PT642798E - Moléculas plataforma de valência não poliméricas defenidas quimicamente e seus conjugados. - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ DESCRIÇÃO "Moléculas plataforma de valência não poliméricas definidas quimicamente e seus conjugados"

Campo técnico

Este invento refere-se a conjugados compreendendo moléculas plataforma de valência definidas quimicamente acopladas a polinucleótidos para tratamento de doenças tais como a doença autoimune lúpus eritematoso sistémico (LES ou "lúpus"). 0 invento refere-se também às moléculas plataforma de valência definidas quimicamente.

Antecedentes Vários compostos têm sido utilizados como transportadores para moléculas biologicamente úteis na preparação de conjugados que são alegadamente tolerogénicos. Por exemplo, Benacerraf, Katz, e seus colegas investigaram e descreveram a utilização de conjugados do co-polímero aleatório ácido D-glutâmico/D-lisina, designado por D-GL em literatura anterior (aqui depois D-EK), com haptenos e vários antigénios para induzir imunotolerância específica. Ver Patentes U.S. N.os 4191668 e 4220565.

Outros investigadores estudaram conjugados de nucleósidos ou de ADN com outros transportadores. Borel et al. (Science (1973) 182:76) avaliaram a capacidade de conjugados isogénicos de nucleósido-IgG de ratinho para reduzir a resposta de anticorpo a ADN desnaturado em animais jovens da estirpe de ratinho nzb. Em estudos separados, Parker et al. (J. Immunol. (1974) 113:292) avaliaram o efeito de ADN desnaturado conjugado com poli-D-lisina e/ou ciclofosfamida na progressão da síndrome anteriormente descrita em ratinhos NZB.

Num artigo posterior (Ann. NY. Acad. Sei. (1986) 475:296-306), Borel et al. descrevem conjugados de oligonucleótido-imunoglobulina. Borel et al. (J. Clin. Invest. (1988) 82:1901-1907 ou Patente U.S. N.° 4650675) descreveram estudos in vltro utilizando conjugados de imunoglobulina de humano ligada a ADN. A Patente U.S. N.° 5126131 (Dintzis et al.) refere-se também a conjugados 2 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ compreendendo transportadores e moléculas envolvidas em respostas imunitárias.

Outras referências descrevem conjugados de polímeros não imunogénicos e de imunogénios (Saski et al., Scand. J. Immun. (1982) 16:191-200; Sehon, Prog, Allergy (1982) 32:161-202;

Wilkinson et al., J. Immunol. (987) 139:326-331, e Borel et al., J. Immunol. Methods (1990) 126:159-168).

No pedido dos mesmos titulares de Patente U.S. N.° de Série 07/914869 (Patente U.S. N.° 5276013), Patente U.S. N.° 5162515 e Pedido de Patente U.S. N° de Série 07/652648 (Patente U.S. N.° 5268454) e em EP-A-0438259, descrevem-se conjugados compreendendo transportadores poliméricos tais como D-EK, polietilenoglicol, poli-D-lisina, poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona e imunoglobulinas.

Efimov et al., Bioorganicheskaya Khimiya, vol. 19, n.° 8, 800-804, 1993 revelam um método para a síntese de moléculas de conjugado de 3'-, 5'- e 3',5'-PEG-oligo-nucleótido. Em WO 88/09810 revelam-se conjugados de oligonucleótido onde oligonucleótidos são unidos, através de um braço de ligação, a uma porção hidrófoba. Em EP-A-0442724 revelam-se derivados de interleucina-6 "PEGuilados".

Em WO 87/00056 descrevem-se composições farmacêuticas compreendendo um meio transportador aquoso farmaceuticamente aceitável, inerte, não tóxico, no qual está dissolvido um conjugado de uma proteína seleccionada de entre interferão-β, interleucina-2 e uma imunotoxina, onde a proteína está conjugada covalentemente a um polímero solúvel em água seleccionado de entre homopolímeros de polietilenoglicol e polióis polioxietilados.

Em suma, crê-se que a especialidade anterior apenas mostra compostos químicos mal definidos ou compostos com numerosos sítios de ligação não específicos, utilizados como moléculas plataforma de valência em conjugados. Porque a valência destes compostos, a localização específica dos locais de ligação e o número de locais de ligação são imprevisíveis e variam grandemente, os conjugados da especialidade anterior compreendendo estes compostos não podem ser produzidos de modo reprodutível e apresentam vastas gamas em termos da sua actividade reportada. 3 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Revelação do invento

Em contraste com a especialidade anteriormente descrita, foram agora desenvolvidos conjugados que compreendem moléculas plataforma de valência definidas quimicamente onde a valência das moléculas plataforma está predeterminada e onde cada sitio de ligação está disponível para ligação de uma molécula biológica ou química. As moléculas plataforma de valência no âmbito do presente invento estão definidas no que se refere à sua estrutura química, valência, homogeneidade e a uma química definida que é susceptível de conjugação efectiva com o polinucleótido.

Por conseguinte, o presente invento proporciona um conjugado compreendendo um polinucleótido acoplado a uma molécula plataforma de valência, conjugado que tem a fórmula geral (I) :

?\ / -C-H O 0 ii n (CH2}5-NHCCH3- 0 II -S(CH2)íO—P-O-PN 0' 0' 00

(CHz^NHC—(CH2)g—NHCCI%-Ò O -SCCH^O- -P~ II0

-0—PN onde G[2] é -CH2 (CH2OCH2)rCH2- onde r = 0 a 300 e PN é um polinucleótido. 0 invento proporciona ainda: • um método para produção de um conjugado de fórmula (I) onde o polinucleótido é um polinucleótido duplex de pelo menos 20 pares de bases, método que compreende: (a) conjugação de um ligador de polinucleótido de fórmula geral (II):

O

II

ssPN -O—P—0(CH2)6SH

O 4 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ onde ssPN significa um polinucleótido de cadeia simples de pelo menos 20 nucleótidos de comprimento, com uma molécula plataforma de valência da fórmula geral (III) : O 0 f! ií 0 / H / 0~~C-N \ (CH2)2NHC—(CH2)5-NHCCH2~ Kg (Cfí^NHC—(CH2)5— NHCCH2— Kg O 0 onde Rg é halogéneo e G[2] é conforme aqui definido; e (b) hibridação de polinucleótidos de cadeia simples complementares com cada um dos referidos polinucleótidos de cadeia simples ssPN; • uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado do invento e um veiculo farmaceuticamente aceitável; e • uma molécula plataforma de valência da fórmula geral (III) : G! m. o o 0 (CH2)2NHC......(Cii2)5— NHCCHj- Λ S| / -O—C—N \ (Hl) (CH2)2NHC~ ti 0 -NHCCH2—Rg i! 2 S 0 onde G[21 é -CH2 (CH2OCH2)rCH2- onde r = 0 a 300 e Rg é halogéneo.

Numa concretização preferida adicional para tratamento de lúpus, o conjugado compreende a molécula plataforma de valência definida quimicamente e uma multiplicidade de duplexes de polinucleótido de pelo menos cerca de 20 pares de bases, cada um ligado à molécula plataforma, e possuindo 5 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ actividade de ligação significativa por autoanticorpos anti-ADNds de LES de humano. Nestas concretizações preferidas, os duplexes de polinucleótido são substancialmente homogéneos em comprimento e uma cadeia do duplex está conjugada com a molécula plataforma de valência quer directamente quer via uma molécula de ligador. Usualmente, polinucleótidos sintéticos são acoplados a uma molécula de ligador antes de serem acoplados a uma molécula plataforma de valência. Usualmente, a cadeia do duplex contendo o ligador é acoplada a uma das suas extremidades, ou na sua proximidade (i.e. dentro de cerca de 5 pares de bases), tal que cada cadeia forma uma cadeia pendente de pelo menos cerca de 20 pares de bases medidos desde o local de ligação da cadeia à molécula de ligador. A segunda cadeia é depois hibridada com a primeira cadeia para formar um duplex.

Uma molécula de ligador adequada no âmbito do presente invento é o tiol de 6 carbonos HAD, um fosfato com uma cadeia de tio-6 carbonos. As moléculas plataforma de valência definidas quimicamente no âmbito do presente invento são formadas, por exemplo, fazendo reagir PEG-bis-cloroformato com N,N-di(2-[6'-N'-carbobenziloxiamino-hexanoamido]etil)-amina (aqui depois "AHAB").

Conseguem-se resultados surpreendentemente inesperados, de pelo menos aproximadamente dez vezes até mais do que vezes de aumento em imunossupressão, utilizando conjugados compreendendo as moléculas plataforma de valência definidas quimicamente do presente invento e um polinucleótido, em comparação com os transportadores poliméricos descritos na especialidade anterior. Por exemplo, conseguiu-se um aumento de pelo menos cem vezes na imunossupressão de autoanticorpos anti-ADNds, conforme aqui descrito, utilizando conjugados no âmbito do presente invento compreendendo moléculas plataforma de valência definidas quimicamente, em comparação com conjugados compreendendo um transportador mal definido descritos na especialidade anterior.

Ainda outro aspecto do invento é um conjugado (a) da molécula plataforma de valência definida quimicamente e (b) de uma multiplicidade de duplexes de polinucleótido, cada um e todos os quais estão ligados à plataforma de valência por um grupo funcional localizado na extremidade de uma das cadeias do duplex, ou na sua proximidade, o referido 6 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ conjugado sendo um tolerógeno de LES de humano.

Os conjugados do invento podem assim ser utilizados num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. Um indivíduo pode assim ser tratado contra o LES por administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz dos conjugados anteriormente descritos.

Os conjugados do invento são preparados por um método compreendendo: ligar covalentemente um polinucleótido a uma molécula plataforma de valência definida quimicamente para formar um conjugado. Assim, os conjugados para tratamento de LES anteriormente descritos podem ser preparados por um método compreendendo: fazer reagir uma multiplicidade de polinucleótidos de cadeia simples cada um dos quais tem pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento e possui um grupo funcional numa sua extremidade, ou na sua proximidade, que reage com grupos funcionais na molécula plataforma de valência definida quimicamente para formar um conjugado, e hibridar polinucleótidos de cadeia simples complementares com os polinucleótidos de cadeia simples conjugados com a molécula plataforma de valência definida quimicamente para formar cadeias pendentes de ADN de cadeia dupla.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 mostra a resposta anti-PN em ratinhos iniciados com PN-KLH, tratados com (PN) 2o-HAD-AHAB-TEG, Conjugado 20-11, nas doses indicadas, ou com HAD-ARAB sozinho, ou o PN sozinho ou uma mistura de cada, depois reforçados com PN-KLH e sangrados 5 dias mais tarde. Testaram-se os soros pelo ensaio de Farr utilizando PN radiomarcado numa concentração de 10“8 M. Calculou-se a redução percentual e apresentam-se os resultados. Existiam 5 ratinhos por grupo.

