JP4868533B2 - シアン耐性ニトリルヒドラターゼ - Google Patents

Description

本発明は、特に、高められたシアン耐性を有するシュードモナス・プチダ株又はシュードモナス・マルギナリス株由来のシアン耐性ニトリルヒドラターゼ、それをシアン化合物の存在下でニトリルからアミドを製造するために用いる使用及び前記酵素をコードするポリヌクレオチド配列に関する。

α−ヒドロキシニトリル（シアンヒドリン）及びα−アミノニトリルをニトリルヒドラターゼを用いて相応のアミドに転化させることは、α−ヒドロキシ酸及びα−アミノ酸を合成する新規の変法を与える。それというのもα−ヒドロキシアミド及びα−アミノアミドは、容易に鹸化することができるからである（メチオニンの製造方法及びそのための触媒（Process and catalysts for the production of methionine. Ponceblanc, Herve; Rossi, Jean-Christophe; Laval, Philip; Gros, Georges. (Rhone-Poulenc Animal Nutrition SA, Fr.), （ＷＯ２００１０６０７８９号））。代替的に、α−ヒドロキシアミドとアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物とを反応させて、相応のヒドロキシ酸の塩にすることもできる。この場合に特に、４−メチルチオ−α−ヒドロキシブチルアミド（ＭＨＡ−アミド）と水酸化カルシウムとを反応させることが好ましい。それというのも、カルシウム−ＭＨＡはメチオニンの代替生成物形として直接使用でき、又はＭＨＡは飼料添加物として使用することができるからである。

しかしながら、α−ヒドロキシニトリル及びα−アミノニトリルは容易に分解して、アルデヒドと青酸あるいはアルデヒドと、青酸と、アンモニアとなる。生成する青酸は、ほぼ全ての公知のニトリルヒドラターゼにとっての強力なインヒビターであるが、ロドコッカス・エクイＸＬ−１由来のニトリルヒドラターゼは例外であり、そのニトリルヒドラターゼは、２０ｍＭのシアン化合物で、今まで知られたなかで最も低い活性損失を示す（シアン耐性ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス・エクイ細胞によるニトリルからのアミドの製造（Production of amides from nitriles by Rhodococcus equi cells having a cyanide resistant-nitrile hydratase）. Nagasawa, Tohru; Matsuyama, Akinobu. (Daicel Chemical Industries, Ltd., Japan)、（ＥＰ１２６６９６２Ａ号））。

休止細胞の生体乾燥質量１ｇあたり約８ｇのアミドという低い生産性と、４３時間という長い反応時間と、７５ｇ／Ｌという比較的低い生成物濃度のため、改善されたニトリルヒドラターゼの探求に導かれる。

従って、本発明の目的は、前記の制限下にない生体触媒を提供することである。更に、該生体触媒がシアン化合物に対して更に高い耐性があることが好ましい。それというのも、α−ヒドロキシニトリル及びα−アミノニトリルは、迅速かつ完全なアルデヒドの反応を保証するために、生成物中に部分的に残留する青酸が、有利には１〜３％過剰で製造されるからである。従って、生体内変換の間に、２０ｍＭを上回るシアン化合物濃度を有することがある。副生成物及び試薬、例えば補助塩基として使用されるアミンも同じく、ニトリルヒドラターゼ活性を阻害してはならない。

本発明の課題は、ニトリルからアミドへの転化に際して反応溶液中に存在するシアン化物イオンに対して、高められた安定性を有するニトリルヒドラターゼを提供することである。

本発明の対象は、特にシュードモナス属の微生物由来の単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号２、３、５、７、８、１０の配列に含まれるアミノ酸配列と９０〜１００％まで同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドであり配列番号２、３、５又は配列番号７、８、１０の配列を有するポリペプチドが、共にそれぞれシアン耐性ニトリルヒドラターゼの活性を有し、あるいはこれらのニトリルヒドラターゼを形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

該ポリヌクレオチドが、シュードモナス・プチダ又はシュードモナス・マルギナリスに由来することが好ましい。

本発明の対象は、
ａ）配列番号１、４、６、９からのヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有するか又は該配列からなるポリヌクレオチド、
ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲でａ）の配列に相当するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｃ）ａ）によるヌクレオチド配列であって機能的に中立な同義突然変異を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
ｄ）ａ）又はｃ）からの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
の群から選択される他のポリヌクレオチドであって、シアン耐性ニトリルヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドである。

また本発明の対象は、前記のポリヌクレオチドによってコードされ、配列番号２、３、５又は配列番号７、８、１０の配列を有し、シュードモナス属の微生物由来のシアン耐性ニトリルヒドラターゼの活性を有するポリペプチドであって、微生物中に蓄積されてか又は単離された形で存在しうるポリペプチドである。配列番号２及び配列番号７は、ニトリルヒドラターゼのα−サブユニットをコードし、配列番号３及び配列番号８は、ニトリルヒドラターゼのβ−サブユニットをコードし、配列番号５及び配列番号１０は、ニトリルヒドラターゼの活性のために同時発現することが必須であるアクチベータータンパク質をコードする（Nojiri et al., 1999, Journal of Biochemistry, 125:696-704）。

本発明によれば、本発明によるポリヌクレオチドによって形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞を使用することが好ましい。

