JP2001520640A

JP2001520640A - 心筋梗塞を処置するためのｇｌｐ―１またはその同族体の使用

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Publication number: JP2001520640A
Application number: JP51186798A
Authority: JP
Inventors: エフェンディク，スアード
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-26
Publication date: 2001-10-30
Also published as: EA003695B1; IL128741A; HUP0003173A2; KR20000035835A; CZ299059B6; AU715295B2; PT964692E; CN100374153C; NO322898B1; KR100389767B1; HUP0003173A3; NO990916D0; PL331986A1; BR9711447A; MY131796A; DE69738615T2; NO990916L; RS49918B; HK1024186A1; NZ334269A

Abstract

(57)【要約】本発明は、心筋梗塞後の罹患率および死亡率を減少させるための方法に関する。血糖を正常化させるに有効な量のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体およびＧＬＰ−１誘導体を投与する。

Description

【発明の詳細な説明】心筋梗塞を処置するためのＧＬＰ−１またはその同族体の使用発明の背景１．発明の技術分野本発明は、糖尿病患者における心筋梗塞後の死亡率および罹患率を減少させるための方法に関する。２．背景技術の情報顕著な糖尿病またはグルコース耐性障害を有する患者における心臓血管疾患の罹患率および死亡率はこれらの障害を有していない患者と比較して高い。梗塞が疑われて心臓集中治療室に収容された患者総数の２４％までは糖尿病が原因であ Fuller J.H.，Diabet.Metab．19:96-99(1993)］。心筋梗塞を伴う糖尿病患者の病院内死亡率は非糖尿病患者の２倍である［Hamsten A.，ら、J.Int.Med．736:1 - 264(1988)］。急性回復期後では糖尿病患者は主として致命的な再梗塞およびう Stone P.,ら、J.Am.Coll．Cardiol.14:49-57(1989)；Karlson B.W.ra,Diabet.Me d.10(5):449-54(1993)；Barbash G．I.,ら、J.Am.Coll.Cardiol.22:707-713(199 3)］。心筋梗塞後の糖尿病および非糖尿病間における死亡率と罹患率の相違は、急性心筋梗塞後の罹患および死亡の傾向が減少したとしても、変わらない［Gran ger C.B.,ら、J.Am.Coll.Cardiol.,21(4):920-5(1993)；Grines C.,ら、N.Engl. J.Med.328:673-679(1993)］。急性心筋梗塞を伴う糖尿病患者の予後が思わしくないことに関与している因子はその急性疾患の前、中および後に作用しているかもしれない。その因子には、より進行し拡散した冠動脈疾患を伴う広汎性冠状アテローム症があり、これが可能性ある糖尿病性心筋症と相俟って高い罹患率のうっ血性心不全をもたらすことがある。また、痛覚障害および安静時心拍数変動の増大を伴う自律性ニューロパシーも重要なことがある。冠動脈血栓は進展性梗塞症の必須部分であり、血小板活性、凝血およびフィブリン分解機能が糖尿病患者では明らかに障害されていることが見出されている［Davi G.,ら、New Englans.J.Med.,322:1769-1774(1990) ］。糖尿病における過度な代謝障害が重要な役割を果たしているかもしれない。心筋梗塞はインスリンの循環を減少させ、アドレナリン作動性状態を劇的に増大させ、そしてストレスホルモン、例えば一緒になって高血糖を増大させ脂質分解を刺激するコルチゾン、カテコールアミン類、グルカゴンを放出させる。放出された遊離脂肪酸はさらに、幾つかの機構を通じて心筋を傷害し、遊離脂肪酸の過剰酸化は心筋の非虚血部に障害を加える可能性がある［Rodrigues B.ら、Cardiova scular Research，26(10):913-922(1992)］。血糖（血中グルコース）を正常化し、糖尿病における梗塞障害を悪化させる代謝カスケードを制御するための待期的手段が必要である。最近の試験では、急性心筋梗塞期の糖尿病患者の代謝管理を改善、例えばインスリンおよびグルコース注入の注意深いモニターおよび皮下多重投与インスリン処置による急性期後の血糖のきっちりとした調節は、臨床的に必要とされない限りインスリン処置を行わなかった糖尿病患者対照群と比較して３０％、心筋梗塞後の年間死亡率を減少させた［Malmberg,K,ら、J.Am.College Cardiology,26:57-65(1995)］。しかし、インスリン注入は、血糖が０．３ｍＭ以下と定義される低血糖症を引き起こす可能性がある。低血糖症は心室性不整脈の危険性を増大させ、インスリン注入の危険な結末である。低血糖症を予防するため、心筋梗塞を伴う糖尿病に対するインスリン注入のためのアルゴリズムが開発された［Hendra,T.J.,ら、Di abetes Res.Clin.Pract.,16:213-220(1992)］。しかし、このアルゴリズムの下でも２１％の患者が低血糖症を引き起こした。心筋梗塞後の別のグルコース制御試験では、インスリンおよびグルコースを注入した場合、１８％の患者が低血糖症を引き起こした［Malmberg,K.A.,ら、Diabetes Care，17:1007-1014 (1994)］。低血糖症の発現を検出でき、できるだけ素早く治療できるように血糖値のモニターリングがインスリン注入にはさらに必要である。上記試験におけるインスリン注入を受けた患者［Malmberg,1994］では、血糖を少なくとも２時間毎に測定し、それに応じて注入速度を調節した。従って、心筋梗塞患者におけるインスリン−グルコース注入療法の安全性および効能は血糖データへのアクセスの容易さおよび迅速さに依存する。