ES2261950T3 - Hidantoina racemasa. - Google Patents
Hidantoina racemasa.Info
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Abstract
Polipéptido aislado con actividad hidantoína racemasa que no sufre de inhibición por la L-5-metilmercaptoetil- hidantoína cuyo péptido tiene al menos 87% de identidad con la SEQ ID: NO. 2 o la SEQ ID: NO. 4.
Description
Hidantoína racemasa.
La presente invención se relaciona con
polipéptidos aislados con actividad hidantoína racemasa. En adición,
la invención se relaciona con el uso de estos polipéptidos.
Los polipéptidos con actividad hidantoína
racemasa, también llamados hidantoínas racemasas, son conocidos en
el arte. Ellas han sido encontradas en una variedad de organismos,
por ejemplo, WO 01/23582 describe una hidantoína racemasa a partir
de la Arthrobacter aurescens (DSM,3747), y JP 04271784
describe una hidantoína racemasa a partir de la Pseudomonas
NS 671 (Watabe y otros, J. Bact. 174; 3461-66
(1992)). Las hidantoínas racemasas han sido también descritas en
cepas de Sinorhizobium meliloti (acc. Nr. CAC 47181, Capela y
otros, PNAS 98:9877-9882 (2001)), de
Microbacterium liquefaciens (acc nr CAD 32593, EP 1.188.826),
y de Microbacterium tumefaciens C58 (acc. nrs. AAL 45498, AAK
88746 y AAK 90298, Las Heras-Vázquez y otros,
Biochem Biophys Res Común 303:541-547 (2003), Wood y
otros, Science 2001, 294:2317-23 y Hinkle y otros,
base de datos NCBI, Complete Genome Sequence of Agrobacterium
tumefaciens C58 (Rhizobium radiobacter C58), the Causative Agente of
Crown Gall Disease in Plants. Direct Submission, Submitted
agosto-14-2001).
En la estructura de la invención, la actividad
hidantoína racemasa es entendida como que significa la capacidad
para catalizar la racemización de las D o L hidantoínas
sustituidas.
Una desventaja de las hidantoínas racemasas
conocidas es que ellas exhiben inhibición por sustrato, en
particular hacia la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína.
Wiese y otros, por ejemplo, describen la ocurrencia de la inhibición
por sustrato de la hidantoína racemasa de la Arthrobacter
aurescens DSM 3747 a una concentración de la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína
desde 5 mM (J. Biotechn. 80; 217-230 (2000)).
También, la hidantoína racemasa de la Pseudomonas NS671
despliega la inhibición por sustrato a concentraciones similares
(Watabe y otros, J. Bact. 174; 3461-66 (1992)). Como
una consecuencia de está propiedad, la enzima puede ser solamente
empleada eficientemente a concentraciones bajas del sustrato.
Sería deseable tener una hidantoína racemasa que
no sufriera del fenómeno de la inhibición por sustrato ya que esto
permitiría la racemización de la D- o L-hidantoína
sustituida a concentraciones del sustrato más altas. Esto
contribuiría de manera efectiva a la reducción de los costos en la
producción de productos intermedios y finales.
Es por lo tanto un objetivo de la invención
proporcionar hidantoínas racemasas que no exhiban inhibición por
sustrato.
Sorprendentemente, ha sido encontrado que las
hidantoínas racemasas no exhiben inhibición por sustrato. El objeto
de la invención es por lo tanto logrado por medio de la provisión de
hidantoínas racemasas obtenibles de la Agrobacterium
radiobacter o equivalentes funcionales de la misma. La SEQ ID:
NO. 2 y la SEQ ID: NO. 4 ofrecen secuencias de amino ácidos de
hidantoínas racemasas de la Agrobacterium radiobacter. La SEQ
ID: NO. 4 tiene 11 amino ácidos adicionales en el terminal N cuando
se compara con la SEQ ID: NO. 2. La SEQ ID: NO. 1 ofrece la
secuencia de ácidos nucleicos de la Agrobacterium radiobacter
que codifica la secuencia de amino ácidos mostrada en la SEQ ID:
NO. 2, mientras la SEQ ID: NO. 3 ofrece la secuencia de ácidos
nucleicos de la Agrobacterium radiobacter que codifica la
secuencia de amino ácidos mostrada en la SEQ ID: NO. 4.
En la estructura de la invención, la inhibición
por sustrato es entendido que significa un decrecimiento en la
actividad inicial al aumentar la concentración del sustrato.
Dentro del alcance de la presente invención,
equivalentes funcionales de las hidantoínas racemasas obtenibles de
la Agrobacterium radiobacter son aquí definidas como
polipéptidos que tienen actividad hidantoína racemasa que no sufren
de la inhibición por sustrato por la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína.
Ejemplos particularmente útiles de tales equivalentes funcionales
son los polipéptidos que tienen al menos 87%, más preferiblemente al
menos 90%, tal como al menos 93%, 95%. 97%, 98% 0 99% de identidad
con la SEQ ID: NO. 2 o la SEQ ID: NO. 4. Las hidantoínas racemasas
obtenibles de la Agrobacterium radiobacter y los
equivalentes funcionales de la misma son aquí colectivamente
referidos como hidantoínas racemasas de acuerdo a la invención o
como polipéptidos de acuerdo a la invención.
Los polipéptidos con actividad hidantoína
racemasa de acuerdo a la invención tienen al menos 87% de identidad
con la SEQ ID: NO. 2 o la SEQ ID: NO. 4, preferiblemente al menos
90% de identidad con la SEQ ID: NO. 2 o la SEQ ID: NO. 4, más
preferiblemente al menos 95%, en particular al menos 97%, más en
particular al menos 98%, aún más en particular al menos 99%, lo más
preferido en particular al menos 99.5% de identidad con la SEQ ID:
NO. 2 o la SEQ ID: NO. 4.
En la estructura de la invención, el porcentaje
de identidad entre dos secuencias de amino ácidos es determinado con
la ayuda del algoritmo blast de alineamiento por pares (NCBI) con
una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento:
no coincidencia = -3, penalización = -3, extensión del hueco = 1,
coincidencia de bonos = 1, Hueco x – droff = 50, esperado = 10,
tamaño de palabra = 3.
En otra realización la invención se relaciona
con polipéptidos aislados con actividad hidantoína racemasa que no
sufren de inhibición por sustrato y los cuales están codificados por
las secuencias de ácido nucleico que se hibridan bajo condiciones de
astringencia alta, preferiblemente bajo condiciones de astringencia
muy alta, con la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID:
NO. 1 o la SEQ ID: NO. 3 o los complementos de las mismas.
Los experimentos de hibridación pueden ser
realizados usando diferentes métodos, que son conocidos en el arte.
Las guías generales para la selección que hay que hacer entre los
varios métodos son dadas por ejemplo en el capítulo 9 de Sambrook,
J., Fritsh, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2da, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
La astringencia de las condiciones de
hibridación es entendida como las condiciones bajo las cuales la
hibridación, que consiste de la hibridación real y los pasos de
lavado, es llevada a cabo. Los pasos de lavado son usados, por
ejemplo, para remover los ácidos nucleicos que no se hibridan con el
ácido nucleico diana, el cual está por ejemplo inmovilizado sobre un
filtro de nitrocelulosa. La astringencia de las condiciones de
hibridación puede por ejemplo ser cambiada cambiando la
concentración de la sal en el licor del lavado y/o la temperatura a
la cual el paso del lavado es llevado a cabo (temperatura del
lavado). La astringencia de la hibridación es por ejemplo
incrementada disminuyendo la concentración de la sal en el licor del
lavado o elevando la temperatura del lavado. En la estructura de la
invención la hibridación es llevada a cabo en 6X cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a una temperatura de alrededor de 45ºC
por alrededor de 12 horas. Ejemplos de condiciones de hibridación
son dos pasos sucesivos de lavado de 30 minutos cada uno en 1X SSC,
0.1% SDS a 60ºC (condiciones de hibridación de astringencia alta) o
a 65ºC (condiciones de hibridación de astringencia muy alta).
En aún otra realización la invención se
relaciona con polipéptidos aislados con actividad hidantoína
racemasa que no sufren de inhibición por sustrato y los cuales
exhiben reactividad cruzada inmunológica con anticuerpos contra al
menos una parte de la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID: NO. 2
o la SEQ ID: NO. 4.
La reactividad cruzada inmunológica puede ser
demostrada a través del uso de una preparación de anticuerpo contra,
o reactiva con, al menos un epítopo del polipéptido aislado con
actividad hidantoína racemasa de acuerdo a la invención. La
preparación de anticuerpo, la cual puede ser monoclonal así como
policlonal, puede ser producida usando métodos conocidos en el arte.
La reactividad cruzada inmunológica puede también ser demostrada
usando métodos conocidos en el arte. La producción de un anticuerpo
y la demostración de la reactividad cruzada inmunológica son por
ejemplo descritas en Hudson y otros, Practical Immunology, Tercera
Edición (1989), Blackwell Scientific Publications.
La invención también se relaciona con las
proteínas de fusión obtenibles por la expresión de una secuencia de
ácido nucleico que codifica al menos parte de un polipéptido de
acuerdo a la invención que está operacionalmente enlazada a una (o
más) secuencia(s) de ácido nucleico que codifican un
polipéptido marcador. "Operacionalmente enlazada" se entiende
que significa que las dos secuencias de ácido nucleico están
enlazadas de tal forma que, cuando son expresadas, el polipéptido de
acuerdo a la invención es producido con el (los)
polipéptido(s) marcador(es) en sus N- o
C-terminales o en ambas terminales. El polipéptido
marcador puede ser usado para muchos propósitos; puede por ejemplo
ser usado para mejorar la estabilidad o la solubilidad de la
proteína de fusión, como una señal de secreción (una señal que
dirige la proteína de fusión a un compartimiento particular en la
célula) o para facilitar la purificación de las proteínas de fusión.
Un ejemplo de un polipéptido marcador usado para facilitar la
purificación de las proteínas de fusión es el péptido hexahistidina.
La purificación de una proteína de fusión con una etiqueta de
hexahistidina es descrita, por ejemplo, en Gentz y otros,
(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, vol. 86, pp.
821-824. Una proteína de fusión con una etiqueta de
hexahistidina puede por ejemplo ser producida en un vector pQE
(Quiagen, Inc.) de acuerdo al protocolo del suministrador.
La invención también comprende mutantes de
polipéptidos con actividad hidantoína racemasa que tienen una o más
mutaciones en comparación con las secuencias de amino ácidos
naturales. Los métodos para hacer mutaciones son conocidos para la
persona experta en el arte, siendo ejemplos la mutagénesis aleatoria
(por ejemplo con ayuda de PCR o por medio de irradiación UV), PCR
dirigida, etc.
La invención también se relaciona con las
secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos con
actividad hidantoína racemasa de acuerdo a la invención.
La secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido de acuerdo a la invención puede ser clonada en un vector
apropiado y después de la introducción en una célula hospedera
apropiada, la secuencia de ácido nucleico puede ser expresada de
manera que produzca un polipéptido de acuerdo a la invención. La
clonación y la expresión de una secuencia de ácido nucleico son
técnicas estándares conocidas en el arte las cuales están descritas
por ejemplo en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2da ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989.
Un polipéptido de acuerdo a la invención puede
también ser producido integrando la secuencia de ácido nucleico que
codifica este polipéptido en el genoma de una célula hospedera y
(sobre)expresándola. La integración de la secuencia de ácido
nucleico y la (sobre)expresión de esta secuencia puede ser
efectuada usando métodos conocidos para la persona experta en el
arte. Es también posible sobre-expresar un
polipéptido de acuerdo a la invención en el microorganismo en el
cual se encuentra de forma natural, por ejemplo colocando un
promotor apropiado en frente de la secuencia de ácido nucleico de
acuerdo a la invención en el genoma del microorganismo, integrando
una o mas copias de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la
invención en el genoma del microorganismo, o
sobre-expresando la secuencia de ácido nucleico de
acuerdo a la invención en un vector apropiado en su hospedero
natural.
La invención por lo tanto también se relaciona
con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de
acuerdo a la invención. La invención también se relaciona con una
célula hospedera que contiene una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido de acuerdo a la invención. Preferiblemente
la invención se relaciona con una célula hospedera que contiene un
vector con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la
invención. La invención también se relaciona con la
sobre-expresión de una secuencia de ácido nucleico
de acuerdo a la
invención.
invención.
Ejemplos de vectores que son apropiados para
expresar una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la invención,
son los vectores normalmente usados para la clonación y la
expresión. Estos vectores son conocidos para la persona promedio
experta en el arte. Ejemplos de vectores apropiados para la
expresión en Escherichia coli son dados, por ejemplo, en la
Tabla 1 en Makrides, S. C., Microbiological reviews, (1996),
512-538. El vector preferiblemente posee un sitio de
clonación que está bajo el control de un promotor inducible.
Ejemplos de promotores inducibles son: el promotor lac, el
promotor araBAD, el promotor T7, el promotor trc, el
promotor tac y el promotor trp. Células hospederas
apropiadas son las células hospederas normalmente usadas para la
clonación y la expresión y son conocidas para la persona promedio
experta en el arte. Ejemplos de cepas de células hospederas de E.
coli apropiadas son: TOP10F, TOP10, DH10B, DH5\alpha, HB101,
W3110, BL21(DE3) y BL21(DE3)pLysS,
BL21Star(DE3).
La selección de un vector a veces depende de la
selección de la célula hospedera (y al revés); si, por ejemplo, un
vector con el promotor araBAD es usado, entonces
preferiblemente una cepa de célula hospedera de E. coli es
usada la cual no es capaz de degradar al inductor arabinoso (célula
hospedera ara de E. coli).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican
un polipéptido de acuerdo a la invención pueden ser encontradas en
otros organismos usando técnicas biológicas moleculares estándares y
la información de la secuencia dada en el presente documento. Por
ejemplo, el uso de la secuencia entera, o parte de ella, de la
secuencia de ácido nucleico descrita en la SEQ ID: NO. 1 o la SEQ
ID: NO. 3 como una sonda de hibridación permite el aislamiento de
las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de
acuerdo a la invención (por ejemplo como esta descrito en Sambrook,
J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2da, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Una secuencia de ácido nucleico la cual
parcialmente o totalmente comprende la SEQ ID: NO. 1 o la SEQ ID:
NO. 3 puede también ser encontrada por medio de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos
(sintéticos) los cuales están basados en la información de la
secuencia en la SEQ ID: NO. 1, la SEQ ID: NO. 2, la SEQ ID: NO. 3
y/o la SEQ ID: NO. 4.
Una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la
invención puede ser amplificada usando, por ejemplo, ADNc, ARNm, ADN
genómico como un patrón y los cebadores de oligonucleótidos
apropiados, por medio de técnicas de amplificación de PCR
estándares. La secuencia de ácido nucleico así amplificada puede ser
clonada en un vector apropiado y puede ser caracterizada por
análisis de la secuencia del ADN.
Es también posible preparar oligonucleótidos que
se corresponden con o son capaces de hibridación con las secuencias
del ácido nucleico de acuerdo a la invención usando técnicas de
síntesis estándares, por ejemplo usando un sintetizador de ADN
automatizado.
Las secuencias de ácido nucleico de acuerdo a la
invención pueden, después del aislamiento, ser clonadas en un vector
apropiado y expresadas en una célula hospedera apropiada, usando
métodos conocidos en el arte, para la producción de un polipéptido
de acuerdo a la invención.
En caso de que se necesite que sea confirmado
que una secuencia clonada realmente codifica una proteína de acuerdo
a la invención, es decir una hidantoína racemasa que no sufre de
inhibición por sustrato, el procedimiento señalado en el ejemplo 3
puede ser seguido.
Ya que ha sido aquí ahora establecido que
existen hidantoínas racemasas que no sufren de inhibición por
sustrato, la racemización de la L- o D-hidantoína
puede por lo tanto ser realizada a concentraciones más altas del
sustrato. En una realización, la invención por lo tanto se relaciona
con un proceso para la racemización de un compuesto de hidantoína
enriquecido enantioméricamente que comprende el paso de contactar
dicho compuesto de hidantoína enriquecido enantioméricamente con un
polipéptido que tiene actividad hidantoína racemasa donde el
polipéptido que tiene la hidantoína racemasa no sufre de inhibición
por sustrato. Tal proceso es aquí referido como un proceso de
acuerdo a la invención.
En una realización preferida una hidantoína
racemasa de acuerdo a la invención es usada en un proceso de acuerdo
a la invención, más preferiblemente una hidantoína racemasa
obtenible de la Agrobacterium radiobacter es usada en un
proceso de acuerdo a la invención, aún más preferiblemente una
hidantoína racemasa de acuerdo a la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4
es usada en un proceso de acuerdo a la invención.
Ejemplos de D- o L-hidantoínas
que pueden ser racemizadas por hidantoínas racemasas de acuerdo a la
invención son: las D- o L-hidantoínas de fórmula
1.
donde R representa un grupo resto
de amino ácidos, por ejemplo un grupo (hetero)alquilo
opcionalmente sustituido con por ejemplo 1-20 átomos
de C o un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido con
por ejemplo 1-20 átomos de C. Ejemplos de
sustituyentes en el grupo (hetero)alquilo o en el grupo
(hetero)arilo son: hidroxil, alcoxi, mercapto, tioalquilo,
alquilo, carboxilo, amino, nitro, halógenos, carbamoil, nitrilo y
acilo. Ejemplos de grupos R son: metilo, i-propilo,
i-butilo, 2-metiltioetileno,
4-aminobutileno, hidroximetileno, metoximetileno,
carboximetileno, carboxietileno, fenilo, p-hidroxifenilo,
m-hidroxifenilo, o-hidroxifenilo,
p-clorofenilo, m-clorofenilo,
2,4-diclorofenilo, p-metoxifenilo, bencilo,
p-hidroxibencilo, 3,4-dihidroxibencilo,
3,4-dimetoxibencilo, benciloximetileno,
3,4-metileno dioxibencilo,
indolilmetileno.
La racemización de la D- o
L-hidantoína en un proceso de acuerdo a la invención
puede ser integrada en otro proceso así como tener lugar
externamente. Integrada en un proceso se entiende que significa que
una D- (o L-) hidantoína es racemizada y que la L- (o D-) hidantoína
del recemato resultante es inmediatamente convertida posteriormente
in situ, de manera que de hecho la racemización de la D- (o
L-) hidantoína tenga lugar continuamente. Externamente es entendido
que significa que la D- o (L-) hidantoína es racemizada en un paso
de reacción separado.
La invención correspondientemente se relaciona
con un proceso para la preparación de \alpha-amino
ácidos enriquecidos enantioméricamente en presencia de
1) una hidantoína racemasa que no sufre de
inhibición por sustrato
2) una hidantoínasa y/o
3) una carbamoilasa enantioselectiva.
La ventaja del uso de las hidantoínas racemasas
en tales procesos es que permite una conversión mayor y/o más rápida
de la hidantoína sustituida en el \alpha-amino
ácido correspondiente en comparación a un proceso donde una
hidantoína racemasa convencional o ninguna hidantoína racemasa es
usada. Una ventaja adicional de las hidantoínas racemasas de acuerdo
a la invención es que ellas tienen una especificidad amplia de
sustrato, como resultado de lo cual ellas pueden ser usadas en la
preparación de muchos \alpha-amino ácido
enriquecidos enantioméricamente diferentes.
Una hidantoína racemasa que no sufre de
inhibición por sustrato es ventajosamente usada en un método donde
un compuesto de hidantoína enriquecido enantioméricamente es
contactado con dicha hidantoína racemasa y donde la concentración
del compuesto de hidantoína enriquecido enantioméricamente está por
encima de 5 mM, preferiblemente por encima de 7.5 o 10 mM, incluso
más preferiblemente por encima de 15 o 20 y lo más preferido por
encima de 25 mM.
Los alfa-amino ácidos con un
grupo resto de amino ácidos R, donde R es como es definido
anteriormente son ejemplos de \alpha-amino ácidos
enriquecidos enantioméricamente que pueden ser apropiadamente
preparados en un proceso de acuerdo a la invención donde una
hidantoína racemasa de acuerdo a la invención es usada junto con una
carbamoilasa enantioselectiva y una hidantoínasa. Ejemplos de
\alpha-amino ácidos son: la alanina, la valina, la
leucina, la isoleucina, la serina, la treonina, la metionina, la
cisteína, la asparagina, la glutamina, la tirosina, el ácido
aspártico, el ácido glutámico, la histidina, la lisina, la arginina,
la citrulina, la fenilalanina, la
3-fluorofenilalanina.
En tal proceso para la preparación de un D- o
L-\alpha-amino ácido enriquecido
enantioméricamente se hace uso preferiblemente de una carbamoilasa
enantioselectiva que tiene una enantioselectividad de al menos 90%,
más preferiblemente una enantioselectividad de al menos 95%, en
particular al menos 98%, lo más preferido en particular una
enantioselectividad de al menos 99%. En la estructura de la
invención una enantioselectividad de la carbamoilasa (por ejemplo
D-carbamoilasa) de por ejemplo 90% se entiende que
significa que la carbamoilasa convierte una mezcla racémica de
N-carbamoil-D-\alpha-amino
ácido y
N-carbamoil-L-\alpha-amino
ácido en el 90% de uno de los enantiómeros (por ejemplo
D-\alpha-amino ácido) y 10% de
otro enantiómero (por ejemplo
L-\alpha-amino ácido) a una
conversión total del 50% de la mezcla racémica de
N-carbamoil-D-\alpha-amino
ácido y
N-carbamoil-L-\alpha-amino
ácido.
La invención también se relaciona con un proceso
para la preparación de un D- o L-amino ácido del
correspondiente
N-carbamoil-D-amino ácido o
N-carbamoil-L-amino ácido, o
cualquier mezcla de amino
N-carbamoil-D-amino ácido y
N-carbamoil-L-amino ácido. En
tal proceso una hidantoína racemasa que no sufra de inhibición por
sustrato puede ser ventajosamente usada junto con una D- o
L-carbamoilasa y una hidantoínasa, por ejemplo en un
único crisol de reacción.
En adición, la invención se relaciona con el uso
de las hidantoínas racemasas junto con una carbamoilasa
enantioselectiva y una hidantoínasa en la preparación de D- o
L-\alpha-amino ácido,
respectivamente, a partir del correspondiente
D-\alpha-amino ácido o del
correspondiente L-\alpha-amino
ácido o cualquier mezcla de los correspondientes D- y
L-\alpha-amino ácidos. En un
ejemplo de tal proceso donde un
L-\alpha-amino ácido es convertido
en un D-\alpha-amino ácido, el
L-\alpha-amino ácido puede primero
ser convertido químicamente en el correspondiente
N-carbamoil-L-amino ácido de
acuerdo a los métodos conocidos en el arte. El
N-carbamoil-L-amino ácido
puede luego ser convertido enzimáticamente en un
D-\alpha-amino ácido en presencia
de una D-carbamoilasa enantioselectiva, una
hidantoínasa y una hidantoína racemasa.
La temperatura y el pH en una reacción en la
cual una hidantoínasa racemasa esta involucrada son preferiblemente
elegidos de manera que se logre una actividad y estabilidad óptima
de la hidantoína racemasa. Si otra enzima está involucrada en la
reacción, además de la hidantoína racemasa, también la temperatura y
el pH son seleccionados de manera que la estabilidad y la actividad
de la hidantoína racemasa y la actividad, estabilidad y, si es
deseado la enantioselectividad de la otra enzima sean las mejores
posibles. La conversión del
N-carbamoil-D-amino ácido o
N-carbamoil-L-amino ácido de
la D- o L-hidantoína, respectivamente, en los
correspondientes D-\alpha-amino
ácido o L-\alpha-amino ácido, en
presencia de una hidantoína racemasa de acuerdo a la invención, una
D- o L-carbamoilasa, respectivamente, y una
hidantoínasa es preferiblemente llevada a cabo a un pH entre 5 y 10.
En particular la conversión puede ser llevada a cabo a un pH entre
6.0 y 7.5. La temperatura de la conversión es preferiblemente
elegida entre 0 y 80ºC, en particular entre 10 y 50ºC, más en
particular entre 35 y 45ºC.
La preparación química del
N-carbamoil-\alpha-amino
ácido a partir del correspondiente \alpha-amino
ácido puede por ejemplo tener lugar contactando el
\alpha-amino ácido con MOCN, donde M representa el
metal álcali, preferiblemente potasio o sodio. La temperatura usada
no es crítica: la reacción preferiblemente tiene lugar a
temperaturas entre alrededor de -5 y 100ºC, en particular a
temperaturas entre 0 y 80ºC; el pH de la reacción química es
preferiblemente seleccionado entre 8 y 11, más en particular entre 9
y 10.
Preferiblemente, la preparación del
D-\alpha-amino ácido a partir del
correspondiente L-\alpha-amino
ácido (o al revés) a través del correspondiente
N-carbamoil-L-\alpha-amino
ácido (o el correspondiente
N-carbamoil-D-\alpha-amino
ácido) es llevado a cabo en un único crisol.
Cuando se hace uso de las hidantoínas racemasas
en forma purificada o presentes en extracto libre de células, un
aditivo puede ser añadido para mejorar la actividad y/o la
estabilidad de la hidantoína racemasa (como por ejemplo es descrito
en Watabe y otros 1992, J. Bact.; pp.
7989-7995 y en Wiese y otros 2000, J. Bact,
pp. 217-230). Ejemplos de aditivos de este tipo son
el azufre divalente que contiene compuestos tales como la
L-metionina, la D-metionina, la
L-cisteína, la
N-carbamoil-L-metionina,
la
N-acetil-D,L-metionina,
el 2-ceto-4-(metiltio) ácido
butírico, el
D,L-2-hidroxi-4-(metiltio)
ácido butírico, el metil éster de L-metionina, el
D,L-metionina ácido hidroxámico, la
S-metil-L-cisteína,
la D-biotina, el
\beta-mercaptoetanol, el ditiotreitol (DTT), el
glutatión.
La invención es adicionalmente explicada a
continuación con referencia a los siguientes ejemplos, sin estar sin
embargo limitada a estos.
Figura 1: Actividad inicial relativa de las
hidantoínas racemasas de la cepa Pseudomonas NS671, A.
radiobacter y Arthrobacter aurescens DSM 3747 contra la
concentración inicial de
L-5-metilmercaptoetilhidantoína
Las técnicas biológicas moleculares estándares
tal como el aislamiento del ADN plasmídico, electroforesis en gel de
agarosa, modificación de la restricción enzimática de los ácidos
nucleicos, transformación de E. coli, etc, fueron llevadas a
cabo como es descrito por Sambrook y otros, 1989, Molecular
cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold
Spring Harbor, NY, o de acuerdo a las instrucciones para el uso
proporcionadas por los varios suministradores.
Los oligodeoxinucleótidos sintéticos fueron
comprados de Invitrogen (Groningen, Holanda).
El análisis de secuencia de ADN fue llevado a
cabo por BaseClear (Leiden, Holanda) usando el método de terminación
de cadena con terminadores de dideoxi marcados con colorantes.
Las concentraciones de proteínas en los
extractos de célula cruda fueron determinadas con la ayuda del
reactivo Bradford a 595 nm.
Ejemplo
1
Una cepa de Agrobacterium radiobacter fue
precultivada a 30ºC en medio LB que consiste de 10 g/l de tripton
(Difco laboratories, sistemas microbiológicos de Becton Dickinson,
Sparks, EUA), 5 g/l de extracto de levadura (Difco) y 5 g/l de
cloruro de sodio. Después de la incubación toda la noche el
precultivo fue inoculado en el medio LB fresco hasta una OD_{600}
de 0.2. Este cultivo fue adicionalmente cultivado a 30ºC y cosechado
hasta una OD_{600} de 1.7.
El ADN genómico de este cultivo de A.
radiobacter fue aislado por medio del método descrito por
Quiagen (Quiagen genomic DNA handbook, 1998, Quiagen, Hilden,
Alemania).
Los genes de la hidantoína racemasa de la A.
radiobacter fueron clonados en el vector de expresión
pET101/D-TOPO (Invitrogen). Los genes fueron
clonados a través de una fusión de inicio de traducción (ATG) y con
los codones de parada originales, de acuerdo al método descrito por
Invitrogen.
Un fragmento que comprende 721 pares de base con
la secuencia de la SEQ ID: NO. 1, extendidos sobre el lado 5' con la
secuencia CACC introducida por el cebador 1, fue amplificada por
medio de PCR del ADN cromosomal de la A. radiobacter con los
siguientes cebadores:
| 5'-CACCATGCATATTCGTCTGATCAACCCG-3' | [Cebador 1; SEQ ID: NO. 5] |
(con la secuencia CACC para la
clonación direccional TOPO en negrita y el codón de inicio
subrayado)
y,
| 5'-TCAGGCGACGAGCTTGGTITC-3' | [Cebador 2; SEQ ID: NO. 6] |
(con el codón de parada
subrayado)
Un fragmento que comprende 754 pares de base con
la secuencia de la SEQ ID: NO. 3, extendidos sobre el lado 5' con la
secuencia CACC introducida por el cebador 3, fue amplificada por
medio de PCR del ADN cromosomal de la A. radiobacter con el
siguiente cebador directo:
| 5'-CACCATGCGAAATGAGCGTCCTGAAAG-3' | [Cebador 3; SEQ ID: NO. 7] |
(con la secuencia CACC para la
clonación direccional TOPO en negrita y el codón de inicio
subrayado) y el cebador 2 como cebador
inverso.
La longitud correcta de los fragmentos
amplificados fue confirmada con electroforesis en gel de agarosa y
los fragmentos fueron clonados directamente en el vector de
expresión pET101/D-TOPO de acuerdo al protocolo del
suministrador y transformados en células químicamente competentes
E. coli TOP10 (Invitrogen). Los transformantes fueron
seleccionados sobre placas de agar LB que contienen 100 mg/l de
carbenicilina. Los plásmidos con la inserción correcta (chequeados
con la ayuda de la determinación de secuencia bidireccional) fueron
llamados pET-Hrac-S y
pET-Hrac-L, donde
Hrac-S representa la inserción con la secuencia de
la SEQ ID: NO. 1 y Hrac-L la inserción con la
secuencia de la SEQ ID: NO. 3. Los plásmidos fueron transformados en
E. coli TOP10. E. coli TOP10
(pET-Hrac-S) y E. coli TOP10
(pET-Hrac-L) fueron depositados bajo
el tratado de Budapest bajo el No. 41131 y el No. 41130,
respectivamente, en las Colecciones Nacionales de Bacterias de la
Industria, los Alimentos y la Marina (NCIMB, Reino Unido).
Ejemplo
2
El ADN plasmídico del
pET-Hrac-S o
pET-Hrac-L que contiene cepas E.
coli Top10 fue aislado usando el método descrito por Quiagen
(mini-kit de plásmido, protocolo de Octubre de 2001)
y subsiguientemente transformado en células químicamente competentes
E. coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen).
Colonias simples de E. coli BL21 Star
(DE3) (pET-Hrac-S) y E. coli
BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-L) fueron
cultivadas durante toda la noche a 28ºC en 25 ml de medio LB con 100
mg/l de carbenicilina hasta una OD_{620 \ nm} de 2.5. Los cultivos
enteros (25 ml) fueron inoculados en 250 ml de medio LB fresco con
100 mg/l de carbenicilina y cultivados adicionalmente a 28ºC.
Después de 1 hora, a una OD_{620 \ nm} de 0.45, los cultivos
fueron inducidos por la adición de 1 mM (concentración final) de
IPTG y cultivados adicionalmente por 4.5 horas a 28ºC, hasta una
OD_{620 \ nm} de 1.7. Las células fueron subsiguientemente
cosechadas y lavadas con 100 mM de buffer de fosfato de potasio, pH
7.0, opcionalmente con 1 mM de DTT, y luego sometidas a
sonificación, de manera que fuera obtenido el extracto libre de
células.
Porciones de 30 mg de células (peso húmedo)
fueron congeladas a -20ºC para su uso posterior.
\newpage
Ejemplo
3
Las mezclas de reacción de 10 ml consistieron de
las concentraciones finales dadas a continuación de la
D-5-bencilhidantoína, la
L-5-isopropilhidantoína o la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína en
100 mM de buffer de fosfato de potasio, pH 7.0. Las reacciones
fueron iniciadas añadiendo la cantidad dada a continuación de
células enteras de E. coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-S) o E. coli BL21
Star (DE3) (pET-Hrac-L) o extractos
libres de células, con o sin ditiotreitol (DTT, 1 mM de
concentración final) añadido, y fueron incubadas a temperatura
ambiente.
Los extractos libres de células fueron
producidos resuspendiendo 600 mg de células en 1 ml 100 mM de buffer
de fosfato de potasio, pH 7.0, o 1 ml 100 mM de buffer de fosfato de
potasio, pH 7.0, con 1 mM de DTT, seguido por sonificación.
Las muestras fueron tomadas (500 \mul) y la
reacción fue detenida por la adición de 5 \mul de ácido fosfórico
al 85%. Las muestras fueron analizadas por medio de HPLC, la
D,L-5-bencilhidantoína y la
D,L-5-isopropilhidantoína fueron
separadas por medio de una columna Chirobotic T (250 mm x 4.6 mm x
I.D. 5 \mum) de Astec (Whippany, EUA), la
D,L-5-metilmercaptoetilhidantoína
fue separada por medio de una columna Chirobotic T (250 mm x 4.6 mm
x I.D. 5 \mum) de Astec, combinada con una columna Nucleosil
120-5 C18 de Machery-Nagel (Duren,
Alemania). En todos los casos el eluente fue 80% de acetato de
amonio de 15 mM, pH 4.1, y 20% de metanol. La velocidad del flujo
del eluente fue 1ml/min a una temperatura de la columna de 22ºC. La
detección tuvo lugar por medio de luz UV a una longitud de onda de
220 nm. Bajo estas condiciones los tiempos de retención fueron 5.3 y
6.3 minutos para la D- y
L-5-isopropilhidantoína,
respectivamente, 6.3 y 8.3 minutos para la D- y
L-5-bencilhidantoína,
respectivamente, y 9.1 y 12.2 minutos para la D- y
L-5-metilmercaptoetilhidantoína,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
De la misma forma que fue descrito en 3.1, 2 mM
de D-5-bencilhidantoína con un e.e.
de 96% fueron incubados con extracto libre de células (concentración
final de la proteína: 0.11 mg/ml). El extracto libre de células de
E. coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-S) dio un e.e. de 52%
después de 4.5 horas. El extracto libre de células de E. coli
BL21 Star (DE3) (pET-Hrac-L) dio un
e.e. de 80% después de 4.5 horas.