As Figuras 2 e 3 mostram a estrutura da molécula plataforma de valência derivatizada e do ligador acoplando o polinucleótido à molécula plataforma para Conjugados 3-1 e 3-II (Figura 2) e 20-1 e 20-11 (Figura 3). A Figura 4 mostra as estruturas da molécula plataforma de valência derivatizada "HAD-AHAB-TEG". 7 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ A Figura 5 ilustra ο aumento na percentagem de redução em anticorpo anti-PNds conseguido por conjugados LJP-249A e LJP-249B, que são o Conjugado 3-II, em comparação com um conjugado da especialidade anterior (LJP-105) compreendendo D-EK e (PN)so. A Figura 6 ilustra a supressão de anticorpos IgG anti-ADN, em circulação no soro, em ratinhos BXSB machos tratados com LJP-394, Conjugado 20-11. Utilizou-se um ensaio ELISA para medir os anticorpos IgG contra (PN)50 conjugado a D-EK. Ensaiou-se o soro a partir de cada um de oito ratinhos individuais em cada grupo.

Modos para realização do invento

Conforme aqui utilizada "molécula plataforma de valência" significa uma molécula não imunogénica definida quimicamente contendo locais que facilitam a ligação de um numero discreto de moléculas biológicas e/ou químicas. "Não imunogénica" é utilizada para descrever a molécula plataforma de valência e significa que a molécula plataforma de valência não induz substancialmente qualquer resposta imunitária quando é administrada só por si a um indivíduo.

Conforme aqui utilizado, "indivíduo" designa um membro de uma espécie de mamífero e inclui humanos, primatas, ratinhos e animais domésticos, tais como gado e ovinos, animais de desporto tais como cavalos, e animais de estimação tais como cães e gatos. A valência de uma molécula plataforma de valência definida quimicamente no âmbito do presente invento é predeterminada pelo número de grupos de ramificação adicionados à molécula plataforma. Um conjugado no âmbito do presente invento está estabilizado biologicamente; isto é, exibe uma semivida de excreção in vivo de horas a dias até meses para conferir eficácia terapêutica. As moléculas plataforma de valência definidas quimicamente do presente invento são também substancialmente não imunogénicas (i.e., não exibem qualquer imunogenicidade ou apenas uma imunogenicidade fraca quando administrados a animais), não tóxicas nas doses administradas (i.e., são suficientemente não tóxicas para serem úteis como agentes terapêuticos) e são 8 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ preferivelmente compostas de uma estrutura química definida. Proporcionam um substrato polifuncional não imunogénico, não tóxico, ao qual se podem ligar covalentemente duplexes de polinucleótido. Terão normalmente um peso molecular médio na gama de cerca de 200 a cerca de 200 000, usualmente cerca de 200 a cerca de 20 000, e são homogéneas em comparação com polímeros da especialidade anterior que eram uma mistura de compostos de peso molecular grandemente variável. Exemplos de moléculas plataforma de valência homogéneas particularmente preferidas no âmbito do presente invento são trietilenoglicol (TEG) derivatizado e polietilenoglicóis (PEGs) possuindo um peso molecular de cerca de 200 a cerca de 8000.

Os duplexes de polinucleótidos sintéticos, que são acoplados à molécula plataforma de valência, são compostos de pelo menos 20 pb e preferivelmente 20-50 pb. Os polinucleótidos aqui descritos são desoxirribonucleótidos, a não ser onde indicado de outro modo, e são apresentados na orientação 5' para 3'. Preferivelmente, os duplexes são substancialmente homogéneos em comprimento; isto é, a variação em comprimento na população não excederá normalmente ±20%, preferivelmente ±10%, do comprimento de duplex médio em pares de bases. Preferivelmente, são também substancialmente homogéneos em composição de nucleótidos; isto é, a sua composição e sequência de bases não variarão de duplex para duplex mais do que 10%. Muito preferivelmente, são totalmente homogéneos em composição de nucleótidos de duplex para duplex.

Com base na interpretação dos espectros circulares dicróicos (CD), os duplexes que são úteis no invento assumem uma estrutura helicoidal do tipo B-ADN. Deverá ser entendido que não se pretende que o invento seja limitado por esta convicção e que os duplexes podem, após análises mais conclusivas, assumir estruturas helicoidais do tipo Z-ADN e/ou A-ADN.

Estes duplexes de polinucleótidos podem ser sintetizados a partir de ADN nativo ou sintetizados por técnicas químicas ou recombinantes. ADNds de ocorrência natural ou produzidos de modo recombinante de comprimento mais longo podem ser digeridos (e.g., enzimaticamente, quimicamente ou por cisalhamento mecânico) e fraccionados (e.g., por gel de agarose ou coluna Sephadex®) para obter polinucleótidos do 9 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ comprimento desejado.

Alternativamente, pares de cadeias de polinucleótido de cadeia simples complementares, com até 70 bases de comprimento, são facilmente preparados utilizando sintetizadores de ADN disponíveis comercialmente e depois hibridados para formar duplexes por procedimentos convencionais. Pode-se obter ADNds sintético de comprimento mais longo por extensão enzimática (fosforilação 5' seguida por ligação) das cadeias mais curtas produzidas quimicamente.

Os polinucleótidos podem também ser preparados por clonagem molecular. Por exemplo, sintetizam-se como anteriormente polinucleótidos de comprimento e sequência desejados. Estes polinucleótidos podem ser desenhados para terem terminais para ligação em locais de restrição específicos. Podem-se ligar em tandem múltiplas iterações destes oligómeros para proporcionar a replicação de múltiplas cópias. A construção resultante é inserida num vector de clonagem padrão e o vector é introduzido num microrganismo/célula adequados por transformação. Os transformantes são identificados por marcadores padrão e são cultivados sob condições que favorecem a replicação de ADN. Os polinucleótidos podem ser isolados a partir do outro ADN da célula/microrganismo por tratamento com enzimas de restrição e fraccionamento de tamanhos convencional (e.g., gel de agarose, coluna Sephadex®).

Alternativamente, os polinucleótidos podem ser replicados pela tecnologia de reacção em cadeia da polimerase (PCR). Saiki, R.K, et al., Science (1985) 230:1350; Sacki, et al., Science (1988) 239:487; Sambrook, et al., In Molecular Cloning Techniques: A Laboratory Manual, Vol. 12, pp. 14.1-14.35 Cold Spring Harbor Press (1989).

Os polinucleótidos podem ser rastreados quanto à actividade de ligação com anti-soros de LES pelos ensaios descritos nos exemplos. Um ensaio preferido é o ensaio de Farr modificado no qual a actividade de ligação pode ser expressa como I50 (a concentração de polinucleótido em nucleótidos molares resultando numa inibição semimáxima). Crê-se que duplexes de polinucleótido com uma I50 inferior a cerca de 500 nM, preferivelmente inferior a 50 nM, têm actividade de ligação significativa e são, deste modo, úteis 10 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ na preparação dos conjugados deste invento.

Os polinucleótidos são conjugados com a molécula plataforma de valência definida quimicamente de um modo que preserva a sua actividade de ligação de anticorpo. Isto é realizado por conjugação do polinucleótido com a molécula plataforma de valência, num local predeterminado sobre a cadeia de polinucleótido, de modo a que o polinucleótido forme uma cadeia pendente de pelo menos 20 pares de bases, medidos desde o local de conjugação até à extremidade livre (não ligada) da cadeia.

Numa concretização particularmente preferida, os polinucleótidos do invento conjugados são acoplados a uma molécula de ligador numa das suas extremidades ou na sua proximidade. A molécula de ligador é depois acoplada à molécula plataforma de valência definida quimicamente. Por exemplo, um PN de cadeia dupla definida pode ser conjugado com uma molécula plataforma de valência proporcionando primeiro uma cadeia simples consistindo de 20 nucleótidos alternantes de citosina (C) e adenosina (A). Quatro cadeias CA podem então ser conjugadas covalentemente através de ligadores, tais como HAD, com quatro locais reactivos sobre uma molécula plataforma derivatizada tal como trietilenoglicol. A molécula plataforma de valência é sintetizada para incluir grupos tais como bromoacetilo. Durante a conjugação, um grupo rejeitável é deslocado por enxofre. Uma segunda cadeia simples de nucleótidos consistindo de 20 nucleótidos alternantes timidina (T) e guanosina (G) pode depois ser hibridada com a cadeia CA para formar um conjugado de PN de cadeia dupla da fórmula, [ (PN) 2o~ligador] 4-molécula plataforma de valência.

Os conjugados serão normalmente formulados para administração por injecção (e.g., intraperitonealmente, intramuscularmente, intravenosamente etc.). Deste modo, serão tipicamente combinados com transportadores aquosos farmaceuticamente aceitáveis tais como solução salina, Solução de Ringer, solução de dextrose, e outras. O conjugado constituirá normalmente cerca de 0,01% a 10% em peso da formulação. O conjugado é administrado a um indivíduo em quantidades suficientes para pelo menos restabelecer parcialmente tolerância aos autoantigénios que causam o LES. Estas quantidades são por vezes aqui referidas por quantidades "terapeuticamente eficazes". O regime de dosagem particular, i.e., dose, tempos e repetição, dependerá do indivíduo particular e da história médica desse indivíduo. 11 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Normalmente, será dada uma dose de cerca de 1 a 1000 pg de conjugado/kg de peso corporal. Podem ser requeridas administrações repetidas para conseguir e/ou manter um estado de tolerância imunitária.

Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente o invento e o seu carácter inesperado em relação à especialidade anterior.

Exemplo 1

Os esquemas reaccionais seguintes ilustram métodos de síntese de moléculas plataforma de valência definidas quimicamente derivatizadas no âmbito do presente invento. Neste exemplo, DMTr = 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo; Tr tritilo; Bz = benzoilo; Cp = desoxicitidina-monofosfato, CE = cianoetilo; CPG = vidro de poro controlado, DMF = dimetil-formamida, DCC = diciclo-hexilcarbodi-imida, TFA = ácido tri-fluoroacético, CDI = carbonildi-imidazole, Ts = tosilo (para-toluenossulfonilo), DIPAT = tetrazoleto de di-isopropilamónio, TBDMSC1 = cloreto de terc-butil-dimetilsililo, TBAF = fluoreto de tetrabutilamónio, IA-DABA = 3,5-bis- (iodoacetamida)benzoilo.

Esquema reaccional 1

O

O

n = aprox. 74, (PEG3j^CCÔNHGHjCHNHg) r DMF/H30 danCô3

tCH-jCONH

}CHtCONH

so<v

tCHjCONH V

I í

XA-DABA-PEG 12 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Esquema reaccional 2 C82HM, CO dietilenotriamina fcíOAt.

