PT96503B

PT96503B - Processo de preparacao de conjugados de polimeros e polinucleotidos biologicamente estaveis para o tratamento do lupus eritematoso sistemico

Info

Publication number: PT96503B
Application number: PT96503A
Authority: PT
Inventors: Stephen M Coutts; Michael J Conrad
Original assignee: Jolla Pharma
Priority date: 1990-01-16
Filing date: 1991-01-16
Publication date: 1998-07-31
Also published as: CA2173878C; WO1991010426A1; EP0438259A1; NO303940B1; IE910131A1; AU6941891A; US5162515A; NO922781L; FI107514B; JP2001354569A; ES2090233T3; GR3021113T3; PT96503A; FI923241A0; CA2173878A1; EP0438259B1; AU640730B2; ATE139448T1; US5276013A; JPH05505520A

Description

Descrição

Campo Tfecnico

Este invento relaciona-se com composições para tratamento do lupus eritematoso sistémico, doença auto-imune (SLE ou lupus). Mais particularmente, relaciona-se com conjugados de polímeros biologicamente estáveis, preferivelmente copolímeros do ácido D-glutâmico (representado aqui pela simples designação letra E) e D-lisina (representado aqui pela simples designação r letra e certos polinucleótidos que foram encontrados como sendo eficazes para indução de tolerância para antigénios envolvidas na SLE. Os copolímeros preferidos são representados aqui pela designação D-EK.

Background

A imunotolerância descreve o mecanismo que conduz á forma de imunosupressão frequentemente permanente e de longa vida,, que impede 'os indivíduos de reacção com os seus próprios tecidos. Acredita-se que a imunotolerãncia para os próprios antigénios (auto-antigènios) è normaimente estabelecida durante o desenvolvimento neonatal e persiste durante toda a vida do animal. Nêío surpreendentemente, no entanto, este esquema è algumas vezes imperfeito e alguns indivíduos, tipicamente tarde na’ vida, adquirem doenças auto-imunes. Uma dessas doenças è o SLE. E caracterizada pela produção de auto-anticorpos para o DNA do indivíduo, e resulta na degeneração inflamatória progressiva dos rins.

SLE è tipicamente tratada pela administração de um largo espectro de imunosupressores não específicos, tais como ciclofosfamida ou prednisona. Devido a estas dragas suprimirem frequentemente todos os aspectos do sistema imune, elas suprimem as suas funções benéficas e necessárias, bem como a mâ função causadora de SLE. Assim, devem ser administradas com extrema cautela e não são sempre apropriadas para tratar a doença de uma forma continua. Além disso, indivíduos que são geralmente e várias vezes imunosuprimi dos, pelo tratamento de drogas estão em perigo para outras complicações, especialmente doenças infecciosas. s

Uma tentativa preferível para o tratamento do SLE seria administrar a droga que è capaz do restabelecimento da imunotolerência para os antigénios envolvidos no SLE sem afectar as funções normais do imunosistema. Infelizmente, não hã um meio vulgar de tratamento do SLE, ou de qualquer tipo de doença autoimune, que seja favorável e especifico para os auto-antigènios associados á doença. Os conjugados do invento são um meio para •fornecimento de tal tratamento para o SLE»

Benacerraf, Katz e os seus colegas investigaram e descreveram a utilização dos conjugados do D-EK com haptenos e vários antigènios para induzir imunotoleráncia especifica. Os seus estudos iniciais envolveram conjugados do hapteno sintético 2ji4-dinitrofenil (DNP) em porquinhos da Índia e ratos, e mostraram que os conjugados poderiam induzir tolerância para o

DNP. Estes estudos iniciais foram estendidos a outros haptenos/antigènios tais como antigènios E de tasna e benzilpeniciloide (BF'O). Ver Patentes dos E. U. no 4.191.668 e

4.220« 565 u

A Patente 4.191.668 dos E. U. (Exemplo IV) descreve a preparação dos conjugados do D--EK e oligonucleótidos isolados do DNA do timo de vitela purificado de DNAse. Os oligonucleótidos foram caracterizados como sendo constituídos por menos de 10 nucleótidos. Embora a coluna 11 da Patente dos E. U. 4.191.668 indique que o inventa deles tem valores terapêuticos para o tratamento da doença auto-imune e mencione o SLE, não foram apresentados dados sobre os efeitos imunológicas dos conjugados oli gonuc 1 eót i d os d o D-EK men c i on ad os „

Katz e os seus colegas também investigaram o potencial dos conjugados do nucleòsido-D-EK para induzir tolerância aos ácidos nucleicos determinantes. Eshar e outros no J. Immunology (1975) 1145 872 -· 876. Neste assunto em questão, os nucleõsidos individuais estão extensamente acreditados como sendo os determinantes principais da especificidade no lupus antisera. Eles administraram conjugados do copolímero D-EK e quatro ribonucleósidos ao SJL ou rato da espécie Balb/c,

subsequentemente imunizaram os ratos,, tratadas com uns conjugados i de (KI-IL) -ribonucleosidos de hemoci anina da lapa lanceteira. Em ambas as espécies., a capacidade de ligação antigônio antinucleósido do sera -foi diminuída para níveis detectáveis com simplicidade. Enquanto estes estudos mostraram que tais conjugados poderiam produzir imunotolerância aos nucleõsidos, eles não mostraram que tais conjugados -fossem eficazes no tratamento do SLE.

Outros investigadores têm estudado conjugados de nucleõsidos ou DNA com outros transportadores» Borel e outros (Science (1973) 182 a 76) avaliaram a capacidade dos conjugados IgG-nucleõsidos do rato isogènico para reduzir a resposta do anticorpo para o DNA desnaturado em animais jovens da espécie de ratos NZB. Esta espécie é usada como modelo para alguns -fenômenos auto-imunes. Eles tendem a produzir anticorpos para ácidos nucleicos determinantes que -formam imunocomplexos que se alojam nos rins e conduzem a nefrite glomerular» Nestes estudos, os animais tratados produziram níveis signi-ficativamente reduzidos de anticorpos DMA anti-desnaturados e exibiram menor ne-frite glomerular membranosa do que o controlo e animais livres tratados com nucleõsidos. Em estudos separados, Parker e outros (J. Immunol (1974) 113 ; 292) avaliaram os efeitos do conjugado DNA desnaturado para a pol i--D-I i si na e/ou ciclofosf amida na progressão do sindroma descrito atrãs, em ratos NZB. Estes estudos demonstraram um aumento significativo na sobrevivência e uma diminuição significativa na capacidade de ligação DNA para os animais tratados quando comparados com os controlos. Nenhum destes estudos, no entanto, foram direccionados para produção de

tolerância para o .dsDNA que parecem ser os antigènios principais envolvidos no SLE humano.

