ES2227935T3 - (s) hidroxinitrilasas con aceptancia mejorada del substrato y su empleo. - Google Patents

(s) hidroxinitrilasas con aceptancia mejorada del substrato y su empleo.

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ES2227935T3 ES99111574T ES99111574T ES2227935T3 ES 2227935 T3 ES2227935 T3 ES 2227935T3 ES 99111574 T ES99111574 T ES 99111574T ES 99111574 T ES99111574 T ES 99111574T ES 2227935 T3 ES2227935 T3 ES 2227935T3
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Abstract

Nueva enzima (S)-hidroxinitrilo liasa mutante con aceptación mejorada que se utiliza para convertir aldehídos o cetonas en enzimas (S)- cianohidrina (S)-hidroxinilo liasas (HNL) y que comprende una Hevea brasiliensis o Manihot esculenta HNL en la cual se sustituyen uno o más aminoácidos voluminosos por otros aminoácidos menos voluminosos.

Description

(S)-Hidroxinitrilasas con aceptancia mejorada del substrato y su empleo.
La realización de reacciones químicas con ayuda de catalizadores biológicos adquiere cada vez mayor significado, ante todo en aquellos campos de aplicación, en los cuales puede aprovecharse la propiedad frecuentemente marcada en el caso de los enzimas, de transformar, preferentemente, uno de los dos enantiómeros en el caso de reacciones con componentes quirales o proquirales.
A este grupo de enzimas pertenece la familia de las hidroxinitrilasas (HNL), entre otras la HNL de Hevea brasiliensis (HbHLN) y Manihot esculenta (NeHNL). Ambos enzimas muestran una elevada identidad de secuencia y pertenecen a las proteínas del tipo "\alpha/\beta-Hydrolase fold", que presentan un pliegue terciario característico y una denominada triada catalítica con ácido asparagínico, serina e histidina como centro activo. En este caso el centro activo se encuentra en el extremo interno de un canal hidrófobo (U. Wagner et al., 1996,Structure, 4, 811- 822).
La HbHNL y MeHNL son adecuadas, en principio, para la conversión de una pluralidad de compuestos de carbonilo, tales como por ejemplo aldehídos y cetonas alifáticas, alicíclicas, insaturadas, aromáticas, así como heteroaromáticas, para dar las (S)-cianhidrinas correspondientes. Puesto que las HNLs han adquirido cada vez mayor significado como biocatalizadores para la obtención de (S)-cianhidrinas, se busca permanentemente la mejora de la actividad catalítica y la aceptancia del substrato. Las HNLs obtenibles hasta el presente presentan, especialmente, en el caso de eductos con restos bloqueantes una aceptancia del substrato que no es satisfactoria, por lo que las cianhidrinas correspondientes se obtienen con una baja velocidad de conversión y/o con un bajo exceso en enantiómeros.
La tarea de la invención consistía, por lo tanto, en poner a disposición (S)-hidroxinitrilasas con una aceptancia mejorada del substrato.
Por lo tanto constituyen el objeto de la invención (S)-hidroxinitrilasas con aceptancia mejorada del substrato, que se derivan de las que proceden de Hevea brasiliensis y Manihot esculenta (MeHNL), caracterizadas porque están substituidos uno o varios restos de triptofano, dentro del canal hidrófobo, que conduce al centro activo, por un resto de aminoácido del grupo formado por alanina, glicina, valina o fenilalanina.
Las HNLs, según la invención, son mutantes de las (S)-HNLs de Hevea brasiliensis (HbHNL) o de Manihot esculenta (MeHNL), que pueden obtenerse a partir de microorganismos genéticamente modificados tales como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o Escherichia coli (VVO 97/03204).
Las HNL's recombinantes a ser modificadas pueden estar presentes en este caso también en una secuencia acortada que se obtiene, por ejemplo, mediante eliminación del o de los primeros aminoácidos en la secuencia.
Los mutantes presentan una secuencia modificada de aquellos aminoácidos, que constituyen el canal hidrófobo que conduce hasta el centro activo.
En este caso uno o varios restos de triptofano están substituidos por un resto de aminoácido del grupo formado por alanina, glicina, valina o fenilalanina.
Son preferentes los mutantes que están substituidos en la posición 128 (triptofano) de la secuencia acortada de HbHNL o de MeHNL por alanina o por fenilalanina.
La obtención de las HNLs según la invención se lleva a cabo mediante sobre-expresión función en microorganismos genéticamente modificados tales como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o Escherichia coli, por ejemplo de manera análoga a la de M. Hasslacher et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 5884 o a la de Wajant, H. y Pfizenmaier, K. 1996, J. Biol. Chem., 25830 - 25834. La mutación se lleva a cabo, por ejemplo, por medio de Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. El Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit es un sistema listo para ser empleado para la obtención de mutantes específicos y se comercializa, por ejemplo, por la firma Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA (USA).
La purificación de las HNLs resultantes se lleva a cabo según los métodos establecidos, por ejemplo de manera análoga a la de Wajant, H. Pfizenmaier, K. 1996, J. Biol. Chem., 25830 - 25834.
Las HNLs según la invención son adecuadas para la obtención de (S)-cianhidrinas con velocidades de conversión mejoradas frente al estado de la técnica y/o con un mayor exceso en enantiómeros.
