JP2000125886A - 改良された基質受容を有する（ｓ）―ヒドロキシニトリルリア―ゼ及びその使用方法 - Google Patents
改良された基質受容を有する（ｓ）―ヒドロキシニトリルリア―ゼ及びその使用方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/002—Nitriles (-CN)
- C12P13/004—Cyanohydrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Detergent Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 改良された基質受容を有する（Ｓ)-ヒドロキ
シニトリルリアーゼ及びその使用方法。 【解決手段】 改良された基質受容を有しかつ Hevea b
rasiliensis 又はManihot esculenta （Ｓ)-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼに由来する（Ｓ)-ヒドロキシニトリル
リアーゼに於て、活性中心に至る疎水性チャンネル内の
大きいアミノ酸残基１種又はそれ以上が、それよりも大
きくないアミノ酸残基で置き代えることを特徴とする、
上記リアーゼ。
シニトリルリアーゼ及びその使用方法。 【解決手段】 改良された基質受容を有しかつ Hevea b
rasiliensis 又はManihot esculenta （Ｓ)-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼに由来する（Ｓ)-ヒドロキシニトリル
リアーゼに於て、活性中心に至る疎水性チャンネル内の
大きいアミノ酸残基１種又はそれ以上が、それよりも大
きくないアミノ酸残基で置き代えることを特徴とする、
上記リアーゼ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】生物触媒（biological catal
yst)による化学反応の実施は、特にこれを使用する領域
でますます重要性を増している。その使用の際、酵素に
於てしばしば顕著である性質をキラル又はプロキラル成
分を用いる反応で２つの対掌体のうちの１つを優先的に
変換ことに利用することができる。
yst)による化学反応の実施は、特にこれを使用する領域
でますます重要性を増している。その使用の際、酵素に
於てしばしば顕著である性質をキラル又はプロキラル成
分を用いる反応で２つの対掌体のうちの１つを優先的に
変換ことに利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】酵素のこのグループは、ヒドロキシニト
リルリアーゼ（ＨＮＬ）族、特にHevea brasiliensis
ＨＮＬ（ＨｂＨＮＬ）及び Manihot esculenta ＨＮＬ
（ＨｅＨＮＬ）を包含する。この２つの酵素は、高い配
列同定を示し、“α／βヒドロラーゼ折りたたみ(fol
d)”タイプのたん白質に属する。このタイプは特徴的な
第三折りたたみ及び活性中心としてアスパラギン酸、セ
リン及びヒスヂジンを含有する、いわゆる触媒三つ組
（triad)軸を示す。この際、活性中心は、疎水性チャン
ネルの内部末端に位置する。
リルリアーゼ（ＨＮＬ）族、特にHevea brasiliensis
ＨＮＬ（ＨｂＨＮＬ）及び Manihot esculenta ＨＮＬ
（ＨｅＨＮＬ）を包含する。この２つの酵素は、高い配
列同定を示し、“α／βヒドロラーゼ折りたたみ(fol
d)”タイプのたん白質に属する。このタイプは特徴的な
第三折りたたみ及び活性中心としてアスパラギン酸、セ
リン及びヒスヂジンを含有する、いわゆる触媒三つ組
（triad)軸を示す。この際、活性中心は、疎水性チャン
ネルの内部末端に位置する。
【０００３】原則として、ＨｂＨＮＬ及びＭｅＨＮＬ
は、大多数のカルボニル化合物、たとえば脂肪族、脂環
式、不飽和、芳香族及びヘテロ芳香族アルデヒド及びケ
トンを対応する（Ｓ)-シアノヒドリンへ変換するのに適
する。ＨＮＬｓは絶えず（Ｓ)-シアノヒドリンを製造す
るためのバイオ触媒(biocatalyst) としてより一層の重
要性を増しているので、種々の試みがその触媒活性及び
基質受容を改良するために常になされている。今まで得
られているＨＮＬの基質受容は、大きい残基を有する出
発化合物の場合満足のいくものではなく、その結果とし
て対応するシアノヒドリンが低い変換率で及び（又は）
低い対掌体過剰(enantiomeric excess) で得られる。
は、大多数のカルボニル化合物、たとえば脂肪族、脂環
式、不飽和、芳香族及びヘテロ芳香族アルデヒド及びケ
トンを対応する（Ｓ)-シアノヒドリンへ変換するのに適
する。ＨＮＬｓは絶えず（Ｓ)-シアノヒドリンを製造す
るためのバイオ触媒(biocatalyst) としてより一層の重
要性を増しているので、種々の試みがその触媒活性及び
基質受容を改良するために常になされている。今まで得
られているＨＮＬの基質受容は、大きい残基を有する出
発化合物の場合満足のいくものではなく、その結果とし
て対応するシアノヒドリンが低い変換率で及び（又は）
低い対掌体過剰(enantiomeric excess) で得られる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の目
的は、改良された基質受容を有する（Ｓ)-ヒドロキシニ
トリルリアーゼを提供することにある。
的は、改良された基質受容を有する（Ｓ)-ヒドロキシニ
