupleksene er i det vesentlige homogene i lengde.
30. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at dupleksene er i det vesentlige homogene i nukleotidsammensetning.
31. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at dupleksene er ca. 20 til ca. 50 bp i lengde.
32. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at dupleksene er bundet til valensplattformsmolekylet ved eller innen omkring 5 basepar fra en av deres ender.
33. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at polynukleotidduplekset er ( CA)\ø : (TG)jø og valensplattformsmolekylet omfatter derivatisert trietylenglykol.
34. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at molforholdet mellom dupleks og valensplattformsmolekyl er i området 2:1 til 8:1.
35. Konjugat ifølge krav 33, karakterisert ved at molforholdet mellom dupleks og valensplattformsmolekyl er 4:1.
36. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at polynukleotidduplekset er (CA)jø : (TG)io °S valensplattformsmolekylet er derivatisert 2,2'-(etylendioksy)-dietylamin.
37. Konjugat ifølge krav 36, karakterisert ved at molforholdet mellom dupleks og valensplattformsmolekylet er i området 2:1 til 8:1.
38. Konjugat ifølge krav 36, karakterisert ved at det molare forholdet mellom dupleks og valensplattformsmolekyl er 4:1.
39. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at konjugatet er et tolerogen for human systemisk lupus erytematosus.
40. Konjugat ifølge krav 23, karakterisert ved at polynukleotiddupleksene har en B-DNA type helisk struktur og en signifikant bindingsaktivitet for humane systemisk lupus erytematosus anti-dsDNA antistoffer.
41. Konjugat ifølge krav 25, karakterisert ved at immunogenet er et eksternt immunogen.
42. Konjugat ifølge krav 41, karakterisert ved at det eksterne immunogenet er et biologisk legemiddel, et allergen eller et Rh/D immunogen forbundet med Rh hemolyttisk sykdom, a-sperma forbundet med mannlig infertilitet eller karbohydratkomplekset forbundet med reumatisk feber.
43. Konjugat ifølge krav 25, karakterisert ved at immunogenet er et selv-immunogen.
44. Konjugat ifølge krav 43, karakterisert ved atselv-immunogenet er forbundet med tyroiditt, diabetes, slag eller myasthenia gravis.
45. Konjugat ifølge krav 25, karakterisert ved at immunogenet og analogene er av samme kjemiske klasse.
46. Konjugat ifølge krav 25, karakterisert ved at immunogenet og analogen er polypeptider.
47. Konjugat ifølge krav 25, karakterisert ved at immunogenet og analogen er av forskjellige kjemiske klasser.
48. Farmasøytisk preparat for behandling av en antistoff formidlet patalogisk tilstand, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et konjugat ifølge krav 25 formulert med en farmasøytisk akseptabel bærer.
49. Farmasøytisk preparat for behandling av lupus, karakterisert v e d at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et konjugat ifølge krav 23 formulert med en farmasøytisk akseptabel bærer.
50. Preparat ifølge krav 49, karakterisert ved at det er for å indusere spesifikk B-celle anergi til et immunogen i et individ.
51. Preparat ifølge krav 40, karakterisert ved at det er for behandling av et inidivid for en antistoff-formidlet patalogisk tilstand hvori uønskede antistoffer produseres som respons på et immunogen.
52. Preparat ifølge et hvilket som helst av krav 48-51, karakterisert ved at preparatet er formulert for administrering ved injeksjon.
53. Fremgangsmåte for fremstilling av konjugatet ifølge krav 23, karakterisert ved at den omfatter: (a) binding av en multiplisitet av enkeltkjedede polynukleotider av minst ca. 20 basepar til valensplattformsmolekylet; og (b) sammensmelting av komplementære enkeltkjedede polynukleotider til de enkeltkjedede polynukleotidene konjugert til valensplattformsmolekylet for å danne nevnte duplekser.
