JP2001178480A - コリネバクテリウムグルタミクムからのプラスミドおよびその使用 - Google Patents
コリネバクテリウムグルタミクムからのプラスミドおよびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 アミノ酸、ビタミン及びヌクレオチドを産生
するコリネ型細菌のための改善された特性を有するプラ
スミドベクターを構築するために適当な新規のプラスミ
ドの提供。 【解決手段】 コリネバクテリウムグルタミクムの株か
ら単離された互いに和合性の新規のプラスミドｐＴＥＴ
３及びｐＣＲＹ４を使用する。
するコリネ型細菌のための改善された特性を有するプラ
スミドベクターを構築するために適当な新規のプラスミ
ドの提供。 【解決手段】 コリネバクテリウムグルタミクムの株か
ら単離された互いに和合性の新規のプラスミドｐＴＥＴ
３及びｐＣＲＹ４を使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規プラスミドｐ
ＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４ならびにベクタープラスミド
の製造のためのその使用に関する。
ＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４ならびにベクタープラスミド
の製造のためのその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】天然産生プラスミドおよびそれから得ら
れるプラスミドベクターはコリネ型細菌の生産特性の改
善に必要不可欠である。工業的に重要な前記の群の細菌
に関するプラスミドベクターの構築は、実質的にコリネ
バクテリアまたはブレビバクテリア（ＵＳ−Ａ５１５８
８９１号およびＵＳ−Ａ４５００６４０号）において機
能できる適当な選択マーカーを提供する潜在プラスミド
（cryptic plasmid）をベースとする。これらのプラス
ミドベクターは、Ｌ−アミノ酸、ビタミンまたはヌクレ
オチドの製造に関連する遺伝子のクローニングおよび増
幅のために使用することができる。これらの特定の遺伝
子の発現は所望の物質の生産にポジティブな影響を及ぼ
すことができる。このように、例えばリジンエクスポー
ター（lysine exporter）に関するタンパク質をコード
するＤＮＡ断片のクローニングはコリネバクテリウム
グルタミクム株ＭＨ２０−２２Ｂ（ＤＥ−Ａ１９５４２
２２号）によるＬ−リジンの発酵的生産の改善をもたら
した。
れるプラスミドベクターはコリネ型細菌の生産特性の改
善に必要不可欠である。工業的に重要な前記の群の細菌
に関するプラスミドベクターの構築は、実質的にコリネ
バクテリアまたはブレビバクテリア（ＵＳ−Ａ５１５８
８９１号およびＵＳ−Ａ４５００６４０号）において機
能できる適当な選択マーカーを提供する潜在プラスミド
（cryptic plasmid）をベースとする。これらのプラス
ミドベクターは、Ｌ−アミノ酸、ビタミンまたはヌクレ
オチドの製造に関連する遺伝子のクローニングおよび増
幅のために使用することができる。これらの特定の遺伝
子の発現は所望の物質の生産にポジティブな影響を及ぼ
すことができる。このように、例えばリジンエクスポー
ター（lysine exporter）に関するタンパク質をコード
するＤＮＡ断片のクローニングはコリネバクテリウム
グルタミクム株ＭＨ２０−２２Ｂ（ＤＥ−Ａ１９５４２
２２号）によるＬ−リジンの発酵的生産の改善をもたら
した。
【０００３】公知かつ同時に工業的に重要な細菌である
エシェリキア コリに対して、コリネバクテリアおよび
ブレビバクテリアに関しては限られた数の天然プラスミ
ドおよび適当な選択マーカーがクローニングベクターお
よび発現ベクターの開発のために使用できるにすぎな
い。異なる名称で知られている多くのプラスミドはその
遺伝的機構のより詳細な分析によって同一であると判明
している。これらのプラスミド単離物はこうして２つの
グループに分類されている（Sonnen et al., Gene 107,
69-74 (1991)）。
エシェリキア コリに対して、コリネバクテリアおよび
ブレビバクテリアに関しては限られた数の天然プラスミ
ドおよび適当な選択マーカーがクローニングベクターお
よび発現ベクターの開発のために使用できるにすぎな
い。異なる名称で知られている多くのプラスミドはその
遺伝的機構のより詳細な分析によって同一であると判明
している。これらのプラスミド単離物はこうして２つの
グループに分類されている（Sonnen et al., Gene 107,
69-74 (1991)）。
【０００４】ｐＢＬ１グループはコリネバクテリウム
グルタミクムＡＪ１１５６０からのプラスミドｐＡＭ２
８６（ＥＰ−Ａ００９３６１１号）、ブレビバクテリウ
ムラクトフェルメンツムＡＴＣＣ１３８６９からのｐＡ
Ｍ３３０（Miwa et al., Agricultural and Biological
Chemistry 48, 2901-2903 (1984)）、ブレビバクテリ
ウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ２１０８６からの
ｐＸ１８（Yeh et al, Gene 47, 301-308 (1986)）およ
びブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ
２１７９８からのｐＢＬ１（Santamaria et al., Journ
al of GeneralMicrobiology 130, 2237-2246 (1984)）
を含む。
グルタミクムＡＪ１１５６０からのプラスミドｐＡＭ２
８６（ＥＰ−Ａ００９３６１１号）、ブレビバクテリウ
ムラクトフェルメンツムＡＴＣＣ１３８６９からのｐＡ
Ｍ３３０（Miwa et al., Agricultural and Biological
Chemistry 48, 2901-2903 (1984)）、ブレビバクテリ
ウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ２１０８６からの
ｐＸ１８（Yeh et al, Gene 47, 301-308 (1986)）およ
びブレビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ
２１７９８からのｐＢＬ１（Santamaria et al., Journ
al of GeneralMicrobiology 130, 2237-2246 (1984)）
を含む。
【０００５】ｐＨＭ１５１９グループはコリネバクテリ
ウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８０８からのｐＣＧ１
（ＵＳ−Ａ４６１７２６７号）、コリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８からのｐＨＭ１５１９
（Miwa et al., Agricultural and Biological Chemist
ry 48, 2901-2903 (1984)）、コリネバクテリウム グル
タミクムＡＴＣＣ１９２２３からのｐＳＲ１（Yoshiham
a et al., Journal ofBacteriology 162, 591-597 (198
5)）およびコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ
３９２６９からのｐＲＮ３．１（ＵＳ−Ａ４５５９３０
８号）を含む。
ウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８０８からのｐＣＧ１
（ＵＳ−Ａ４６１７２６７号）、コリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８からのｐＨＭ１５１９
（Miwa et al., Agricultural and Biological Chemist
ry 48, 2901-2903 (1984)）、コリネバクテリウム グル
タミクムＡＴＣＣ１９２２３からのｐＳＲ１（Yoshiham
a et al., Journal ofBacteriology 162, 591-597 (198
5)）およびコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ
３９２６９からのｐＲＮ３．１（ＵＳ−Ａ４５５９３０
８号）を含む。
【０００６】前記の２つのグループのプラスミドのメン
バーの他に、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ
３１８３２からの潜在プラスミドｐＣＧ２（ＵＳ−Ａ４
４８９１６０号）およびコリネバクテリウム メラッセ
コラ２２２２０からのｐＡＧ３（ＵＳ−Ａ５１５８８９
１号）も単離されている。
バーの他に、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ
３１８３２からの潜在プラスミドｐＣＧ２（ＵＳ−Ａ４
４８９１６０号）およびコリネバクテリウム メラッセ
コラ２２２２０からのｐＡＧ３（ＵＳ−Ａ５１５８８９
１号）も単離されている。
【０００７】以前から使用できていた単なる選択系は、
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３０
からのストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性プ
ラスミドｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ４４８９１６０号）および
コリネバクテリウム メラッセコラ２２２４３からのテ
トラサイクリン耐性プラスミドｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ５１
５８８９１号）において同定された２種の抗生物質耐性
マーカーである。またプラスミドｐＣＧ４はサルファメ
トキサゾール耐性を付与するｓｕｌＩ遺伝子を有し、該
遺伝子の配列はネスベラ他（Nesvera et al）によって
決定された（FEMS Microbiology Letters 169, 391-395
(1998)）。
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３０
からのストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性プ
ラスミドｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ４４８９１６０号）および
コリネバクテリウム メラッセコラ２２２４３からのテ
トラサイクリン耐性プラスミドｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ５１
５８８９１号）において同定された２種の抗生物質耐性
マーカーである。またプラスミドｐＣＧ４はサルファメ
トキサゾール耐性を付与するｓｕｌＩ遺伝子を有し、該
遺伝子の配列はネスベラ他（Nesvera et al）によって
決定された（FEMS Microbiology Letters 169, 391-395
(1998)）。
【０００８】アミノ酸、ビタミンまたはヌクレオチドを
産生する株を迅速に調査しかつ改善するべきであれば、
互いに和合性であり十分に安定なプラスミドベクターを
有することが重要である。
産生する株を迅速に調査しかつ改善するべきであれば、
互いに和合性であり十分に安定なプラスミドベクターを
有することが重要である。
【０００９】ｐＨＭ１５１９プラスミド誘導体およびｐ
ＢＬ１プラスミド誘導体が共存しうることは先行技術か
ら公知である。更にＵＳ−Ａ５１７５１０８号に記載さ
れるプラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２が和合性である
ことは公知である。
ＢＬ１プラスミド誘導体が共存しうることは先行技術か
ら公知である。更にＵＳ−Ａ５１７５１０８号に記載さ
れるプラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２が和合性である
ことは公知である。
【００１０】考慮中の遺伝子の発現の段階分けを可能に
するような高いコピー数、中程度のコピー数または低い
コピー数を有するプラスミドベクターもまた重要であ
る。最も知られたプラスミドは高いコピー数を有してい
る。ＵＳ−Ａ５１７５１０８号に記載されるプラスミド
ｐＧＡ２のみが低いコピー数を有することが知られてい
る。
するような高いコピー数、中程度のコピー数または低い
コピー数を有するプラスミドベクターもまた重要であ
る。最も知られたプラスミドは高いコピー数を有してい
る。ＵＳ−Ａ５１７５１０８号に記載されるプラスミド
ｐＧＡ２のみが低いコピー数を有することが知られてい
る。
【００１１】広範に使用されるプラスミドベクターは
Ｃ．グルタミクム種から由来する成分および別の細菌
種、一般にＥ．コリからの成分で構成される。該方法は
外来ＤＮＡをＣ．グルタミクム中に導入する。外因性Ｄ
ＮＡのみを有し、こうして自己クローニングの基準を満
たす段階分けされたコピー数を有する機能的プラスミド
ベクターは専門家に知られている。
Ｃ．グルタミクム種から由来する成分および別の細菌
種、一般にＥ．コリからの成分で構成される。該方法は
外来ＤＮＡをＣ．グルタミクム中に導入する。外因性Ｄ
ＮＡのみを有し、こうして自己クローニングの基準を満
たす段階分けされたコピー数を有する機能的プラスミド
ベクターは専門家に知られている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、アミ
ノ酸、ビタミンおよびヌクレオチドを産生するコリネ型
細菌のための改善された特性を有するプラスミドベクタ
ーを構築するために適当な新規のプラスミドを提供する
ことである。
ノ酸、ビタミンおよびヌクレオチドを産生するコリネ型
細菌のための改善された特性を有するプラスミドベクタ
ーを構築するために適当な新規のプラスミドを提供する
ことである。
【００１３】アミノ酸、ビタミンおよびヌクレオチドは
動物の栄養、食品工業、医薬品工業ならびにヒトの医学
において使用される。これらの物質はコリネ型細菌の株
を使用して製造される。生産特性はプラスミドベクター
によって適当な遺伝子を増幅することによって改善され
る。従って改善された特性を有する新規のプラスミドベ
クターを提供することにおいて関心が持たれている。
動物の栄養、食品工業、医薬品工業ならびにヒトの医学
において使用される。これらの物質はコリネ型細菌の株
を使用して製造される。生産特性はプラスミドベクター
によって適当な遺伝子を増幅することによって改善され
る。従って改善された特性を有する新規のプラスミドベ
クターを提供することにおいて関心が持たれている。
【００１４】本発明は、ＤＳＭに番号５８１６で寄託さ
れているコリネバクテリウム グルタミクムから単離さ
れた相互に和合性のプラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲ
Ｙ４を提供し、その際、 １．１ プラスミドｐＴＥＴ３は約２７．８ｋｂｐの長
さおよび図１に示される制限地図、ならびに抗生物質耐
性領域を特徴とし、 １．２ プラスミドｐＣＲＹ４は約４８ｋｂｐの長さお
よび図２に示される制限地図を特徴としている。
れているコリネバクテリウム グルタミクムから単離さ
れた相互に和合性のプラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲ
Ｙ４を提供し、その際、 １．１ プラスミドｐＴＥＴ３は約２７．８ｋｂｐの長
さおよび図１に示される制限地図、ならびに抗生物質耐
性領域を特徴とし、 １．２ プラスミドｐＣＲＹ４は約４８ｋｂｐの長さお
よび図２に示される制限地図を特徴としている。
【００１５】また本発明は、コリネ型細菌における自己
複製を可能にするｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４の複合プ
ラスミド（composite plasmid）を提供し、その際、前
記プラスミドは ２．１ 一部または全体のヌクレオチド配列、 ２．２ プラスミドｐＴＥＴ３またはｐＣＲＹ４の１つ
から得られる少なくとも１つのＤＮＡ複製領域、 ２．３ 場合によりＥ．コリ、Ｂ．サチリスまたはスト
レプトマイセスにおいて増えることができるプラスミド
から得られる遺伝子断片、 ２．４ 有利にはプラスミドｐＴＥＴ３からの作用物質
耐性の発現のための少なくとも１つの領域を有する。
複製を可能にするｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４の複合プ
ラスミド（composite plasmid）を提供し、その際、前
記プラスミドは ２．１ 一部または全体のヌクレオチド配列、 ２．２ プラスミドｐＴＥＴ３またはｐＣＲＹ４の１つ
から得られる少なくとも１つのＤＮＡ複製領域、 ２．３ 場合によりＥ．コリ、Ｂ．サチリスまたはスト
レプトマイセスにおいて増えることができるプラスミド
から得られる遺伝子断片、 ２．４ 有利にはプラスミドｐＴＥＴ３からの作用物質
耐性の発現のための少なくとも１つの領域を有する。
【００１６】また本発明は、本発明による新規のプラス
ミドからの少なくとも全てまたは一部の作用物質耐性な
らびにｐＧＡ１および／またはｐＧＡ２を有する複合プ
ラスミドを提供する。
ミドからの少なくとも全てまたは一部の作用物質耐性な
らびにｐＧＡ１および／またはｐＧＡ２を有する複合プ
ラスミドを提供する。
【００１７】新規のプラスミドｐＴＥＴ３（その制限地
図は図１に示されている）は、 １． 配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する
複製領域および ２． 配列番号６に示される、テトラサイクリン耐性を
付与するｔｅｔＡ遺伝子およびストレプトマイシンおよ
びスペクチノマイシンの耐性を付与するａａｄＡ遺伝子
からなる抗生物質耐性領域を有する。
図は図１に示されている）は、 １． 配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する
複製領域および ２． 配列番号６に示される、テトラサイクリン耐性を
付与するｔｅｔＡ遺伝子およびストレプトマイシンおよ
びスペクチノマイシンの耐性を付与するａａｄＡ遺伝子
からなる抗生物質耐性領域を有する。
【００１８】新規のプラスミドｐＣＲＹ４（その制限地
図は図２に示されている）は配列番号４に示されるヌク
レオチド配列を有する複製領域を有する。
図は図２に示されている）は配列番号４に示されるヌク
レオチド配列を有する複製領域を有する。
【００１９】また本発明はｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４
ならびに場合によりｐＧＡ１またはｐＧＡ２ヌクレオチ
ド配列を有するプラスミドベクター（複合プラスミド）
を使用するアミノ酸、ビタミンおよびヌクレオチドの製
造方法を提供する。
ならびに場合によりｐＧＡ１またはｐＧＡ２ヌクレオチ
ド配列を有するプラスミドベクター（複合プラスミド）
を使用するアミノ酸、ビタミンおよびヌクレオチドの製
造方法を提供する。
【００２０】ＥＰ−Ｂ０４７２８６９号においてＤＳＭ
５８１６として寄託されたコリネバクテリウム グルタ
ミクムＬＰ−６は、そこに記載されるプラスミドｐＧＡ
１およびｐＧＡ２の他に新規のプラスミドｐＴＥＴ３お
よびｐＣＲＹ４を有する。ＤＳＭ５８１６に関する保管
期間はブタペスト条約の規則９．１に準じて延長されて
いる。
５８１６として寄託されたコリネバクテリウム グルタ
ミクムＬＰ−６は、そこに記載されるプラスミドｐＧＡ
１およびｐＧＡ２の他に新規のプラスミドｐＴＥＴ３お
よびｐＣＲＹ４を有する。ＤＳＭ５８１６に関する保管
期間はブタペスト条約の規則９．１に準じて延長されて
いる。
【００２１】プラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４は
慣用の培地、例えば脳−心臓ブイヨン（brain-heart bo
uillon）またはルリア−ベルタニ培地中で株ＬＰ−６を
培養することによって製造される。細胞を遠心分離によ
って回収し、リゾチームで処理し、アルカリリシス法
（alkaline lysis method）によって消化する。次いで
ＤＮＡをシリカゲル粒子上でのアニオン交換クロマトグ
ラフィーによって精製し、エタノールまたはイソプロパ
ノールによって沈殿させ、次いでＨ2Ｏ中に再懸濁す
る。プラスミドＤＮＡの単離のための完全な系は“キッ
ト”として市販されている。かかるキットの一例は、ク
ロンテック ラボラトリーズＧｍｂＨ（Clontech Labora
tories）からの“ヌクレオボンド プラスミド キット
（NucleoBond Plasmid Kit）”である。当業者は、該キ
ットの使用に関する詳細な教示をクロンテック ラボラ
トリーズＧｍｂＨ（ハイデルベルク、ドイツ、１９９
７）からのマニュアル“ヌクレオボンド核酸精製キット
およびカートリッジ、ユーザーマニュアル（ＰＴ３１６
７−１）（Nucleobond Nucleic Acid Purification Kit
s and Cartridges, User Manual）”において見いだす
ことができる。プラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４
は、アガロースゲル電気泳動によって前記のように得ら
れた全プラスミドＤＮＡを分離し、かつエチジウムブロ
ミドで染色することによってプラスミドバンドとして現
れる。プラスミドｐＴＥＴ３からのＤＮＡおよびプラス
ミドｐＣＲＹ４からのＤＮＡを次いでアガロースゲルか
ら単離してよい。この目的のためにプラスミドＤＮＡを
含有するアガロースゲルをカオトロピック試薬と混合
し、得られた溶液中に存在するプラスミドＤＮＡをガラ
ス表面またはシリカゲル粒子上に結合させ、次いでこの
基材から溶出させる。当業者はこの方法に関する詳細な
教示をキアゲンＧｍｂＨ（ヒルデン、ドイツ、１９９
７）からのマニュアル“アガロースゲルからのＤＮＡ抽
出のためのＱＩＡＥＸＩＩハンドブック（QIAEX II Han
dbook for DNA Extraction from Agarose Gels）”にお
いて見いだすことができる。前記のように純粋な形でｐ
ＴＥＴ３のＤＮＡおよびｐＣＲＹ４のＤＮＡを製造する
ことができる。
慣用の培地、例えば脳−心臓ブイヨン（brain-heart bo
uillon）またはルリア−ベルタニ培地中で株ＬＰ−６を
培養することによって製造される。細胞を遠心分離によ
って回収し、リゾチームで処理し、アルカリリシス法
（alkaline lysis method）によって消化する。次いで
ＤＮＡをシリカゲル粒子上でのアニオン交換クロマトグ
ラフィーによって精製し、エタノールまたはイソプロパ
ノールによって沈殿させ、次いでＨ2Ｏ中に再懸濁す
る。プラスミドＤＮＡの単離のための完全な系は“キッ
ト”として市販されている。かかるキットの一例は、ク
ロンテック ラボラトリーズＧｍｂＨ（Clontech Labora
tories）からの“ヌクレオボンド プラスミド キット
（NucleoBond Plasmid Kit）”である。当業者は、該キ
ットの使用に関する詳細な教示をクロンテック ラボラ
トリーズＧｍｂＨ（ハイデルベルク、ドイツ、１９９
７）からのマニュアル“ヌクレオボンド核酸精製キット
およびカートリッジ、ユーザーマニュアル（ＰＴ３１６
７−１）（Nucleobond Nucleic Acid Purification Kit
s and Cartridges, User Manual）”において見いだす
ことができる。プラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４
は、アガロースゲル電気泳動によって前記のように得ら
れた全プラスミドＤＮＡを分離し、かつエチジウムブロ
ミドで染色することによってプラスミドバンドとして現
れる。プラスミドｐＴＥＴ３からのＤＮＡおよびプラス
ミドｐＣＲＹ４からのＤＮＡを次いでアガロースゲルか
ら単離してよい。この目的のためにプラスミドＤＮＡを
含有するアガロースゲルをカオトロピック試薬と混合
し、得られた溶液中に存在するプラスミドＤＮＡをガラ
ス表面またはシリカゲル粒子上に結合させ、次いでこの
基材から溶出させる。当業者はこの方法に関する詳細な
教示をキアゲンＧｍｂＨ（ヒルデン、ドイツ、１９９
７）からのマニュアル“アガロースゲルからのＤＮＡ抽
出のためのＱＩＡＥＸＩＩハンドブック（QIAEX II Han
dbook for DNA Extraction from Agarose Gels）”にお
いて見いだすことができる。前記のように純粋な形でｐ
ＴＥＴ３のＤＮＡおよびｐＣＲＹ４のＤＮＡを製造する
ことができる。
【００２２】調査されるべきプラスミドのＤＮＡを制限
酵素で個々にか、または組み合わせてロベルツ他（Robe
rts et al）（Nucleic Acids Research 27, 312-313 (1
999)）によって記載されるように処理する。得られたＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、制
限部位を割り当てる。当業者はこの点における教示を、
例えばロドリゲスおよびタイト（Rodriguez and Tait）
の“組み換えＤＮＡ技術：イントロダクション”（Addi
son-Wesley Publishing Company, London, 1983）また
はベルガーおよびキンメル（Berger and Kimmel）編集
の“分子クローニング技術へのガイド（Guide to Molec
ular Cloning Techniques）”（Methods in Enzymolog