宿主細胞には、特に安定な発現系が知られている真核生物又は原核生物を数えることができる。

宿主生物としては、発現系のために挙げられる有利な微生物、例えばシュードモナス、ピチア、種々異なる酵母、サッカロマイセス、アスペルギルス又はストレプトマイセス科、特に大腸菌が用いられる。ロドコッカス属の微生物も同様に適している。

ベクターＤＮＡは、真核細胞又は原核細胞中に、公知の形質転換技術又はトランスフェクション技術により導入することができる。

“形質転換”、“トランスフェクション”、“接合”及び“遺伝子導入”とは、異種ＤＮＡを導入するための先行技術により知られる処置を指す。

また本発明の対象は、シュードモナス・マルギナリス又はシュードモナス・プチダからの完全な遺伝子又はその一部を含む相応の遺伝子バンクと、本発明による配列番号１、４又は配列番号６、９からなるポリヌクレオチド又はその断片を有するプローブとをハイブリダイズさせることによりスクリーニングし、そして挙げられるポリヌクレオチド配列を単離することによって得られるポリヌクレオチド配列から主になっているポリヌクレオチドである。

本発明による配列を有するポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、本発明によるタンパク質をコードする核酸あるいはポリヌクレオチド又は遺伝子を全長で単離するか又は本発明による遺伝子の配列と高い配列相似性を有する核酸あるいはポリヌクレオチド又は遺伝子を単離するために適している。また該ポリヌクレオチドは、いわゆる“アレイ”、“マイクロアレイ”又は“ＤＮＡチップ”上に適用することができ、そこで相応のポリヌクレオチド又はそこから導き出される配列、例えばＲＮＡ又はｃＤＮＡの検出及び決定がなされる。

本発明による配列を有するポリヌクレオチドは、更に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で本発明によるタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡを作製できるプライマーとして適している。

プローブ又はプライマーとして用いられるかかるオリゴヌクレオチドは、少なくとも２５又は３０の、有利には少なくとも２０の、殊に有利には少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する。同様に、少なくとも４０又は５０のヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドが適している。場合により、少なくとも１００、１５０、２００、２５０又は３００のヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドも適している。

“単離された”とは、その自然な環境から切り離されたことを意味する。

“ポリヌクレオチド”は、一般に、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ又は改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよいポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを指す。

本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１、４、６、９によるポリヌクレオチド又はそこに含まれる断片と、その配列番号１、４、６、９によるポリヌクレオチド又はそこに含まれる断片と少なくとも９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％同一であるものを包含する。

“ポリペプチド”とは、ペプチド結合を介して結合した２つ又はそれ以上のアミノ酸を有するペプチド又はタンパク質を表す。

本発明によるポリペプチドは、配列番号２、３、５、７、８、１０によるポリペプチドと、その配列番号２、３、５、７、８、１０によるポリペプチドと少なくとも９０％、特に有利には少なくとも９１％、９５％、９７％又は９９％同一であるものを包含する。

所望の遺伝子バンクから得られたＤＮＡ配列を、次いで公知のアルゴリズム又は配列解析プログラムを用いて、例えばＳｔａｄｅｎ(Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986))、Ｍａｒｃｋ(Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988))によるプログラム、又はＢｕｔｌｅｒ(Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998))によるＧＣＧ−プログラムにより調査することができる。

配列番号１、４、６、９の配列に含まれる配列の遺伝子コードの縮重によって得られたコーディングＤＮＡ配列も同様に本発明の要素である。同様に、前記の配列又はその一部とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の要素である。当業界においては、更に、タンパク質中での保存的アミノ酸置換、例えばグリシンとアラニンの置換又はアスパラギン酸とグルタミン酸の置換は、“同義突然変異”（“sense mutations”）として知られ、この置換は、タンパク質活性の根本的変化をもたらさず、すなわち機能的に中立である。更に、タンパク質のＮ−末端及び／又はＣ−末端での変化が、その機能を実質的に損ねず又はそれどころか安定化できることは知られている。当業者は、それらの説明を、とりわけＢｅｎ−Ｂａｓｓａｔ他（Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)）で、Ｏ’Ｒｅｇａｎ他（Gene 77:237-251 (1989）で、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈ他（Protein Sciences 3:240-247 (1994)）で、Ｈｏｃｈｕｌｉ他（Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)）で、かつ遺伝学と分子生物学の公知の教科書において見出す。

最後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、配列番号１、４、６、９から得られるプライマーを使用して作製されるＤＮＡ配列は本発明の要素である。かかるオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも１５の連続したヌクレオチドの長さを、特に２０、３０又は４０の連続したヌクレオチドの長さを有する。

当業者は、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の同定の手引きを、とりわけベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ社のマニュアル“フィルタハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステム利用者手引き（The DIG System Users Guide for Filter Hybridization）”（ドイツ・マンハイム在、１９９３年）において、そしてＬｉｅｂｌ他（International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260）で見出す。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施される、すなわち、プローブと目的配列、つまりそのプローブで処理されるポリヌクレオチドとが少なくとも９０％同一である場合にのみハイブリッドが形成される。洗浄工程を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、バッファー組成の変更、温度変更及び塩濃度変更によって左右されあるいは規定されることは公知である。ハイブリダイゼーション反応は、洗浄工程に対して比較的低いストリンジェンシーで実施することが好ましい（Ｈｙｂａｉｄ社ハイブリダイゼーションガイド（Hybaid Hybridisation Guide）、Ｈｙｂａｉｄ有限会社（Hybaid Limited）、英国・テディントン在、１９９６年）。