54. Fremgangsmåte ifølge krav 53, karakterisert ved at den videre omfatter trinnet med først binding av polynukleotiddupleksene til et linkermolekyl og deretter binding av linkermolekylet til valensplattformsmolekylet.
55. Fremgangsmåte for fremstilling av konjugatet ifølge krav 25, karakterisert ved at den innbefatter: (a) kovalent binding av analogen av immunogenet som mangler T-celle epitoper til det kjemisk-definerte valensplattformsmolekylet for å danne et konjugat; og (b) utvinning av konjugatet fra reaksjonsblandingen.
56. Sammensetning for anvendelse ved dannelse av konjugater med biologisk aktive molekyler omfattende kjemisk definerte valensplattformsmolekyler ifølge krav 1 som har en homogen molekylvekt, karakterisert ved at nevnte plattformmolekyler omfatter forgrenende grupper, hvor valensen av nevnte plattformmolekyler er forhåndsbestemt ved antallet forgrenede grupper, hvor valensen av nevnte plattformmolekyler er to eller mer.
57. Sammensetning ifølge krav 56, karakterisert ved at de forgrenende gruppene er avledet fra en gruppe valgt fra gruppen bestående av diaminosyre, triamin og aminodisyre.
58. Konjugat, karakterisert ved at det omfatter: biologisk aktive molekyler; og et kjemisk definert valensplattformmolekyl ifølge krav 2.
59. Konjugat ifølge krav 19 eller 58, karakterisert ved at de biologisk aktive molekylene omfatter et polynukleotid.
60. Konjugat ifølge krav 59, karakterisert ved at de biologisk aktive molekyler omfatter et polynukleotiddupleks.
61. Konjugat ifølge krav 59, karakterisert ved at polynukleotidet er en dupleks med en lengde på minst omkring 20 basepar.
62. Konjugat ifølge krav 58, karakterisert ved at de biologisk aktive molekylene omfatter et analog av et immunogen som binder spesifikt til et antistoff hvortil immunogenet binder spesifikt og mangler T-celle-epitoper.
63. Konjugat ifølge krav 58, karakterisert ved at de biologisk aktive molekylene er valgt fra gruppen bestående av karbohydrater, lipider, lipopolysakkarider, proteiner, peptider, glykoproteiner og legemidler.
64. Konjugat ifølge krav 19 eller 58, karakterisert ved at de biologiske aktive molekylene omfatter et polypeptid.
65. Preparat for behandling av antistoff formidlede patologiske tilstander, karakterisert ved at det omfatter et flertall av konjugater ifølge krav 62 hvor preparatet er formulert for administrering ved injeksjon.
66. Preparat for behandling av human systemisk lupus erytematosus, karakterisert ved at det omfatter et flertall av konjugater ifølge krav 59 eller 61, hvor preparatet er formulert for administrering ved injeksjon.
67. Forbindelse, karakterisert ved formelen: hvor r = 0-300; og hver U er hvor X = 0 eller S; og PN er et enkelt eller dobbeltkjedet polynukleotid.
68. Forbindelse ifølge krav 67, karakterisert ved at oksygenet som forbinder polynukleotidet til fosforatomet er oksygenet av 5'-hydroksyl til det enkeltkjedede polynukleotidet eller 5'-hydroksyl til en av kjedene til det dobbelt-kjedede nukleotidet.
69. Forbindelse ifølge krav 67, karakterisert ved atPNer et dobbelt-kjedet polynukleotid.
70. Forbindelse ifølge krav 69, karakterisert ved at r = 2; X = O og hvor PN er et omkring 20 basepar polynukleotid.
71. Forbindelse ifølge krav 70, karakterisert ved at polynukleotidet er (CA)io ■ (TG)io
72. Forbindelse ifølge krav 71, karakterisert ved at oksygenet som forbinder polynukleotidet til fosforatomet er oksygenet av 5'-hydroksyl av (CA)lø, slik at forbindelsen er av formelen
73. Forbindelse ifølge krav 58, karakterisert ved atPNer et enkelt-kjedet polynukleotid.
74. Forbindelse ifølge krav 73, karakterisert ved atr = 2; X = O og hvor PN er et 20 baser polynukleotid.
75. Forbindelse ifølge krav 74, karakterisert ved at polynukleotidet er (CA) jø.
76. Forbindelse ifølge krav 75, karakterisert ved at oksygenet som forbinder polynukleotidet til fosforatomet er oksygenet ved 5'-hydroksyl av(CA)10.
77. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et konjugat ifølge et hvilket som helst av kravene 19-47 og 58-64 eller en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 67-75, og en farmasøytisk akseptabel bærer.
78. Farmasøytisk preparat ifølge krav 77, karakterisert v e d at det omfatter et konjugat ifølge krav 59 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
79. Farmasøytisk preparat ifølge krav 77, karakterisert v e d at det omfatter et konjugat ifølge krav 60 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
80. Farmasøytisk preparat ifølge krav 77, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 67 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
81. Farmasøytisk preparat ifølge krav 77, karakterisert v e d at det omfatter en forbindelse ifølge krav 72 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
82. Farmasøytisk preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 78-81, karakterisert ved at det er egnet for injeksjon.
83. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 72 for fremstilling av et preparat for behandling av human systemisk lupus erytematosus.
NO19960952A 1993-09-08 1996-03-07 Kjemisk definerte valensplattformmolekyler, konjugater derav, farmasoytiske preparater innholdende disse, fremgangsmate for fremstilling av konjugatene, sammensetning for anvendelse ved fremstilling, samt anvendelse av en forbindelse. NO319084B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/118,055 US6060056A (en) 1991-02-08 1993-09-08 Composition for inducing humoral anergy to an immunogen comprising a T cell epitope-deficient analog of the immunogen conjugated to a nonimmunogenic valency platform molecule
US08/152,506 US5552391A (en) 1990-01-16 1993-11-15 Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
PCT/US1994/010031 WO1995007073A1 (en) 1993-09-08 1994-09-08 Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO960952D0 NO960952D0 (no) 1996-03-07
NO960952L NO960952L (no) 1996-05-02
NO319084B1 true NO319084B1 (no) 2005-06-13

Family

ID=26815927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19960952A NO319084B1 (no) 1993-09-08 1996-03-07 Kjemisk definerte valensplattformmolekyler, konjugater derav, farmasoytiske preparater innholdende disse, fremgangsmate for fremstilling av konjugatene, sammensetning for anvendelse ved fremstilling, samt anvendelse av en forbindelse.

Country Status (9)

Country Link
US (5) US5552391A (no)
EP (1) EP0722318A4 (no)
JP (2) JPH09500389A (no)
CN (2) CN1203847C (no)
AU (1) AU677710B2 (no)
CA (1) CA2171434C (no)
FI (1) FI117322B (no)
NO (1) NO319084B1 (no)
WO (1) WO1995007073A1 (no)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5268454A (en) 1991-02-08 1993-12-07 La Jolla Pharmaceutical Company Composition for inducing humoral anergy to an immunogen comprising a t cell epitope-deficient analog of the immunogen conjugated to a nonimmunogenic carrier
US5552391A (en) * 1990-01-16 1996-09-03 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
EP0642798B1 (en) * 1993-09-08 2007-04-18 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
KR100361933B1 (ko) * 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
US8071737B2 (en) 1995-05-04 2011-12-06 Glead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5874409A (en) * 1995-06-07 1999-02-23 La Jolla Pharmaceutical Company APL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for APL antibody-mediated pathologies
US6410775B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 La Jolla Pharmaceutical Company APL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for APL antibody-mediated pathologies
US6232299B1 (en) 1996-05-01 2001-05-15 Eli Lilly And Company Use of protein kinase C inhibitors to enhance the clinical efficacy of oncolytic agents and radiation therapy
JP2000512981A (ja) * 1996-06-06 2000-10-03 ラ ホヤ ファーマシューティカル カンパニー ａＰＬ免疫応答性ペプチド、その結合体およびａＰＬ抗体媒介病理のための処置方法
