JPH01104186A - Ｌ−トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｌ−）リブトファンの製造法に関するもので
ある。更に詳しくは、本発明は、トリプトファンシンタ
ーゼ又はトリプトファナーゼ含有菌体の細胞Ｍ￥！透過
性を改善した菌体を酵素触媒として用いて、インドール
とＬ−若しくはＤＬ−セリン又はインドールとピルビン
酸若しくはその塩とアンモニア若しくはアンモニウムイ
オンがらＬ−トリプトファンを製造する方法に関する。

（従来の技術と課題） 従来、トリプトファンシンターゼ又はトリプトファナー
ゼ含有菌体のＪ３ｉＩＪ性を向上させる方法としては、
培養集菌体を予め６０℃以下の温度で６時間以上保存静
置する方法（特開昭６０−１８８０８７号）が提案され
ているが、この方法では、培養集菌体をＬ−１リブトフ
アンの製造に直ちに使用出来ない為、Ｌ−）リプトファ
ンの生産効率が悪いという欠点を有していた。

（発明の構成） 本発明者らは、トリプトファンシンターゼ若しくは、ト
リプトファナーゼ含を菌体の培養集菌体の細胞膜透過性
を改善する方法を鋭Ｘ検討し、Ｌ−）リプトファンを収
率良く効率的に製造する方法を完成した。

即ち、本発明は、トリプトファンシンターゼ又はトリプ
トファナーゼ含有菌体の存在下、インドールとＬ−若し
くはＤＬ−セリン又はインドールとピルビン酸若しくは
その塩とアンモニア若しくはアンモニウムイオンとを酵
素反応させてＬ−トリプトファンを製造する方法におい
て、該菌体が細胞壁溶解酵素と接触されたものであるこ
とを特徴とするＬ−）リプトファンの製造法である。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、トリプトファンシンターゼ若し
くはトリプトファナーゼ含有菌体の培養集菌体の細胞膜
透過性が向上する為、培養集菌体を直ちに酵素触媒とし
てＬ−トリプトファン製造に使用出来、さらに細胞膜透
過性が改善される為にＬ−トリプトファン生産収率が向
上した優れた製造法が提供される。

（発明の詳細な説明） 本発明は、インドールとＬ−若しくはＤＬ−セリン又は
インドールとピルビン酸若しくはその塩とアンモニア若
しくはアンモニウムイオンからＬ−トリプトファンを製
造するに際し、細胞膜透過性が改善されたトリプトファ
ンシンターゼ又はトリプトファナーゼ含有菌体を酵素触
媒として使用することを特徴とするものである。

本発明に使用する微生物としては、トリプトファンシン
ターゼを含有する２体としては、・特に限定されるもの
ではないが、例えば、エシエリヒア・コリ（ｔ！５ｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｌ１２［２００１（Ｆ［！Ｒ
？Ｉ　Ｐ−７１３９）　、エシエリヒア・コリ　（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ目）　Ｋ−１２ＹＫ２００４（
ＰＦ！ＲＭ　Ｐ−７８３８）　、エシエリヒア・コリ　
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ目）Ｋ−１２ＹＫ２
００９（ＦＥＲＭ　Ｐ−７９５７）又はエシエリヒア・
コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ目）　Ｋ−１
２ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ　Ｐ−８３２８）等が用いら
れる。

また、トリプトファナーゼを含有する菌体としては、特
に限定されるものではないが、例えば、トリプトファナ
ーゼ生産菌が、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２ＹＫ３００２（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−８８４４）又はエシエリヒア・コリ　（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｅｈｉａ　　’ｃ。

＋＋）に−１２ＹＫ３００３（ＰＥＲＭ　Ｐ−８８４５
）又は、エシエリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２Ｙに３００４（ＦＥＲＭ　
Ｐ−９２１９）等が用いられる。