/ \ HM nhCO{CH2)sMHCB2

NHCO{CH3)3nhC82 bis-cloroformato de trietilenoglicol piridina

CE2HH(CH2) 5oo WH o W......' x^~ o

CBZHMíCH^dCONH

J

'0 (

oA......U

-NHC0(CH2)3KHCBZ t NHCO(ÇHs),NHC92 is

t^N(CH,)sCONH

O

Pd/ C ciclo-hexeno BOH

H2M(CH,}sCOWH j Q X 17° ^

/"•WHOOíCHjlsNHj 0 { <1 V NHCÔ(CK,LMH. m m MeHCOa H20/dioxano 8íC HqCQ M N (CHZ) jCON 11'

O

8fCH?COHN(CH2}sCOWH NV- NHCO(CH-) -WHCOCH ,Qr 2Λ WHCO(CH,)„WHCOCH,eí

!3rA - AHAB ~ TEG 13 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Esquema reaccional 3 trifosgénio Ο » » Ο polietilenoglicol (ΡΕβ;335θ5 JL / q \ 31 X Jn

CSZHNCOiaísCONH

CeZHNÍCf^JgOÔNH Λ Ν- Ο (composto 18 dioxano/piridina y f~ NHCO{{>fe3sWC82

O

&jL. ?á7C ciclo-hexeno/EtOH NHO)(GHg)sMHCa2:

H2N(CH2)eOONH

H?N(CHjJsCOWH

J

O

Γ -N NHCO(CH2)sNH3 "NHCO(CH2)5NHg 39 n = aprox. 74

BrCHjCOHNÍCH^iCOí-JH Λ

SíCHaCOHNfCMjJsCQMH

J

J 1& N^HCOj Y dioxano/H20 N~-"xrtWA

O

O f NHCCKCH^sNHCOCHjSf - NHCOíO^isíííHCClCH^f 33. n = aprox. 74

BrA - AHAB - PEG 14 14 EP 0

642 798 /PT A síntese de reagentes utilizados para modificar (CA)8, (CA) ίο' (CA) i2 e (CA) i6 com ligadores de dissulfureto é

Rescrita no Esquema reaccional 4 a seguir:

Esquema reaccional 4 tioureia

o- HH2f Cl- i2 OH

ΟΙΡΛΤ Νθαί2032θΡ01[Κ{1-Ρί·) 2] 2 ' di-isopropiletilamina ( s-s ‘OQMTr "X^()\y

13 .O. âl

j p i <X

'CM

"CM A síntese de um reagente utilizado para modificar (CA)25 m ligadores de diol vicinal é descrita no Esquema reaccional 5 a seguir: 15 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Esquema reaccional 5

^crtBOMS TBDMSCt imidazole WMMO/OaOd oãx

OTBOMS NC^ 8zO 52

CgHjCoa piridina

OH OBz

"OTBOMS OP{ND-P0z32 dipat NO-P^k Ό-Ρ &&

Os^·

CM

Exemplo 2 Síntese de moléculas plataforma de valência definidas quimicamente

Composto de referência 1 - [Ácido 3,5-bis-(iodoacetamido)-benzóico]: Adicionaram-se 2,93 g (8,28 mmol, 2,2 eq) de anidrido iodoacético a uma suspensão agitada de 572 mg (3,76 mmol) de ácido 3,5-diaminobenzóico em 19 ml de dioxano à temperatura ambiente sob uma atmosfera de n2. Agitou-se a mistura, cobriu-se com película durante 20 horas e repartiu-se entre 50 ml de EtOAc e 50 ml de solução de HC1 1 N. Lavou-se a fase de EtOAc com salmoura, secou-se sobre MgS04, filtrou-se, e concentrou-se num evaporador rotativo para dar 3,3 g de um sólido castanho. Purificou-se o material por cromatograf ia em sílica gel (94/5/1 CH2Cl2/MeOH/HOAc) para produzir 992 mg (54%) de composto 1 como um sólido branco: RMN (DMSO) 3,84 (s, 4H) , 7,91 (S, 2H) , 8,14 (s, 1H) , 10,56 (s, 2H).

Composto de referência 2 - Cloreto de [3,5-bis- (iodoacetamido)benzoilo]: Adicionaram-se 117 μΐ (1,6 mmol, 190 mg) de S0C12 a uma solução de 390 mg (0,8 mmol) de 1 em 34 ml de THF. Levou-se a mistura ao refluxo sob atmosfera de N2 até todos os sólidos se terem dissolvido (aproximadamente 16 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ 30 minutos) para dar uma solução castanho-avermelhada clara. Concentrou-se a mistura no evaporador rotativo e colocou-se sob vácuo para proporcionar o composto em bruto 2 como um sólido espumoso, que foi utilizado directamente no passo seguinte.

Composto de referência 3 - Derivado de [N,N'-bis-(3,5-bis-(iodoacetamido)benzoilo) de a,ω-bis-(Ν-2-aminoetilcarbamoil)-polietilenoglicol]: Colocaram-se 570 mg de a,ω-bis-(N-2-aminoetilcarbamoil)polietilenoglicol (0,16 mmol, 3350 g/mol, Sigma) num balão tarado. Adicionou-se tolueno (20 ml) e removeu-se a água por destilação azeotrópica. Secou-se o resíduo sob vácuo para dar 549 mg de sólido e dissolveu-se em 4 ml de THF com 89 μΐ (0,64 mmol) de di-isopropiletilamina. Dissolveu-se o cloreto de ácido em bruto em 4 ml de THF anidro e adicionou-se à mistura durante 30 segundos sob N2. Agitou-se a mistura durante 16 horas à temperatura ambiente e repartiu-se entre 25 ml de HC1 0,1 N e 25 ml de CH2C12. Extraiu-se outra vez a fase aquosa com CH2C12 e combinaram-se as fases orgânicas, lavaram-se com 25 ml de H20, seguindo-se 50 ml de uma solução de NaHC03. Secaram-se as fases orgânicas com Na2S04, filtrou-se e concentrou-se para dar 784 mg de um óleo cor-de-laranja. A cromatografia em sílica gel (CH2Cl2/MeOH 9/1) produziu 190 mg de um óleo incolor que foi cristalizado a partir de Et0H/Et20 quente, recolhido sobre um filtro de vidro sinterizado sob uma pressão de N2 e seco sob vácuo para proporcionar 177 mg de composto 3_ como um sólido branco: RMN (CDC13) 3,40 (m largo, 8H), 3,59 (s largo, (CH2CH20)n, integral demasiado largo para integração em relação a outros integrais), 3,91 (s, 8H), 4,21 (m, 4H), 6,04 (m largo, 2H), 7,55 (m largo, 2H), 7,78 (s largo, 4H), 8,10 (s largo, 2H), 9,30 (m largo, 4H); determinação de iodoacetilo (European Journal of Biochemistry (1984) 140:63-71): Calculado 0,92 mmol/g; Encontrado, 0,96 mmol/g.

Composto 10 - [Bromoacetato de 4-nitrofenilo]: Adicionaram-se 9,28 g (45 mmol) de diciclo-hexilcarbodi-imida a uma solução agitada de 5,0 g (35,9 mmol) ácido bromoacético e 8,50 g (61,1 mmol) de 4-nitrofenol em 180 ml de EtOAc a 0°C. Agitou-se a mistura durante 16 horas a 5°C e adicionou-se 1 ml de ácido acético. Agitou-se a mistura durante 20 minutos à temperatura ambiente e depois colocou-se num congelador durante 20 minutos. Removeu-se o material sólido por filtração, e concentrou-se o filtrado até se obter um óleo 17 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ viscoso e cristalizou-se a partir de Et20/hexanos para proporcionar 7,73 g (83%) de composto 10^ na forma de flocos: p.f. 86-87°C; TLC Rf = 0,63 (hexanos/EtOAc/HOAc 50/50/1); RMN XH (CDC13) d 4,13 (s, 2H), 7,36 (d, J = 12 Hz, 2H), 8,32 (d, J = 12 Hz, 2H) ; RMN 13C (CDC13) d 24,9, 122, 1, 125,3, 155,5 164,9; Anál. calc. para C8H6BrNC>4: C, 36,95; H, 2,33; N, 5,39. Encontrada: C, 37,24; H, 2,33; N, 5,42.

Composto 18 - [1,5-bis(N-carbobenziloxi-6-amino-hexanoamido)-3-azapentanel: Adicionaram-se 3,09 g (19,0 mmol) de carbonildi-imidazole a uma solução de 5,05 g (19,0 mmol) de ácido N-carbobenziloxi-6-amino-hexanóico em 25 ml de EtOAc à temperatura ambiente. Agitou-se a mistura durante 15 horas e depois adicionaram-se 1,02 ml (982 mg, 9,52 mmol) de dietilenotriamina, seguindo-se 2,65 ml (1,93 g, 19,0 mmol) de Et3N. Agitou-se a mistura resultante durante 4 horas, e recolheu-se 0 produto sólido por filtração. A recristalização (MeOH/EtOAc) deu 4,27 g (75%) de composto 18_ na forma de um sólido granuloso fino: p.f. 132-133°C; RMN XH (CDC13) d 1,33 (m, 4H), 1,52 (m, 4H), 1,64 (m, 4H), 2,18 (t, 4H), 2,73 (t, 4H), 3,16 (m, 4H), 3,35 (m, 4H), 4,96 (s largo, 2H), 5,09 (s, 4H), 6,13 (s largo, 2H), 7,33 (s, 10H); Anál. calc. para C32H47N5O6: C, 64,29; H, 7,50; N, 11,72. Encontrada: C, 63,54; H, 7,75; N, 11,91.

Composto 19: Adicionaram-se 657 μΐ (880 mg, 3,2 mmol) de bis-cloroformato de trietilenoglicol (Aldrich) a uma solução de 4,86 g (8,1 mmol) de composto em 162 ml de piridina num banho de água a 20°C. A mistura formou imediatamente um precipitado. Agitou-se a mistura durante 16 horas e concentrou-se sob vácuo a solução amarela turva resultante. Repartiu-se o concentrado entre 150 ml de EtOAc e duas porções de 150 ml de HC1 1 N (assegurando que a fase aquosa estava ácida). Combinaram-se as fases aquosas e extrairam-se com uma segunda porção de 150 ml de EtOAc. Combinaram-se as fases de EtOAc, secou-se (MgS04), filtrou-se e concentrou-se. Cristalizou-se o resíduo resultante (EtOAc/hexanos/CHCl3) para proporcionar 1,92 g (43%) de composto 19_ na forma de cristais finos de cor amarela: p.f. 86-91°C; RMN :H (CDC13) I, 31 (m, 8H), 1,52 (m, 8H), 1,62 (m, 8H), 2,20 (m, 8H), 3,20 (m, 8H), 3,39 (s, 16H), 3,62 (s, 4H), 3,68 (m, 4H), 4,26 (m, 4H), 5,08 (s, 8H), 5,32 (s largo, 4H), 7,31 (s largo, 4H), 7,37 (s, 20H) ; RMN 13C (CDC13) d 25,1, 26,2, 26,4, 29, 6, 36,0, 36,2, 38,5, 38,8, 40,8, 64,5, 66,4, 69,1, 70,3, 128,0, 128,4, 18 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ 136,7, 156,5, 156,9, 173,6; Anál. calc. para C72H104N10O18: C, 61,87; Η, 7,50; N, 10,02. Encontrada: C, 61,68; H, 7,63; N, 9,95.

Composto 36: Adicionaram-se 3,5 ml de ciclo-hexeno a uma solução de 800 mg (0,57 mmol) de composto 19 em 5 ml de EtOH absoluto. Colocou-se a solução sob azoto, adicionaram-se 500 mg de 10% de Pd sobre carbono, e levou-se a mistura resultante ao refluxo com agitação durante 2 horas. Após arrefecer, filtrou-se a mistura através de terra de diatomáceas e concentrou-se para dar 500 mg (100%) de composto 36_ na forma de um óleo: RMN ΧΗ (CDCI3/CD3OD 50/50) d 1,21 (m, 8H), 1,49 (m, 8H) , 1,62 (m, 8H), 2,19 (t, J = 7,4

Hz, 8H), 2,67 (t, J = 7,4 Hz, 8H), 3,36 (s largo, 16H), 3,67 (s, 4H), 3,71 (m, 4H), 4,21 (m, 4H).