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
ES2546173T3 (es) 1998-03-13 2015-09-21 Canon Kabushiki Kaisha Aparato y procedimiento para el procesamiento de la información
US6251382B1 (en) * 1998-04-17 2001-06-26 Enzon, Inc. Biodegradable high molecular weight polymeric linkers and their conjugates
US6858210B1 (en) 1998-06-09 2005-02-22 La Jolla Pharmaceutical Co. Therapeutic and diagnostic domain 1 β2GPI polypeptides and methods of using same
EP1632496A1 (en) * 1998-06-22 2006-03-08 Affymetrix, Inc. Reagents and methods for solid phase synthesis and display
US6458953B1 (en) * 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
US20010010818A1 (en) * 1998-12-09 2001-08-02 Engle Steven B. Methods and formulations for reducing circulating antibodies
AU2173500A (en) * 1998-12-09 2000-06-26 La Jolla Pharmaceutical Company Methods and formulations for reducing circulating antibodies
US6399578B1 (en) * 1998-12-09 2002-06-04 La Jolla Pharmaceutical Company Conjugates comprising galactose α1,3 galactosyl epitopes and methods of using same
KR20010093813A (ko) * 1998-12-09 2001-10-29 와이즈먼 앤드루 카르바메이트 결합을 포함하는 템플레이트로서 작용하는분자 스캐폴드
EP1183230A1 (en) * 1999-06-08 2002-03-06 La Jolla Pharmaceutical Valency platform molecules comprising aminooxy groups
US7479285B1 (en) 1999-08-19 2009-01-20 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
KR20020059808A (ko) 1999-11-28 2002-07-13 와이즈먼 앤드루 항체 친화도에 기초한 루프스 치료방법 및 그것의 사용을위한 스크리닝 방법과 조성물
AU2001268228A1 (en) 2000-06-08 2001-12-17 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
EP2351855A1 (en) * 2000-09-26 2011-08-03 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
ATE471374T1 (de) 2000-12-27 2010-07-15 Dynavax Tech Corp Immunomodulatorische polynukleotide und verfahren zur deren verwendung
WO2002066066A1 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
ATE378342T1 (de) * 2001-02-20 2007-11-15 Enzon Inc Terminal verzweigte, polymere linker und diese enthaltende polymere konjugate
WO2002092011A2 (en) * 2001-05-17 2002-11-21 La Jolla Pharmaceutical Company Methods of treating antibody-mediated pathologies using agents which inhibit cd21
DE60237768D1 (de) * 2001-05-25 2010-11-04 Univ Duke Modulatoren pharmakologischer mittel
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
EP1404873B1 (en) * 2001-06-21 2013-05-22 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US20030114405A1 (en) * 2001-08-13 2003-06-19 Linnik Matthew D. Methods of treating systemic lupus erythematosus in individuals having significantly impaired renal function
US20030138425A1 (en) * 2001-09-21 2003-07-24 Mather Jennie Powell Antibodies that bind to cancer-associated antigen cytokeratin 8 and methods of use thereof
GB0123961D0 (en) * 2001-10-05 2001-11-28 Astrazeneca Ab Process and intermediates
US7105135B2 (en) * 2001-10-16 2006-09-12 Lockheed Martin Corporation System and method for large scale detection of hazardous materials in the mail or in other objects
AU2003230929A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
CN1662254A (zh) * 2002-05-03 2005-08-31 雷文生物技术公司 Alcam和alcam调制剂
AU2003243749B2 (en) 2002-06-19 2010-03-11 Macrogenics West, Inc. Novel RAAG10 cell surface target and a family of antibodies recognizing that target
JP2006505523A (ja) 2002-08-12 2006-02-16 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫調節組成物、その製造方法および使用方法
CA2505633A1 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antigen pipa and antibodies that bind thereto
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
AU2003297483B2 (en) 2002-12-23 2010-11-18 Trisalus Life Sciences, Inc. Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US20040208864A1 (en) * 2002-12-27 2004-10-21 Vibeke Strand Methods of improving health-related quality of life in individuals with systemic lupus erythematosus