y, Vol. 152, Academic Press, London, 1987）におい
て見いだすことができる。前記のようにプラスミドの長
さを決定できるか、または制限地図をプロットできる。
プラスミドｐＴＥＴ３は約２７．８ｋｂｐの長さを有
し、これは図１に示されている。プラスミドｐＣＲＹ４
は約４８ｋｂｐの長さを有し、これは図２に示されてい
る。
酵素で個々にか、または組み合わせてロベルツ他（Robe
rts et al）（Nucleic Acids Research 27, 312-313 (1
999)）によって記載されるように処理する。得られたＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、制
限部位を割り当てる。当業者はこの点における教示を、
例えばロドリゲスおよびタイト（Rodriguez and Tait）
の“組み換えＤＮＡ技術：イントロダクション”（Addi
son-Wesley Publishing Company, London, 1983）また
はベルガーおよびキンメル（Berger and Kimmel）編集
の“分子クローニング技術へのガイド（Guide to Molec
ular Cloning Techniques）”（Methods in Enzymolog
y, Vol. 152, Academic Press, London, 1987）におい
て見いだすことができる。前記のようにプラスミドの長
さを決定できるか、または制限地図をプロットできる。
プラスミドｐＴＥＴ３は約２７．８ｋｂｐの長さを有
し、これは図１に示されている。プラスミドｐＣＲＹ４
は約４８ｋｂｐの長さを有し、これは図２に示されてい
る。
【００２３】プラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４は
中程度または低いコピー数を有している。この特性によ
って、有利にはコリネバクテリウムのための公知のプラ
スミドの範囲を補完する。コピー数決定に関連する教示
は、例えばミワ他（農業化学および生物化学４８，２９
０１−２９０３（１９８４））およびヴォラドスキー他
（Vohradsky et al）（電気泳動１３、６０１−６１２
（１９９３））において見いだすことができる。
中程度または低いコピー数を有している。この特性によ
って、有利にはコリネバクテリウムのための公知のプラ
スミドの範囲を補完する。コピー数決定に関連する教示
は、例えばミワ他（農業化学および生物化学４８，２９
０１−２９０３（１９８４））およびヴォラドスキー他
（Vohradsky et al）（電気泳動１３、６０１−６１２
（１９９３））において見いだすことができる。
【００２４】プラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４の
容易な取り扱いを保証するために、各プラスミドにおけ
る複製を担うＤＮＡ領域は決定されている。コリネ型細
菌中で複製できないが、その耐性遺伝子は発現するエシ
ェリキア コリの公知のプラスミドベクター、例えばｐ
Ｋ１８（Pridmore, Gene 56, 309-312 (1987)）、ｐＫ
１８ｍｏｂ２（Tauch et al., Plasmid 40, 126-139 (1
998））またはｐＣＲ２．１（Invitrogen BV, Groninge
n, Netherlands）をこの目的のために使用する。プラス
ミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４からのＤＮＡを単離
し、かつ制限酵素で処理する。前記のように得られた個
々のＤＮＡ断片を、場合によりまた単離することができ
る。使用されるプラスミドベクターのＤＮＡを同じ制限
酵素または適合性の末端を作り出す前記の酵素で処理す
る。得られたＤＮＡ分子を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼで処理する。これらの“クローニング”技術は先行技
術に属し、例えばサンブローク他（Sambrook et al）に
よる公知のマニュアル（モレキュラークローニング：ラ
ボラトリーマニュアル、コールド スプリング ハーバー
ラボラトリープレス（１９８９））（Molecular Cloni
ng: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Labor
atory Press (1989））中に詳細が記載されている。コ
リネ型宿主、例えばコリネバクテリウム グルタミクム
をライゲーション混合物で形質転換し、かつ使用される
Ｅ．コリのプラスミドベクターの耐性遺伝子に関して選
択した後に、形質転換体が得られる。コリネ型細菌の形
質転換に関連する開示は、例えばチールバッハ他（Thie
rbach et al）（応用微生物学および環境微生物学（App
lied and Environmental microbiology)２９，３５６−
３６２（１９８８））、リーブル他（Liebl et al）（F
EMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)）また
はデュニカン他（Dunican et al）（Bio/Technology 7,
1067-1070 (1989)）において見いだすことができる。
これらの形質転換体のプラスミドＤＮＡは、コリネ型細
菌における複製の能力を付与するｐＴＥＴ３またはｐＣ
ＲＹ４のＤＮＡ断片を有する。これらの例は： ・ Ｅ．コリのプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ２およびプラ
スミドｐＴＥＴ３の複製領域からなるプラスミドｐＴＥ
Ｔ３−Ｒｅｐ（図３）、ならびに ・ Ｅ．コリのプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ２およびプラ
スミドｐＣＲＹ４の複製領域からなるプラスミドｐＣＲ
Ｙ４−Ｒｅｐ（図４）である。
容易な取り扱いを保証するために、各プラスミドにおけ
る複製を担うＤＮＡ領域は決定されている。コリネ型細
菌中で複製できないが、その耐性遺伝子は発現するエシ
ェリキア コリの公知のプラスミドベクター、例えばｐ
Ｋ１８（Pridmore, Gene 56, 309-312 (1987)）、ｐＫ
１８ｍｏｂ２（Tauch et al., Plasmid 40, 126-139 (1
998））またはｐＣＲ２．１（Invitrogen BV, Groninge
n, Netherlands）をこの目的のために使用する。プラス
ミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４からのＤＮＡを単離
し、かつ制限酵素で処理する。前記のように得られた個
々のＤＮＡ断片を、場合によりまた単離することができ
る。使用されるプラスミドベクターのＤＮＡを同じ制限
酵素または適合性の末端を作り出す前記の酵素で処理す
る。得られたＤＮＡ分子を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼで処理する。これらの“クローニング”技術は先行技
術に属し、例えばサンブローク他（Sambrook et al）に
よる公知のマニュアル（モレキュラークローニング：ラ
ボラトリーマニュアル、コールド スプリング ハーバー
ラボラトリープレス（１９８９））（Molecular Cloni
ng: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Labor
atory Press (1989））中に詳細が記載されている。コ
リネ型宿主、例えばコリネバクテリウム グルタミクム
をライゲーション混合物で形質転換し、かつ使用される
Ｅ．コリのプラスミドベクターの耐性遺伝子に関して選
択した後に、形質転換体が得られる。コリネ型細菌の形
質転換に関連する開示は、例えばチールバッハ他（Thie
rbach et al）（応用微生物学および環境微生物学（App
lied and Environmental microbiology)２９，３５６−
３６２（１９８８））、リーブル他（Liebl et al）（F
EMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)）また
はデュニカン他（Dunican et al）（Bio/Technology 7,
1067-1070 (1989)）において見いだすことができる。
これらの形質転換体のプラスミドＤＮＡは、コリネ型細
菌における複製の能力を付与するｐＴＥＴ３またはｐＣ
ＲＹ４のＤＮＡ断片を有する。これらの例は： ・ Ｅ．コリのプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ２およびプラ
スミドｐＴＥＴ３の複製領域からなるプラスミドｐＴＥ
Ｔ３−Ｒｅｐ（図３）、ならびに ・ Ｅ．コリのプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ２およびプラ
スミドｐＣＲＹ４の複製領域からなるプラスミドｐＣＲ
Ｙ４−Ｒｅｐ（図４）である。
【００２５】前記のように特徴付けられるＤＮＡの切片
を次いでＤＮＡ配列決定のために適当な通常のベクター
にサブクローニングする。ＤＮＡ配列決定のために適当
なかかるベクターの例は、例えばプロメガ コーポレー
ションからのプラスミドｐＧＥＭ−５ｚｆ（−）もしく
はｐＧＥＭ−５ｚｆ（＋）（プロメガプロトコールおよ
びアプリケーションガイド、第２版、１９９１，パート
ナンバー Ｙ９８１，プロメガ コーポレーション、マジ
ソン，ＷＩ，ＵＳＡ）、プラスミドｐＵＣ１９（ヤニシ
ュ−ペロン他（Yanish-Perron et al）、Ｇｅｎｅ３
３，１０３−１１９（１９８５））またはプラスミドｐ
Ｋ１８（プリドモア（Pridmore）、Ｇｅｎｅ５６，３０
９−３１２（１９８７））である。
を次いでＤＮＡ配列決定のために適当な通常のベクター
にサブクローニングする。ＤＮＡ配列決定のために適当
なかかるベクターの例は、例えばプロメガ コーポレー
ションからのプラスミドｐＧＥＭ−５ｚｆ（−）もしく
はｐＧＥＭ−５ｚｆ（＋）（プロメガプロトコールおよ
びアプリケーションガイド、第２版、１９９１，パート
ナンバー Ｙ９８１，プロメガ コーポレーション、マジ
ソン，ＷＩ，ＵＳＡ）、プラスミドｐＵＣ１９（ヤニシ
ュ−ペロン他（Yanish-Perron et al）、Ｇｅｎｅ３
３，１０３−１１９（１９８５））またはプラスミドｐ
Ｋ１８（プリドモア（Pridmore）、Ｇｅｎｅ５６，３０
９−３１２（１９８７））である。
【００２６】ＤＮＡ配列決定法は、就中サンガー他（Pr
oceedings of the National Academy of Sciences of t
he United States of America USA, 74, 5463-5467, 19
77）およびツィマーマン他（Nucleic Acids Research 1
8, 1067 (1990)）に記載されている。
oceedings of the National Academy of Sciences of t
he United States of America USA, 74, 5463-5467, 19
77）およびツィマーマン他（Nucleic Acids Research 1
8, 1067 (1990)）に記載されている。
【００２７】次いで得られた配列を公知のアルゴリズム
または配列分析プログラム、例えば“ＳＴＡＤＥＮコン
ピュータ ソフトウェア パッケージ（STADEN computer
software package）”（分子生物学５、２３３−２４１
（１９９６））、ブトラーのＧＣＧプログラム（Butle
r's GCG program）（生化学分析の方法３９、７４−９
７（１９９８））、ペアーソン＆リップマンのＦＡＳＴ
Ａアルゴリズム（Pearson & Lipman's FASTA algorith
m）（Proceedings of the National Academy of Scienc
es USA, 85, 2444-2448, (1988)）またはアルチュル他
のＢＬＡＳＴアルゴリズム（Alschul et al.'s BLAST a
lgorithm）（Nature Genetics 6, 119-129 (1994)）を
使用して調査し、そして公共にアクセスできるデータベ
ースで利用できる配列全体と比較してよい。公共にアク
セスできるヌクレオチド配列データベースは、例えば欧
州分子生物学研究所データベース（the European Molec
ular Biology Laboratory database）（ＥＭＢＬ、ハイ
デルベルク、ドイツ）または生物学情報に関する国立セ
ンター（the National Center for Biotechnology Info
rmation database）（ＮＣＢＩ、ベテスダ、ＭＤ、ＵＳ
Ａ）である。
または配列分析プログラム、例えば“ＳＴＡＤＥＮコン
ピュータ ソフトウェア パッケージ（STADEN computer
software package）”（分子生物学５、２３３−２４１
（１９９６））、ブトラーのＧＣＧプログラム（Butle
r's GCG program）（生化学分析の方法３９、７４−９
７（１９９８））、ペアーソン＆リップマンのＦＡＳＴ
Ａアルゴリズム（Pearson & Lipman's FASTA algorith
m）（Proceedings of the National Academy of Scienc
es USA, 85, 2444-2448, (1988)）またはアルチュル他
のＢＬＡＳＴアルゴリズム（Alschul et al.'s BLAST a
lgorithm）（Nature Genetics 6, 119-129 (1994)）を
使用して調査し、そして公共にアクセスできるデータベ
ースで利用できる配列全体と比較してよい。公共にアク
セスできるヌクレオチド配列データベースは、例えば欧
州分子生物学研究所データベース（the European Molec
ular Biology Laboratory database）（ＥＭＢＬ、ハイ
デルベルク、ドイツ）または生物学情報に関する国立セ
ンター（the National Center for Biotechnology Info
rmation database）（ＮＣＢＩ、ベテスダ、ＭＤ、ＵＳ
Ａ）である。
【００２８】プラスミドｐＴＥＴ３の複製を担う新規Ｄ
ＮＡ配列（該配列は本発明により配列番号１として提供
されており、かつ複製を担うｒｅｐＡ遺伝子および安定
化を担うｐａｒＡを有する）は前記のようにして得られ
る。更に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を前
記のＤＮＡ配列から推測した。配列番号２は安定化タン
パク質ＰａｒＡの得られるアミノ酸配列を示しており、
一方配列番号３はｐＴＥＴ３の複製タンパク質ＲｅｐＡ
の得られるアミノ酸配列を示している。
ＮＡ配列（該配列は本発明により配列番号１として提供
されており、かつ複製を担うｒｅｐＡ遺伝子および安定
化を担うｐａｒＡを有する）は前記のようにして得られ
る。更に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を前
記のＤＮＡ配列から推測した。配列番号２は安定化タン
パク質ＰａｒＡの得られるアミノ酸配列を示しており、
一方配列番号３はｐＴＥＴ３の複製タンパク質ＲｅｐＡ
の得られるアミノ酸配列を示している。
【００２９】更に、プラスミドｐＣＲＹ４の複製を担う
新規ＤＮＡ配列（該配列は本発明により配列番号４とし
て提供されており、かつｐＣＲＹ４の複製を担うｒｅｐ
Ａ遺伝子を有する）は前記のようにして得られる。配列
番号５はプラスミドｐＣＲＹ４の複製タンパク質Ｒｅｐ
Ａの推測されるアミノ酸配列を示している。
新規ＤＮＡ配列（該配列は本発明により配列番号４とし
て提供されており、かつｐＣＲＹ４の複製を担うｒｅｐ
Ａ遺伝子を有する）は前記のようにして得られる。配列
番号５はプラスミドｐＣＲＹ４の複製タンパク質Ｒｅｐ
Ａの推測されるアミノ酸配列を示している。
【００３０】コリネバクテリウム グルタミクムに抗生
物質耐性を付与する天然産生遺伝子は例外的にのみ知ら
れている。従ってプラスミドｐＴＥＴ３がテトラサイク
リン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンおよび
サルファメトキサゾールという抗生物質に対する耐性を
付与することが見いだされたのは非常に意想外であっ
た。
物質耐性を付与する天然産生遺伝子は例外的にのみ知ら
れている。従ってプラスミドｐＴＥＴ３がテトラサイク
リン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンおよび
サルファメトキサゾールという抗生物質に対する耐性を
付与することが見いだされたのは非常に意想外であっ
た。
【００３１】新規のプラスミドにおいて抗生物質耐性遺
伝子を同定するために、調査されるべき株（本発明の場
合はコリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６）およ
び感受性の対照株（本発明の場合はコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２）をまず種々の抗生
物質および抗生物質の濃度に対する耐性または感受性に
関して試験する。臨床研究所規格の国立委員会（the Na
tional Committee ofClinical Laboratory Standards）
（ＮＣＣＬＳ）試験手順をこの目的のために有利には使
用する（“好気的に増殖する細菌のための希釈抗菌物質
感受性試験のための方法（Methods for dilution antim
icrobial susceptibility tests forbacteria that gro
w aerobically）”、第４版；承認規格（Approved Stan
dard）、Ｍ７−Ａ４、ＮＣＣＬＳ １７（２）、（１９
９７））。“承認規格Ｍ７−Ａ４”の方法を使用して、
抑制濃度を決定し、こうして調査された細菌株の耐性を
確かめることができる。
伝子を同定するために、調査されるべき株（本発明の場
合はコリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６）およ
び感受性の対照株（本発明の場合はコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２）をまず種々の抗生
物質および抗生物質の濃度に対する耐性または感受性に
関して試験する。臨床研究所規格の国立委員会（the Na
tional Committee ofClinical Laboratory Standards）
（ＮＣＣＬＳ）試験手順をこの目的のために有利には使
用する（“好気的に増殖する細菌のための希釈抗菌物質
感受性試験のための方法（Methods for dilution antim
icrobial susceptibility tests forbacteria that gro
w aerobically）”、第４版；承認規格（Approved Stan
dard）、Ｍ７−Ａ４、ＮＣＣＬＳ １７（２）、（１９
９７））。“承認規格Ｍ７−Ａ４”の方法を使用して、
抑制濃度を決定し、こうして調査された細菌株の耐性を
確かめることができる。
【００３２】次いで調査されるべきプラスミド（本願で
はｐＴＥＴ３）を前記の株ＬＰ−６から単離し、かつこ
れを使用して適当な対照株または指示株（本願では株Ａ
ＴＣＣ１３０３２）を形質転換した。コリネ型細菌の形
質転換のための方法は、例えばチールバッハ他（応用微
生物学および環境微生物学２９，３５６−３６２（１９
８８））、リーブル他（FEMS Microbiology Letters 6
5, 299-304 (1989)）またはデュニカン他（Bio/Technol
ogy 7, 1067-1070 (1989)）に記載されている。選択
は、適当な抗生物質を補った慣用の複合栄養培地、例え
ば脳−心臓ブイヨンまたはルリア−ベルタニ培地上で実
施する。抗生物質および前記の選択法のためのその濃度
は前記の“承認規格Ｍ７−Ａ４”に基づいて決定され
る。前記のように、株ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ
３］はテトラサイクリン耐性に関する選択によって得ら
れる。株ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］および対照
株ＡＴＣＣ１３０３２の耐性／感受性を次いで前記の方
法を使用して調査し、その際、株ＡＴＣＣ１３０３２
［ｐＴＥＴ３］がテトラサイクリン、ストレプトマイシ
ン、スペクチノマイシンおよびサルファメトキサゾール
という抗生物質に対して耐性であるという結果が得られ
た。
はｐＴＥＴ３）を前記の株ＬＰ−６から単離し、かつこ
れを使用して適当な対照株または指示株（本願では株Ａ
ＴＣＣ１３０３２）を形質転換した。コリネ型細菌の形
質転換のための方法は、例えばチールバッハ他（応用微
生物学および環境微生物学２９，３５６−３６２（１９
８８））、リーブル他（FEMS Microbiology Letters 6
5, 299-304 (1989)）またはデュニカン他（Bio/Technol
ogy 7, 1067-1070 (1989)）に記載されている。選択
は、適当な抗生物質を補った慣用の複合栄養培地、例え
ば脳−心臓ブイヨンまたはルリア−ベルタニ培地上で実
施する。抗生物質および前記の選択法のためのその濃度
は前記の“承認規格Ｍ７−Ａ４”に基づいて決定され
る。前記のように、株ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ
３］はテトラサイクリン耐性に関する選択によって得ら
れる。株ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］および対照
株ＡＴＣＣ１３０３２の耐性／感受性を次いで前記の方
法を使用して調査し、その際、株ＡＴＣＣ１３０３２
［ｐＴＥＴ３］がテトラサイクリン、ストレプトマイシ
ン、スペクチノマイシンおよびサルファメトキサゾール
という抗生物質に対して耐性であるという結果が得られ
た。
【００３３】前記の抗生物質耐性をクローニングおよび
配列決定によって更に特徴付ける。この目的のために、
プラスミドｐＴＥＴ３を株ＬＰ−３またはＡＴＣＣ１３
０３２［ｐＴＥＴ３］から単離し、適当な制限酵素で処
理し、同様に処理したクローニングベクターと混合し、
かつＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理する。ライゲーション
混合物をエシェリキア コリの適当なクローニング宿主
中に形質転換によって導入する。形質転換のための選択
は適当な抗生物質を補った複合栄養培地上で実施する。
当業者は、前記の方法に関する教示をサンブローク他に
よる公知のマニュアル中に見いだすことができる。適当
なクローニングベクターの例はｐＵＣ１９（ヤニシュ−
ペロン他、Ｇｅｎｅ３３，１０３−１１９（１９８
５））、ｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プラスミド４
０，１２６−１３９（１９９８））またはｐＣＲ２．１
（インビトロゲンＢＶ、グロニンゲン、オランダ）であ
る。適当な宿主は、特に制限欠損および組み換え欠損
（restriction and recombinationdefect）を有する
Ｅ．コリ株である。そのような株の一例はグラント他
（Grantet al）（Proceedings of the National Academ
y of Sciences USA, 87, 4645-4649, (1990)）によって
記載されている株ＤＨ５α ＭＣＲである。形質転換法
は、例えばハナハン（Journal of Molecular Biology 1
66, 577-580 (1983)）またはタウチ他（プラスミド４
０，１２６−１３９（１９９８））に記載されている。
形質転換体選択は、プラスミドｐＴＥＴ３が耐性を付与
する抗生物質を使用することによって実施する。次いで
得られる形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離し、かつ
クローニングしたプラスミドｐＴＥＴ３のＤＮＡ断片を
配列決定した。次いで配列を前記のように分析し、収集
されたＤＮＡ配列のデータベースと比較する。
配列決定によって更に特徴付ける。この目的のために、
プラスミドｐＴＥＴ３を株ＬＰ−３またはＡＴＣＣ１３
０３２［ｐＴＥＴ３］から単離し、適当な制限酵素で処
理し、同様に処理したクローニングベクターと混合し、
かつＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理する。ライゲーション
混合物をエシェリキア コリの適当なクローニング宿主
中に形質転換によって導入する。形質転換のための選択
は適当な抗生物質を補った複合栄養培地上で実施する。
当業者は、前記の方法に関する教示をサンブローク他に
よる公知のマニュアル中に見いだすことができる。適当
なクローニングベクターの例はｐＵＣ１９（ヤニシュ−
ペロン他、Ｇｅｎｅ３３，１０３−１１９（１９８
５））、ｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プラスミド４
０，１２６−１３９（１９９８））またはｐＣＲ２．１
（インビトロゲンＢＶ、グロニンゲン、オランダ）であ
る。適当な宿主は、特に制限欠損および組み換え欠損
（restriction and recombinationdefect）を有する
