EP0969095A2 - (S)-Hydroxynitrillyasen mit verbesserter Substratakzeptanz und deren Verwendung - Google Patents

(S)-Hydroxynitrillyasen mit verbesserter Substratakzeptanz und deren Verwendung Download PDF

Info

Publication number
EP0969095A2
EP0969095A2 EP99111574A EP99111574A EP0969095A2 EP 0969095 A2 EP0969095 A2 EP 0969095A2 EP 99111574 A EP99111574 A EP 99111574A EP 99111574 A EP99111574 A EP 99111574A EP 0969095 A2 EP0969095 A2 EP 0969095A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydroxynitrile lyases
hydroxynitrile
substituted
amino acid
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
EP99111574A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP0969095A3 (de
EP0969095B1 (de
Inventor
Franz Effenberger
Peter Lauble
Holger Bühler
Harald Wajant
Siegfried Förster
Helmut Schwab
Christoph Kratky
Ulrike Wagner
Ernst Steiner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Patheon Austria GmbH and Co KG
Original Assignee
DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH and Co KG filed Critical DSM Fine Chemicals Austria Nfg GmbH and Co KG
Priority to DK99111574T priority Critical patent/DK0969095T3/da
Priority to AT99111574T priority patent/ATE278022T1/de
Publication of EP0969095A2 publication Critical patent/EP0969095A2/de
Publication of EP0969095A3 publication Critical patent/EP0969095A3/de
Application granted granted Critical
Publication of EP0969095B1 publication Critical patent/EP0969095B1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C12P13/004—Cyanohydrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • This group of enzymes includes the family of hydroxynitrile lyases (HNL), including HNL from Hevea brasiliensis (HbHNL) and Manihot esculenta (MeHNL). Both enzymes show a high sequence identity and belong to the proteins of the " ⁇ / ⁇ -hydrolase fold" type, which have a characteristic tertiary fold and a so-called catalytic triad with aspartic acid, serine and histidine as the active center. The active center lies at the inner end of a hydrophobic channel.
  • the object of the invention was therefore to (S) -hydroxynitrile lyases with a to provide improved substrate acceptance.
  • Single or more bulky amino acid residues are substituted by less bulky amino acid residues. Tryptophan is preferably substituted as a bulky amino acid residue by a less bulky amino acid residue, such as alanine, glycine, valine, but also phenylalanine. Mutants which are substituted in position 128 (tryptophan) of the unabridged sequence of HbHNL or MeHNL by alanine or phenylalanine are particularly preferred.
  • HNLs are purified using standard methods, for example analogous to Wajant, H. Pfizenmaier, K., J. Biol. Chem. 1996, 25830-25834.
  • the HNLs according to the invention are suitable for the preparation of (S) -cyanohydrins at a rate of conversion which is improved over the prior art and / or with a higher enantiomeric excess.
  • the HNLs according to the invention are used as substrates for aliphatic and aromatic aldehydes and ketones.
  • Aliphatic aldehydes are preferably saturated or unsaturated, branched or cyclic aldehydes with 2 to 20 carbon atoms.
  • Saturated or unsaturated branched aldehydes having 4 to 18 carbon atoms are particularly preferred.
  • the aliphatic and aromatic aldehydes can be unsubstituted or substituted by groups which are inert under the reaction conditions, for example by optionally substituted aryl or heteroaryl groups such as phenyl or indolyl groups, by halogen, ether, alcohol, acyl, carboxylic acid, nitro or azido groups his.
  • Suitable aliphatic aldehydes are hexanal, hexenal, heptanal, propanal, octanal, octenal, 2-methylpropanal.
  • Suitable aromatic or heteroaromatic substrates are, for example, benzaldehyde or variously substituted benzaldehydes, such as 3-phenoxybenzaldehyde, 4-fluoro-3-phenoxybenzaldehyde, 2-chlorobenzaldehyde, 2-nitrobenzaldehyde, 4-methylbenzaldehyde, etc
  • the substrates are coated with a Cyanide group donor implemented.
  • cyanide group donor come hydrocyanic acid, alkali cyanide or a cyanohydrin of the general formula R 1 R 2 C (OH) (CN), into consideration.
  • R 1 and R 2 independently of one another denote hydrogen or an unsubstituted hydrocarbon group, or R 1 and R 2 together represent an alkylene group with 4 or 5 C atoms, where R 1 and R 2 do not simultaneously denote hydrogen.
  • the hydrocarbon groups are aliphatic or aromatic, preferably aliphatic groups.
  • R 1 and R 2 are preferably alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and the cyanide group donor acetone cyanohydrin is very preferred.
  • the cyanide group donor can be prepared by known processes. Cyanohydrins, especially acetone cyanohydrin, are also available for purchase. Hydrogen cyanide (HCN), KCN, NaCN, or acetone cyanohydrin is preferably used, particularly preferably hydrocyanic acid as the cyanide group donor.
  • HCN Hydrogen cyanide
  • KCN KCN
  • NaCN NaCN
  • acetone cyanohydrin is preferably used, particularly preferably hydrocyanic acid as the cyanide group donor.
  • the hydrocyanic acid can also be from one of its salts just before the reaction about NaCN or KCN released and in substance or in dissolved form Reaction mixture are added.
  • the recombinant plasmid pHNL104 which contains the cDNA of the hnl gene from Hevea brasiliensis (plasmid preparation analogous to Hasslacher et al. 1996 J.Biol.Chem. 271, 5884), was used as the template for the mutagenesis reaction.
  • the mutated plasmid was then transformed into Escherichia coli (Epicurian Coli® XL1-Blue supercompetent cells, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA).
  • the plasmid DNA was then isolated from several transformants and this was checked with the restriction enzyme AccIII for the presence of the AccIII site introduced with the mutation. Positive clones were then subjected to sequence analysis in the region of the hnl cDNA in order to verify the presence of the desired mutation at position 128 and to be able to rule out that undesired mutations were introduced in other regions of the hnl gene. A fragment encoding the respective mutated HNL was then obtained from the corresponding plasmid by digestion with the restriction endonuclease EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis.
  • the mutation was transformed into pQE4-MeHNLwt using the Quick-Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA).
  • 2 complementary primers corresponding to nucleotides 383-435 from MeHNL (5'AAG CTT TTG GAG TCG TTT CCT GAC GCG AGA GAC ACA GAG TAT TTT ACG TTC AC 3 ')
  • the mutated plasmids were then transformed into E. coli XL1-Blue.
  • the mutants were identified by sequence analysis using a modified determination method analogous to Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 with T7DNA analysis system (Pharmacia).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

