JPS63500004A - 光学活性な有機化合物の調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光学活性な有機化合物の調製方法 光肌Ω丘景 本発明は、光学活性なアミノ酸の調製方法に関する。更に詳しくは、本発明は、 アミノ酸のアミノニトリル類似体の鏡像異性混合物の水溶液を鏡像異性選択的な ニトリラーゼで処理し、その後生成する光学活性アミノ酸又はアミノ酸アミドを 回収することから成る、光学活性なアミノ酸又はアミノ酸アミドの単一の鏡像異 性体を調製する方法に関する。

光学活性のアミノ酸は工業的に大きな興味のある有機化合物のクラスを構成する 。従って天然に産出するアミノ酸は食物や食料添加物として大きなスケールで工 業的に適用され、近年では天然に見出されず後に非天然性アミノ酸として参照す るいくつかのアミノ酸が、例えば種々の薬学的組成物の構成成分や光学活性化合 物の有機合成のための中間体としての幅広い用途が見出されている。

それらの分子構造に起因して、多くのアミノ酸はアミノ酸分子のいわゆる光学異 性に関連して異なる２つの固有の形態で存在することができる。分子レベルでは 他の鏡像であるこれら２つの形態のアミノ酸は通常アミノ酸のＤ一体及びＬ一体 として表示される。天然に見出される多くのアミノ酸はＬ−立体配置であり従っ て、対応するＤ一体又は異性体は生体細胞により代謝されることができず通常の 細胞代謝及び細胞機能を阻害するので、食物や食料添加物として使用されるアミ ノ酸もし一立体配置であることが必須である。しかしＤ−アミノ酸のこの能力は 、例えばその活性が分子構造中の天然にない光学異性の残基による又は残基によ り高められる、薬学的に活性な化合物中への天然にないアミノ酸の異性体を組み 入れることにより役立てて利用することができる。このような場合には、天然に 存在する立体配置を有する分子種の存在はこのような場合に問題の化合物の生物 的活性に有害な効果を及ぼずので、天然にない立体配置のアミノ酸のみを使用す ることが必須である。

天然及び天然にないアミノ酸の広い用途のため、一般に幅広い種類のアミノ酸の 工業的適用のための光学的に純粋なつまり鏡像異性的に純粋な天然及び天然にな い立体配置を利用できることが高度に望まれており、−古道にＤ一体とＬ一体の 混合物であるいわゆるラセミ体は限定された工業的興味しかない。

アミノ酸の調製において１つの鏡像異性体を過剰に供給するという希望は、この ような化合物の工業的生産に現在使用される方法中に反映されている。微生物の 性質に起因して天然の立体配置のアミノ酸を単独に生産することになる微生物醗 酵により、食物及び食料添加物として使用される多くのアミノ酸が生産される。

更に微生物又は他の生体から誘導される酵素も、このような場合、通用された酵 素の光学異性からその光学異性を誘導するアミノ酸の生産に使用されてきた。

光学活性なアミノ酸の調製に使用されてきた酵素的方法の例が米国特許明細古巣 ４．０８０，２５９号及び第３．９７１．７００号に記載されている。これらの 特許に開示された方法は次のスキームＩのように例示することができる。

Ｐｈ−ＣＨ０＋ＨＣＮ　＋Ｎ）１３→ ここで、ｐｈは例えばフェニルを示す。

示されているように、酵素つまりアミノ酸アミダーゼ、いわゆるアミノペプチダ ーゼはアミノ酸アミドを対応するアミノ酸に変換するために利用される。スキー ムＩから分かるように、例示した方法で使用されるアミノ酸アミドは、光学活性 のない出発物質からアミノ酸ニトリルのラセミ体を経由して入手され、その結果 は該方法で使用されたアミノ酸アミドはラセミ体混合物である。しかし該方法で 使用された酵素は光学異性であり、従ってアミノ酸アミドの２つの異性体を識別 することができる。その結果、アミノペプチダーゼで触媒される反応の経路中で 発生するアミノ酸はＬ−立体配置で、一方酵素的変換が終了した後の反応混合物 中の残るアミノ酸アミドはＤ−立体配置である。これら２つの化学的に別個の種 類の化合物は従来法に従って分離することができ、このようにして得られる鏡像 異性的に純粋なアミノ酸アミドは続いて化学的手段で加水分解して光学的に純粋 なり一アミノ酸を与える。従って上記米国特許明細書に開示された方法は、光学 的に純粋なＬ−及びＤ−アミノ酸の調製のための手段としての役割を果たす。