ハイブリダイゼーション反応のためには、例えば５×ＳＳＣバッファーは、約５０℃〜６８℃の温度で使用することができる。この場合に、プローブは、プローブの配列に対して７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができる。かかるハイブリッドは、あまり安定ではなく、そしてストリンジェントな条件下で洗浄によって取り除かれる。このことは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣにまで下げ、場合により引き続き０．５×ＳＳＣにまで下げることによって、その際に温度を約５０℃〜６８℃に調整して達成することができる（フィルタハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステム利用者手引き（The DIG System Users Guide for Filter Hybridization）、ベーリンガーマンハイム社（ドイツ・マンハイム在、１９９５年））。場合により、塩濃度を０．１×ＳＳＣにまで下げることが可能である。ハイブリダイゼーション温度を、約１〜２℃の幅で、５０℃から６８℃に段階的に高めることによって、使用されるプローブの配列と例えば少なくとも９０％〜９５％の同一性を有するポリヌクレオチド断片を単離することができる。ハイブリダイゼーションについての更なる手引きは、いわゆるキットの形で市場から入手することができる（例えばロシュ・ディアグノスティクスＧｍｂＨ社（ドイツ・マンハイム在）のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ、カタログ番号１６０３５５８）。

当業者は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたＤＮＡ配列の増幅のための手引きを、特に、Ｇａｉｔによるマニュアル：オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide synthesis）：実際のアプローチ（a practical approach）（ＩＲＬ出版（IRL Press）、英国・オックスフォード在、１９８４年）及びＮｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍ：ＰＣＲ（スペクトラム・アカデミッシャー出版（Spektrum Akademischer Verlag）、ドイツ・ハイデルベルク在、１９９４年）で見出す。

一般的に行われるのは、良好に発現可能な遺伝子は低コピー数を有するベクター中にクローニングし、より弱い発現能力を有する遺伝子はより高いコピー数及び／又は強力なプロモーターを有するベクター上でクローニングすることである。宿主細胞は、前記のベクターで形質転換されており、こうして該細胞は、出発生物と比較して、ニトリルヒドラターゼの形成をコードする付加的なヌクレオチド配列コピーを少なくとも各々有する。

こうして作製された、特にシュードモナス属の形質転換された微生物又は組み換え微生物も同様に本発明の一部である。

本発明によるニトリルヒドラターゼとヘルパータンパク質Ｐ４７Ｋをコードする遺伝子を微生物において増強することによって、ニトリルヒドラターゼの産生向上がもたらされ、又はニトリルヒドラターゼの活性増大ももたらされる。

概念“増強”とは、この関連においては、微生物中で相応のＤＮＡによってコードされる１種又はそれ以上の酵素の細胞内活性を、例えば１種あるいは複数の遺伝子のコピー数を高めるか、強力なプロモーターを使用するか、又は高い活性を有する相応の酵素をコードする遺伝子を使用し、そして場合によりこれらの処置を組み合わせて、組み換えられていない出発生物と比較して高めることを説明している。

過剰発現の達成のために、構造遺伝子の上流にあるプロモーター領域及び調節領域又はリボソーム結合部位を突然変異させることができる。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットが同様にはたらく。更に、誘導可能なプロモーターによって、発酵によるアミノ酸産生の過程において発現を増大させることも可能である。ｍ−ＲＮＡの寿命の延長のための処置によっても同様に、発現は改善される。

更に、酵素タンパク質の分解の防止によっても同様に、酵素活性は増強される。遺伝子又は遺伝子構築物は、種々異なるコピー数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体に組み込まれそして増幅されうる。更に代替的に、当該遺伝子の過剰発現は、培地組成及び培養操作の変更によって達成することができる。

同様に以下も本発明の対象である。

１）ニトリルからアミドを酵素により製造する方法において、以下の工程：
ａ）ニトリル基を有する化合物と、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の酵素とを反応させる工程と、
ｂ）形成されたアミドを分離する工程とを有し、その際、
ｃ）ニトリルからアミドへの反応のために、本発明によるニトリルヒドラターゼを使用する方法。その酵素の残留活性は、メタクリルニトリルを２０ｍＭ（ｍＭ＝ミリモル／ｌ）のシアン化物イオンの存在下で２０℃で反応させた３０分後に、その酵素を同じ条件下にシアン化物イオンの不在下で反応に使用した場合の酵素の残留活性の少なくとも９０％の残留活性であることが好ましい。

２）１）による方法において、５０ｍＭのシアン化物イオンの存在下で反応させた後の残留活性が少なくとも６０％であることを特徴とする方法。

３）１）又は２）による方法において、酵素を産生しかつ含有する微生物又はその溶解物を使用することを特徴とする方法。

４）３）による方法において、微生物の休止細胞を使用することを特徴とする方法。

５）１）又は２）による方法において、精製酵素を使用することを特徴とする方法。

６）１）ないし５）による方法において、酵素が、シュードモナス属の微生物、特にシュードモナス・プチダ又はシュードモナス・マルギナリスに由来することを特徴とする方法。

７）６）による方法において、酵素が、シュードモナス属の微生物であって番号ＤＳＭ１６２７５及びＤＳＭ１６２７６として寄託されている微生物に由来し、かつ配列番号２、３、５、７、８、１０の配列を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。

