DE69906802T2 - Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-aminonitrilen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von optisch aktiven alpha-aminonitrilen

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung eines α-Aminonitrils mit erhöhter optischer Reinheit, wobei ein Gemisch aus den Enantiomeren des N-Formyl-α-aminonitrils mit einer Acylase in Kontakt gebracht wird, wodurch eines der Enantiomere des N-Formyl-α-aminonitrils selektiv in das ungeschützte entsprechende α-Aminonitril deformyliert wird.
  • Es sind nach Stand der Technik keine Verfahren bekannt, bei welchen ein Gemisch aus den Enantiomeren eines α-Aminonitrils enzymatisch, enantioselektiv formyliert wird, oder bei welchen ein Gemisch aus den Enantiomeren eines N-Formyl-α-aminonitrils deformyliert wird.
  • Der Anmelder hat nun herausgefunden, dass es möglich ist, die N-schützende Formylgruppe von einem der Enantiomere eines Gemisches aus den Enantiomeren von N-Formyl-α-aminonitrilen enantioselektiv zu entfernen. In solchen enantioselektiven Verfahren können darüber hinaus sehr hohe E-Werte erhalten werden.
  • Als Substrat in dem Verfahren der Erfindung zu verwendende α-Aminonitrile sind zum Beispiel aliphatische und aromatische α- Aminonitrile, zum Beispiel die von Phenylglycin, Phenylalanin, m-Methoxy-phenylalanin, Valin und α-Methyl-phenylglycin abgeleiteten α-Aminonitrile. Im Rahmen dieser Erfindung versteht sich ein α-Aminonitril als eine α-Aminosäure, in welcher die Carboxygruppe durch eine Cyanogruppe ersetzt ist.
  • Als Substrat zu verwendende N-Formyl-α-aminonitrile sind zum Beispiel Nitrile der Formel 1
  • worin:
  • R&sub1; eine gegebenenfalls substituierte Alkyl- oder Arylgruppe darstellt,
  • R&sub2; für H, eine gegebenenfalls substituierte Alkyl- oder Arylgruppe steht.
  • Die Alkylgruppen in R&sub1; und R&sub2; können cyclisch oder linear oder verzweigte Ketten sein. Die Alkyl- und Arylgruppen können substituiert sein. Geeignete Substituenten sind zum Beispiel Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, z. B. Methoxy, Mercapto, Alkylmercapto, Amino, Guanyl, Carboxamid, Halogen, z. B. Chlor, Aryl, z. B. Phenyl und Hydroxyphenyl, Imidazolyl oder Indolyl.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Gemisch aus den Enantiomeren eines (ungeschützten) α-Aminonitrils in Gegenwart einer Acylase und eines Formylierungsmittels einer Formylierung unterworfen, wodurch eines det Enantiomere selektiv in das entsprechende N-Formyl-α-aminonitril umgewandelt wird.
  • Geeignete Formylierungsmittel sind zum Beispiel Ameisensäure, falls eine thermodynamisch kontrollierte Formylierung durchgeführt werden kann, oder Ameisensäureester oder -amide, wenn die Formylierung kinetisch kontrolliert wird. In einer thermodynamisch kontrollierten Formylierung wird das Äquilibrium zur Seite des Formylderivats verschoben, vorzugsweise durch Ausfällen des Formylderivats.
  • Darüber hinaus zeigte sich, dass ausgehend von α-Aminonitrilen die nicht formylierten α-Aminonitrile bei pH-Werten von höher als 5 relativ schnell racemisierten. In solchen einem Fall kann das optisch wirksame N-Formyl-aminonitril mit einem enantiomeren Überschuss von mehr als 90%, insbesondere mehr als 95% und mit einer Ausbeute von mehr als 90%, insbesondere mehr als 95% erhalten werden, errecht mit Bezugnahme auf die Gesamtmenge an (racemischem) α-Aminonitril-Ausgangsprodukt.