Num artigo posterior (Ann Ny Acad Sc.i. (1986) 475 ; 296306) Borel e outros sugerem que a realização da imunoterapia especifica para o SLE tem sido impedida por uma incapacidade para ligar os fragmentos de DNA a proteínas soláveis. Citando os trabalhos anteriores de Stoller (Papalian e outros; J. Clin Invest (1980) 65 s 469 e Stoller e Papalian, J» Clin Invest (1980) 66 s 2:1.0), os autores referem que um tamanho mínima de, pelo menos, 10 - 40 pares de bases do DNA è necessário para ligar o anticorpo anti-DNA produzido nos doentes de SLE, 0 artigo descreve conjugados imunoglobulino-aligonucleõtidos feitos por ligação de uma fracção de DMA nativa um pouco maior que 10 pares de bases usando glutaraldeideo como agente de ligação. A Figura do artigo descreve os estudos usados para seleccionar a fracção do DNA. Aquela Figura descreve a reactividade das várias fracções de DNA ligadas ás células vermelhas do sangue do carneiro, via g-1 utaral ciei deo com anticorpos anti-DNA no sera BWF , Nestes 1 testes, a fracção designada 70 - 80 foi a mais reactiva. 0 ) tamanha dessa fracção è descrito com sendo um pouco maior que a fracção 81 - 101 que corresponde a cerca de 10 oligonucleõtidos. A seguinte maior fracção em relação á 70 80, designada 40 - 69, exibiu reactividade significativamente reduzida, relativamente á fracção 70 - 80» Serã apreciado que a fracção um pouco maior que 10 pares de bases seja heterogénea no tamanha e, devida ao procedimento de ligação, è ligada á imunoglobulina num local ao acaso na cadeia. Além disso, devido ao agente de ligação bifuncional ser usado, è provável que alguns ο

graus da ligação cruzada (cross-1inking) tenham ocorrido na reacção de acoplagem,, Assim., o conjugado descrita neste artigo não è uma metade definida quimicamente na medida em que (a) Q comprimento do oligonucleótido não è especificado, (b) a fracção do oligonucleótido contém cadeias de comprimento variável, (c) o local da ligação ã imunoglobulina, ao longo do comprimento da cadeia de oligonucleótido ê aleatório (d) hã alguns graus de cross.....linking, e (e) oligonucleótidos não conjugados mas ligados por cruzamento pode não ser separado do material conjugado.

Borel e outras têm recentemente (J. Clin Invest <1988 §2 = 1901 - 1907) relatado estudas in vitro usando conjugados de i munogl obul ina humana ligados,, ou a DMA total sintetizado (designado N ), ou a 20 - 30 fracções de pares de bases

10-100 (designada N ) usando glutaraldeideo como agente de ligação.

20-30

Os conjugados foram relatados como exibindo propriedades geneticamente toleráveis in vitro em PBL’s de doentes de SLE.

Estes conjugados, no entanto, semelhantes àquele relatado no seu artigo de 1986, também são produzidos com misturas heterogéneas de oligonucleótidos usando métodos que produzem, não especificamente, cadeias de cross-1inking. A partir desta altura, nem a quimica nem a actividade biológica destes conjugados seria suficientemente reproduzível para permitir que eles sejam aprovados como farmacêuticos.

Descoberta do invento

Em contraste com a técnica anterior, os requerentes têm . desenvolvido conjugados definidos quimicamente de polímeros biologicamente estáveis, e duplexes de polinucleõtidos que são geneticamente toleráveis para o SI..E humano. Estes duplexes são definidos no que diz respeito ao comprimento, local de ligação ao polímero, estrutura helicoidal, afinidade obrigatória para os anticorpos anti-dsDNA do SLE humano. Consequentemente, as suas actividades quimica, e de tolerância genética são reproduzíveis num grau que torna estes conjugados responsáveis para controlo de qualidade e aprovação como farmacêuticos.

Assim, um aspecto do invento fe um conjugado de um polímero biologicamente estável e uma multiplicidade de duplexes polinucleótidos de, pelo menos, cerca de 20 pares de bases cada uma ligada ao polímero, actividade de ligação significativa para os auto-anticorpos anti-dsDNA do SLE humano. Numa configuração preferida destes conjugados, os duplexes são substancialmente homogéneos em comprimento e são acoplados ao polímero em ou próximo (isto è, dentro de cerca de 5 pares de bases) de um dos seus finais, de tal maneira que cada duplex forma uma cadeia pendente, de pelo menos, cerca de 30 pares de bases, medida a partir do local de ligação do duplex ao polímero atè ao fim livre da cadeia.

Composições farmacêuticas contendo estes conjugados e métodos para tratamento do SLE que empregam estes conjugados são outros aspectos do presente invento.

Ainda outro aspecto fe um conjugado de (a) um polímero biologicamente estável e (b) uma multiplicidade de duplexes polinucleótidos, cada um deles e todos ligados ao polímero por um grupo funcional localizada em, ou próximo do terminus de uma das cadeias do duplex, sendo o dito conjugado tolerável geneticamente ao SLE humano.

Um aspecto posterior do invento è um método para fabricar os conjugados descritas em cima, compreendendo: a reacção de uma multiplicidade de polinucleõtidos de cadeia simples, em que cada um deles tem pelo menos cerca de 20 nucleótidos em comprimento e tem um grupo funcional em, ou próximo de um dos seus terminus, que reage com grupos amino livres no polímero, para formar um conjugado e emparelhando comp1ementarmente polinucleõtidos de cadeia simples, aos polinucleõtidos de cadeia simples, conjugados com o polímero para formar cadeias pendentes de DNA de cadeia dupla.

J

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 è um gráfico dos dados obtidos através dos testes descritos no Exempla 1.

A Figura 2 e 3 são reproduções do espectro CD descrito no Exemplo 3.

A Figura 4 è um gráfico comparando as capacidades de ligação do antisera do SLE ás DNAs tendo tipos diferentes de configurações helicoidais.

As Figuras 5 - 8 são gráficos de dados obtidos nos J testes descritos no Exemplo 5.

Modos de Concretização do Invento □ componente do polímero do conjugado è biologicamente estável, isto è, ele exibe in vitro uma meia-vida de excreção de dias até meses. Estes polímeros são também substancialmente não imunogènicos (isto è, eles exibem nenhuma ou apenas fraca imunogeneicidade quando administrados aos animais) e são

constituídos preferencialmente por uma cadeia simples sintética de composição definida. Eles terão normalmente um peso molecular médio na ordem de cerca de 5.000 até cerca de 200.000, preferivelmente 5.000 até 50.000. Exemplos de tais polímeros são palietilenoglicol, pol isi na, alcóo'1 polivinllico, poliviniIpirrolidona, imunoglobulinas, e D-EK. Os polímeras preferidos particularmente são os D-EK's tendo um peso molecular de cerca de 5.000 até cerca de 50.000 e uma proporção molar E:K de aproximadamente 60:40.

Os duplexes polinucleõtidos sintéticos, que são acopladas aos polímeros biologicamente estáveis, são compostos por, pelo menos, cerca de 20 bp, mais usalmente, pelo menos 30 bp, tipicamente 30 - 250 bp, e preferivelmente 50 -150 bp

Preferivelmente, os duplexes são substancialmente homogéneos em comprimento; ou seja, a variação em comprimento na população não excederá normalmente cerca de ± 207., pref eri velmente ±107, do comprimento médio do duplex em pares de bases. Eles são também, preferivelmente, substancialmente homogéneos na composição de nucleótidos; ou seja, a sua composição de base não variarã mais de cerca de 107. Mais preferencíalmente, eles são inteiramente homogéneos na sua composição de nucleótidos. Em termos de composição, o sintético preferido ou dsDNA recombinante è constituído preferencialmente por cadeias de unidades mer de repetição, complementarmente de 2 - 4 bases (isto è, um dlmero de repetição, trimeros ou tetraimeros), tais como (AC) (dimero) (TG) (TAC) (trí mero)

(ATG) (GCTA) (tetraímero) n’ ’ (CGAT) n’ ?

em que n, n’, e n^:’· são números inteiros seleccionados para -fornecer o número desejado de pares de bases. Polinucleõtidos constituídas de dímeros isomèricos, por exemplo, poli d(AC)s poli d(GT) e poli d(AG)s poli d(CT) são os mais preferidos.

