ITMI951513A1 - Uso di derivati 1,4-diidropiridinici per la prevenzione e la terapia della degenerazione aterosclerotica della parete arteriosa - Google Patents

Abstract

Viene descritto l'uso di derivati 1,4-diidropiridinici come agenti terapeutici per la realizzazione di farmaci adatti a prevenire, arrestare e far regredire la degenerazione aterosclerotica della parete arteriosa nell'uomo, in quanto contrastano numerosi dei processi che concorrono all'insorgenza delle lesioni vascolari aterosclerotiche quali: la proliferazione e migrazione miocitiche, il metabolismo del colesterolo nei macrofagi e la modificazione ossidativa delle lipoproteine a bassa densità. Composti preferiti allo scopo sono la lercanidipina, la (S)-lercanidipina e la (R)-lercanidipina.

Description

DESCRIZIONE dell’Invenzione avente per titolo:

“USO DI DERIVATI 1,4-DIIDROPIRIDINICI PER LA PREVENZIONE E LA TERAPIA DELLA DEGENERAZIONE ATEROSCLEROTICA DELLA PARETE ARTERIOSA"

Oggetto della presente invenzione e’ l’Impiego d1 derivati 1,4-diidropiridinici per contrastare numerosi processi che prendono parte nell’insorgenza delle lesioni vascolari aterosclerotlche, quali la proliferazione e la migrazione miocitiche, il metabolismo del colesterolo nel macrofagi e la modificazione ossidatlva delle Hpoprotelne a bassa densità’. Gli effetti positivi esercitati sul suddetti processi biologici possono essere considerati la base della prevenzione e della terapia nella degenerazione ateroseierotica della parete arteriosa umana. L’invenzione prevede Inoltre l’Impiego d1 derivati 1,4-diidropiridinici nella fabbricazione di farmaci per prevenire, arrestare e far regredire nell’uomo la degenerazione ateroscleratica della parete arteriosa.

L'arteriosclerosi, termine generico per descrivere l’ispessimento e l’Indurimento della parete arteriosa, e’ responsabile di molti decessi sia negli Stati Uniti, sia nelle altre società’ occidentali. Un tipo di arteriosclerosi e’ l’aterosclerosi, disturbo delle arterie piu’ grandi, che sta alla base della maggior parte delle coronaropatle, degli aneurismi aortici e delle malattie arteriose delle estremità’ inferiori e che svolge Inoltre una parte di primo plano nelle malattie cerebrovascolari. L’aterosclerosi e’ di gran lunga la causa principale di morte negli Stati Uniti, sia prima che dopo 1 65 anni.

E’ stato ora riconosciuto che l’aterosclerosi e’ un processo multlfattoriale caratterizzato, quando provoca complicanze cllniche, da una notevole proliterazione delle cellule muscolari lisce migrate nell'intima dell’arteria colpita. La formazione delle placche

aterosclerotiche può’ essere considerata la conseguenza di tre processi biologici fondamentali:

1) migrazione e proliferazione delle cellule muscolari lisce

Intimali, unite all’accumulo d1 quantità’ variabili di macrofagi e linfociti T;

2) formazione, da parte delle cellule muscolari lisce proliferate, d1 grandi quantità’ d1 matrice di tessuto connettivo, quale collagene, fibre elastiche e proteogllcanl;

3) deposito di lipidi, soprattutto 1n forma di esteri del

colesterolo e colesterolo Ubero, nelle cellule e nel tessuti

connettivi adiacenti.

Inoltre, diverse evidenze sperimentali fanno ipotizzare un ruolo chiave svolto dalla modificazione ossldatlva delle Hpoprotelne a bassa densità’ (LDL) nel primi stadi dell’aterosclerosi nell’uomo, in cui l’ipercolesterolemia costituisce il principale fattore di rischio assodato all’aumento dell’incidenza della patologia. I dati a disposizione fanno supporre che le LDL siano soggette a modificazione ossidativa e che le LDL ossidate possano indurre l'eterogenesi attraverso diversi meccanismi, quali un aumento del loro assorbimento nel macrofagi tlssutall che provoca un accumulo di grassi e attività' chemiotattlca per 1 monod tl e una citotossicita’ per le cellule endotellali della parete arteriosa.