８）１）ないし７）の１つ又はそれ以上による方法において、一般式

［式中、
Ｘは、ＯＨ、Ｈ、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、ＮＨ_２を意味し、
Ｒは、Ｈ、１〜１２個の炭素原子を有し分枝鎖状もしくは非分枝鎖状であってＮＨ_２で置換されていてよい飽和アルキル基、１つの二重結合を有しかつ１〜１２個の炭素原子を有し分枝鎖状もしくは非分枝鎖状の不飽和アルキル基、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、アルキルチオ基で置換されたアルキレン基であってそのアルキルがＣ_１〜Ｃ_３−基に相当しかつそのアルキレンが二価のＣ_３〜Ｃ_８−基に相当する基を意味し、
Ｒ′は、Ｈ（ＲがＨを意味しない場合に）、１〜３個の炭素原子を有するアルキルを意味し、
Ｒ′′は、６〜１２個の炭素原子を有し１もしくは２つのアルキル基（Ｃ_１〜Ｃ_３）、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆで置換されていてよい一核もしくは二核の不飽和環、１〜６個の炭素原子を有する一価のアルキルニトリル基を意味する］で示される化合物を転化させて、相応のアミドを得ることを特徴とする方法。

９）８）による方法において、一般式（Ｉ）の化合物を青酸又は青酸の塩の存在下で反応させることを特徴とする方法。

１０）９）による方法において、反応を、使用されるニトリルに対して０．１モル％のシアン化合物ないし３モル％のシアン化合物、有利には＞２〜３モル％のシアン化合物の存在下に実施することを特徴とする方法。このことは、１モルの最終濃度で、３モル％の場合に３０ミリモルのシアン化合物に相当する。

１１）１）ないし１０）の１つ又はそれ以上による方法において、ニトリルとして、メチオニンニトリルを使用することを特徴とする方法。

１２）１）ないし１０）の１つ又はそれ以上による方法において、ニトリルとして、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを使用することを特徴とする方法。

青酸、３−メチルチオプロピオンアルデヒドを、補助塩基、例えばトリエチルアミンの存在下で、先行技術に従って反応させて得られる反応混合物を使用することが好ましい。

該混合物は、有利には後精製することなく使用することができる。

このことは、本発明による酵素がアルデヒドとアミンに対して付加的に安定性があることを指示ししてる。

１３）メタクリルアミドのための前駆物質として、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオニトリルを使用する方法。

１４）本発明は、同様に、シュードモナス属であって番号ＤＳＭ１６２７５（ＭＡ３２、シュードモナス・マルギナリス）及びＤＳＭ１６２７６（ＭＡ１１３、シュードモナス・プチダ）として寄託されている単離と精製がなされた微生物にならうものである。

１５）シュードモナス属の菌株、特に番号ＤＳＭ１６２７５及びＤＳＭ１６２７６として寄託されているシュードモナス・プチダ及びシュードモナス・マルギナリスの菌株から単離されたシアン耐性ニトリルヒドラターゼ。

その寄託は、２００４年３月９日に、ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）（ブラウンシュバイク在）にてブタペスト条約に従って行った。

これらの菌株は、本発明による酵素を産生するのに特に適している。

“単離と精製がなされた微生物”は、天然にみられるより高い濃度で存在する微生物に関連する。

また本発明の対象は、前記のシアン耐性ニトリルヒドラターゼの製造方法において、
ａ）前記ニトリルヒドラターゼを産生する微生物、特にシュードモナス・マルギナリス又はシュードモナス・プチダといったシュードモナス属の微生物を、該酵素がその微生物中に形成される条件下で発酵させ、そして
ｂ）対数増殖期の完了後できるだけ早期に細胞を回収する方法である。

引き続き、
ａ）酵素を含有する微生物を、休止細胞の形で、場合により細胞膜の透過性を高めた後でか、又は
ｂ）細胞の溶解物を、又は
ｃ）微生物の細胞から公知の処置で単離された酵素を、
そのいずれかを、ニトリルからアミドへの本発明による転化に使用する。

そのニトリルヒドラターゼは、組み換えられていない微生物により産生された酵素でも組み換え微生物により産生された酵素でもよい。

更に本発明の対象は、本発明によるポリペプチドの組み換えによる製造方法において、このポリペプチドを産生する微生物を培養し、場合により関連するポリヌクレオチドの発現を誘導し、そして該酵素を場合により培養から単離する方法である。

一般には、
ａ）特にシュードモナス・マルギナリス又はシュードモナス・プチダといったシュードモナス属の微生物を発酵させるにあたり、それを、シュードモナスの科の微生物由来の単離されたポリヌクレオチドであって配列番号２と３と５又は配列番号７と８と１０中の配列を含むアミノ酸配列と９０〜１００％まで同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしそのポリペプチドがそれぞれ共通してシアン耐性ニトリルヒドラターゼの活性を有するポリヌクレオチドを、増強し、特に組み換えにより過剰発現させて行い、
ｂ）これらの微生物から、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素を場合により単離するか又はこの酵素を含有するタンパク質分画を製造し、そして
ｃ）ａ）による微生物又はｂ）による酵素又はこの酵素を含有するタンパク質分画を、一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）のニトリル基含有化合物を含有する培地に移す方法である。

発酵に使用される培養培地は、適宜、その都度の菌株の要求を満たさねばならない。様々な微生物の培養培地の説明は、米国微生物学学会（American Society for Bacteriology）のマニュアル“一般的な細菌学の方法のマニュアル（Manual of Methods for General Bacteriology）”（米国・ワシントンＤ．Ｃ．、１９８１年）に含まれている。
炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ脂、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノール、及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。これらの物質は、単独で又は混合物として使用することができる。