前記微生物の培養に用いる培地としては、炭素源として
、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュクロ
ース、糖蜜等の種々の炭水化物が使用出来る。また、窒
素源としては、塩化アンモニウム、１ｉｆｔ酸７ンモニ
ウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナ
トリウム、硝酸カリ、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、ア
ンモニア等が好適に用いられ、ｆｉ＃ＩＡ物としては、
リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜
鉛等が用いられる。また、必要に応じて、ビタミン、ア
ミノ酸等の栄養源を添加することが出来る。

培養温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃
であり、培養中の培地のｐＨは７．２に調箇する。

アルカリ性物質としては、アンモニア水並びに水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム及び水酸化カルシウムの水溶
液が好適に用いられる。

培養は、通気攪拌条件の下、好気的に行う。

本発明に用いる細胞壁溶解酵素は、細胞壁の主たる構成
物である多糖のグリコシド結合を加水分解する酵素であ
るグリコシダーゼを用いるのが好ましく、中でもリゾチ
ーム及び／又はＮ−アセチルムラミダーゼの使用が好ま
しい。

上記のようにして調製された培養菌体の細胞壁溶解酵素
との接触は、該酵素を含有する水又は適当な緩衝液等に
上記培養集菌体を懸濁させたものを用いることが出来る
し、また、培養の末期に該酵素を添加することも出来る
し、また、インドールとＬ−若しくはＤＬ−セリン又は
、インドールとピルビン酸若しくはその塩とアンモニア
若しくはアンモニウムイオンとからＬ−）リプトファン
を生成させる反応系に該酵素を添加することも出来る。

該酵素の添加濃度は、特に制限されるものではないが、
一般に、０．０００１〜０．０１重量％が好適に用いら
れる。この接触処理時のｐＨは５〜９、好ましくは６〜
８の範囲であり、トリプトファンシンターゼ又はトリプ
トファナーゼ含有菌体の濃度は特に限定されるものでは
ないが、好ましくは、０．１〜５０ｉ１ｉ量％が用いら
れる。接触処理時の温度と′しては、０〜５０℃、好ま
しくは４〜３０℃であり、接触時間は、接触温度等によ
っても異なるが、例えばｌＯ分〜３時間、好ましくは、
２０分〜２時間が用いられる。

上記の様にして調製された菌体は、インドールとＬ−若
しくはＤＬ−セリン又はインドールとピルビン酸若しく
はその塩とアンモニア若しくはアンモニウムイオンとか
らＬ−トリプトファンを生成する反応の酵素触媒として
使用される。

上記反応は通常の酵素反応と同様に例えば０゜１　Ｍ　
Ｉ７７酸緩衝液（ｐＨ７，０〜９．０）あルイは水（ｐ
Ｈ７，０〜９．０）等の溶媒中で、約２０〜５０℃、好
ましくは約３０℃〜４０ｔの温度で通常約２〜約７２時
間行なわれる。

該反応に使用するインドール、Ｌ−若しくはＤＬ−セリ
ン、ピルビン酸若しくはその塩とアンモニア若しくはア
ンモニウムイオンの濃度には、特に制限はないが、一般
にはそれぞれを０．１〜２０重量％の濃度範囲で使用す
るのが適当である。

また、該菌体の使用量も特に制限されるものではないが
、一般に０．１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で使用
することができる。

反応後の反応液からのＬ−１−リブトファンの分離、精
製は、それ自体既知の方法、例えば、イオン交換樹脂、
活性炭素等による吸着、膜着処理等の方法で行うことが
出来る。

以下、実施例で本発明の詳細な説明する。

実施例−１ 第１表に示した培地１００ｍｊ！を５００ｍｌ！容三角
フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したも
のにトリプトファンシンターゼ化８１であるエシエリヒ
ア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ
−１２Ｙに２００１（ＦＥＲＭ　Ｐ−７１３９）を植菌
し、３７℃で１日振盪培養後、該培養物の２０　ｍ　Ａ
！を同様にして調製した培地１０００ｍ　ｊに接種し、
３７℃にて回転数６００ｒｐｍ＋、通気量１ｖｖｗ、　
ｐ　Ｈ７，２（２８％アンモニア水で調整）にて１５時
間培養した。