E’ stato ora sorprendentemente trovato che alcuni derivati 1,4-diidropiridinici, di cui il brevetto americano US 4,705,797 evidenzia l’attlvlta’ coronarodllatatorla ed antiiportensiva, sono 1n grado di contrastare molti del processi biologici che provocano le lesioni aterosclerotiche e, di conseguenza, possono essere impiegate nell’uomo per prevenire e curare la degenerazione aterosclerotica della parete arteriosa, l’ipercolesterolemia ed i vari disturbi da questi generati. Tra questi ultimi, ad esemplo, i disturbi del cuore 1schem1co come l'Infarto miocardico o i disturbi cerebrovascolarl come l’Infarto e l’apoplessia cerebrali.

I composti dell'Invenzione possono anche essere usati per l’Inibizione della restenosl causata da angloplastlca transluminaie percutanea delle coronarle (PTCA) e per arrestare la progressione dell’Ipertrofia vascolare assod ata all’Ipertensione.

Tra questi derivati della 1,4-diidropiridina si preferiscono in particolare la lercanidipina, i suo enantlomerl e i loro sali farmaceuticamente accettabili. La Iercanidipina e' il meti

1,1,N-trimetil-N-(3,3-difenilpropil)-2-aminoetil 1,4-diidro-2,6--dlmetll-4-(3-nitrofenil)piridin-3,5-dicarbossilato.

La Iercanidipina ed il suo enantlomero (S) sono entrambi dotati di attività’ antiipartansiva oltre che antlateroseierotica e possono essere quindi utilizzati 1n pazienti che necessitano di cure, sia per l'Ipertensione, sia per l’aterosclerosi.

D’altra parte, la (R)-lercanidipina e’ praticamente priva di attività’ antiipertensiva e può’ essere utilizzata per trattare l’aterosclerosi senza dare effetti cardiovascolari. Questo enantlomero può’ quindi essere utilizzato nel pazienti ateroseierotici 1n cui un abbassamento della pressione sia indesiderato.

L’Invenzione fornisce un metodo per la prevenzione, l’arresto e la regressione della degenerazione aterosclerotlca della parete arteriosa, metodo che prevede la somministrazione al paziente di quantità’ terapeuticamente efficaci d1 un composto avente la formula generale I

dove

Ph rappresenta un gruppo fenilico, Ar rappresenta un gruppo 2-nitrofenilico, 3-nitrofenilico,

2,3-diclorofenilico o benzofurazan-4-iico, A rappresenta un gruppo alchllenico a catena ramificata con 3-6 atomi di carbonio,

R rappresenta un gruppo alchilico a catena lineare o ramificata con 1-6 atomi di carbonio, alternativamente monosostltulto da un gruppo alcossl con 1-6 atomi di carbonio, R1 rappresenta un atomo di idrogeno, un gruppo idrossi o un gruppo alchlUco con 1-4 atomi di carbonio, ed

R2 rappresenta un atomo di Idrogeno o un gruppo metilico; o d1 un suo sale, enantlomero, idrato o solvato.

L’Invenzione prevede inoltre l'Impiego di un composto d1 formula generale I per la preparazione di farmaci per la prevenzione, l’arresto e la regressione della degenerazione aterosclerotlca delle pareti arteriose del paziente.

I derivati 1,4-diidropiridinici preferiti per la somministrazione al paziente e per l'Impiego nella preparazione di farmaci sono la Iercanidipina ed i suoi enantiomeri (R) ed (S). La lercanidipina può' essere preparata mediante ciclizzazione secondo Hantzsch del metile 3-aminocrotonato (1) con Vl.l.N-trlmetll-N-O.a-dlfenlìpropll)-2-aminoetil a-acetil-3-nitrocinnamato (2) secondo il metodo Illustrato nello Schema 1 e descritto p1u’ 1n dettaglio nel brevetto US 4,707,797.

SCHEMA 1

In alternativa, la Iercanidipina può’ essere

preparata per esterificazione dell’acido

1,4-diidro-2,6-dimetil-5-metossicarbonil--4-(3-nitrofenil)-piridin-3-carbossilico (3) con 2,N-dimetil-N-~(3,3-difenilpropil)-1-amino-2-propanolo (4) secondo il metodo Illustrato di seguito nello Schema 2 e descritto più’ dettagliatamente nell’Esempio 3.

SCHEMA 2

Gli enantiomeri della Iercan1d1p1na possono essere preparati secondo il metodo di esterificazione indicato nel suddetto Schema 2 usando gli opportuni acidi omochlrall che, quando presenti 1n rapporto d1 1:1, costituiscono il suddetto acido 3. Tali acidi omochlrall, d1 seguito chiamati per comodità’ addo 5 [enantlomero (R)] e acido 6 [enantlomero (S)], possono essere preparati facilmente mediante risoluzione dell’acido racemlco 3 secondo 1 metodi Illustrati da A. Ashimorl et al., Chem. Pharm. Bull. 39, 108 (1991).

L’esterificazione di cui allo Schema 2 può' essere eseguita in presenza di in agente d1 accoppiamento, quale dicicloesilcarbodiimide, N,N’-carboniIdiimidazolo o dletll danofosfonato opzionalmente 1n presenza di un agente promotore, quale N-idrossisuccinimide o

4-dimetilaminopiridine. Possono essere utilizzati solventi aprotici o clorurati, quali per esempio dimetiIformammide o cloroformio, a temperature variabili da -10 a 140'C secondo noti metodi d1 sintesi: Albertson, Org. Read. 12, 205 (1982); Ooherty et al., J. Ned. Chem. 35, 2 (1992); Staab et al., Newer Methods Prep. Org. Chem. 5, 81 (1988); Ishlhara, Chem. Pharm. Bull. 39, 3238 (1991).

In alternativa, gl1 enantiomeri della lercanidlplna possono essere preparati facendo prima reagire l’addo 5 (o 6) con alchlle cloroformlato in presenza di un’ammlna terziaria quale trletllarrenina, aggiungendo poi l’Intermedio (4) a 0-80‘C. In alternativa, prima dell'aggiunta dell’intermedio (4) può’ essere aggiunto un agente promotore, quale la 1-1dross1p1per1d1na, (vedi: Albertson, Org. Reac.

12, 157 (1982)).

Gli enantiomeri della lercanidlplna possono Inoltre essere preparati per trasformazione dell'acido 5 (o 6) nel corrispondente alogenuro adlco usando un alogenuro addo Inorganico, quale fosforo pentacloruro,ossalil cloruro, fosforo tricloruro, fosforo osslcloruro o tlonlle cloruro, in solvente clorurato, per esemplo cloroformio, dlcloroetano, dlclorometano o 1,1,1-tricloroetano anche 1n presenza di un agente promotore quale dimetlIformammlde, ad una temperatura di -10/85‘C. Gli alogenurl adIlei possono, ma non e’ indispensabile, essere Isolati prima dell’aggiunta dell'intermedio (4).

Gli enantlomeri della Iercanidipina, Indipendentemente da come sono ottenuti, possono essere purificati secondo i metodi noti nell’arte, sia in forma di base (per esemplo mediante cromatografia su colonna), sia in forma di sale (per esemplo mediante riprecipitazione o ricristallizzazione).

I metodi sopra citati con riferimento alla Iercan1d1p1na ed al suol enantlomerl possono essere adottati, apportando le opportune modifiche che risulteranno ovvie all’esperto nell’arte, anche per la preparazione e la purificazione degli altri composti di formula generale I.

Nel metodo di trattamento previsto dall’Invenzione, il derivato I della 1,4-diidropiridina può’ essere somministrato al paziente tal quale o in forma di un qualsiasi suo sale, Idrato o solvato farmaceuticamente accettabile. I sali preferibili sono quelli formati con addo cloridrico, solforico, malelco, sucdnlco, citrico, metansolfonlco e toluensolfonlco, che possono essere preparati con le basi libere nel modo tradizionale. Qualsiasi sia la forma (base, sale, idrato o solvato), il principio attivo può’ essere normalmente somminlstrato miscelato a un veicolo farmaceutlcernente accettabile.

Per la somministrazione orale, i derivati 1,4-diidropiridinici possono essere incorporati in eccipienti e usati in forma d1 compresse, tavolette, capsule, elisir, sospensioni, sciroppi, cialde, gonne da masticare e slmili. Tali preparati devono contenere almeno lo 0,5% di principio attivo, ma la quantità’ del principio attivo può’ variare in funzione della forma particolare e può’ opportunamente variare tra il 5% e 11 70% circadel peso complessivo dell’unita’. Normalmente la quantità’ di principio attivo presente 1n tali composizioni e’ tale da consentire d1 ottenere un dosaggio Idoneo, sebbene il dosaggio desiderato possa anche essere ottenuto somministrando una molteplicità’ d1 forme farmaceutiche. I composti dell’Invenzione possono essere somministrati 1n un dosaggio orale d10,1-400 mg, preferibilmente 1n un dosaggio d1 1-200 mg.

Le compresse, pillole, capsule, cialde e slmili possono Inoltre contenere, per esemplo, 1 seguenti Ingredienti: un legante quale la cellulosa mlcrocristal1Ina, la gomma adragante o la gelatina; un eccipiente quale l'amido o 11 lattosio; un disgregante quale l’acido alglnlco, l’amido gllcolato sodico, l’amido d1 mais e slmili; un lubrificante quale 11 magnesio stearato o l’olio d1 ricino Idrogenato e un agente per favorire lo scorrimento quale il ilossido di silicio colloidale. Possono essere previsti dolcificanti quali il saccarosio o la saccarina, cosi’ come aromi quali la menta piperita, il meti salicilato e l’arancia. Se la forma farmaceutica e’ una capsula, oltre al materiali del tipo suddetto, si può’ Inserire un veicolo liquido quale un olio grasso. Le unita’ farmaceutiche per uso orale possono contenere diversi altri materiali che modificano la forma fisica dell’unita’ stessa, per esempio come rivestimento. In tal modo, le compresse e le pillole possono essere rivestite con zucchero, gomma laccao altri agenti per il rivestimento gastroreslstente. Lo sciroppo può’ contenere, oltre al principio attivo, il saccarosio come dolcificante ed alcuni conservanti, coloranti o aromi.

I materiali utilizzati per la preparazione d1 queste diverse composizioni devono essere farmaceuticamente puri e atossici nelle quantità’ Impiegate.

Per la somministrazione parenterale, i derivati

1,4-diidropiridinici possono essere Incorporati 1n una soluzione o 1n una sospensione. Tali preparati devono contenere almeno lo 0,1% d1 principio attivo, ma la quantità’ del principio attivo può’ variare dallo 0,5% al 30% circa del loro peso. La quantità’ di principio attivo 1n tali composizioni e’ tale da consentire d1 ottenere un dosaggio Idoneo. Di preferenza, un’unita’ farmaceutica per uso parenterale contiene 0,5-100 mg d1 principio attivo. Le soluzioni e sospensioni possono prevedere Inoltre i seguenti componenti: un diluente sterile quale l’acqua per preparazioni Iniettatili, la soluzione fisiologica, gli olii fissi, 1 glicoli polietilenici, la glicerina, il glicole propllenico e altri solventi sintetici; un antibatterico quale l’alcool benzilco e 1 p-oss1benzoati metilici; un antiossidante quale l’addo ascorbico e il sodio bisolfito; un agente chelante quale l'addo et1lendlarreninotetraacetlco; un tampone quale un acetato, un citrato o fosfato e un agente per la correzione della tossicità’ quale il sodio cloruro o il destrosio.

I flaconi multldose per uso parenterale possonoessere di vetro o plastica.

Le forme farmaceutiche, gli ingredienti supplementari e le vie di somministrazione previsti sono quelli illustrati nel brevetti US 4,089,969 ed US 5,091,182.

Gl1 esempi seguenti Illustrano in particolare la preparazione della Iercanidipina e del suoi enantiomerl, ma non Intendono costituire una limitazione della presente Invenzione.

PARTE FARMACOLOGICA

Descrizione delle figure

La Figura 1 e’ una rappresentazione grafica dell’effetto esercitato dalla Iercanidipina e dai suoi enantiomeri sull'Incorporamento di <3>H-timidina nel miociti delle cellule della muscolatura liscia di ratto.

La Figura 2 e’ una rappresentazione grafica della capacita' della Iercanidipina e del suol enantlomerl di Interferire con la migrazione dei miodti arteriosi.

La Figura 3 e' una rappresentazione grafica della capacita’ della Iercanidipina e del suol enantlomerl di inibire l’enzima ACAT e l’esterificazione del colesterolo Indotta da AcLDL nel macrofagi peritoneali di topo.

La Figura 4 e’ una rappresentazione grafica dell’effetto concentrazione-dipendente esercitato dalla Iercan1d1p1na e dal suoi enantlomerl sull’Inibizione della esterificazione del colesterolo nel macrofagi caricati con esteri del colesterolo.

Le Figure 5 e 6 sono rappresentazioni grafiche dell'effetto esercitato dalla Iercanidipina e dal suol enantlomerl sull’ossidazione d1 LDL mediata a livello cellulare.

La Figura 7 e’ l’andamento in funzione del tempo dell’ossidazione lipidica cellulo-medlata con o senza incubazione con Iercan1d1p1na.

Effetti sulla migrazione e proliferazione del miociti arteriosi I modelli animali di lesione vascolare dimostrano che la lesione arteriosa e’ seguita dalla proliferazione del m1oc1t1 mediali, molti del quali migrano all’Interno dell’Intima e proliferano ulteriormente formando una lesione neointimale. Le cause di questi fenomeni non sono completamente chiare. Da studi recenti e’ emerso che i miociti rappresentano circa il 90-95% della popolazione cellulare della lesione aterosclerotica negli adulti giovani e costituiscono 1n media il 50* della placca aterosclerotlca avanzata. Inoltre, i miodtl vascolari contribuiscono alla lesione sintetizzando la matrice extracellulare e possono accumulare lipidi diventando cellule schiumose. In tal modo, la comprensione del fattori che Influenzano questi fenomeni fornisce nuovi approcci per l’Inibizione del processi dell’ eterogenesi..

Ai fini della presente invenzione, la migrazione del miociti e' stata studiata in cellule muscolari lisce di aorta di ratto in presenza d1 fibrinogeno come fattore chemlotattlco, mentre per gli studi sulla loro proliferazione sono state usate cellule di ratto e umane. Per la valutazione della crescita miocitica si e' fatto ricorso al conteggio delle cellule e all'Incorporamento di <3>H-t1m1d1na.

La metodologia e’ la seguente: si preparano colture di miociti dello strato intimo-mediale dell’aorta di ratti Sprague-Dawley maschi (200-250 g) e si crescono le cellule in monostratl a 37°C 1n atmosfera umida al 5% di CO2 in terreno M.E.M. di Eagle Integrato col 10* (v/v) di siero fetale di vitello, 100 U/mL di penicillina, 0,1 mg/mL d1 streptomicina, 20 mM di tampone trldna e soluzione all’1% (v/v) d1 aminoacidi non essenziali, cambiandolo ogni tre giorni. S1 utilizzano le cellule tra il 4° e il 10° iassaggio, controllandone la vitalità’ mediante esclusione con Trlpan blu. I miociti vengono Identificati in base al comportamento di crescita, alla morfologia e per mezzo di anticerpi monoclonall specifici per a-act1na, lMsoforma dell’actlna tipica del miociti (Biotech Research Laboratories - New Orleans - USA). I miociti vascolari umani (A 617 di arteria femorale umana), ottenuti dal prof. Gabbiani dell’Istituto di Patologia Generale, Università’ di Ginevra, sono coltivati nelle stesse condizioni. S1 seminano le cellule in densità’ diverse (ratto 2 x 105 e uomo 5 x 104) di miociti/piastra di Patri (35 mm) e si mettono in incubazione in terreno M.E.M. di Eagle Integrato col 10% di siero fetale di vitello. 24 ore p1u’ tardi s1 sostituisce il terreno con uno contenente lo 0,4% di siero fetale d1 vitello per bloccare la crescita cellulare, e si mettono le colture 1n Incubazione per 72 ore. A quel punto (tempo 0) si sostituisce il terreno con uno contenente 11 10% d1 siero fetale d1 vitello in presenza ed assenza d1 concentrazioni note del composti 1n esame e si prosegue l’Incubazione per altre 72 ore a 37°C. Al tempo 0, appena prima dell’aggiunta delle sostanze da saggiare, si preleva un campione per 11 conteggio delle cellule. La proliferazione cellulare viene valutata mediante conteggio delle cellule dopo tripsinizzazione del monostrati con un contatore Coulter modello ZM. I risultati sono riportati nella Tabella 1. La vitalità’ cellulare e’ stata misurata mediante esclusione con Trlpan blu, ed e’ risultata essere, alla concentrazione d1 farmaco Impiegata, superiore al 95%.

