DE68906904T2 - Verfahren zur herstellung von optisch aktiven 2-arylalkansaeuren. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von optisch aktiven 2-arylalkansaeuren.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven 2-Arylalkansäuren der allgeineinen Formel (I):
- Ar - H - COOH (I)
- durch enantioselektive Hydrolyse der entsprechenden racemischen Amide.
- In der allgemeinen Formel (I) stellt Ar einen gegebenenfalls substituierten aromatischen Rest dar und R bedeutet einen Ethyl-, Propyl- oder Isopropyl -Rest.
- Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung der S(+)-Enantiomeren der 2-Arylalkansäuren der allgemeinen Formel (I).
- Ganz besonders betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung der S(+)-Enantiomeren der 2-Phenyl-3-methyl-buttersäuren der allgemeinen Formel (II):
- in der X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Chloratom, oder einen Methylrest darstellt.
- Es ist bekannt [Y. Kawakami, J. Synth. Org. Chem., 38, 574 (1980)], daß die Ester der allgemeinen formel (III):
- in der X wie vorstehend definiert ist, bemerkenswerte insektizide Eigenschaften besitzen.
- In der allgemeinen Formel (III) führt die Anwesenheit von zwei asymmetrischen Kohlenstoffen zur Existenz von vier möglichen optischen Isomeren. Unter diesen Isomeren besitzen diejenigen, die von den S(+)-Isomeren der Säuren der allgemeinen Formel (II) abgeleitet sind, eine höhere Aktivität als die entsprechenden racemischen Produkte (DE 27 37 297).
- Es ist bekannt [H. Nohira et coll., Agric. Biol. Chem., 50, 675 (1986)], optisch aktive Isomere der Produkte der allgemeinen Formel (II) durch bevorzugte Kristallisation des Salzes der Säure der allgemeinen Formel (II) mit Diethylamin herzustellen.
- Es wurde jetzt gefunden, und dies bildet den Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß die 2-Arylalkansäuren der allgemeinen Formel (I) in der S-Form durch enantioselektive Hydrolyse der entsprechenden racemischen Amide mit Hilfe von Mikroorganismen oder Enzymen erhalten werden können, die in Abhängigkeit von ihrer Fähigkeit, racemisches α-Phenylpropionamid zur S-α-Phenylpropionsäure zu hydrolysieren, selektiv trennen.
- Die Selektion der Mittel, die die enantioselektive Hydrolyse der Amide von racemischen 2-Arylalkansäuren der allgemeinen Formel (I) ermöglicht, wird durchgeführt, indem man das Mittel mit α-Phenylpropionamid in einem geeigneten Medium solange in Kontakt bringt, bis 20 % des Produktes umgewandelt sind und man anschließend den Enantiomeren-Überschuß mißt. Die hydrolysierenden Mittel werden unter Bedingungen ausgewählt, die racemisches α-Phenylpropionamid zur S-α-Phenylpropionsäure mit einem Enantiomeren-Überschuß von mehr als 65 % selektieren.
- Unter den Mikroorganismen, die besonders gut geeignet sind, kann man die Stämme von der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium nennen, und insbesondere Brevibacterium R 312 (CBS 717.73) und Corvnebacterium N 771 (FERM P 4445) oder Corynebacterium N 774 (FERM P 4445), die es ermöglichen, S-2-Arylalkansäuren mit einem Enantiomeren-Überschuß des S-Isomeren von im allgemeinen höher als 90 % zu erhalten.
- Es ist überraschend festzustellen, daß unter den Mikroorganismen Brevibacterium R 312, beschrieben in FR-7 901803/2 447 359 und in Advances in Biochemical Engineering, Vol.14, S.1-32 (1980), das eine allgemeine, nicht stereospezifische Amidase besitzt, stereospezifisch die Amide der racemischen 2- Arylalkansäuren der allgemeinen Formel (I) hydrolysiert, während sein Mutant A&sub4;, der eine L-stereospezifische Amidase besitzt, nicht die Amide der racemischen 2-Arylalkansäuren der allgemeinen Formel (I) hydrolysiert.
- Dabei ist ebenfalls festzustellen, daß Corynebacterium N 771 und Corynebacterium N 774, beschrieben in EP-0 187 680, beispielsweise das Milchsäurenitril zur D,L-Milchsäure und das α-Amino-phenylpropionitril zum D,L-Phenylalanin hydrolysieren, ohne dabei eine Stereoselektivität zu beobachten.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren im allgemeinen im homogenen oder heterogenen, wäßrigen oder wäßrig-organischen Milieu durchgeführt, unter Bedingungen von Temperatur und pH-Wert, die sich nach den Eigenschaften des Mikroorganismus und des Enzyms richten, und unter Rühren einer Suspension von Zellen oder Zell-Extrakten des Mikroorganismus und des Amides der racemischen 2-Arylalkansäure.