トリルリアーゼを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】それ故に、本発明は、変
えられた基質受容、特に特定の基質の場合に改良された
基質受容を有しかつ Hevea brasiliensis 及び Manihot
esculentaから得られる（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリア
ーゼに由来する（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼに於
いて、活性中心に至る疎水性チャンネル内の大きい(bul
ky) アミノ酸残基１種又はそれ以上を、それよりも大き
くない（less bulky) アミノ酸残基によって置き換える
ことを特徴とする、上記（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリア
ーゼに関する。
えられた基質受容、特に特定の基質の場合に改良された
基質受容を有しかつ Hevea brasiliensis 及び Manihot
esculentaから得られる（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリア
ーゼに由来する（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼに於
いて、活性中心に至る疎水性チャンネル内の大きい(bul
ky) アミノ酸残基１種又はそれ以上を、それよりも大き
くない（less bulky) アミノ酸残基によって置き換える
ことを特徴とする、上記（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリア
ーゼに関する。
【０００６】本発明によるＨＮＬは、Hevea brasiliens
is（ＨｂＨＮＬ）又は Manihotesculenta （ＭｅＨＮ
Ｌ）（Ｓ)-ＨＮＬｓの変異体であり、これは組換えで修
飾された微生物、たとえばピチアパストリス(Pichia pa
storis) 、サッカロマイセスセレヴィシアエ(Saccharom
yces cerevisiaｅ）又は大腸菌(Escherichia coli)から
得ることができる(WO 97/03204) 。
is（ＨｂＨＮＬ）又は Manihotesculenta （ＭｅＨＮ
Ｌ）（Ｓ)-ＨＮＬｓの変異体であり、これは組換えで修
飾された微生物、たとえばピチアパストリス(Pichia pa
storis) 、サッカロマイセスセレヴィシアエ(Saccharom
yces cerevisiaｅ）又は大腸菌(Escherichia coli)から
得ることができる(WO 97/03204) 。
【０００７】この場合、修飾すべき組換えＨＮＬｓは、
一部切りつめられている(truncated) 配列を有していて
もよく、この配列はたとえば配列中で第一アミノ酸を除
くことによって得られる。
一部切りつめられている(truncated) 配列を有していて
もよく、この配列はたとえば配列中で第一アミノ酸を除
くことによって得られる。
【０００８】変異体は、活性中心に至る疎水性チャンネ
ルを生じるこれらのアミノ酸の変性された配列を有す
る。
ルを生じるこれらのアミノ酸の変性された配列を有す
る。
【０００９】この場合、個々の大きいアミノ酸残基又は
いくつかの大きいアミノ酸残基は、それよりも大きくな
いアミノ酸残基に置き換えられる。
いくつかの大きいアミノ酸残基は、それよりも大きくな
いアミノ酸残基に置き換えられる。
【００１０】大きいアミノ酸残基としてトリプトファン
をこれよりも大きくないアミノ酸残基、たとえばアラニ
ン、グリシン、バリン又はフエニルアラニンで置き換え
るのが好ましい。
をこれよりも大きくないアミノ酸残基、たとえばアラニ
ン、グリシン、バリン又はフエニルアラニンで置き換え
るのが好ましい。
【００１１】特に好ましくは、ＨｂＨＮＬ又はＭｅＨＮ
Ｌの完全な配列の位置１２８のトリプトファンがアラニ
ン又はフエニルアラニンによって置き換えられている変
異体である。
Ｌの完全な配列の位置１２８のトリプトファンがアラニ
ン又はフエニルアラニンによって置き換えられている変
異体である。
【００１２】本発明によるＨＮＬｓを、組換えで修飾さ
れた微生物、たとえば Pichiapastoris, Saccharomyces
cerevisiae又は大腸菌中で、たとえば M. Hasslacher
等, J. Biol. Chem. 1996, 271, 5884又は Wajant, H.
及び Pfizenmaier, K.1996, J. Biol. Chem. 25830-248
34と同様に機能的に過発現させることによって産生す
る。この変異は、たとえばクイックチェンジサイト- 直
接変異誘発キット(Quick Change Site-Directed Mutage
nesis Kit ）（Stratagene) を用いて製造業者の仕様書
に従って行われる。このクイックチェンジサイト- 直接
変異誘発キットは、特定の変異体を産生するのにすぐに
使用できるシステムであり、たとえばストラータジーン
・クローニング・システム(Stratagene Cloning System
s)、La Jolla, ＣＡ（米国）によって市販されている。
れた微生物、たとえば Pichiapastoris, Saccharomyces
cerevisiae又は大腸菌中で、たとえば M. Hasslacher
等, J. Biol. Chem. 1996, 271, 5884又は Wajant, H.
