JP2002533091A - 高められた光学純度を有するα−アミノニトリルの製造方法 - Google Patents

高められた光学純度を有するα−アミノニトリルの製造方法

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Abstract

(57)【要約】 キラルなN-ホルミル-α-アミノニトリルの鏡像異性体の混合物をアシラーゼと接触させ、それによってN-ホルミルアミノニトリルの鏡像異性体の１つが、保護されていない対応するα-アミノニトリルへと選択的に脱ホルミル化される、高められた光学純度を有するα-アミノニトリルの製造方法および、キラルな（保護されていない）α-アミノニトリルの鏡像異性体の混合物をアシラーゼおよびホルミル化剤の存在下でホルミル化反応に供し、それによって鏡像異性体の１つが選択的にN-ホルミル-α-アミノニトリルに転化される、高められた光学純度を有するα-アミノニトリルの製造方法。好ましくは、金属が周期律系の第５〜11族から選ばれる２価金属イオンを有するペプチドデホルミラーゼ、例えば、分類EC 3.5.2.27またはEC 3.5.1.31から選ばれるペプチドデホルミラーゼがアシラーゼとして使用される。そのようなペプチドデホルミラーゼはしばしば、 (i)HEXXH、(ii)EGCLSおよび(iii)GXGXAAXQの配列を含む。２価金属は好ましくは、Fe、Ni、MnおよびCoからなる群より選択され、特にNiまたはFeである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高められた光学純度を有するα-アミノニトリルの製造方法に関し
、N-ホルミル-α-アミノニトリルの鏡像異性体の混合物をアシラーゼと接触させ
、それによってN-ホルミル-α-アミノニトリルの鏡像異性体の１つが、保護され
ていない対応するα-アミノニトリルへと選択的に脱ホルミル化される方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術および課題】
α-アミノニトリルの鏡像異性体の混合物を、酵素的に鏡像異性選択的に(enan
tioselectively)ホルミル化するか、またはN-ホルミル-α-アミノニトリルの鏡
像異性体の混合物を脱ホルミル化する従来公知の方法はない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本出願人はここで、N-保護されているホルミル基を、N-ホルミル-α-アミノニ
トリルの鏡像異性体の混合物の鏡像異性体の１つから鏡像異性選択的に除去する
ことが可能であることを見出した。そのような鏡像異性選択的プロセスにおいて
はさらに、非常に高いE-値を得ることができる。 本発明の方法において基質として使用されるべきα-アミノニトリルは、例え
ば脂肪族および芳香族α-アミノニトリル、例えばフェニルグリシン、フェニル
アラニン、m-メトキシ-フェニルアラニン、バリンおよびα-メチル-フェニルグ
リシンから誘導されるα-アミノニトリルである。本発明においては、α-アミノ
ニトリルは、カルボキシ基がシアノ基で置換されたα-アミノ酸であると理解さ
れる。
【０００４】 基質として使用されるべきN-ホルミル-α-アミノニトリルは、例えば式１：
【化１】 （ここで、 R1は、任意的に置換されたアルキルまたはアリール基を表し、 R2は、Ｈ、任意的に置換されたアルキルまたはアリール基を表す） のニトリルである。 R1およびR2におけるアルキル基は、環状、直鎖状または分岐状鎖であることが
できる。アルキルおよびアリール基は置換されることができる。適当な置換基は
、例えばヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、例えばメトキシ、メルカプト、ア
ルキルメルカプト、アミノ、グアニル、カルボキシアミド、ハロゲン、例えばク
ロロ、アリール、例えばフェニルおよびヒドロキシフェニル、イミダゾリルまた
はインドリルである。
【０００５】 本発明の別の実施態様においては、（保護されていない）α-アミノニトリル
の鏡像異性体の混合物は、アシラーゼおよびホルミル化剤の存在下でホルミル化
に供され、それによって、鏡像異性体の１つが、対応するN-ホルミルα-アミノ
ニトリルへと選択的に転化される。 適当なホルミル化剤は、例えば、熱力学的に制御されたホルミル化を行うこと
ができる場合にはギ酸または、ホルミル化が動力学的に制御されるときにはギ酸
エステルもしくはアミドである。熱力学的に制御されたホルミル化においては、
好ましくはホルミル誘導体の沈殿によって、平衡がホルミル誘導体側へシフトす
る。
【０００６】 さらに、α-アミノニトリルから出発すると、ホルミル化されていないα-アミ
ノニトリルは、５より上のpH値で比較的急速にラセミ化する。そのような場合、