TABELLA 1

Inibizione della crescita del mlociti valutata con conteggio cellulare

(*) = ottenuti dalla Charles River, Calco (Como) - Italia La 1ercan1d1p1na ed 1 suoi enantlomerl riducono la proliferazione dei miocitl d1 ratto e umani 1n misura proporzionale alla concentrazione, come risulta dalla Tabella 1, e dimostrano praticamente la stessa potenza delle 1,4-diidropiridine di riferimento esaminate. Va sottolineato che la Iercanidipina (ed i suoi inantlomerl) si dimostra attiva sulle cellule di tutte le specie analizzate, in particolare su quelle umane.

In un’altra serie di esperimenti, si e’ ottenuta la sincronizzazione del miocitl con l'interfase G0/Q1 del ciclo cellulare mediante Incubazione di colture a crescita logaritmica (= 3 x 10<5 >cellule / piastra) per 96-120 ore 1n un terreno contenente lo 0,4% di siero fetale di vitello. Le cellule quiescenti sono state incubate per 20 ore 1n terreno fresco col 10% d1 siero fetale di vitello 1n presenza del farmaci 1n esame, valutando quindi la proliterazione cellulare mediante Incorporamento nucleare di <3>H-timidina, che e’ stata Incubata con le cellule (1 pCi/mL terreno) per 2 ore. La radioattivita’ e' stata valutata con cocktail per scintillazione F1lter-Count.

I risultati sono riportati nella Figura 1, e confermano l’elevata potenza della Iercan1d1p1na e del suoi enantlomerl nell’1n1b1re la crescita cellulare.

La migrazione del miocitl di ratto e’ stata esaminata usando una microcamera per chemiotassi da 48 pozzetti (Neuro-Probe, USA). S1 sospendono del miocitl appena tripsinizzati in un terreno integrato con il 5% di siero fetale di vitello (terreno sperimentale). I pozzetti Inferiori, contenenti 27 μl di terreno sperimentale comprendente fibrinogeno (600 μl/mL) come agente chemiotattico, vengono coperti con un filtro d1 policarbonato privo di polivinilpirrolidone (dimensione del pori 8 μΜ). Si mettono quindi nello scomparto superiore assieme al composti in esame 50 μl della sospensione cellulare (1 x 10<6 >cellule/mL) e si lascia il tutto In Incubazione per 5 ore a 37°C in atmosfera al 95% di aria e 5X di CO2. Dopo l’Incubazione si tolgono i filtri dalla camera, si raschiano dalla superficie superiore le cellule non migrate e si lavano i filtri tre volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato, S1 colorano i filtri con D1ff-Quick (Merz-Dade AG, Svizzera) e s1 determina al microscopio il numero del miociti per campo di alta risoluzione che sono migrati alla superficie Inferiore del filtri. S1 valutano sei campi ad alta risoluzione (100x) per campione, mediando i risultati.

I risultati sono riportati nella Figura 2 e dimostrano la capacita’ della lercanidipina e del suol enantiomeri di Interferire con la migrazione del miociti arteriosi. Tutti i composti esaminati sono in grado di Inibire la migrazione miocitica in misura dose-dipendente, con l’enantiomero (R) che dimostra l’effetto più’ pronunciato.