アミノニトリルを対応するアミノ酸アミドに変換するための酵素の使用は実行可 能であるが、化学的加水分解と比較して利点を提供しない。ジャラゲス（Ｊａｌ 　Ｉａｇｅａｓ）と共同研究者によりアトパンシーズ・イン・バイオケミカル・ エンジニアリング、１４　、　（１９８０）　１−３２、に記載されているよう に、アミノニトリルの酵素的変換はＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の混合物を与え ることになる。従ってこの酵素的方法は、アミノニトリルの化学的変換の欠点、 つまりラセミ体の出発物質の半分のみが反応の経路中で発生するＤ−アミノ酸ア ミドから分離されなければならない所望のアミノ酸に変換されるという欠点に類 似した欠点を被ることになる。

衾班公概要 本発明方法は、アミノニトリルの２つの鏡像異性体の１つを対応するアミノ酸又 はアミノ酸アミドへ優先的に変換するニトリラーゼを使用して、アミノニトリル の対応するアミノ酸又はアミノ酸アミドへの変換を行うことを特徴としている。

本発明方法は、鏡像異性選択的なニトリラーゼが、ラセミ体アミノニトリルから 、１つの鏡像異性体を過剰に含むアミノ酸又はアミノ酸アミドを生成する役割を 果たす条件下で、見出され使用されることができるという驚くべき観察に基づく ものである。所望の化合物のみを得ることが好ましいにもかかわらず、通常は所 望の化合物を過剰に含む混合物が得られる。本発明の本質的な特徴は次のスキー ム■に例示される。

ここでＲは下記に定義する通りである。

示されているように、出発物質として使用されるアミノニトリルは、アミノニト リルのＤ−及びＬ一体の、例えば等量の混合物の形態で存在する。しかしながら 本発明方法に従って適用されるニトリラーゼは、２つの鏡像異性体の１つを優先 的に対応するアミノ酸アミド又は、直接対応するアミノ酸のいずれかへ変換する 。その結果、酵素的変換で得られる反応混合物は２つの鏡像異性体の１つ、つま りアミノ酸又はアミノ酸“１ミドを過剰に含む。スキーム■でも示したように、 アミンニトリルの１つの鏡像異性体の他の鏡像異性体への変換は、アミノニトリ ルの鏡像異性体のうちの１つの酵素的優先的変換と同時に起こるため、本発明に よるアミノニトリルの全ラセミ体混合物は、アミノ酸又はアミノ酸アミドの１つ の鏡像異性体を過剰に含む反応混合物へ変換されることができる。

本発明方法による調製できる化合物は一般的Ｉ：Ｒ−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＸ　（ １） で表わすことができる：ここで、Ｒはインドリル；ベンジル：ベンジロキシ；ヒ ドロキシ、メルカプト、アミノ、ハロゲン、フェニル、フェノキシ、ベンジル又 は低級アルキルチオで置換されていてもよい低級アルキル；又はヒドロキシ、ア ミノ、ハロゲン、カルボキシ又は低級アルコキシから成る置換基群の１又は２以 上で置換されていてもよいフェニルを表し：Ｘはヒドロキシ又はアミノ；又はそ れらの塩を表している。