- Das Verfahren führt zu einer Mischung von S-2-Arylalkansäure und dem Amld der R-2-Arylalkansäure. Dieses letztere kann nach bekannten Techniken zum Amid der racemischen 2-Arylalkansäure racemisiert werden, das dann von neuem unter den vorstehend angegebenen Bedingungen zur S-2-Arylalkansäure hydrolysiert wird.
- Die Racemisierung kann beispielsweise mittels Erhitzen mit Ammoniak auf eine Temperatur zwischen 80 ºC und 160 ºC durchgeführt werden.
- Wenn der verwendete Mikroorganismus die Eigenschaft besitzt, Nitrile zu hydrolysieren, verbunden mit der Eigenschaft, enantioselektiv α-Phenylpropionamid zu hydrolysieren, ist es möglich, eine S-2-Arylalkansäure zu erhalten, entweder ausgehend vom Nitril der racemischen 2-Arylalkansäure oder vom Amid der racemischen 2-Arylalkansäure.
- Die nachfolgenden, als nicht einschränkend angegebenen Beispiele zeigen, wie die Erfindung in der Praxis angewendet werden kann.
- a) Der Stamm Brevibacterium R 312 (CBS 717.73) wird in einem Fläschchen, gerührt 14 Stunden lang bei einer Temperatur von 28 ºC, in einem Milieu kultiviert, das die folgende Zusammensetzung besitzt:
- - Glukose 10 g
- - (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 5g
- - KH&sub2;PO&sub4; 1,01 g
- - Na&sub2;HPO&sub4;, 12H20 1,64 g
- - K&sub2;HPO&sub4; 0,82 g
- - CaCl&sub2;, 2H&sub2;O 0,012 g
- - ZnCl&sub2; 0,0012 g
- - FeSO&sub4;, 7H&sub2;O 0,0012 g
- - MnSO&sub4;, H&sub2;O 0,0012 g
- - MgSO&sub4;, 7H&sub2;O 0,5 g
- - Thiamin-Hydrochlorid 0,002 g
- - Wasser zu .... 1000 cm³
- Diese Vorkultur wird für die Insemination eines Kulturmediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung aufweist, aber zusätzlich N-Methylacetamid in einer Konzentration von 20 mM enthält. Die Kultur wird in einem Fläschchen durchgeführt, gerührt 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 28 ºC. Die erhaltene Biomasse wird durch Zentrifugieren abgetrennt und anschließend zweimal mit einer Natriumchlorid-Lösung (9 g/l) gewaschen.
- b) Ein Zentrifugations-Rückstand, enthaltend 13 g Zellen von Brevibacterium R 312, ausgedrückt in Trockenmasse, wird in 2 cm³ Phosphat-Puffer (50 mM) bei pH 7 suspendiert. Dann gibt man 25 mg racemisches 2-Phenyl-propionitril (190 uMol) hinzu. Nach 24 Stunden Rühren bei 25 ºC wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von 23 cm3 einer Mischung Acetonitril/N-Chlorwasserstoffsäure (90/10, Vol.) verdünnt. Die Bakterien werden durch Zentrifugieren entfernt. Die Zusammensetzung des aufschwimmenden Anteiles wird durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) bestimmt.
- Der aufschwimmende Anteil enthält:
- 119 uMol 2-Phenylpropionamid
- 62 uMol 2-Phenylpropionsäure.
- Dann gibt man Natriumchlorid hinzu, um die Abtrennung der wäßrigen oder organischen Phasen zu begünstigen. Nach Eindampfen der organischen Phase bis zur Trockne wird der Rückstand in 20 cm³ einer Mischung Chloroform/Natriumhydroxid 0,1N (1/1, Vol.) aufgenommen.
- Die basische Phase wird angesäuert und anschließend mit Chloroform extrahiert.
- Die Messung des Drehvermögens zeigt, daß der Enantiomeren-Überschuß an dem S(+)-Isomeren 100 % beträgt. L
- Nach der Derivatisierung der 2-Phenylpropionsäure mit R(+ )-α-Methylbenzylamin zeigt die Analyse durch HPLC, daß der Enantiomeren-Überschuß 96,4 % beträgt.