Ｅ．コリ株である。そのような株の一例はグラント他
（Grantet al）（Proceedings of the National Academ
y of Sciences USA, 87, 4645-4649, (1990)）によって
記載されている株ＤＨ５α ＭＣＲである。形質転換法
は、例えばハナハン（Journal of Molecular Biology 1
66, 577-580 (1983)）またはタウチ他（プラスミド４
０，１２６−１３９（１９９８））に記載されている。
形質転換体選択は、プラスミドｐＴＥＴ３が耐性を付与
する抗生物質を使用することによって実施する。次いで
得られる形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離し、かつ
クローニングしたプラスミドｐＴＥＴ３のＤＮＡ断片を
配列決定した。次いで配列を前記のように分析し、収集
されたＤＮＡ配列のデータベースと比較する。
【００３４】前記のようにテトラサイクリン、ストレプ
トマイシン、スペクチノマイシンおよびサルファメトキ
サゾールという抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子
が連続的なＤＮＡ断片上に位置していることを見いだし
た。該ＤＮＡ断片を図５に制限地図として示す。遺伝子
ｔｅｔＲ、ｔｅｔＡおよびａａｄＡを有するＤＮＡ部分
を配列として配列番号６に示し、これは本発明により提
供される。
トマイシン、スペクチノマイシンおよびサルファメトキ
サゾールという抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子
が連続的なＤＮＡ断片上に位置していることを見いだし
た。該ＤＮＡ断片を図５に制限地図として示す。遺伝子
ｔｅｔＲ、ｔｅｔＡおよびａａｄＡを有するＤＮＡ部分
を配列として配列番号６に示し、これは本発明により提
供される。
【００３５】更に特定の遺伝子によってコードされるタ
ンパク質のアミノ酸配列を確かめられたＤＮＡ配列から
推測した。配列番号７はｔｅｔＡ遺伝子によってコード
されるテトラサイクリン耐性タンパク質ＴｅｔＡの推測
されたアミノ酸配列を示し、かつ配列番号８はａａｄＡ
遺伝子によってコードされるスペクチノマイシン／スト
レプトマイシン耐性タンパク質ＡａｄＡの推測されたア
ミノ酸配列を示す。配列番号９はｔｅｔＲ遺伝子のコー
ディング領域を示し、配列番号１０はテトラサイクリン
耐性リプレッサータンパク質ＴｅｔＲのアミノ酸配列を
示す。
ンパク質のアミノ酸配列を確かめられたＤＮＡ配列から
推測した。配列番号７はｔｅｔＡ遺伝子によってコード
されるテトラサイクリン耐性タンパク質ＴｅｔＡの推測
されたアミノ酸配列を示し、かつ配列番号８はａａｄＡ
遺伝子によってコードされるスペクチノマイシン／スト
レプトマイシン耐性タンパク質ＡａｄＡの推測されたア
ミノ酸配列を示す。配列番号９はｔｅｔＲ遺伝子のコー
ディング領域を示し、配列番号１０はテトラサイクリン
耐性リプレッサータンパク質ＴｅｔＲのアミノ酸配列を
示す。
【００３６】遺伝子コードの縮重のために配列番号６か
ら生じるコーディングＤＮＡ配列も本発明によって提供
される。配列番号１または配列番号１の部分とハイブリ
ダイズするＤＮＡ配列も同様に本発明によって提供され
る。タンパク質におけるアミノ酸の保存的置換、例えば
アラニンとのグリシンの置換またはグルタミン酸とのア
スパラギン酸の置換は専門家には“センス突然変異”と
して公知であり、これはタンパク質の活性に根本的な変
化をもたらさない、すなわちこれらは機能上中立であ
る。前記のように配列番号７、８および１０から生じる
アミノ酸配列も本発明によって提供される。
ら生じるコーディングＤＮＡ配列も本発明によって提供
される。配列番号１または配列番号１の部分とハイブリ
ダイズするＤＮＡ配列も同様に本発明によって提供され
る。タンパク質におけるアミノ酸の保存的置換、例えば
アラニンとのグリシンの置換またはグルタミン酸とのア
スパラギン酸の置換は専門家には“センス突然変異”と
して公知であり、これはタンパク質の活性に根本的な変
化をもたらさない、すなわちこれらは機能上中立であ
る。前記のように配列番号７、８および１０から生じる
アミノ酸配列も本発明によって提供される。
【００３７】次いでコリネバクテリウム グルタミクム
株ＬＰ−６からのプラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ
４のＤＮＡ断片を他の微生物、例えばエシェリキア コ
リまたはコリネバクテリウム グルタミクムの公知のプ
ラスミドのＤＮＡ断片と組合せて、他の新規のプラスミ
ドベクターを得てもよい。本発明の目的のために、種コ
リネバクテリウム グルタミクムの他の株からのプラス
ミドＤＮＡを使用することは有利である。自己クローニ
ング（self cloning）として知られるこのアプローチ
は、外来ヌクレオチド配列が種コリネバクテリウム グ
ルタミクムに導入されないという利点を有している。そ
のような更に発達したプラスミドベクターは新規プラス
ミドｐＴＥＴ３の成分だけ、すなわち複製領域および選
択マーカーとして使用される少なくとも１つの抗生物質
耐性領域からなる。このようなベクターの一例は図６に
示されるプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１である。
しかしながら、これらのベクターも公知のプラスミドの
成分ならびにｐＴＥＴ３またはｐＣＲＹ４の成分から構
成される。このようなベクターの一例は図７に示される
プラスミドベクターｐＳＥＬＦ１−１であり、該ベクタ
ーにおいては公知の潜在プラスミドｐＧＡ１（ＵＳ−Ａ
５１７５１０８号）がｐＴＥＴ３のテトラサイクリン耐
性を付与するｔｅｔＡ遺伝子が提供されている。
株ＬＰ−６からのプラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ
４のＤＮＡ断片を他の微生物、例えばエシェリキア コ
リまたはコリネバクテリウム グルタミクムの公知のプ
ラスミドのＤＮＡ断片と組合せて、他の新規のプラスミ
ドベクターを得てもよい。本発明の目的のために、種コ
リネバクテリウム グルタミクムの他の株からのプラス
ミドＤＮＡを使用することは有利である。自己クローニ
ング（self cloning）として知られるこのアプローチ
は、外来ヌクレオチド配列が種コリネバクテリウム グ
ルタミクムに導入されないという利点を有している。そ
のような更に発達したプラスミドベクターは新規プラス
ミドｐＴＥＴ３の成分だけ、すなわち複製領域および選
択マーカーとして使用される少なくとも１つの抗生物質
耐性領域からなる。このようなベクターの一例は図６に
示されるプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１である。
しかしながら、これらのベクターも公知のプラスミドの
成分ならびにｐＴＥＴ３またはｐＣＲＹ４の成分から構
成される。このようなベクターの一例は図７に示される
プラスミドベクターｐＳＥＬＦ１−１であり、該ベクタ
ーにおいては公知の潜在プラスミドｐＧＡ１（ＵＳ−Ａ
５１７５１０８号）がｐＴＥＴ３のテトラサイクリン耐
性を付与するｔｅｔＡ遺伝子が提供されている。
【００３８】新規プラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ
４から構築されるプラスミドベクターは、有利には工業
的に関心を持たれる代謝産物、例えばアミノ酸、ビタミ
ンおよびヌクレオチドの発酵的製造のために使用してよ
い。
４から構築されるプラスミドベクターは、有利には工業
的に関心を持たれる代謝産物、例えばアミノ酸、ビタミ
ンおよびヌクレオチドの発酵的製造のために使用してよ
い。
【００３９】例えば本発明の枠組みの中で、フィードバ
ック耐性アスパラギン酸キナーゼをコードするＣ．グル
タミクムのｌｙｓＣ（ＦＢＲ）アレルをｐＳＥＬＦ１−
１によってＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中にク
ローニングした。前記のように、自己クローニングした
Ｃ．グルタミクムのリジン産生株を製造した。
ック耐性アスパラギン酸キナーゼをコードするＣ．グル
タミクムのｌｙｓＣ（ＦＢＲ）アレルをｐＳＥＬＦ１−
１によってＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中にク
ローニングした。前記のように、自己クローニングした
Ｃ．グルタミクムのリジン産生株を製造した。
【００４０】他の例によって、Ｃ．グルタミクムからの
アスパラギン酸α−デカルボキシラーゼをコードするｐ
ａｎＤ遺伝子をｐＳＥＬＦ１−１によってＣ．グルタミ
クム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ中にクローニング
した。前記のように、自己クローニングしたＣ．グルタ
ミクムのパントテン酸産生株を製造した。
アスパラギン酸α−デカルボキシラーゼをコードするｐ
ａｎＤ遺伝子をｐＳＥＬＦ１−１によってＣ．グルタミ
クム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ中にクローニング
した。前記のように、自己クローニングしたＣ．グルタ
ミクムのパントテン酸産生株を製造した。
【００４１】新規のプラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲ
Ｙ４ならびにそれに基づく他のプラスミドベクターの１
つの非常に特定の利点は、これらが公知のプラスミドま
たはプラスミドベクターに非常に高レベルの和合性を示
すことである。
Ｙ４ならびにそれに基づく他のプラスミドベクターの１
つの非常に特定の利点は、これらが公知のプラスミドま
たはプラスミドベクターに非常に高レベルの和合性を示
すことである。
【００４２】従って、プラスミドｐＴＥＴ３はｐＧＡ１
（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）、ｐＡＧ３（ＵＳ−Ａ５
１５８８９１号）、ｐＢＬ１（サンタマリア他、ジャー
ナルオブ ジェネラル ミクロバイオロジー１３０、２２
３７−２２４６（１９８４））またはｐＨＭ１５１９
（ミワ他、農業化学および生物化学４８、２９０１−２
９０３（１９８４））の存在下に共存するか、またはこ
れらをベースとするプラスミドベクターに和合性であり
うることが判明した。ｐＴＥＴ３の和合性は関連の宿主
細胞が既に２種以上の公知のプラスミドベクター、例え
ばｐＢＬ１誘導体および同時にｐＨＭ１５１９誘導体を
有する場合でも保持される。ｐＴＥＴ３の公知のプラス
ミドまたはプラスミドベクターと共存する能力は十分に
長い期間にわたるか、または十分に多くの世代の間で確
かめられた。
（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）、ｐＡＧ３（ＵＳ−Ａ５
１５８８９１号）、ｐＢＬ１（サンタマリア他、ジャー
ナルオブ ジェネラル ミクロバイオロジー１３０、２２
３７−２２４６（１９８４））またはｐＨＭ１５１９
（ミワ他、農業化学および生物化学４８、２９０１−２
９０３（１９８４））の存在下に共存するか、またはこ
れらをベースとするプラスミドベクターに和合性であり
うることが判明した。ｐＴＥＴ３の和合性は関連の宿主
細胞が既に２種以上の公知のプラスミドベクター、例え
ばｐＢＬ１誘導体および同時にｐＨＭ１５１９誘導体を
有する場合でも保持される。ｐＴＥＴ３の公知のプラス
ミドまたはプラスミドベクターと共存する能力は十分に
長い期間にわたるか、または十分に多くの世代の間で確
かめられた。
【００４３】更にプラスミドｐＣＲＹ４は、ｐＡＧ３
（ＵＳ−Ａ５１５８８９１号）、ｐＢＬ１（サンタマリ
ア他、ジャーナル オブ ジェネラル ミクロバイオロジ
ー１３０、２２３７−２２４６（１９８４））またはｐ
ＨＭ１５１９（ミワ他、農業化学および生物化学４８、
２９０１−２９０３（１９８４））をベースとするプラ
スミドベクターの存在下に、プラスミドｐＴＥＴ３、ｐ
ＧＡ１（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）、ｐＧＡ２（ＵＳ
−Ａ５１７５１０８号）の同時の存在下に共存するか、
またはこれらに和合性でありうることが判明した。ｐＴ
ＥＴ３の和合性は関連の宿主細胞が既に２種以上の公知
のプラスミドベクター、例えばｐＢＬ１誘導体および同
時にｐＨＭ１５１９誘導体を有する場合でも保持され
る。ｐＣＲＹ４の公知のプラスミドまたはプラスミドベ
クターと共存する能力は十分に長い期間にわたるか、ま
たは十分に多くの世代の間で確かめられた。
（ＵＳ−Ａ５１５８８９１号）、ｐＢＬ１（サンタマリ
ア他、ジャーナル オブ ジェネラル ミクロバイオロジ
ー１３０、２２３７−２２４６（１９８４））またはｐ
ＨＭ１５１９（ミワ他、農業化学および生物化学４８、
２９０１−２９０３（１９８４））をベースとするプラ
スミドベクターの存在下に、プラスミドｐＴＥＴ３、ｐ
ＧＡ１（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）、ｐＧＡ２（ＵＳ
−Ａ５１７５１０８号）の同時の存在下に共存するか、
またはこれらに和合性でありうることが判明した。ｐＴ
ＥＴ３の和合性は関連の宿主細胞が既に２種以上の公知
のプラスミドベクター、例えばｐＢＬ１誘導体および同
時にｐＨＭ１５１９誘導体を有する場合でも保持され
る。ｐＣＲＹ４の公知のプラスミドまたはプラスミドベ
クターと共存する能力は十分に長い期間にわたるか、ま
たは十分に多くの世代の間で確かめられた。
【００４４】高められたプラスミドｐＴＥＴ３およびｐ
ＣＲＹ４の和合性は、有利にはアミノ酸、ビタミンおよ
びヌクレオチドを生産する株を改善するために使用する
ことができる。ザームおよびエッゲリング（Sahm and E
ggeling）（応用および環境微生物学６５，１９７３−
１９７９（１９９９））はパントテン酸産生株ＡＴＣＣ
１３０３２ΔｉｌｖＡ［ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ、ｐ
ＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ］を記載している。該株はｐＨＭ
１５１９誘導体のｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤおよびｐＢ
Ｌ１誘導体のｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを有している。既
に２種のプラスミドを有する前記の株の性能特性におい
てプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１によるｐａｎＤ
遺伝子の導入後に明らかな改善を達成することが可能で
あると判明した。
ＣＲＹ４の和合性は、有利にはアミノ酸、ビタミンおよ
びヌクレオチドを生産する株を改善するために使用する
ことができる。ザームおよびエッゲリング（Sahm and E
ggeling）（応用および環境微生物学６５，１９７３−
１９７９（１９９９））はパントテン酸産生株ＡＴＣＣ
１３０３２ΔｉｌｖＡ［ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤ、ｐ
ＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ］を記載している。該株はｐＨＭ
１５１９誘導体のｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤおよびｐＢ
Ｌ１誘導体のｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣを有している。既
に２種のプラスミドを有する前記の株の性能特性におい
てプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１によるｐａｎＤ
遺伝子の導入後に明らかな改善を達成することが可能で
あると判明した。
【００４５】
【実施例】本発明を以下の実施例により更に詳細に説明
する。
する。
【００４６】以下の細菌株を使用した：コリネバクテリ
ウム グルタミクムＬＰ−６はＥＰ−Ｂ０４７２８６９
号においてドイツ微生物および細胞培養保存機関（ＤＳ
ＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）に番号ＤＳＭ５８
１６で寄託された。ＤＳＭ５８１６に関する保管期間は
ブタペスト条約の規則９．１に準じて延長されている。
ＤＳＭ５８１６は以下の分類学的特徴を有している： − 細胞形態：Ｙ形分枝（Y-shaped branching） − ペプチドグリカン：メソ−ジアミノピメリン酸 − ミコール酸：ＤＳＭ２０３００と高レベルの類似性
を有するコリネバクテリウムのミコール酸 − 脂肪酸パターン：ＤＳＭ２０３００と高レベルの類
似性を有する非分枝鎖状の、飽和および不飽和の脂肪酸
を有するコリネバクテリウムに典型的な脂肪酸パターン − Ｇ＋Ｃ含量：５５．１％ − １６Ｓ ｒＤＮＡ配列：ＤＳＭ２０３００と比較し
て９８．６％同一 − ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：ＤＳＭ２０３００に対
して８１．６％ コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
を米国寄託機関（マナッサス、ＵＳＡ）から得た。
ウム グルタミクムＬＰ−６はＥＰ−Ｂ０４７２８６９
号においてドイツ微生物および細胞培養保存機関（ＤＳ
ＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）に番号ＤＳＭ５８
１６で寄託された。ＤＳＭ５８１６に関する保管期間は
ブタペスト条約の規則９．１に準じて延長されている。
ＤＳＭ５８１６は以下の分類学的特徴を有している： − 細胞形態：Ｙ形分枝（Y-shaped branching） − ペプチドグリカン：メソ−ジアミノピメリン酸 − ミコール酸：ＤＳＭ２０３００と高レベルの類似性
を有するコリネバクテリウムのミコール酸 − 脂肪酸パターン：ＤＳＭ２０３００と高レベルの類
似性を有する非分枝鎖状の、飽和および不飽和の脂肪酸
を有するコリネバクテリウムに典型的な脂肪酸パターン − Ｇ＋Ｃ含量：５５．１％ − １６Ｓ ｒＤＮＡ配列：ＤＳＭ２０３００と比較し
て９８．６％同一 − ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジー：ＤＳＭ２０３００に対
して８１．６％ コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
を米国寄託機関（マナッサス、ＵＳＡ）から得た。
【００４７】コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３０３２ΔｉｌｖＡをドイツ微生物および細胞培養
保存機関（ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）に
番号ＤＳＭ１２４５５で寄託した。
Ｃ１３０３２ΔｉｌｖＡをドイツ微生物および細胞培養
保存機関（ＤＳＭＺ、ブラウンシュバイク、ドイツ）に
番号ＤＳＭ１２４５５で寄託した。
【００４８】以下の例における一般的な遺伝的方法およ
びそこで使用される栄養培地は専門家の文献でサンブロ
ーク他（モレキュラークローニング：ラボラトリーマニ
ュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレ
ス（１９８９））において記載されている。プラスミド
ＤＮＡの電気的な導入はリーブル他（FEMS Microbiolog
y Letters65,299−304）の方法を使用して実施した。
びそこで使用される栄養培地は専門家の文献でサンブロ
ーク他（モレキュラークローニング：ラボラトリーマニ
ュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレ
ス（１９８９））において記載されている。プラスミド
ＤＮＡの電気的な導入はリーブル他（FEMS Microbiolog
y Letters65,299−304）の方法を使用して実施した。
【００４９】以下の例に記載されるＤＮＡ断片をサンガ
ー他（Proceedings of the National Academy of Scien
ces USA 74, 5463-5467 (1977)）によるジデオキシ鎖伸
長停止法（dideoxy chain termination method）によっ
て配列決定した。得られた生配列データを“ＳＴＡＤＥ
Ｎソフトウェアパッケージ”（Staden, Molecular Biot
echnology 5 233-241 (1996)）を使用して加工した。コ
ンピュータを使用するコーディング範囲の分析はＸＮＩ
Ｐソフトウェア（Staden, Molecular Biotechnology 5,
233-241 (1996)）を使用して実施した。“ＢＬＡＳＴ
プログラム”（アルチュル他、核酸リサーチ２５，３３
８９−３４０２（１９９７））を使用して更なる配列分
析を実施した。
ー他（Proceedings of the National Academy of Scien
ces USA 74, 5463-5467 (1977)）によるジデオキシ鎖伸
長停止法（dideoxy chain termination method）によっ
て配列決定した。得られた生配列データを“ＳＴＡＤＥ
Ｎソフトウェアパッケージ”（Staden, Molecular Biot
echnology 5 233-241 (1996)）を使用して加工した。コ
ンピュータを使用するコーディング範囲の分析はＸＮＩ
Ｐソフトウェア（Staden, Molecular Biotechnology 5,
233-241 (1996)）を使用して実施した。“ＢＬＡＳＴ
プログラム”（アルチュル他、核酸リサーチ２５，３３
８９−３４０２（１９９７））を使用して更なる配列分
析を実施した。
【００５０】例１ 新規のプラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４の単離お
よび特徴付け 新規プラスミドの同定およびプラスミドＤＮＡの単離の
ために、細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＬＰ
−６をＬＢ培地で培養し、“ヌクレオボンド核酸精製キ
ットおよびカートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３
１６７−１）”（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、
ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）に挙げられる教示
に従って単離した。単離したプラスミドＤＮＡを０．８
％のアガロースゲル中で分離し、新規のプラスミドｐＴ
ＥＴ３およびｐＣＲＹ４に相当するプラスミドバンドを
それぞれ別々にアガロースゲルから再単離した。実験手
順は“ＱＩＡＥＸ ＩＩアガロースゲルからのＤＮＡ抽
出のためのハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデ
ン、ドイツ、１９９７）に従った。次いでｐＴＥＴ３の
再単離されたプラスミドＤＮＡを製造者の教示に従って
制限酵素ＡｖｒＩＩ、ＭｕｎＩ（ニューイングランドバ
イオラボＧｍｂＨ、シュヴァルバッハ、ドイツ）、Ｈｐ
ａＩ、ＳｃａＩ、ＸｂａＩ（ファルマシアバイオテック
ヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイツ）およびＳ
ｐｅＩ（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マ
ンハイム、ドイツ）を使用してその都度、個々にかつ組
み合わせて消化させた。制限処理バッチを次いで０．８
％のアガロースゲル中で分離した。得られたＤＮＡ断片
と既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分子量マーカーＸ、
ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）との比較によって図１に示されるコリネバ
クテリウム グルタミクムＬＰ−６からのプラスミドｐ
ＴＥＴ３の制限地図を決定した。
よび特徴付け 新規プラスミドの同定およびプラスミドＤＮＡの単離の
ために、細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＬＰ
−６をＬＢ培地で培養し、“ヌクレオボンド核酸精製キ
ットおよびカートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３
１６７−１）”（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、
ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）に挙げられる教示
に従って単離した。単離したプラスミドＤＮＡを０．８
％のアガロースゲル中で分離し、新規のプラスミドｐＴ
ＥＴ３およびｐＣＲＹ４に相当するプラスミドバンドを
それぞれ別々にアガロースゲルから再単離した。実験手
順は“ＱＩＡＥＸ ＩＩアガロースゲルからのＤＮＡ抽
出のためのハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデ
ン、ドイツ、１９９７）に従った。次いでｐＴＥＴ３の
再単離されたプラスミドＤＮＡを製造者の教示に従って
制限酵素ＡｖｒＩＩ、ＭｕｎＩ（ニューイングランドバ
イオラボＧｍｂＨ、シュヴァルバッハ、ドイツ）、Ｈｐ