Composto 20: Adicionaram-se 3,9 g (46,4 mmol) de NaHC03 a uma solução de 5,0 g (5,8 mmol) de composto 36_ em 37,5 ml de dioxano e 12,5 ml de H20. Arrefeceu-se a mistura até 0°C num banho de gelo e adicionaram-se 8,7 g (34,8 mmol) de bromoacetato de 4-nitrof enilo, composto _10. Agitou-se a mistura a 0°C durante 1 hora e adicionaram-se lentamente 50 ml de H2S04 1 N. Extraiu-se a mistura com três porções de 50 ml de EtOAc. Rejeitaram-se os extractos de EtOAc e extraiu-se a fase aquosa com seis porções de 50 ml de MeOH/CH2Cl2 20/80. Secaram-se as fases combinadas de MeOH/CH2Cl2 (Na2S04), filtrou-se e concentrou-se. Purificou-se o resíduo por cromatografia em sílica gel (gradiente em degrau de CH2Cl2/MeOH 9/1 e depois CH2Cl2/MeOH/THF 85/15/5) para proporcionar 3,62 g (46%) de composto 20_ na forma de um sólido branco: ponto de fusão 66,0-70,5°C. Preparou-se uma amostra analítica por HPLC preparativa (coluna de fase reversa Ci8, gradiente de CH3CN/H20/CF3C02H de 25/75/0, 1 até 35/65/0,1 durante 50 minutos, 225 nm) para dar um óleo claro, que solidificou em repouso sob vácuo para dar um sólido branco: ponto de fusão 87-89°C; RMN XH (CDC13) d 1,35 (m, 8H), 1,55 (m, 8H), 1,64 (m, 8H), 2,26 (m, 8H), 3,28 (m, 8H), 3,42 (s largo, 16H), 3,66 (s, 4H), 3,70 (m, 4H), 3,89 (s, 8H), 4,19 (m, 4H) ; RMN 13C (CDC13) d 25,1, 26,2, 28,8, 29,0, 38,5, 39,1, 40,0, 47,8, 48,3, 64,7, 69,1, 70,3, 157,0, 166,3, 174,9; MS (FAB) m/e (intensidade relativa) MH+ [1341(25), 1343(60), 1345(70), 1347(56), 1349(21)], 705,6(100); Anál. calc. para C48H84NioOi4Br4: C, 42,86; H, 6,29; N, 9,27; Br, 23,77. Encontrada: C, 42,15; H, 6,28; N, 9,87; Br, 25,33. 19 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Composto 31 - [Bis-cloroformato de PEG3350] : Adicionaram-se duas gotas de piridina seca, seguindo-se 125 mg (0,418 mmol) de trifosgénio, a uma solução de 1,0 grama (0,249 mmol) de polietilenoglicol (J.T. Baker, peso molecular médio 3350 g por mol), que tinha sido seco por destilação azeotrópica (tolueno) em 12 ml de CH2CI2. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 20 horas e evaporou-se o solvente sob vácuo para dar 1,0 g (100%) de composto 3_1 na forma de um sólido branco: RMN 1H (CDCI3) d 3, 40-3, 65 (m, aprox. 300H, integral demasiado largo para ser exacto), 3,77 (m, 4H), 4,46 (m, 4H).

Composto 32: Adicionou-se uma solução de 1,0 g (0,25 mmol) de composto 3JL em 12 ml de CH2Cl2/dioxano 5:1, gota a gota, a uma solução a 50°C de 600 mg (1,0 mmol) de composto 18_ em 10 ml de dioxano e 1,5 ml de piridina. Agitou-se a solução turva resultante durante 72 horas. Adicionaram-se 25 ml de CH2CI2 e depois filtrou-se a mistura. Evaporou-se o filtrado e purificou-se o resíduo semi-sólido por cromatografia em G-10 Sephadex®. Cristalizou-se o sólido resultante (CH2C12/Et20) para dar 829 mg (75%) de composto 3_2 na forma de um sólido amarelado: RMN 1H (CDCI3) d 1,30 (m, 8H), 1,40 (m, 8H), 1,61 (m, 8H), 2,18 (m, 8H), 3,17 (m, 8H), 3,40 (m, 16H), 3,62 (m, aprox. 300H, integral demasiado largo para ser exacto), 4,15 (m, 4H), 5,07 (s, 8H), 7,33 (m, 20H).

Composto 39: Adicionaram-se 100 mg de 10% de Pd/C a uma solução de 300 mg (0,065 mmol) de composto 32 em 5 ml de EtOH absoluto e 2 ml de ciclo-hexeno sob azoto. Levou-se esta mistura ao refluxo sob azoto durante 2 horas. Filtrou-se a mistura através terra de diatomáceas e evaporou-se o solvente para dar 237 mg (90%) de composto 39_ na forma de um sólido branco: RMN (CDC13) d 1,37 (m, 8H), 1,48 (m, 8H), 1,65 (m, 8H), 2,21 (m, 8H), 2,50 (m, 8H), 3,39 (m, 16H), 3,64 (m, aprox. 300H, integral demasiado largo para ser exacto), 4,19 (m, 4H) .

Composto 33: Adicionaram-se 125 mg (0,67 mmol) de NaHC03 e 115 mg (0,44 mmol) de composto 10_ a uma solução de 225 mg (0, 055 mmol) de 3_9 em 5 ml de dioxano e 5 ml de água. Agitou-se a solução amarela resultante à temperatura ambiente durante 12 horas. Extraiu-se depois a solução com três porções de 30 ml de CH2CI2. Acidificou-se a fase aquosa com H2SO4 1 N e extraiu-se com três porções de 30 ml de CH2C12. 20 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Secaram-se as fases combinadas de CH2C12 (MgS04), filtrou-se e concentrou-se para proporcionar um óleo amarelo. A purificação por cromatografia em G-10 Sephadex® (MeOH) e recristalização do óleo resultante (Et0H/Et20) proporcionou 182 mg (73%) de composto 3^ na forma de um sólido branco: RMN XH (CDC13) d 1,35 (m, 8H) , 1,55 (m, 8H), 1,65 (m, 8H), 2,22 (m, 8H) , 3,28 (m, 8H), 3,42 (m, 16H), 3,50-364 (m, aprox. 300H, integral demasiado largo para ser exacto), 3,87 (s, 8H), 4,18 (m, 4H) ; determinação de bromoacetilo (European

Journal of Biochemistry 1984, 140, 63-71): Calculado, 0,87 mmol/g; Encontrado, 0.73 mmol/g. Anál. calc. para Ci9iH375087NioBr4: C, 50, 84; H, 8,33; N, 3,09; Br, 7,05.

Encontrada: C, 51,98; H, 8,34; N, 2,45; Br, 10,19.

Composto 47 - Cloreto de S-(6-hidroxi-hexil)isotiourónio:

Adicionaram-se 11,1 g (146 mmol) de tioureia a uma solução de 16,6 ml (20,0 g, 146 mmol) de 6-cloro-hexanol em 49 ml de etanol e levou-se a mistura ao refluxo durante 24 horas. Arrefeceu-se a mistura até 0°C e o produto cristalizou. Recolheram-se os cristais por filtração de vácuo e secaram-se para dar 28,4 g (92%) de composto _41_ como um sólido branco: p.f. 122-124 °C; RMN XH (DMSO) 1,40 (m, 4H), 1,65 (m, 2H), 3,21 (t, 2H) , 3,41 (t, 2H) , 9,27 e 9,33 (singuletos largos sobrepostos, 4H) ; Anál. calc. para C7H17CIN2OS: C, 39,51; H, 8,06; N, 13,17; S, 15,07. Encontrada: C, 39,69; H, 8,00; N, 13,01; S, 15,16.

Composto 48 - 6-Mercapto-hexan-l-ol: Adicionaram-se 9,25 g de peletes de NaOH a uma solução de 17,8 mg (83,6 mmol) de composto 47 em 120 ml de H20 e 120 ml de EtOH. Levou-se a mistura ao refluxo durante 4 horas. Concentrou-se cuidadosamente a mistura até aproximadamente 75 ml e purificou-se o concentrado por destilação de vácuo para proporcionar 7,4 g (66%) de composto 48_; p.eb. 95-105°C a 5 mm Hg; RMN ΧΗ (CDC13) 1,41 (m, 9H), 2,59 (dt, 2H), 3,69 (t com s largo subjacente, 3H) ; RMN 13C (CDC13) d 24,5, 25,2, 28, 0, 32,5, 33,9, 62, 7; Anál. calc. para C6Hi4OS : C, 53,68, H, 10,51; S, 23,89. Encontrada: C, 53,35; H, 10,72; S, 23,60.

Composto 49 - Bis-(6-hidroxi-hexil)dissulfureto: Adicionou-se uma solução de 4,02 g (15,8 mmol) de I2 em 90 ml de MeOH, gota a gota durante um período de 10 minutos, a uma solução de 4,26 g (31,7 mmol) de composto £8 em 10 ml de MeOH e 13,7 ml (9,97 g, 98,5 mmol) de Et3N sob uma atmosfera de N2, e 21 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ arrefeceu-se num banho de gelo. Removeu-se o banho de arrefecimento e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 4 horas. Concentrou-se a mistura no evaporador rotativo e purificou-se por cromatografia em silica gel (hexano/EtOAc 1:1) para proporcionar 3,12 g (73%) de composto 49 na forma de um sólido amarelo-claro: TLC Rf 0,18 (hexano/EtOAc 1:1); p.f. 38-48°C; RMN (CDC13) 1,15-2,20 (m, 16H), 2,73 (t, 4H), 3,70 (t, 4H) ; Anál. calc. para C12H26S2O2: C, 54,09; H, 9,84; S, 24, 06. Encontrada: C, 54, 85, H, 9,86; S, 24,11.

Composto 50 - Mono-O-(4',4"-dimetoxitrifenilmetil)-bis-(6- hidroxi-hexil)dissulfureto: Adicionaram-se 3,97 g (11,7 mmol) de cloreto de 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo a uma solução de 3,12 g (11,7 mmol) de composto 49 e 45 ml de piridina. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 16 horas. Removeu-se a maior parte da piridina no evaporador rotativo e repartiu-se o residuo entre 100 ml de solução saturada de NaHC03 e 100 ml de EtOAc. Lavou-se a fase de EtOAc com 50 ml de solução saturada de NaCl, secou-se (Na2S04), filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo. A purificação por cromatograf ia em silica gel (CH2Cl2/EtOAc 9:1) produziu 2,84 g (43%) de composto .50 na forma de um óleo viscoso: TLC Rf 0,35 (CH2Cl2/EtOAc 9:1); RMN XH (CDC13) 1.41 (m, 8H), 1.65 (m, 8H), 2.70 (dois tripletos sobrepostos, 4H), 3,08 (t, 2H), 3,65 (t, 2H), 3,81 (s, 6H), 6,85 (d, 4H), 7,32 (m, 7H), 7,47 (d, 2H) ; HRMS (FAB, M+), calc. para C33H44O4S2: 568,2681.