窒素源としては、有利には、有機ニトリル又は酸アミド、例えばアセトニトリル、アセトアミド、メタクリルニトリル、メタクリルアミド、イソブチロニトリル、イソブチルアミド又は尿素を使用することができ、また他の窒素含有化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉との組み合わせで、及び／又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することができる。前記窒素源は、単独で又は混合物として使用してよい。

リン源として、リン酸、リン酸水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又はこの相応するナトリウム含有塩を使用することができる。前記培養培地は更に、金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有することが必要であり、これらは成長に必要である。最後に、必須栄養成長物質、例えばアミノ酸及びビタミンを上述の物質に加えて使用してよい。上述の使用物質は、１回のバッチの形で培養物に添加するか、又はこの培養の間に適宜供給することができる。

前記培養物のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、又はアンモニア水、又は酸性化合物、例えばリン酸、又は硫酸が適宜使用される。気泡発生の制御のために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用してよい。好気条件を維持するために、酸素又は酸素含有のガス混合物、例えば空気を培養に導入する。培養温度は、通常では、１０℃〜４０℃であり、有利には１０℃〜３０℃である。培養は、対数増殖期が完了するまで続ける。この目標は、通常では、１０時間〜７０時間の間に達成される。これに引き続き、細胞を、有利には、回収し、洗浄し、バッファー中に懸濁液としてｐＨ値６〜９、特に６．８〜７．９で取り込む。その細胞濃度は、１〜２５％、特に１．５〜１５％（湿分質量／容量）に達する。透過性は、物理的又は化学的な方法により、例えばトルエンを用いて、例えばWilms et al., J. Biotechnol., 86巻 (2001), 19-30で記載されるように、この転化すべきニトリルが細胞壁を透過してアミドが流出できるように高めることができる。

以下のニトリルを転化させることが好ましい：
飽和モノニトリル：
アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリル
飽和ジニトリル：
マロンニトリル、スクシノニトリル、グルタロニトリル、アジポニトリル
芳香族の非置換及び置換のモノニトリル及びジニトリル：
ベンゾニトリル、２，６−ジフルオロベンゾニトリル、フタロニトリル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル
α−アミノニトリル：
α−アミノプロピオニトリル、α−アミノメチルチオブチロニトリル、α−アミノブチロニトリル、アミノアセトニトリル、天然アミノ酸から導き出される全てのニトリル、α−アミノ−３，３−ジメチルプロピオニトリル、α−アミノ−２，３−ジメチルプロピオニトリル
カルボキシル基を有するニトリル：
シアノ酢酸
β−アミノニトリル：
アミノ−３−プロピオニトリル
不飽和ニトリル：
アクリルニトリル、メタクリロニトリル、アリルシアニド、クロトノニトリル
α−ヒドロキシニトリル：
α−ヒドロキシ−ｎ−プロピオニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−ブチロニトリル、α−ヒドロキシ−イソブチロニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−ヘキサノニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−ヘプタノニトリル、α−ヒドロキシ−ｎ−オクタノニトリル、α，γ−ジヒドロキシ−β，β−ジメチルブチロニトリル、アクロレインシアノヒドリン、メタクリルアルデヒド シアノヒドリン、３−クロロラクトニトリル、４−メチルチオ−α−ヒドロキシブチロニトリル及びα−ヒドロキシ−フェニルプロピオニトリル。

転化させるべきニトリルの反応溶液中での濃度は、規定の範囲に制限されない。

基質による酵素活性の阻害を回避するために、ニトリルの濃度は、一般には、乾燥細胞質量としての生体内触媒の量に対して、０．０２〜１０質量％、特に０．１〜２質量％に保持される。基質は、転化開始時に全体を添加することができ又は転化の過程において連続的にもしくは断続的に添加することができる。

乾燥質量の測定は、湿分分析器（Moisture Analyser)ＭＡ４５型（ザルトリウス社）で行われる。

水性反応系へのニトリル化合物の溶解度が低すぎる場合には、溶解補助剤を添加してよい。

しかしながら代替的に、その反応を、水／有機溶剤の二相系で実施することもできる。

微生物の細胞を酵素活性物質として使用する場合には、使用される細胞の量は、基質量に対して、乾燥細胞質量として有利には０．０２〜１０質量％である。

また、単離された酵素を、一般に知られる技術に従って固定化し、そしてその形で使用することも可能である。

反応は、一般には、−５℃〜５０℃、特に０℃〜３０℃の温度で、かつ０．１〜１００時間の時間で実施される。

保持されるべき反応混合物のｐＨ値は、酵素活性が損なわれない限りは一定の範囲に制限されない。転化の後に、形成されたアミドを、反応溶液から公知のように分離し、精製してよい。

また本発明の対象は、アミドもしくはアミドを含有する溶液を、例えばバイオマスの細胞から分離し、そしてそのアミドを、鹸化させて相応の酸にするか、又はアルカリ金属水酸化物もしくはアルカリ土類金属水酸化物を添加しつつ転化させて、相応の酸の塩にする方法である。ＭＨＡ−アミドを水酸化カルシウムで鹸化させ、そして相応のカルシウム塩を単離することが好ましい。

実施例
実施例１
培養条件
前培養は、２４時間以内で、３０℃で振盪下に、容量５ｍｌでガラス試験管中で増殖を行った。１ｍｌの前培養を、１００ｍｌの主培養に接種し、そして２５℃で４２時間、全容量１０００ｍｌを有するエルレンマイヤーフラスコ中で振盪した。