  • Geeignete Acylasen, welche in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind zum Beispiel Penizillin-Acylasen, zum Beispiel Pen-G- oder Pen-V-Acylasen, Metalloproteasen, Esterasen, Deacetylasen. Besonders brauchbare Enzyme sind Peptid-deformylasen.
  • Peptid-deformylasen (PDF's) sind im Allgemeinen Enzyme mit Formylmethioninpeptid-deformylasewirksamkeit. Die gemäß der Erfindung zu verwendenden Peptid-deformylasen haben eine mehr als 10-fach, vorzugsweise mehr als 100-fach, insbesondere mehr als 1000-fach höhere Wirksamkeit gegenüber den N-Formyl-geschützten α-Aminonitrilen im Vergleich zu den entsprechenden N-Acetylgeschützten α-Aminonitrilen. Wirksamkeit ist hier definiert als die katalytische Effizienz (auch Spezifitätskonstante genannt) Kcat/Km, ausgedrückt in M&supmin;¹ sek&supmin;¹; worin Km (ausgedrückt in mM) die Michaelis-Konstante repräsentiert (dies ist die Substratkonzentration, bei welcher die Umsetzungsgeschwindigkeit 50% der beobachteten maximalen Umsetzungsgeschwindigkeit beträgt) und Kcat (ausgedrückt in min&supmin;¹) die Wechselzahl repräsentiert. Es sollte vermerkt werden, dass in der Literatur auch andere Namen, statt dem Namen Peptid-deformylase verwendet werden; insbesondere die folgenden Namen können hier erwähnt werden: Formylmethionindeformylase, N-Formylmethionylaminoacyl-tRNA-deformylase, N- Formyl-L-methionin-amidohydrolase, N-Formylmethionyl-aminoacyl- tRNA-amidohydrolase.
  • In dem Verfahren gemäß der Erfindung zu verwendende, geeignete Peptid-deformylasen sind als EC 3.5.1.27 klassifizierte Peptid-deformylasen. Vorzugsweise ist das Enzym ein Enzym mit der für EC 3.5.1.27 beschriebenen Wirksamkeit, weil mit solchen Enzymen hervorragende Ergebnisse bei der Deformylierung erreicht werden. Es sollte vermerkt werden, dass bis kürzlich angenommen wurde, dass das als EC 3.5.1.31 kodierte Enzym eine unterschiedliche Umsetzung katalysiert. Mittlerweile ist jedoch gezeigt worden, dass die als EC 3.5.1.27 und EC 3.5.1.31 bekannten Enzyme durch genau das gleiche Gen kodiert werden und die gleiche Wirksamkeit haben. Daher umschließt die Bezeichnung EC 3.5.1.27, wie hierin verwendet, nicht nur EC 3.5.1.31, sondern gleichermaßen alle weiteren Enzyme mit der gleichen, für EC.2.5.1.27 beschriebenen Wirksamkeit.
  • Obwohl sich die Familie der PDF's aus Proteinen mit einem relativ niedrigen Grad der Sequenz-Identität zusammensetzt, zeigen sich die 3D-Strukturen der Mitglieder dieser Familie eng miteinander verwandt, mit insbesondere dem Aufbau einer gemeinsamen Falte um das bivalente Metall-Ion und drei Signatursequenzen. Wie durch Wagner et al., J. Biol. Chem., 273, 11413-6 (1998) beschrieben (für PDF's, angezeigt als PDF), sind für viele dieser Enzyme charakteristisch drei kurze Aminosäurestrecken als streng erhaltene Motive vorhanden, nämlich dass die Enzyme die Sequenzen (i) HEXXH, (ii) EGCLS und (iii) GXGXAAXQ enthalten. In diesen Sequenzen stellt X eine natürliche Aminosäure dar und es werden einbuchstabige Standard-Codes für Aminosäuren verwendet: A = Alanin, C = Cystein, E = Glutaminsäure, G = Glycin, H = Histidin, L = Leucin, S = Serin und Q = Glutamin.