WO2004089422A2 (en) * 2003-03-30 2004-10-21 La Jolla Pharmaceutical Co. Methods of treating and monitoring systemic lupus erythematosus in individuals
US20050232926A1 (en) * 2003-06-06 2005-10-20 Oncomax Acquisition Corp. Antibodies specific for cancer associated antigen SM5-1 and uses thereof
CN1279056C (zh) * 2003-06-06 2006-10-11 马菁 肿瘤相关抗原sm5－1的特异性抗体及其应用
CN1867580B (zh) * 2003-09-03 2010-09-29 协和发酵麒麟株式会社 被甘油衍生物修饰的化合物
AU2004274487B2 (en) 2003-09-18 2011-09-01 Macrogenics West, Inc. KID3 and KID3 antibodies that bind thereto
CN1980947B (zh) * 2004-04-22 2013-01-30 雷加多生物科学公司 改良的凝血因子调节物
AU2005252699B2 (en) * 2004-06-07 2010-12-23 Macrogenics West, Inc. Transferrin receptor antibodies
KR101268877B1 (ko) * 2004-09-01 2013-05-31 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 선천성 면역반응 및 자가면역의 억제를 위한 방법 및조성물
CA2591582A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for induction or promotion of immune tolerance
EP1846767B1 (en) 2005-01-12 2012-06-06 MacroGenics West, Inc. Kid31 and antibodies that bind thereto
JP2008538173A (ja) * 2005-01-31 2008-10-16 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド Ｌｕｃａ２およびそれに結合する抗体
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
WO2006084078A2 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Raven Biotechnologies, Inc. Jam-3 and antibodies that bind thereto
US7572896B2 (en) 2005-02-03 2009-08-11 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies to oncostatin M receptor
CA2597198C (en) * 2005-02-04 2016-06-21 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to epha2 and methods of use thereof
JP5601836B2 (ja) 2006-11-08 2014-10-08 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド Ｔｅｓ７およびｔｅｓ７に結合する抗体
CN101636495A (zh) * 2006-11-09 2010-01-27 戴纳瓦克斯技术公司 使用免疫刺激性寡核苷酸进行长期的疾病修饰
EP2209896B1 (en) 2007-10-26 2017-03-01 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for inhibition of immune responses and autoimmunity
AU2009246169B2 (en) 2008-05-15 2015-01-22 Dynavax Technologies Corporation Long term disease modification using immunostimulatory oligonucleotides
EP2464661B1 (en) 2009-08-13 2018-01-17 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function with anti-b7-h7cr antibodies
CN102762983B (zh) * 2010-02-12 2016-01-20 耶达研究及发展有限公司 系统性红斑狼疮（sle）的诊断
HUE045487T2 (hu) 2010-03-04 2019-12-30 Macrogenics Inc B7-H3-ra reaktív antitestek, immunológiailag aktív fragmenseik és alkalmazásaik
CN103153346A (zh) 2010-06-16 2013-06-12 戴纳瓦克斯技术公司 使用tlr7和/或tlr9抑制剂的治疗方法
US9228184B2 (en) 2012-09-29 2016-01-05 Dynavax Technologies Corporation Human toll-like receptor inhibitors and methods of use thereof
JP2017503169A (ja) 2013-12-31 2017-01-26 イエダ・リサーチ・アンド・デベロツプメント・カンパニー・リミテツド オリゴヌクレオチド抗原を使用する全身性エリテマトーデスの診断
BR112016018754A2 (pt) 2014-02-14 2017-10-10 S Chi Andrew método de tratamento de um câncer com vascularização
EP3265814B1 (en) 2015-03-01 2020-11-18 Immunarray Ltd. Diagnosis of systemic lupus erythematosus using protein, peptide and oligonucleotide antigens
US10864279B2 (en) 2016-12-16 2020-12-15 Industrial Technology Research Institute Linker-drug and antibody-drug conjugate (ADC) employing the same
US11198761B2 (en) * 2017-02-16 2021-12-14 Agency For Science, Technology And Research Biodegradable polyionenes
CA3099434C (en) * 2018-05-04 2023-09-05 Twinpig Biolab Inc. Targeting m2-like tumor-associated macrophages by using melittin-based pro-apoptotic peptide
GB201909103D0 (en) * 2019-06-25 2019-08-07 Univ Bath Compounds

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4191668A (en) * 1977-02-03 1980-03-04 Scripps Clinic And Research Foundation Induction of immunological tolerance
US4220565A (en) * 1979-01-18 1980-09-02 Scripps Clinic & Research Foundation Immunochemical conjugates: method and composition
US5126131A (en) * 1983-01-24 1992-06-30 The Johns Hopkins University Therapeutic suppression of specific immune responses by administration of antigen-competitive conjugates.