Especialmente las HNLs según la invención se emplean a modo de substrato en el caso de los aldehídos y de las cetonas alifáticas y aromáticas.
En este caso deben entenderse por aldehídos alifáticos preferentemente los aldehídos saturados o insaturados, ramificados o cíclicos con 2 hasta 20 átomos de carbono.
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Son especialmente preferentes los aldehídos saturados o insaturados, ramificados, con 4 hasta 18 átomos de carbono.
Los aldehídos alifáticos y aromáticos pueden estar insubstituidos o pueden estar substituidos por grupos inertes bajo las condiciones de la reacción, por ejemplo por grupos arilo o heteroarilo, substituidos en caso dado, tales como grupos fenilo o grupos indolilo, por grupos halógeno, éter, alcohol, acilo, carboxilo, nitro o azido.
Ejemplos de aldehídos alifáticos adecuados son hexanal, hexenal, heptanal, propanal, octanal, octenal, 2-metilpropanal.
Los substratos aromáticos o heteroaromáticos adecuados son, por ejemplo, benzaldehído o bien benzaldehídos substituidos de diversas maneras, tales como por ejemplo 3-fenoxibenzaldehído, 4-flúor-3-fenoxibenzaldehído, 2-clorobenzaldehído, 2-nitrobenzaldehído, 4-metilbenzaldehido, etc.
Los substratos se hacen reaccionar en presencia de las HNLs según la invención con un donador del grupo cianida.
Como donadores del grupo cianida entran en consideración ácido cianhídrico, cianuros alcalinos o una cianhidrina de la fórmula general
Fórmula IR_{1}R_{2}C(OH)(CN)
En la fórmula I, R_{1} y R_{2} significan, independientemente entre sí, hidrógeno o un grupo hidrocarbonado no substituido, o R_{1} y R_{2} significan conjuntamente un grupo alquilo con 4 o 5 átomos de carbono, sin que R_{1} y R_{2} signifiquen simultáneamente hidrógeno. Los grupos hidrocarbonados son grupos alifáticos o aromáticos, preferentemente alifáticos. Preferentemente R_{1} y R_{2} significan grupos alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, siendo muy especialmente preferente la acetona cianhidrina como donador de grupo cianida.
La obtención del donador de los grupos cianida puede llevarse a cabo según procedimientos conocidos. Las cianhidrinas, especialmente la acetona cianhidrina, pueden adquirirse en el comercio.
Como donadores de grupo cianida se emplearán, preferentemente, ácido cianhídrico (HCN), KCN, NaCN o acetona cianhidrina, de forma especialmente preferente se empleará el ácido cianhídrico.
El ácido cianhídrico puede liberarse en este caso también poco antes de la reacción a partir de sus sales tales como por ejemplo NaCN o KCN y añadirse a la mezcla de la reacción en substancia o en forma disuelta.
La reacción puede llevarse a cabo en sistema orgánico, acuoso o en sistema de 2 fases o en emulsión.
Como sistema acuoso se empleará una solución acuosa, que contenga la HNL según la invención o solución tampón. Ejemplos a este respecto son: el tampón de citrato de Na, el tampón de fosfato, etc.
Como disolventes orgánicos pueden emplearse hidrocarburos alifáticos o aromáticos, no miscibles con agua o solo ligeramente miscibles con agua, que estén halogenados en caso dado, alcoholes, éteres o ésteres o mezclas de los mismos. Preferentemente se emplearán el metil-terc.-butiléter (MTBE), el diisopropiléter, el dibutiléter y el acetato de etilo o sus mezclas.
Las HNLs según la invención pueden presentarse en este caso bien como tales o inmovilizadas en el diluyente orgánico, pudiéndose llevar a cabo la transformación sin embargo también en un sistema de dos fases o en emulsión con HNL no inmovilizada.
Ejemplo 1 Obtención de HbHNL mutada en la posición 128
Se prepararon mutantes específicos con empleo del QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stragagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA). Además de un intervalo de aminoácidos en la posición 128 de la proteína HNL se introdujo además, por medio de una mutación silenciosa, un punto de corte para el enzima de restricción AccIII.
Para ello se utilizaron los siguientes oligonucleótidos:
a) Para la obtención del mutante W128A:
W128AFOR: 5' GCTCATGGAGGTGTTTCCGGACGCAAAAGACACCACG 3'
W128AREV: 5' CGTGGTGTCTTTTGCGTCCGGAAACACCTCCCATGAGC 3'
b) Para la obtención del mutante W128F:
W128FFOR: 5' GCTCATGGAGGTGTTTCCGGACTTCAAAGACACCACG 3'
W128FREV: 5' CGTGGTGTCTTTGAAGTCCGGAAACACCTCCCATGAGC 3'
Como matriz para la reacción de mutagénesis se utilizó el plásmido recombinante pHNL104, que contiene cDNA del gen hnl de Hevea brasiliensis (obtención del plásmido análoga a la de Hasslacher et al. 1996 J. Biol. Chem. 271, 5884). El plásmido mutado se transformó a continuación en Escherichia coli (Epicurian) Coli®XL1-Blue supercompetent cells, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA).
A continuación se aisló el plásmido DNA a partir de varios transformantes y este se verificó con el enzima de restricción AccIII con relación a la presencia del punto de corte AccIII introducido con la mutación. Los clones positivos se sometieron a continuación a un análisis de secuencia en la zona del hnl- cDNA, para verificar la presencia de la mutación deseada en la posición 128 y para poder excluir que hayan sido introducidas mutaciones indeseables en otras zonas del gen hnl.