光学活性なN-ホルミルアミノニトリルを、90％より多い、特に95％より多い鏡像
異性体過剰で、かつ（ラセミ体の）α-アミノニトリル出発生成物の全量に対し
て計算して90％より上、特に95％より上の収率で、得ることができる。 本発明の方法において使用することができる適当なアシラーゼは、例えばペニ
シリンアシラーゼ、例えばPen-GまたはPen-Vアシラーゼ、メタロプロテアーゼ、
エステラーゼ、デアセチラーゼである。特に有用な酵素は、ペプチドデホルミラ
ーゼである。
【０００７】 ペプチドデホルミラーゼ(PDF)は一般に、ホルミルメチオニンペプチドデホル
ミラーゼ活性を有する酵素である。本発明に従って使用されるべきペプチドデホ
ルミラーゼは、対応するN-アセチル保護されたα-アミノニトリルと比べて10倍
より高い、好ましくは100倍より高い、特には1000倍より高いN-ホルミル保護さ
れたα-アミノニトリルに対する活性を有する。活性はここで、M-1秒-1で表され
た触媒効率（また、特異性定数と言われる）Ｋcat／Ｋmとして定義され、ここで
、Ｋm（mMで表される）はミハエリス(Michaelis)定数（これは、反応速度が、観
察される最大反応速度の50％である基質濃度である）を表し、Ｋcat（分-1で表
される）は、回転数を表す。文献では、ペプチドデホルミラーゼという名称の代
わりに他の名称がまた使用されていることに注意すべきである。特に、以下の名
称をここに列挙することができる：ホルミルメチオニンデホルミラーゼ、N-ホル
ミルメチオニルアミノアシル-tRNAデホルミラーゼ、N-ホルミル-L-メチオニンア
ミドヒドロラーゼ、N-ホルミルメチオニル-アミノアシル-tRNAアミドヒドロラー
ゼ。
【０００８】 本発明の方法において使用されるべき適当なペプチドデホルミラーゼは、EC 3
.5.1.27として分類されているペプチドデホルミラーゼである。好ましくは、こ
の酵素は、EC 3.5.1.27について記載されている活性を有する酵素である。とい
うのは、そのような酵素を用いての脱ホルミル化において優れた結果が達成され
ているからである。最近まで、EC 3.5.1.31としてコード化されている酵素が異
なる反応を触媒していると考えられていたことに注意すべきである。しかしなが
ら、ところで、EC 3.5.1.27およびEC 3.5.1.31として知られている酵素が正確に
同じ遺伝子によってコードされ、同じ活性を有することが示された。したがって
、ここで使用されるように、EC 3.5.1.27という語は、EC 3.5.1.31だけでなくEC
3.5.1.27について記載されているのと同じ活性を有する他のすべての酵素もま
た包含している。
【０００９】 PDFの族は、比較的低レベルの配列同一性を有するタンパク質からなるが、こ
の族のメンバーの3D構造は、特に、２価金属イオンおよび３つの署名配列(signa
ture sequence)の周りの共通の折り畳みの構成について、互いに非常に関連性が
あると思われる。ワグナー(Wagner)ら、J. Biol. Chem., 273, 11413-6 (1998)
によって記載されている（PDFとして示されたPDFについて）ように、これらの酵
素の多くについて、特徴的なことには、３つの短いアミノ酸伸長が、厳密に保存
されたモティーフとして存在する。すなわち、酵素が、配列(i)HEXXH、(ii)EGCL
Sおよび(iii)GXGXAAXQを含む。これらの配列において、Xは任意の天然のアミノ
酸を表し、アミノ酸について標準の１つの文字コードが使用される：A=アラニン
、C=システイン、E=グルタミン酸、G=グリシン、H=ヒスチジン、L=ロイシン、S=
セリンおよびQ=グルタミン。
【００１０】 ペプチドデホルミラーゼは、例えばユーバクテリア、例えば大腸菌 (Escheric
hia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、クロストリジウム アセトブチリカム
(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム ビーエリンキイ(Clostridi
um beijerinckii)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、サーモトガ
マリティマ(Thermotoga maritima)、サームス アクアティカス(Thermus aquati
cus)、サームス サーモフィルス(Thermus thermophilus)、カロスリックス(Cal
othrix) PCC 7601、バチルス ステロサーモフィルス(Bacillus stearothermoph