Com base na interpretação do espectro dicrõico circular (CD), acredita-se que os duplexes, que são úteis no invento, assumem uma estrutura helicoidal típica B-DNA. Deveria ser entendido que não è intenção que o invento seja limitado por estas convicções e que os duplexes possam, apõs anãlises mais conclusivas, assumir estruturas helicoidais tipicas de Z-DNA e/ou A--DNA. As hélices de sentido directo das -formas de B-DMA, tendo pares de bases aproximadamente perpendiculares ao eixo longitudinal helicoidal dos outros dois tipos de hélices de DNA. As estruturas helicoidais dos diferentes tipos de DMA podem ser caracterizadas pelo espectro dicroico circular (CD). 0 espectro CD das formas B de DMA exibe (:l.) bandas dicrõicas positivas associadas com a helicidade de sentido directo nas porções do espectro abaixo de· 250 nm, mas separadas das bandas dicrõicas de comprimento de onda longo positivo superiores a 206 nm por um mínimo significativo num comprimento de onda entre 240 e 260 nm, e (2) um singelo pico nítido, superior a 250 nm, com um salto azul máximo relativo á máxima vista no espectro das formas A do

RNA, e DMA e centradas num comprimento de onda entre 270 e 290 nm. Por meio da comparação geral das entras duas formas helicoidais do DNA, o Ζ-DNA è distinguido pela sua curva r

helicoidal estreita de sentido inverso com pares de bases nâo posicionados, simetricamente em volta do eixo helicoidal, e o A~ DNA forma uma hélice mais aberta de sentido directo, em que os pares de bases são orientadas abliquamente ao eixo helicoidal longitudinal e são puxados para fora do centro da hélice.

Estes duplexes polinucleotldicas podem ser sintetizados a partir do DNA nativo, ou sintetizado por técnicas químicas ou recombinantes. 0 dsDNA, ocorrendo naturalmente ou produzido recombinantemente, de longo comprimento, pode ser purificado (por exemplo, enzimaticamente, quimicamente, ou por cisão mecânica) e fraccionadas (par exemplo, por gel de agarose ou coluna de Sephadex), para obter polinucleótidos do comprimento desejado.

Alternativamente, pares de cadeias polinucleotldicas de cadeias simples e complementares, encadeados com até cerca de 70 bases em comprimento, são preparados rapidamente usando sintetizadores de DNA disponíveis comercialmente, e depois emparelhados para formar duplexes pelos procedimentos convencionais. Os dsDNA sintéticos de comprimento longo podem ser obtidos por extensão enzimática (5^!' -fosf ori 1 ização seguida de ligação) das cadeias pequenas produzidas quimicamente.

Os polinucleótidos também podem ser produzidos por clonagem molecular. Por exempla, os oligonucleótidos de comprimento e sequência desejada são sintetizados como acima. Estes oligonucleótidos podem ser concebidos para terem terminus apropriados para ligação em locais de restrição especifica. Repetiçóes múltiplas destes oligómeros podem ser ligadas em fila para promover as replicações de múltiplas cópias. As construções resultantes são inseridas num vector de clonagem padrão, e o vector fe introduzido numa cfelula/microorganismo adequado, por transformação. Os transformados são identificados por marcadores padrão e são aumentados sob condições que favorecem a replicação do DNA. Os polinucleótidos podem ser isolados do outro DNA das cfelulas/microarganismos por tratamento com enzimas de restrição e fraccionamento de tamanho convenciona], (por exemplo, gel de agarose, colunas de Sephadex).

Alternativamente, os oligonucleõtidos podem ser replicados pela tecnologia de reacção em cadeia de polimerase (f''CR) . Saiki, R» K. , e outros, Science (1980) 230; 1550; Sacki, e outros, Science (1988) 259a487; Sambrook, e outras, In Molecular Cloning Techniques : A Laboratory Manual, vol. 12, p. 14, 1 - 14, 35 Cold Spring Harbor Press (1989),

Em contraste com os conjugados da indústria anterior, cada duplex polinucleotidico empregue no presente inventa exibe actividade de ligação significativa com o SLE antisera.

Preferivelmente, eles são substancialmente homogéneos em comprimento. Neste aspecto, os polinucleõtidos da técnica anterior eram heterogéneos em comprimento e constituídos por uma mistura de cadeias, sendo algumas ou todas elas pequenas demais para exibirem tal actividade. Os polinucleõtidos podem ser pesquisados quanto á actividade de ligação com o SLE antisera pelos ensaios descritos nos exemplos. 0 ensaio Farr modificado, em que a actividade de ligação pode ser expressa como I (a concentração polinucleotidica, em nucleótidos molares, resultando em metade da inibição máxima) fe um ensaio preferido. Os duplexes polinucleotidicos tenda um I de menos do que cerca de 500nM, preferivelmente menos de 50 nM, considera-se que têm actividade de ligação significativa e são, por isso, úteis para o fabrico dos conjugadas deste invento.

Os polinucleótidos são ligados ao polimero de uma maneira que preserva a sua actividade de ligação. Isto fe feito pélo acoplamento do polinucleótido ao polímero num local pródeterminado na cadeia polinucleotldica, de tal forma que o polinucleótido forma uma cadeia pendente, de pelo menos cerca de •30 pares de bases medida desde o local de acoplamento atè ao fim livre (não ligado a nada) da cadeia. Em contraste, a técnica de acoplamento de gluteraldeldeo ensinada por Borel e outros, refere causas de acoplamento em locais aleatórios, ao longo da cadeia, e ligações cruzadas. Assim, usando aquela técnica, cadeias maiores do que 20 pares de bases podem ser acopladas num local intermédio na cadeia para formar cadeias pendentes de, substancialmente, menos do que 20 pares des bases em comprimento, ou as cadeias podem ser juntamente acopladas para formar redes ligadas cruzadamente de tamanho indefinido.