このように血糖をモニターリングしなければならない強い必要性は健康管理従事者に大きな負担を強い、処置の不便さと経費を増大させる。その結果、心臓集中治療室では、インスリンの静脈内投与によって得られるであろう急性心筋梗塞を伴う糖尿病患者の血糖値をモニターし最適化するための手段を多くの場合は講じない。インスリン注入に内在する危険性および負担を考えると、糖尿病患者における急性心筋梗塞期の血糖を管理する別の方法が求められる。内分泌ホルモンであるグルカゴン様ペプチド１（以下、ＧＬＰ−１と略す）は消化管においてプログルカゴンからプロセッシングされ、栄養誘発性のインスリン放出を増大させる［Krcymann B.,ら、Lancet 2:1300-1303(1987)］。ＧＬＰ− １の種々の断頭型がインスリン分泌（インスリノトロピック作用）およびｃＡＭＰ生成を刺激することが知られている［例えば、Mojsov,S.，Int.J．Peptide Pr otein Reserch，40:333-343(1992)を参照］。インビトロにおける種々の研究実験と外的に投与したＧＬＰ−１、ＧＬＰ−（７−３６）アミドおよびＧＬＰ−１（７−３７）酸に対する哺乳動物、特にヒトにおけるインスリン分泌応答との相関性は確立している［例えば、Nauck,M.A.ら、Diabetologia,36:741-744(1993) ；Gutniak,M.,ら、New England J．of Medicine，326(20):1316-1322(1992)；Na uck,M.A.,ら、J.Clin.Invest.,91:301-307(1993)；およびThorens,B.,ら、Diabe tes,42:1219-1225(1993)を参照］。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドは、インスリン感受性を刺激しかつグルコース誘発性のインスリン放出を生理学的濃度で増大させることによって、インスリン依存型糖尿病患者において明らかな抗糖尿病誘発作用を示す［Gutniak M.ら、New England J.Med.326:1316-1322 (1992)］。インスリン非依存型糖尿病患者にＧＬＰ−１（７−３６）アミドを投与すると、インスリン放出が刺激され、グルカゴン分泌が低減し、胃内容排出が阻害され、グルコース利用性が増大される［Nauck,1993；Gutniak,1992；Nauck, 1993］。ＧＬＰ−１型分子を糖尿病の長期療法に使用することは、このようなペプチドの血清半減期が非常に短いため、妨げられていた。例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）は３−５分の血清半減期しかない。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドは皮下投与した場合約５０分の半減期を有する。このように、これらのＧＬＰ分子は長期的な効果を得るためには連続注入などして投与しなければならない［Gutniak M. ら、Diabetes Care 17:1039-1044(1994)］。本発明では、患者は、心臓集中治療室のベッドに寝かされており、そこでは液剤が非経口的に連続投与されているのが通常であるので、ＧＬＰ−１の短い半減期と結果的な連続投与の必要性は不都合なことではない。発明の概要本発明は、心筋梗塞後の死亡率および罹患率を減少させる方法であって、それを必要としている患者にＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体、ＧＬＰ−１誘導体およびそれらの製薬的に許容される塩からなる群の中から選ばれる化合物の、血糖を正常化するのに有効な量を投与することを特徴とする方法を提供するものである。本発明は、急性心筋梗塞期にある糖尿病におけるグルコースおよびインスリン併用処置に観察される心筋梗塞後の死亡率および罹患率を減少させるのに有益であり、血糖の頻繁なモニターリング、血糖結果の解釈およびインスリン投与速度の調節という不便性および不経済性を要せず、またインスリン注入にこれまでは付きまとっていた低血糖症という危険性を伴わない。図面の簡単な説明図１は、５人のインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者における夜間の平均血糖濃度（ｍＭ）に対するＧＬＰ−１（７−３６）アミドの連続注入の効果者における別の夜間の平均血糖濃度に対するインスリンの連続注入の効果（--○ --）も示している。図２は、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを日中、３食それぞれの開始時から３時間注入した場合のその注入における５人のＮＩＤＤＭ患者の平均血糖濃度（ｍ人のＮＩＤＤＭ患者における別の日の平均血糖濃度に対する各食事直前におけるインスリンの皮下注射の効果（--○--)も示している。発明の詳しい説明「ＧＬＰ−１」とはＧＬＰ−１（７−３７）を意味する。ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ末端は数字７を割当て、カルボキシ末端には数字３７を割当てるのが当業界の慣例である。ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸配列は当業者に周知であるが、便宜的に以下にその配列を示す：「ＧＬＰ−１同族体」はＧＬＰ−１と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、逆位または付加を有する分子と定義される。当業者に知られているＧＬＰ−１同族体には例えば、ＧＬＰ−１（７−３４）およびＧＬＰ−１（７ −３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｎ⁹−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ− Ｇｌｎ⁹−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｔｈｒ¹⁶−Ｌｙｓ¹⁸−ＧＬＰ−１（７−３７）、およびＬｙｓ¹⁸−ＧＬＰ−１（７−３７）がある。