Encontrada: 568,2665.

Composto 51 - O-[14-(4',4"-dimetoxitrifenilmetoxi)-7, 8-ditio-tetradecil]-O-(2-cianoetil)-N,N-di-isopropilfosforamidito: Adicionaram-se 458 mg (1,52 mmol) de O-cianoetil-N,N,Ν',N'-tetra-isopropilfosforodiamidito em 0,5 ml de CH2C12 a uma solução de 771 mg (1,36 mmol) de composto _50 e 116 mg (0,68 mmol) de tetrazoleto de di-isopropilamónio em 6,8 ml de CH2C12 sob uma atmosfera de N2. Agitou-se a mistura durante 4 horas e repartiu-se entre 25 ml de NaHC03 e 3x25 ml de CH2C12. Lavaram-se as fases combinadas de CH2C12 com solução saturada de NaCl, secou-se (Na2C03), filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo. A purificação por filtração através de um leito de 2" de alumina básica numa coluna de 25 mm, por eluição com CH2Cl2/Et3N 9:1 proporcionou 831 mg (80%) de composto _51 na forma de um óleo viscoso: RMN ΧΗ (CDCI3) d I, 25 (m, 12H), 1,45 (m, 8H), 1,70 (m, 8H), 2,72 (m, 6H), 3,09 22 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ (t, 2Η) , 3,65 (m, 4Η) , 3,87 (s, 6Η), 3,91 (m, 2Η) , 6,89 (d, 4Η) , 7,35 (m, 7Η), 7,49 (d, 2Η) ; RMN 31Ρ (CDC13 com padrão interno de H3PO4 a 15%) 147,69; HRMS (FAB, MH+) calc. para C42H62N2O5PS2 769, 3839, encontrada 769,3853.

Composto 52 - Álcool tritil-HAD: Adicionaram-se 60 g (0,21 mol) de cloreto de tritilo a uma solução de 57 g (0,21 mole) de composto 49 e 60 ml de piridina. Agitou-se esta mistura a 100°C durante 19 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e filtrou-se. Diluiu-se 0 filtrado com 300 ml de diclorometano e extraiu-se com 200 ml de bicarbonato de sódio saturado. Secou-se a fase orgânica sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo. A purificação por cromatografia em silica gel (gradiente de hexanos:acetato de etilo 9:1 até hexanos:acetato de etilo 3:1) proporcionou 55 g de composto _52 (50%); RMN 1¥í (CDC13) δ 1,38 (m, 8H), 1,63 (m, 8H), 2,66 (m, 4H), 3,04 (t, 2H), 3,62 (t, 2H), 7,25 (m, 9H) , 7,42 (m, 6H) . HRMS (FAB, M+) calc. para C31H40O2S 508, 2470, encontrada 508,2482.

Composto 53 - Tritil-HAD-fosforamidito: A uma solução de 10 g (19,7 mmol) de composto .52 e 6,3 ml (36,2 mmol) de di-isopropiletilamina em 90 ml de diclorometano a 0°C sob árgon, adicionaram-se lentamente 4,5 ml (20,2 mmol) de 2-cianoetil-N,N-di-isopropilclorofosforamidito. Após agitação durante 90 minutos, extraiu-se a mistura reaccional duas vezes com 100 ml de bicarbonato de sódio saturado. Secou-se a solução de diclorometano sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo. A purificação por cromatografia em alumina básica (hexanos:acetato de etilo:trietilamina 75:24:1) proporcionou 11,3 g (81%) de composto 53_ na forma de um óleo: RMN 3H (CDCI3) δ 1,18 (m, 12H), 1,37 (m, 8H), 1,62 (m, 8H), 2,6 (m, 6H), 3,04 (t, 2H), 3,60 (m, 4H), 3,82 (m, 2H), 7,26 (m, 6H), 7,44 (m, 9H) . HRMS (FAB, MH+) calc. para C4oH58N203PS2 709,3626, encontrada 709,3621.

Composto 54 - O-(terc-butildimetilsilil)-5-hexenol: Juntaram-se 15,66 g (230 mmol) de imidazole e 20,0 g (130 mmol) de cloreto de terc-butildimetilsililo a uma solução de 12,47 ml (10,4 g, 104 mmol) de 5-hexen-l-ol em 104 ml de DMF. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 4 horas e repartiu-se entre 200 ml de EtOAc e 100 ml de solução saturada de NaHC03. Lavou-se a fase de EtOAc com 100 ml de solução saturada de NaHC03, 100 ml de solução saturada de 23 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

NaCl, secou-se (MgS04), filtrou-se e concentrou-se até um volume de aproximadamente 100 ml. A destilação sob vácuo proporcionou 70, 07 g (90%) de composto 5_4: p.eb. 130-143°C a 100 mm Hg; RMN XH (CDC13) 0,11 (s, 6H), 0,95 (s, 9H) , 1,48 (m, 2H), 1,57 (m, 2H), 2,11 (dt, 2H), 3,66 (t, 2H), 5,03 (m, 2H), 5,86 (m, 1H); RMN 13C (CDC13) -5,25, 18, 40, 25,21, 26,01, 32,35, 33,60, 63,09, 114,40, 138,92; Anál. calc. para

Ci2H26OSi: C, 67, 22; H, 12,22. Encontrada: C, 66,96 ; H, 12,16.

Composto 55 - 1-0-(terc-butildimetilsilil)-1, 5,6-hexanotriol: A uma solução de 9,86 g (46,0 mmol) de composto 5_4 em 92 ml de acetona, adicionou-se uma solução de 6,46 g (55,2 mmol) de óxido de N-metilmorf olina em 23 ml de h20. à mistura, adicionaram-se 443 μΐ de uma solução a 2,5% de 0s04 em álcool terc-butilico (360 mg de solução, 9,0 mg de 0s04, 35 pmol) e 50 μΐ de H202 a 30%. Agitou-se a mistura durante 16 h e adicionou-se uma solução de 474 mg de ditionito de sódio em 14 ml de H20. Após mais 0,5 h, filtrou-se a mistura através de celite. Secou-se o filtrado com MgS04 e filtrou-se através de 1" de sílica gel num funil de Buchner de 150 ml utilizando porções de 250 ml de EtOAc para a eluição. Concentraram-se as fracções contendo produto para proporcionar 11,0 g (96%) de 55 na forma de um óleo viscoso: TLC Rf 0,2 (hexano/EtOAc 1:1); RMN ΧΗ (CDC13) 0,05 (S, 6H) , 0,89 (s, 9H) , 1,25 (m, 4H), 1,55 (m, 2H), 3,41 (dd, 2H), 3,62 (t, 2H), 3,71 (m, 1H); RMN 13C (CDCI3) -5, 23, 18, 42, 21, 91, 26,02, 32, 68, 32, 81, 63, 16, 66, 74, 72, 24; HRMS (FAB, MH+), calc. para Ci2H2903Sí: 249,1886. Encontrada: 249,1889.

Composto 56 - 5,6-(bis-O-benzoil)-1-0-(terc-butildimetil silil) -1,5,6-hexanotriol: Adicionaram-se 6,18 ml (7,48 g, 53,2 mmol) de cloreto de benzoilo a uma solução de 5,29 g (21,3 mmol) de 55_ em 106 ml de piridina. Agitou-se a mistura durante 18 horas e concentrou-se no evaporador rotativo. Repartiu-se a mistura entre 100 ml de HC1 1 N frio e 100 ml de EtOAc. Verificou-se o pH da fase aquosa para assegurar que era ácido. Lavou-se a fase de EtOAc sucessivamente com 100 ml de H20 e 100 ml de NaCl saturado, secou-se (MgS04), filtrou-se e concentrou-se para proporcionar 10,33 g (99%) de composto 5_6 na forma de um óleo viscoso amarelo: TLC Rf 0,45 (EtOAc/hexanos 1:4); RMN XH (CDC13) d 0,05 (s, 6H), 0,88 (s, 9H), 1,59 (m, 4H), 1,85 (m, 2H), 3,14 (t, 2H), 4,49 (dd, 1H) , 4,59 (dd, 1H), 5,54 (m, 1H), 7,45 (m, 4H), 7,58 (m, 2H), 8,05 (m, 4H) . 24 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Composto_57_-_5,6- (bis-O-benzoil) -1,5, 6-hexanotriol:

Adicionaram-se 10,7 ml (10,7 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio 1 N em THF a uma solução de 2,62 g (5,36 mmol) de composto _56 em 10,9 ml de THF. Agitou-se a mistura durante 16 horas. Repartiu-se a mistura entre 25 ml de solução saturada de NaHC03 e 3x25 ml de EtOAc. Lavaram-se os extractos combinados de EtOAc com solução saturada de NaCl, secou-se (MgS04), filtrou-se e concentrou-se até se obter um óleo viscoso que foi purificado por cromatografia em silica gel (hexano/EtOAc 1:1) para proporcionar 823 mg (41%) de composto 5J_ na forma de um óleo viscoso; Rf 0,14 (hexano/EtOAc 1:1); RMN ΧΗ (CDC13) d 1,58 (m, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 3,68 (t, 2H), 4,52 (dd, 1H), 4,62 (dd, 1H), 5,56 (m, 1H), 7,46 (m, 4H), 7,58 (m, 2H), 8,05 (m, 4H);

RMN 13C (CDC13) d 22,08, 31,20, 31,30, 32, 88, 62, 92, 66,17, 72,63, 128,93, 130,19, 130,57, 133,62, 166,72, 166,86; HRMS (FAB MH+), calc. para C20H23O5; 343,1545. Encontrada: 343,1553.

Composto 58 - O-[5,6-(bis-O-benzoiloxi)hexil]-O-(2-ciano- etil)-N,N-di-isopropilfosforamidito: Adicionou-se uma solução de 989 mg (3,28 mmol) de 0-cianoetil-N,N,N',N'-tetra- isopropilfosforodiamidito em 2,0 ml de CH2C12 a uma solução de 1,02 g (2,98 mmol) de composto 5J_ e 255 mg (1,49 mmol) de tetrazoleto de di-isopropilamónio (preparado por mistura de soluções em acetonitrilo de di-isopropilamina e tetrazole numa proporção molar de um para um e concentração até se obter um sólido branco) em 14,9 ml de CH2C12. Agitou-se a mistura durante 4 horas e depois repartiu-se entre 25 ml de CH2C12 e 25 ml de solução saturada gelada de NaHC03. Lavou-se a fase de CH2C12 com solução saturada de NaCl, secou-se (Na2SC>4), filtrou-se e concentrou-se. A purificação por filtração através de um leito de 2" de alumina básica numa coluna de 25 mm, por eluição com EtOAc/Et3N 9:1, proporcionou 1,5 g (93%) de composto 5_8 na forma de um óleo viscoso: RMN (CDCI3) d 1,19 (m, 12H), 1,62 (m, 2H), 1,73 (m, 2H) , 1,90 (m, 2H), 2,62 (dd, 2H), 3,53-3,92 (m, 6H), 4,53 (dd, 1H), 4,62 (dd, 1H), 5,58 (m, 1H), 7,48 (m, 4H), 7,60 (m, 2H), 8,09 (m, 4H); RMN 31P (CDC13 com padrão interno de H3PO4 a 15%) d 148,2; HRMS (FAB, MH+) , calc. para C29H40O6N2P 543,2624.