(S)-Hydroxynitrillyasen mit einer verbesserten Substratakzeptanz, welche sich von jenen aus Hevea brasiliensis und Manihot esculenta ableiten, wobei einer oder mehrere sperrige Aminosäurereste innerhalb des zum aktiven Zentrum führenden hydrophoben Kanals durch weniger sperrige Aminosäurereste substituiert sind.

Description

Die Durchführung chemischer Reaktionen unter Zuhilfenahme biologischer Katalysatoren erlangt zunehmend Bedeutung, vor allem in solchen Anwendungsbereichen, in denen die bei Enzymen häufig ausgeprägte Eigenschaft, bei Reaktionen mit chiralen oder prochiralen Komponenten bevorzugt eines der beiden Enantiomeren umzusetzen, genutzt werden kann.
Zu dieser Gruppe Enzyme zählt die Familie der Hydroxynitrillyasen (HNL), unter anderem HNL aus Hevea brasiliensis (HbHNL) und Manihot esculenta (MeHNL). Beide Enzyme zeigen eine hohe Sequenzidentität und gehören zu den Proteinen des "α/β-Hydrolase fold"-Typs, die eine charakteristische Tertiärfaltung und eine sogenannte katalytische Triade mit Asparaginsäure, Serin und Histidin als aktives Zentrum aufweisen. Das aktive Zentrum liegt dabei am inneren Ende eines hydrophoben Kanals.
HbHNL und MeHNL eignen sich im Prinzip für die Umsetzung einer Vielzahl von Carbonylverbindungen, wie etwa aliphatische, alicyclische, ungesättigte, aromatische, sowie heteroaromatische Aldehyde und Ketone, zu den entsprechenden (S)-Cyanhydrinen. Da HNLs eine immer größere Bedeutung als Biokatalysatoren zur Herstellung von (S)-Cyanhydrinen erlangen, wird ständig versucht, deren katalytische Aktivität und Substratakzeptanz zu verbessern. Bisher erhältliche HNLs weisen insbesondere bei Edukten mit sperrigen Resten eine nicht zufriedenstellende Substratakzeptanz auf, wodurch die entsprechenden Cyanhydrine entweder mit geringer Umsatzgeschwindigkeit und/oder geringem Enantiomerenüberschuß erhalten werden.
Aufgabe der Erfindung war es demnach, (S)-Hydroxynitrillyasen mit einer verbesserten Substratakzeptanz bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung sind demnach (S)-Hydroxynitrillyasen mit einer veränderten, insbesondere für definierte Substrate verbesserten Substratakzeptanz, welche sich von jenen aus Hevea brasiliensis und Manihot esculenta ableiten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß einer oder mehrere sperrige Aminosäurereste innerhalb des zum aktiven Zentrum führenden hydrophoben Kanals durch weniger sperrige Aminosäurereste substituiert sind.
Die erfindungsgemäßen HNLs sind Mutanten von (S)-HNLs aus Hevea brasiliensis (HbHNL) oder Manihot esculenta (MeHNL), die aus gentechnisch modifizierten Mikroorganismen wie Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, oder Escherichia coli erhalten werden können. (WO 97/03204)
Die zu modifizierenden rekombinanten HNL's können dabei auch in einer verkürzten Sequenz, die beispielsweise durch Entfernen der ersten Aminosäure(n) in der Sequenz erhalten wird, vorliegen.
Die Mutanten weisen eine veränderte Sequenz derjenigen Aminosäuren auf, die den zum aktiven Zentrum führenden hydrophoben Kanal bilden.
Dabei sind einzelne oder mehrere sperrige Aminosäurereste durch weniger sperrige Aminosäurereste substituiert.
Bevorzugt wird als sperriger Aminosäurerest Tryptophan durch einen weniger sperrigen Aminosäurerest, wie Alanin, Glycin, Valin, aber auch Phenylalanin, substituiert.
Besonders bevorzugt sind Mutanten die in Position 128 (Tryptophan) der unverkürzten Sequenz von HbHNL oder MeHNL durch Alanin oder Phenylalanin substituiert sind.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen HNLs erfolgt durch funktionelle Überexpression in gentechnisch modifizierten Mikroorganismen wie Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae oder Escherichia coli, beispielsweise analog M. Hasslacher et al., J.Biol. Chem. 1996, 271, 5884 oder Wajant, H. und Pfizenmaier, K. 1996, J. Biol. Chem., 25830 - 24834. Die Mutation wird beispielsweise mittels Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Der Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit ist ein gebrauchsfertiges System zur Herstellung von spezifischen Mutanten und wird beispielsweise von der Fa. Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA (USA) kommerziell vertrieben.
Die Aufreinigung der resultierenden HNLs erfolgt nach Standardmethoden, beispielsweise analog Wajant, H. Pfizenmaier, K., J. Biol. Chem. 1996, 25830-25834.
Die erfindungsgemäßen HNLs eignen sich zur Herstellung von (S)-Cyanhydrinen in gegenüber dem Stand der Technik verbesserter Umsatzgeschwindigkeit und/oder mit höherem Enantiomerenüberschuß.
Insbesondere werden die erfindungsgemäßen HNLs bei aliphatischen und aromatischen Aldehyden und Ketonen als Substrate eingesetzt.
Unter aliphatischen Aldehyden sind dabei bevorzugt gesättigte oder ungesättigte, verzweigte oder cyclische Aldehyde mit 2 bis 20 C-Atomen zu verstehen.
Besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte verzweigte Aldehyde mit 4 bis 18 C-Atomen.