好ましいＧＬＰ−１同族体はＧＬＰ−１（７−３４）およびＧＬＰ−１（７−３５）であり、これらは米国特許第５，１１８，６６６号（これは引用によって本明細書に包含される）に記載されており、またインスリン分泌特性を有するＧＬＰ−１の生物学的プロセッシング型であるＧＬＰ−１（７−３６）も好ましい。他のＧＬＰ−１同族体は米国特許第５，５４５，６１８号に記載されており、これは引用によって本明細書に包含される。「ＧＬＰ−１誘導体」はＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１同族体のアミノ酸配列を有しているが、そのアミノ酸側鎖の基、α−炭素原子、末端アミノ基または末端カルボン酸基の１つまたはそれ以上に化学的修飾を付加的に有している分子として定義される。化学的修飾には化学部分の付加、新たな結合の創製および化学部分の削除があるが、これらに限定されない。アミノ酸側鎖基の修飾にはリジンε −アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンのＮ−アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化があるが、これらに限定されない。末端アミノの修飾にはデス−アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキルおよびＮ−アシル修飾があるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾にはアミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミドおよび低級アルキルエステル修飾があるが、これらに限定されない。低級アルキルはＣ₁−Ｃ₄アルキルである。さらに、１つまたはそれ以上の側鎖の基または末端の基は通常の知識を有するタンパク質化学者に知られている保護基によって保護されていてもよい。アミノ酸のα−炭素はモノ−またはジ−メチル化されていてもよい。本発明に使用されるＧＬＰ−１同族体または誘導体の好ましい化合物群は式：［式中、Ｒ₁はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２ −アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、およびα−メチル−ヒスチジンの中から選ばれ、ＸはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅおよびα−メチル−Ａｌａの中から選ばれ、ＹはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＧｌｙの中から選ばれ、ＺはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＧｌｙの中から選ばれ、そしてＲ₂はＮＨ₂およびＧｌｙ−ＯＨの中から選ばれる。ただし、該化合物の等電点は約６．０から約９．０であり、また、Ｒ₁がＨｉｓ、ＸがＡｌａ、ＹがＧｌｕおよびＺがＧｌｕの場合、Ｒ₂はＮＨ₂でなければならない。］で示される分子およびその製薬的に許容される塩から構成される。等電点がこの範囲にある多くのＧＬＰ−１同族体および誘導体は既に記載されており、これには例えば、などがある［例えばＷＯ９１／１１４５７号を参照］。本発明に使用される活性化合物の別の好ましい群は、ＷＯ９１／１１４５７号に記載されており、以下に示す修飾群から選ばれる少なくとも１つの修飾を有するＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）もしくはＧＬＰ−１（７−３７）またはそれらのアミド体およびそれらの製薬的に許容される塩から本質的に構成される： (a) ２６位および／または３４位のリジンに代わるグリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニンまたはＤ−リジンへの置換；または３６位のアルギニンに代わるグリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、リジンまたはＤ −アルギニンへの置換； (b) ３１位のトリプトファンに代わる酸化耐性アミノ酸への置換； (c) １６位のバリンからチロシン、１８位のセリンからリジン、２１位のグルタミン酸からアスパラギン酸、２２位のグリシンからセリン、２３位のグルタミンからアルギニン、２４位のアラニンからアルギニンおよび２６位のリジンからグルタミンの中から選ばれる少なくとも１つの置換； (d) ８位のアラニンに代わるグリシン、セリンまたはシステイン；９位のグルタミン酸に代わるアスパラギン酸、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン；１０位のグリシンに代わるセリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン；および１５位のアスパラギン酸に代わるグルタミン酸、の中から選ばれる少なくとも１つの置換；および (e) ７位のヒスチジンに代わるグリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニンまたはＤ−もしくはＮ−アシル化もしくはアルキル化型ヒスチジンへの置換；ここに、(a)、(b)、(d)および(e)の置換では、置換されるアミノ酸はＤ−型であってよく、７位に置換されるアミノ酸はＮ−アシル化またはＮ−アルキル化型であってもよい。ジペプチジル−ペプチダーゼIV酵素（ＤＰＰIV）は投与されたＧＬＰ−１の観察される迅速なインビボ失活に関与し得るので［例えば、Mentlein,R.,ら、 Eur.J．Biochem.,214:829-835(1993)］、このＤＰＰIV活性から保護されるＧＬＰ−１同族体および誘導体を投与するのが好ましく、Ｇｌｙ⁸−ＧＬＰ−１（７ −３６）ＮＨ₂、Ｖａｌ⁸−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、α−メチル−Ａｌａ⁸ −ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ₂、およびＧｌｙ⁸−Ｇｌｎ²¹−ＧＬＰ−１（７− ３７）ＯＨまたはそれらの製薬的に許容される塩を投与するのがより好ましい。