US4650675A (en) * 1983-08-18 1987-03-17 The Children's Medical Center Corporation Oligonucleotide conjugates
US4751181A (en) * 1984-12-31 1988-06-14 Duke University Methods and compositions useful in the diagnosis and treatment of autoimmune diseases
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4946235A (en) * 1989-10-11 1990-08-07 Eastman Kodak Company Nonlinear optical waveguide device
US5162515A (en) * 1990-01-16 1992-11-10 La Jolla Pharmaceutical Company Conjugates of biologically stable polymers and polynucleotides for treating systemic lupus erythematosus
US5552391A (en) * 1990-01-16 1996-09-03 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
CA2098281A1 (en) * 1990-12-17 1992-06-18 Howard M. Dintzis Suppression of immune responses of oligomeric forms of antigen of controlled chemistry
WO1993012145A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
EP0642798B1 (en) * 1993-09-08 2007-04-18 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
NO960952L (no) 1996-05-02
JP2002085062A (ja) 2002-03-26
US20080293660A1 (en) 2008-11-27
US5633395A (en) 1997-05-27
CA2171434A1 (en) 1995-03-16
NO960952D0 (no) 1996-03-07
CN1203847C (zh) 2005-06-01
CN1572797A (zh) 2005-02-02
CN1134109A (zh) 1996-10-23
AU677710B2 (en) 1997-05-01
EP0722318A1 (en) 1996-07-24
US20070254851A1 (en) 2007-11-01
FI961100A0 (fi) 1996-03-08
FI961100A (fi) 1996-05-08
US5552391A (en) 1996-09-03
WO1995007073A1 (en) 1995-03-16
CN1318023C (zh) 2007-05-30
US5606047A (en) 1997-02-25
EP0722318A4 (en) 1998-08-05
JPH09500389A (ja) 1997-01-14
AU7720994A (en) 1995-03-27
CA2171434C (en) 2009-03-17
FI117322B (fi) 2006-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO319084B1 (no) Kjemisk definerte valensplattformmolekyler, konjugater derav, farmasoytiske preparater innholdende disse, fremgangsmate for fremstilling av konjugatene, sammensetning for anvendelse ved fremstilling, samt anvendelse av en forbindelse.
US7115581B2 (en) Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
US7138244B2 (en) Composition for inducing humoral anergy to an immunogen comprising a T cell epitope-deficient analog of the immunogen conjugated to a nonimmunogenic valency platform molecule
EP0642798A2 (en) Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
US5276013A (en) Conjugates of biologically stable polyfunctional molecules and polynucleotides for treating systemic lupus erythematosus
Kojima et al. Limiting dilution comparison of the repertoires of high and low responder MHC-restricted T cells.
JP3836888B2 (ja) 化学的に定義された非ポリマー性結合手プラットフォーム分子およびその複合体
PT642798E (pt) Moléculas plataforma de valência não poliméricas defenidas quimicamente e seus conjugados.

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees