JP2005526519A - ヒダントインラセマーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
1)基質阻害を被らないヒダントインラセマーゼ、
2)ヒダントイナーゼ、及び/又は、
3)鏡像選択的カルバモイラーゼ
の存在下で、鏡像体に豊むα-アミノ酸を調製する方法に関する。
一般手順
標準分子生物学的技術例えばプラスミドDNA分離、アガロースゲル電気泳動、核酸の酵素的制限変性、大腸菌形質転換などが、Sambrookら、1989年、"Molecular cloning:a laboratorymanual"、Cold Spring Harbor Laboratories、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州によって記載されているように又は様々な供給者によって提供される使用のための説明書に従い実行された。
アグロバクテリウム ラジオバクター株は、10g/l トリプトン(Difcolaboratories、Becton Dickinson microbiology systems、スパークス、米国)、5g/l 酵母抽出物(Difco)及び5 g/l 塩化ナトリウムからなるLB培地中、30℃で前培養された。一晩のインキュベーション後に、該前培養物は、新鮮なLB培地中に、0.2のOD600まで接種された。この培養物は30℃でさらに培養され、そして1.7のOD600で収穫された。
(太字の方向性TOPOクローニング(directional TOPO cloning)のためのCACC配列及び下線の開始コドンを有する)
(下線の終止コドンを有する)
(太字の方向性TOPOクローニングのためのCACC配列及び下線の開始コドンを有する)。
pET-Hrac-S又はpET-Hrac-Lを含む大腸菌TOP10の株のプラスミドDNAは、Qiagen社によって記載された方法(plasmid mini-kit、2001年10月のプロトコル)を使用して分離され、そして引き続き化学的にコンピテントな大腸菌BL21 Star(DE3)細胞(Invitrogen社)内に形質転換された。
3.1 一般的手順
10ml 反応混合物は、100mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.0)中のD-5-ベンジルヒダントイン、L-5-イソプロピルヒダントイン又はL-5-メチルメルカプトエチルヒダントインの、下記の最終濃度から成った。該反応は、添加されたジチオトレイトール(DTT、1 mM 最終濃度)有り又は無しで、大腸菌BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S)若しくは大腸菌BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-L)又はセルフリー抽出物の全細胞の下記の量を添加することによって開始され、そして室温でインキュベーションされた。
3.1項で記載されたのと同じ方法で、96%のe.e.を有する2mM D-5-ベンジルヒダントインが、セルフリー抽出物(最終タンパク質濃度:0.11 mg/ml)とインキュベーションされた。大腸菌BL21 Star (DE3)(pET-Hrac-S)のセルフリー抽出物は、4.5時間後に52%のe.e. を与えた。大腸菌BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S)のセルフリー抽出物は、4.5時間後に80%のe.e. を与えた。
3.1項で記載されたような反応の一組において、99%のe.e.を有する40 mM L-5-イソプロピルヒダントインが、大腸菌BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S)及び大腸菌BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-L)の、DTTを有する全細胞(120 mg)及びセルフリー抽出物(最終タンパク質濃度:0.44 mg/ml)とともにインキュベーションされた。
3.1項で記載されたような反応の一組において、89 %のe.e. を有するL-5-メチルメルカプトエチルヒダントインの種々の濃度が、大腸菌BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-S)及び大腸菌BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-L)の全細胞とともにインキュベーションされた。L-5-メチルメルカプトエチルヒダントイン濃度は、1、5、10、50及び80 mM であった。初期反応速度は、生成物濃度(D-5-メチルメルカプトエチルヒダントインが時間とともに直線的に増加する期間の間に決定され、そして1時間当たりのmMで表される。図1では、初期活性が初期基質濃度に対してプロットされた。
Claims (9)
- 基質阻害を被らないヒダントインラセマーゼ活性を有する分離されたポリペプチド。
- 配列ID:No.2又は配列ID:No.4と少なくとも87%同一性を有する、請求項1に記載の分離されたポリペプチド。
- 高い又は非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列ID:No.1及び/又は配列ID:No.3又はそれらの補体とハイブリダイズする核酸配列によってコード化される、請求項1又は2に記載の分離されたポリペプチド。
- 配列ID:No.2又は配列ID:No.4に従うアミノ酸配列の少なくとも一部分に対する抗体調製物との免疫学的交差反応性を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の分離されたポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
- 請求項5に記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項5に記載の核酸配列又は請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 鏡像体に豊むヒダントイン化合物を請求項1〜4に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、鏡像体に豊むヒダントイン化合物のラセミ化方法。
- a.請求項1〜4に記載のポリペプチド、
b.ヒダントイナーゼ、及び/又は
c.鏡像選択的カルバモイラーゼ
の存在下で、鏡像体に豊むD−又はL-α-アミノ酸を調製する方法。
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