Die aliphatischen und aromatischen Aldehyde können unsubstituiert oder durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Heteroarylgruppen wie Phenyl- oder Indolylgruppen, durch Halogen-, Ether-, Alkohol-, Acyl-, Carbonsäure-, Nitro- oder Azidogruppen substituiert sein.
Beispiele für geeignete aliphatische Aldehyde sind Hexanal, Hexenal, Heptanal, Propanal, Octanal, Octenal, 2-Methylpropanal.
Geeignete aromatische oder heteroaromatische Substrate sind etwa Benzaldehyd bzw. verschieden substituierte Benzaldehyde, wie etwa 3-Phenoxybenzaldehyd, 4-Fluor-3-phenoxybenzaldehyd, 2-Chlorbenzaldehyd, 2-Nitrobenzaldehyd, 4-Methylbenzaldehyd, u.s.w.
Die Substrate werden in Anwesenheit der erfindungsgemäßen HNLs mit einem Cyanidgruppendonor umgesetzt.
Als Cyanidgruppendonor kommen Blausäure, Alkali-Cyanide oder ein Cyanhydrin der allgemeinen Formel R1R2C(OH)(CN), in Betracht. In der Formel I bedeuten R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe, oder R1 und R2 gemeinsam eine Alkylengruppe mit 4 oder 5 C-Atomen, wobei R1 und R2 nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten. Die Kohlenwasserstoffgruppen sind aliphatische oder aromatische, bevorzugt aliphatische Gruppen. Bevorzugt bedeuten R1 und R2 Alkylgruppen mit 1 - 6 C-Atomen, ganz bevorzugt ist der Cyanidgruppendonor Acetoncyanhydrin.
Die Herstellung des Cyanidgruppendonors kann nach bekannten Verfahren erfolgen. Cyanhydrine, insbesonders Acetoncyanhydrin, sind auch käuflich zu erwerben.
Bevorzugt wird Blausäure (HCN), KCN, NaCN, oder Acetoncyanhydrin, besonders bevorzugt Blausäure als Cyanidgruppendonor eingesetzt.
Die Blausäure kann dabei auch erst kurz vor der Reaktion aus einem ihrer Salze wie etwa NaCN oder KCN freigesetzt und in Substanz oder in gelöster Form dem Reaktionsgemisch zugegeben werden.
Die Umsetzung kann im organischen, wäßrigen oder 2-Phasensystem oder in Emulsion durchgeführt werden.
Als wäßriges System wird eine wäßrige, die erfindungsgemäße HNL enthaltende Lösung oder Pufferlösung verwendet. Beispiele dafür sind Na-Citratpuffer, Phosphatpuffer u.s.w.
Als organisches Verdünnungsmittel können mit Wasser nicht oder geringfügig mischbare aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, die gegebenenfalls halogeniert sind, Alkohole, Ether oder Ester oder Gemische davon verwendet werden. Bevorzugt werden Methyl -tert.Butylether (MTBE), Diisopropylether, Dibutylether und Ethylacetat oder deren Gemisch eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen HNLs können dabei entweder als solche oder immobilisiert in dem organischen Verdünnungsmittel vorliegen, die Umsetzung kann jedoch auch in einem Zweiphasensystem oder in Emulsion mit nicht-immobilisierter HNL erfolgen.
Beispiel 1:
Herstellung von in Position 128 mutierter HbHNL
Spezifische Mutanten wurden unter Verwendung des QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stragagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) hergestellt. Neben einem Aminosäureaustausch in der Position 128 des HNL Proteins wurde über eine stille Mutation zusätzlich noch eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym AccIII eingeführt.
Dazu wurden folgende Oligonukleotide verwendet:
  • a) Zur Herstellung der Mutante W128A:
    W128AFOR:
    5' GCTCATGGAGGTGTTTCCGGACGCAAAAGACACCACG 3'
    W128AREV:
    5' CGTGGTGTCTTTTGCGTCCGGAAACACCTCCCATGAGC 3'
  • b) Zur Herstellung der Mutante W128F:
    W128FFOR:
    5' GCTCATGGAGGTGTTTCCGGACTTCAAAGACACCACG 3'
    W128FREV:
    5' CGTGGTGTCTTTGAAGTCCGGAAACACCTCCCATGAGC 3'
    • Als Template für die Mutagenese-Reaktion wurde das rekombinante Plasmid pHNL104, das die cDNA des hnl-Gens von Hevea brasiliensis enthält (Plasmidherstellung analog Hasslacher et al. 1996 J.Biol.Chem. 271, 5884) verwendet. Das mutierte Plasmid wurde anschließend in Escherichia coli (Epicurian Coli® XL1-Blue supercompetent cells, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) transformiert.
    Aus mehreren Transformanten wurde dann die Plasmid-DNA isoliert und diese mit dem Restriktionsenzym AccIII auf das Vorhandensein der mit der Mutation eingeführten AccIII-Schnittstelle überprüft. Positive Klone wurden dann im Bereich der hnl- cDNA einer Sequenzanalyse unterzogen, um das Vorhandensein der gewünschten Mutation an der Position 128 zu verifizieren und um ausschließen zu können, daß in anderen Bereichen des hnl-Gens unerwünschte Mutationen eingeführt wurden.
    Aus dem entsprechenden Plasmid wurde dann durch Verdau mit der Restriktionsendonuclease EcoRI und nachfolgender Agarosegelelektrophorese ein Fragment, das die jeweilige mutierte HNL kodiert, gewonnen. Dieses Fragment wurde in die mit EcoRI linearisierte und mit alkalischer Phosphatase dephosphorylierte DNA des Expressionsvektors pHIL-D2 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) ligiert und die rekombinante DNA in Escherichia coli SURE® (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) transformiert.