Preferivelmente, os duplexes polinucleotidicos dos conjugados do inventa são acoplados ou conjugados ao polimero num local em, ou próximo de um dos seus extremos. Várias conjugações estratégicas estão disponíveis para a ligação dos oligonucleótidos ao biopolimero. 0 polinucleótido pode ser acoplado ao polimero na extremidade 3’ do polinucleõtido, via uma ponte morfolina, formada pela condensação de uma ribose terminal 3’ oxidada numa das cadeias do polinucleõtido, com um grupo amino livre no polimero, e depois sujeitando o aducto á condição de redução, para -formar as ligações morfolinas. Tal acoplamento requer que o polímero tenha, pelo menos, um número igual de s grupos amino livres (por exemplo, os grupos amino epsilon do DEK) para o número de duplexes polinucleotidicos para serem ligados ao polímero» A síntese de um tal conjugado fe conduzida em dois passas. 0 primeiro passo fe o acoplamento de uma cadeia de duplexes polinucleotidicos ao polímero, via a reacção de condensação/redução descrita atrás. A ribose terminal 3·’ oxidada fe -formada na cadeia polinucleotidica simples, pelo tratamento da cadeia com periodato, para converter o grupo ribose terminal 3’ num grupo ribose oxidado. 0 polinuclefetido de cadeia simples è depois adicionado suavemente a uma solução aquosa do polímero de pH de cerca de · 6,0 atfe 8,0, a 2 - 8°C« A razão molar do polinuclefetido para o polímero em todas as conjugações estratégicas serà normalmente na ordem de cerca de 2:1 atè cerca de 30:1, preferivelmente cerca de 5:1 atfe 10:1. Durante ou depois da reacção de condensação (normalmente o tempo de reacção de 24 atfe 48 horas) , um agente de reacção -forte, tal como o cianoboroidrido de sfedio, fe adicionado para formar o grupo morfalino. A cadeia complementar do duplex fe depois adicionada ao conjugado, e a mistura fe aquecida e suavemente arrefecida para originar as cadeias para emparelhar. 0 conjugado pode ser purificado por cromatografia de permeação em gel.

Outra estratégia envolve formação de grupos funcionais aldeldeos terminais nos oligonucleótidos, e usando os grupos funcionais para acoplar o oligonucleótido ao polímero, via os grupos amino existentes nesse local. Podem ser tiradas vantagens do facto de que o gem, os dióis vi clnal s, ligados á extremidade

3’ do oligonucleótido,, podem ser oxidados com periodato de sõdio para produzir aldeideos que podem condensar-se com os grupos amino do polímero. Quando os diois se encontram num sistema de anel, por exemplo, um anel com 5 membros, o produto da condensação resultante fe um anel heterocíclico contendo nitrogénio, por exemplo, um morfolino com seis membros ou anel piperidino. 0 produto da imino-condensação fe estabilizado pela redução com um agente de redução adequado, por exemplo, boroidrido de sõdio ou cianoboroidrido de sõdio. Quando o diol è aclclico, o produto de oxidação resultante contem sõ um aldeldeo, e o produto da condensação fe uma amina secundária.

A estratégia do diol vicinal também pode ser continuado por ligações 5*-terminais. Isto è completado pela formação de derivados cianoeti1fosforamiditos de um grupo hidroxi terceàrio num triol, onde os grupos hidroxi restantes são vicinais, por exemplo, 3,4-cis-diidroxi,1-hidroximeti1ciclo-pentano. Neste caso especifico, os grupos diidroxi vicinais estão bloqueados com dimetiIsilano, e o grupo diidroxi primário fe conseguido com 2ci anoeti 1 ™N, N-di i soprop! 1 cl orof osf orami di to, Q derivado resultante ê usado no último passo de sintese do oligonucleótido padrão, e transforma-se no resíduo 5^!’-terminal. Apõs o desbloqueamento do oligonucleótido e remoção do grupo dimeti Isi 1 i lo com o ião fluorido, àc.ido, ou base, o diol vicinal pode ser oxidado com periodato e condensado com grupos amino, como atrás. Uma estratégia similar pode ser seguida para os triois aclclicos para serem usadas como ligantes 5^?-terminais.

Outro procedimento envolve a introdução de metades alquilamino ou alqui1 sulfidrilo, quer dentro das extremidades 3’ ou 5’ do oligonucleótido, pela química de nucleótidos apropriada, por exemplo, a química do fosforamidato. Os grupos nucleofi1icos podem depois ser usados para reagir com o grande excesso de reagente de cross-linking homobifuncional, por exemplo, dimetil suberimi dato, no caso de derivados alquilaminas, ou um excesso de reagente de cross-linking heterobifuncional, por exemplo, ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), ou succinimidil (4-iodoaceti1) aminobenzoato (SXAB), para os derivados al qui 1 sul f i dri 1 o. Uma vez removido o excesso do ligante de cruzamento, os derivados oligonucleôtidos vão reagir com grupos amina no polímero.

Ainda outra estratégia emprega nucleõsidos modificados. Derivados deoxinucleõsidos adequados podem ser incorporados, por química sintética de DNA padrão, numa posição desejada no oligonucleótido, preferivelmente na extremidade 5’ ou 3’. Estes derivados nucleósidos podem reagir depois especifica e directamente com grupos alquiloamino no polímero.

Alternativamente, reacções secundárias verificadas com a química do dialdeideo quimico descrito atrás, tal como a eliminação-beta catalizada por aminas, podem estar envolvidas pela aplicação de derivados nucleõsidos apropriados, como o terminus 3’ da cadeia a ser ligada. Um exemplo disto è a extensão 5’metileno da ribose; isto fe, um grupo 5’(2-hidroxieti1) em vez de um grupo

5’hidroximeti1. Uma alternativa seria usar um fosfonato ou uma ligação fosfinato para o dinucleòtido 3’ terminal do oligonucleótido a ser ligado ao polímero.

A capacidade dos conjugados para actuar como SLE geneticamente tolerável e suprimir especificamente a produção de anticorpos anti-dsDNA pode ser avaliada no modelo murino descrito nos exemplos.

Os conjugados normalmente serão formulados para administração por injecção (por exemplo, intraperitonealmente, intramuscularmente, etc.). Consequentemente, eles serão tipicamente combinados com portadores aquosos, farmaceuticamente aceitáveis tais como salina, solução de Ringer, solução dextrose, e outras. 0 conjugada normalmente constituirá cerca de 0,01% atè 107. por peso da formulação. 0 conjugado è administrado a um indivíduo em quantidades suficientes para, pelo menos, restabelecer parcialmente a tolerância para os antigènios causadores do SLE. Tais quantidades são referidas aqui, por vezes, como quantidades terapeuticamente eficazes. 0 regime de dosagem particular, isto è, a dose, temporização e repetição, dependerão do indivíduo em particular, e da sua história médica individual. Normalmente serà dada uma dose de cerca de 1 atè 1000 pg de conjugado/Kg de peso corporal. Podem ser requeridas administrações repetitivas podem ser requeridas para alcançar e/ou manter um estado de imuno-tolerância»

Os seguintes exemplos ilustram posteriormente o invento e as suas caracter1 sticas imprevistas relativas á indústria anterior. Estes exemplos não pretendem limitar, de forma alguma, o invento.

Teste do Conjugado do Ρ--ΈΚ e dos Nucleõsidos

Individuals

Como indicado previamente, o desenvolvimento dos conjugados do invento foi precedido por testes que mostraram que os conjugados do D-EK e dos nucleõsidos individuais não toleravam a resposta anti-DNA no modelo murino para o SLE (ratos da espécie (NZB !·: NZW)F ) .

Foram obtidos bastantes D-EK foram obtidos da

BioMakor/Yeda (Rehovet, Israel), Os seus pesos relativos foram padronizados contra proteinas conhecidas por cromatografia de permeação por gel material foi dessalinizado e medido por diàlise tubos cutoff de 25 Kd contra 0,ÍM K HPO , pH 9,5 moleculares globulares HPLC, e o exaustiva em , 0 material foi depois dializado duas vezes contra ãgua. Este material è guardado em tampão com 0, IM de K HF'0 , pH 9,5, a 4° C. Os pesos 2 4 mbleculares médios dos produtos foram determinados por métodos fisicos, incluindo equilíbrio de sedimentação, F'AGE, e HPLC-GPC, e difusão de baixo ângulo, e descobriu-se que era de, aproximadamente, 28,000, Aminoãcidos analisados por hidrólise ácida mostraram que o copolímero tinha ácido glutâmico 607, e lisina 407«.