- Ein Zentrifugations-Rückstand, enthaltend 320 mg Zellen von Brevibacterium R 312, ausgedrückt in Trockenmasse, wird in 5 cm³ Phosphat-Puffer (50 mM) bei pH 7 suspendiert. Dann gibt man 71,2 mg racemisches 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-butyramid (337 pMol) hinzu. Nach 117 Stunden Rühren bei 25 ºC wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von 45 cm³ einer Mischung Acetonitril/N-Chlorwasserstoffsäure (90/10, Vol.) verdünnt. Die Bakterien werden durch Zentrifugieren entfernt. Die Zusammensetzung der Mischung wird durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) bestimmt.
- Der aufschwimmende Anteil enthält:
- 258 uMol 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-butyramid
- 73 uMol 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-buttersäure.
- Dann gibt man Natriumchlorid hinzu, um die Abtrennung der wäßrigen und organischen Phasen zu begünstigen. Zu der durch Dekantation abgetrennten organischen Phase gibt man eine Mischung Ether/Natriumhydroxid 0,1N (3/1, Vol.) Nach Abtrennung der wäßrigen und organischen Phasen durch Dekantation und Ansäuern der wäßrigen Phase wird die 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-buttersäure mit Chloroform extrahiert.
- Die Messung des Drehvermögens zeigt, daß der Enantiomeren-Überschuß an dem S(+)-Isomeren 97,5 % beträgt.
- Nach der Derivatisierung der Säure mit R(+)-α-Methylbenzylamin zeigt die Analyse durch HPLC, daß der Enantiomeren-Überschuß größer als 90 % ist.
- Ein Zentrifugations-Rückstand, enthaltend 321 mg Zellen von Brevibacterium R 312, ausgedrückt in Trockenmasse, wird in 5 cm3 Phosphat-Puffer (50 mM) bei pH 7 suspendiert. Dann gibt man 75,9 mg racemisches 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-butyronitril (392 uMol) hinzu. Nach 117 Stunden Rühren bei 25 ºC wird die Reaktionsmischung durch Zugabe von 45 cm³ einer Mischung Acetonitril/N-Chlorwasserstoffsäure (90/10, Vol.) verdünnt. Die Bakterien werden durch Zentrifugieren entfernt. Die Zusammensetzung der Mischung wird durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) bestimmt.
- Der aufschwimmende Anteil enthält:
- 289 uMol 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-butyramid
- 78 uMol 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-buttersäure.
- Die Säure wird unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen extrahiert.
- Nach der Derivatisierung der Säure mit R(+)-α-Methylbenzylamin zeigt die Analyse der Mischung durch HPLC, daß der Enantiomeren-Überschuß an dem S(+)-Isomeren der 2-(4-Chlorphenyl)-3-methyl-buttersäure 97 % beträgt.
Claims (8)
1.) Verfahren zur Herstellung von S(+)-Enantiomeren von
2-Arylalkansäuren der allgemeinen Formel
Ar - H - COOH
worin Ar einen gegebenenfalls substituierten aromatischen Rest
bedeutet, und R für einen Ethyl-, Propyl- oder Isopropylrest
steht, dadurch gekennzeichnet, daß man enantioselektiv die
Amide der entsprechenden racemischen 2-Arylalkansäuren, die
gegebenenfalls in situ hergestellt worden sind, in Anwesenheit
eines Mikroorganismus oder eines Enzyms, entstammend diesem
Mikroorganismus, ausgewählt in Abhängigkeit von seiner
Befähigung, selektiv racemisches α-Phenylpropionamid zu der
S-α-Phenylpropionsäure mit einem Enantiomeren-Überschuß von
mehr als 65 % zu hydrolysieren, hydrolysiert, wonach man die
S-2-Arylalkansäure von dem Amid der R-2-Arylalkansäure
abtrennt.
2.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Mikroorganismen unter Brevibacterium und
Corynebacterium ausgewählt werden.
3.) Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Mikroorganismen unter Brevibacterium R 312
(CBS 717.73), Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) und
Corynebacterium N 774 (FERM P 4446) ausgewählt werden.
4.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mikroorganismus eine Nitrilase-Aktivität besitzt, die
mit der Befähigung, enantioselektiv racemisches α-
Phenylpropionamid zu der S-α-Phenylpropionsäure zu
hydrolysieren, assoziert ist.
5.) Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man direkt das Nitril der racemischen 2-Arylalkansäure zu
der S-2-Arylalkansäure hydrolysiert.
6.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen unter Brevibacterium
und Corynebacterium ausgewählt werden.
7.) Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Mikroorganismen unter Brevibacterium R 312
(CBS 717.73), Corynebacterium N 771 (FERM P 4445) und
Corynebacterium N 774 (FERM P 4446) ausgewählt werden.
8.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur
Herstellung von Säuren der allgemeinen Formel
worin X ein Halogenatom oder den Methylrest bedeutet, in der
S(+)-Form.
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