Encontrada, 543,2619. 25 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Exemplo de referência 1

Síntese e ensaio de Conjugado 3-II

Esquema reaccional 6 QDMTf

N(í'Pf)2

1) (CA)io-CPG tetf02Ol8% k_ 3) NH40H O d

OlWTrO (CH^6SS(CHáeO — Ρ-0{0Α) ,0 0' (CA) i n modificado em 5f com DMTr P6u3

O 3-! HS{CHa)eO—P-0{CÁ) t(j 0'

Preparação de (CA)i0 modificado em 5' com DMTr 0 polinucleótido d-[DMTr-(bzCp (CE)bzA) 10] foi preparado num sintetizador de ADN Milligen 8800 Prep Scale seguindo os protocolos do fabricante para a síntese de fosforamidito de ADN. A síntese foi realizada sobre 10 g de suporte DMTr-d-bzA-CPG com um carregamento de nucleósido de 30,0 pmol/g. O grupo bloqueador DMTr final foi removido utilizando o protocolo da máquina. Adicionaram-se solução de activador Milligen, n.° de cat. MBS 5040 (45 ml) e 0,385 g de composto 51 (ver Esquema reaccional 4) à mistura reaccional e mexeu-se a suspensão durante 8 minutos por ebulição de árgon. Oxidou-se a mistura pelo protocolo usual da máquina e recolheu-se por filtração o polinucleótido ligado ao suporte, secou-se ao ar e tratou-se com 100 ml de amónia concentrada durante 16 horas a 55°C. Após arrefecimento, filtrou-se a mistura através de um filtro de polipropileno de 10 pm Gelman. Lavou-se o filtro com 200 ml de NaCl 2 mM ajustado a pH 12 com NaOH. Aplicou-se depois o filtrado a uma coluna de cromatografia Amicon (0,45x9,4 cm, 150 ml) que tinha sido empacotada com Q-Sepharose (Pharmacia) equilibrada primeiro com NaCl 3 M e depois com NaCl 2 mM, pH 12. Eluiu-se a coluna com 500 ml de um gradiente linear (NaCl 2 mM, pH 12 até NaCl 1,3 M, pH 12), depois lavou-se com NaCl 1,3 M, pH 12 até todo o material absorvente de U.V. ter saído. As fracções que absorveram a 260 nm foram adicionalmente analisadas por 26 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ electroforese em poliacrilamida e reuniram-se aquelas contendo produto puro. Trataram-se as fracções reunidas (120 ml) com 240 ml de isopropanol frio e armazenou-se durante 30 minutos a -20°C. Recolheu-se o precipitado por centrifugação numa centrifugadora Sorvall RC 3B, utilizando um rotor modelo H-6000A, durante 15 minutos a 3000 rpm e 4°C, para proporcionar (CA)i0 modificado em 5' com DMTr (14946 unidades A2601 498 mg, 62,2 μΜ, 20% com base em nucleósido CPG 300 μΜ) . Síntese de um (CA) 10 modificado em 5' com Tr

Esquema reaccional 7

OTr χ,-Α'ν 53 /«Wa

CN

1} (CAJ.o-CPG 3} nh4oh 0 TtOíCH^SS^CH^çO — P-0(CA),o 0' (CA) 10 modificado em 5' com Tr j PB!* ~_i___ 2C —,—

2.ÍLI o HS(CH^sG—P- O (C A). c 0' A síntese de (CA)i0 modificado em 5' com Tr foi realizada conforme anteriormente descrito para a síntese de (CA) 10 modificado em 5' com DMTr (preparado conforme descrito no Esquema reaccional 4) utilizando o composto 53_ em substituição do composto 51.

Conjugação de polinucleótidos modificados em 5' com DMTr com Composto 3 (IA-DABA-PEG, Esquema reaccional 1) - Preparação de Conjugado 3-1

Nos procedimentos de conjugação que se seguem, todos os tampões e soluções utilizados foram purgados exaustivamente com hélio e todos os vasos reaccionais foram purgados com árgon antes da utilização. Tratou-se uma solução de 11 568 unidades de A26o (48,2 pmol, assumindo a extinção molar a 260 nm = 240 000) do (CA)10 modificado em 5' com DMTr em 7,7 ml de água com 1 ml de NaHC03 0,1 M e 210 μΐ (876 pmol, excesso molar de 18 vezes) de tributilfosfina, durante 0,5 hora à temperatura ambiente. Agitou-se a suspensão de vez em quando. 27 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Tratou-se a suspensão com 0,8 ml de NaCl 3 M e 16 ml de isopropanol frio. Após 30 minutos a -20°C, centrifugou-se o material a 3000 rpm durante 20 minutos. Redissolveu-se o sedimento em 2 ml de água, 0,2 ml de NaCl 3 M, tratou-se com 4 ml de isopropanol e centrifugou-se outra vez. Secou-se brevemente o sedimento sob vácuo e dissolveu-se em 2,8 ml de água e 1 ml de NaHC03 0,1 N que tinha sido purgado com hélio. Adicionaram-se 6,7 mg de composto 3_ (IA-DABA-PEG) e manteve-se a mistura durante 16 horas à temperatura ambiente no escuro. Aplicou-se a mistura reaccional num volume final de 6 ml a uma coluna Pharmacia 5x91 (1800 Ml) que tinha sido empacotada com Sephacryl 200 (Pharmacia). Eluiu-se a coluna com NaCl 0,5 M, borato de sódio 0,1 M, pH 8,3. Utilizou-se uma bomba peristáltica e ajustou-se para dar um caudal de aproximadamente 2 ml por minuto, e recolheram-se fracções de 15 ml. Mediu-se a absorvância das fracções a 260 nm. Analisaram-se também as fracções por electroforese em gel de poliacrilamida e reuniram-se aquelas contendo conjugado puro.

Hibridação de Conjugado 3-1 - Preparação de Conjugado 3-II

As fracções reunidas anteriores continham 726 unidades de A26o- Adicionou-se a quantidade equivalente de (TG)i0 e aqueceu-se o tubo a 90 °C durante dez minutos, e depois deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Adicionou-se uma quantidade igual de isopropanol e manteve-se a mistura durante 3 horas a -20°C. Após centrifugação a 3000 rpm durante 20 minutos, dissolveu-se o sedimento em NaCl 0,15 M, citrato de sódio 0,01 M, pH 6,8. Obtiveram-se 53 mg do híbrido. Diluiu-se uma alíquota do material no tampão anterior e determinou-se a temperatura de fusão do duplex num espectrofotómetro Carey 3E. O material tinha uma Tm de 73,4°C e 24,3% de hipercromicidade. Hibridou-se uma alíquota de 10 unidades de A260 do produto com (TG)io em excesso conforme anteriormente descrito. Analisaram-se este e também o conjugado não hibridado e padrão de (TG)io por HPLC de permeação em gel numa coluna Shodex Protein KW 8025, num equipamento de HPLC Rainin. Eluiu-se a coluna isocraticamente com NaH2PC>4 0,05 M, pH 6,5, NaCl 0,5 Μ. O tempo de ensaio foi 12 minutos. O produto tinha um tempo de retenção de 6,9 minutos e o (TG)i0 9,2 minutos. A comparação da área sob os picos mostrou que 98, 09% do produto eram ADN de cadeia dupla. O conjugado é representado pela estrutura designada "Conjugado 3-II" na Figura 2. 28 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Exemplo de Referência 2 Preparação de conjugado PN-KLH O conjugado PN-KLH foi preparado de acordo com o esquema seguinte: QS& 1} {CAJst-CPQ feirsxflfs £) ia ^ H0S 3} Ρ·5/:·Η cmA/ O'"P''0"'(C A; ί 0' 1) Na! O. 2) {KLH)“““'NH5 piridina borano O « hibridar (TG)2

>— P"0-(CA)25.(Tí3j2$ C

(KOI}MH 0 0'

Síntese de (CA)25 modificado com ACT 0 composto _58 foi acoplado a (CA)25 como o passo final da síntese automatizada. Realizaram-se quarenta e nove passos sequenciais utilizando fosforamiditos dC e dA alternantes, começando com 10 g de suporte de DMT-d-bzA-CPG, com um carregamento de nucleósido de 30 pmol/g. Removeu-se o grupo bloqueador DMTr do d-[DMTr-(bzCp(CE)bzA)2s] resultante, e adicionaram-se à mistura reaccional 40 ml de solução de activador (Milligen, n.° de cat. MBS 5040) e 800 mg de composto 58_. Agitou-se a suspensão durante 8 minutos por ebulição de árgon e submeteu-se a um passo de oxidação convencional. Removeu-se o polinucleótido ligado ao suporte do vaso reaccional, secou-se ao ar e tratou-se com 100 ml de amónia concentrada durante 40 horas a 55°C. Após arrefecer, filtrou-se a mistura através um filtro de polipropileno de 10 pm Gelman e purificou-se depois o filtrado por cromatografia de permuta iónica convencional. As fracções que absorveram a 260 nm foram adicionalmente analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida e combinaram-se aquelas contendo produto puro, e precipitou-se com isopropanol para gerar 510 mg (31,9 pmol, 10%) do (CA)25 modificado com ACT.

Síntese de conjugado de PN de cadeia simples-KLH A uma solução de 100 mg (2,5 pmol) de (CA)25 modificado com ACT, tratado com Nai04, em 1,33 ml de borato de sódio 50 mM pH 8,0, adicionaram-se 31,3 mg (0,208 pmol) de KLH e 2,0 29 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ mg (31,8 μιηοΐ) de piridina-borano. Manteve-se a mistura a 37°C durante 72 h, e purificou-se o produto por cromatografia em S-200.

Hibridação de conjugado de PN de cadeia simples-KLH com (TG)25

Adicionou-se a quantidade equivalente de (TG)2s ao conjugado PN de cadeia simples-KLH e aqueceu-se o tubo a 90°C durante dez minutos, e depois deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente durante uma hora e meia. A precipitação com álcool isopropilico proporcionou 53 mg de produto, PN-KLH; Tm (NaCl 0,15 M, citrato de sódio 0,01 M, pH 6,8) 73,4°C, 31,1% de hipercromicidade; 98% de cadeia dupla conforme determinado por comparação por HPLC com padrões consistindo de amostra hibridada com (TG)i0 em excesso, conjugado não hibridado e (TG)i0 não hibridado (coluna Shodex Protein KW 8025, NaH2P04 0, 05 M, pH 6,5, NaCl 0,5 M) . Este conjugado pode ser representado pela fórmula. KLH- [NH (CH2) 5OPO2.0- (CA) 25 : (TG) 25] -5 (assumindo um peso molecular de 105 para a KLH) e é designado por "PN-KLH."

Ensaio do Conjugado 3-II como um tolerógeno

Ensaiou-se o Conjugado 3-II quanto à sua capacidade para induzir tolerância em ratinhos que tinham sido imunizados com uma forma imunogénica do polinucleótido.

Materiais e métodos

Ratinhos: Adquiriram-se ratinhos fêmea C57BL/6 com 6 semanas de idade no Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Os ratinhos foram enjaulados e mantidos de acordo com métodos aprovados pelo NIH.