及び Pfizenmaier, K.1996, J. Biol. Chem. 25830-248
34と同様に機能的に過発現させることによって産生す
る。この変異は、たとえばクイックチェンジサイト- 直
接変異誘発キット(Quick Change Site-Directed Mutage
nesis Kit ）（Stratagene) を用いて製造業者の仕様書
に従って行われる。このクイックチェンジサイト- 直接
変異誘発キットは、特定の変異体を産生するのにすぐに
使用できるシステムであり、たとえばストラータジーン
・クローニング・システム(Stratagene Cloning System
s)、La Jolla, ＣＡ（米国）によって市販されている。
【００１３】得られたＨＮＬｓを標準法、たとえば Waj
ant, H. Pfizenmaier, K., J. BiolChem. 1996, 25830-
25834 と同様に精製する。
ant, H. Pfizenmaier, K., J. BiolChem. 1996, 25830-
25834 と同様に精製する。
【００１４】本発明のＨＮＬｓは、従来技術に比して優
れた変換率及び（又は）より高い対掌体過剰で（Ｓ)-シ
アノヒドリンを産生するのに適する。
れた変換率及び（又は）より高い対掌体過剰で（Ｓ)-シ
アノヒドリンを産生するのに適する。
【００１５】本発明のＨＮＬｓを、特に脂肪族及び芳香
族アルデヒド及びケトンを基質として使用する場合に使
用する。
族アルデヒド及びケトンを基質として使用する場合に使
用する。
【００１６】この際、脂肪族アルデヒドは炭素原子２〜
２０個を有する飽和又は不飽和の、分枝状又は環状アル
デヒドであるのが好ましい。
２０個を有する飽和又は不飽和の、分枝状又は環状アル
デヒドであるのが好ましい。
【００１７】特に好ましくは、炭素原子４〜１８個を有
する飽和又は不飽和分枝状アルデヒドである。
する飽和又は不飽和分枝状アルデヒドである。
【００１８】脂肪族及び芳香族アルデヒドは、置換され
ていないか又は反応条件下に不活性である基、たとえば
場合により置換されたアリール- 又はヘテロアリール
基、たとえばフエニル基又はインドリル基、又はハロゲ
ン、エーテル、アルコール、アシル、カルボン酸、ニト
ロ又はアジド基によって置換されていてよい。
ていないか又は反応条件下に不活性である基、たとえば
場合により置換されたアリール- 又はヘテロアリール
基、たとえばフエニル基又はインドリル基、又はハロゲ
ン、エーテル、アルコール、アシル、カルボン酸、ニト
ロ又はアジド基によって置換されていてよい。
【００１９】適当な脂肪族アルデヒドとして、たとえば
ヘキサナル、ヘキセナル、ヘプタナル、プロパナル、オ
クタナル、オクテナル及び２- メチルプロパナルが挙げ
られる。
ヘキサナル、ヘキセナル、ヘプタナル、プロパナル、オ
クタナル、オクテナル及び２- メチルプロパナルが挙げ
られる。
【００２０】適当な芳香族又はヘテロ芳香族基質とし
て、たとえばベンズアルデヒド又は種々に置換されたベ
ンズアルデヒド、たとえば３- フエノキシベンズアルデ
ヒド、４- フルオロ-3- フエノキシベンズアルデヒド、
２- クロロベンズアルデヒド、２- ニトロベンズアルデ
ヒド、４- メチルベンズアルデヒド等々が挙げられる。
て、たとえばベンズアルデヒド又は種々に置換されたベ
ンズアルデヒド、たとえば３- フエノキシベンズアルデ
ヒド、４- フルオロ-3- フエノキシベンズアルデヒド、
２- クロロベンズアルデヒド、２- ニトロベンズアルデ
ヒド、４- メチルベンズアルデヒド等々が挙げられる。
【００２１】この基質を本発明のＨＮＬｓの存在下にシ
アニド基ドナーと反応させる。
アニド基ドナーと反応させる。
【００２２】適当なシアニド基ドナーは、シアン化水
素、アルカリ金属のシアン化物又は一般式 Ｒ1 Ｒ2 Ｃ（ＯＨ)(ＣＮ） Ｉ のシアノヒドリンである。
素、アルカリ金属のシアン化物又は一般式 Ｒ1 Ｒ2 Ｃ（ＯＨ)(ＣＮ） Ｉ のシアノヒドリンである。
【００２３】式Ｉに於て、Ｒ1 及びＲ2 は相互に独立し
て水素又は非置換の炭化水素残基を示すか又はＲ1 及び
Ｒ2 は一緒になって炭素原子４又は５個を有するアルキ
レン基を示す。但しこの際Ｒ1 及びＲ2 は同時に水素を
示さない。炭化水素残基は脂肪族又は芳香族、好ましく
は脂肪族基である。Ｒ1 及びＲ2 は炭素原子１〜６個を
有するアルキル基を示すのが好ましい。シアニド基ドナ
ーは、アセトンシアノヒドリンであるのが極めて好まし
い。
て水素又は非置換の炭化水素残基を示すか又はＲ1 及び
Ｒ2 は一緒になって炭素原子４又は５個を有するアルキ
レン基を示す。但しこの際Ｒ1 及びＲ2 は同時に水素を
示さない。炭化水素残基は脂肪族又は芳香族、好ましく
は脂肪族基である。Ｒ1 及びＲ2 は炭素原子１〜６個を
有するアルキル基を示すのが好ましい。シアニド基ドナ
ーは、アセトンシアノヒドリンであるのが極めて好まし
い。
【００２４】シアニド基ドナーを、公知方法によって製
造することができる。シアノヒドリン、特にアセトンシ
アノヒドリンも市場で入手することができる。
造することができる。シアノヒドリン、特にアセトンシ
アノヒドリンも市場で入手することができる。
【００２５】シアン化水素（ＨＣＮ），ＫＣＮ，ＮａＣ
Ｎ又はアセトンシアノヒドリンを、シアニド基ドナーと
して使用するのが好ましい。但しこの際シアン化水素を
使用するのが特に好ましい。
Ｎ又はアセトンシアノヒドリンを、シアニド基ドナーと
して使用するのが好ましい。但しこの際シアン化水素を
使用するのが特に好ましい。
【００２６】この場合、シアン化水素をその塩、たとえ
ばＮａＣＮ又はＫＣＮのうちの１つから、反応直前に遊