  • Peptid-deformylasen sind zum Beispiel erhältlich von Eubakterien, zum Beispiel Escherichia coli, Bacillus subtilis, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Haemophilus influenzae, Thermotoga maritima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Calothrix PCC 7601, Bacillus stearothermopilus oder Lactococcus lactis. Vorzugsweise wird ein von Escherichia coli erhältliches Enzym verwendet.
  • Vorzugsweise wird eine Peptid-deformylase mit einem bivalenten Metall-Ion verwendet, wobei das Metall ausgewählt wird aus den Gruppen 5-11 des Periodensystems (New IUPAC Version; siehe Handbook of Chemistry and Physics, 70. Auflage, CRC Press, 1989-1990, Innenseite des Deckels), und zwar als Co-Faktor. Vorzugsweise wird das Metall ausgewählt aus der Gruppe von V, Cr, Fe, Ni, Mn, Co, Cu, Pd und Pt, insbesondere aus der Gruppe von Fe, Ni, Mn und Co, am meisten bevorzugt Fe oder Ni.
  • Vorzugsweise sollte die Menge an bivalenten Metall-Ionen zu der Anzahl an Mol von Enzym äquivalent sein. Geeigneterweise liegt das Molverhältnis zwischen diesen bivalenten Metall-Ionen und der Anzahl an PDF-Molekülen im Bereich von 0,6 bis 1,4, vorzugsweise von 0,8 bis 1, 2, und insbesondere bevorzugt ist die Menge an bivalenten Metall-Ionen äquimolar zum Enzym.
  • Austausch der bivalenten Metall-Ione in den PDF's, um PDF- Enzyme mit einem Co-Faktor zu erhalten, wie für die vorliegende Erfindung notwendig, kann durch die verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, wie in Groche et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 246, 342-346 (1998) beschrieben. Diese Verfahren schließen einfache Metall-Ersetzung durch Inkubation des ursprünglichen Enzyms in einem Überschuss des gewünschten bivalenten Metall-Ions ein, falls nötig ist diesem die Herstellung des Apoenzyms durch Behandlung des ursprünglichen Enzyms mit einer Metall-Chelationsverbindung vorhergegangen. Ferner kann das gewünschte bivalente Metall-Ion schon eingeführt sein (zumindest ein Teil der Enzymmoleküle), und zwar durch Verwenden eines bakteriellen Wachstumsmedium mit einem erhöhten Verhältnis des gewünschten bivalenten Metall-Ions über Fe²&spplus;.
  • Zusätzlich können Maßnahme ergriffen werden, um die Stabilität des Enzyms zu erhöhen, zum Beispiel die Zugabe von Stabilisierungsmitteln, zum Beispiel Katalase, Tris-(2-carboxyethyl)- phosphin, Glycose-oxidase oder Kombinationen daraus; oder Vergrößern der Konzentration der PDF, zum Beispiel zu einer PDF- Konzentration von mindestens 0,1 mg PDF pro ml; bevorzugter von mindestens 1,0 mg/ml. Die obere Grenze der Konzentration von PDF ist nicht kritisch, falls praktische Konzentrationen verwendet werden. Die Verwendung von Stabilisationsmaßnahmen wird besonders bevorzugt, wenn ein leicht oxidierbares Metall-Ion, z. B. Fe&spplus;&spplus; als ein Co-Faktor vorhanden ist, oder ein leicht oxidierbares Substrat. Falls nicht, zum Beispiel in dem Fall, dass Ni&spplus;&spplus; als ein Co-Faktor vorhanden ist, schien die Zugabe eines Stabilisierungsmittels überflüssig zu sein, da sich das Enzym sogar ohne Stabilisierungsmittel als sehr stabil herausstellte.