それゆえに、出発物質は一般式■： Ｒ−ＣＨ（ＮＨｚ）−ＣＮ　（ＩＩ　）のアミノニトリルであり、ここでＲは上 記で定義した通り、又はその塩である。

Ｒと示されている置換基の例は次の通りである。メチル、イソプロピル、セカン ダリ−ブチル、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ベンジル、１−ヒドロキシ エチル、メルカプトメチル、メチルチオメチル、ベンジロキシ及びフェノキシメ チル。好ましくはＲは、ヒドロキシ、アミノ及び／又は低級アルコキシから成る 群の１又はそれ以上で置換されていてもよいインドリル又はベンジルである。

ここで低級アルキルという語は、８未満、好ましくは５未満の炭素原子を含むア ルキルを示している。同様に低級アルコキシは８未満、好ましくは５未満の炭素 原子を含んでいる。

本発明による酵素的方法は、例えば反応混合物のｐＨ値及び温度をコントロール しながら水溶液中のニトリラーゼとアミノニトリルの混合物を攪拌することによ るバッチ式方法により行うことができる。反応温度は、反応媒体の凝固点と約６ ５℃の間、好ましくは２０と４５℃の間、最も好ましくは約３７℃で行うことが できる。望むならば、反応物の溶解度を増加させるために有機溶媒を利用するこ とができ、そのような溶媒は例えばエタノール、メタノール、イソプロパツール 又はターシャリ−ブタノールのようなアルコールであり、又はジオキサン、Ｎ、 Ｎ−ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフオキシド又はへキサメチルフォス スオラストリアミドのような有機溶媒である。該反応は、反応物の懸濁物又は例 えば水とヘキサン又はシクロヘキサンのような炭化水素のような２つの混合しな い溶媒を使用する２相系で行うことができる。

本発明方法に適用されるニトリラーゼは、精製した酵素、粗酵素溶液、所望の活 性を示す微生物細胞又は細胞のホモジネートであってもよい。必要ならば、固定 された状態又は化学的に修飾された形態の酵素を使用して、利用された反応条件 下で適用された酵素の良好な安定性と反応性を確保してもよい。

本発明方法は、２つの鏡像異性体の１つを本酵素的方法の出発物質として使用さ れるアミノニトリルの２つの鏡像異性体の他のものへの迅速な相互変換を確保す るために中性又はアルカリ性ｐ１（値で行うことができる。この相互変換は７未 満のｐｏ値でも起こることができ、又はそれはアミノニトリルラセマーゼを適用 することにより確保することができる。それゆえ優先的なｐ）Ｉ値は約６から約 １３である。

上述した通り、本発明方法で使用されるニトリラーゼは、アミノニトリルの２つ の鏡像異性体に対して異なった活性を示す酵素である。通常本発明方法により調 製されるアミノ酸又はアミノ酸アミドは２つの鏡像異性体の１つを大過剰に含む ことが望ましいため、好ましくは、これらの鏡像異性体の１つに対して強い選択 性を示すニトリラーゼを使用する。本発明の好ましい態様では、アミノ酸又はア ミノ酸アミドの２つの鏡像異性体の１つは２５％を越える過剰度とする。従って 与えられたアミノニトリルの変換に使用する前に、ニトリラーゼを試験すること が好ましい。この試験は例えば、問題のアミノニトリルを酵素調製液に露出し、 続いてアミノニトリルの少量を変換像生成するアミノ酸アミド及び／又はアミノ 酸を例えば高圧液体クロマトグラフィーにより単離し、そして単離された化合物 の光学純度を分析することにより行うことができる。好ましくは、この試験は適 用されるアミノニトリルの種々の変換度で行われる。

本発明方法で使用される酵素は、微生物、植物又は動物から単離することができ る。しかし好ましくは、バクテリア、菌又は他の微生物のような微生物起源の酵 素を利用する。