離し、物質そのものとして又は溶解された形で反応混合
物に加えることもできる。
ばＮａＣＮ又はＫＣＮのうちの１つから、反応直前に遊
離し、物質そのものとして又は溶解された形で反応混合
物に加えることもできる。
【００２７】反応を有機相、水性相又は２- 相システム
中で又はエマルジョン中で実施することができる。
中で又はエマルジョン中で実施することができる。
【００２８】使用される水性相は、本発明のＨＮＬを含
有する水溶液又は緩衝液である。この溶液又は緩衝液と
しては、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等
々が挙げられる。
有する水溶液又は緩衝液である。この溶液又は緩衝液と
しては、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等
々が挙げられる。
【００２９】使用される有機希釈剤は、水と混和しない
か又はほんの僅かしか混和しない脂肪族又は芳香族炭化
水素であってよく、これは場合によりハロゲン化された
アルコール、エーテル又はエステル又はそれらの混合物
であってよい。メチルｔ- ブチルエーテル（ＭＴＢ
Ｅ）、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル又は
酢酸エチル又はこれらの化合物の混合物を使用するのが
好ましい。
か又はほんの僅かしか混和しない脂肪族又は芳香族炭化
水素であってよく、これは場合によりハロゲン化された
アルコール、エーテル又はエステル又はそれらの混合物
であってよい。メチルｔ- ブチルエーテル（ＭＴＢ
Ｅ）、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル又は
酢酸エチル又はこれらの化合物の混合物を使用するのが
好ましい。
【００３０】この場合、本発明のＨＮＬｓを有機希釈剤
中にそのまま又は固定化して存在させることができる。
しかし反応を非固定化ＨＮＬを用いて２相系中で又はエ
マルジョン中で実施することもできる。
中にそのまま又は固定化して存在させることができる。
しかし反応を非固定化ＨＮＬを用いて２相系中で又はエ
マルジョン中で実施することもできる。
【００３１】
【実施例】次に本発明を例によって説明する。 〔例１〕位置１２８で変異されたＨｂＨＮＬの産生。
【００３２】特異変異体を Quik Change TM Site-Direc
ted Mutagenesis Kit (StratageneCloning Systems, La
Jolla, CA, USA) を用いて産生する。ＨＮＬたん白質
の位置１２８のアミノ酸交換とは別に、制限酵素Ａｃｃ
IIIに対する切断部位を、サイレント変異によって更に
導入する。
ted Mutagenesis Kit (StratageneCloning Systems, La
Jolla, CA, USA) を用いて産生する。ＨＮＬたん白質
の位置１２８のアミノ酸交換とは別に、制限酵素Ａｃｃ
IIIに対する切断部位を、サイレント変異によって更に
導入する。
【００３３】次のオリゴヌクレオチドをこの目的のため
に使用する： ａ）変異体Ｗ１２８Ａを産生するために：
に使用する： ａ）変異体Ｗ１２８Ａを産生するために：
【００３４】
【００３５】ｂ）変異体Ｗ１２８Ｆを産生するために：
【００３６】
【００３７】Hevea brasiliensis hnl遺伝子のｃＤＮＡ
を有する組換えプラスミドｐＨＮＬ１０４を変異誘発反
応に対する鋳型として使用する(plasmid preparation i
nanalogy with Hasslacher 等. 1996 J. Biol. Chem. 2
71, 5884)。次いで変異されたプラスミドで大腸菌を形
質転換する〔Epicurian Coli (登録商標) XL1 LaJolla,
CA,米国）。
を有する組換えプラスミドｐＨＮＬ１０４を変異誘発反
応に対する鋳型として使用する(plasmid preparation i
nanalogy with Hasslacher 等. 1996 J. Biol. Chem. 2
71, 5884)。次いで変異されたプラスミドで大腸菌を形
質転換する〔Epicurian Coli (登録商標) XL1 LaJolla,
CA,米国）。
【００３８】次いでプラスミドＤＮＡをいくつかの形質
転換体から単離し、変異と共に導入されたＡｃｃIII切
断部位の存在について制限酵素ＡｃｃIIIで調べる。次
いで正のクローンを、位置１２８の所望の変異の存在を
立証するために及び望まない変異がｈｎｌ遺伝子の他の
領域に導入される可能性を排除できるように、ｈｎｌｃ
ＤＮＡの領域で配列分析に付す。
転換体から単離し、変異と共に導入されたＡｃｃIII切
断部位の存在について制限酵素ＡｃｃIIIで調べる。次
いで正のクローンを、位置１２８の所望の変異の存在を
立証するために及び望まない変異がｈｎｌ遺伝子の他の
領域に導入される可能性を排除できるように、ｈｎｌｃ
ＤＮＡの領域で配列分析に付す。
【００３９】夫々の変異されたＨＮＬをコードするフラ
グメントを制限エンドヌクレアーゼＥCOＲＩによる消
化、次いでアガロースゲル電気泳動によって対応するプ
ラスミドから単離する。このフラグメントを発現ベクタ
ーｐＨＩＬ- Ｄ２のＤＮＡ(Invitrogen Corporation, C
arlsbad, CA,米国) に連結する。このＤＮＡはＥCOＲＩ
で線状化され、アルカリホスファターゼで脱ホスホリル
化されている。この組換えＤＮＡで大腸菌ＳＵＲＥ（登
録商標）（Stratagene clonong Systems, LaJolla, CA.