第　　１　　表 グルコース　　　　　　　　　　　　　３０ｇＫＨ２Ｐ
　０４　　　　　　　　　　　　１．　６　ｇＫｔ　Ｈ
ＰＯ４５，５ｇ （ＮＨ，）ｚ　３０４　　　　　　　　　３．０ｇＭｇ
ＳＯ４・７Ｈ２００，１ｇ Ｆｅ５０．　　・７Ｈ２０８０ｍｇ 蒸留水　　　　　　　　　　　　１０００ｍ１００Ｏ７
，２） 培養終了後、該培養液１００ｍｊ＋づつから遠心分離（
８０００ｒ　ｐ　ｍ　、　１５分間、４℃）にて集菌後
、該国体を第３表に示す各酵素を含有する０、５ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸酢酸水溶液１０　（水を溶媒とす
る、ｐ）１８．０）に懸濁し、４℃にて０．５時間静置
保存した。該保存液から遠心骨Ｍｉ（８０００ｒｐｍ、
１５分間、４℃）にて集菌後、１００ｍＭ１−リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，８）の２０ｍ１にて１度洗浄し、遠心
骨Ｎｌ　（８０００ｒ　ｐ　ｍ　、　１５分間、４℃）
した該集菌体を第２表に示した反応液５０ｍＪに懸濁さ
せて、３７℃、５時間反応した６反応終了後遠心分Ｉｌ
ｌ　（８０００ｒ　ｐ　ｍ　、　１５分間、４℃）にて
除菌汲上澄液中のＬ−）リプトファン量を高速液体クロ
マトグラフィーにより定量した。さらに反応終了液４０
　ｍ　ｌをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂（［ダイ
ヤイオン″’５Ｋ−ＩＢ　Ｊ　、三菱化成社製）のカラ
ムを通してＬ−１−リプトファンを吸着させた後、アル
カリ溶液で溶出後、濃縮しＬ−）リブトファンの粗結晶
を析出させた。これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ−ト
リプトファンの結晶を得た。結果を第３表に示した。

第　　２　　表 インドール　　　　　　　　　　　　２．５ｇＤＬ−セ
リン　　　　　　　　　　　　１０　　ｇピリドキサー
ル−５′−リン酸　　　　０．５ｍｇト　リ　ト　ン　
Ｘ−１ｏｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２．５ｇ１００ｍＭ　　ｌ−リス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，８）　　　　５０ｍ　ｌ！第　　３　　表 細胞壁　　　　濃度　　Ｌ−トリゾ　　Ｌ−）リプ溶解
ｆＩＩＩ素　　重量％　　トファン　　トファン生成量
ｇ／Ｉ　　精製量＋ｓｇ リゾチーム　　０．００１　　０．８．　　　２ＯＮ−
アセチル　　０．００１　　０．７　　　１８ムラミダ
ーゼ 比較洲本 （無添加）　　　　　　　　　０．６　　　１６市培養
集菌体を水に浸漬し、４℃で１　ｈｒ静置保存実施例−
２ 菌株としてエシエリヒア・コリ　（Ｆ！５ｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　、−ｃｏｌｉ）に−１２ＹＫ２００４（ＰＥＲ
）’Ｉ　Ｐ−７１１１３８）を使用した以外は実施例−
１と同様の操作を実施した。結果を第４表に示した。

第　　４　　表 細胞壁　　　　濃度　　Ｌ−）リプ　　し−トリゾ溶解
酵素　　重量％　　トファン　　トファン生成量ｇ／ｌ
　　精製量−ｇ リゾチーム　　０．００１　　７．１　　　１７９Ｎ−
アセチル　　０．００１　　７．０　　　１７８ムラミ
ダーゼ 比較例申 （無添加）　　　　−６，１１５４ 本培養集菌体を水に浸漬し、４℃で１　ｈｒ静置保存実
施例−３ 菌株としてエシエリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）に−１２Ｙに２００９（ＦＩＥＲＩＩ　
Ｐ−７９５７）を使用した以外は実施例−１と同様の操
作を実施した。結果を第５表に示した。