Os conjugados do D-EK e riboadenosina, riboguanosina, ribocitosina e ribotimidina foram essencialmente preparados como descrito em Eshar e outros, J. Imm. (1975) 114:872. Uma mistura de partes iguais de cada um destes conjugados (designados nucleõsidos D-EK) foi utilizada nos seguintes testes.

Dois grupos de 6 ratos fêmeas (NZB x NZW)FÍ com 17 semanas de idade foram injectados i.p«, ou com um purgante salino ou 1 mg/rato de nucleõsido D-EK por dia durante três dias. Sete dias mais tarde os ratos estavam a sangrar. Duas semanas mais tarde, o tratamento foi repetida. Sete dias mais tarde os ratos «SSís» estavam a sangrar. 0 sera da primeira e segunda sangrias foram testadas para anticorpos anti ssDNA utilizando o seguinte protocolo ELISA do antigénio especifica» ssDNA fe imobilizado em recipientes de pratos de poliestireno e reage com anticorpos no sera de lupus URL dpr/lpr) dos ratos. Os anticorpos anti-ssDIMA são visualizados por adição de anticorpos ligados por enzimas específicos para os isotipos de imunoglobulinas ligados ao ssDNA no prato. A adição subsequente do substrato de enzima resulta numa reacção de cor, que fe lida num espectrofotòmetro.

ssDNA fe preparado a partir de dsDIMA de timo de vitela. 0 dsDNA de timo de vitela, obtido comerciaimente, fe tratado com nuclease S-l, para obter dsDIMA homogéneo. 0 dsDNA è fervido durante 5 min. num banho de ãgua, e arrefecido rapidamente num banho de gelo. Cada cozedura de ssDNA fe preparada imediatamente antes de ser usada na experiência.

Noventa e seis pratos de fundo liso do recipiente são expostos á luz ultravioleta (UV), durante a noite, num Steril Gard Hood, antes do uso. Os recipientes nos pratos são revestidos na véspera a 4°C com 100 pl de ssDNA, a uma concentração de 1 pg/ml, num sal contendo 10 pg/ml de albumina metilada do soro bovino. Na manhã seguinte, os pratos são lavados uma vez, em fosfato salino dissolvido (PBS), e são depois bloqueados colocando 200 pl de albumina de soro bovino a 17. em PBS (PBSA) em cada recipiente, durante 45 min» a 37° C. Apõs o bloqueio, os pratos são lavados segunda vez em PBS e secados ràpidamente. Depois, 100 pl de diluições série de teste e contraio de sera, diluido em PBSA a 17. e contendo 0,57. de Tween-20, são colocados

1?

Qm recipientes apropriados. Os pratos são incubados durante 1 hora a 37° C. Depois estes são lavados 5 vezes em PBS e secados ràpidamente, seguindo-se a adição de cem microlitros de anticorpo de fosfatase alcalina de cabra conjugada anti-rato UgG, A e M). Os pratos são incubados durante outra hora a 37° C. Os pratos são lavados 7 vezes em PBS e secados rapidamente. Depois, 50 pl de substrato de enzima 1-x è adicionado, e os pratos são incubados á temperatura ambiente durante hora. A reacção acaba pela adição de 50 pl de fosfato de hidrogénio dissódico, pH 8,6. 0 valor da densidade óptica a 550 nm è determinado para cada recipiente com um espectrofotómetro Titertek»

Os dados são mostrados na Figura 1. Como se mostra, o nucleósido D-EK não tem nenhum efeito detectável nos títulos anti-ssDNA nos ratos.

Exemplo 2

Teste de F'olinucleótidos para a Actividade de Ligação com Antisera SLE.

Em adição aos polinucleótidos usados nos conjugados do invento, vários outros DNA^s foram preparados e testados quanto á sua actividade de ligação com antisera SLE. Estes testes, descritos em baixo, mostram que a reactividade dos pol i nucleótidos dos conjugados do .invento foi imprevisível e inesperàvel.

Vários polinucleòtidos de cadeia simples e de cadeia dupla foram preparados por síntese quimica e, quando apropriado, extensão enzimática e/ou empareihagem. A sintese quimica de oligonucleótidos foi feita num Pharmacia Gene Assembler, utilizando uma coluna ajustãvel Cruachem, e química do fosfito trièster. A fase sólida foi de cristais porosamente controlados de 500 angstrom que eram derivados com o apropriada 3’-riba ou 3^:‘ -deoxi nucleótido. Os oligonucleótidos foram purificados por diálise simples» Mo caso de oligonucleótidos de comprimento maior que '70 bases, cadeias individuais foram fosforilatadas usando ATP e qui nase poli nuc1eotídi ca rT4» Após dessali ηi zação numa coluna Pharmacia PD10, as cadeias fosfori1 atadas foram acopladas covalentemente utilizando ligase de DNA rT4. Todas as cadeias compartilham uma sequência final CATO 5’ comum, que fornece um ónico fim viscoso» Onde apropriado,, cadeias simples foram emparelhadas para formar dsDNA.

Dois ensaios foram empregues para determinar a ligação dos polinucleótidos com lupus antiseras (1) um ensaio Farr modificado, no qual o DNA radiomarcado ó precipitado da solução após estar ligado ao anticorpo, e (2) um ELISA. Num molde, 25 pl de cada diluição anti-soro foi previamente preparada num sal Tris dissolvido (TBS, 0,151*1 de NaCl, 0,011*1 de Tris, pH 7,5) contendo 0,1 mg/ml de gama globulina humana. Estais foram diluídas com 125

125 pl de TBS, 50 pl de Ι-dsDNA (Diagnostics Products Corp., Los

Angeles, CA) foram adicionados a cada amostra, e as amostras foram incubadas a 37° C durante ^!<z hora» Depois, 500 pl de (NH ) SC) saturado foram adicionados, a amostra foi incubada a 4° 4 2 4

C durante 15 min» e centrifugada» A radioactividade do sobrenadante foi medida num contador gama. A deplecção da radioactividade do sobrenadante foi uma medida directa da concentração de anticorpo na solução. No ELISA, os recipientes dos pratos foram revestidos a 4° C com 100 pl de dsDNA a 10 pg/ml em solução salina,, contendo 10 pg/ml de BSA metilatado. Os recipientes foram lavados com PBS e depois bloqueados colocando 200 pl de BSA a 17» em l'BS (PBSA) , em cada recipiente, durante 45 min» a 37° 0. Os pratos foram de novo lavados com PBS. Depois, 100 pl de sera de teste diluído em PBSA a 17, contendo Tween 20 a 0,57», foram adicionados. Para estudos de inibição, o inibidor (por exemplo, um polinucleótido) também foi adicionado. Os pratos foram depois incubados 1 hora a 37° C e lavados com PBS. Anticorpo de cabra marcado com fosfatase alcalina, 100 pl/cèlula, foi adicionado e os pratos incubados durante outra hora a -37° C. Os pratos foram depois lavados, o substrato foi adicionado, e os pratos foram incubados numa estufa durante hora. A reacção foi parada pela adição de fosfato de hidrogénio dissódico e os pratos foram lidos com um espectrofotõmetro.