米国) を形質転換する。
グメントを制限エンドヌクレアーゼＥCOＲＩによる消
化、次いでアガロースゲル電気泳動によって対応するプ
ラスミドから単離する。このフラグメントを発現ベクタ
ーｐＨＩＬ- Ｄ２のＤＮＡ(Invitrogen Corporation, C
arlsbad, CA,米国) に連結する。このＤＮＡはＥCOＲＩ
で線状化され、アルカリホスファターゼで脱ホスホリル
化されている。この組換えＤＮＡで大腸菌ＳＵＲＥ（登
録商標）（Stratagene clonong Systems, LaJolla, CA.
米国) を形質転換する。
【００４０】プラスミドＤＮＡをもう一度いくつかの形
質転換体から産生し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ
を用いてｐＨＩＬ- Ｄ２の aoxI プロモーターに対する
hnlｃＤＮＡの存在及び（又は）配向について調べる。
質転換体から産生し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ
を用いてｐＨＩＬ- Ｄ２の aoxI プロモーターに対する
hnlｃＤＮＡの存在及び（又は）配向について調べる。
【００４１】適当なクローンからプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＮｏｔＩで線状化し、次いで電気形質転換(elect
rotransformation）によって Pichia pastoris 株ＧＳ
１１５に導入する。但しその選択は使用される宿主株の
ヒスチジン栄養要求の相補に対して行われる。この様に
して得られた形質転換体を次いで最小メタノール培地上
で減数増殖についてテストする。次いでいくつかのこの
様なＭｕｔS 形質転換体を、ＨＮＬたん白質を発現する
その能力に関してテストし、適する発現株を２つのＨＮ
Ｌ変異体の夫々に対して選択する。この処理は、Pichia
発現キット(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA,
米国) を用いる説明書中に詳述されている実験と同様に
行われる。Pichia pastoris ゲノムへのｈｎｌ ｃＤＮ
Ａの組込み及び２つの発現株中に特異変異の存在を、Ｐ
ＣＲによって増幅されたＤＮＡフラグメントを配列する
ことによって確かめる。Ausubel 等, Current Protocol
sin Molecular Biology, Vols. 1-3, Greene Publishin
g Associates 及び Wiley-Interscience,ニューヨーク,
1995, に記載された方法を用いて単離された染色体Ｄ
ＮＡは、ＰＣＲに対する鋳型として役立つ。ＰＣＲプラ
イマーの配列は次の通りである：
限酵素ＮｏｔＩで線状化し、次いで電気形質転換(elect
rotransformation）によって Pichia pastoris 株ＧＳ
１１５に導入する。但しその選択は使用される宿主株の
ヒスチジン栄養要求の相補に対して行われる。この様に
して得られた形質転換体を次いで最小メタノール培地上
で減数増殖についてテストする。次いでいくつかのこの
様なＭｕｔS 形質転換体を、ＨＮＬたん白質を発現する
その能力に関してテストし、適する発現株を２つのＨＮ
Ｌ変異体の夫々に対して選択する。この処理は、Pichia
発現キット(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA,
米国) を用いる説明書中に詳述されている実験と同様に
行われる。Pichia pastoris ゲノムへのｈｎｌ ｃＤＮ
Ａの組込み及び２つの発現株中に特異変異の存在を、Ｐ
ＣＲによって増幅されたＤＮＡフラグメントを配列する
ことによって確かめる。Ausubel 等, Current Protocol
sin Molecular Biology, Vols. 1-3, Greene Publishin
g Associates 及び Wiley-Interscience,ニューヨーク,
1995, に記載された方法を用いて単離された染色体Ｄ
ＮＡは、ＰＣＲに対する鋳型として役立つ。ＰＣＲプラ
イマーの配列は次の通りである：
PP5AOX1 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3' PP3AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3' 発現株を醗酵し、変異されたＨＮＬたん白質を Hasslac
her 等, 1997,Protein Expression and Purification,
11, 61-71に記載されている様に単離し、精製する。 〔例２〕位置１２８が変異されたＭｅＨＮＬの産生。
her 等, 1997,Protein Expression and Purification,
11, 61-71に記載されている様に単離し、精製する。 〔例２〕位置１２８が変異されたＭｅＨＮＬの産生。
【００４２】変異をクイックチェンジサイト- 直接変異
誘発キット（Stratagene CloningSystems, La Jolla, C
A,米国) を用いてｐＱＥ４- ＭｅＨＮＬｗｔに変える。
このために２個の相補プライマー──これはＭｅＨＮＬ
のヌクレオチド３８３- ４３５ (5' AAG CTT TTG GAG T
CG TTT CCT GAC GCG AGA GAC ACA GAG TAT TTT ACGTTC
AC 3')に相当し、所望の変異（下線部分）を含有する─
─を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、生
じる生成物をＤｐｎｌで処理する。次いで変異されたプ
ラスミドで大腸菌ＸＬ１ブルーを形質転換する。変異体
をＴ７ＤＮＡ分析システム(Pharmacia) を用いて Sange
r 等(1977) Proc. Natl. Acad. Sci.米国, 74, 5463-54
67 と同様に変化された測定法による配列分析によって
確かめる。 〔例３〕（Ｓ)-３- フエノキシベンズアルデヒドシアノ
ヒドリンの産生。
誘発キット（Stratagene CloningSystems, La Jolla, C