ilus)またはラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)から得ることが
できる。好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)から得ることができる酵素が使
用される。
【００１１】 好ましくは、ペプチドデホルミラーゼは２価の金属イオンと共に使用され、そ
れによって、金属は、補因子として、周期律系（新しいIUPAC版；化学および物
理学のハンドブック(Handbook of Chemistry and Physics)、第70版、CRCプレス
(Press)、1989-1990年、カバーの内側の頁参照）の第５〜11族から選択される。
好ましくは金属は、V、Cr、Fe、Ni、Mn、Co、Cu、PdおよびPtからなる群より、
特にFe、Ni、MnおよびCoからなる群より選択され、最も好ましくはFeまたはNiで
ある。 好ましくは、２価金属イオンの量は、酵素のモル数にほぼ等価でなければなら
ない。適当には、これらの２価金属イオンとPDF分子の数との間のモル比は0.6〜
1.4、好ましくは0.8〜1.2の範囲にあり、最も好ましくは２価金属イオンの量は
酵素と等モルである。
【００１２】 本発明のために必要であるような補因子を有するPDF酵素を得るために、PDFに
おける２価金属イオンの交換を、グロケ(Groche)ら、Biochem. Biophys. Res. C
omm., 246, 342-346 (1998)に記載されているような種々の方法によってなすこ
とができる。これらの方法は、必要なら、元の酵素を金属キレート化合物で処理
することによるアポ酵素の製造より前に(preceeded) 、所望の２価金属イオン過
剰中で元の酵素をインキュベーションすることによる単純な金属交換を含む。さ
らには、所望の２価金属イオンは、Fe2+に対する所望の２価金属イオンの比を増
加した細菌増殖培地を用いることによって、（酵素分子の少なくとも一部に）す
でに導入されていることができる。
【００１３】 さらに、酵素の安定性を高めるために、処置をなし得る。例えば、安定化剤、
例えばカタラーゼ、トリス-（2-カルボキシエチル）ホスフィン、グルコースオ
キシダーゼもしくはそれらの組合せの添加；またはPDFの濃度の増加、例えば少
なくとも0.1mgのPDF /ml、より好ましくは少なくとも1.0mg /mlのPDF濃度への増
加である。実際的な濃度が使用されるなら、PDFの濃度の上限は重要ではない。
容易に酸化可能な金属イオン、例えばFe++が補因子として存在するかまたは容易
に酸化可能な基質が存在するときには、安定化の処置の使用は特に好ましい。そ
うでないなら、例えばNi++が補因子として存在する場合には、酵素は安定化剤な
しでさえ非常に安定であるとわかったので、安定化剤の添加は余計であると思わ
れた。 （以下、上記段落と重複）
【００１４】 さらに、酵素の安定性を高めるために、処置をなし得る。例えば、安定化剤、
例えばカタラーゼ、トリス-（2-カルボキシエチル）ホスフィン、グルコースオ
キシダーゼもしくはそれらの組合せの添加；またはPDFの濃度の増加、例えば少
なくとも0.1mgのPDF /ml、より好ましくは少なくとも1.0mgのPDF /mlの濃度への
増加である。実際的な濃度が使用されるなら、PDFの濃度の上限は重要ではない
。容易に酸化可能な金属イオン、例えばFe++が補因子として存在するかまたは容
易に酸化可能な基質が存在するときには、安定化の処置の使用は特に好ましい。
そうでないなら、例えばNi++が補因子として存在する場合には、酵素は安定化剤
なしでさえ非常に安定であるとわかったので、安定化剤の添加は余計であると思
われた。
【００１５】 あるいは、例えば（脱）ホルミル化反応において高められた活性または鏡像異
性選択性を有する、遺伝的に操作したPDFの変異体を使用することができる。こ
れらの変異体は、多数の異なるアプローチにより、例えば部位特異的変異誘発、
部位特異的ランダム変異誘発、位置特異的ランダム変異誘発および完全にランダ
ムな変異誘発によって生成することができ、後者の変異誘発形態が、方向付けら
れた進化としてよりよく知られている。これらの異なるタンパク質操作アプロー
チを行うための一般的な許容できる方法は、当業者によく知られている。ランダ
ムアプローチが適用されるなら、変異誘発周期は、耐性があり、かつ活性な変異
体の選択が次にくる必要があり、それによって、適当な変異体の同定に至る。PD
F変異体を得るために、異なるタンパク質操作アプローチの組合せおよび／また
はランダム変異誘発の数巡りがまた使用され得る。
【００１６】 本発明の酵素的脱ホルミル化またはホルミル化のための反応条件はあまり重要
ではなく、使用される基質に依存し得る。PDFに対して不活性な任意の適当な溶
媒系を施与することができ、そのような溶媒としては、水性系（溶液もしくはス