実施例２
微生物の単離及び同定
両者の菌株ＭＡ３２とＭＡ１１３とを、休止細胞のニトリルヒドラターゼ活性を２ｍＭのシアン化カリウムの存在下で測定することによって選択した。

その細胞性脂肪酸のプロフィールは、シュードモナスのＩ群に典型的である。

４８４塩基対長の１６Ｓ ｒＲＮＡ断片の解析によって、シュードモナス・マルギナリスの配列との１００％の一致が結果として得られた。

全てのデータを考慮に入れて、ＭＡ３２は、シュードモナス・マルギナリスとして同定できた。

その細胞性脂肪酸のプロフィールは、シュードモナスのＩ群に典型的である。

４７６塩基対長の１６Ｓ ｒＲＮＡ断片の解析によって、シュードモナス・プチダの配列との１００％の一致が結果として得られた。

全てのデータを考慮に入れて、ＭＡ１１３は、シュードモナス・プチダとして同定できた。

実施例３
酵素活性の測定
細胞を、実施例１に記載されるように増殖させ、遠心分離により培養培地から分離し、そして標準的バッファー（５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー ｐＨ７．５）中に再懸濁した。この細胞懸濁液５０μｌを、標準的バッファー７００μｌに添加し、そして反応の開始のために、ニトリルを標準的バッファー中に溶かした２００ｍＭ溶液２５０μｌと混合した。この場合に、細胞懸濁液中の細胞の濃度は、ニトリルが２０℃で１０分後に、５〜３０％まで転化されるように見積もられた。２０℃で１０分後に、半分に濃縮されたリン酸２０μｌを添加することによって反応を停止させ、そして細胞を遠心分離によって分離した。

１ユニットの活性を、１マイクロモルのメタクリルニトリルが１分間転化してアミドとなる酵素量として定義した。アミドの他に酸も生じたのであれば、１ユニットを、１マイクロモルのメタクリルニトリルが１分間転化してアミドと酸となる酵素量として定義した。

図１と図２において、菌株ＭＡ３２と菌株ＭＡ１１３の相対活性を示している。

実施例４
ニトリルヒドラターゼの活性へのシアン化合物の影響
実施例３と同様にして製造された細胞懸濁液５０μｌを、０ｍＭ、２１．４ｍＭ、５３．６ｍＭ及び１０７．１ｍＭのシアン化カリウムを含有する標準的バッファー７００μｌ（最終濃度 ０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭのシアン化合物）に添加した。反応の開始のために、それぞれ他の反応溶液と同じシアン化合物濃度を有する標準的バッファー中にニトリルを溶かした２００ｍＭの溶液２００μｌを添加した。この場合に、細胞懸濁液中の細胞の濃度は、ニトリルが、シアン化合物を含まないバッチ中で２０℃で１０分後に、１６％まで転化されるように見積もられた。２０℃で１０分後に、半分に濃縮されたリン酸２０μｌを添加することによって反応を停止させ、そして転化率を実施例２と同様にして測定した。

図３と図４において、シアン化合物濃度に依存するメタクリルニトリルの転化についての相対活性を示している。

実施例５
シュードモナス・マルギナリスＭＡ３２休止細胞によるアセトンシアンヒドリンの転化
シュードモナス・マルギナリスＭＡ３２細胞を、実施例１に記載されるように増殖させ、そして遠心分離した。１．１６ｇの生体乾燥質量を含む細胞の量を、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）５０ｍＭで最終容量５０ｍｌにまで希釈した。更に、該反応混合物に０．０２ｍＭの２−メチル−１−プロパンボロン酸を添加した。蒸留したばかりのアセトンシアンヒドリンを、４℃で、激しく撹拌しながら連続的に、反応中の濃度がどの時点でも５ｇ／Ｌを上回らないような速度で添加した。ｐＨは、７．５で一定に保持した。反応の追跡は、ＨＰＬＣを用いて、実施例３に記載されるようにして実施した。１４０分後に、１０．０ｇのニトリルは、完全に、１０．７ｇのアミドと１．４ｇの酸とに転化した。

図５において、菌株ＭＡ１１３で達成された反応の時間的経過を示している。

実施例６
シュードモナス・マルギナリスＭＡ３２休止細胞による粗製ＭＨＡ−ニトリルの転化
シュードモナス・マルギナリスＭＡ３２細胞を、実施例１に記載されるように増殖させ、そして遠心分離した。０．３４ｇの生体乾燥質量を含む細胞の量を、５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で最終容量７０ｍｌにまで希釈した。更に、該反応混合物に０．０２ｍＭの２−メチル−１−プロパンボロン酸を添加した。粗製ＭＨＡ−ニトリルを、４℃で、激しく撹拌しながら連続的に、反応中の濃度がどの時点でも１０ｇ／Ｌを上回らないような速度で添加した。ｐＨは、８．０で一定に保持した。反応の追跡は、ＨＰＬＣを用いて、実施例２に記載されるようにして実施した。５１０分後に、１０．０５ｇのニトリルは、完全に、１１．１３ｇのアミドと０．３１ｇの酸とに転化した。それは、１リットルあたり１３９ｇのアミドの最終濃度に相当する。