A continuación se obtuvo, a partir del plásmido correspondiente, mediante digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI y subsiguiente electrofóresis con gel de agarosa, un fragmento que codifica la HNL mutada correspondiente. Este fragmento se ligó en el DNA, linealizado con EcoRI y desfosforilado con fosfatasa alcalina, del vector de expresión pHIL-D2 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) y se transformó el DNA recombinante en Escherichia coli SURE®(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA).
Nuevamente se preparó el plásmido DNA a partir de varios transformantes y se verificó la presencia o bien la orientación del hnl cDNA con relación al promotor aoxI de pHIL-D2 con ayuda de la endonucleasa de restricción NdeI. A continuación se linealizó el plásmido DNA procedente de clones adecuados con el enzima de restricción NotI y se introdujo a continuación, por medio de electrotransformación, en la cepa GS115 de Pichia pastoris, seleccionándose sobre el complemento de la histidina de la cepa huésped empleada. Los transformantes obtenidos de este modo se verificaron a continuación con respecto al crecimiento reducido sobre Minimal Methanol Medium. A continuación se ensayaron varios de estos transformantes Mut^{S} en lo que se refiere a su capacidad para la expresión de la proteína HNL, y se eligió una cepa de expresión adecuada para cada uno de los dos mutantes HNL. Estos trabajos se llevaron a cabo de manera análoga a la de los experimentos descritos detalladamente en el manual del Pichia Expression Kit (Invitrogen Corporation, Carisbad, CA, USA).
La integración del hnl cDNA en el genoma de Pichia pastoris y la presencia de la mutación específica en ambas cepas de expresión se verificó mediante secuenciado de un fragmento de DNA amplificado con PCR. Como matriz para la PCR sirvió DNA cromosómico, que se había aislado según los métodos descritos por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vols, 1-3, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1995. Las secuencias del iniciador PCR eran las siguientes:
PP5AOX1 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3'
PP3AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3'.
La fermentación de las cepas de expresión, así como el aislamiento y la purificación de las proteínas HNL mutadas se llevaron a cabo de la manera descrita por Hasslacher et al. 1997, Protein Expression and Purification, 11, 61-71.
Ejemplo 2 Obtención de MeHNL mutada en la posición 128
La mutación se transformó en pQE4-MeHNLwt por medio del Quick-Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA). Para ello se prolongaron 2 iniciadores complementarios, de acuerdo con los nucleótidos 383-435 de MeHNL (5'AAG CTT TTG GAG TCG TTT CCT GAC GCG AGA GAC ACA GAG TAT TTT ACG TTC AC 3'), que contienen la mutación deseada (diferente) por medio de la Pfu DNA polimerasa y el producto, obtenido de este modo, se trató con Dpnl. Los plásmidos mutados se transformaron a continuación en E.coli XL1-Blue.
Los mutantes se controlaron mediante análisis de secuencia por medio de un método modificado de determinación análogo al de Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467 con sistema de análisis T7DNA (Pharmacia).
Ejemplo 3 Obtención de la (S)-3-fenoxibenzaldehídocianhidrina
La (S)-3-fenoxibenzaldehídocianhidrina (PBAC) se obtuvo mediante reacción de 10 o bien de 5 mmoles de m-fenoxibenzaldehído (PBA), y 14,4 o bien 7,7 mmoles de HCN en terc.-butilmetiléter (MTBE) en presencia de MeHNL W128A substituido en la posición 128 por alanina o bien de MeHNL recombinante (J. Hughes et al., Arch. Biochem. Biophys. 1994, 311 (2), pp. 496-502) o del mutante ejemplificativo HbHNL recombinante.
Para ello se diluyeron, respectivamente 1,3 ml de solución enzimática (0,26 ml para HbHNL) con 8,3 ml 50 mmoles de tampón de citrato sódico 5,4 (o bien 9,74 ml, H_{2}O destilada para HbHNL), se añadió la cantidad correspondiente de PBA (1,98 g/1 g) y 3 o bien 1,5 ml de MTBE y, a continuación, se añadieron rápidamente, gota a gota, 0,06 ml/ml de aldehído de HCN. El transcurso de la reacción se siguió mediante controles por IP a través de la disminución del contenido en aldehído. Al cabo de 2 horas se interrumpieron las reacciones. Para la elaboración se diluyeron las soluciones de la reacción respectivamente con 2,5 ml de MTBE, se sacudieron y se centrifugaron.
Los resultados pueden verse en la tabla 1.
TABLA 1
1
Ejemplo 4
Comparación de la MeHNL recombinante (tipo silvestre) procedente de Manihot esculenta y de MeHNL W128A mutante en medio orgánico.
De manera análoga a la del ejemplo 3 se hicieron reaccionar 3 mg del enzima, 100 mg de nitrocelulosa (tratada previamente con 20 mmoles de tampón de citrato pH 3,3), 1 mmol de substrato y 150 \mul de HCN en 5 ml de diisopropiléter.
Los resultados pueden verse en la tabla 2.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2
2
p-HBA p-Hidroxibenzaldehído
PPA Fenilpropionaldehído
CPA Ciclopent-1-enilacetaldehído
BMK Butilmetilcetona
BEK Butiletilcetona.
Ejemplo 5
Comparación entre el MeHNL recombinante y el MeHNL W128A mutante en sistema tampón acuoso.
De manera análoga a la del ejemplo 3 se hicieron reaccionar 1,2 mg del enzima con 0,5 mmoles de substrato en 2,5 ml de un tampón de citrato de sodio 0,5 M, pH 3,8, con 1 mmol de KCN en 3,5 ml de tampón de citrato de sodio 0,5 M, pH 3,8.
Los resultados pueden verse en la tabla 3.
TABLA 3
3