    Wiederum wurde aus mehreren Transformanten die Plasmid-DNA präpariert und das Vorhandensein bzw. die Orientierung der hnl cDNA bezüglich des aoxI - Promotors von pHIL-D2 mit Hilfe der Restriktionsendonuklease NdeI überprüft. Plasmid-DNA aus geeigneten Klonen wurde dann mit dem Restriktionsenzym NotI linearisiert und in weiterer Folge mittels Elektrotransformation in den Pichia pastoris Stamm GS115 eingebracht, wobei auf die Komplementation der Histidin-des verwendeten Wirtsstammes selektioniert wurde. So erhaltene Transformanten wurden anschließend auf verringertes Wachstum auf Minimal Methanol Medium geprüft. Mehrere solcher Muts-Transformanten wurden dann hinsichtlich der Fähigkeit zur Expression von HNL-Protein getestet, und ein geeigneter Expressionsstamm wurde für jede der beiden HNL-Mutanten ausgewählt. Diese Arbeiten wurden analog den im Manual zum Pichia Expression Kit (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) detailliert beschriebenen Experimenten durchgeführt.
    Die Integration der hnl cDNA ins Pichia pastoris Genom und das Vorhandensein der spezifischen Mutation in den beiden Expressionsstämmen wurde durch Sequenzierung eines mit PCR amplifizierten DNA Fragmentes überprüft. Als Template für die PCR diente chromosomale DNA, die nach der bei Ausubel et. al., Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-3, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1995, beschriebenen Methode isoliert wurde. Die Sequenzen der PCR-Primer waren wie folgt:
    PP5AOX1
    5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3'
    PP3AOX1
    5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3'
    Die Fermentation der Expressionsstämme, sowie die Isolierung und Reinigung der mutierten HNL-Proteine erfolgte wie bei Hasslacher et al. 1997, Protein Expression and Purification, 11, 61-71, beschrieben.
    Beispiel 2 Herstellung von in Position 128 mutierter MeHNL.
    Die Mutation wurde in pQE4-MeHNLwt mittels Quick-Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) transformiert. Dazu wurden 2 komplementäre Primer, entsprechend den Nukleotiden 383-435 von MeHNL (5'AAG CTT TTG GAG TCG TTT CCT GAC GCG AGA GAC ACA GAG TAT TTT ACG TTC AC 3') die die gewünschte Mutation (unterstrichen) enthalten mittels Pfu DNA polymerase verlängert und das so erhaltene Produkt mit Dpnl behandelt. Die mutierten Plasmide wurden anschließend in E.coli XL1-Blue transformiert. Die Mutanten wurden durch Sequenzanalyse mittels einer modifizierten Bestimmungsmethode analog Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,74, 5463-5467 mit T7DNA analysis system (Pharmacia) kontrolliert.
    Beispiel 3 Herstellung von (S)-3-Phenoxybenzaldehydcyanhydrin
    (S)-3-Phenoxybenzaldehydcyanhydrin (PBAC) wurde durch Umsetzung von 10 bzw. 5 mmol m-Phenoxybenzaldehyd (PBA), und 14,4 bzw. 7,7 mmol HCN in tert. Butylmethylether (MTBE) in Anwesenheit von in Position 128 durch Alanin substituierte MeHNL W128A bzw. von rekombinanter MeHNL (J.Hughes et al., Arch.Biochem.Biophys.1994, 311 (2), pp. 496-502) oder von rekombinanter HbHNL - Bsp. Mutant erhalten.
    Dazu wurde jeweils 1,3 ml Enzymlösung (0,26 ml für HbHNL) mit 8,3 ml 50 mMol Na-Citratpuffer 5,4 verdünnt (bzw. 9,74 ml, dest. H2O für HbHNL), die entsprechende Menge PBA (1,98 g/1 g) und 3 bzw. 1,5 ml MTBE zugegeben und anschließend 0,06 ml/ml Aldehyd HCN rasch zugetropft. Der Reaktionsverlauf wurde mittels IP-Kontrolle über die Abnahme des Aldehydgehaltes verfolgt. Nach 2 Stunden wurden die Reaktionen abgebrochen. Zur Aufarbeitung wurden die Reaktionslösungen mit jeweils 2,5 ml MTBE verdünnt, geschüttelt und zentrifugiert.
    Die Ergebnisse sind aus Tabelle 1 ersichtlich.
    HNL IU/ml mmol PBA Gehalt PBAC [%] ee [%]
    MeHNL (Wildtyp) 1092 10 82
    MeHNL (Wildtyp) 1092 5 88,5 97,03
    MeHNL (W128A) 315 10 98,7
    MeHNL (W128A) 315 5 97 97
    HbHNL 5200 10 83
    HbHNL 5200 5 84,5
    Beispiel 4
    Vergleich rekombinante MeHNL (Wildtyp) aus Manihot esculenta und mutante MeHNL W128A im organischen Medium.
    Analog Bsp. 3 wurden 3 mg Enzym, 100 mg Nitrocellulose (vorbehandelt mit 20 mMol Citratpuffer pH 3.3) 1 mmol Substrat und 150 µl HCN in 5 ml Diisopropylether umgesetzt.
    Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 ersichtlich
    MeHNL W128A
    Substrat t [h] Ausbeute [%] ee [%] t [h] Ausbeute [%] ee [%]
    Nonanal 6 35 81,1 6 87,3 80,2
    Heptanal 1 99 80 1 99,5 88
    2-Methylbutanal 4,5 89 93,6 4,5 99 96,6
    2-Hexenal 3,2 21,1 >99 3,2 85 96
    n-PBA 7 30 99 8 82 99
    2 31 >99 2 60 >99
    1 90,7 99 1 94,3 99
    0,3 79 67 0,3 93 86
    Phenylaceton 4 69,8 99 4 81,6 96
    4,5 100 52 4,5 100 78
    5 40 45 5 46 82
    Beispiel 5
    Vergleich rekombinante MeHNL und mutante MeHNL W128A im wäßrigen Puffersystem
    Analog Bsp. 3 wurden 1,2 mg Enzym mit 0,5 mmol Substrat in 2,5 ml eines 0,5 M Na-Citratpuffers pH 3.8 mit 1 mmol KCN in 3,5 ml 0,5 M Na-Citratpuffer pH 3.8 umgesetzt.
    Die Ergebnisse sind aus Tabelle 3 ersichtlich
    MeHNL W128A
    Substrat t [h] Ausbeute [%] ee [%] t [h] Ausbeute [%] ee [%]
    4 11 99 4 47 95
    PBA 22 66 97 22 75 92
    m-HBA 3 74 0 3 80 0
    p-HBA 1 76 92 1 71 96
    PPA 1.2 60 21 1.2 94 90