  • Alternativ können genetisch konstruierte Mutanten von PDR's verwendet werden, welche zum Beispiel erhöhte Wirksamkeit oder Enantioselektivität in der (De)formylierungsumsetzung aufweisen. Diese Mutanten können durch eine Anzahl von unterschiedlichen Herangehensweisen erzeugt werden; zum Beispiel durch auf Stellen gerichtete Mutagenese, Stellen-spezifische willkürliche Mutagenese, Regio-spezifische willkürliche Mutagenese und vollständig willkürliche Mutagenese; die letztere Form von Mutagenese ist besser bekannt als direkte Evolution. Allgemein anwendbare Verfahren, um diese unterschiedlichen Protein-konstruierenden Herangehensweisen durchzuführen, sind dem Fachmann gut bekannt. Falls eine willkürliche Herangehensweise angewendet wird, muss dem Mutagenesezyklus Selektion von resistenten und wirksamen Mutant(en) folgen, was dadurch zur Identifikation von geeigneten Mutanten führt. Um PDF-Mutanten zu erhalten, kann auch eine Kombination aus unterschiedlichen Protein-konstruierenden Herangehensweisen und/oder mehreren Runden willkürlicher Mutagenese verwendet werden.
  • Die Umsetzungsbedingungen für die enzymatische Deformylierung oder Formylierung gemäß der Erfindung sind nicht sehr kritisch und können von den verwendeten Substraten abhängen. Jedes geeignete Lösungsmittelsystem, welches gegenüber dem PDF inert ist, kann angewendet werden; solche Lösungsmittel schließen wässerige Systeme (Lösungen oder Aufschlämmungen) ein, oder wässerige Systeme, welche ebenfalls ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthalten, welches unter den Umsetzungsbedingungen inert ist. Wässerige Systeme werden jedoch bevorzugt. Die Konzentration der N-Formylverbindung ist ebenfalls nicht kritisch, und kann zum Beispiel im Bereich von etwa 0,1 bis 1000 mM liegen. Es ist nicht notwendig, dass die gesamte N-Formylverbindung gelöst wird; ein Teil davon kann als Aufschlämmung vorhanden sein. Die Konzentration der PDF ist gleichfalls nicht sehr kritisch und wird üblicherweise bei 0,001 bis 100 Gew.-% der Formylverbindung liegen, zum Beispiel bei etwa 0,2 mM PDF.
  • Der pH für die Umsetzung wird vorzugsweise im Bereich von 4,0 bis 11,0 gewählt, bevorzugterweise von 5,0 bis 10,0. Der optimale pH wird durch die Stabilität des α-Aminonitrils und/oder des N-Formyl-α-aminonitrils, und/oder die Stabilität und/oder Wirksamkeit des Enzyms bestimmt. Der Fachmann kann den optimalen pH- Wert leicht bestimmen. Die Temperatur ist nicht sehr kritisch und wird geeigneterweise im Bereich von 10 bis 50ºC liegen, z. B. bei etwa 37ºC, aber für thermostabile PDF-Enzyme können höhere Temperaturen angewendet werden.
  • In jenen Fällen, in welchen die absolute Konfiguration des (de)formylierten Enantiomers bestimmt wurde, zeigte sich, dass das S-Enantiomer schneller (de)formyliert wurde, als das R- Enantiomer. Die optische Reinheit wird durch den enantiomeren Überschuss (ee) angegeben, die Enantioselektivität des Enzyms wird durch E dargestellt und als kf/ks errechnet, worin kf definiert ist als die Geschwindigkeitskonstante der (De)formylierung des am schnellsten (de)formylierten Enantiomers und ks definiert ist, als die Geschwindigkeitskonstante der (De)formylierung des am wenigsten schnell (de)formylierten Enantiomers.
  • Gegebenenfalls wird ein Salz, welche hydrophobe Interaktionen fördert, zu dem Umsetzungsgemisch zugegeben, zum Beispiel ein Sulfat, Phosphat, Sulfit oder Acetat von Ammonium, Rb, K, Na, Cs oder Li. Insbesondere bevorzugt wird Ammoniumsulfat oder Lithiumsulfat verwendet.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden 3 Beispiele weiter veranschaulicht werden, ohne darauf begrenzt zu werden.