ａＩ、ＳｃａＩ、ＸｂａＩ（ファルマシアバイオテック
ヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイツ）およびＳ
ｐｅＩ（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マ
ンハイム、ドイツ）を使用してその都度、個々にかつ組
み合わせて消化させた。制限処理バッチを次いで０．８
％のアガロースゲル中で分離した。得られたＤＮＡ断片
と既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分子量マーカーＸ、
ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）との比較によって図１に示されるコリネバ
クテリウム グルタミクムＬＰ−６からのプラスミドｐ
ＴＥＴ３の制限地図を決定した。
【００５１】次いでコリネバクテリウム グルタミクム
ＬＰ−６から再単離された新規プラスミドｐＣＲＹ４の
プラスミドＤＮＡを製造者の教示に従って制限酵素Ａｖ
ｒＩＩ（ニューイングランドバイオラボＧｍｂＨ、シュ
ヴァルバッハ、ドイツ）、ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩおよび
ＣｌａＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂ
Ｈ、フライブルク、ドイツ）でその都度、個々にかつ組
み合わせて消化した。次いで制限処理バッチを０．８％
アガロースゲル中で分離した。得られたＤＮＡ断片と既
知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分子量マーカーＸ、ロッ
ヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ド
イツ）との比較によって図２に示されるコリネバクテリ
ウム グルタミクムＬＰ−６からのプラスミドｐＣＲＹ
４の制限地図を決定した。
ＬＰ−６から再単離された新規プラスミドｐＣＲＹ４の
プラスミドＤＮＡを製造者の教示に従って制限酵素Ａｖ
ｒＩＩ（ニューイングランドバイオラボＧｍｂＨ、シュ
ヴァルバッハ、ドイツ）、ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩおよび
ＣｌａＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂ
Ｈ、フライブルク、ドイツ）でその都度、個々にかつ組
み合わせて消化した。次いで制限処理バッチを０．８％
アガロースゲル中で分離した。得られたＤＮＡ断片と既
知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分子量マーカーＸ、ロッ
ヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ド
イツ）との比較によって図２に示されるコリネバクテリ
ウム グルタミクムＬＰ−６からのプラスミドｐＣＲＹ
４の制限地図を決定した。
【００５２】例２ プラスミドｐＴＥＴ３の複製領域の単離および配列決定 コリネ型細菌における新規プラスミドの安定な複製のた
めに必要なＤＮＡ領域を単離するために、プラスミドＤ
ＮＡをまずコリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６
から細菌細胞のアルカリ処理によって単離した。実験方
法は“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカートリッ
ジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”（クロ
ンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイ
ツ、１９９７）に関する教示において詳細に記載されて
いる。コリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６から
得られたＤＮＡ調製物を次いで０．８％のアガロースゲ
ル中で分離し、プラスミドバンドの存在に関して調査し
た。コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６からの同
定されたプラスミドバンドを公知のｐＧＡ１およびｐＧ
Ａ２（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）ならびに新規プラス
ミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４に割り当てた。プラス
ミドｐＴＥＴ３に相当するプラスミドバンドをアガロー
スゲルから再単離した（例１参照）。実験手順は“ＱＩ
ＡＥＸ ＩＩアガロースゲルからのＤＮＡ抽出のための
ハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ、１９９７）に見いだすことができる。次いで再単離
したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡｖｒＩＩ（ニューイ
ングランドバイオラボＧｍｂＨ、シュヴァルバッハ、ド
イツ）およびＨｐａＩ（ファルマシアバイオテックヨー
ロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイツ）で消化し、か
つ制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ（ファルマシアバイ
オテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイツ）
で切断したベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プラ
スミド４０，１２６−１３９（１９９８））中にクロー
ニングした。ＤＮＡ制限処理およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）を使用するＤＮＡライゲーションを製造者
の教示に従って実施した。次いでライゲーション混合物
を株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２中にエレクトロポレーションで導入した。選択を２
５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢアガー上で
実施した。３０℃での４８時間のインキュベート後に、
プラスミドを有するコロニーを単離した。形質転換した
細菌細胞におけるプラスミドの存在は“ＱＩＡＧＥＮプ
ラスミドミニキットのためのプラスミドミニハンドブッ
ク”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９
７）における教示に従ってアルカリリシス法によって明
らかにした。。単離したプラスミドをｐＴＥＴ３−Ｒｅ
ｐと名付けた。ｐＴＥＴ３−Ｒｅｐの制限分析および得
られた断片の長さと既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分
子量マーカーＸ、ロッヒェディアグノスティックスＧｍ
ｂＨ、マンハイム、ドイツ）との比較によってｐＴＥＴ
３−Ｒｅｐは約４５００塩基対（ｂｐ）のサイズのｐＴ
ＥＴ３からのＤＮＡ断片を有するクローニングベクター
ｐＫ１８ｍｏｂ２からなることが明らかになった。
めに必要なＤＮＡ領域を単離するために、プラスミドＤ
ＮＡをまずコリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６
から細菌細胞のアルカリ処理によって単離した。実験方
法は“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカートリッ
ジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”（クロ
ンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイ
ツ、１９９７）に関する教示において詳細に記載されて
いる。コリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６から
得られたＤＮＡ調製物を次いで０．８％のアガロースゲ
ル中で分離し、プラスミドバンドの存在に関して調査し
た。コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６からの同
定されたプラスミドバンドを公知のｐＧＡ１およびｐＧ
Ａ２（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）ならびに新規プラス
ミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４に割り当てた。プラス
ミドｐＴＥＴ３に相当するプラスミドバンドをアガロー
スゲルから再単離した（例１参照）。実験手順は“ＱＩ
ＡＥＸ ＩＩアガロースゲルからのＤＮＡ抽出のための
ハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ、１９９７）に見いだすことができる。次いで再単離
したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＡｖｒＩＩ（ニューイ
ングランドバイオラボＧｍｂＨ、シュヴァルバッハ、ド
イツ）およびＨｐａＩ（ファルマシアバイオテックヨー
ロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイツ）で消化し、か
つ制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ（ファルマシアバイ
オテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイツ）
で切断したベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プラ
スミド４０，１２６−１３９（１９９８））中にクロー
ニングした。ＤＮＡ制限処理およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）を使用するＤＮＡライゲーションを製造者
の教示に従って実施した。次いでライゲーション混合物
を株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２中にエレクトロポレーションで導入した。選択を２
５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢアガー上で
実施した。３０℃での４８時間のインキュベート後に、
プラスミドを有するコロニーを単離した。形質転換した
細菌細胞におけるプラスミドの存在は“ＱＩＡＧＥＮプ
ラスミドミニキットのためのプラスミドミニハンドブッ
ク”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９
７）における教示に従ってアルカリリシス法によって明
らかにした。。単離したプラスミドをｐＴＥＴ３−Ｒｅ
ｐと名付けた。ｐＴＥＴ３−Ｒｅｐの制限分析および得
られた断片の長さと既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分
子量マーカーＸ、ロッヒェディアグノスティックスＧｍ
ｂＨ、マンハイム、ドイツ）との比較によってｐＴＥＴ
３−Ｒｅｐは約４５００塩基対（ｂｐ）のサイズのｐＴ
ＥＴ３からのＤＮＡ断片を有するクローニングベクター
ｐＫ１８ｍｏｂ２からなることが明らかになった。
【００５３】ｐＴＥＴ３−Ｒｅｐからの約４５００ｂｐ
のＤＮＡ断片の二本鎖ＤＮＡ配列決定の目的のために、
ＤＮＡを“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカート
リッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”
（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベル
ク、ドイツ、１９９７）の教示に従って単離した。配列
決定および引き続いてのコーディング領域分析によって
配列決定したＤＮＡ断片上に２つのオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）が明らかとなった。図３はｐＴＥ
Ｔ３−Ｒｅｐの配列決定したＤＮＡ断片の制限地図を示
しており、これは２つの同定されたＯＲＦの位置も示し
ている。ＢＬＡＳＴプログラムによる分析によってＯＲ
Ｆ１がＰａｒＡと称される安定化タンパク質をコード
し、かつＯＲＦ２がＲｅｐＡと称される複製タンパク質
をコードすることが明らかになった。ＯＲＦ１をｐａｒ
Ａ遺伝子をして、かつＯＲＦ２をｒｅｐＡ遺伝子として
示す。クローニングした断片のＤＮＡ配列を配列番号１
に再現する。ＤＮＡ配列から推測される安定化タンパク
質ＰａｒＡのアミノ酸配列を配列番号２に示し、かつ複
製タンパク質ＲｅｐＡの推測されたアミノ酸配列を図３
に示す。
のＤＮＡ断片の二本鎖ＤＮＡ配列決定の目的のために、
ＤＮＡを“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカート
リッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”
（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベル
ク、ドイツ、１９９７）の教示に従って単離した。配列
決定および引き続いてのコーディング領域分析によって
配列決定したＤＮＡ断片上に２つのオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）が明らかとなった。図３はｐＴＥ
Ｔ３−Ｒｅｐの配列決定したＤＮＡ断片の制限地図を示
しており、これは２つの同定されたＯＲＦの位置も示し
ている。ＢＬＡＳＴプログラムによる分析によってＯＲ
Ｆ１がＰａｒＡと称される安定化タンパク質をコード
し、かつＯＲＦ２がＲｅｐＡと称される複製タンパク質
をコードすることが明らかになった。ＯＲＦ１をｐａｒ
Ａ遺伝子をして、かつＯＲＦ２をｒｅｐＡ遺伝子として
示す。クローニングした断片のＤＮＡ配列を配列番号１
に再現する。ＤＮＡ配列から推測される安定化タンパク
質ＰａｒＡのアミノ酸配列を配列番号２に示し、かつ複
製タンパク質ＲｅｐＡの推測されたアミノ酸配列を図３
に示す。
【００５４】例３ ｐＴＥＴ３レプリコンのコリネバクテリウム グルタミ
クムＡＴＣＣ１３０３２中でのコピー数の決定 プラスミドｐＴＥＴ３−Ｒｅｐのコピー数を決定するた
めに、細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３０３２［ｐＴＥＴ３−Ｒｅｐ］を２５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを有するＬＢ培地１００ｍｌ中で３０℃
で２０時間培養した。次いで株の全ＤＮＡをタウチ他
（プラスミド３４、１１９−１３１（１９９５））によ
る方法を使用して２５ｍｌの細菌培養から単離した。得
られたＤＮＡを３７℃で２０分間ＲＮアーゼ／ＤＮアー
ゼ不含（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マ
ンハイム、ドイツ）で処理し、かつフェノール抽出後に
０．８％のアガロースゲル中で電気泳動によって分離し
た。エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルをＵ
Ｖ光下にサイバーテックＣＳ１カメラシステム（Cybert
ech CS1 camera system）（サイバーテックＧｍｂＨ、
ベルリン、ドイツ）によって写真を撮り、ネガ画像をＨ
Ｐスキャンジェット６１００Ｃ／Ｔオプティカルスキャ
ナー（ヒューレット−パッカードＣｏ、パロアルト、Ｃ
Ａ、ＵＳＡ）でディジタル化した。ＤＮＡのバンド密度
をサイバーテックＧｍｂＨ社のウィンカムコンピュータ
システム（Wincam computer system）を使用してデンシ
トメトリーによって定量した。コピー数はミワ他（農業
化学および生物化学４８，２９０１−２９０３（１９８
４））の方法によって３０８２ｋｂのクロモソームサイ
ズ（バーゼ他、分子および一般遺伝学２５２，２５５−
２６５（１９９６））を想定して計算し、これによって
プラスミドｐＴＥＴ３−Ｒｅｐに関してクロモソームあ
たり１５プラスミドの値がコリネバクテリウム グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０３２において示された。
クムＡＴＣＣ１３０３２中でのコピー数の決定 プラスミドｐＴＥＴ３−Ｒｅｐのコピー数を決定するた
めに、細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３０３２［ｐＴＥＴ３−Ｒｅｐ］を２５μｇ／ｍｌ
のカナマイシンを有するＬＢ培地１００ｍｌ中で３０℃
で２０時間培養した。次いで株の全ＤＮＡをタウチ他
（プラスミド３４、１１９−１３１（１９９５））によ
る方法を使用して２５ｍｌの細菌培養から単離した。得
られたＤＮＡを３７℃で２０分間ＲＮアーゼ／ＤＮアー
ゼ不含（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マ
ンハイム、ドイツ）で処理し、かつフェノール抽出後に
０．８％のアガロースゲル中で電気泳動によって分離し
た。エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルをＵ
Ｖ光下にサイバーテックＣＳ１カメラシステム（Cybert
ech CS1 camera system）（サイバーテックＧｍｂＨ、
ベルリン、ドイツ）によって写真を撮り、ネガ画像をＨ
Ｐスキャンジェット６１００Ｃ／Ｔオプティカルスキャ
ナー（ヒューレット−パッカードＣｏ、パロアルト、Ｃ
Ａ、ＵＳＡ）でディジタル化した。ＤＮＡのバンド密度
をサイバーテックＧｍｂＨ社のウィンカムコンピュータ
システム（Wincam computer system）を使用してデンシ
トメトリーによって定量した。コピー数はミワ他（農業
化学および生物化学４８，２９０１−２９０３（１９８
４））の方法によって３０８２ｋｂのクロモソームサイ
ズ（バーゼ他、分子および一般遺伝学２５２，２５５−
２６５（１９９６））を想定して計算し、これによって
プラスミドｐＴＥＴ３−Ｒｅｐに関してクロモソームあ
たり１５プラスミドの値がコリネバクテリウム グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０３２において示された。
【００５５】例４ プラスミドｐＣＲＹ４の複製領域の単離および配列決定 コリネ型細菌における新規のプラスミドｐＣＲＹ４の安
定複製のために必要なＤＮＡ領域を単離するために、プ
ラスミドＤＮＡをまずコリネバクテリウム グルタミク
ムＬＰ−６から細菌細胞のアルカリ処理によって単離し
た。実験方法は“ヌクレオボンド核酸精製キットおよび
カートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−
１）”（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデル
ベルク、ドイツ、１９９７）に関する教示に見いだすこ
とができる。コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６
の得られたＤＮＡ調製物を次いで０．８％のアガロース
ゲル中で分離し、かつｐＣＲＹ４プラスミドバンドの存
在に関して調査した。次いで新規のプラスミドｐＣＲＹ
４に相当する同定されたプラスミドバンドをアガロース
ゲルから再単離した（例１参照）。実験方法は、“アガ
ロースゲルからのＤＮＡ抽出のためのＱＩＡＥＸ ＩＩ
ハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ、１９９７）において見いだすことができる。次いで
再単離したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩ（ファ
ルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブル
ク、ドイツ）で消化し、かつ制限酵素ＳｐｈＩで切断さ
れたベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プラスミド
４０，１２６−１３９（１９９８））中にクローニング
した。ＤＮＡ制限処理および酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）を使用するＤＮＡライゲーションを製造者
の教示に従って実施した。次いでライゲーション混合物
をコリネ型細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２中に電気的に導入した。選択を２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地上で実施し
た。４８時間の３０℃でのインキュベーション後に、プ
ラスミドを有するコロニーを単離した。形質転換した細
菌細胞におけるプラスミドの存在はアルカリリシス法に
よって“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキットのためのプ
ラスミドミニハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒル
デン、ドイツ、１９９７）における教示に従って明らか
にした。単離されたプラスミドをｐＣＲＹ４−Ｒｅｐと
名付けた。ｐＣＲＹ４−Ｒｅｐの制限分析および得られ
た断片長さと既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分子量マ
ーカーＸ、ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、
マンハイム、ドイツ）との比較によってｐＣＲＹ４−Ｒ
ｅｐが約１９００ｂｐのＤＮＡ断片を有することが明ら
かとなった。
定複製のために必要なＤＮＡ領域を単離するために、プ
ラスミドＤＮＡをまずコリネバクテリウム グルタミク
ムＬＰ−６から細菌細胞のアルカリ処理によって単離し
た。実験方法は“ヌクレオボンド核酸精製キットおよび
カートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−
１）”（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデル
ベルク、ドイツ、１９９７）に関する教示に見いだすこ
とができる。コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６
の得られたＤＮＡ調製物を次いで０．８％のアガロース
ゲル中で分離し、かつｐＣＲＹ４プラスミドバンドの存
在に関して調査した。次いで新規のプラスミドｐＣＲＹ
４に相当する同定されたプラスミドバンドをアガロース
ゲルから再単離した（例１参照）。実験方法は、“アガ
ロースゲルからのＤＮＡ抽出のためのＱＩＡＥＸ ＩＩ
ハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ、１９９７）において見いだすことができる。次いで
再単離したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩ（ファ
ルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブル
ク、ドイツ）で消化し、かつ制限酵素ＳｐｈＩで切断さ
れたベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プラスミド
４０，１２６−１３９（１９９８））中にクローニング
した。ＤＮＡ制限処理および酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）を使用するＤＮＡライゲーションを製造者
の教示に従って実施した。次いでライゲーション混合物
をコリネ型細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２中に電気的に導入した。選択を２５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地上で実施し
た。４８時間の３０℃でのインキュベーション後に、プ
ラスミドを有するコロニーを単離した。形質転換した細
菌細胞におけるプラスミドの存在はアルカリリシス法に
よって“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキットのためのプ
ラスミドミニハンドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒル
デン、ドイツ、１９９７）における教示に従って明らか
にした。単離されたプラスミドをｐＣＲＹ４−Ｒｅｐと
名付けた。ｐＣＲＹ４−Ｒｅｐの制限分析および得られ
た断片長さと既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ分子量マ
ーカーＸ、ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、
マンハイム、ドイツ）との比較によってｐＣＲＹ４−Ｒ
ｅｐが約１９００ｂｐのＤＮＡ断片を有することが明ら
かとなった。
【００５６】ｐＣＲＹ４−Ｒｅｐからの約１９００ｂｐ
のＤＮＡ断片の二本鎖ＤＮＡ配列決定の目的のために、
ＤＮＡを“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカート
リッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”
（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベル
ク、ドイツ、１９９７）の教示に従って単離した。ＤＮ
Ａ配列決定およびコンピュータによるコーディング領域
分析によって配列決定されたＤＮＡ断片上に１つのオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）が同定できた。
図４はｐＣＲＹ４−Ｒｅｐの配列決定されたＤＮＡ断片
の制限地図を示し、これは同定されたＯＲＦの位置も示
している。ＢＬＡＳＴプログラムによる分析によってＯ
ＲＦ１は複製タンパク質（ＲｅｐＡ）をコードし、これ
はｒｅｐＡ遺伝子と称される。クローニングした断片の
ＤＮＡ配列を配列番号４として再現し、一方複製タンパ
ク質ＲｅｐＡの推測されるアミノ酸配列を配列番号５に
示す。
のＤＮＡ断片の二本鎖ＤＮＡ配列決定の目的のために、
ＤＮＡを“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカート
リッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”
（クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベル
ク、ドイツ、１９９７）の教示に従って単離した。ＤＮ
Ａ配列決定およびコンピュータによるコーディング領域
分析によって配列決定されたＤＮＡ断片上に１つのオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ１）が同定できた。
図４はｐＣＲＹ４−Ｒｅｐの配列決定されたＤＮＡ断片
の制限地図を示し、これは同定されたＯＲＦの位置も示
している。ＢＬＡＳＴプログラムによる分析によってＯ
ＲＦ１は複製タンパク質（ＲｅｐＡ）をコードし、これ
はｒｅｐＡ遺伝子と称される。クローニングした断片の
ＤＮＡ配列を配列番号４として再現し、一方複製タンパ
ク質ＲｅｐＡの推測されるアミノ酸配列を配列番号５に
示す。
【００５７】例５ コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
におけるｐＣＲＹ４レプリコンのコピー数の決定 プラスミドｐＣＲＹ４−Ｒｅｐのコピー数の決定のため
に、細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ
１３０３２［ｐＣＲＹ４−Ｒｅｐ］を２５μｇ／ｍｌの
カナマイシンを有するＬＢ培地１００ｍｌ中で３０℃で
２０時間培養した。該株の全ＤＮＡを細菌培養からタウ
チ他（プラスミド３４、１１９−１３１（１９９５））
による方法を使用して単離した。得られたＤＮＡを２０
μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含（ロッヒェデ
ィアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）
を使用して３７℃で２０分間処理し、かつフェノール抽
出後に０．８％アガロースゲル中で電気泳動によって分
離した。エチジウムブロミドで染色したアガロースゲル
をＵＶ光下にサイバーテックＣＳ１カメラシステム（サ
イバーテックＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）によって写
真を撮り、ネガ画像をＨＰスキャンジェット６１００Ｃ
／Ｔオプティカルスキャナー（ヒューレット−パッカー
ドＣｏ、パロアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）でディジタル化し
た。ＤＮＡのバンド密度をサイバーテックＧｍｂＨ社の
ウィンカムコンピュータシステムを使用してデンシトメ
トリーによって定量した。コピー数はミワ他（農業化学
および生物化学４８，２９０１−２９０３（１９８
４））の方法によって３０８２ｋｂのクロモソームサイ
ズ（バーゼ他、分子および一般遺伝学２５２，２５５−
２６５（１９９６））を想定して計算し、これによって
プラスミドｐＣＲＹ−Ｒｅｐに関してクロモソームあた
り３プラスミドの値がコリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２において示された。
におけるｐＣＲＹ４レプリコンのコピー数の決定 プラスミドｐＣＲＹ４−Ｒｅｐのコピー数の決定のため
に、細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ
１３０３２［ｐＣＲＹ４−Ｒｅｐ］を２５μｇ／ｍｌの
カナマイシンを有するＬＢ培地１００ｍｌ中で３０℃で
２０時間培養した。該株の全ＤＮＡを細菌培養からタウ
チ他（プラスミド３４、１１９−１３１（１９９５））
による方法を使用して単離した。得られたＤＮＡを２０
μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含（ロッヒェデ
ィアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）
を使用して３７℃で２０分間処理し、かつフェノール抽
出後に０．８％アガロースゲル中で電気泳動によって分
離した。エチジウムブロミドで染色したアガロースゲル
をＵＶ光下にサイバーテックＣＳ１カメラシステム（サ
イバーテックＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）によって写
真を撮り、ネガ画像をＨＰスキャンジェット６１００Ｃ
／Ｔオプティカルスキャナー（ヒューレット−パッカー
ドＣｏ、パロアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）でディジタル化し
た。ＤＮＡのバンド密度をサイバーテックＧｍｂＨ社の
ウィンカムコンピュータシステムを使用してデンシトメ
トリーによって定量した。コピー数はミワ他（農業化学
および生物化学４８，２９０１−２９０３（１９８
４））の方法によって３０８２ｋｂのクロモソームサイ
ズ（バーゼ他、分子および一般遺伝学２５２，２５５−
２６５（１９９６））を想定して計算し、これによって
プラスミドｐＣＲＹ−Ｒｅｐに関してクロモソームあた
り３プラスミドの値がコリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２において示された。
【００５８】例６ プラスミドｐＴＥＴ３の抗生物質耐性領域の単離および
配列決定 新規プラスミドｐＴＥＴ３またはｐＣＲＹ４における抗
生物質耐性領域を同定するために、耐性試験株コリネバ
クテリウム グルタミクムＬＰ−６および感受性対照株
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
をまず種々の抗生物質の存在および不在下に、種々の抗
生物質濃度で臨床研究所規格の国立委員会（the Nation
al Committee of Clinical Laboratory Standard）の実
験方法（臨床研究所規格の国立委員会、好気的に増殖す
る細菌のための希釈抗菌物質感受性試験のための方法；
承認規格、Ｍ７−Ａ４（１９９７））に従って培養し
た。該試験のために必要な抗生物質、就中テトラサイク
リン、スペクチノマイシンおよびサルファメトキサゾー
ルという抗生物質はシグマ−アルドリッヒヒェミーＧｍ
ｂＨ（ダイゼンホッフェン、ドイツ）から得られ、かつ
“承認規格Ｍ７−Ａ４”に記載された濃度で使用した。
該試験のために必要な栄養培地、“ミュラー−ヒントン
ブイヨン（MUELLER-HINTON bouillon）”はメルクＫＧ
ａＡ社（ダルムシュタット、ドイツ）から得られ、かつ
製造者の教示に従って使用した。“承認規格Ｍ７−Ａ
４”の方法を使用して、抑制濃度（第１表）の測定、お
よびテトラサイクリン、スペクチノマイシン、ストレプ
トマイシンおよびサルファメトキサゾールという抗生物
質に対する細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＬ
Ｐ−６の耐性の同定が可能である。アルカリリシス法
（“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカートリッジ
のユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”、クロン
テックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイ
ツ、１９９７）を使用するコリネバクテリウム グルタ
ミクムＬＰ−６から単離されたプラスミドＤＮＡを次い
でコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２中に電気的に導入した。選択は同定されたテトラサイ
クリン耐性の存在に関して直接、第１の選択においては
５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー
上で実施した。形質転換された細菌株コリネバクテリウ
ム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２におけるプラスミ
ドの存在をアルカリリシス法（“ヌクレオボンド核酸精
製キットおよびカートリッジのユーザーマニュアル（Ｐ
Ｔ３１６７−１）”、クロンテックラボラトリーＧｍｂ
Ｈ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）によって明ら
かにした。単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析およ
び得られた断片長さと既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ
分子量マーカーＸ、ロッヒェディアグノスティックスＧ
ｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）およびプラスミドｐＴＥ
Ｔ３のＤＮＡ断片との比較によって、テトラサイクリン
耐性を付与する形質転換されたプラスミドがプラスミド
ｐＴＥＴ３であることが判明した。形質転換した株をコ
リネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
［ｐＴＥＴ３］と名付けた。
配列決定 新規プラスミドｐＴＥＴ３またはｐＣＲＹ４における抗
生物質耐性領域を同定するために、耐性試験株コリネバ
クテリウム グルタミクムＬＰ−６および感受性対照株
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
をまず種々の抗生物質の存在および不在下に、種々の抗
生物質濃度で臨床研究所規格の国立委員会（the Nation
al Committee of Clinical Laboratory Standard）の実
験方法（臨床研究所規格の国立委員会、好気的に増殖す
る細菌のための希釈抗菌物質感受性試験のための方法；
承認規格、Ｍ７−Ａ４（１９９７））に従って培養し
た。該試験のために必要な抗生物質、就中テトラサイク
リン、スペクチノマイシンおよびサルファメトキサゾー
ルという抗生物質はシグマ−アルドリッヒヒェミーＧｍ
ｂＨ（ダイゼンホッフェン、ドイツ）から得られ、かつ
“承認規格Ｍ７−Ａ４”に記載された濃度で使用した。
該試験のために必要な栄養培地、“ミュラー−ヒントン
ブイヨン（MUELLER-HINTON bouillon）”はメルクＫＧ
ａＡ社（ダルムシュタット、ドイツ）から得られ、かつ
製造者の教示に従って使用した。“承認規格Ｍ７−Ａ
４”の方法を使用して、抑制濃度（第１表）の測定、お
よびテトラサイクリン、スペクチノマイシン、ストレプ
トマイシンおよびサルファメトキサゾールという抗生物
質に対する細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＬ
Ｐ−６の耐性の同定が可能である。アルカリリシス法
（“ヌクレオボンド核酸精製キットおよびカートリッジ
のユーザーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”、クロン
テックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイ
ツ、１９９７）を使用するコリネバクテリウム グルタ
ミクムＬＰ−６から単離されたプラスミドＤＮＡを次い
でコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２中に電気的に導入した。選択は同定されたテトラサイ
クリン耐性の存在に関して直接、第１の選択においては
５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー
上で実施した。形質転換された細菌株コリネバクテリウ
ム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２におけるプラスミ
ドの存在をアルカリリシス法（“ヌクレオボンド核酸精
製キットおよびカートリッジのユーザーマニュアル（Ｐ
Ｔ３１６７−１）”、クロンテックラボラトリーＧｍｂ
Ｈ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）によって明ら
かにした。単離されたプラスミドＤＮＡの制限分析およ
び得られた断片長さと既知の長さのＤＮＡ断片（ＤＮＡ
分子量マーカーＸ、ロッヒェディアグノスティックスＧ
ｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）およびプラスミドｐＴＥ
Ｔ３のＤＮＡ断片との比較によって、テトラサイクリン
耐性を付与する形質転換されたプラスミドがプラスミド
ｐＴＥＴ３であることが判明した。形質転換した株をコ
リネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
［ｐＴＥＴ３］と名付けた。
【００５９】単離された耐性試験株コリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］およ
び感受性対照株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ１３０３２を使用する種々の濃度のテトラサイクリ
ン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびサ
ルファメトキサゾールという抗生物質の存在下での臨床
研究所規格の国立委員会の教示による別の耐性試験によ
って、試験株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３０３２［ｐＴＥＴ３］がこれらの抗生物質に対し
て耐性であることが証明された（第１表）。
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］およ
び感受性対照株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ１３０３２を使用する種々の濃度のテトラサイクリ
ン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンおよびサ
ルファメトキサゾールという抗生物質の存在下での臨床
研究所規格の国立委員会の教示による別の耐性試験によ
って、試験株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３０３２［ｐＴＥＴ３］がこれらの抗生物質に対し
て耐性であることが証明された（第１表）。
【００６０】第１表 種々のコリネバクテリウム グルタミクム株の最少抑制
濃度（ｍｌあたりの抗生物質のμｇ）
濃度（ｍｌあたりの抗生物質のμｇ）
【００６１】
【表１】
【００６２】記号は以下のように定義する： ＞：最少抑制濃度が規定値より高い ≦：最少抑制濃度が規定値未満または規定値と等しい ｐＴＥＴ３の抗生物質耐性をアルカリリシス法（“ヌク
レオボンド核酸精製キットおよびカートリッジのユーザ
ーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”、クロンテックラ
ボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９
７）を使用してコリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］からプラスミドＤＮＡを
再単離することによって更に特徴付けた。次いでプラス
ミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｃＩ
（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フラ
イブルク、ドイツ）で開裂させ、エシェリキア コリの
クローニングベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プ
ラスミド４０，１２６−１３９（１９９８））またはｐ
ＵＶ１９（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂ
Ｈ、フライブルク、ドイツ）中にライゲーションした。
ＤＮＡ制限処理および酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ロッ
ヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ド
イツ）を使用するＤＮＡライゲーションを製造者の教示
に従って実施した。次いでライゲーション混合物を細菌
株エシェリキア コリＤＨ５αＭＣＲ（Tauch et al., F
EMS Microbiology Letters 123, 343-348 (1994)）中に
エレクトロポレーションで導入した。５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンまたは２５０μｇ／ｍｌのスペクチノマ
イシンを含有するＬＢアガー上で選択した後に、形質転
換されたコロニーが得られ、そのプラスミドベクターは
プラスミドｐＴＥＴ３からのＤＮＡ切片を有していた。
プラスミドベクターの存在をアルカリリシス法（“プラ
スミドＤＮＡのためのＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレ
ップハンドブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ド
イツ、１９９７）によって明らかにした。単離されたプ
ラスミドＤＮＡの制限分析および得られた断片の長さと
既知の長さのＤＮＡ断片との比較によって単離されたｐ
ＴＥＴ３−Ｈ９の名称のプラスミドはプラスミドベクタ
ーｐＫ１８ｍｏｂ２および約４０００ｂｐのｐＴＥＴ３
からのＤＮＡ断片からなり、かつｐＸＣＳ１０の名称の
単離されたプラスミドはプラスミドベクターｐＵＣ１９
（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フラ
イブルク、ドイツ）および約６７５０ｂｐのｐＴＥＴ３
からのＤＮＡ断片からなることが明らかとなった。制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩでのクローニングから得られるプラ
スミドベクターｐＴＥＴ３−Ｈ９はエシェリキア コリ
ＤＨ５αＭＣＲにテトラサイクリン耐性（５μｇ／ｍ
ｌ）を付与し、一方制限酵素ＳａｃＩでのクローニング
から得られるプラスミドベクターｐＸＣＳ１０はスペク
チノマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシ
ン（２５０μｇ／ｍｌ）およびサルファメトキサゾール
（３００μｇ／ｍｌ）の抗生物質に対する耐性を付与す
る。プラスミドベクターｐＴＥＴ３−Ｈ９およびｐＸＣ
Ｓ１０におけるｐＴＥＴ３のクローニングされたＤＮＡ
断片の制限分析の比較によって、更に両者のＤＮＡ断片
は約２４００ｂｐオーバーラップしており、従って約８
３５０ｂｐの長さの連続的ＤＮＡ鎖に組み合わせること
ができると判明した。
レオボンド核酸精製キットおよびカートリッジのユーザ
ーマニュアル（ＰＴ３１６７−１）”、クロンテックラ
ボラトリーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９
７）を使用してコリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］からプラスミドＤＮＡを
再単離することによって更に特徴付けた。次いでプラス
ミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｃＩ
（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フラ
イブルク、ドイツ）で開裂させ、エシェリキア コリの
クローニングベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（タウチ他、プ
ラスミド４０，１２６−１３９（１９９８））またはｐ
ＵＶ１９（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂ
Ｈ、フライブルク、ドイツ）中にライゲーションした。
ＤＮＡ制限処理および酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ロッ
ヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ド
イツ）を使用するＤＮＡライゲーションを製造者の教示
に従って実施した。次いでライゲーション混合物を細菌
株エシェリキア コリＤＨ５αＭＣＲ（Tauch et al., F
EMS Microbiology Letters 123, 343-348 (1994)）中に
エレクトロポレーションで導入した。５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンまたは２５０μｇ／ｍｌのスペクチノマ
イシンを含有するＬＢアガー上で選択した後に、形質転
換されたコロニーが得られ、そのプラスミドベクターは
プラスミドｐＴＥＴ３からのＤＮＡ切片を有していた。
プラスミドベクターの存在をアルカリリシス法（“プラ
スミドＤＮＡのためのＱＩＡＧＥＮプラスミドミニプレ
ップハンドブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ド
イツ、１９９７）によって明らかにした。単離されたプ
ラスミドＤＮＡの制限分析および得られた断片の長さと
既知の長さのＤＮＡ断片との比較によって単離されたｐ
ＴＥＴ３−Ｈ９の名称のプラスミドはプラスミドベクタ
ーｐＫ１８ｍｏｂ２および約４０００ｂｐのｐＴＥＴ３
からのＤＮＡ断片からなり、かつｐＸＣＳ１０の名称の
単離されたプラスミドはプラスミドベクターｐＵＣ１９
（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フラ
イブルク、ドイツ）および約６７５０ｂｐのｐＴＥＴ３
からのＤＮＡ断片からなることが明らかとなった。制限
酵素ＨｉｎｄＩＩＩでのクローニングから得られるプラ
スミドベクターｐＴＥＴ３−Ｈ９はエシェリキア コリ
ＤＨ５αＭＣＲにテトラサイクリン耐性（５μｇ／ｍ
ｌ）を付与し、一方制限酵素ＳａｃＩでのクローニング
から得られるプラスミドベクターｐＸＣＳ１０はスペク
チノマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシ
ン（２５０μｇ／ｍｌ）およびサルファメトキサゾール
（３００μｇ／ｍｌ）の抗生物質に対する耐性を付与す
る。プラスミドベクターｐＴＥＴ３−Ｈ９およびｐＸＣ
Ｓ１０におけるｐＴＥＴ３のクローニングされたＤＮＡ
断片の制限分析の比較によって、更に両者のＤＮＡ断片
は約２４００ｂｐオーバーラップしており、従って約８
３５０ｂｐの長さの連続的ＤＮＡ鎖に組み合わせること
ができると判明した。
【００６３】テトラサイクリン、スペクチノマイシンお
よびストレプトマイシンに対する耐性を付与するｐＴＥ
Ｔ３からの約７３００ｂｐの連続的なＤＮＡ断片の二本
鎖ＤＮＡ配列決定の目的のために、ＤＮＡを“プラスミ
ドＤＮＡ精製のためのＱＩＡｐｒｅｐミニプレップハン
ドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１
９９７）の教示に従ってプラスミドｐＴＥＴ３−Ｈ９お
よびｐＸＣＳ１０から単離した。配列決定および配列分
析の後に、４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）を配列決定されたＤＮＡ断片上に決定できた。図５
はｐＴＥＴ３の配列決定されたＤＮＡ領域の制限地図な
らびに同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）の位置を示している。分析によってＯＲＦ１がテト
ラサイクリン耐性リプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）
をコードするｔｅｔＲ遺伝子を表し、ＯＲＦ２がテトラ
サイクリン耐性タンパク質（ＴｅｔＡ）をコードするｔ
ｅｔＡ遺伝子を表し、ＯＲＦ３がスペクチノマイシン／
ストレプトマイシン耐性タンパク質（ＡａｄＡ）をコー
ドするａａｄＡ遺伝子を表し、かつＯＲＦ４がサルファ
メトキサゾール耐性タンパク質（ＳｕｌＩ）をコードす
るｓｕｌＩ遺伝子を表すことが明らかとなった。ｐＴＥ
Ｔ３の耐性領域のＤＮＡ配列を配列番号６に再現した。
配列データから推測されるテトラサイクリン耐性タンパ
ク質（ＴａｔＡ）のアミノ酸配列を配列番号７に示し、