第　　５　　表 細胞壁　　　　濃度　　Ｌ−）リプ　　Ｌ−）リプ溶解
酵素　　重量％　　トファン　　トファン生成量ｇ／ｌ
　　Ｍｔ’ＪＪ量１ｍｇ リゾチーム　　　０．００１　　１３．１　　３３５Ｎ
−アセチル　　０．００１　　１２．９　　３３０ムラ
ミダーゼ 比較洲本 （無添加）　　　　　　　　　１１．３　　２８５本培
養集菌体を水に浸漬し、４℃で１　ｈｒ静置保存実施例
−４ 菌株としてエシエリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）　Ｋ−１２ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ　Ｐ
−８３２８）を使用し、Ｌ−）リブトファンの生産反応
時間を４時間にした以外は実施例−１と同様の操作を実
施した。結果を第６表に示した。

第　　６　　表 細胞壁　　　　濃度　　Ｌ−）リプ　　Ｌ４リブ溶解酵
素　　重量％　　トファン　　トファン生成量ｇ／Ｉ　
　精ｉ量−ｇ リゾチーム　　０．００１　　１３．２　　３３６Ｎ−
アセチル　　０．００１　　１３．０　　３３２ムラミ
ダーゼ 比較例量 （無添加）　　　　　−１１，１２７７本培養集菌体を
水に浸漬し、４℃で１　ｈｒ静置保存実施例−５ トリプトン：ＩＯｇ、酵母エキス：５ｇ、ＮａＣｊ！：
５ｇ、グルコース：１ｇ、蒸留水：ｌｊ！、ｐ＋−１７
，２なる培地１００ｍｊ！を５００ｍｌｍｌ用フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、ト
リプトファナーゼ生産菌であるエシエリヒア・コリ　（
Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２ＹＫ
３００２（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８４４）を植菌し、３７℃
にて１日振盪培養した。更に、Ｌ−トリプトファンを２
００μｇ　／　ｍ　１の濃度で含有するＬ−培地１０１
００Ｏ（１２０℃で１５分間滅菌処理したもの）に上記
振盪培養液２０ｍｊ！を接種し、これを３７℃にて８時
間振盪培養した。得られた培養液の１００ｍｊ！づつか
ら遠心骨ｌｉＩＭ（８０００ｒｐｍ。

１５分間、４℃）にて集菌後実施例−１と同様の操作及
び条件にて各酵素含有溶液に浸漬後、集菌菌体を第７表
に示した反応液２００ｍＡに添加し、攪拌しつつインド
ールを１時間毎に５ｍＭずつ計５回添加し最終濃度が２
９ｍＭとなるように添加した。

反応温度は３７℃、ｐ）（ｓ、Ｏで、６時間反応させた
０反応終了後、反応液から遠心分離（８０ＱＱｒｐｍ、
１５分間、４℃）により上澄液を調製し、該上澄液中の
Ｌ−トリプトファンを液体クロマトグラフィーにより測
定した。

また、反応上澄液１００ｍＡから実施例−１と同様の操
作にてＬ−）リプトファンの結晶を得た。

結果を第８表に示した。

第　　７　　表 インドール　　　　　　　　４ｍＭ　（初発濃度）ピル
ビン酸ナトリウム　　　２００ｍＭ酢酸アンモニウム　
　　　　１００ｍＭピリドキサール−５′−リン酸　　
０．０２ｍ　Ｍ蒸留水にて全容　　　　　　１０００ｍ
１（ｐＨ８，０に５Ｎ−ＮａＯＨにて調整）第　　８　
　表 細胞壁　　　　濃度　　Ｌ４リプ　　Ｌ−）リプ溶解酵
素　　重量％　　トファン　　トファン生成量ｇ／ｌ　
　精製量−ｇ リゾチーム　　０．００１　　４．８　　　３０２Ｎ−
アセチル　　０．００１　　４．９　　　３０９ムラミ
ダーゼ 比較例量 （無添加）　　　　　　　　　４．０　　　２５３本培
養集菌体を水に浸漬し、４℃で１　ｈｒ静置保存実施例
−６ 菌株としてエシエリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ）に−１２ＹＫ３００３（ＦＥｌ？Ｍ　Ｐ
−８８４５）を使用した以外は実施例−５と同様の操作
を実施した。結果は第９表に示した。