As tabelas 1 e 2 apresentam, a seguir, respectivamente, vários polinucleõtidos de cadeia simples e polinucleòtidos de cadeia dupla que não inibem significativamente o dsDNA, ligados por auto-anticorpos SLE. nestes testes.

TABELA 1

HOMOPOLÍMEROS NUCLEPTIDICOS____DE CADEIA SIMPLES QUE ABAIXO DE

500nM NAO INIBIAM SIGNIFICATIVAMENTE 0 dsDNA LIGADOS A MURINA (MRL) QU AUTO-ANTICORPOS SLE HUMANOS composição n-mer composição n-mer

A. Homopurinas poli d(G)n

1219 * 350 *

OQ poli d(A)n

390 * 60 OX 22 12 i

B. Homopirimidinas poli d(C)n

32? * poli d(T)n

Λ.Χ.7

* Enzimàticamente sintetizada, utilizando polimerase rT4 DNA. Porque os pesos moleculares são uma distribuição, os valores de n para os oliçjõmeros sintetizados enzimaticamente constituem um número médio do peso, estimado a partir do valor Sw,20 de cada.

TABELA 2

EXEMPLOS DE DUPLEXES 0LIG0NUCLEQTIDQ5 ATE 32 PARES DE BASES QUE

ABAIXO DE 500 nM NAO INIBIAM SIGNIFICATIVAMENTE A LIGAÇAQ DO dsDNA A MURINA (MRL) OU ANTISERA SLE HUMANO

A, HOMOPOLÍMEROS

Regular

Exemplos: EA3 : ET3 , EG3 : EC3 ,EI3 : EC3

30 25 25 20 20

B. HETEROPOLIMEROS

1. Auto-ali nhamento

Exemplo: EG3 -EA3 -EC3 ;EG3 -ET3 -EC3 2 10 2 2 10 2

2· Plmeros de repetição

Exemplos: EAT3 :EAT3 , EAC3 : EGT3

16 10 10

3. Trímeros de repetição

Exemplos; ETTC3 : EGAA3 , ETTG3 : ECAA3 8 8 8

4. Tetralmeros de repetição ! Exemplo: EACGT3 : EACGT3

TABELA 3

EXEMPLOS DE DUPLEXES 0L.160NUCLEDTIDDS QUE ABAIXO DE 500 nM < I menor que 500 nM) INIBIAM SIGNI Fl'CAT 1'VAMENTE A LIGAÇAO DO dsDNA

AQ SORO HUMANO SLE E AP SORO DA MURINA (MRL)

Composição	n Maior que	Comprimento	do Oligòmero
—		—	—	—	--------------
d(AC)	:d(TG)	20	40	ou	maior
n	n
d(AT)	:d(TA)	20	40	ou	mai or
n	n
d(IC)	:d(CI)	20	40	ou	maior
n	n
d (AC)	:d(TG)	20	40	ou	maior
n	n
d (AG)	:d(TC)	20	40	ou	maior
n	n
d(ATC)	:d(GAT)	15	45	ou	maior
n	n
d(TAC)	sd(GTA)	15	45	ou	mai or
n	n
Exemplo	3

Correlação da Actividade de Ligação com o Espectro CD

As medidas espectrais do CD foram concretizadas em poli(AT): poli(AT) de cerca de 228 bp em comprimento (por exemplo de A-DNA), poli(GC): poli(GC) de aproximadamente 330 bp em comprimento (por exemplo, de Z-DNA), esperma de salmão DNA de comprimento médio maior que 1200 bp (um exemplo do DNA nativo com um tipo B-DNA com configuração helicoidal) e o duplex (AC) :(TG) acima descrito. Ensaios de ligação dD antisera SLE 30 30 nestes oligonucleótidos e no DNA foram concretizados utilizando o ΐ ensaio Parr modificado como atrãs.

Todos os DNA’s e oligonucleótidos foram dissolvidos em dissolvente padrão (0,15M de NaCl, 0,IM de citrato de sódio, pH 7,0), e as suas relativas capacidades para ligar ao sera H-SLE auto-imune foram comparadas ás suas capacidades respectivas para absorver a luz monocromática polarizada circularmente á esquerda e á direita (espectroscopia CD). Os dados serológicos são expressos como a capacidade para inibir a ligação do dsDNA ao sera; o espectro è apresentado como uma elipticidade molar por residuo nucleôtido:

COZI = 100/c.L.

onde 9 è a elipticidade observada em graus, L è o comprimento do encaminhamento na célula em cm, e c è a concentração em moles de nucleótidos por litro.

A Figura 2 mostra o espectro CD do poli(AT): poli(AT).

' A Figura 3 mostra o espectro CD do poli(GC): poli(GC) (linha a cheio interrompida com círculos a cheio), o esperma de salmão DNA (linha tracejada), e o duplex (AC) : (TG) (linha

30 continua a cheio).

A Figura 4 mostra as capacidades relativas das diferentes formas de DNA para ligar ao antisera SLE. Como fe mostrado, o DNA tipo B sintético tem reactividade similar ao DNA tipo B (foi utilizado o timo DNA de vitela), e reactividade substancial mente maior que qualquer DNA tipo A ou tipo Z. (0 tipo helicoidal foi caracterizado pelo espectro CD e, como indicado em cima, pode não ser conclusivo.)

Síntese do Conjugado D-EK do (AC) ;(TG) .30 30

Com base na actividade de ligação e estabilidade, o duplex (AC) : (TG) descrito acima foi seleccionado para

30 estudos de tolerância genética. Um conjugado deste duplex e um copolímero D-EK foi preparado utilizando o procedimento de sintese preferido, em cima delineado. Seguem-se os detalhes desta sintese.

^5 rj»««25saae2^,a’^sS! ^w'.*^eai

-j

60:40,

MW med copolímero D-EK, G:L mol 30.000 daltons foi preparado a com uma relação de partir do material obtido da BioMakor, Rehovet, Israel. Este copolímero foi dializado contra 0, 1M de KHCO , pH 9,5, em tubos de diàlise com um grau de

T admissão de peso molecular de 25.000 dal tons, para uma concentração final de 20 mg/ml, como determinado pela absorvância a 220 nm numa cuvete de 1 cm, em que:

A (30.000 mg/nmol) (168.000 mL/cm nmol) □ (AC) foi sintetizado num sintetizador DNA e 30 dializado contra ãgua desionizada em tubos de diàlise com um grau de admissão de peso molecular de 12.000 - 14,000 daltons» A solução resultante è ajustada para uma concentração final de 35 mg/ml, como determinado pela absorvância a 260 nm numa cuvete de i cm, em que

A (18,106 mg/nmol)

260 <flC>^ mg/ml (458.160 mL/cm nmol)

Uma solução aquosa de periodato de sõdio, 0,1M, e àgua foi adicionada ao (AC) para dar uma reacção de mistura com um 30 excesso molar de 5:1 do periodato para o DNA. A mistura foi bem agitada e depois colocada a 4° C durante 15 min.. 0 excesso de periodato foi então precipitado pela adição de um excesso de cloreto de potássio e o precipitado foi removido por centrifugação.