    Claims (9)

    1. (S)-Hydroxynitrillyasen mit einer verbesserten Substratakzeptanz, welche sich von jenen aus Hevea brasiliensis und Manihot esculenta ableiten, dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehrere sperrige Aminosäurereste durch weniger sperrige Aminosäurereste substituiert ist.
    2. (S)-Hydroxynitrillyasen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich von rekombinanten (S)-Hydroxynitrillyasen aus Hevea brasiliensis oder Manihot esculenta ableiten.
    3. (S)-Hydroxynitrillyasen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinanten (S)-Hydroxynitrillyasen in vollständiger oder in verkürzter Sequenz vorliegen.
    4. (S)-Hydroxynitrillyasen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als sperriger Aminosäurerest Tryptophan durch Alanin oder Phenylalanin substituiert ist.
    5. (S)-Hydroxynitrillyasen nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Position 128 der unverkürzten Sequenz der rekombinanten (S)-Hydroxynitrillyasen der Tryptophanrest durch Alanin oder Phenylalanin substituiert ist.
    6. Verfahren zur Herstellung von (S)-Hydroxynitrillyasen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb des zum aktiven Zentrum führenden hydrophoben Kanals eine Mutation mittels Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit durchgeführt wird.
    7. Verwendung von (S)-Hydroxynitrillyasen nach Anspruch 1, zur Herstellung von (S)-Cyanhydrinen.
    8. Verfahren zur Herstellung von (S)-Cyanhydrinen, dadurch gekennzeichnet, daß aliphatische und aromatische Aldehyde und Ketone in Anwesenheit eines Cyanidgruppendonors mit (S)-Hydroxynitrillyasen nach Anspruch 1 umgesetzt werden.
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in einem organischen, wäßrigen oder in einem 2-Phasensystem oder in Emulsion durchgeführt wird.
    EP99111574A 1998-07-02 1999-06-15 (S)-Hydroxynitrillyasen mit verbesserter Substanzakzeptanz und deren Verwendung Expired - Lifetime EP0969095B1 (de)