第９表 細胞壁　　　　濃度　　Ｌ−トリゾ　　Ｌ−）リブ溶解
酵素　　重量％　　トファン　　トファン生成量ｇ／Ｉ
　　精製量−ｇ リゾチーム　　　０．００！　　　５　、０　　　　３
１５Ｎ−アセチル　　０．００１　　５．０　　　３１
４ムラミダーゼ 比較洲本 （無添加）　　　　　　　　　４．３　　　２７０車培
＃築菌体を水に浸漬し、４℃で１　ｈｒＤ置装存実施例
−７ 菌株としてエシェリヒア・コ’Ｊ　　（Ｅｓｃｉｌｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　Ｋ−１２’　　ＹＫ３００４（
ＦＥＲＭ　Ｐ−９２１９）を使用した以外は実施例−５
と同様の操作を実施した。結果は第１０表に示した。

第　　ｌ　Ｏ表 細胞壁　　　　濃度　　Ｌ−トリゾ　　Ｌ４リブ溶解酵
素　　重量％　　トファン　　トファン生成量ｇ／Ｉ　
　精製９醜ｇ リゾチーム　　０．００１　　５．１　　　３２１Ｎ−
アセチル　　０．００１　　５．１　　　３１９ムラミ
ダーゼ 比較洲本

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）［Ａ］「トリプトファンシンターゼ含有菌体の存
   在下インドールとＬ−若しくはＤＬ−セリンからＬ−ト
   リプトファンを生成する反応」又は、［Ｂ］「トリプト
   ファナーゼ含有菌体の存在下インドールとピルビン酸若
   しくはその塩とアンモニア若しくはアンモニウムイオン
   からＬ−トリプトファンを生成する反応」 に際し、それら菌体をそれぞれ細胞壁溶解酵素と接触さ
   せることを特徴とするＬ−トリプトファンの製造法。
2. （２）細胞壁溶解酵素が、グリコシダーゼである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）グリコシダーゼがリゾチーム又はＮ−アセチルム
   ラミダーゼである特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）トリプトファンシンターゼ生産菌が、少なくとも
   トリプトファンシンターゼの構造遺伝子を含むプラスミ
   ドで形質転換されたエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
   ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
5. （５）トリプトファナーゼ生産菌が、少なくともトリプ
   トファナーゼの構造遺伝子を含むプラスミドで形質転換
   されたエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
   ｏｌｉ）である特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）トリプトファンシンターゼ生産菌が、エシエリヒ
   ア・コリ（Ｅｎｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２
   ＹＫ２００１（ＦＥＲＭＰ−７１３９）、エシエリヒア
   ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２Ｙ
   Ｋ２００４（ＦＥＲＭＰ−７８３８）、エシエリヒア・
   コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２ＹＫ
   ２００９（ＦＥＲＭＰ−７９５７）又はエシエリヒア・
   コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２ＹＫ
   ２０１４（ＦＥＲＭＰ−８３２８）である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
7. （７）トリプトファンシンターゼ生産菌が、エシエリヒ
   ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２
   ＹＫ３００２（ＦＥＲＭＰ−８８４４）、エシエリヒア
   ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２Ｙ
   Ｋ３００３（ＦＥＲＭＰ−８８４５）又はエシエリヒア
   ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２Ｙ
   Ｋ３００４（ＦＥＲＭＰ−９２１９）である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。