Uma solução de D-EK e cianoboroidrido de sõdio foi pipetada num vaso de reacção de polipropileno e o pH foi ajustado entre 6,0 e 8,0. 0 (AC) oxidado foi adicionado gota-a-gota ao 30

D-ER numa relação de peso de 6,035:1 (relação molar de conjugação ó

qs de IOsl), com agitação vigorosa durante 24 - 48 horas a 4°C. Apõs condensação, foi adiccionado boroidrido de sõdio sólido á mistura da reacção, com agitação, atè ser atingida uma concentração final de 1,0 mg/ml . 0 vaso da reacção foi mais ou menos encapsulado e deixou-se ficar, sem ser agitado, durante, pelo menos, 30 min.. A mistura da reacção foi depois transferida para os tubos de diàlise com um grau de admissão de 50.000 daltons e foi dializada extensivamente contra 0,21*1 de citrato de sõdio, pH 5,0, a 4° C.

conjugado foi depois purificado numa coluna cromatográfica de permeação de gel Sephacryl S-200, em 0,21*1 de fosfata de sõdio, 0,51*1 de cloreto de sõdio, pH 7,2. As fracções foram analizadas quanto á concentração de oligonucleõtidos por

0D , e quanto á concentração de D-EK por um ensaio de sulfunato 260 de trinitrobenzeno (Albers, R. W., e outros, Analyt Biochem (1983) 137s437-443). A separação do conjugado do oligonucleótido '-’Xlivre foi determinada por uma P-quinase rotulada de 5’hidroxil ria cadeia oligonucleotidica, seguida por uma poliacri1amida a

107., 81*1 de gel sequenciando ureia, e autoradiografia. 0 gel foi cortado e contado num contador beta de cintilação liquida, e essas fracções exibindo i 957. de pureza foram agrupadas e dializadas contra 0,011*1 de citrato de sõdio, 0,151*1 de cloreto de sõdio, pH 7,0 (dissolvente de formulação) em preparação para empareihagem.

(TG) foi preparado como, descrito em cima e 30 dializado contra o dissolvente de formulação, da mesma maneira que o (AC) . A concentração molar de nucleòtidos (l*INC) do (TG)

30 foi determinada pela medição da absorvància a 260 nm numa cuvete de 1 cms l*INC (TG)

A /(9164 mL/cm mmol)

260 nm

líNC do conjugado do (AC) -D-EK foi determinado pela 30 medição da absorvância da solução dializada a 260 nm·.

MNC (AC) -D-EK = A /(7636 mL/cm mmol)

260 nm (TG) foi depois emparelhado com o conjugado do 30 (AC) -D-EK como se segue» Um MNC do (TG) igual foi adicionado 30 30 ao reagente de limitação do (AC) -D-EK num recipiente de 30 propileno ou de vidro. A mistura foi aquecida atè > 95° C num banho de ãgua, que foi mantido entre 95° C e 98° C durante 10 min.» A solução foi depois suavemente arrefecida á temperatura ambiente a uma taxa i 10°/hora.

produto emparelhada è dializado contra o dissolvente de formulação em tubos de diàlise com um grau de admissão de peso molecular de 50.000 daltons. Apés diàlise extensiva, o conjugado final è filtrado esterilmente através de uma membrana de 0,22 pm. E caracterizado por espectroscopia UV, cromatografia liquida com gel de permeação de alta resolução, electroforèse com gel poliacri1amida e termografia antes do enchimento estéril.

Exemplo 5

Teste dos Conjugados do (TG) 50; (AC) -D-EK como um 50 50

Toleragénio

D conjugado do (TG) s(AC) -D-EK, descrito acima, foi

30 testado no modelo murino iíRL (lpr/lpr) para o SLE humano. Um defeito genético nesta espécie de rato conduz a hiperproliferação de células auxiliares T que, em todas as possibilidades, participam em diferenciação autoreactiva das células B. Estes resultados em secreção de anticorpos para o DNA, bem como uma pletora de outros anticorpos. Como indicado previamente, os anticorpos para o dsDNA são um contraste do SLE humano e a sua presença correlaciona-se bem com a severidade da doença e a patologia renal nos seres humanos.

conjugado foi diluido numa solução salina até á concentração desejada, para injecção i.p. nos ratos. Foram usados quatrogrupos de cinco ratos com 12 a 14 semanas de idade cada. Os 'ratos sangraram na manhã do dia 1 e foram injectados de tarde. Cansequentemente, os ratos sangraram de manhã e foram injectados de tarde cada semana, durante mais cinco semanas» Nas semanas 6 e 7 os ratos apenas sangraram. 0 Grupo 1 (controlo) foi injectado com 0,3 mg de copolímero D-EK/semana/rato; o Grupo 2, com 0,1 mg do conjugado/semana/rato; o Grupo 3, o Grupo 4, com 0,3 mg do conjugado/semana/rato; e conjugado/semana/rato.

As amostras de plasma retiradas dos ratos foram diluídas 1:10 e 1:50 em dissolvente Tris (0,11*1, pH 7,4) e usadas com

1,0 mg do no ensaio Farr modificada descrito em cima, usando H-dsDNA em

125 vez de Ι-dsDNA para determinar a titulação do anticorpo antidsDNA das amostras. Os dados obtidos no ensaio Farr modificado foram convertidos em capacidade de ligação do antigénio e estão traçados na Figura 5 (o conjugado é designada por LJP-105).

Quatro semanas depois do fim do tratamento, dois ratos de cada grupo e ainda um rato do grupo de controlo foram sacrificados, e os níveis de secreção de anticorpos anti-dsDNA em cada grupo foram determinados numa célula do baço por ELISA onde

4 i x 10 até 1,5 x 10 células do baço em diluições duplas foram colocadas em cada célula. Os resultados desses testes são relatados na Figura 6.

Uma experiência do conjugado -foi também realizada em ratos MRL mais velhos, com 22 a 24 semanas. De novo, os ratos foram doseados por i.p. uma vez por semana, durante quatro semanas. Os niveis serolõgicos de anti-dsDNA foram determinados apõs um mês de tratamento, e foram comparados aos valores antes da sangria obtidos no inicio. Esses dados, expressos como uma mudança percentual em capacidade de ligação do antigénio (ABC) para ratos individuais, são mostrados na Figura 7. A Figura 7a mostra os dados médios desses testes. A variabilidade nos ratos por grupo de dosagem (conjugados 0,01, 0,1, 0,3 e 1,0 mg/rato; os ratos de controlo recebiam uma mistura do polimero portador e do ácido nucleico inconjugado substituto) reflecte as mortes durante a experiência.

Os dados do ensaio das células do baço da experiência terapêutica são apresentados na Figura 8, demonstrando de novo uma diferença significativa entre os ratas de controla e as tratados com conjugado, e confirmam os resultados serolõgicos prévios. Como experiência de controlo, mostrou-se que o dsDNA solúvel inibia o ensaio das células do baço. Adicionalmente, adicionando as células do baço de animais tratados com polinucleõtidos ás células de controlo do baço, não decresciam de côr; de preferência, o efeito foi aditivo, determinando assim que aquele conjugado da célula limite tenha inibido o ensaio.