A,米国) を用いてｐＱＥ４- ＭｅＨＮＬｗｔに変える。
このために２個の相補プライマー──これはＭｅＨＮＬ
のヌクレオチド３８３- ４３５ (5' AAG CTT TTG GAG T
CG TTT CCT GAC GCG AGA GAC ACA GAG TAT TTT ACGTTC
AC 3')に相当し、所望の変異（下線部分）を含有する─
─を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、生
じる生成物をＤｐｎｌで処理する。次いで変異されたプ
ラスミドで大腸菌ＸＬ１ブルーを形質転換する。変異体
をＴ７ＤＮＡ分析システム(Pharmacia) を用いて Sange
r 等(1977) Proc. Natl. Acad. Sci.米国, 74, 5463-54
67 と同様に変化された測定法による配列分析によって
確かめる。 〔例３〕（Ｓ)-３- フエノキシベンズアルデヒドシアノ
ヒドリンの産生。
【００４３】（Ｓ)-3-フエノキシベンズアルデヒドシア
ノヒドリン（ＰＢＡＣ）が、ｍ- フエノキシベンズアル
デヒド（ＰＢＡ）１０又は５ｍｍｏｌ夫々とＨＣＮ１
４．４又は７．７ｍｍｏｌ夫々とｔ- ブチルメチルエー
テル（ＭＴＢＥ）中で、位置１２８がアラニンで置換さ
れているＭｅＨＮＬ Ｗ１２８Ａ又は組換えＭｅＨＮＬ
(J. Hughes等, Arch. Biochem. Biophys. 1994, 311
(2), pp. 496-502)又は組換えＨｂＨＮＬ−Ｅｘ．変異
体の存在下に反応させることによって得られる。
ノヒドリン（ＰＢＡＣ）が、ｍ- フエノキシベンズアル
デヒド（ＰＢＡ）１０又は５ｍｍｏｌ夫々とＨＣＮ１
４．４又は７．７ｍｍｏｌ夫々とｔ- ブチルメチルエー
テル（ＭＴＢＥ）中で、位置１２８がアラニンで置換さ
れているＭｅＨＮＬ Ｗ１２８Ａ又は組換えＭｅＨＮＬ
(J. Hughes等, Arch. Biochem. Biophys. 1994, 311
(2), pp. 496-502)又は組換えＨｂＨＮＬ−Ｅｘ．変異
体の存在下に反応させることによって得られる。
【００４４】このために、夫々の場合、酵素液１．３ｍ
ｌ（ＨｂＨＮＬの場合０．２６ｍｌ）を５０ｍｍｏｌク
エン酸ナトリウム緩衝液８．３ｍｌ、ｐＨ５．４（Ｈｂ
ＨＮＬの場合蒸留水９．７４ｍｌ）で希釈し、その後適
量のＰＢＡ（１．９８ｇ／１ｇ）及びＭＴＢＥ３又は
１．５ｍｌを加える。次いでアルデヒド０．０６ｍｌ
（ＨＣＮ／ｍｌ）を急速に滴加する。反応の経過を、Ｉ
Ｐモニターを用いてアルデヒド含有量の減少によって追
跡する。反応を２時間後停止する。後処理のために、反
応液を夫々の場合ＭＴＢＥ２．５ｍｌで希釈し、振とう
し、遠心分離する。その結果は表１に示される。
ｌ（ＨｂＨＮＬの場合０．２６ｍｌ）を５０ｍｍｏｌク
エン酸ナトリウム緩衝液８．３ｍｌ、ｐＨ５．４（Ｈｂ
ＨＮＬの場合蒸留水９．７４ｍｌ）で希釈し、その後適
量のＰＢＡ（１．９８ｇ／１ｇ）及びＭＴＢＥ３又は
１．５ｍｌを加える。次いでアルデヒド０．０６ｍｌ
（ＨＣＮ／ｍｌ）を急速に滴加する。反応の経過を、Ｉ
Ｐモニターを用いてアルデヒド含有量の減少によって追
跡する。反応を２時間後停止する。後処理のために、反
応液を夫々の場合ＭＴＢＥ２．５ｍｌで希釈し、振とう
し、遠心分離する。その結果は表１に示される。
【００４５】 *) １．５時間後 n.d. 測定されなかった 〔例４〕有機培地中で、Manihot esculenta からの組換
えＭｅＨＮＬ（野性型）と変異体ＭｅＨＮＬ Ｗ１２８
Ａの比較。
えＭｅＨＮＬ（野性型）と変異体ＭｅＨＮＬ Ｗ１２８
Ａの比較。
【００４６】例３と同様に、酵素３ｍｇ、ニトロセルロ
ース１００ｍｇ（２０ｍｍｏｌクエン酸塩緩衝液、ｐＨ
３．３で調製）、基質１ｍｍｏｌ及びＨＣＮ１５０μｌ
をジイソプロピルエーテル５ｍｌ中で反応させる。
ース１００ｍｇ（２０ｍｍｏｌクエン酸塩緩衝液、ｐＨ
３．３で調製）、基質１ｍｍｏｌ及びＨＣＮ１５０μｌ
をジイソプロピルエーテル５ｍｌ中で反応させる。
【００４７】その結果を表２中に示す。
【００４８】 表 ２ MeHNL W128A 基質 t(h) 収率 ee t(h) 収率 ee (%) (%) (%) (%) ノナナル 6 35 81.1 6 87.3 80.2 ヘプタナル 1 99 80 1 99.5 88 2-メチル- 4.5 89 93.6 4.5 99 96.6 ブタナル 2-ヘキセナル 3.2 21.1 >99 3.2 85 96 n-PBA 7 30 99 8 82 99 p-HBA 2 31 >99 2 60 >99 CPA 1 90.7 99 1 94.3 99 PPA 0.3 79 67 0.3 93 86 フエニル- 4 69.8 99 4 81.6 96 アセトン BMK 4.5 100 52 4.5 100 78 BEK 5 40 45 5 46 82 p-HBA p-ヒドロキシベンズアルデヒド PPA フエニルプロピオンアルデヒド CPA シクロペンテン-1- イルアセトアルデヒド BMK ブチル メチル ケトン BEK ブチル エチル ケトン 〔例５〕水性緩衝系中で組換えＭｅＨＮＬと変異体Ｍｅ
ＨＮＬ Ｗ１２８Ａを比較。
ＨＮＬ Ｗ１２８Ａを比較。
【００４９】例３と同様に、０．５Ｍクエン酸ナトリウ
ム緩衝液２．５ｍｌ中に基質０．５ｍｍｏｌと共にある
酵素１．２ｍｇをＫＣＮ １ｍｍｏｌと０．５Ｍクエン
酸ナトリウム緩衝液３．５ｍｌ、ｐＨ３．８中で反応さ
せる。
ム緩衝液２．５ｍｌ中に基質０．５ｍｍｏｌと共にある
酵素１．２ｍｇをＫＣＮ １ｍｍｏｌと０．５Ｍクエン
酸ナトリウム緩衝液３．５ｍｌ、ｐＨ３．８中で反応さ
せる。
【００５０】その結果を表３中に示す。 表 ３ MeHNL W128A 基質 t(h) 収率 ee t(h) 収率 ee (%) (%) (%) (%) FPBA 4 11 99 4 47 95 PBA 22 66 97 22 75 92 m-HBA 3 74 0 3 80 0 p-HBA 1 76 92 1 71 96 PPA 1.2 60 21 1.2 94 90 FPBA 4-フルオロ-3- フエノキシベンズアルデヒド