配列データから推測されるスペクチノマイシン／ストレ
プトマイシン耐性タンパク質（ＡａｄＡ）のアミノ酸配
列を配列番号８に示す。テトラサイクリン耐性リプレッ
サータンパク質（ＴｅｔＲ）をコードするｔｅｔＲ遺伝
子のコーディング領域を配列番号９に示し、かつ推測さ
れるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
よびストレプトマイシンに対する耐性を付与するｐＴＥ
Ｔ３からの約７３００ｂｐの連続的なＤＮＡ断片の二本
鎖ＤＮＡ配列決定の目的のために、ＤＮＡを“プラスミ
ドＤＮＡ精製のためのＱＩＡｐｒｅｐミニプレップハン
ドブック”（キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１
９９７）の教示に従ってプラスミドｐＴＥＴ３−Ｈ９お
よびｐＸＣＳ１０から単離した。配列決定および配列分
析の後に、４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）を配列決定されたＤＮＡ断片上に決定できた。図５
はｐＴＥＴ３の配列決定されたＤＮＡ領域の制限地図な
らびに同定されたオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）の位置を示している。分析によってＯＲＦ１がテト
ラサイクリン耐性リプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）
をコードするｔｅｔＲ遺伝子を表し、ＯＲＦ２がテトラ
サイクリン耐性タンパク質（ＴｅｔＡ）をコードするｔ
ｅｔＡ遺伝子を表し、ＯＲＦ３がスペクチノマイシン／
ストレプトマイシン耐性タンパク質（ＡａｄＡ）をコー
ドするａａｄＡ遺伝子を表し、かつＯＲＦ４がサルファ
メトキサゾール耐性タンパク質（ＳｕｌＩ）をコードす
るｓｕｌＩ遺伝子を表すことが明らかとなった。ｐＴＥ
Ｔ３の耐性領域のＤＮＡ配列を配列番号６に再現した。
配列データから推測されるテトラサイクリン耐性タンパ
ク質（ＴａｔＡ）のアミノ酸配列を配列番号７に示し、
配列データから推測されるスペクチノマイシン／ストレ
プトマイシン耐性タンパク質（ＡａｄＡ）のアミノ酸配
列を配列番号８に示す。テトラサイクリン耐性リプレッ
サータンパク質（ＴｅｔＲ）をコードするｔｅｔＲ遺伝
子のコーディング領域を配列番号９に示し、かつ推測さ
れるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００６４】例７ プラスミドｐＴＥＴ３と公知のコリネ型プラスミドとの
コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に
おける共存 例６で作成した細菌株コリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］を使用して、コリ
ネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６からの新規のプ
ラスミドｐＴＥＴ３と公知のコリネ型プラスミドとの共
存を分析した。
コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に
おける共存 例６で作成した細菌株コリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３］を使用して、コリ
ネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６からの新規のプ
ラスミドｐＴＥＴ３と公知のコリネ型プラスミドとの共
存を分析した。
【００６５】該株のエレクトロコンピテントな細胞を作
成し、該株にコリネ型細菌の公知のプラスミドおよび選
択マーカー断片からなるプラスミドベクターを導入し
た。プラスミドベクターｐＧＡ１−ＫＥ１２、ｐＡＧ３
−Ｘｂａ、ｐＥＢＭ２（タウチ他、微生物学のアーカイ
ブ１６９，３０３−３１２（１９９８））、ｐＥＣＭ２
（Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123, 343
-348 (1994)）およびｐＥＣＭ３を前記のＤＮＡ導入の
ために選択した。プラスミドｐＧＡ１−ＫＥ１２はコリ
ネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６からの潜在プラ
スミドｐＧＡ１とベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（Tauch et
al., Plasmid 40, 126-139 (1998)）とのＥｃｏＲＩフ
ュージョンである。プラスミドｐＧＡ３ＸｂａはｐＡＧ
３とｐＫ１８ｍｏｂ２のＸｂａＩフュージョンである。
プラスミドｐＥＣＭ３はｐＥＣＭ２のＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ＩＩＩ欠失である。カナマイシン耐性を付与するプラス
ミドベクターｐＧＡ１−ＫＥ１２（ｐＧＡ１誘導体）、
ｐＡＧ３−Ｘｂａ（ｐＡＧ３誘導体）、ｐＥＢＭ２（ｐ
ＢＬ１誘導体）およびｐＥＣＭ２（ｐＨＭ１５１９誘導
体）の導入が完了したら、選択を２５μｇ／ｍｌのカナ
マイシンを含有するＬＢアガー上で実施した。クロラム
フェニコール耐性を付与するプラスミドｐＥＣＭ３、ｐ
ＨＭ１５１９誘導体を更に、プラスミドｐＴＥＴ３およ
びｐＥＢＭ２を有する得られた細菌株コリネバクテリウ
ム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐ
ＥＢＭ２］中に導入した。ＤＮＡの導入後に、選択を
７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（シグマ−ア
ルドリッヒヒェミーＧｍｂＨ、ダイゼンホッフェン、ド
イツ）を含有するＬＢアガー上で実施した。プラスミド
の導入の完了を確かめるために、プラスミドＤＮＡを得
られた株または形質転換体から単離し（“ヌクレオボン
ド核酸精製キットおよびカートリッジのユーザーマニュ
アル（ＰＴ３１６７−１）”、クロンテックラボラトリ
ーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）、か
つ０．８％アガロースゲル中で検出した。
成し、該株にコリネ型細菌の公知のプラスミドおよび選
択マーカー断片からなるプラスミドベクターを導入し
た。プラスミドベクターｐＧＡ１−ＫＥ１２、ｐＡＧ３
−Ｘｂａ、ｐＥＢＭ２（タウチ他、微生物学のアーカイ
ブ１６９，３０３−３１２（１９９８））、ｐＥＣＭ２
（Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123, 343
-348 (1994)）およびｐＥＣＭ３を前記のＤＮＡ導入の
ために選択した。プラスミドｐＧＡ１−ＫＥ１２はコリ
ネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６からの潜在プラ
スミドｐＧＡ１とベクターｐＫ１８ｍｏｂ２（Tauch et
al., Plasmid 40, 126-139 (1998)）とのＥｃｏＲＩフ
ュージョンである。プラスミドｐＧＡ３ＸｂａはｐＡＧ
３とｐＫ１８ｍｏｂ２のＸｂａＩフュージョンである。
プラスミドｐＥＣＭ３はｐＥＣＭ２のＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ＩＩＩ欠失である。カナマイシン耐性を付与するプラス
ミドベクターｐＧＡ１−ＫＥ１２（ｐＧＡ１誘導体）、
ｐＡＧ３−Ｘｂａ（ｐＡＧ３誘導体）、ｐＥＢＭ２（ｐ
ＢＬ１誘導体）およびｐＥＣＭ２（ｐＨＭ１５１９誘導
体）の導入が完了したら、選択を２５μｇ／ｍｌのカナ
マイシンを含有するＬＢアガー上で実施した。クロラム
フェニコール耐性を付与するプラスミドｐＥＣＭ３、ｐ
ＨＭ１５１９誘導体を更に、プラスミドｐＴＥＴ３およ
びｐＥＢＭ２を有する得られた細菌株コリネバクテリウ
ム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐ
ＥＢＭ２］中に導入した。ＤＮＡの導入後に、選択を
７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（シグマ−ア
ルドリッヒヒェミーＧｍｂＨ、ダイゼンホッフェン、ド
イツ）を含有するＬＢアガー上で実施した。プラスミド
の導入の完了を確かめるために、プラスミドＤＮＡを得
られた株または形質転換体から単離し（“ヌクレオボン
ド核酸精製キットおよびカートリッジのユーザーマニュ
アル（ＰＴ３１６７−１）”、クロンテックラボラトリ
ーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）、か
つ０．８％アガロースゲル中で検出した。
【００６６】前記のように、コリネバクテリウム グル
タミクムの以下の株を作成した： ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＧＡ１−ＫＥ１
２］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＡＧ３−Ｘｂ
ａ］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＥＢＭ２］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＥＣＭ２］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＥＢＭ２、ｐＥ
ＣＭ３］ 新規のプラスミドｐＴＥＴ３と公知のプラスミドベクタ
ーとの共存の他の証拠を提供するために、作成した株を
まず適当な抗生物質（５μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ン、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍ
ｌのクロラムフェニコール）を補ったＬＢ培地中で３０
℃で２４時間培養した。それぞれの培地１ｍｌ部を次い
で抗生物質不含のＬＢ培地で２回洗浄した。洗浄した細
菌懸濁液の希釈列（dilution seriese）をＬＢ培地中に
作成し、１０4細胞を有する０．１ｍｌの懸濁液をその
都度１００ｍｌの抗生物質不含および抗生物質含有のＬ
Ｂ培地上に移した。これらの培地を再度約２５世代にわ
たり３０℃で培養し、増殖を分光光度計（ファルマシア
ＬＫＢ ＮｏｖａｓｐｅｃＩＩ、ファルマシア、フライ
ブルク、ドイツ）を使用して５８０ｎｍの波長で光学密
度を測定することによってモニターした。前記の培養を
少なくとも８の光学密度（１の光学密度は１ｍｌあたり
４×１０8細胞に相当する）以下で培養した。次いでプ
ラスミドＤＮＡを培養から単離し、０．８％アガロース
ゲル中で分離した。得られたプラスミドバンドは両方の
培養条件において、すなわち抗生物質の存在および不在
において同一であり、それぞれはプラスミドｐＴＥＴ３
および形質転換されたプラスミドベクター、すなわちｐ
ＧＡ１−ＫＥ１２、ｐＡＧ３−Ｘｂａ、ｐＥＢＭ２、ｐ
ＥＣＭ２およびｐＥＣＭ２＋ｐＥＣＭ３の存在を示し
た。
タミクムの以下の株を作成した： ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＧＡ１−ＫＥ１
２］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＡＧ３−Ｘｂ
ａ］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＥＢＭ２］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＥＣＭ２］ ・ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＴＥＴ３、ｐＥＢＭ２、ｐＥ
ＣＭ３］ 新規のプラスミドｐＴＥＴ３と公知のプラスミドベクタ
ーとの共存の他の証拠を提供するために、作成した株を
まず適当な抗生物質（５μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ン、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍ
ｌのクロラムフェニコール）を補ったＬＢ培地中で３０
℃で２４時間培養した。それぞれの培地１ｍｌ部を次い
で抗生物質不含のＬＢ培地で２回洗浄した。洗浄した細
菌懸濁液の希釈列（dilution seriese）をＬＢ培地中に
作成し、１０4細胞を有する０．１ｍｌの懸濁液をその
都度１００ｍｌの抗生物質不含および抗生物質含有のＬ
Ｂ培地上に移した。これらの培地を再度約２５世代にわ
たり３０℃で培養し、増殖を分光光度計（ファルマシア
ＬＫＢ ＮｏｖａｓｐｅｃＩＩ、ファルマシア、フライ
ブルク、ドイツ）を使用して５８０ｎｍの波長で光学密
度を測定することによってモニターした。前記の培養を
少なくとも８の光学密度（１の光学密度は１ｍｌあたり
４×１０8細胞に相当する）以下で培養した。次いでプ
ラスミドＤＮＡを培養から単離し、０．８％アガロース
ゲル中で分離した。得られたプラスミドバンドは両方の
培養条件において、すなわち抗生物質の存在および不在
において同一であり、それぞれはプラスミドｐＴＥＴ３
および形質転換されたプラスミドベクター、すなわちｐ
ＧＡ１−ＫＥ１２、ｐＡＧ３−Ｘｂａ、ｐＥＢＭ２、ｐ
ＥＣＭ２およびｐＥＣＭ２＋ｐＥＣＭ３の存在を示し
た。
【００６７】例８ プラスミドｐＣＲＹ４と他のコリネ型プラスミドとのコ
リネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６における共存 ｐＣＲＹ４が既にプラスミドｐＧＡ１、ｐＧＡ２および
ｐＴＥＴ３と共存しているコリネバクテリウム グルタ
ミクムＬＰ−６を使用して、プラスミドｐＣＲＹ４と公
知のコリネ型プラスミドとの共存を分析した。
リネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６における共存 ｐＣＲＹ４が既にプラスミドｐＧＡ１、ｐＧＡ２および
ｐＴＥＴ３と共存しているコリネバクテリウム グルタ
ミクムＬＰ−６を使用して、プラスミドｐＣＲＹ４と公
知のコリネ型プラスミドとの共存を分析した。
【００６８】公知のコリネ型プラスミドと選択マーカー
断片からなる他のプラスミドベクターを前記の細菌株に
導入した。プラスミドベクターｐＡＧ３−Ｘｂａ、ｐＥ
ＢＭ２（タウチ他、微生物学のアーカイブ１６９，３０
３−３１２（１９９８））、ｐＥＣＭ３（Tauch et al
., FEMS Microbiology Letters 123, 343-348 (199
4)）およびｐＥＣＭ３を前記のＤＮＡ導入のために使用
した。プラスミドｐＥＣＭ３はｐＥＣＭ２のＢａｍＨＩ
−ＢｇＩＩＩ欠失である。プラスミドベクターｐＡＧ３
−Ｘｂａ（ｐＡＧ３誘導体）、ｐＥＢＭ２（ｐＢＬ１誘
導体）およびｐＥＣＭ２（ｐＨＭ１５１９誘導体）の導
入を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢアガ
ー上で選択した。クロラムフェニコール耐性を付与する
プラスミドｐＥＣＭ３、ｐＨＭ１５１９誘導体を更にｐ
ＧＡ１、ｐＧＡ２、ｐＴＥＴ３、ｐＣＲＹ４およびｐＥ
ＢＭ２を有する得られた細菌株コリネバクテリウム グ
ルタミクムＬＰ−６［ｐＥＢＭ２］中に導入した。ＤＮ
Ａ導入の後に、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコー
ルを含有するＬＢアガー上で選択を実施した。効率よい
プラスミド導入を確認するために、プラスミドＤＮＡを
得られた株または形質転換体から単離し（“ヌクレオボ
ンド核酸精製キットおよびカートリッジのユーザーマニ
ュアル（ＰＴ３１６７−１）”、クロンテックラボラト
リーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）、
０．８％アガロースゲル中で検出した。
断片からなる他のプラスミドベクターを前記の細菌株に
導入した。プラスミドベクターｐＡＧ３−Ｘｂａ、ｐＥ
ＢＭ２（タウチ他、微生物学のアーカイブ１６９，３０
３−３１２（１９９８））、ｐＥＣＭ３（Tauch et al
., FEMS Microbiology Letters 123, 343-348 (199
4)）およびｐＥＣＭ３を前記のＤＮＡ導入のために使用
した。プラスミドｐＥＣＭ３はｐＥＣＭ２のＢａｍＨＩ
−ＢｇＩＩＩ欠失である。プラスミドベクターｐＡＧ３
−Ｘｂａ（ｐＡＧ３誘導体）、ｐＥＢＭ２（ｐＢＬ１誘
導体）およびｐＥＣＭ２（ｐＨＭ１５１９誘導体）の導
入を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢアガ
ー上で選択した。クロラムフェニコール耐性を付与する
プラスミドｐＥＣＭ３、ｐＨＭ１５１９誘導体を更にｐ
ＧＡ１、ｐＧＡ２、ｐＴＥＴ３、ｐＣＲＹ４およびｐＥ
ＢＭ２を有する得られた細菌株コリネバクテリウム グ
ルタミクムＬＰ−６［ｐＥＢＭ２］中に導入した。ＤＮ
Ａ導入の後に、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコー
ルを含有するＬＢアガー上で選択を実施した。効率よい
プラスミド導入を確認するために、プラスミドＤＮＡを
得られた株または形質転換体から単離し（“ヌクレオボ
ンド核酸精製キットおよびカートリッジのユーザーマニ
ュアル（ＰＴ３１６７−１）”、クロンテックラボラト
リーＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ、１９９７）、
０．８％アガロースゲル中で検出した。
【００６９】前記のように以下のコリネバクテリウム
グルタミクムの株を作成した： ・ＬＰ−６［ｐＡＧ３−Ｘｂａ］ ・ＬＰ−６［ｐＥＢＭ２］ ・ＬＰ−６［ｐＥＣＭ２］ ・ＬＰ−６［ｐＥＢＭ２、ｐＥＣＭ３］ （受容株であるコリネバクテリウム グルタミクムＬＰ
−６は既にプラスミドｐＧＡ１、ｐＧＡ２、ｐＴＥＴ３
およびｐＣＲＹ４を有していることを留意すべきであ
る。） プラスミドｐＣＲＹ４と公知のプラスミドベクターとの
共存の他の証拠を提供するために、作成した株をまず適
当な抗生物質（５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、２５
μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのクロ
ラムフェニコール）を補ったＬＢ培地中で３０℃で２４
時間培養した。細菌培地１ｍｌ部を次いで抗生物質不含
のＬＢ培地で２回洗浄した。洗浄した細菌懸濁液の希釈
列をＬＢ培地中に作成し、１０4細胞を有する０．１ｍ
ｌの懸濁液をその都度１００ｍｌの抗生物質不含および
抗生物質含有のＬＢ培地上に移した。これらの培養を再
度約２５世代にわたり３０℃で培養し、増殖を分光光度
計（ファルマシアＬＫＢＮｏｖａｓｐｅｃＩＩ、ファル
マシア、フライブルク、ドイツ）を使用して５８０ｎｍ
の波長で光学密度を測定することによってモニターし
た。前記の培養を少なくとも８の光学密度（１の光学密
度は１ｍｌあたり４×１０8細胞に相当する）以下で培
養した。次いでプラスミドＤＮＡを培養から単離し、
０．８％アガロースゲル中で分離した。得られたプラス
ミドバンドは選択的および非選択的な培養条件におい
て、すなわち抗生物質の存在および不在において同一で
あり、それぞれはプラスミドｐＧＡ１、ｐＧＡ２、ｐＴ
ＥＴ３およびｐＣＲＹ４ならびに形質転換されたプラス
ミドベクター、すなわちｐＡＧ３−Ｘｂａ、ｐＥＢＭ
２、ｐＥＣＭ２およびｐＥＢＭ２＋ｐＥＣＭ３の存在を
示した。
グルタミクムの株を作成した： ・ＬＰ−６［ｐＡＧ３−Ｘｂａ］ ・ＬＰ−６［ｐＥＢＭ２］ ・ＬＰ−６［ｐＥＣＭ２］ ・ＬＰ−６［ｐＥＢＭ２、ｐＥＣＭ３］ （受容株であるコリネバクテリウム グルタミクムＬＰ
−６は既にプラスミドｐＧＡ１、ｐＧＡ２、ｐＴＥＴ３
およびｐＣＲＹ４を有していることを留意すべきであ
る。） プラスミドｐＣＲＹ４と公知のプラスミドベクターとの
共存の他の証拠を提供するために、作成した株をまず適
当な抗生物質（５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、２５
μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのクロ
ラムフェニコール）を補ったＬＢ培地中で３０℃で２４
時間培養した。細菌培地１ｍｌ部を次いで抗生物質不含
のＬＢ培地で２回洗浄した。洗浄した細菌懸濁液の希釈
列をＬＢ培地中に作成し、１０4細胞を有する０．１ｍ
ｌの懸濁液をその都度１００ｍｌの抗生物質不含および
抗生物質含有のＬＢ培地上に移した。これらの培養を再
度約２５世代にわたり３０℃で培養し、増殖を分光光度
計（ファルマシアＬＫＢＮｏｖａｓｐｅｃＩＩ、ファル
マシア、フライブルク、ドイツ）を使用して５８０ｎｍ
の波長で光学密度を測定することによってモニターし
た。前記の培養を少なくとも８の光学密度（１の光学密
度は１ｍｌあたり４×１０8細胞に相当する）以下で培
養した。次いでプラスミドＤＮＡを培養から単離し、
０．８％アガロースゲル中で分離した。得られたプラス
ミドバンドは選択的および非選択的な培養条件におい
て、すなわち抗生物質の存在および不在において同一で
あり、それぞれはプラスミドｐＧＡ１、ｐＧＡ２、ｐＴ
ＥＴ３およびｐＣＲＹ４ならびに形質転換されたプラス
ミドベクター、すなわちｐＡＧ３−Ｘｂａ、ｐＥＢＭ
２、ｐＥＣＭ２およびｐＥＢＭ２＋ｐＥＣＭ３の存在を
示した。
【００７０】例９ ｐＴＥＴ３からのプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１
の構築 唯一の成分の新規のプラスミドｐＴＥＴ３からなるプラ
スミドベクターを構築するために、コリネバクテリウム
グルタミクムＬＰ−６から全プラスミドＤＮＡを細菌
細胞のアルカリ処理（“ヌクレオボンド核酸精製キット
およびカートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６
７−１）”、クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイ
デルベルク、ドイツ、１９９７）によって単離した。次
いで得られたＤＮＡ調製物を０．８％アガロースゲル中
で分離した。新規プラスミドｐＴＥＴ３に相当するプラ
スミドバンドをアガロースゲルから再単離した（“アガ
ロースゲルからのＤＮＡ抽出のためのＱＩＡＥＸ ＩＩ
ハンドブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ）。次いで再単離したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｘ
ｈｏＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂ
Ｈ、フライブルク、ドイツ）で製造者の教示に従って消
化した。制限処理バッチを０．８％アガロースゲル中で
分離し、かつＤＮＡ配列データ（例６）によればテトラ
サイクリン耐性領域が配置されている約２５００ｂｐの
ＤＮＡを再単離した。次いで単離したｐＴＥＴ３のＤＮ
Ａを制限酵素ＡｖｒＩＩ（ニューイングランドバイオラ
ブスＧｍｂＨ、シュヴァルバッハ、ドイツ）およびＨｐ
ａＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、
フライブルク、ドイツ）で切断した。切断したバッチを
０．８％アガロースゲル中で分離し、ＤＮＡ配列決定情
報によればｐＴＥＴ３の複製領域が配置されている約４
５００ｂｐのＤＮＡ断片を再単離した。両者の再単離さ
れたＤＮＡ断片の突出ＤＮＡ末端を次いで酵素クレノウ
ポリメラーゼで充填した。酵素クレノウポリメラーゼで
の充填反応は製造者の教示に従って実施した。（ロッヒ
ェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイ
ツ）。充填されたＤＮＡ断片を次いで一緒に酵素Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（ロッヒェディアグノスティックスＧｍ
ｂＨ、マンハイム、ドイツ）によって製造者の教示に従
ってライゲーションした。ライゲーション混合物をコリ
ネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中に
エレクトロポレーションによって導入した。５μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー上で選択を
実施した。４８時間の３０℃でのインキュベーションの
後に、新規プラスミドベクターを有するコロニーを単離
した。形質転換した細菌細胞におけるプラスミドベクタ
ーの存在をアルカリリシス法（“ＱＩＡＧＥＮプラスミ
ドミニキットのためのプラスミドミニハンドブック”、
キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によ
って明らかにした。単離したプラスミドをｐＳＥＬＦ３
−１と名付けた。ｐＳＥＬＦ３−１の制限分析ならびに
得られた断片の長さと既知の長さのＤＮＡ断片との比較
によって図６として添付した制限地図が得られた。
の構築 唯一の成分の新規のプラスミドｐＴＥＴ３からなるプラ
スミドベクターを構築するために、コリネバクテリウム
グルタミクムＬＰ−６から全プラスミドＤＮＡを細菌
細胞のアルカリ処理（“ヌクレオボンド核酸精製キット
およびカートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６
７−１）”、クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイ
デルベルク、ドイツ、１９９７）によって単離した。次
いで得られたＤＮＡ調製物を０．８％アガロースゲル中