    • Abkürzungen:
  • TB-Medium: 12 g/l Bacto-Trypton, Difco; 24 g/l Hefeextrakt, Difco; 4 g/l Glycerol; 2,3 g/l KH&sub2;PO&sub4;; 12,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;);
  • Hepes: N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethan- Schwefelsäure;
  • AEBSF: 2-Aminoethyl-p-benzolsulfonylfluorid;
  • TCEP: Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin;
  • MOPS: 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure
  • MES: 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure
    • Isolierung von PDF(Fe)
  • Für eine detaillierte Diskussion der verwendeten Verfahren wird auf Groche et al., BBRC 246, 342-346 (1998) verwiesen.
  • PDF(Fe) wurde aus überproduzierenden E.coli Zellen isoliert, gewachsen bei 30ºC in 1,6 1 TB-Medium für 14-16 Stunden. Etwa 13 g (Nassgewicht) Zellpaste wurde in 26 ml Puffer (20 mM Hepes/KOH, 100 mM KF, pH 7,7, ergänzt durch 10 ug/ml Katalase aus Rinderleber (Boehringer Mannheim) und 1 mM AEBSF suspendiert, durch Beschallung (Branson 812, 20 min) bei 0ºC zerkleinert und bei 200.000 g für 1 Std. zentrifugiert. Der klare Flüssigkeitsüberstand (1,3 g Protein; gemäß Biuretumsetzung) wurde mit 1,3 ml 10% (Gew./Vol.) Polymin G-35 (BASF) gemischt, auf pH 7,7 angepasst und bei 40.000 g für 10 min zentrifugiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde auf eine 20 ml Met-Lys-Sepharose- Säule angewendet, die mit 20 mM Hepes/KOH, 100 mM KF, 0,2 mM TCEP, pH 7,7 äquilibriert worden war. Nach Waschen mit 120 ml von 20 mM Hepes/KOH, 100 mM KF, 0,2 mM TCEP, pH 7,7 wurde PDF(Fe) mit 150 ml 20 mM Hepes/KOH, 100 mM KCl, 0,2 mM TCEP, pH 7,7 eluiert. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden durch Ultrafiltration unter Verwendung von Amicon PM10 Membran konzentriert (Ausbeute: 140 mg Protein, 1400 U/mg; bestimmt gemäß Groche et al). Nach Anpassung der TCEP-Konzentration auf 1 mM und Proteinkonzentration auf 40 mg/ml wurde die PDF(Fe)- Vorratslösung (40 mg/ml = 2 mM) gefroren bei -60ºC gelagert.
  • Nach Auftauen konnte die PDF(Fe)-Vorratslösung direkt in den unten beschriebenen Deformylierungsversuchen verwendet werden. Falls jedoch Lösungen mit niedrigeren PDF(Fe)-Konzentrationen für diese Deformylierungsversuche erforderlich waren, wurde die PDF-Vorratslösung in 20 mM Hepes/KOH, pH 7,7, 100 mM KCl, 1 mg/ml Rinderserum Albumin, 10 ug/ml Katalsaselösung weiter verdünnt.
    • HPLC-Analyse
  • In allen Fällen mussten HPLC-Bedingungen entwickelt werden, bei welchen die zwei deformylierten Isomere voneinander und von den formylierten Isomeren getrennt wurden. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedenen Techniken angewendet, also Verfahren A und Verfahren B wie unten beschrieben.
  • Aus den Konzentrationen an deformylierten Isomeren in den Proben nach verschiedenen Umsetzungszeiten konnte die (De)formylierungs-Geschwindigkeitskonstante (kf und ks in M&supmin;¹s&supmin;¹) für beide Enantiomere berechnet werden, als auch die entsprechenden ee-Werte des deformylierten Produkts. Die Enantioselektivität des Enzyms (E-Wert) wurde berechnet, indem der Quotient von kf/ks genommen wurde, und wird ebenso wie der maximale ee- Wert des deformylierten Produkts, welcher während der Versuche beobachtet wurde, in den Beispielen unten angegeben.