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハラルト・ヴアジャント ドイツ連邦共和国、70771 ラインフエル デン− エッヒターデインゲン、ゾンネン ビユール、２ (72)発明者 ペーター・ラウブル ドイツ連邦共和国、10965 ベルリン、カ ッツバッハストラーセ、32 (72)発明者 ジーグフリート・フエルスター ドイツ連邦共和国、70569 シュトウット ガルト、ボーゲンストラーセ、９エー (72)発明者 ホルガー・ビユーラー ドイツ連邦共和国、71640 ルートウイッ ヒスブルク、ルードルフ− グライナー− ストラーセ、14 (72)発明者 ヘルムート・シュウアーブ オーストリア国、8043グラーツ、マリアグ リューナーストラーセ、93 (72)発明者 クリストフ・クラッキー オーストリア国、8010グラーツ、アム・ド ミニカナーグルンド、38 (72)発明者 ウルリケ・ヴアーグナー オーストリア国、8010グラーツ、クレンガ ッセ、30 (72)発明者 エルンスト・シユタイナー オーストリア国、8144トーベルバート、バ ートストラーセ、11
Claims (9)
- 【請求項１】 改良された基質受容を有しかつ Hevea b
rasiliensis 又はManihot esculenta （Ｓ)-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼに由来する（Ｓ)-ヒドロキシニトリル
リアーゼに於て、大きいアミノ酸残基１個又はそれ以上
を、それよりも大きくないアミノ酸残基で置き代えるこ
とを特徴とする、上記リアーゼ。 - 【請求項２】 Hevea brasiliensis又は Manihot escul
entaから得られる組換え（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリア
ーゼに由来する、請求項１記載の（Ｓ)-ヒドロキシニト
リルリアーゼ。 - 【請求項３】 組換え（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアー
ゼの配列が完全な形であるか又は切りつめられている、
請求項２記載の（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ。 - 【請求項４】 大きいアミノ酸残基としてトリプトファ
ンをアラニン又はフエニルアラニンで置き代える、請求
項１記載の（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ。 - 【請求項５】 組換え（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアー
ゼの完全な配列の位置１２８のトリプトファン残基がア
ラニン又はフエニルアラニンによって置き代えられてい
る、請求項１ないし４のいずれかに記載の（Ｓ)-ヒドロ
キシニトリルリアーゼ。 - 【請求項６】 クイックチェンジサイト- 直接変異誘発
キットを用いて、活性中心に至る疎水性チャンネル内で
突然変異を行うことを特徴とする、請求項１記載の
（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼを製造する方法。 - 【請求項７】 （Ｓ)-シアノヒドリンを製造するため
に、請求項１記載の（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ
を使用する方法。 - 【請求項８】 脂肪族及び芳香族アルデヒド及びケトン
をシアニド基ドナーの存在下に請求項１記載の（Ｓ)-ヒ
ドロキシニトリルリアーゼと反応させることを特徴とす
る（Ｓ)-シアノヒドリンの製造方法。 - 【請求項９】 有機相、水性相又は２- 相系中で又はエ
マルジョン中で反応を遂行する、請求項８記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0115998A AT407397B (de) | 1998-07-02 | 1998-07-02 | (s)-hydroxynitrillyasen mit verbesserter substratakzeptanz und deren verwendung |
| AT1159/98 | 1998-07-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000125886A true JP2000125886A (ja) | 2000-05-09 |
| JP4430757B2 JP4430757B2 (ja) | 2010-03-10 |
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ID=3507883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18809499A Expired - Fee Related JP4430757B2 (ja) | 1998-07-02 | 1999-07-01 | 改良された基質受容を有する（ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ及びその使用方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0969095B1 (ja) |
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| AT (2) | AT407397B (ja) |
| CA (1) | CA2277594A1 (ja) |
| DE (1) | DE59910627D1 (ja) |
| DK (1) | DK0969095T3 (ja) |
| ES (1) | ES2227935T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005095602A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Novel modified s-hydroxynitrile lyase |
| WO2006041226A1 (ja) | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ |
| JP2006520201A (ja) * | 2003-03-20 | 2006-09-07 | ディーエスエム ファイン ケミカルズ オーストリア エヌエフジー ゲーエムベーハー アンド コーポレイション カーゲー | 改良された基質受容性を有するｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼ及びその使用 |
| JP2006320263A (ja) * | 2005-05-19 | 2006-11-30 | Nippon Shokubai Co Ltd | 新規高活性改変型ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ |
| WO2007037354A1 (ja) * | 2005-09-29 | 2007-04-05 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | 新規耐酸性改変型s-ヒドロキシニトリルリアーゼ |
| WO2008041272A1 (fr) | 2006-09-29 | 2008-04-10 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | S-hydroxynitrile lyase modifiÉe et hautement active inÉdite |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69928206T2 (de) | 1998-12-28 | 2006-08-03 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyasen |
| DE10255597B4 (de) * | 2002-11-28 | 2006-08-10 | Biospring Gmbh | Rekombinante Expression der (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in Mikroorganismen |
| WO2004090124A2 (en) * | 2003-04-14 | 2004-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Sequences encoding s-hydroxynitril lyases and their use in methods for the production of cyanohydrins |
| AT500910B1 (de) * | 2004-01-30 | 2006-11-15 | Dsm Fine Chem Austria Gmbh | Verfahren zur herstellung von beta-hydroxynitroverbindungen |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT396252B (de) * | 1991-10-31 | 1993-07-26 | Chemie Linz Gmbh | Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven herstellung optisch aktiver cyanhydrine |
| AT404837B (de) * | 1995-07-12 | 1999-03-25 | Chemie Linz Gmbh | (s)-hydroxynitrillyase aus hevea brasiliensis |
| DE19529116A1 (de) * | 1995-08-08 | 1997-03-06 | Chemie Linz Deutschland Gmbh I | (S)-Hydroxynitrillyase aus Hevea brasiliensis |
-
1998
- 1998-07-02 AT AT0115998A patent/AT407397B/de not_active IP Right Cessation
-
1999
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- 1999-06-15 EP EP99111574A patent/EP0969095B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-15 DK DK99111574T patent/DK0969095T3/da active
- 1999-06-15 DE DE59910627T patent/DE59910627D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-15 AT AT99111574T patent/ATE278022T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-06-30 CA CA002277594A patent/CA2277594A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-01 JP JP18809499A patent/JP4430757B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-01 US US09/345,773 patent/US6319697B1/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| JP2006520201A (ja) * | 2003-03-20 | 2006-09-07 | ディーエスエム ファイン ケミカルズ オーストリア エヌエフジー ゲーエムベーハー アンド コーポレイション カーゲー | 改良された基質受容性を有するｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼ及びその使用 |
| WO2005095602A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Novel modified s-hydroxynitrile lyase |
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