    Priority Applications (2)

    Application Number Priority Date Filing Date Title
    DK99111574T DK0969095T3 (da) 1998-07-02 1999-06-15 (S)-hydroxynitrillyaser med forbedret substratacceptans og anvendelsen heraf
    AT99111574T ATE278022T1 (de) 1998-07-02 1999-06-15 (s)-hydroxynitrillyasen mit verbesserter substanzakzeptanz und deren verwendung

    Applications Claiming Priority (2)

    Application Number Priority Date Filing Date Title
    AT115998 1998-07-02
    AT0115998A AT407397B (de) 1998-07-02 1998-07-02 (s)-hydroxynitrillyasen mit verbesserter substratakzeptanz und deren verwendung

    Publications (3)

    Publication Number Publication Date
    EP0969095A2 true EP0969095A2 (de) 2000-01-05
    EP0969095A3 EP0969095A3 (de) 2002-08-28
    EP0969095B1 EP0969095B1 (de) 2004-09-29

    Family

    ID=3507883

    Family Applications (1)

    Application Number Title Priority Date Filing Date
    EP99111574A Expired - Lifetime EP0969095B1 (de) 1998-07-02 1999-06-15 (S)-Hydroxynitrillyasen mit verbesserter Substanzakzeptanz und deren Verwendung

    Country Status (8)

    Country Link
    US (1) US6319697B1 (de)
    EP (1) EP0969095B1 (de)
    JP (1) JP4430757B2 (de)
    AT (2) AT407397B (de)
    CA (1) CA2277594A1 (de)
    DE (1) DE59910627D1 (de)
    DK (1) DK0969095T3 (de)
    ES (1) ES2227935T3 (de)

    Cited By (6)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    EP1016712A2 (de) * 1998-12-28 2000-07-05 Nippon Shokubai Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyasen
    WO2004083424A1 (de) * 2003-03-20 2004-09-30 Dsm Fine Chemicals Austria Nfg Gmbh & Co Kg R-hydroxynitrillyasen mit verbesserter substratakzeptanz und deren verwendung
    AT500910A1 (de) * 2004-01-30 2006-04-15 Dsm Fine Chem Austria Gmbh Verfahren zur herstellung von beta-hydroxynitroverbindungen
    WO2006041226A1 (ja) * 2004-10-15 2006-04-20 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
    DE10255597B4 (de) * 2002-11-28 2006-08-10 Biospring Gmbh Rekombinante Expression der (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in Mikroorganismen
    EP2078748A1 (de) * 2006-09-29 2009-07-15 Nippon Shokubai Co., Ltd. Neue hochaktive modifizierte typ-s-hydroxynitril-lyase

    Families Citing this family (4)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    WO2004090124A2 (en) * 2003-04-14 2004-10-21 Basf Aktiengesellschaft Sequences encoding s-hydroxynitril lyases and their use in methods for the production of cyanohydrins
    US7531330B2 (en) 2004-03-31 2009-05-12 Nippon Shokubai Co., Ltd. Modified S-hydroxynitrile lyase
    JP4494286B2 (ja) * 2005-05-19 2010-06-30 株式会社日本触媒 新規高活性改変型ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ
    JP2007089513A (ja) * 2005-09-29 2007-04-12 Nippon Shokubai Co Ltd 新規耐酸性改変型ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ

    Citations (1)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    WO1997003204A2 (de) * 1995-07-12 1997-01-30 Dsm Chemie Linz Gmbh (s)-hydroxynitrillyase aus hevea brasiliensis

    Family Cites Families (2)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    AT396252B (de) 1991-10-31 1993-07-26 Chemie Linz Gmbh Enzymatisches verfahren zur enantioselektiven herstellung optisch aktiver cyanhydrine
    DE19529116A1 (de) * 1995-08-08 1997-03-06 Chemie Linz Deutschland Gmbh I (S)-Hydroxynitrillyase aus Hevea brasiliensis

    Patent Citations (1)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    WO1997003204A2 (de) * 1995-07-12 1997-01-30 Dsm Chemie Linz Gmbh (s)-hydroxynitrillyase aus hevea brasiliensis