Imunização: Os ratinhos foram desafiados, de acordo com o método de Iverson (Assay for in vivo Adoptive Immune Response em Handbook of Experimental Immunology, Vol. 2 Cellular Immunology, Eds. D.M. Weir, L.A. Herzenberg, C. Blackwell e A. Herzenberg, 4.a Edição, Blackwell Scientific Publications, Oxford), por injecção dos ratinhos, i.p., com 100 pg de PN-KLH precipitado com alúmen e com 2xl09 organismos pertussis, 30 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ fixados em formalina, como adjuvante. Os ratinhos foram reforçados com 50 pg de PN-KLH, em solução salina, i.p.

Acoplamento de PN a SRBC: Compraram-se glóbulos vermelhos de ovino (SRBC, "Sheep Red Blood Cells") em Alsevers na Colorado Serum Co., Denver, CO, e utilizaram-se num prazo de duas semanas. Revestiram-se os SRBC com (CA)2s: (TG)2s (um 50-mero de CA:GT) pelo método de Kipp e Miller ("Preparation of Protein-Conjugated Red Blood Cells with ECDI (Modification)" em Selected Methods in Cellular Immunology, (1980), Eds. B.B. Mishell e S.M. Shiigi, W.H. Freemen and Co., San Francisco, pp. 103). Resumidamente, lavaram-se os SRBC 4 vezes em solução salina fria, misturaram-se com 2 mg de (CA) 25: (TG) 2s acoplado a D-EK em manitol 0,35 M, NaCl 0,01 M contendo 10 mg de carbodi-imida, e incubou-se durante 30 minutos a 4°C. Lavaram-se os SRBC revestidos duas vezes com Solução Salina Equilibrada e ressuspenderam-se até 10% (v/v).

Ensaio em placa: Determinou-se o número de células formadoras de placa (pfc) anti-PN utilizando a técnica de Cunningham (Marbrook, J., "Liquid Matrix (Slide Method)", em Selected Methods in Cellular Immunology, (1980), Eds. B.B. Mishell e S.M. Shiigi, W.H. Freemen and Co., San Francisco, pp. 86). Determinou-se 0 número de pfc IgG por eliminação de placas IgM utilizando IgG de coelho e anti-ratinho conforme descrito por Henry ("Estimation of IgG responses by Elimination of IgM Plaques" em Selected Methods in Cellular Immunology, (1980), Eds. B.B. Mishell e S.M. Shiigi, W.H. Freemen and Co., San Francisco, pp. 91). Resumidamente, colheram-se os baços e prepararam-se suspensões de células individuais em solução salina equilibrada (BSS) . Adicionou-se soro de porquinho-da-índia aos SRBC revestidos com polinucleótido para dar uma diluição final de soro de porquinho-da-india de 1:9, e adicionou-se suficiente IgG de coelho anti-ratinho para dar uma diluição final de 1:100 de IgG de coelho anti-ratinho. Misturaram-se volumes iguais de mistura de SRBC e das células de baço diluídas em poços de microtitulação e transferiram-se para câmaras Cunningham. Testou-se cada baço individualmente e em triplicado. Selaram-se as arestas das câmaras com parafina e incubaram-se as câmaras a 37°C durante 1 hora. Enumeraram-se os números de placas por observação das câmaras sob um microscópio invertido. A redução em percentagem dos anticorpos anti-ADNds é ilustrada na Figura 5. 31 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Resultados

Os ratinhos foram iniciados com PN-KLH precipitado em alúmen com pertussis como adjuvante (A&P) e, sete semanas mais tarde, divididos em grupos de 3 ratinhos cada. Os ratinhos foram tratados, i.p., com diluições em duplicado de PN-DABA-PEG, Conjugado 3-II, cinco dias depois, todos os ratinhos, incluindo o controlo, foram reforçados com 50 pg de PN-KLH, em solução salina, i.p. Quatro dias depois, colheram-se os baços e determinou-se o número de pfc IgG. Como se mostra na Tabela 1, todas as doses de Conjugado 3-II testadas mostraram uma redução significativa no número de pfc em comparação com o grupo de controlo.

Tabela 1

Actividade toleroqénica de Conjugado 3-II (PN-DABA-PEG) Dose (pg/ratinho) pfc/106 células de baço Média (D.P.)) % de Redução Média Nenhuma 12865 (2846) 62,5 2868 (6809) 77,7 125 3331 (939) 74,1 250 3044 (1929) 76, 3 500 1809 (759) 85,9 1000 2814 (554) 78,1

Exemplo 3

Preparação e ensaio de Conjugado 20-11

Conjugação de (CA)io modificado em 5' à molécula plataforma de valência 20 - Preparação de Conjugado de cadeia simples 20-1

Adicionaram-se 969 μΐ (789 mg, 3,89 mmol) de tri-n-butilfosfina a uma solução de 918 mg (0,14 mmol) de (CA)io modificado em 5' em 30 ml de H20 sob atmosfera de árgon. Agitou-se a mistura durante 1 hora e depois adicionaram-se 2,4 ml de uma solução de NaCl 3 M seguindo-se 42 ml de isopropanol que tinha sido purgado com hélio para remover o oxigénio. Colocou-se a mistura num congelador, a -20°C durante 1 hora, e depois centrifugou-se a 3000 rpm durante 30 minutos. Removeu-se o sobrenadante e dissolveu-se o resíduo oleoso em 15,5 ml de H20 purgada com hélio. Adicionaram-se à mistura 1,24 ml de NaCl 3 M e 21,7 ml de isopropanol purgado com hélio. Colocou-se depois a mistura resultante num congelador, a -20°C durante 1 hora, e centrifugou-se a 3000 32 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ rpm durante 20 minutos. Secou-se o sedimento oleoso sob vácuo durante 18 horas para proporcionar um sólido. Dissolveu-se o sólido em 6 ml de H20 purgada com hélio para dar um volume total de 6,4 ml. A quantidade de ADN foi 863 mg, conforme determinado por absorvância de UV a 260 nm (0, 033 mg por unidade de absorvância em solução salina tamponada com fosfato pH 7,5). Transferiu-se a solução para um balão de três tubuladuras de 50 ml sob árgon. Uma tubuladura do balão tinha uma entrada de árgon gasoso enquanto que as outras duas foram rolhadas. Ajustou-se o volume total a 7,7 ml com H20 e 0,87 ml de tampão de fosfato de sódio 1 M, pH 7,8, purgado com hélio e 0,97 ml de MeOH. Adicionaram-se à mistura 1,9 ml (33, 63 mg, 0, 025 mmol) de uma solução de 17,7 mg/ml de composto 20_ em MeOH. Agitou-se a mistura resultante sob árgon durante 20 horas e depois diluiu-se até 100 ml com uma solução compreendendo NaCl 0,1 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, e MeOH a 10%. A purificação foi realizada por cromatografia em Fractogel® (equilíbrio: NaCl 0,1 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, MeOH a 10%: gradiente de eluição NaCl 0,5 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, MeOH a 10% até NaCl 0,8 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, MeOH a 10%). As fracções contendo conjugado 20-1 puro, conforme evidenciado por HPLC e electrof orese em gel de poliacrilamida, foram recolhidas em 232 ml de eluente. O produto e sais foram precipitados por adição de um volume igual de isopropanol e colocação num congelador a -20°C durante 1 hora. A diálise contra H20 (2x100 vol) deu 335 mg de conjugado 20-1 (32 ml de 10,47 mg/ml, 0,033 mg/por unidade de absorvância a 260 nm).

Hibridação de Conjugado 20-1 com (TG)iq para formar conjugado 20-11 de cadeia dupla

Colocaram-se 150 mg (14,33 ml de 10,47 mg/ml com base em 0,033 mg/unidade de absorvância a 260 nm) de conjugado 20-1 e 157,5 mg (1,50 ml de 104,6 mg/ml com base em 0,033 mg/unidade de absorvância a 260 nm) de (TG) io, num tubo de centrifugadora de polipropileno de 50 ml. Ajustou-se a concentração a 15 mg/ml por adição de 2,0 ml de PBS 10x, pH 7,2, e de 2,17 ml de H20. Colocou-se a mistura num banho de água a 90°C e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Determinou-se que a concentração era 17,7 mg/ml pela absorvância a 260 nm (0,050 mg/unidade de absorvância); temperatura de fusão de transição 67,5°C; hipercromicidade 27%; osmolalidade 346; pH 7,2. Para 33 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ formulação final do conjugado 20-11, diluiu-se a solução até uma concentração final de 12,7 mg/ml e uma osmolalidade de 299 por adição de 7,23 ml de PBS l/2x, pH 7,2, e filtração através de um filtro de 0,22 pm.

Conjugação alternativa de (CA) 10-20 modificado em 5'

Preparação de conjugado 20-1 de cadeia simples

Adicionam-se 10 equivalentes de tri-n-butilfosfina a uma solução de 10 mg/ml de (CA)i0 modificado em 5' em acetato sódio 100 mM pH 5 purgado com He. Agita-se a mistura durante 1 hora e depois precipita-se com 1,4 volumes de álcool isopropilico (IPA). Coloca-se a mistura no congelador a -20°C durante 1 hora e centrifuga-se a 3000 rpm durante 20 minutos. Remove-se o sobrenadante e dissolve-se o sedimento até 10 mg/ml em IPA purgado com He. Coloca-se a mistura no congelador a -20°C durante 1 hora e centrifuga-se a 3000 rpm durante 20 minutos. Seca-se o sedimento sob vácuo durante 18 horas para dar um sólido. Prepara-se uma solução 50 mg/ml do sólido em tampão de borato de sódio 100 mM, pH 10, purgado com He. Adicionam-se à mistura 0,25 equivalentes de composto 20 sob a forma de uma solução 40 mg/ml em Me0H/H20 9/1. Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 3-20 horas e dilui-se (NaCl 0,1 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, MeOH a 10%) . A purificação é realizada por cromatografia em Factogel (equilíbrio; NaCl 0,1 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, MeOH a 10%: gradiente de eluição; NaCl 0,5 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, MeOH a 10% até NaCl 0,8 M, fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,5, MeOH a 10%). Recolheram-se as fracções contendo 20-1 puro, conforme evidenciado por HPLC e electroforese em gel de poliacrilamida. O produto e sais são precipitados por adição de um volume igual de IPA e repouso no congelador a -20°C durante 1 hora. A diálise contra H20 (2x10 vol) dá 20-1.