ニトリラーゼを生産するための微生物種の例は次の通りでジウム、ルーコノスト ック、セルロモナス、ミクロバクテリ−５Ａ、プロピオニバクテリウム、ミコバ クテリウム、久上２左、ロドトルラ、クロエケラ、ゲオトリフム、そして好まし インＡ４（オランダのラボラトリ−・オン・ミクロバイオロジー（以下ＬＭＤと して示す）に番号ＬＭＤ７９．２で寄託）、ストレインＮ−７７Ｌ　Ｎ　−７７ ４及びＮ−７７５（それぞれ日本のファーメンテ−ジョン・リサーチ・インステ ィチュート（以下ＦＲＩとして示す）に第４４４５号、４４４６号及び４４４７ 号として寄託）の株、及びここに参考文献として組み入れられる米国特許明細古 筆４，００１，０８１号の表■に述べられている株Ｒ３３２（オランダのセント ラアルプリュー・フォー・シメルカルチャレス（以下ＣＢＳとして示す’）　、 Ｒ３４０（ＣＢ　Ｓ番号４９５．７４）、Ｒ３４１（ＣＢ　Ｓ番号４９６．７４ ）　、Ａ１１ｌ（ＣＢ　Ｓ番号４９７．７４）、Ｂ２２２（ＣＢ　Ｓ番号４９８ ．７４）　、Ａ１１２．　Ａ１３　、　Ａ１４１．　Ａ１４２．　Ｂ２１１゜Ｂ ２１２．　Ｂ２２１．　Ｃ２１ＨＣＢ　Ｓ番号４９９．７４）　、Ｒ２１、Ｒ２ ２，Ｒ３１１゜Ｒ３１２（ＣＢ　Ｓ番号７１７．７３）及びＲ３３１゜所望のア ミノ酸アミド又はアミノ酸はそれ自身公知である方法、例えば必要に応じて酸性 度を調節した後の沈澱又は蒸発により、反応混合物から単離される。

先行する説明中及び以下の実施例及び請求の範囲中に開示されている特徴は、単 独で又は組み合わされて異なった形態に本発明を現実化するための材料としても よい。

本発明方法を以下の実施例により更に例示するが、該実施例は本発明を限定する ものと考えられるべきではない。これらの実施例はいくつかの好ましい態様を例 示する。

実拒炎上 −４：Ｌ−ロイシンアミドの澗− 鏡像異性選択的なアミノニトリルヒドラターゼの調製品を、塩化アンモニウムの 代用物として１％のグルコース、０．０５％のイースト抽出物及び０．５％のア セトニトリルを含む修正されたＭ９媒体（マニアチスらのモレキュラー・クロー ニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル、Ｃ５）ｌ　、　１９８２年参照）中で 、ニトリラーゼを生産する株第３１１号（１９８６年５月にナショナル・コレク ション・オン・インダストリアル・バクテリア（ＮＣＩＢ）にＮＣＩＢ番号１２ ２５６で寄託）を培養することにより調製した。発生するバイオマスを３日間３ ７℃で成長させた後収穫し、リン酸緩衝液（０，１Ｍ　、　ｐ）１７）で完全に 洗浄し、最後に該緩衝液中に懸濁液として保存した。この懸濁液を次の実施例で 酵素溶液として使用した。

ラセミ体のロイシンアミノニトリルの溶液を次の方法で調製した。

５、５　ｍＺの水中の塩化アンモニウム（０，０３２モル）を、室温で２、２　 ｍｌの水中の３−メチルブタナール（０，０３１モル）の溶液に加えた。３０分 後に、該混合物を０°Ｃまで冷却してシアン化ナトリウム（０，０３１モル）の 溶液を加えた。次いで生成する混合物を１時間Ｏ℃で、次いで１２時間室温で攪 拌した。最後に該溶液をリン酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７）で希釈してアミノニ トリルの最終的な濃度が１２０ｍＭとなるようにした。

続いて該アミノニトリルの酵素的加水分解を、酵素溶液を０、３　ｍＺのアミノ ニトリル溶液光たり０．１−加え、そして生成する混合物を１時間攪拌し、遠心 分離で酵素を除去し、そして最後に生成物を吸収してイオン交換樹脂からそれを 溶離させることにより行った。このような方法で単離されたアミドは、４０％の し一アミドを鏡像異性的に過剰に含んでいた。