米国特許第５，１８８，６６６号（これは引用によって本明細書に明らかに包含される）にて特許請求されている分子を本発明に使用することが好ましい。このような分子は以下のアミノ酸配列：［式中、ＸはＬｙｓおよびＬｙｓ−Ｇｌｙから選ばれる］を有するペプチドおよび該ペプチドの誘導体から構成される群から選ばれ、該ペプチドは該ペプチドの製薬的に許容される酸付加塩、該ペプチドの製薬的に許容されるカルボキシレート塩、該ペプチドの製薬的に許容される低級アルキルエステル、およびアミド体、低級アルキルアミド体および低級ジアルキルアミド体から選ばれる該ペプチドの製薬的に許容されるアミド体の中から選ばれる。本発明に使用される別の好ましい群の化合物は、式：［式中、Ｒ¹は４−イミダゾプロピオニル、４−イミダゾアセチル、または４− イミダゾ−α，α−ジメチルアセチルであり、Ｒ²はＣ₆−Ｃ₁₀非分枝アシルの中から選ばれるか、または不存在であり、Ｒ³はＧｌｙ−ＯＨまたはＮＨ₂であり、ＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである］で示される米国特許第５，５１２，５４９号（これは引用によって本明細書に明らかに包含される）にて特許請求されている化合物およびその製薬的に許容される塩から構成され、これらを本発明に使用することができる。本発明に使用される配列番号４で示されるさらに好ましい化合物はＸａａがＡｒｇであり、Ｒ²がＣ₆−Ｃ₁₀非分枝アシルである化合物である。本発明に使用される配列番号４で示される、よりさらに好ましい化合物はＸａａがＡｒｇであり、Ｒ²がＣ₆−Ｃ₁₀非分枝アシルであり、Ｒ³がＧｌｙ−ＯＨである化合物である。本発明に使用される配列番号４で示される、もっと好ましい化合物はＸａａがＡｒｇであり、Ｒ²がＣ₆−Ｃ₁₀非分枝アシルであり、Ｒ³がＧｌｙ−ＯＨであり、Ｒ¹が４−イミダゾプロピオニルである化合物である。本発明に使用される配列番号４で示される、最も好ましい化合物はＸａａがＡｒｇであり、Ｒ²がＣ₈非分枝アシルであり、Ｒ³がＧｌｙ−ＯＨであり、Ｒ¹が４ −イミダゾプロピオニルである化合物である。米国特許第５，１２０，７１２号（引用によって本明細書に明らかに包含される）に特許請求されている分子を本発明に使用するのがより好ましい。このような分子は以下のアミノ酸配列：を有するペプチドおよび該ペプチドの誘導体から構成される群から選ばれ、該ペプチドは該ペプチドの製薬的に許容される酸付加塩、該ペプチドの製薬的に許容されるカルボキシレート塩、該ペプチドの製薬的に許容される低級アルキルエステル、ならびにアミド体、低級アルキルアミド体および低級ジアルキルアミド体から選ばれる該ペプチドの製薬的に許容されるアミド体の中から選ばれる。本発明ではＧＬＰ−１（７−３６）アミドまたはその製薬的に許容される塩を使用するのが最も好ましい。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドのアミノ酸配列は：である。本発明に使用される活性化合物、即ち本発明に使用されるＧＬＰ−１、ＧＬＰ −１同族体またはＧＬＰ−１誘導体の製造方法は周知であり、また米国特許第５，１１８，６６６号、第５，１２０，７１２号および第５，５２３，５４９号に記載されている（これらは引用によって本明細書に包含される）。本発明にて使用される活性化合物またはその前駆体のアミノ酸部分は、１）固相合成化学、２）天然資源からのＧＬＰ分子の精製または３）組換えＤＮＡ技術のいずれによっても製造される。ポリペプチドの固相化学合成は当業者に周知であり、これはDugas,H.およびPe nney，C.，Bioorganic Chemistry，Springer-Verlag，ニューヨーク(1981)，pp5 4-92、Merrifield，J.M.，Chem.Soc.,85:2149(1962)、およびStewartおよびYoun g，Solid Phase Peptide Synthesis，Freeman，サンフランシスコ(1969)pp.24-6 6などの当業界の一般的教書に見出すことができる。例えば、アミノ酸部分は、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズから供給されている４３０Ａペプチド合成装置（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，Inc. ，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA 94404）および合成サイクルを利用する固相方法によって合成することができる。ＢＯＣ−アミノ酸および他の試薬はＰＥ−アプライド・バイオシステムズおよび他の化学品供給会社から市販されている。Ｃ−末端カルボキサミド類の製造のためには、ダブル・カップル・プロトコールを使用する連続Ｂｏｃ化学を出発ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂に適用する。Ｃ−末端酸の製造には、対応するＰＡＭ樹脂を使用する。Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＡｒｇを、前もって製造したヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを使用してカップリングする。側鎖保護基としては以下のものを使用できる：Ａｒｇ，トシルＡｓｐ，シクロヘキシルＧｌｕ，シクロヘキシルＳｅｒ，ベンジルＴｈｒ，ベンジルＴｙｒ，４−ブロモカルボベンズオキシ。Ｂｏｃ脱保護は塩化メチレン中、トリフルオロ酢酸を用いて行うことができる。合成が完了したなら、１０％メタ−クレゾールを含有する無水フッ化水素（ＨＦ）を用いてペプチドを脱保護し、樹脂から切断する。側鎖保護基の切断および樹脂からのペプチドの切断は−５℃から５℃、好ましくは氷上にて６０分行う。ＨＦを除去した後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄し、ペプチドを氷酢酸で抽出し、凍結乾燥する。組換えＤＮＡ技術における当業者に周知の手法を使用し、本発明に使用される活性化合物を調製できる。実際、組換えＤＮＡ手法は高収率であるため、好ましい。