    Non-Patent Citations (5)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Title
    HASSLACHER M ET AL: "MOLECULAR CLONING OF THE FULL-LENGTH CDNA OF (S)-HYDROXYNITRILE LYASE FROM HEVEA BRASILIENSIS. FUNCTIONAL EXPRESSION IN ESCHERICHIA COLI AND SACCHAROMYCES CERECISIAE AND IDENTIFICATION OF AN ACTIVE SITE RESIDUE" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, Bd. 271, Nr. 10, 8. M{rz 1996 (1996-03-08), Seiten 5884-5891, XP002022209 ISSN: 0021-9258 *
    HASSLACHER MEINHARD ET AL: "Hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis: Molecular characterization and mechanism of enzyme catalysis." PROTEINS STRUCTURE FUNCTION AND GENETICS, Bd. 27, Nr. 3, 1997, Seiten 438-449, XP001083603 ISSN: 0887-3585 *
    LAUBLE HANSPETER ET AL: "Structure determinants of substrate specificity of hydroxynitrile lyase from Manihot esculenta." PROTEIN SCIENCE, Bd. 11, Nr. 1, Januar 2002 (2002-01), Seiten 65-71, XP001080762 ISSN: 0961-8368 *
    WAGNER U G ET AL: "Mechanism of cyanogenesis: the crystal structure of hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis." STRUCTURE (LONDON, ENGLAND) ENGLAND 15 JUL 1996, Bd. 4, Nr. 7, 15. Juli 1996 (1996-07-15), Seiten 811-822, XP002203197 ISSN: 0969-2126 *
    WAJANT H ET AL: "IDENTIFICATION OF POTENTIAL ACTIVE-SITE RESIDUES IN THE HYDROXYNITRILE LYASE FROM MANIHOT ESCULENTA BY SITE-DIRECTED MUTAGENESIS" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, Bd. 271, Nr. 42, 18. Oktober 1996 (1996-10-18), Seiten 25830-25834, XP000995344 ISSN: 0021-9258 *

    Cited By (13)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    EP1016712A3 (de) * 1998-12-28 2001-07-18 Nippon Shokubai Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyasen
    US6387659B1 (en) 1998-12-28 2002-05-14 Nippon Shokubai Co., Ltd. Process for producing S-hydroxynitrile lyase
    EP1016712A2 (de) * 1998-12-28 2000-07-05 Nippon Shokubai Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyasen
    DE10255597B4 (de) * 2002-11-28 2006-08-10 Biospring Gmbh Rekombinante Expression der (S)-Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta in Mikroorganismen
    WO2004083424A1 (de) * 2003-03-20 2004-09-30 Dsm Fine Chemicals Austria Nfg Gmbh & Co Kg R-hydroxynitrillyasen mit verbesserter substratakzeptanz und deren verwendung
    US7572608B2 (en) 2003-03-20 2009-08-11 Dsm Fine Chemicals Austria Nfg Gmbh & Co. Kg R-hydroxynitrillyases having improved substrate tolerance and the use thereof
    AT500910A1 (de) * 2004-01-30 2006-04-15 Dsm Fine Chem Austria Gmbh Verfahren zur herstellung von beta-hydroxynitroverbindungen
    WO2006041226A1 (ja) * 2004-10-15 2006-04-20 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
    US8030053B2 (en) 2004-10-15 2011-10-04 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Substitutional variants of hydroxynitrile lyase with high specific activity and methods of use
    US8383389B2 (en) 2004-10-15 2013-02-26 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Hydroxynitrile lyase
    US8409841B2 (en) 2004-10-15 2013-04-02 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Hydroxynitrile lyase
    EP2078748A1 (de) * 2006-09-29 2009-07-15 Nippon Shokubai Co., Ltd. Neue hochaktive modifizierte typ-s-hydroxynitril-lyase
    EP2078748A4 (de) * 2006-09-29 2010-01-06 Nippon Catalytic Chem Ind Neue hochaktive modifizierte typ-s-hydroxynitril-lyase

    Also Published As

    Publication number Publication date
    ATE278022T1 (de) 2004-10-15
    DK0969095T3 (da) 2004-10-25
    AT407397B (de) 2001-02-26
    ES2227935T3 (es) 2005-04-01
    JP4430757B2 (ja) 2010-03-10
    ATA115998A (de) 2000-07-15
    CA2277594A1 (en) 2000-01-02
    EP0969095A3 (de) 2002-08-28
    EP0969095B1 (de) 2004-09-29
    JP2000125886A (ja) 2000-05-09
    DE59910627D1 (de) 2004-11-04
    US6319697B1 (en) 2001-11-20

    Similar Documents

    Publication Publication Date Title
    EP1730291B1 (de) Nitrilhydratase aus rhodococcus
    EP0326063B1 (de) Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen
    EP0527553B1 (de) Verfahren zur Herstellung von R(-)-Mandelsäure und deren Derivat
    EP0969095B1 (de) (S)-Hydroxynitrillyasen mit verbesserter Substanzakzeptanz und deren Verwendung
    SE443803B (sv) Forfarande for enzymatisk framstellning av l-karnitin
    DE60128581T2 (de) Herstellung von alpha -hydroxy-carboxy säure mit hilfe von einem gekoppelten enzym system
    EP0054897A2 (de) Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure
    DE3875953T2 (de) Verfahren zur herstellung von organischen chemischen verbindungen.
    EP1566441B1 (de) Gene, enthaltend eine für Hydroxynitrillyase codierende DNA-Sequenz, rekombinante Proteine mit Hydroxynitrillyase-Aktivität und deren Verwendung
    EP0927766B1 (de) Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von (S)-Cyanhydrinen
    EP1613748B1 (de) R-hydroxynitrillyasen mit verbesserter substratakzeptanz und deren verwendung
    EP0300287B1 (de) Verfahren zur Reduktion von Ketonen
    DE60115849T2 (de) Methode und katalytisches system zur stereoselektiven invertierung eines chiralen zentrums in einer chemischen verbindung
    EP1200601B1 (de) Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren aus ihren racemischen n-acetyl-d,l-derivaten durch enzymatische racemat-spaltung mittels isolierter, rekombinanter enzyme
    EP0632130A1 (de) Enzymatisches Verfahren zur Herstellung aliphatischer S-Cyanhydrine
    EP1238094B1 (de) Verfahren zur herstellung von optisch aktiven cyanhydrinen unter verwendung von r-oxynitrilase
    EP0377083A1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
    DE60120379T2 (de) Hydroperoxidlyase der Warzenmelone (Cucumis Melo) sowie deren Verwendungen
    AT411600B (de) Dna-sequenzen kodierend für hydroxynitrillyase, daraus abgeleitete rekombinante proteine mit hydroxynitrillyase-aktivität, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
    DE3823866A1 (de) Verfahren zur herstellung von s-cyanhydrinen
    EP2092061B1 (de) (r)-hydroxynitril-lyase aus brassicaceen
    DE19942812A1 (de) Verfahren zur Herstellung von D-(3'-Pyridyl)-alanin
    DE69906802T2 (de) Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-aminonitrilen
    DE60126767T2 (de) Neuartige (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionat (d-phenyllaktat) dehydrogenase und für diese kodierendes gen
    FR2605316A1 (fr) Procede perfectionne de preparation de l-carnitine.