Hibridação alternativa de 20-1 com (TG) iq-20 para formar Conjugado 20-11 de cadeia dupla A metodologia é essencialmente a mesma que a anteriormente descrita excepto que a hibridação é realizada a 70°C em vez de a 90°C. 34 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ

Segunda conjugação alternativa de (CA)io-2q modificado em 5'. Preparação de Conjugado 20-1 de cadeia simples

Adicionaram-se sob N2 4,8 ml de tri-n-butilfosfina a uma solução de 7,75 g de (CA)i0 modificado em 5' em 104 ml de acetato de sódio 100 mM, pH 5, purgado com Ar. Agitou-se a mistura durante 1 hora e depois precipitou-se com 232,5 ml de IPA. Colocou-se a mistura num congelador durante -20°C durante 1,5 horas, centrifugou-se a 3000 rpm durante 20 minutos e depois gelou-se a -20°C durante 24 horas. Removeu-se o sobrenadante e dissolveu-se o sedimento em 170 ml de solução de NaCl 0,3 M purgada com He. Precipitou-se outra vez a mistura com 232 ml de IPA purgado com Ar. Colocou-se depois a mistura num congelador a -20°C durante 2 horas, centrifugou-se a 3000 rpm durante 20 minutos e depois deixou-se a -20°C durante 11 horas. Decantou-se o sobrenadante e secou-se o sedimento sob vácuo durante 12 horas para dar um sólido. Preparou-se uma solução do sólido em 110 ml de tampão de borato de sódio 100 mM, pH 10, purgado com Ar. Adicionaram-se à mistura 406 mg de composto 20_ na forma de uma solução em 4,4 ml de Me0H/H20 9/1. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura de produto continha 62% de 20-1 por cromatografia iónica de alta pressão, coluna Waters Gen Pak Fax (100x4 mm), 60°C, gradiente linear desde 65%A/35%B até 18%A/82%B; A = NaH2P04 0,05 M, pH 7,5, EDTA 1 mM, MeOH a 10% (v/v); B = NaH2P04 0,05 M, pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, MeOH a 10% (v/v), eluição aos 19,5 minutos.

Ensaio de Conjugado 20-11 e de controlos não conjugados

Imunizaram-se ratinhos C57BL/6 com PN-KLH e A&P. Após três semanas, trataram-se grupos de 5 ratinhos/grupo com doses diferentes de Conjugado 20-11 ou HAD-AHAB-TEG 4,5 nM (ligador, HAD, ligado à molécula plataforma de valência derivatizada, AHAB-TEG, ver Figura 4), ou com (CA) i0: (TG)20 1,8 nM (4x4,5) ou uma mistura de HAD-AHAB-TEG 4,5 nM mais (CA) io: (TG) io 18 nM, i.p.; e um grupo não foi tratado. Administraram-se aos grupos injecções de reforço, e colheram-se e ensaiaram-se os soros conforme descrito no Exemplo de Referência 2. Na Figura 1 mostra-se a redução percentual da resposta anti-PN. As respostas anti-KLH destes ratinhos eram normais. Os resultados mostram claramente que a resposta anti-PN não foi afectada (i) pela molécula plataforma de 35 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ valência sozinha, (ii) pelo PN sozinho, ou (iii) por uma mistura dos dois. 0 PN tem de estar acoplado à molécula plataforma de valência não imunogénica de modo a induzir tolerância. 0 Conjugado 20-11 causa uma redução no número de células

produtoras de anticorpos específicos de PN

Imunizaram-se ratinhos C57B1/6 com PN-KLH, A&P. Após três semanas, trataram-se grupos de 3 ratinhos/grupo com doses diferentes de Conjugado 20-11, i.p; um grupo não foi tratado. Após cinco dias, administrou-se a todos os ratinhos uma injecção de reforço de pn-klh em solução salina, i.p., e 4 dias mais tarde colheram-se os seus baços e ensaiaram-se quanto ao número de células produtoras de IgG, específica de PN, utilizando o ensaio de placa hemolítica. Os resultados, apresentados na Tabela 2, mostram claramente que este conjugado reduziu o número de células produtoras de IgG, específica de PN.

Tabela 2

Redução no número de pfc pelo Conjugado 20-11

Grupo # Dose pg/ratinho pfc específico de PN por 106 células (média & D.P.) de baço % de redução 1 Nenhuma 5562 (2570) 2 274 982 (1871) 82,3 3 91 1867 (1335) 66,4 4 30 2247 (1606) 59,6 5 10 6109 (2545) 0 6 3 4045 (1411) 27, 3 7 1 4578 (2475) 17, 7 8 0,4 5930 (897) 0

Exemplo 4

Tratamento de ratinhos BXSB com LJP 394, Conjugado 20-11

Protocolo de tratamento de ratinhos

Ratinhos BXSB machos com 6 a 9 semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me) foram alojados na instalação de La Jolla Pharmaceutical. Forneceram-se comida e água ad libitum. Os ratinhos ficaram em repouso durante uma semana antes da utilização. Obtiveram-se amostras de sangue e os pesos iniciais antes do primeiro tratamento com conjugado. Iniciou-se o tratamento com conjugado às 7 a 9 de idade e 36 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ administrou-se intravenosamente duas vezes por semana desde o dia 59 até ao dia 150. Sangraram-se os animais periodicamente e determinaram-se os seus titulos de anticorpo anti-ADN.

Ensaio quanto à produção de anticorpo iqG anti-ADN

Avaliou-se por ELISA uma amostra de soro retirada de cada ratinho quanto à presença de anticorpo anti-ADN. Revestiram-se placas de ensaio de microtitulação de 96 poços Falcon Probind (Becton Dickerson, Oxnard, CA) com 100 μΐ/poço de (PN) 50-D-EK (um co-polimero de ácido D-glutâmico e D-lisina) numa concentração de 50 pg/ml, de um dia para o outro a 4°C. Lavaram-se as placas duas vezes com pbs sem cálcio nem magnésio e Tween 20 a 0,05% (tampão de lavagem), utilizando um equipamento de lavagem de placas M96V (ICN Biomedical, Inc., Irvine, CA). Bloquearam-se as placas durante 1 hora à temperatura ambiente em PBS contendo 1% de gelatina (Norland Products, Inc., New Brunswick, NJ) e Tween 20 a 0,05%. Lavaram-se as placas duas vezes com tampão de lavagem antes da adição de amostras de soro ou de padrões. As amostras de soro e os padrões foram preparados num diluente contendo PBS com 1% de gelatina, Tween 20 a 0,05% e 10% de soro de cabra. Incubaram-se as placas com amostras de soro durante 60 a 90 minutos a 37°C e depois lavaram-se os poços quatro vezes com tampão de lavagem. Diluiu-se igG de cabra anti-ratinho biotinilada (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 1/1000 em solução de bloqueio contendo 10% de soro de cabra. Incubaram-se as placas durante 1 hora a 37°C e lavaram-se quatro vezes. Adicionou-se o substrato, OPD (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Incubaram-se as placas no escuro até a leitura mais elevada do padrão mais elevado ser aproximadamente 1 unidade de OD, num leitor de placas ELISA a OD 450 nm (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) . Parou-se a reacção com 50 μΐ de HC1 3 M e leram-se as placas a 490 nm. Incluiu-se em cada placa de microtitulação o soro positivo de referência e os poços positivos a partir de cada ensaio estavam dentro da gama de sensibilidades da curva de referência 95% do tempo. Nas últimas sangrias, algumas amostras positivas excederam a curva de referência. Contudo, a amostra de soro de ratinho mais diluída estava dentro da gama da curva de referência. Não se observou qualquer ligação significativa pelo soro negativo de controlo normal. Os resultados são apresentados na Figura 6 .

Lisboa,

Claims (22)

1. ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado que compreende um polinucleótido acoplado a uma molécula plataforma de valência, conjugado que tem a fórmula geral (I): gPL O . i! /Ό-ΟΝ \ O 0 ii it •fCH2)s™NHCCH3- 0 -(Ce2)5~NHCCH2-o L 0st - S (CH^O™ P—O— PNA· 0’ S(CHj)gO—P—0—PN 0 0 (D em que G[2] é -CH2 (CH2OCH2) rCH2-, onde r = 0 a 300, e PN é um polinucleótido.
2. 2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, onde G[2] é: -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-
3. 3. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde o polinucleótido é ADN.
4. 4. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde o polinucleótido é um duplex de polinucleótido de pelo menos 20 pares de bases.
5. 5. Conjugado de acordo com a reivindicação 4, onde o duplex tem 20 a 50 pares de bases de comprimento.
6. 6. Conjugado de acordo com a reivindicação 4, onde o polinucleótido é (CA) 10: (TG) 10.
7. 7. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, onde os duplexes de polinucleótido estão ligados à molécula plataforma de valência numa das extremidades de cada duplex ou na sua proximidade.
8. 8. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, onde o duplex de polinucleótido tem uma actividade de ligação significativa por autoanticorpos anti- ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ 2/4 ADNds de lúpus eritematoso sistémico de humano.
9. 9. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, que tem a fórmula: o O 0 lí II ti S(CHj) <β~~ P— O—CACACACACACACACACACA I. GTGTGTGTCTGTGTGTGTGT O O 0 O -CACACACACACACACACACA GTCTGTOTGTOTCTCTdTGT (CHÚjNHC/CH/isNHCCHjSíCiyeO- P- t 0'
10. 10. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula plataforma de valência é obtenível fazendo reagir bis-cloroformato de polietilenoglicol com N,N-di(2-[6'-N'-carbobenziloxiamino-hexanoamido]etil)amina.
11. 11. Método para produção de um conjugado de acordo com a reivindicação 4, método que compreende: a) conjugação de um ligador de polinucleótido de fórmula geral (II) : O li (Π) ssPN~~0~ P~0 (CB2)6SH G‘ onde ssPN significa um polinucleótido de cadeia simples de pelo menos 20 nucleótidos de comprimento, com uma molécula plataforma de valência da fórmula geral (III) : O 0 (CH2)2NHC—(CH2)5-NHCCH3~- Rg G [23 \ m (CHxfeNHC—(CH2)5-NHCCH2-Rg O O onde Rg é halogéneo e G[2] é como definido na reivindicação 1; e ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ 3/4 b) hibridação de polinucleótidos de cadeia simples complementar com cada um dos referidos polinucleótidos de cadeia simples ssPN.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, onde Rg é bromo.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, onde o polinucleótido de cadeia simples é (CA)i0 e o polinucleótido de cadeia simples complementar hibridado com este é (TG)io, tal que o conjugado compreende o polinucleótido de cadeia dupla: CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA GT GT GT GT GT GT GT GT GT GT
14. 14. Composição farmacêutica que compreende um conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14 onde o veiculo é um transportador aquoso injectável farmaceuticamente aceitável.
16. 16. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.
17. 17. Conjugado de acordo com a reivindicação 8 ou 9 para utilização num método de tratamento de lúpus.
18. 18. Molécula plataforma de valência da fórmula geral (III) :

    \y ií O !! O

    1 ΕΡ Ο 642 798 /ΡΤ 4/4 em que G[21 é -CH2 (CH2OCH2) rCH2-, onde r = 0 a 300, eRgé halogéneo.
19. 19. Molécula plataforma de valência de acordo com a reivindicação 18, onde G[2] é: -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-.
20. 20. Molécula plataforma de valência de acordo com a reivindicação 18 ou 19, onde Rg é bromo.
21. 21. Molécula plataforma de valência de acordo com a reivindicação 18, que tem a fórmula: 0 o -ch2och2ch2o- H .(CHí^NHC—(CH2)r-NH<:CH2—Br -C—N (CH2)2NHC^(CH2)5^-NHCCífe^Bf O 0 -*2
22. 22. Molécula plataforma de valência de acordo com a reivindicação 18, que é obtenível fazendo reagir bis-cloro-formato de polietilenoglicol com N,N-di(2-[6'-Ν'-carbo-benziloxiamino-hexanoamido]etil)amina. Lisboa,