この組換え生産の基本的な工程は以下の工程からなる： a) ＧＬＰ−１分子をコードする天然のＤＮＡ配列を単離するか、またはＧＬＰ−１分子の合成もしくは半合成ＤＮＡコード化配列を構築する、 b) 得られたコード化配列を、単独にまたは融合タンパク質としてタンパク質を発現するのに適した態様で発現ベクターに移入する、 c) この発現ベクターによって適当な真核生物または原核生物宿主細胞を形質転換する、 d) 形質転換した宿主細胞をＧＬＰ−１分子が発現できる条件下に培養する、そして e) 組換え的に産生させたＧＬＰ−１分子を回収し精製する。上述のように、コード化配列は全体として合成してもよく、またはより大きな天然グルカゴンコード化ＤＮＡを修飾した産物であってもよい。プレプログルカゴンをコードするＤＮＡ配列はLundら、Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A.79:345-349 (1982)に記載されており、これは所望の産物が得られるように改変することによって本発明の化合物の半合成生産における出発物質として使用することができる。ＧＬＰ−１分子の生産を導くインビトロまたはインビボ転写および翻訳における合成遺伝子は当業者に周知の手法によって構築できる。遺伝子コードの天然の縮重により、当業者ならば、かなり多いが限定された数の、そのすべてがＧＬＰ −１分子をコードするＤＮＡ配列が構築され得ることは理解されよう。合成遺伝子の構築方法は当業者に周知である。Brownら、(1979)Methods in En zymology，Academic Press，N.Y.，68:109-151を参照。遺伝子コードを使用して所望のアミノ酸配列からＤＮＡ配列を設計するが、これは当業界の生物学者ならば容易に突き止めることができる。設計すれば、配列自体は通常のＤＮＡ合成装置、例えば３８０Ａまたは２８０Ｂモデル合成装置（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA 94404）によって合成できる。本発明に使用される化合物のアミノ酸部分を発現させるため、適当な制限エンドヌクレアーゼを使用することにより、遺伝子操作した合成ＤＮＡ配列を多くの適当な組換えＤＮＡ発現ベクター中に挿入する。概説はManiatisら、(1989)Mole cular Cloning;A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press ，N.Y.，Vol.1-3を参照のこと。制限エンドヌクレアーゼ切断部位は当業者に周知の増幅および発現ベクターから単離し、それに組み込むことができるようにＧＬＰ−１分子コード化ＤＮＡのいずれかの末端となるように操作する。使用する個々のエンドヌクレアーゼは使用する親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンによって変動する。制限部位は、コード化配列が制御配列に対して正しく配向し、それにより目的タンパク質が正しく解読枠内に配置し発現されるように選択する。コード化配列は、タンパク質を発現させようとする宿主細胞内で機能する発現ベクターのプロモーターおよびリボゾーム結合部位に対して正しい解読枠内に位置させなければならない。合成遺伝子が効率的に転写するには、プロモーター−オペレーター領域と作動可能に関連していなければならない。従って、合成遺伝子のプロモーター−オペレーター領域は合成遺伝子のＡＴＧ開始コドンに対して同じ配向で逐次的に置く。原核生物および真核生物細胞を形質転換するに有用な種々の発現ベクターは当業者に周知である。The Promega Biological Research Products Catalogue(199 2)(Promega Corp.，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI，53711-5399)；およびThe Stratagene Cloning Systems Catalogue(1992)(Stratagene Corp.，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA，92037)を参照。さらに、米国特許第４，７１０，４７３号には外来遺伝子を大腸菌において高率に発現させるのに有用な環状ＤＮＡプラスミド形質転換ベクターが開示されている。このプラスミドは組換えＤＮＡ手法の形質転換ベクターとして有用であり、かつ (a) 宿主細胞内での自律的複製能をプラスミドに付与し、 (b) 宿主細胞培養が維持されている温度に相関して自律的プラスミド複製を制御し、 (c) 宿主細胞集合体でのプラスミドの保全性を安定化させ、 (d) 宿主細胞集合体でのプラスミド保全性の指標となるタンパク質産物を合成させ、 (e) プラスミドに固有の一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を提供し、そして (f) ｍＲＮＡ転写を終止させる。この環状ＤＮＡプラスミドは、外来遺伝子を高レベルで発現させるための組換えＤＮＡ手法のベクターとして有用である。本発明に使用される化合物のアミノ酸部分に対する発現ベクターを構築すると、次ぎの工程はそのベクターを適当な細胞内に入れることにより、ポリペプチドを発現するのに有用な組換え宿主細胞を構築することである。組換えＤＮＡベクターで細胞を形質転換する手法は当業者に周知であり、Maniatisら（前掲）などの一般的教書に見出すことができる。作成する宿主細胞は真核生物または原核生物細胞のいずれからでも構築される。原核生物宿主細胞は一般に、タンパク質を比較的高率かつ容易に培養中に産生する。高レベル細菌発現系にて発現されるタンパク質は粒子状または封入体として凝集するのが特徴であり、これは過剰発現タンパク質を高レベルに含む。このようなタンパク質凝集体は当業者に周知の手法により、回収し可溶化し変性し再折りたたみしなければならないのが普通である。Kreuger，ら、(1990)in Protei n Folding，Gierash and King，eds，pg136-142，Amerian Association for the Advancement of Science Publication No．89-18S，Washington,D.C.；および米国特許第４，９２３，９６７号を参照のこと。