El blanco químico dio un e.e. de 90% después de
4.5 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un conjunto de reacciones como fue descrito
en 3.1, 40 mM de
L-5-isopropilhidantoína con un e.e.
de 99% fueron incubados con células enteras (120 mg) y extracto
libre de células con DTT (concentración final de la proteína: 0.44
mg/ml) de E. coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-S) y E. coli BL21
Star (DE3) (pET-Hrac-L).
Con las células enteras y el extracto libre de
células con DTT de de E. coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-S) un e.e. de 0% fue
logrado después de 5 horas. Con las células enteras de E.
coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-L) un e.e. de 28% fue
logrado después de 19 horas. Con el extracto libre de células con
DTT de E. coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-L) un e.e. de 9% fue
logrado después de 19 horas.
El blanco químico dio un e.e. de 98% después de
19 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un conjunto de reacciones como fue descrito
en 3.1, diferentes concentraciones de la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína con
un e.e. de 89% fueron incubados con células enteras de E.
coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-S) y E. coli BL21
Star (DE3) (pET-Hrac-L). Las
concentraciones de la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína
fueron 1, 5, 10, 50 y 80 mM. Las velocidades iniciales de la
reacción fueron determinadas durante el periodo de tiempo en el cual
la concentración del producto
(D-5-metilmercaptoetilhidantoína)
aumenta linealmente con el tiempo y son expresadas en mM por hora.
En la Figura 1 las actividades iniciales están trazadas contra las
concentraciones iniciales del
sustrato.
sustrato.
Como puede ser observado en la Figura 1, la
actividad de la racemasa de E. coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-S) y E. coli BL21
Star (DE3) (pET-Hrac-L) aumenta con
el aumento una concentración inicial del sustrato aumentada, lo que
significa que las hidantoínas racemasas con la SEQ ID: NO. 2 y NO. 4
no exhiben inhibición por sustrato contra la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína. Las
hidantoínas racemasas de la cepa Pseudomonas NS671 y
Arthrobacter aurescens DSM 3747 por otra parte muestran
claramente que la actividad inicial relativa disminuye a
concentraciones de la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína
mayores de 2.5 y 5 mM respectivamente. Por lo tanto, se concluyó que
las hidantoínas racemasas clonadas de la A. radiobacter no
son inhibidas por la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína.
Valores de Km y Vmax para la
L-5-metilmercaptoetilhidantoína
fueron determinados trazando 1/V contra 1/S en un gráfico de
Lineweaver Burk. El extracto libre de células de E. coli BL21
Star (DE3) (pET-Hrac-S) tiene una
Km de 1 mM y una Vmax de 0.4 mM/hora. El extracto libre de células
de E. coli BL21 Star (DE3)
(pET-Hrac-L) tiene una Km de 20 mM y
una Vmax de 0.2 mM/hora.
<110> DSM NV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Hidatonina racemasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Hidatonina racemasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> NL 1020663
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-05-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agrobacterium radiobacter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agrobacteium radiobacter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 750
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agrobacetrium radiobacter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agrobacterium radiobacter
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccatgcat attcgtctga tcaacccg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaggcgacg agcttggttt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebadores
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccatggca aatgagcgtc ctgaag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Polipéptido aislado con actividad hidantoína
racemasa que no sufre de inhibición por la
L-5-metilmercaptoetil-hidantoína
cuyo péptido tiene al menos 87% de identidad con la SEQ ID: NO. 2 o
la SEQ ID: NO. 4.
2. Polipéptido aislado con actividad hidantoína
racemasa que no sufre de inhibición por la
L-5-metilmercaptoetil-hidantoína
cuyo péptido es codificado por una secuencia de ácido nucleico que
se hibrida bajo condiciones de astringencia alta o muy alta con la
SEQ ID: NO. 1 y/o la SEQ ID: NO. 3 o los complementos de las
mismas.
3. Polipéptido aislado de acuerdo a las
reivindicaciones 1 y 2 con reactividad cruzada inmunológica con una
preparación de anticuerpo contra al menos parte de la secuencia de
amino ácidos de acuerdo a la SEQ ID: NO. 2 o la SEQ ID: NO. 4.
4. Secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3.
5. Vector que contiene la secuencia de ácido
nucleico de acuerdo a la reivindicación 4.
6. Célula hospedera que contiene una secuencia
de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 4 o un vector de
acuerdo a la reivindicación 5.
7. Un proceso de racemización de un compuesto de
hidantoína enriquecido enantioméricamente que comprende el paso de
contactar dicho compuesto de hidantoína enriquecido
enantioméricamente con un polipéptido de acuerdo a las
reivindicaciones 1 a 3.
8. Un proceso para la preparación de D- o
L-\alpha-amino ácidos enriquecidos
enantioméricamente en presencia de
- a.
- Un polipéptido de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 3 y
- b.
- Una hidantoínasa y/o
- c.
- Una carbamoilasa enantioselectiva.
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