そのＭＨＡ−ニトリルは、３−メチルチオプロピオンアルデヒドと多少過剰な青酸とから直接的に製造された。このＭＨＡ−ニトリルを水中に溶かした５０ｍＭの溶液は、０．５ｍＭのシアン化合物を含有した（Ｓｐｅｋｔｒｏｑｕａｎｔ（登録商標）、メルク社）。

図６において、菌株ＭＡ３２で達成された反応の時間的経過を示している。

実施例７
シュードモナス・マルギナリスＭＡ３２からのニトリルヒドラターゼ遺伝子クラスターのクローニング及び発現ベクターの構築
α−サブユニットと、β−サブユニットと、ニトリルヒドラターゼの活性に同時発現が必須であるニトリルヒドラターゼ−アクチベータータンパク質とを含むニトリルヒドラターゼの遺伝子クラスター（Nojiri et al., 1999, Journal of Biochemistry, 125:696-704）を、プライマー１Ｆとプライマー１ＲでＰＣＲによって増幅させて、制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩのための切断部位を挿入した。こうして得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断されたベクター中にライゲーションし、その際、挿入された遺伝子は、ラムノース−プロモーターの制御下にある。こうして得られた発現ベクターを、ｐＫＥ３１と呼ぶ。

制限地図は、図７、つまり配列番号１の配列で明らかになる。

発現プラスミドを、ドイツ微生物細胞培養コレクションＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）で２００１年８月２２日に寄託されている大腸菌ＤＳＭ１４４５９で形質転換した。

以下の遺伝子：
α−サブユニットの遺伝子： ヌクレオチド２５〜６０９
β−サブユニットの遺伝子： ヌクレオチド６５０〜１３１２
アクチベータータンパク質の遺伝子 ヌクレオチド１３０９〜２５７７
が配列番号１の断片にある。

実施例８
シュードモナス・プチダＭＡ１１３からのニトリルヒドラターゼ遺伝子クラスターのクローニング
α−サブユニットと、β−サブユニットと、ニトリルヒドラターゼの活性に同時発現が必須であるニトリルヒドラターゼ−アクチベータータンパク質とからなるニトリルヒドラターゼの遺伝子クラスター（Nojiri et al., 1999, Journal of Biochemistry, 125:696-704）を、プライマー１Ｆとプライマー１ＲでＰＣＲによって増幅させた。

その配列は配列番号６で明らかにしている。

以下の遺伝子：
α−サブユニットの遺伝子： ヌクレオチド１〜５８２
β−サブユニットの遺伝子： ヌクレオチド６２４〜１２８６
アクチベータータンパク質の遺伝子 ヌクレオチド１２８３〜２３６０
が配列番号５の断片にある。

実施例９
シュードモナス・マルギナリスＭＡ３２由来のニトリルヒドラターゼの大腸菌ＤＳＭ１４４５９での異種発現
大腸菌ＤＳＭ１４４５９は、ＤＥ１０１５５９２８号との関連で寄託された。

ｐＫＥ３１で形質転換された細胞を、２ｍＭのクエン酸鉄（ＩＩＩ）及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＭｉｌｌｅｒによるＬＢブイヨン、ＶＷＲ）中で３７℃で振盪しつつ増殖させた。１２〜１６時間後に、かかる量の前培養を主培養中に接種しなおし、そのＯＤ６００を０．１とした。主培養の培養培地は、前培養のそれに相当するが、付加的に２ｇ／ＬのＬ−ラムノースを含有している。細胞の回収は、３０℃で２２時間培養した後に実施した。

実施例１０
酵素活性の測定
細胞培養と活性測定は、実施例９と実施例３とに記載されるようにして実施した。

プラスミドｐＫＥ３１で形質転換された大腸菌株ＤＳＭ１４４５９の細胞は、比活性１７Ｕ／ｍｇ ＢＴＭを有する。

実施例１１
１００ｍＭのシアン化カリウムの存在下での酵素活性の測定
細胞培養と活性測定は、１００ｍＭのシアン化カリウムの存在下で、実施例９と実施例４とに記載されるようにして実施した。

プラスミドｐＫＥ３１で形質転換された大腸菌株ＤＳＭ１４４５９の細胞は、比活性１１Ｕ／ｍｇ ＢＴＭを有する。

図１は、菌株ＭＡ３２の相対活性を示している 図２は、菌株ＭＡ１１３の相対活性を示している 図３は、菌株ＭＡ３１でのシアン化合物濃度に依存するメタクリルニトリルの転化についての相対活性を示している 図４は、菌株ＭＡ１１３でのシアン化合物濃度に依存するメタクリルニトリルの転化についての相対活性を示している 図５は、菌株ＭＡ１１３で達成された反応の時間的経過を示している 図６は、菌株ＭＡ３２で達成された反応の時間的経過を示している 図７は、プラスミドｐＫＥ３１の制限地図を示している

Claims (23)