Effetti sul metabolismo del colesterolo nel macrofagi peritoneali di topo

L’ateroma contiene due principali tipi di cellule: i macrofagi e le cellule muscolari lisce. I primi derivano dal monoc tl circolanti e sono le principali cellule cariche di lipidi riscontrabili nella lesione. Il meccanismo attraverso il quale accumulano colesterolo lpoprotelco e si sviluppano in cellule schiumose dipende soprattutto da processi mediati dal recettori, che Interessano i cosiddetti “recettori scavenger" che sono in grado di riconoscere le LDL che hanno subito modificazioni chimiche e biologiche, quali le LDL acetilate (AcLDL) e le LDL ossidate. Al contrario del recettore delle LDL, ii recettore scavenger non e’ soggetto alla regolazione di feedback, col risultato di un massiccio accumulo di colesterolo nelle cellule. Il colesterolo si accumula nel macrofagi in forma esterificata mediante un processo che Interessa l'enzima acil-coenzima A-colesterolo adltransferasl (ACAT) che catalizza l’esterlficazlone del colesterolo nel citoplasma. Solo ii colesterolo Ubero può’ essere eliminato dal macrofagi.

L'esterificazione del colesterolo Indotta dalle AcLDL e’ stata studiata nei macrofagi peritoneali di topo nel modo seguente: si ricavano i macrofagi peritoneali di topo (Balb/c Charles River, Calco, Italia) mediante lavaggio peritoneale tre giorni dopo l’Iniezione intraperitoneale di tloglicolato. Si mettono le cellule (2-3 x i0<6>) in pozzetti di 35 mm con terreno M.E.M. di Dulbecco contenente ii i0% di siero fetale bovino. Dopo 3 ore, si lavano le piastre per eliminare le cellule staccate e si mantengono in terreno M.E.M.dl Dulbecco più’ ii i0% di siero fetale bovino per 24 ore prima dell’uso. Dopo la coltura in piastre delle cellule, si eseguono gli esperimenti a 37°C in terreno M.E.M. di Dulbecco contenente lo 0,2% di albumina sierica bovina sostanzialmente priva di acidi grassi piu’ le addizioni Indicate. Le LDL umane (d = i,0i9-i,063 g/mL) si isolano dal plasma di volontari sani mediante ultracentrlfugazlone sequenziale (Beckman L5-50, Palo Alto, California). Par l'acetilezione si diallzzano le LDL contro NaCl 0,i5M, pH 7,4, diluito con un pari volume di sodio acetato saturo e trattato con anidride acetica. Per le AcLDL I'<28>, si marcano le Hpoprotelne con Ioduro sodico I<128 >desaiinato per filtrazione su gel in Sephadex G-25 ed elulto con soluzione fisiologica tamponata con fosfato. L’attività’ specifica e’ di i00-200 cpm/ng di proteina. La radioattivita’ non precipitata dell’acido trlcloroacetlco e’ Inferiore al 2% del totale. Tutte le Hpoprotelne sono sterilizzate per filtrazione. Si mettono le cellule in Incubazione per 24 ore con i composti in esame e, dopo la sostituzione del terreno con uno Identico, si prosegue l’Incubazione per altre 24 ore. Durante questa seconda Incubazione si aggiungono le AcLDL inarcate con I'<25 >(50 pg/mL). L’esterificazione del colesterolo si misura dopo l’aggiunta di addo oleico i-<,4>C (campione di 0,68 mCi) in

complesso con albumina sierica bovina durante le ultime i o 2 ore di Incubazione e la successiva determinazione della radioattivita’ associata agli esteri del colesterolo cellulari. Se del caso, si arricchiscono le cellule con colesterolo Incubando per 24 ore con 50 pg/mL di AcLDL prima dell’aggiunta del farmaco e delle determinazioni sperimentaii.

La Iercanidipina ed i suol enantlomerl si dimostrano in grado di Inibire, in misura proporzionale alla concentrazione, fino al 90X della formazione di colesterolo esterificato Indotta dalle AcLDL nel macrofagi peritoneali di topo (in altre parole l’effetto esterificante dell’enzima ACAT). I valori di IC50 relativi alla Iercanidipina e agli enantlomerl variano da 8 a i5 μΜ, come si nota nella Figura 3, con i’enantlomero (R) che e’ il composto piu’ attivo.

Un’altra serie di esperimenti e’ stata condotta per valutare l’effetto della lercanldlpina sull’esterificazione del colesterolo nel macrofagi carichi di esteri di colesterolo prima dell’aggiunta del composto, condizione che e’ uguale a quella delle cellule schiumose. Le cellule sono caricate di esteri del colesterolo mediante esposizione per 24 ore a un terreno contenente 50 pg/mL di acetii-LDL. L’Inibizione di ACAT e’ stata determinata come descritto in precedenza.