所望のＧＬＰ−１同族体またはＧＬＰ−１誘導体を調製するには、前駆体ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１同族体アミノ酸配に次ぎの周知の方法によって改変を施す：ＧＬＰ−１前駆体の化学的修飾、酵素的修飾または化学的および酵素的修飾の組み合わせ。伝統的な液相法および半合成法の手法も本発明に使用されるＧＬＰ−１分子の調製に有用である。本発明のＧＬＰ−１分子を調製する方法はペプチド化学の当業者には周知である。当業者に既知の種々の方法のいずれによっても、Ｌｙｓ³⁴のε−アミノ基にアシル基を付加できる。Bioconjugate Chem."Chemical Modifications of Protein s:History and Applications"1,2-12頁(1990)およびHashimotoら、Pharmaceutic al Res．6(2):171-176(1989)。例えば、ホウ酸緩衝液中、５０％アセトニトリルを使用し、オクタン酸のＮ− ヒドロキシ−スクシンイミドエステルをリジル−εアミンに付加することができる。このペプチドはイミダゾール基を加える前または後いずれでもアシル化することができる。さらに、組換え的にペプチドを調製するのであれば、酵素的切断の前にアシル化すればよい。また、ＷＯ９６−２９３４２号（引用によって本明細書に包含される）に教示されているようにＧＬＰ−１誘導体のリジンをアシル化できる。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド分子およびＧＬＰ−１（７−３７）分子における保護された、保護されていないおよび部分的に保護された天然のおよび非天然の多くの機能的な同族体および誘導体の存在および調製は当業界の文献に記載されている［例えば、米国特許第５，１２０，７１２号および第５，１１８，６６６号（これらは引用によって本明細書に包含される）、およびOrskov,C.,ら、J. Biol.Chem.,264(22):12826-12829(1989)およびＷＯ９１／１１４５７号（Buckle y,D.I.,ら、1991年8月8日発行）を参照のこと］。要すれば、ＧＬＰ−１誘導体のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸残基は保護してもよく、あるいはいずれか一方を保護してもよい。このような保護基を形成し除去するための反応は標準的な文献、例えば"Protective Groups in Organi c Chemistry",Plenum Press，ロンドンおよびニューヨーク(1973)；Green,T.H., "Protective Groups in Organic Synthesis"，Whiley,ニューヨーク(1981)；および"The Peptides",Vol.I，Schroder and Lubke，Academic Press London and New York(1965)などに記載されている。代表的なアミノ保護基には例えば、ホルミル、アセチル、イソプロピル、ブトキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、カルボベンジルオキシなどがある。代表的なカルボキシ保護基には例えば、ベンジルエステル、メチルエステル、エチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステルなどがある。本発明に使用されるカルボキシ末端における低級アルキルエステルのＧＬＰ− １誘導体は、塩酸などの触媒酸の存在下、所望の（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノールを所望のポリペプチドと反応させることによって調製される。このようなアルキルエステル形成のための適当な条件は反応温度約５０℃、約１時間から約３時間の反応時間である。同様に、Ａｓｐおよび／またはＧｌｕ残基のアルキルエステル誘導体を形成できる。本発明に使用される化合物のカルボキサミド誘導体の調製は例えばStewart，J .M.,ら、Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Company Press，19 84に記載されているようにして行う。本発明では、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体またはＧＬＰ−１誘導体の製薬的に許容される塩形態を使用できる。酸付加塩を形成するために普通に使用される酸は塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、およびｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸である。このような塩の例には硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、燐酸塩、一水素燐酸塩、二水素燐酸塩、メタ燐酸塩、ピロ燐酸塩、塩化物、臭素化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバカン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジ酸塩、ヘキシン−１，６−ジ酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、その他の塩を包含する。好ましい酸付加塩は塩酸および臭酸などの鉱酸、特に塩酸から形成される塩である。塩基付加塩には、アンモニウムまたは水酸化、炭酸、重炭酸アルカリもしくはアルカリ土類金属、などの無機塩基から誘導されるものが包含される。本発明の塩の製造に有用な塩基には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどがある。塩形態は特に好ましい。本発明に使用されるＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体またはＧＬＰ−１誘導体は本発明使用前に１つまたはそれ以上の賦形剤とともに製剤化することができる。例えば、本発明に使用される活性化合物は周知の方法によって２価金属カチオンと錯体化することができる。