1. シアン耐性ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質（ａ）もしくは（ｂ）をコードする、シュードモナス属の微生物由来のポリヌクレオチドであって、前記タンパク質（ａ）が、シュードモナス・マルギナリスに由来し、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドとを含むタンパク質であり、かつ前記タンパク質（ｂ）が、シュードモナス・プチダに由来し、かつ配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドとを含むタンパク質である、前記ポリヌクレオチド。
2. 請求項１記載のポリヌクレオチドであって、
   ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
   ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲でａ）の配列に相当するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
   の群から選択され、その際、シアン耐性ニトリルヒドラターゼをコードするポリヌクレオチド。
3. 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、又は配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有するタンパク質。
4. 請求項３記載のシアン耐性ニトリルヒドラターゼの活性を有するタンパク質であって、その残留活性が、メタクリルニトリルを２０ｍＭ（ｍＭ＝ミリモル／ｌ）のシアン化物イオンの存在下で２０℃で反応させた３０分後に、その酵素を同じ条件下にシアン化物イオンの不在下で反応について評価した場合の酵素の残留活性の少なくとも９０％の残留活性であるタンパク質。
5. 請求項１又は２記載のポリヌクレオチドを有するベクター。
6. 請求項１又は２記載のポリヌクレオチドの導入により形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞。
7. 請求項５記載のベクターの導入により形質転換された宿主細胞。
8. ニトリルからアミドを酵素により製造するための方法において、以下の工程：
   ａ）ニトリル基を有する化合物と、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物酵素（タンパク質）とを、青酸又は青酸の塩の存在下で反応させる工程、及び
   ｂ）形成したアミドを分離する工程
   を有し、その際、ニトリルを転化させてアミドにするために、請求項３又は４記載のシアン耐性ニトリルヒドラターゼを使用する、ニトリルからアミドを酵素により製造するための方法。
9. 請求項８記載の方法において、請求項６又は７記載の宿主細胞又はその溶解物を使用することを特徴とする方法。
10. 請求項９記載の方法において、微生物の休止細胞を使用することを特徴とする方法。
11. 請求項８記載の方法において、精製されたニトリルヒドラターゼを使用することを特徴とする方法。
12. 請求項８から１１までのいずれか１項記載の方法において、一般式
    

    

    ［式中、
    Ｘは、ＯＨ、Ｈ、アルキル、ＮＨ_２を意味し、
    Ｒは、Ｈ、１〜１２個の炭素原子を有し、分枝鎖状又は非分枝鎖状の、ＮＨ_２で置換されていてよい飽和アルキル基、１個の二重結合と１〜１２個の炭素原子を有し、分枝鎖状又は非分枝鎖状の不飽和アルキル基、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、アルキルチオ基で置換されたアルキレン基であってそのアルキル基がここではＣ_１〜Ｃ_３−基に相当しかつそのアルキレンが二価のＣ_３〜Ｃ_８−基に相当する基を意味し、
    Ｒ′は、Ｈ、１〜３個の炭素原子を有するアルキルを意味し、
    Ｒ′′は、６〜１２個の炭素原子を有し、１又は２個のアルキル基（Ｃ_１〜Ｃ_３）、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆで置換されていてよい一核もしくは二核の不飽和環、１〜６個の炭素原子を有するアルキルニトリル基を意味する］の化合物を転化させて、相応のアミドを得、その際、一般式（Ｉ）の化合物は、青酸又は青酸の塩の存在下で反応されることを特徴とする方法。
13. 請求項１２記載の方法において、転化を、使用されるニトリルに対して、０．５モル％より高くて３モル％までの出発濃度のシアン化物の存在下で実施することを特徴とする方法。
14. 請求項８から１３までのいずれか１項記載の方法において、ニトリルとして、２−アミノ−４−メチルチオブチロニトリルを使用することを特徴とする方法。
15. 請求項８から１３までのいずれか１項記載の方法において、ニトリルとして、２−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルであって該ニトリルの製造からの反応混合物中に含まれていてよいニトリルを使用することを特徴とする方法。
16. 請求項８から１３までのいずれか１項記載の方法において、ニトリルとして、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオニトリルを使用することを特徴とする方法。
17. 請求項８から１６までのいずれか１項記載の方法において、アミドもしくはアミド含有溶液からバイオマスの細胞を分離し、そしてそのアミドを鹸化させて、相応の酸にすることを特徴とする方法。
18. 請求項８から１６までのいずれか１項記載の方法において、アミドもしくはアミド含有溶液からバイオマスの細胞を分離し、そしてそのアミドをアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物により鹸化させて、相応のカルボン酸の塩にすることを特徴とする方法。
19. 請求項１８記載の方法において、ＭＨＡ−アミドを水酸化カルシウムで鹸化させ、そしてカルシウム塩を得ることを特徴とする方法。
20. 請求項８から１９までのいずれか１項記載の方法において、
    ａ）シュードモナス属の微生物を発酵させるにあたり、それを、単離されたポリヌクレオチドであって配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、又は配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有するタンパク質をコードしそのタンパク質がシアン耐性ニトリルヒドラターゼの活性を有する単離されたポリヌクレオチドを、増強し、組み換えにより過剰発現させて行い、
    ｂ）これらの微生物から、ニトリルヒドラターゼ活性を有する組み換えにより作製された酵素を場合により単離するか又はこの酵素を含有するタンパク質分画を製造し、そして
    ｃ）ａ）による微生物又はｂ）による酵素又はこの酵素を含有するタンパク質分画を、一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）のニトリル基含有化合物を含有する培地に移す
    ことを特徴とする方法。
21. 請求項８から１９までのいずれか１項記載の方法において、請求項６又は７記載の宿主細胞を使用することを特徴とする方法。
22. 番号ＤＳＭ１６２７５又はＤＳＭ１６２７６として寄託されている、シュードモナス属の微生物。
23. 番号ＤＳＭ１６２７５又はＤＳＭ１６２７６として寄託されているシュードモナス属の菌株から単離されたシアン耐性ニトリルヒドラターゼであって、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、又は配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを有するシアン耐性ニトリルヒドラターゼ。

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