ラリー）または、反応条件下で不活性な水混和性有機溶媒をまた含む水性系を包
含する。しかしながら、水性系が好ましい。N-ホルミル化合物の濃度がまた重要
でなく、例えば約0.1〜1000mMの範囲にあり得る。N-ホルミル化合物のすべてが
溶解されることは必要でなく、その一部が、スラリーとして存在することができ
る。PDFの濃度がまたあまり重要でなく、通常、ホルミル化合物の0.001〜100重
量％であり、例えば約0.2mM のPDFである。反応のためのpHは好ましくは4.0〜11
.0の範囲、より好ましくは5.0〜10.0の範囲で選択される。最適pHは、α-アミノ
ニトリルおよび／もしくはN-ホルミル-α-アミノニトリルの安定性、ならびに／
または酵素の安定性および／もしくは活性により決定される。当業者は最適pH値
を容易に決定することができる。温度はあまり重要でなく、適当には、10〜50℃
の範囲、例えば約37℃であるが、熱安定性PDF酵素については、より高い温度が
施与され得る。 （脱）ホルミル化された鏡像異性体の絶対配置が決定された場合には、S-鏡像
異性体が、R-鏡像異性体より急速に（脱）ホルミル化されると思われた。光学純
度は、鏡像異性体過剰率(ee)によって与えられ、酵素の鏡像異性選択性はEによ
り示され、kf／ksとして計算され、ここで、kfは最も急速に（脱）ホルミル化さ
れた鏡像異性体の（脱）ホルミル化の速度定数として定義され、ksは最も遅く（
脱）ホルミル化された鏡像異性体の（脱）ホルミル化の速度定数として定義され
る。
【００１７】 任意的に、疎水性の相互作用を促進する塩が反応混合物に添加され、そのよう
な塩は、例えばアンモニウム、Rb、K、Na、CsまたはLiの硫酸塩、リン酸塩、亜
硫酸塩または酢酸塩である。最も好ましくは、硫酸アンモニウムまたは硫酸リチ
ウムが使用される。
【００１８】 以下の３実施例により、それに限定されることなく本発明をさらに説明する。
【００１９】
【実施例】
略語： TB培地：12g/リットルのバクト-トリプトン(Bacto-Tryptone)、ディフコ(Difc
o)；24 g/リットルの酵母抽出物、ディフコ(Difco)；4 g/リットルのグリセロー
ル；2.3 g/リットルのKH2PO4；12.5 g/リットルのK2HPO4； Hepes：N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタン硫酸； AEBSF：2-アミノエチル-p-ベンゼンスルホニルフロリド； TCEP：トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン。 MOPS：3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸。 MES：2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸。PDF(Fe)の分離 使用した方法の詳細な議論のためには、グロケ(Groche)ら、BBRC 246, 342-34
6 (1998)参照。 1.6リットルのTB培地中で30℃にて14〜16時間増殖させた、過剰生産している
大腸菌(E.coli)細胞から、PDF(Fe)を分離した。約13g（湿潤重量）の細胞ペース
トを、26mlの緩衝液（20mMのHepes/KOH、100mMのKF、pH7.7、10μg/mlのカタラ
ーゼ（牛肝臓から）（ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim)）およ
び1mMのAEBSFで栄養補給したもの）中に懸濁させ、0℃にて超音波（ブランソン(
Branson) B12、20分間）により崩壊し、200,000gにて１時間遠心分離した。透明
な上清（1.3gのタンパク質；ビウレット反応による）を、pH7.7に調整した1.3ml
の10％（重量／体積）Polymin G-35(BASF)と混合し、40,000gにて10分間遠心分
離した。20mMのHepes/KOH 、100mMのKF 、0.2mMのTCEP、pH7.7にて平衡させてお
いた、20mlのMet-Lys-セファロースカラムに、上清を施与した。20mMのHepes/KO
H、100mMのKF、0.2mMのTCEP、pH7.7の120mlで洗浄した後、20mMのHepes/KOH、10
0mMのKCl、0.2mMのTCEP、pH7.7の150mlにてPDF(Fe)を溶出した。タンパク質含有
画分を、アミコン(Amicon) PM10膜を用いた限外ろ過によって濃縮した（収量：1
40mgのタンパク質、1400U/mg；グロケ(Groche)らに従って測定した）。TCEP濃度
を1mMに、かつタンパク質濃度を40mg/mlに調整した後、PDF(Fe)ストック溶液（4