このような金属カチオンには例えば、Ｚｎ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺ 、Ｆｅ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺、Ｃｄ⁺⁺、Ｎｉ⁺⁺などがある。本発明に使用される活性化合物は要すれば、製薬的に許容される緩衝液と一緒にすることができ、許容される安定性を付与するようｐＨを調整でき、また非経口投与に適したｐＨとすることができる。１つまたはそれ以上の製薬的に許容される塩を加えてイオン強度または張性を調節できる。１つまたはそれ以上の賦形剤を加えて、さらに製剤の等張性を調節できる。グリセリンは等張性調節賦形剤の例である。投与は医師が有効であると認識しているあらゆる経路によって行われる。非経口投与が好ましい。非経口投与は医学文献では、滅菌シリンジまたは他の何らかの器械的装置例えば注入ポンプなどによって身体に投与剤形を注射するものとして普通は理解される。非経口投与には静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄内、くも膜下内、脳室内、動脈内、くも膜下、および硬膜外などがある。静脈内、筋肉内および皮下投与経路は本発明使用化合物にとってより好ましい。静脈内および皮下経路が本発明使用化合物にとってさらにより好ましい。非経口投与では、本発明に使用する活性化合物は適当なｐＨで蒸留水と一緒にする。また、別の製薬方法によって作用時間を制御できる。放出制御調製は、本発明に使用する活性化合物を複合化または吸収できるポリマーを使用することによって行うことができる。延長された期間は、適当な巨大分子、例えばポリエステル類、ポリアミノ酸類、ポリビニルピロリドン、エチレンビニル・アセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミンを選択し、および巨大分子の濃度および組込み方法を選択し、放出を長期化させることによって達成される。活性の長期化を図るための可能性ある別の方法は、本発明に使用する活性化合物をポリエステル類、ポリアミノ酸類、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテート共重合体などの重合体物質の粒子中に組込むことである。あるいは、これら重合体粒子に化合物を組込む代わりに、本発明に使用する化合物をマイクロカプセルに封入することも可能であり、このマイクロカプセルは例えば、コアセルベーション法または界面重合化によって調製され、それは例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルであり、あるいは該化合物をコロイド状薬物供給システム、例えばリポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル、またはマイクロエマルジョン中に封入することも可能である。このような手法はRemington's Pharmaceutical Sciences(1980)に記載されている。「心筋梗塞」の診断は医師の判断事項であり、通常は以下に示す徴候および指標のうち少なくとも２つの検知に依存して行われる：１）少なくとも１５分間の胸痛；２）症状発現の１０−１６時間後における正常範囲を少なくとも２標準偏差超えた血清クレアチニンキナーゼおよび血清クレアチニンキナーゼＢの少なくとも２つの値；３）症状発現後の４８−７２時間以内における正常範囲を少なくとも２標準偏差超えた２またはそれ以上の乳酸脱水素酵素の血清レベル；および４）少なくとも２回の１２標準的ＥＣＧ誘導におけるＴ波反転後の新たなＱ波および／または初期ＳＴ上昇の発現。心筋梗塞の急性期は上記徴候または指標が発現して最初の７２時間の間に起こる。本発明が目的とする処置は心筋梗塞の急性期、即ち急性心筋梗塞において行う。本発明に使用される化合物が必要とされる患者は心筋梗塞の急性期にあり、かつ血糖を自律的に調節できない患者である。患者が血糖を自律的に調節できないとは、患者が以下の状態の場合である：１）National Diabetes Data Group［Diagetes，28:1039-1057(1979)］の定義により、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）またはインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）と過去に診断されたことのある患者；２）過去に糖尿病と診断されていなくても、血糖値が１１ｍｍｏｌ／リットルである患者；または３）異常なグルコース耐性である患者。患者の血糖値を正常化するのに有効なＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体またはＧＬＰ−１誘導体の投与量は、多くの因子、例えば患者の性別、体重および年齢、血糖調節能の欠如の程度、血糖調節能の欠如の原因、グルコースもしくは他の炭水化物供給源を同時に投与するか否か、投与経路およびバイオアベイラビリティー、身体の持久力、製剤、投与化合物の活性強度によって左右されるが、これらに限定されない。投与を連続的に行う場合、適当な投与速度は０．２５から６ｐｍｏｌ／ｋｇ体重／分、好ましくは約０．５から約１．２ｐｍｏｌ／ｋｇ／分である。間欠的に投与する場合、１回の投与における投与量は投与の間隔、ＧＬＰ −１、ＧＬＰ−１同族体またはＧＬＰ−１誘導体のバイオアベイラビリティー、正常血糖を与えるに必要なレベルを考慮すべきである。所望の臨床効果を得るためのＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体またはＧＬＰ−１誘導体の投与量および投与速度は通常の医師によって決定される。本発明をより平易にするため、特定の実施例を以下に記載するが、これらは本発明の例示であって限定するものでない。実施例１インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者５人に対し、夜間に１０時間ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを皮下注入した。対照として、同じ５人の患者に対し、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを注入した日とは別の日にインスリンを連続注入した。