    • Verfahren A (ohne Derivatisierung)
  • Eine Crownpakm CR(+) Säule (4 · 150 mm) wurde verwendet. Aus dem Deformylierungsgemisch entnommene Proben (5 ul) wurden mit 95 ul wässerigem HclO&sub4; (10 mM) gemischt, im PDF (Fe²&spplus;) zu inaktivieren. Nach einer kurzen Zentrifugation wurden 20 ul des Flüssigkeitsüberstands an der Crownpakm CR(+) Säule angewendet. Für spezifische chromatographische Bedingungen und Retentionszeiten siehe die Beispiele II und III.
    • Verfahren B (Vorsäulen-Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd (OPA) und N-Acetyl-L-cystein, (NAC))
  • Aus dem Deformylierungsgemisch entnommene Proben (25 ul) wurden mit 25 ul wässerigem HClO&sub4; (100 mM) gemischt, um PDF (Fe²&spplus;) zu inaktivieren. Nach einer kurzen Zentrifugation wurden 40 ul des Flüssigkeitsüberstands zu 80 ul 1 M wässerigem H&sub3;CO&sub3;/- NaOH pH 11 zugegeben und nachfolgend wurden 20 ul OPA-Reagens (bestehend aus OPA in H&sub2;O/CH&sub3;OH 1 : 1 v/v mit einer wie in dem Beispiel angezeigten Konzentration) zugegeben und 10 Minuten später wurden 20 ul NAC-Reagens (bestehend aus NAC in H&sub2;O/CH&sub3;OH 1 : 1 v/v mit einer wie in dem Beispiel angezeigten Konzentration) zugegeben. Nach 5 min wurde die Derivatisierung durch Zugabe von 80 ul (500 mM) wässerigem H&sub3;PO&sub4; beendet und 20 ul der Lösung wurden sofort an einer NucleosilTM 120-5 C&sub1;&sub8;-Säule (250 · 4 mm) angewendet. Die Temperatur ist die der Umgebung und Nachweis erfolgt spektrophotometrisch unter Verwendung einer Wellenlänge von 257 nM und/oder 340 nm; der verwendete Eluent ist ein Gemisch aus 80 Mol-% wässerigem 0,05 M H&sub3;PO&sub4; (mit 1 M NaOH auf pH = 7,0 gebracht) und 20 Vol.-% CH&sub3;CN.
    • Beispiel I: Deformylierung von N-Formyl-valin-aminonitril in Gegenwart von Li&sub2;SO&sub4; bei pH = 7,2
  • Die Deformylierungsumsetzung von N-Formyl-valin-aminonitril wurde in einem 1,5 ml Eppendorf Umsetzungstestrohr durchgeführt. Das Umsetzungsgemisch mit einem Gesamtvolumen von 200 ul enthielt 100 mM wässeriges MOPS/NaOH, 2 M Li&sub2;SO&sub4;-Puffer pH 7,2 und 10 mM N-Formyl-valin-aminonitril. Nach thermischer Äquilibrierung auf 37ºC wurde die Deformylierungsumsetzung durch die Zugabe von 50 uM PDF begonnen. Bei verschiedenen Umsetzungszeiten wurden Proben des Umsetzungsgemisches entnommen, in welchen die Umsetzung durch Zugabe von HClO&sub4; gestoppt wurde.
  • HPLC-Analyse wurde gemäß Verfahren B durchgeführt, mit [OPA] = 16 mg/ml und [NAC] = 4 mg/ml, Retentionszeiten: 8,6 min (L-Enantiomer), 10,2 min (D-Enantiomer).
    • Ergebnisse:
  • E = 47,9
  • eemax = 95,5
  • kx= 0,62 M&supmin;¹s&supmin;¹
  • kf = 29,7 M&supmin;¹s&supmin;¹
    • Beispiel II: Deformylierung von N-Formyl-m-methoxy-phenylalaninaminonitril ohne Li&sub1;SO&sub4; bei PH 7,2
  • Die Deformylierungsumsetzung von N-Formyl-m-methoxyphenylalanin-aminonitril wurde wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, dass 100 mM MOPS/NaOH, 250 mM NaCl, 0,1 mg/ml Katalase-Puffer pH 7,2 statt 100 mM MOPS/NaOH, 2 M Li&sub2;SO&sub4;-Puffer pH 7,2 verwendet wurde. Ferner wurden 7,2 mM N-Formyl-m-methoxyphenylalanin-aminonitril und 2,5 uM PDF verwendet.