0mg/ml=2mM）を−60℃にて凍結して貯蔵した。 解凍後、PDF(Fe)ストック溶液は、以下に記載する脱ホルミル化実験に直接使
用することができた。しかしながら、低いPDF(Fe)濃度の溶液がこれらの脱ホル
ミル化実験のために必要とされるなら、PDFストック溶液をさらに、20mM Hepes/
KOH、pH7.7、100mMのKCl、1mg/mlの牛血清アルブミン、10μg/mlのカタラーゼ溶
液で希釈した。HPLC-分析 すべての場合に、２つの脱ホルミル化した異性体が互いに分離され、ホルミル
化された異性体から分離されるHPLC条件が展開されなければならなかった。この
ために、２つの異なる技術が適用された。すなわち、以下に記載する方法Aおよ
び方法Bである。 種々の反応時間後の試料中の脱ホルミル化した異性体の濃度から、（脱）ホル
ミル化速度定数（M-1秒-1で表したkfおよびks）を両方の鏡像異性体について計
算することができ、ならびに、脱ホルミル化された生成物のそれぞれのee値を計
算することができた。酵素の鏡像異性選択性（E値）は、比kf／ksをとることに
よって計算され、以下の実施例において与えられ、ならびに、実験中に観察され
た脱ホルミル化生成物の最大ee値が与えられる。方法A（誘導なし） クラウンパック(Crownpak)CR(+)カラム（4 x 150 mm）を使用した。脱ホルミ
ル化混合物から取られた試料（5μl）を95μlの水性HClO4（10mM）と混合して、
PDF(Fe2+)を不活化した。短時間の遠心分離後、20μlの上清をクラウンパック(C
rownpak)CR(+)カラムに施与した。特定のクロマトグラフィー条件および滞留時
間については、実施例IIおよびIII参照。方法B（o-フタルジアルデヒド(OPA)およびN-アセチル-L-システイン(NAC)を用い たプレカラム誘導） 脱ホルミル化混合物から取られた試料（25μl）を25μlの水性HClO4（100mM）
と混合して、PDF(Fe2+)を不活化した。短時間の遠心分離後、40μlの上清を、80
μlの1M水性H3BO3/NaOH、pH11に添加し、次いで20μlのOPA試薬（実施例に示し
た濃度の、H2O/CH3OH １：１体積／体積中のOPAからなる）を加え、10分後、20
μlのNAC試薬（実施例に示した濃度の、H2O/CH3OH １：１体積／体積中のNACか
らなる）を加えた。５分後、80μl（500mM）の水性H3PO4の添加によって誘導を
停止し、20μlの溶液をヌクレオシル(Nucleosil) 120-5 C18カラム（250 x 4 mm
）に即座に施与した。温度は周囲温度であり、検出は、257nmおよび／または340
nmの波長を用いた分光光度法であり；使用した溶出液は、80モル％の水性0.05M
H3PO4（1MのNaOHを用いてpH=7.0にした）および20体積％のCH3CNの混合物である
。
【００２０】実施例I：Li2SO4の存在下、pH=7.2でのN-ホルミル-バリンアミノニトリルの脱ホ ルミル化 N-ホルミル-バリンアミノニトリルの脱ホルミル化反応を、1.5mlのエッペンド
ルフ(Eppendorf)反応試験管中で行った。全体積200μlを有する反応混合物は、1
00mMの水性MOPS/NaOH、2MのLi2SO4緩衝液pH7.2および10ｍMのN-ホルミル-バリン
アミノニトリルを含んでいた。37℃に熱平衡後、50μMのPDFの添加により、脱ホ
ルミル化反応を開始した。種々の反応時間で反応混合物の試料を取り、反応は、
HClO4の添加により停止させた。 [OPA]=16 mg/mlおよび[NAC]=4 mg/ml、滞留時間：8.6分間（L-鏡像異性体）、
10.2分間（D-鏡像異性体）にて、方法Bにしたがって、HPLC分析を行った。結果： E=47.9 eemax＝95.5 ks=0.62 M-1秒-1 Kf=29.7 M-1秒-1
【００２１】実施例II：Li2SO4なし、pH 7.2でのN-ホルミル-m-メトキシフェニルアラニンア
ミノニトリルの脱ホルミル化 100ｍMのMOPS/NaOH、2MのLi2SO4緩衝液pH7.2の代わりに100mMのMOPS/NaOH、25
0mMのNaCl、0.1mg/mlのカタラーゼ緩衝液pH7.2を使用したこと以外は実施例Iに
記載したようにして、N-ホルミル-m-メトキシフェニルアラニンアミノニトリル
の脱ホルミル化反応を行った。さらに、7.2mMのN-ホルミル-m-メトキシフェニル
アラニンアミノニトリルおよび2.5μMのPDFを使用した。 方法Aにしたがって、HPLC-分析を行った。 溶出液：90体積％の10mM水性HClO4／10体積％のCH3OH、 流速：0.8ml/分、温度：5℃、検出：210nm、 滞留時間： 脱ホルミル化された鏡像異性体：23.8分 30.7分 N-ホルミルアミノニトリル： 52.0分。結果： E=685 eemax＝99.0 Kf =1370 M-1秒-1 ks =2 M-1秒-1