Finalmente, mostrou-se que o conjugado pode ser eficaz por via i.p, i.m, ou i.v.. Ratos fêmeas MRL, com vinte e duas semanas, foram doseados com 0,1 mg de conjugada por semana durante quatro semanas, e medida a variação percentual na capacidade de ligação antigênica para anti-dsDNA. Enquanto os ratos de controla não incrementaram tanto como se tinha visto com outras experiências, houve significativamente maiores títulos de anti-dsDNA nos ratos doseadas subcutâneamente, por um lado, e os ratos doseados com o outro conjugado por via i.p, i.m, ou i.v., por outro.

Exemplo 6

Este exemplo ilustra os procedimentos alternativos para fazer o conjugado (AC) :(ΤΘ) -D-EK.

30 i

Clongagem de 60 mers

A clonagem molecular è utilizada para fazer 60 mers segundo o seguinte protocolo. Um 64-mer, consistindo na sequência

S^AATTC (ST) S3· e um segundo 64-mer de sequência 5’TCGAC 29 (AC) G3’ são sintetizados e fosforilados por métodos padrão. Os 29 oligómeros são misturados em relações molares iguais, e arrefecidos suavemente para permitir formação dupla e a ocorrência de oligomerização. As saliências dos oligómeros são emparelhadas devido á sobreposição de 4 bases do primeiro oligómero, criando um local EcoRI, e a segunda saliência criando um local posição Sal I (a mesma que o local HincII). Após arrefecimento vagarosa, a mistura è ligada por métodos padrão para formar um oligómero de 60 unidades mer ligadas, covalentemente separadas, tanto por uma posição EcoRI ou por uma Sall. A mistura oligomèrica è ligada num pUC19, que foi previamente digerido com EcoRI e Sall. A mistura de ligação è introduzida no JM107 de E. Coli < por transformaçâo.

Colónias resistentes de Ampicilina são apanhadas, desenvolvidas e isoladas do plasmídeo DNA. 0 tamanho de inserção è determinado digestão com restrição. 0 clone desejado tem uma inserção que compreende, pelo menos, metade do plasmídeo ou > 50, 60 unidades mer.

clone resultante está desenvolvido em larga escala e isolado do plasmídeo. 0 plasmídeo è digerido com EcoRI e Hindi para libertar 60 mer com uma saliência EcoRI de 4 bases e um -fim brusco no extremo oposto e gerado pelo Hindi. Os oligómeros são purificados e emparelhados com o D-EK que tem o oligómero de 4 bases 3’TTAA-P com um fosfato 5’ covalentemente ligado ao D-EK atravós do 3^;‘T. Os 60 mers são emparelhados e ligados covalentemente ao D-EK/TTAA por ligase.

Produção PCR de 60 mer

A reacção em cadeia da polimerase è utilizada para sintetizar 60 mers para acoplar ao D-EK, pelos métodos descritos nas referências acima citadas.

Em resumo, o (GT) è quimicamente sintetizado com 30 pequenas sequências aleatórias tais como GACT e CTGA, no extremo

5^!’ e 3’ do (GT) , respectivamente (como ilustrado a seguir). As 30 pequenas sequências aleatórias são suficientemente longas para assegurar registos características do primer para o modelo. 0 primer contém a sequência da sequência aleatória, mais várias repetições extra do GT como necessário para a estabilidade na reacção de empareihagem. Um dos primers” também tem uma base extra modificada no fim 5’, que permite acoplagem quimica ao DEK.

A reacção PCR è realizada durante, pelo menos, 20 ciclos segundo os métodos citados em cima. Os oligõmeros produzidos por PCR são purificados por cromatografia, tal como o

HPLC, e depois conjugada para o D-EK por um dos procedimentos acima descritos.

PRIMER ls (CA)-GACTS’

MODELO 1: 5’fcNGACT-(ST) -CTGA3’

PRIMER 2: 5¹¹ *GACT-<GT)

MODELO 2: 3^?CTGA-(CA) -TACGõ’ = base modificada para acoplamento ao D-EK

Claims

REIVINDICAÇÕES ί- Um conjugado de (a) um polímero biologicamente estável, e (b) uma multiplicidade de duplexes polinucleotldicos de, pelo menos, 20 pares de base, cada um ligado ao polímero, caracterizado pelo facto de os referidos duplexes possuirem, cada uma ligada, uma actividade de ligação significativa para os auto-anticorpos anti-DNA de cadeia dupla do lupus eritematoso sistémico humano.
2- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o polímero biologicamente estável ser um copolímero de ácido D-glutámico (E) e D-lisina (K) tendo um peso molecular de cerca de 5.000 a cerca de 50.000 e uma proporção de moles E:K de, aproximadamente, 60:40.
3- ·· Um conjugado, conforme reivindicado na rei vi ndi cação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de os duplexes serem substancialmente homogéneos em comprimento.
4- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de os duplexes serem substancialmente homogéneos na composição nucleotidica.
5- Um conjugado, conforme reivindicado nas reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo facto de os duplexes terem de 30 a 250 pb em comprimento.
6- Um conjugado, conforme reivindicado nas rei vindicações 1,

2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo facto de os duplexes serem ligados ao polímero na, au próximo de uma das suas extremidades.
7- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de os duplexes serem ligados ao polímero através de uma reacção entre um grupo funcional em, ou prõximo do terminus de uma cadeia do duplex e dos grupos amino livres no poli mero.
8- Um conjugado, conforme reivindicado nas reivindicações i,

2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo facto de os duplexes polinucleotldicos serem compostos de unidades mer de repetição complementares, de 2 a 4 bases diferentes.
9- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de os duplexes polinucleotldicos serem:

poli d(GC)!poli d(CB>; poli d(AT>:poli d(TA>; poli d(IC):poli d(CP); poli d(AC)spoli d(TG); ou poli d(AS)spoli d(TC).
10- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o duplex polinucleotldico ser (AC) ; (TS) .

30 30
11- Uma composição farmacêutica para tratamento do lupus, compreendendo o conjugado das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, ó, 7, 8, 9, ou 10, caracterizada pelo facto de ser formulada com um veículo injectàvel, farmaceuticamente aceitável.
12- Um polinucleótido de cadeia simples de, pelo menos, 20 bases, possuindo um grupo funcional em, ou próximo de um dos seus terminus que reagirá com um grupo amino livre, quando emparelhado com um polinucleótido de cadeia simples complementar, caracterizado pelo facto de possuir uma actividade de ligação significativa quanto aos auto-anticorpos anti-DNA de cadeia dupla do lupus sistémico humano.
13- Um polinucleótido de cadeia simples, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de ser constituido de uma unidade mer de repetição, de 2 a 4 bases diferentes.
14- Um método para a obtenção do congujado da reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender:

(a) a reacção de uma multiplicidade de polinucleòtidos de cadeia simples, de, pelo menos 20 pares de base, cada um dos quais possui um grupo funcional amino-reactivo em, ou próximo dos seus terminus, formando os grupos amino livres, no polímero, um conjugado, (b) o empareihamento de polinucleòtidos de cadeia simples complementares com os polinucleõtidos de cadeia simples conjugados com o polímero, para formar cadeia pares do cadeia dupla.