Claims (8)

1. (S)-Hidroxinitrilasas con aceptancia mejorada del substrato, que se derivan de Hevea Brasiliensis y de Manihot esculenta, caracterizadas porque uno o varios restos de triptofano están substituidos dentro del canal hidrófobo, que conduce hasta el centro activo, por un resto de aminoácido del grupo formado por alanina, glicina, valina o fenilalanina.
2. (S)-Hidroxinitrilasas según la reivindicación 1, caracterizadas porque se derivan de (S)-hidroxinitrilasas de Hevea brasiliensis y de Manihot esculenta, que se presentan con la secuencia completa o con la secuencia acortada.
3. (S)-Hidroxinitrilasas según la reivindicación 1, caracterizadas porque están substituidos uno o varios restos de triptofano, dentro del canal hidrófobo, que conduce hasta el centro activo, por alanina o por fenilalanina.
4. (S)-Hidroxinitrilasas según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque el resto triptofano está substituido por alanina o por fenilalanina en la posición 128 de la secuencia no acortada de las (S)-hidroxinitrilasas.
5. Procedimiento para la obtención de (S)-hidroxinitrilasas según la reivindicación 1, caracterizado porque se lleva a cabo dentro del canal hidrófobo, que conduce hasta el centro activo, una mutación por medio de Quick Change Site-Directed Mutagenesis.
6. Empleo de las (S)-hidroxinitrilasas según la reivindicación 1 para la obtención de (S)-cianhidrinas.
7. Procedimiento para la obtención de (S)-cianhidrinas, caracterizado porque se hacen reaccionar aldehídos y cetonas alifáticas y aromáticas en presencia de un donador de grupos cianida con (S)-hidroxinitrilasas según la reivindicación1.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo en un sistema orgánico, acuoso o en un sistema de dos fases o en emulsión.
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