【００２２】実施例III：Li2SO4添加なし、pH 6.2でのN-ホルミル-フェニルアラニンアミノニ トリルの脱ホルミル化 100ｍMのMOPS/NaOH、2MのLi2SO4緩衝液pH7.2の代わりに100mMのMES/NaOH緩衝
液pH 6.2を使用したこと以外は実施例Iに記載したようにして、N-ホルミル-フェ
ニルアラニンアミノニトリルの脱ホルミル化反応を行った。さらに、7.5mMのN-
ホルミル-フェニルアラニンアミノニトリルおよび20μMのPDFを使用した。 方法Aにしたがって、HPLC-分析を行った。 溶出液：90体積％の10mM水性HClO4／10体積％のCH3OH、 流速：0.8ml/分、温度：5℃、検出：210nm、 滞留時間： 脱ホルミル化されたアミノニトリル：11.8分 15.1分 N-ホルミルアミノニトリル： 28.6分。結果： E=880 eemax＝98.8 Kf =880 M-1秒-1 ks =1 M-1秒-1
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ワグナー，アドルフ，フリッツ，フォルカ ー ドイツ国， 71638 ルドウィグスバーグ， ヴィスケルストラッセ 25 (72)発明者 ブロクスターマン，クワイリナス，ベルナ ルダス オランダ国， 6151 ジェイエイ シッタ ルド， ゲルレストラート 11 (72)発明者 ボエステン，ウィルヘルムス，フベルタ ス，ジョセフ オランダ国， 6132 ビージェイ シッタ ルド， ブラウンツラーン ９ Ｆターム(参考） 4B064 AE01 CA21 CB30 CD01 CD27 DA20

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 高められた光学純度を有するα-アミノニトリルの製造方法
    であって、キラルなN-ホルミル-α-アミノニトリルの鏡像異性体の混合物をアシ
    ラーゼと接触させ、それによってN-ホルミルアミノニトリルの鏡像異性体の１つ
    が、保護されていない対応するα-アミノニトリルへと選択的に脱ホルミル化さ
    れる方法。
  2. 【請求項２】 高められた光学純度を有するα-アミノニトリルの製造方法
    であって、キラルな（保護されていない）α-アミノニトリルの鏡像異性体の混
    合物をアシラーゼおよびホルミル化剤の存在下でホルミル化反応に供し、それに
    よって鏡像異性体の１つが選択的にN-ホルミル-α-アミノニトリルに転化される
    方法。
  3. 【請求項３】 ホルミル化剤として、ギ酸、ギ酸アミドまたはギ酸エステル
    が使用される請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 金属が周期律系の第５〜11族から選ばれる２価金属イオンを
    有するペプチドデホルミラーゼが、アシラーゼとして使用される請求項１〜３の
    いずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 ペプチドデホルミラーゼが、分類EC 3.5.2.27またはEC 3.5.
    1.31から選ばれる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 ペプチドデホルミラーゼが、 (i)HEXXH、(ii)EGCLSおよび(i
    ii)GXGXAAXQの配列を含む請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 ペプチドデホルミラーゼが大腸菌 (Escherichia coli)から
    のものである請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 ２価金属が、Fe、Ni、MnおよびCoからなる群より選択される
    請求項４〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 ２価金属がNiである請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 さらに安定化剤が添加される請求項１〜８のいずれか１項
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】 安定化剤がカタラーゼである請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ２価金属がFeである請求項１０または１１記載の方法。
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