  • HPLC-Analyse wurde gemäß Verfahren A durchgeführt.
  • Eluent: 90 Vol.-% 10 mM wässeriges HClO&sub4;/10 Vol.-% CH&sub3;OH Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min. Temperatur: 5ºC, Nachweis: 210 nm,
  • Retentionszeiten:
  • Deformylierte(s) Enantiomer(e): 23,8 min.
  • 30,7 min.
  • N-Formyl-aminonitril: 52,0 min.
    • Ergebnisse:
  • E = 685
  • eemax= 99,0
  • kf = 1370 M&supmin;¹s&supmin;¹
  • ks = 2 M&supmin;¹s&supmin;¹
    • Beispiel III: Deformylierung von N-Formyl-phenylalaninaminonitril ohne L&sub2;SO&sub4;-Zuaabe bei pH 6,2
  • Die Deformylierungsumsetzung von N-Formyl-phenylalaninaminonitril wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, außer dass 100 mM MES/NaOH-Puffer pH 6,2 anstelle von 100 MOPS/NaOH, 2 M Li&sub2;SO&sub4;-Puffer pH 7,2 verwendet wurde. Ferner wurden 7,5 mM N-Formyl-phenylalanin-aminonitril und 20 uM PDF verwendet.
  • HPLC-Analyse wurde gemäß Verfahren A durchgeführt.
  • Eluent: 90 Vol.-% 10 mM wässeriges HClO&sub4;/10 Vol.-% CH&sub3;OH Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min. Temperatur: 5ºC, Nachweis: 210 nm,
  • Retentionszeiten:
  • Deformyliertes Aminonitril 11,8 min.
  • 15,1 min.
  • N-Formyl-aminonitril: 28,6 min.
    • Ergebnisse
  • E = 880
  • eemax = 98,8
  • kf = 880
  • ks = 1

Claims (12)

1. Verfahren für die Herstellung eines α-Aminonitrils mit erhöhter optischer Reinheit, wobei ein Gemisch aus den Enantiomeren eines chiralen N-Formyl-α-aminonitrils mit einer Acylase in Kontakt gebracht wird, wodurch eines der Enantiomere des N-Formylaminonitrils selektiv in das ungeschützte entsprechende α- Aminonitril deformyliert wird.
2. Verfahren für die Herstellung eines α-Aminonitrils mit erhöhter optischer Reinheit, wobei ein Gemisch aus den Enantiomeren eines chiralen (ungeschützten) α-Aminonitrils in Gegenwart einer Acylase und eines Formylierungsmittels einer Formylierungsumsetzung unterworfen wird, wodurch eines der Enantiomere selektiv in N-Formyl-α-aminonitril umgewandelt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei Ameisensäure, ein Ameisensäureamid oder ein Ameisensäureester als Formylierungsmittel verwendet wird.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei eine Peptiddeformylase mit einem bivalenten Metall-Ion, worin das Metall aus Gruppe 5-11 des Periodensystems ausgewählt wird, als Acylase verwendet wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die Peptiddeformylase aus der Klasse EC 3.5.2.27 oder EC 3.5.1.31 ausgewählt wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, wobei die Peptiddeformylase die Sequenzen (I) HEXXH, (ii) EGCLS und (iii) GXGXAAXQ enthält.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4-6, wobei die Peptiddeformylase von Escherichia coli stammt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4-7, wobei das bivalente Metall ausgewählt wird aus der Gruppe von Fe, Ni, Mn und Co.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das bivalente Metall Ni ist.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, wobei zusätzlich ein Stabilisierungsmittel zugegeben wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Stabilisierungsmittel Katalase ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei das bivalente Metall Fe ist.
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