で分離した。新規プラスミドｐＴＥＴ３に相当するプラ
スミドバンドをアガロースゲルから再単離した（“アガ
ロースゲルからのＤＮＡ抽出のためのＱＩＡＥＸ ＩＩ
ハンドブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ）。次いで再単離したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｘ
ｈｏＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂ
Ｈ、フライブルク、ドイツ）で製造者の教示に従って消
化した。制限処理バッチを０．８％アガロースゲル中で
分離し、かつＤＮＡ配列データ（例６）によればテトラ
サイクリン耐性領域が配置されている約２５００ｂｐの
ＤＮＡを再単離した。次いで単離したｐＴＥＴ３のＤＮ
Ａを制限酵素ＡｖｒＩＩ（ニューイングランドバイオラ
ブスＧｍｂＨ、シュヴァルバッハ、ドイツ）およびＨｐ
ａＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、
フライブルク、ドイツ）で切断した。切断したバッチを
０．８％アガロースゲル中で分離し、ＤＮＡ配列決定情
報によればｐＴＥＴ３の複製領域が配置されている約４
５００ｂｐのＤＮＡ断片を再単離した。両者の再単離さ
れたＤＮＡ断片の突出ＤＮＡ末端を次いで酵素クレノウ
ポリメラーゼで充填した。酵素クレノウポリメラーゼで
の充填反応は製造者の教示に従って実施した。（ロッヒ
ェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイ
ツ）。充填されたＤＮＡ断片を次いで一緒に酵素Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（ロッヒェディアグノスティックスＧｍ
ｂＨ、マンハイム、ドイツ）によって製造者の教示に従
ってライゲーションした。ライゲーション混合物をコリ
ネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中に
エレクトロポレーションによって導入した。５μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー上で選択を
実施した。４８時間の３０℃でのインキュベーションの
後に、新規プラスミドベクターを有するコロニーを単離
した。形質転換した細菌細胞におけるプラスミドベクタ
ーの存在をアルカリリシス法（“ＱＩＡＧＥＮプラスミ
ドミニキットのためのプラスミドミニハンドブック”、
キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によ
って明らかにした。単離したプラスミドをｐＳＥＬＦ３
−１と名付けた。ｐＳＥＬＦ３−１の制限分析ならびに
得られた断片の長さと既知の長さのＤＮＡ断片との比較
によって図６として添付した制限地図が得られた。
【００７１】前記の構築方法により、プラスミドｐＳＥ
ＬＦ３−１は新規のプラスミドｐＴＥＴ３のＤＮＡ断片
のみからなり、従ってコリネバクテリウム グルタミク
ムのみから由来するＤＮＡである。
ＬＦ３−１は新規のプラスミドｐＴＥＴ３のＤＮＡ断片
のみからなり、従ってコリネバクテリウム グルタミク
ムのみから由来するＤＮＡである。
【００７２】例１０ プラスミドベクターｐＳＥＬＦ１−１の構築 プラスミドベクターｐＳＥＬＦ１−１を公知のプラスミ
ドｐＧＡ１（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）から、ｐＴＥ
Ｔ３からのテトラサイクリン耐性遺伝子（例１〜６参
照）を使用して作成した。
ドｐＧＡ１（ＵＳ−Ａ５１７５１０８号）から、ｐＴＥ
Ｔ３からのテトラサイクリン耐性遺伝子（例１〜６参
照）を使用して作成した。
【００７３】この目的のために、コリネバクテリウム
グルタミクムＬＰ−６の全プラスミドＤＮＡをまず細菌
細胞のアルカリ処理（“ヌクレオボンド核酸精製キット
およびカートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６
７−１）”、クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイ
デルベルク、ドイツ、１９９７）によって単離した。次
いで得られたＤＮＡ調製物を０．８％アガロースゲル中
で分離した。公知のプラスミドｐＧＡ１および新規プラ
スミドｐＴＥＴ３に相当するプラスミドバンドをアガロ
ースゲルから再単離した（“アガロースゲルからのＤＮ
Ａ抽出のためのＱＩＡＥＸ ＩＩハンドブック”、キア
ゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）。次いでｐＧＡ１か
ら再単離したＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩ（ファルマシア
バイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイ
ツ）で製造者の教示に従って消化した。単離されたｐＴ
ＥＴ３のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ（ファル
マシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブル
ク、ドイツ）で切断した。ｐＴＥＴ３の制限処理バッチ
を０．８％アガロースゲル中で分離し、かつＤＮＡ配列
決定データ（例６）によればテトラサイクリン耐性領域
が配置されている約２５００ｂｐのＤＮＡ断片を再単離
した。作成したｐＧＡ１のＤＮＡ断片および再単離した
ｐＴＥＴ３のＤＮＡ断片を一緒にＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）によって製造者の教示に従ってライゲーシ
ョンした。ライゲーション混合物をコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中にエレクトロポレ
ーションによって導入した。５μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含有するＬＢアガー上で選択を実施した。４８
時間の３０℃でのインキュベーションの後に、新規プラ
スミドベクターを有するコロニーを単離した。形質転換
した細菌細胞におけるプラスミドベクターの存在をアル
カリリシス法（“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキットの
ためのプラスミドミニハンドブック”、キアゲンＧｍｂ
Ｈ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によって明らかにし
た。単離したプラスミドをｐＳＥＬＦ１−１と名付け
た。ｐＳＥＬＦ１−１の制限分析ならびに得られた断片
の長さと既知の長さのＤＮＡ断片との比較によって図７
として添付した制限地図が得られた。
グルタミクムＬＰ−６の全プラスミドＤＮＡをまず細菌
細胞のアルカリ処理（“ヌクレオボンド核酸精製キット
およびカートリッジのユーザーマニュアル（ＰＴ３１６
７−１）”、クロンテックラボラトリーＧｍｂＨ、ハイ
デルベルク、ドイツ、１９９７）によって単離した。次
いで得られたＤＮＡ調製物を０．８％アガロースゲル中
で分離した。公知のプラスミドｐＧＡ１および新規プラ
スミドｐＴＥＴ３に相当するプラスミドバンドをアガロ
ースゲルから再単離した（“アガロースゲルからのＤＮ
Ａ抽出のためのＱＩＡＥＸ ＩＩハンドブック”、キア
ゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）。次いでｐＧＡ１か
ら再単離したＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩ（ファルマシア
バイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ドイ
ツ）で製造者の教示に従って消化した。単離されたｐＴ
ＥＴ３のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ（ファル
マシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブル
ク、ドイツ）で切断した。ｐＴＥＴ３の制限処理バッチ
を０．８％アガロースゲル中で分離し、かつＤＮＡ配列
決定データ（例６）によればテトラサイクリン耐性領域
が配置されている約２５００ｂｐのＤＮＡ断片を再単離
した。作成したｐＧＡ１のＤＮＡ断片および再単離した
ｐＴＥＴ３のＤＮＡ断片を一緒にＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（ロッヒェディアグノスティックスＧｍｂＨ、マンハイ
ム、ドイツ）によって製造者の教示に従ってライゲーシ
ョンした。ライゲーション混合物をコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中にエレクトロポレ
ーションによって導入した。５μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含有するＬＢアガー上で選択を実施した。４８
時間の３０℃でのインキュベーションの後に、新規プラ
スミドベクターを有するコロニーを単離した。形質転換
した細菌細胞におけるプラスミドベクターの存在をアル
カリリシス法（“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキットの
ためのプラスミドミニハンドブック”、キアゲンＧｍｂ
Ｈ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によって明らかにし
た。単離したプラスミドをｐＳＥＬＦ１−１と名付け
た。ｐＳＥＬＦ１−１の制限分析ならびに得られた断片
の長さと既知の長さのＤＮＡ断片との比較によって図７
として添付した制限地図が得られた。
【００７４】前記の構築方法により、プラスミドｐＳＥ
ＬＦ１−１はコリネバクテリウムグルタミクムのみから
由来するＤＮＡ断片のみからなる。
ＬＦ１−１はコリネバクテリウムグルタミクムのみから
由来するＤＮＡ断片のみからなる。
【００７５】例１１ ｐＳＥＬＦ１−１を使用するリジンの製造 コリネ型細菌におけるアミノ酸リジンの生合成に関連す
る遺伝子のコピー数を増大させるために、コリネバクテ
リウム グルタミクムからのｌｙｓＣ（ＦＢＲ）遺伝子
を選択した。ｌｙｓＣ（ＦＢＲ）遺伝子は代謝拮抗物質
Ｓ−（２−アミノエチル）システインに耐性な酵素アス
パラギン酸キナーゼの形をコードし、プラスミドベクタ
ーｐＪＣ３０（クレーマー他（Cremer et al）、応用お
よび環境微生物学５７，１７４６−１７５２（１９９
１））にクローニングされた形であった。
る遺伝子のコピー数を増大させるために、コリネバクテ
リウム グルタミクムからのｌｙｓＣ（ＦＢＲ）遺伝子
を選択した。ｌｙｓＣ（ＦＢＲ）遺伝子は代謝拮抗物質
Ｓ−（２−アミノエチル）システインに耐性な酵素アス
パラギン酸キナーゼの形をコードし、プラスミドベクタ
ーｐＪＣ３０（クレーマー他（Cremer et al）、応用お
よび環境微生物学５７，１７４６−１７５２（１９９
１））にクローニングされた形であった。
【００７６】ｌｙｓＣ（ＦＢＲ）遺伝子を例１０に記載
したプラスミドベクターｐＳＥＬＦ１−１中にクローニ
ングするために、ｐＳＥＬＦ１−１およびｐＪＣ３０の
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩ
（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フラ
イブルク、ドイツ）で切断した。次いで制限処理バッチ
を酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ロッヒェディアグノステ
ィックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）で一緒にライ
ゲーションし、細菌株コリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２中に形質転換した。選択を５μｇ
／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー上で実
施した。プラスミドＤＮＡを形質転換したコロニーから
アルカリリシス法（“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキッ
トのためのプラスミドミニハンドブック”、キアゲンＧ
ｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によって再単離
した。このプラスミドＤＮＡの制限分析および既知の長
さのＤＮＡ断片との比較によって、プラスミドｐＳＥＬ
Ｆ１−ｌｙｓＣを単離し、これはプラスミドベクターｐ
ＳＥＬＦ１−１およびｌｙｓＣ（ＦＢＲ）遺伝子領域か
らなっていた。
したプラスミドベクターｐＳＥＬＦ１−１中にクローニ
ングするために、ｐＳＥＬＦ１−１およびｐＪＣ３０の
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩ
（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フラ
イブルク、ドイツ）で切断した。次いで制限処理バッチ
を酵素Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ロッヒェディアグノステ
ィックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）で一緒にライ
ゲーションし、細菌株コリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０３２中に形質転換した。選択を５μｇ
／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー上で実
施した。プラスミドＤＮＡを形質転換したコロニーから
アルカリリシス法（“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキッ
トのためのプラスミドミニハンドブック”、キアゲンＧ
ｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によって再単離
した。このプラスミドＤＮＡの制限分析および既知の長
さのＤＮＡ断片との比較によって、プラスミドｐＳＥＬ
Ｆ１−ｌｙｓＣを単離し、これはプラスミドベクターｐ
ＳＥＬＦ１−１およびｌｙｓＣ（ＦＢＲ）遺伝子領域か
らなっていた。
【００７７】プラスミドｐＳＥＬＦ１−ｌｙｓＣおよび
対照ベクターｐＳＥＬＦ１−１を株コリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中にエレクトロポレ
ーションによって形質転換した。次いでプラスミドの導
入をアルカリリシスおよびゲル電気泳動（“ＱＩＡＧＥ
Ｎプラスミドミニキットのためのプラスミドミニハンド
ブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９
９７）によって明らかにした。前記のように構築した株
ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＳＥＬＦ１−１］およびＡＴＣ
Ｃ１３０３２［ｐＳＥＬＦ１−ｌｙｓＣ］をリジンの製
造のために使用した。
対照ベクターｐＳＥＬＦ１−１を株コリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２中にエレクトロポレ
ーションによって形質転換した。次いでプラスミドの導
入をアルカリリシスおよびゲル電気泳動（“ＱＩＡＧＥ
Ｎプラスミドミニキットのためのプラスミドミニハンド
ブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９
９７）によって明らかにした。前記のように構築した株
ＡＴＣＣ１３０３２［ｐＳＥＬＦ１−１］およびＡＴＣ
Ｃ１３０３２［ｐＳＥＬＦ１−ｌｙｓＣ］をリジンの製
造のために使用した。
【００７８】両方の株をまず５μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含有するルリア−ベルタニ培地５０ｍｌ中で３
０℃で２４時間培養した。次いで培養１ｍｌ部をミネラ
ル培地（ブレエル他（Broeer et al）、応用および環境
微生物学５９、３１６−３２１（１９９３））で２回洗
浄し、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１０
０ｍｌのミネラル培地中に移し、３０℃で２４時間イン
キュベートした。培養上清５ｍｌを１３８００×ｇおよ
び４℃で１５分間ペレット化し、ミレックス−ＧＳ濾過
装置（Millex-GS filter unit）（０．２２μｍ、ミリ
ポアＳ．Ａ、モルシャイム、フランス）を使用して濾過
滅菌した。リジンを濾過した培養上清においてＨＰＬＣ
分析によってビュンテマイヤー他（Buentemeyer et a
l）の方法（細胞工学５、５７−６７（１９９１））を
使用して測定した。２４時間の培養後に得られたリジン
濃度を第２表にまとめる。
クリンを含有するルリア−ベルタニ培地５０ｍｌ中で３
０℃で２４時間培養した。次いで培養１ｍｌ部をミネラ
ル培地（ブレエル他（Broeer et al）、応用および環境
微生物学５９、３１６−３２１（１９９３））で２回洗
浄し、５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１０
０ｍｌのミネラル培地中に移し、３０℃で２４時間イン
キュベートした。培養上清５ｍｌを１３８００×ｇおよ
び４℃で１５分間ペレット化し、ミレックス−ＧＳ濾過
装置（Millex-GS filter unit）（０．２２μｍ、ミリ
ポアＳ．Ａ、モルシャイム、フランス）を使用して濾過
滅菌した。リジンを濾過した培養上清においてＨＰＬＣ
分析によってビュンテマイヤー他（Buentemeyer et a
l）の方法（細胞工学５、５７−６７（１９９１））を
使用して測定した。２４時間の培養後に得られたリジン
濃度を第２表にまとめる。
【００７９】第２表 種々のコリネバクテリウム グルタミクム株の培養上清
におけるリジン濃度
におけるリジン濃度
【００８０】
【表２】
【００８１】例１２ ｐＳＥＬＦ３−１を使用するパントテン酸の製造 コリネ型細菌のパントテン酸生合成に関連する遺伝子の
コピー数の増加のために、コリネバクテリウム グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０３２からのｐａｎＤ遺伝子を選択
した。ｐａｎＤ遺伝子は酵素Ｌ−アスパラギン酸α−デ
カルボキシラーゼをコードし、これはプラスミドベクタ
ーｐＮＤ１０（ドゥッシュ他（Dusch etal）、応用およ
び環境微生物学６５，１５３０−１５３９（１９９
９））にクローニングされた形であった。
コピー数の増加のために、コリネバクテリウム グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０３２からのｐａｎＤ遺伝子を選択
した。ｐａｎＤ遺伝子は酵素Ｌ−アスパラギン酸α−デ
カルボキシラーゼをコードし、これはプラスミドベクタ
ーｐＮＤ１０（ドゥッシュ他（Dusch etal）、応用およ
び環境微生物学６５，１５３０−１５３９（１９９
９））にクローニングされた形であった。
【００８２】ｐａｎＤ遺伝子を例９に記載の新規のプラ
スミドベクターｐＳＥＬＦ３−１中にクローニングする
ために、ｐＳＥＬＦ３−１のプラスミドＤＮＡを制限酵
素ＳａｃＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍ
ｂＨ、フライブルク、ドイツ）およびＢｓｔＺ１７Ｉ
（ニューイングランドバイオラブスＧｍｂＨ、シュヴァ
ルバッハ、ドイツ）で切断し、ｐＮＤ１０のプラスミド
ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｃＩ（ファルマシ
アバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ド
イツ）で製造者の教示に従って切断した。次いで制限処
理バッチを製造者の教示（ロッヒェディアグノスティッ
クスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に従って酵素Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを使用して一緒にライゲーションし、
細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２中に形質転換した。選択を５μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンを含有するＬＢアガー上で実施した。プラス
ミドＤＮＡをアルカリリシス（“ＱＩＡＧＥＮプラスミ
ドミニキットのためのプラスミドミニハンドブック”、
キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によ
って形質転換したコロニーから再単離した。単離したプ
ラスミドＤＮＡの制限分析および既知の長さのＤＮＡ断
片（ＤＮＡ分子量マーカーＸ、ロッヒェディアグノステ
ィックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）との比較によ
って、プラスミドｐＳＥＬＦ３−ｐａｎＤを単離し、こ
れはプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１およびｐａｎ
Ｄ遺伝子をコードするｐＮＤ１０の領域からなる。
スミドベクターｐＳＥＬＦ３−１中にクローニングする
ために、ｐＳＥＬＦ３−１のプラスミドＤＮＡを制限酵
素ＳａｃＩ（ファルマシアバイオテックヨーロッパＧｍ
ｂＨ、フライブルク、ドイツ）およびＢｓｔＺ１７Ｉ
（ニューイングランドバイオラブスＧｍｂＨ、シュヴァ
ルバッハ、ドイツ）で切断し、ｐＮＤ１０のプラスミド
ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｃＩ（ファルマシ
アバイオテックヨーロッパＧｍｂＨ、フライブルク、ド
イツ）で製造者の教示に従って切断した。次いで制限処
理バッチを製造者の教示（ロッヒェディアグノスティッ
クスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に従って酵素Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを使用して一緒にライゲーションし、
細菌株コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２中に形質転換した。選択を５μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンを含有するＬＢアガー上で実施した。プラス
ミドＤＮＡをアルカリリシス（“ＱＩＡＧＥＮプラスミ
ドミニキットのためのプラスミドミニハンドブック”、
キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によ
って形質転換したコロニーから再単離した。単離したプ
ラスミドＤＮＡの制限分析および既知の長さのＤＮＡ断
片（ＤＮＡ分子量マーカーＸ、ロッヒェディアグノステ
ィックスＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）との比較によ
って、プラスミドｐＳＥＬＦ３−ｐａｎＤを単離し、こ
れはプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１およびｐａｎ
Ｄ遺伝子をコードするｐＮＤ１０の領域からなる。
【００８３】コリネ型細菌中でのパントテネートの生産
の分析のために、構築したプラスミドベクターｐＳＥＬ
Ｆ３−ｐａｎＤおよび対照ベクターｐＳＥＬＦ３−１を
株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ（ザーム他、応用およ
び環境微生物学６５、１９７３−１９７９（１９９
９））中に形質転換した。次いでプラスミドの存在をア
ルカリリシス（“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキットの
ためのプラスミドミニハンドブック”、キアゲンＧｍｂ
Ｈ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によって明らかにし
た。前記のように構築した株ＡＴＣＣ１３０３２Δｉｌ
ｖＡ［ｐＳＥＬＦ３−１］およびＡＴＣＣ１３０３２Δ
ｉｌｖＡ［ｐＳＥＬＦ３−ｐａｎＤ］をパントテネート
の製造のために使用した。
の分析のために、構築したプラスミドベクターｐＳＥＬ
Ｆ３−ｐａｎＤおよび対照ベクターｐＳＥＬＦ３−１を
株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ（ザーム他、応用およ
び環境微生物学６５、１９７３−１９７９（１９９
９））中に形質転換した。次いでプラスミドの存在をア
ルカリリシス（“ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニキットの
ためのプラスミドミニハンドブック”、キアゲンＧｍｂ
Ｈ、ヒルデン、ドイツ、１９９７）によって明らかにし
た。前記のように構築した株ＡＴＣＣ１３０３２Δｉｌ
ｖＡ［ｐＳＥＬＦ３−１］およびＡＴＣＣ１３０３２Δ
ｉｌｖＡ［ｐＳＥＬＦ３−ｐａｎＤ］をパントテネート
の製造のために使用した。