実斑皿Ｉ ８′′　なし−ロイシンの８．１！ ロイシンアミノニトリルの溶液を、実施例１で述べた方法と類似した方法で製造 し上記した酵素溶液で処理した。酵素的加水分解の間にときどき、酵素を遠心分 離で除去しその後反応混合物のｐＨを２Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えて１１ に調節した。１５分後に反応混合物のｐＨを初期値に調節し、生触媒と混合した 。この操作を全反応時間６時間の間に５回行い、その後で薄層クロマトグラフィ ーで決定したところアミノニトリルのアミノ酸への変換は完了していた。次いで 該アミノ酸はイオン交換クロマトグラフィーで単離され、３５％鏡像異性的に過 剰に含むことが見出された。

災施貫主 ５　なＬ−バリンアミドの言。す 実施例１で述べた方法と類似した方法でイソブチルアルデヒドからし一バリンア ミドを調製した。反応混合物中のし一アミドの鏡像異性的過剰度は３５％である ことが見出された。

実施桝土 ゝ　なＬ−バリンのＬｌｌｌ 実施例２で述べた方法と類似した方法でイソブチルアルデヒドからし一バリンを 調製した。Ｌ−アミノ酸の鏡像異性的過剰度は３０％であることが見出された。

国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．対応するアミノニトリルの鏡像異性混合物の溶液を鏡像異性選択的なニトリ ラーゼで処理し、続いて生成する光学活性なアミノ酸又はアミノ酸アミドを回収 することから成るアミノ酸又はアミノ酸アミドの調製方法。
2. ２．一般式１： Ｒ−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＸ　（Ｉ） （ここで、Ｒはインドリル；ベンジル；ベンジロキシ；ヒドロキシ、メルカプト 、アミノ、ハロゲン、フェニル、フェノキシ、ベンジル又は低級アルキルチオで 置換されていてもよい低級アルキル；又はヒドロキシ、アミノ、ハロゲン、カル ボキシ又は低級アルコキシから成る置換基群の１又は２以上で置換されていても よいフェニルを表し；更にＸはヒドロキシ又はアミノ；又はそれらの塩を表す） で表わされる光学活性なアミノ酸又はアミノ酸アミドを調製することを特徴とす る請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．Ｌ−立体配置のアミノ酸又はアミノ酸アミドを調製することを特徴とする請 求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
4. ４．少なくとも２５％過剰の鏡像異性のアミノ酸又はアミノ酸アミドを調製する ことを特徴とする先行する請求の範囲のいずれかに記載の方法。
5. ５．約６から約１３までのｐＨ値で処理を行うことを特徴とする先行する請求の 範囲のいずれかに記載の方法。
6. ６．変換をフミノニトリルラセマーゼの存在下に行うことを特徴とする先行する 請求の範囲のいずれかに記載の方法。
7. ７．約２０から約４５℃、好ましくは約３７℃の反応温度を使用することを特徴 とする先行する請求の範囲のいずれかに記載の方法。
8. ８．変換を、アルコール、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド、ジメ チルスルフォキシド又はヘキサメチルフォスフォラストリアミドを含んでいても よい水性媒体中で行うことを特徴とする先行する請求の範囲のいずれかに記載の 方法。
9. ９．微生物起源、好ましくはバクテリア起源のニトリラーゼを使用することを特 徴とする先行する請求の範囲のいずれかに記載の方法。
10. １０．ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・バクテリア（ＮＣ ＩＢ）にＮＣＩＢ番号１２２５６で寄託した株番号３１１又はその突然変異体の 培養で得られるアミノニトリル・ヒドロダーゼの酵素的性質と実質的に同一の酵 素的性質を有するアミノニトリル・ヒドラターゼを使用することを特徴とする請 求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．アミノニトリルを対応する光学活性なアミノ酸又はアミノ酸アミドへ変換 するための鏡像異性選択的なニトリラーゼの使用方法。