    Legal Events

    Date Code Title Description
    PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

    AK Designated contracting states

    Kind code of ref document: A2

    Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

    AX Request for extension of the european patent

    Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI

    RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

    Owner name: DSM FINE CHEMICALS AUSTRIA NFG GMBH & COKG

    PUAL Search report despatched

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009013

    AK Designated contracting states

    Kind code of ref document: A3

    Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

    AX Request for extension of the european patent

    Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI

    17P Request for examination filed

    Effective date: 20021213

    AKX Designation fees paid

    Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR LI

    RBV Designated contracting states (corrected)

    Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB IE IT LI NL

    17Q First examination report despatched

    Effective date: 20030924

    GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

    Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

    GRAS Grant fee paid

    Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

    GRAA (expected) grant

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

    AK Designated contracting states

    Kind code of ref document: B1

    Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB IE IT LI NL

    REG Reference to a national code

    Ref country code: GB

    Ref legal event code: FG4D

    Free format text: NOT ENGLISH

    REG Reference to a national code

    Ref country code: CH

    Ref legal event code: NV

    Representative=s name: BOVARD AG PATENTANWAELTE

    Ref country code: CH

    Ref legal event code: EP

    GBT Gb: translation of ep patent filed (gb section 77(6)(a)/1977)
    REG Reference to a national code

    Ref country code: DK

    Ref legal event code: T3

    REG Reference to a national code

    Ref country code: IE

    Ref legal event code: FG4D

    Free format text: GERMAN

    REF Corresponds to:

    Ref document number: 59910627

    Country of ref document: DE

    Date of ref document: 20041104

    Kind code of ref document: P

    REG Reference to a national code

    Ref country code: ES

    Ref legal event code: FG2A

    Ref document number: 2227935

    Country of ref document: ES

    Kind code of ref document: T3

    PLBE No opposition filed within time limit

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

    STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

    Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

    ET Fr: translation filed
    26N No opposition filed

    Effective date: 20050630

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: NL

    Payment date: 20070615

    Year of fee payment: 9

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: AT

    Payment date: 20070618

    Year of fee payment: 9

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: IE

    Payment date: 20070628

    Year of fee payment: 9

    Ref country code: ES

    Payment date: 20070628

    Year of fee payment: 9

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: IT

    Payment date: 20070614

    Year of fee payment: 9

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: BE

    Payment date: 20070711

    Year of fee payment: 9

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: FR

    Payment date: 20070615

    Year of fee payment: 9

    BERE Be: lapsed

    Owner name: *DSM FINE CHEMICALS AUSTRIA NFG G.M.B.H. & CO. K.G

    Effective date: 20080630

    NLV4 Nl: lapsed or anulled due to non-payment of the annual fee

    Effective date: 20090101

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: BE

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20080630

    REG Reference to a national code

    Ref country code: IE

    Ref legal event code: MM4A

    REG Reference to a national code

    Ref country code: FR

    Ref legal event code: ST

    Effective date: 20090228

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: IE

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20080616

    Ref country code: AT

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20080615

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: NL

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20090101

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: DK

    Payment date: 20090629

    Year of fee payment: 11

    REG Reference to a national code

    Ref country code: ES

    Ref legal event code: FD2A

    Effective date: 20080616

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: IT

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20080615

    Ref country code: FR

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20080630

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: ES

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20080616

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: CH

    Payment date: 20090625

    Year of fee payment: 11

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: GB

    Payment date: 20090625

    Year of fee payment: 11

    Ref country code: DE

    Payment date: 20090629

    Year of fee payment: 11

    REG Reference to a national code

    Ref country code: CH

    Ref legal event code: PL

    Ref country code: DK

    Ref legal event code: EBP

    GBPC Gb: european patent ceased through non-payment of renewal fee

    Effective date: 20100615

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: CH

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20100630

    Ref country code: LI

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20100630

    Ref country code: DE

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20110101

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: GB

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20100615

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: DK

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20100630