【００８４】細菌株をまず５μｇ／ｍｌのテトラサイク
リンを含有するルリア−ベルタニ培地５０ｍｌ中で３０
℃で２４時間培養した。次いで１ｍｌ部の細菌培養を、
２ｍＭのイソロイシン（シグマ−アルドリッヒヒェミー
ＧｍｂＨ、ダイゼンホッフェン、ドイツ）が添加されて
いるＣＧＸＩＩ培地（カイルハウエル他（Kailhaueret
al）ジャーナルオブバクテリオロジー１７５，５５９５
−５６０３、（１９９３））で２回洗浄し、これを２ｍ
Ｍのイソロイシンおよび５μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンを有するＣＧＸＩＩ培地５０ｍｌ中に移し、３０℃で
２４時間培養した。該培地３ｍｌを２ｍＭのイソロイシ
ンを含有する他のＣＧＸＩＩ培地５０ｍｌに接種した。
該バッチを３０℃で２４時間インキュベートした後に、
細菌培養２０ｍｌを１２５０×ｇで１０分間ペレット化
した。次いで培養上清をミレックス−ＧＳ濾過装置
（０．２２μｍ、ミリポアＳ．Ａ、モルシャイム、フラ
ンス）で濾過滅菌した。パントテネート濃度を濾過した
培養上清中でディフコマニュアル（Difco Manual）、第
１０版（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガ
ン、ＵＳＡ）の教示に従って測定した。２４時間の培養
後に得られたパントテネート濃度を第３表にまとめる。
リンを含有するルリア−ベルタニ培地５０ｍｌ中で３０
℃で２４時間培養した。次いで１ｍｌ部の細菌培養を、
２ｍＭのイソロイシン（シグマ−アルドリッヒヒェミー
ＧｍｂＨ、ダイゼンホッフェン、ドイツ）が添加されて
いるＣＧＸＩＩ培地（カイルハウエル他（Kailhaueret
al）ジャーナルオブバクテリオロジー１７５，５５９５
−５６０３、（１９９３））で２回洗浄し、これを２ｍ
Ｍのイソロイシンおよび５μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンを有するＣＧＸＩＩ培地５０ｍｌ中に移し、３０℃で
２４時間培養した。該培地３ｍｌを２ｍＭのイソロイシ
ンを含有する他のＣＧＸＩＩ培地５０ｍｌに接種した。
該バッチを３０℃で２４時間インキュベートした後に、
細菌培養２０ｍｌを１２５０×ｇで１０分間ペレット化
した。次いで培養上清をミレックス−ＧＳ濾過装置
（０．２２μｍ、ミリポアＳ．Ａ、モルシャイム、フラ
ンス）で濾過滅菌した。パントテネート濃度を濾過した
培養上清中でディフコマニュアル（Difco Manual）、第
１０版（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガ
ン、ＵＳＡ）の教示に従って測定した。２４時間の培養
後に得られたパントテネート濃度を第３表にまとめる。
【００８５】第３表 種々のコリネバクテリウム グルタミクム株の培養上清
におけるパントテネート濃度
におけるパントテネート濃度
【００８６】
【表３】
【００８７】構築したプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３
−ｐａｎＤを使用して、株ＡＴＣＣ１３０３２Δｉｌｖ
Ａ［ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ、ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣ
Ｄ］（ザーム他、応用および環境微生物学６５、１９７
３−１９７９（１９９９））を改善した。この株は、既
に遺伝子ｉｌｖＢＮＣＤおよびｐａｎＢＣを有してお
り、これは公知のプラスミドベクターのパントテネート
生合成に有利な影響を与える。
−ｐａｎＤを使用して、株ＡＴＣＣ１３０３２Δｉｌｖ
Ａ［ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ、ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣ
Ｄ］（ザーム他、応用および環境微生物学６５、１９７
３−１９７９（１９９９））を改善した。この株は、既
に遺伝子ｉｌｖＢＮＣＤおよびｐａｎＢＣを有してお
り、これは公知のプラスミドベクターのパントテネート
生合成に有利な影響を与える。
【００８８】プラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−ｐａｎ
Ｄおよび対照ベクターｐＳＥＬＦ３−１を株ＡＴＣＣ１
３０３２ΔｉｌｖＡ［ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ、ｐＥＣ
Ｍ３ｉｌｖＢＮＣＤ］（ザーム他、応用および環境微生
物学６５、１９７３−１９７９（１９９９））中にエレ
クトロポレーションによって導入した。選択を５μｇ／
ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー上で実施
した。導入したプラスミドベクターおよび細菌株中に既
に存在するプラスミドの存在をアルカリリシス（“ＱＩ
ＡＧＥＮプラスミドミニキットのためのプラスミドミニ
ハンドブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ、１９９７）によって明らかにした。前記のように構
築した両者の株を前記のようにパントテネートの製造の
ために使用した。２４時間の培養後に培養上清中に得ら
れたパントテネート濃度を第４表にまとめる。
Ｄおよび対照ベクターｐＳＥＬＦ３−１を株ＡＴＣＣ１
３０３２ΔｉｌｖＡ［ｐＥＫＥｘ２ｐａｎＢＣ、ｐＥＣ
Ｍ３ｉｌｖＢＮＣＤ］（ザーム他、応用および環境微生
物学６５、１９７３−１９７９（１９９９））中にエレ
クトロポレーションによって導入した。選択を５μｇ／
ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢアガー上で実施
した。導入したプラスミドベクターおよび細菌株中に既
に存在するプラスミドの存在をアルカリリシス（“ＱＩ
ＡＧＥＮプラスミドミニキットのためのプラスミドミニ
ハンドブック”、キアゲンＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイ
ツ、１９９７）によって明らかにした。前記のように構
築した両者の株を前記のようにパントテネートの製造の
ために使用した。２４時間の培養後に培養上清中に得ら
れたパントテネート濃度を第４表にまとめる。
【００８９】第４表 種々のコリネバクテリウム グルタミクム株の上清中の
パントテネート濃度
パントテネート濃度
【００９０】
【表４】
【００９１】以下の図を添付する： ・図１：プラスミドｐＴＥＴ３の制限地図。
【００９２】・図２：プラスミドｐＣＲＹ４の制限地
図。
図。
【００９３】・図３：プラスミドｐＴＥＴ３の複製領域
の地図。
の地図。
【００９４】・図４：プラスミドｐＣＲＹ４の複製領域
の地図。
の地図。
【００９５】・図５：プラスミドｐＴＥＴ３の抗生物質
耐性領域の地図。
耐性領域の地図。
【００９６】・図６：プラスミドベクターｐＳＥＬＦ３
−１の地図。
−１の地図。
【００９７】・図７：プラスミドベクターｐＳＥＬＦ１
−１の地図。
−１の地図。
【００９８】規定の長さは近似であることを留意すべき
である。
である。
【００９９】使用される略語および用語は以下の意味を
有する： ｂｐｓ：塩基対 ＡｖｒＩＩ：制限酵素ＡｖｒＩＩの制限部位 ＣｌａＩ：制限酵素ＣｌａＩの制限部位 ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位 ＥｃｏＲＶ：制限酵素ＥｃｏＲＶの制限部位 ＦｓｐＩ：制限酵素ＦｓｐＩの制限部位 ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位 ＨｐａＩ：制限酵素ＨｐａＩの制限部位 ＭｕｎＩ：制限酵素ＭｕｎＩの制限部位 ＮｒｕＩ：制限酵素ＮｒｕＩの制限部位 ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの制限部位 ＳａｃＩ：制限酵素ＳａｃＩの制限部位 ＳａｃＩＩ：制限酵素ＳａｃＩＩの制限部位 ＳａｌＩ：制限酵素ＳａｌＩの制限部位 ＳｃａＩ：制限酵素ＳｃａＩの制限部位 ＳｍａＩ：制限酵素ＳｍａＩの制限部位 ＳｐｅＩ：制限酵素ＳｐｅＩの制限部位 ＳｐｈＩ：制限酵素ＳｐｈＩの制限部位 ＸｂａＩ：制限酵素ＸｂａＩの制限部位 ＸｈｏＩ：制限酵素ＸｈｏＩの制限部位 ａａｄＡ：スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐
性タンパク質のための遺伝子 ｐａｒＡ：安定化タンパク質ＰａｒＡのための遺伝子 ｓｕｌＩ：サルファメトキサゾール耐性タンパク質のた
めの遺伝子 ｒｅｐＡ：複製タンパク質ＲｅｐＡのための遺伝子 ｔｅｔＡ：テトラサイクリン耐性タンパク質のための遺
伝子 ｔｅｔＲ：テトラサイクリンリプレッサータンパク質の
ための遺伝子
有する： ｂｐｓ：塩基対 ＡｖｒＩＩ：制限酵素ＡｖｒＩＩの制限部位 ＣｌａＩ：制限酵素ＣｌａＩの制限部位 ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位 ＥｃｏＲＶ：制限酵素ＥｃｏＲＶの制限部位 ＦｓｐＩ：制限酵素ＦｓｐＩの制限部位 ＨｉｎｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位 ＨｐａＩ：制限酵素ＨｐａＩの制限部位 ＭｕｎＩ：制限酵素ＭｕｎＩの制限部位 ＮｒｕＩ：制限酵素ＮｒｕＩの制限部位 ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの制限部位 ＳａｃＩ：制限酵素ＳａｃＩの制限部位 ＳａｃＩＩ：制限酵素ＳａｃＩＩの制限部位 ＳａｌＩ：制限酵素ＳａｌＩの制限部位 ＳｃａＩ：制限酵素ＳｃａＩの制限部位 ＳｍａＩ：制限酵素ＳｍａＩの制限部位 ＳｐｅＩ：制限酵素ＳｐｅＩの制限部位 ＳｐｈＩ：制限酵素ＳｐｈＩの制限部位 ＸｂａＩ：制限酵素ＸｂａＩの制限部位 ＸｈｏＩ：制限酵素ＸｈｏＩの制限部位 ａａｄＡ：スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐
性タンパク質のための遺伝子 ｐａｒＡ：安定化タンパク質ＰａｒＡのための遺伝子 ｓｕｌＩ：サルファメトキサゾール耐性タンパク質のた
めの遺伝子 ｒｅｐＡ：複製タンパク質ＲｅｐＡのための遺伝子 ｔｅｔＡ：テトラサイクリン耐性タンパク質のための遺
伝子 ｔｅｔＲ：テトラサイクリンリプレッサータンパク質の
ための遺伝子
【０１００】
【０１０１】
【外１】
【０１０２】
【外２】
【０１０３】
【外３】
【０１０４】
【外４】
【０１０５】
【外５】
【０１０６】
【外６】
【０１０７】
【外７】
【０１０８】
【外８】
【０１０９】
【外９】
【０１１０】
【外１０】
【０１１１】
【外１１】
【０１１２】
【外１２】
【０１１３】
【外１３】
【０１１４】
【外１４】
【０１１５】
【外１５】
【０１１６】
【外１６】
【０１１７】
【外１７】
【０１１８】
【外１８】
【０１１９】
【外１９】
【０１２０】
【外２０】
【０１２１】
【外２１】
【０１２２】
【外２２】
【図１】図１はプラスミドｐＴＥＴ３の制限地図を示
す。
す。
【図２】図２はプラスミドｐＣＲＹ４の制限地図を示
す。
す。
【図３】図３はプラスミドｐＴＥＴ３の複製領域の地図
を示す。
を示す。
【図４】図４はプラスミドｐＣＲＹ４の複製領域の地図
を示す。
を示す。
【図５】図５はプラスミドｐＴＥＴ３の抗生物質耐性領
域の地図を示す。
域の地図を示す。
【図６】図６はプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３−１の
地図を示す。
地図を示す。
【図７】図７はプラスミドベクターｐＳＥＬＦ１−１の
地図を示す。
地図を示す。
ｂｐｓ 塩基対、 ＡｖｒＩＩ 制限酵素ＡｖｒＩＩの
制限部位、 ＣｌａＩ制限酵素ＣｌａＩの制限部位、
ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位、 Ｅｃｏ
ＲＶ 制限酵素ＥｃｏＲＶの制限部位、 ＦｓｐＩ 制
限酵素ＦｓｐＩの制限部位、 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位、 ＨｐａＩ 制限酵素Ｈ
ｐａＩの制限部位、 ＭｕｎＩ 制限酵素ＭｕｎＩの制
限部位、 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの制限部位、
ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの制限部位、 ＳａｃＩ
制限酵素ＳａｃＩの制限部位、 ＳａｃＩＩ 制限酵素
ＳａｃＩＩの制限部位、 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩ
の制限部位、 ＳｃａＩ制限酵素ＳｃａＩの制限部位、
ＳｍａＩ 制限酵素ＳｍａＩの制限部位、ＳｐｅＩ
制限酵素ＳｐｅＩの制限部位、 ＳｐｈＩ 制限酵素Ｓ
ｐｈＩの制限部位、 ＸｂａＩ 制限酵素ＸｂａＩの制
限部位、 ＸｈｏＩ 制限酵素ＸｈｏＩの制限部位、
ａａｄＡ スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐
性タンパク質のための遺伝子、 ｐａｒＡ 安定化タン
パク質ＰａｒＡのための遺伝子、 ｓｕｌＩ サルファ
メトキサゾール耐性タンパク質のための遺伝子、 ｒｅ
ｐＡ 複製タンパク質ＲｅｐＡのための遺伝子、 ｔｅ
ｔＡ テトラサイクリン耐性タンパク質のための遺伝
子、 ｔｅｔＲ テトラサイクリンリプレッサータンパ
ク質のための遺伝子
制限部位、 ＣｌａＩ制限酵素ＣｌａＩの制限部位、
ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位、 Ｅｃｏ
ＲＶ 制限酵素ＥｃｏＲＶの制限部位、 ＦｓｐＩ 制
限酵素ＦｓｐＩの制限部位、 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位、 ＨｐａＩ 制限酵素Ｈ
ｐａＩの制限部位、 ＭｕｎＩ 制限酵素ＭｕｎＩの制
限部位、 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの制限部位、
ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの制限部位、 ＳａｃＩ
制限酵素ＳａｃＩの制限部位、 ＳａｃＩＩ 制限酵素
ＳａｃＩＩの制限部位、 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩ
の制限部位、 ＳｃａＩ制限酵素ＳｃａＩの制限部位、
ＳｍａＩ 制限酵素ＳｍａＩの制限部位、ＳｐｅＩ
制限酵素ＳｐｅＩの制限部位、 ＳｐｈＩ 制限酵素Ｓ
ｐｈＩの制限部位、 ＸｂａＩ 制限酵素ＸｂａＩの制
限部位、 ＸｈｏＩ 制限酵素ＸｈｏＩの制限部位、
ａａｄＡ スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐
性タンパク質のための遺伝子、 ｐａｒＡ 安定化タン
パク質ＰａｒＡのための遺伝子、 ｓｕｌＩ サルファ
メトキサゾール耐性タンパク質のための遺伝子、 ｒｅ
ｐＡ 複製タンパク質ＲｅｐＡのための遺伝子、 ｔｅ
ｔＡ テトラサイクリン耐性タンパク質のための遺伝
子、 ｔｅｔＲ テトラサイクリンリプレッサータンパ
ク質のための遺伝子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/02 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 イェルン カリノフスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト レン バッハシュトラーセ 19 (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ヴァルトシュレスヒェン ２ (72)発明者 ゲオルク ティーアバッハ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト グン ストシュトラーセ 21
Claims (10)
- 【請求項１】 番号ＤＳＭ５８１６で寄託されているコ
リネバクテリウムグルタミクムの株から単離された互い
に和合性のプラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ４にお
いて、プラスミドｐＴＥＴ３は、 １．１ 長さ約２７．８ｋｂｐおよび図１に示される制
限地図、 １．２ 配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有す
る複製領域、 １．３ テトラサイクリン耐性を付与するｔｅｔＡ遺伝
子およびストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン
の耐性を付与するａａｄＡ遺伝子からなる配列番号６に
示される抗生物質耐性領域を特徴とし、かつプラスミド
ｐＣＲＹ４は、 １．４ 長さ約４８ｋｂｐおよび図２に示される制限地
図、および １．５ 配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有す
る複製領域 を特徴とする、プラスミドｐＴＥＴ３およびｐＣＲＹ
４。 - 【請求項２】 コリネ型細菌において自己複製可能な複
合プラスミドにおいて、該プラスミドが ２．１ これらのプラスミドのヌクレオチド配列の一部
または全体、 ２．２ プラスミドｐＴＥＴ３またはｐＣＲＹ４の１つ
から得られる少なくとも１つのＤＮＡ複製領域、 ２．３ Ｅ．コリ、Ｂ．サチリスまたはストレプトマイ
セスから得られ、かつそこで増加できる遺伝子断片、お
よび ２．４ 作用物質耐性の発現のための少なくとも１つの
領域 を有することを特徴とする複合プラスミド。 - 【請求項３】 プラスミドｐＴＥＴ３からの作用物質耐
性を有する、請求項２記載の複合プラスミド。 - 【請求項４】 プラスミドｐＧＡ１および／またはｐＧ
Ａ２のヌクレオチド配列の一部または全体を有する、請
求項３記載の複合プラスミド。 - 【請求項５】 ビタミン、ヌクレオチドまたはＬ−アミ
ノ酸の生合成経路からの遺伝子をコードし、かつコリネ
型細菌中で発現する少なくとも１つのＤＮＡ断片を有す
る、請求項２記載の複合プラスミド。 - 【請求項６】 コリネ型細菌中で自己複製可能であり、 ６．１ プラスミドｐＧＡ１、ｐＧＡ２、ｐＴＥＴ３ま
たはｐＣＲＹ４の１つから得られる少なくとも１つの複
製領域、 ６．２ プラスミドｐＴＥＴ３からの少なくとも１つの
作用物質耐性、および場合により ６．３ ビタミン、ヌクレオチドまたはＬ−アミノ酸の
生合成経路からの遺伝子をコードし、かつコリネ型細菌
中で発現する少なくとも１つのＤＮＡ断片 を含有するプラスミドベクター。 - 【請求項７】 長さ約７．０ｋｂｐおよび図６に記載さ
れる制限地図を有するプラスミドベクターｐＳＥＬＦ３
−１。 - 【請求項８】 長さ約７．３ｋｂｐおよび図７に記載さ
れる制限地図を有するプラスミドベクターｐＳＥＬＦ１
−１。 - 【請求項９】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンまたはＬ
−トレオニンをコリネ型細菌の発酵により製造するため
の方法において、請求項２から７までのいずれか１項記
載の１つ以上のプラスミドベクターを有する株を使用す
ることを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。 - 【請求項１０】 ビタミン、特にＤ−パントテン酸をコ
リネ型細菌の発酵によって製造するための方法におい
て、請求項７または８記載の１つ以上のプラスミドベク
ターを有する株を使用することを特徴とするビタミンの
製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19953206.0 | 1999-11-05 | ||
| DE19953206A DE19953206A1 (de) | 1999-11-05 | 1999-11-05 | Plasmide aus Corynebacterium glutamicum und deren Verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001178480A true JP2001178480A (ja) | 2001-07-03 |
Family
ID=7927972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000336502A Pending JP2001178480A (ja) | 1999-11-05 | 2000-11-02 | コリネバクテリウムグルタミクムからのプラスミドおよびその使用 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1097998B1 (ja) |
| JP (1) | JP2001178480A (ja) |
| KR (1) | KR20010070189A (ja) |
| CN (1) | CN1295127A (ja) |
| AT (1) | ATE394495T1 (ja) |
| AU (1) | AU6807700A (ja) |
| BR (1) | BR0005721A (ja) |
| CA (1) | CA2322657A1 (ja) |
| DE (2) | DE19953206A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0004275A2 (ja) |
| ID (1) | ID28192A (ja) |
| PL (1) | PL343703A1 (ja) |
| SK (1) | SK16462000A3 (ja) |
| ZA (1) | ZA200006271B (ja) |
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| KR100694389B1 (ko) * | 2004-12-30 | 2007-03-12 | 씨제이 주식회사 | 표적 유전자 변형 원핵 세포 생산 방법 |
| DE102010032484A1 (de) * | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Evonik Goldschmidt Gmbh | Zellen und Verfahren zur Herstellung von Rhamnolipiden |
| CN102191258A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-09-21 | 南京农业大学 | 水稻白叶枯病菌抗链霉素检测基因及其检测方法 |
| DE102012016716A1 (de) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-Inhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden |
| CN103374540B (zh) * | 2013-08-13 | 2015-04-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 谷氨酸棒杆菌及其应用 |
| US10400257B2 (en) | 2014-10-09 | 2019-09-03 | Cathay R&D Center Co., Ltd | Expression of recombinant tetracycline efflux pumps for the production of lysine or lysine-derived products, and methods and applications thereof |
| CN111019966B (zh) * | 2019-12-26 | 2023-01-24 | 华南农业大学 | 一种具有较高棒状杆菌复制能力的表达质粒及其构建方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4027453A1 (de) | 1990-08-30 | 1992-03-05 | Degussa | Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren |
| DE4400926C1 (de) * | 1994-01-14 | 1995-06-01 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Herstellung von L-Isoleucin mittels rekombinanter Mikroorganismen mit deregulierter Threonindehydratase |
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1999
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- 2000-10-11 AT AT00122056T patent/ATE394495T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-10-11 EP EP00122056A patent/EP1097998B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-10-25 AU AU68077/00A patent/AU6807700A/en not_active Abandoned
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