インスリン注入の速度は２時間毎に調節して最適な制御を行い、低血糖とならないようにした。表１および図１のデータに示されるように、ＧＬＰ− １（７−３６）アミドの皮下注入は、いずれの患者においても低血糖を誘発させることなく血糖を殆ど正常化した。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドによる代謝制御はインスリンにより達成されるものよりも良好であり、２３：００、０：００および１：００時点における平均血糖値はＧＬＰ−１（７−３６）アミド処置のほうが対照よりも統計的に有意な程度低かった。表１夜間に１０時間ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを連続注入した５人のＮＩＤＤＭ患者における平均血糖値。異なる日に同じ患者を用いて試験した対照では、インスリンを連続注入により投与した。実施例２朝食時、昼食時およびタ食時に３時間、５人のＮＩＤＤＭ患者に日中、ＧＬＰ −１（７−３６）アミドを注入した。注入時間は図２に示しているように、７：３０−１０：３０（朝食時）、１０：３０−１：３０（昼食時）、および４：３０−７：３０（タ食時）であった。別の日に行う同じ５人のＮＩＤＤＭ患者での対照実験では、図２に示しているように食事の直前にインスリンを皮下注射した。ＧＬＰ−１を注入する間は、インスリン注入により観察される食後グルコースの偏奇運動を排除し、正常血糖値を維持させた。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの各注入の終了直後には、血糖値が有意に増大した。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの不適当な副作用は観察されなかった。これらのデータは、ＧＬＰ−１（７− ３６）アミド注入がインスリン注射よりも食後グルコースレベルをより有効に制御し、この制御がＧＬＰ−１（７−３６）アミド注入を続けている限り有効であることを示している。表２各食事の開始から始めて３時間ＧＬＰ−１（７−３６）アミドを注入した５人のＮＩＤＤＭ患者の平均血糖値。同じ患者を用いて別の日に行う対照実験では、各食事の直前にインスリンを皮下注射して投与した。食事は７：３０、１０：３０および４：３０に開始した。

【手続補正書】【提出日】平成１１年４月１日（１９９９．４．１）【補正内容】請求の範囲１．心筋梗塞後の死亡率および罹患率を減少させる医薬組成物であって、血糖を正常化するに有効な量のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体、ＧＬＰ−１誘導体およびそれらの製薬的に許容される塩の中から選ばれる化合物を含有する医薬組成物。２．静脈内投与するための請求項１記載の組成物。３．皮下投与するための請求項１記載の組成物。４．連続して投与するための請求項２または３記載の組成物。５．０．２５から６ｐｍｏｌ／ｋｇ／分の速度で投与する、請求項４記載の組成物。６．０．５から２．４ｐｍｏｌ／ｋｇ／分の速度で投与する、請求項５記載の組成物。７．該速度が約０．５から約１．２ｐｍｏｌ／ｋｇ／分である、請求項５記載の組成物。８．間欠的に静脈内に投与するための請求項２記載の組成物。９．ＧＬＰ（７−３６）アミドまたはその製薬的に許容される塩を含有する、請求項１記載の組成物。１０．心筋梗塞後の罹患率および死亡率を減少させるための組成物であって、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体およびＧＬＰ−１誘導体がそのインスリン分泌活性を示す際に相互作用するレセプターまたはレセプター群と同じものと相互作用することによってインスリン分泌活性を示す化合物を含有する組成物。１１．心筋梗塞後の罹患率および死亡率を減少させるための組成物であって、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体およびＧＬＰ−１誘導体が相互作用してインスリン感受性を増大させるレセプターまたはレセプター群と同じものと相互作用することによってインスリン感受性を増大させる化合物を含有する組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．心筋梗塞後の死亡率および罹患率を減少させる方法であって、それを必要としている患者に、血糖を正常化するに有効な量のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体、ＧＬＰ−１誘導体およびそれらの製薬的に許容される塩の中から選ばれる化合物を投与することを特徴とする方法。２．化合物を静脈内投与する、請求項１記載の方法。３．化合物を皮下投与する、請求項１記載の方法。４．投与が連続的である、請求項２または３記載の方法。５．化合物の投与速度が０．２５から６ｐｍｏｌ／ｋｇ／分である、請求項４記載の方法。６．化合物の投与速度が０．５から２．４ｐｍｏｌ／ｋｇ／分である、請求項５記載の方法。７．該速度が約０．５から約１．２ｐｍｏｌ／ｋｇ／分である、請求項５記載の方法。８．静脈内投与が間欠的である、請求項２記載の方法。９．化合物を静脈内投与し、さらに他の非経口的経路によっても投与する、請求項２記載の方法。１０．他の非経口的経路が皮下経路である、請求項９記載の方法。１１．投与する化合物がＧＬＰ（７−３６）アミドまたはその製薬的に許容される塩である、請求項１記載の方法。１２．心筋梗塞後の罹患率および死亡率を減少させるための方法であって、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体およびＧＬＰ−１誘導体がそのインスリン分泌活性を示す際に相互作用するレセプターまたはレセプター群と同じものと相互作用することによってインスリン分泌活性を示す化合物を投与することを特徴とする方法。１３．心筋梗塞後の罹患率および死亡率を減少させるための方法であって、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１同族体およびＧＬＰ−１誘導体が相互作用してインスリン感受性を増大させるレセプターまたはレセプター群と同じものと相互作用することによってインスリン感受性を増大させる化合物を投与することを特徴とする方法。