I risultati, Figura 4, Indicano che la lercanldlpina Inibisce i'esterificazione del colesterolo fino al 70% in misura dipendente dalla concentrazione con un valore di IC50 di circa 7 μΜ. L’enantiomero (R) della lercanldlpina si dimostra leggermente piu’ potente del racemo e la (S)-lercanidipina risulta la meno potente tra 1 composti esaminati.

Infine, e’ stato dimostrato che la lercanldlpina e i suoi

enantiomerl a 5 pM non riducono la capacita’ dei macrofagi di

Idrolizzare ii colesterolo esterificato depositato nel citoplasma.

Questi esperimenti sono stati eseguiti Incubando le cellule precarlcate con colesterolo <3>H in presenza dello specifico Inibitore dell’ACAT, S-58035 [C.A. Ross et al., J. Biol. Chem. 259 (2), 815-819 (1984)].

II blocco della riesterificazione Intracellulare del colesterolo consente di valutare la capacita’ delle cellule di Idrolizzare gli esteri del colesterolo accumulato. L’aggiunta della lercanldlpina e del suol enantiomerl non Influenza l'attività’ Idrolitica cellulare come documentano i valori di radioattivita’ della frazione di colesterolo esterificato.

Per studi che richiedono la quantizzazlone dell’Idrolisi degli esteri del colesterolo nelle gocce lipidiche citoplasmatiche, le celle sono caricate con esteri del colesterolo per esposizione di 24 ore a un mezzo contenente 50 ug/mL di acetil-LDL.

L’ [i,2-<3>H]colesterolo e’ incluso in tutti i terreni di coltura in concentrazione di 0,5 pCi/mL. Dopo un periodo di Incubazione di 24 ore, durante il quale il colesterolo radiomarcato viene incorporato ed esterificato, si lavano i monostrati cellulari e si mettono in Incubazione per altre 24 ore in terreno contenente lo 0,i% di albumina sierica bovina per consentire l’equilibratura alla stessa attività’ specifica del depositi Intracellulari di colesterolo marcato. Per quantificare l’idrolisi degli esteri del colesterolo, si mettono in incubazione le cellule cariche per un massimo di 24 ore in terreno M.E.M. di Dulbecco contenente i principi attivi, lo 0,1% di siero di albumina bovino ed ii composto 3-(decndimetilsilil)-N-[2-(4-metilfenil)-i-feniletil]propanamide (S-58035), un Inibitore deli’ACAT preparato secondo quanto descritto nel brevetto EP 25,569. L’inibizione deli’acil-coenzima A-colesterolo aciltransferasl Impedisce la

riesterificazione del colesterolo Ubero generato dall’Idrolisi degli esteri dello stesso e consente cosi’ la valutazione dell’attività’ dell’idrolasi. L’Idrolisi degli esteri del colesterolo e’ quantificata determinando la riduzione degli esteri del colesterolo radiomarcato (E.H. Harrlson et al., J. L1p1d. Res. 3i., 2i87 (i990)). Dopo le suddette Incubazioni, si lavano le cellule con soluzione fisiologica tamponata con fosfato e si estraggono con esano:Isopropanolo (3:2 v/v). I terreni sono estratti con cloroformioimetanolo (2:i v/v). Dopo i’eliminazione del solvente, si separano ii colesterolo Ubero e quello esterificato mediante TLC (iscottano:etere diatilico:acido acetico, 75:25:2 in volume).

S1 determina il volume di colesterolo o la radioattivita’ delle macchie rispettivamente con un metodo enzimatico (Boehrlnger Mannheim, Germania) [F. Bernini et al., Atheroscierosls i04, i9 (i993)] e mediante conteggio per scintillazione liquida (Llpoluma Lumac, Landgraf, Olanda). I risultati sono riportati nella Tabella 2.

TABELLA 2

Effetto della Iercanidipina (LE) e del suol enantlomerl sull'Idrolisi degli esteri del colesterolo nel macrofagi

Effetti sull'ossidazione delle LDL

I risultati sperimentali fanno supporre un ruolo chiave della modificazione ossidativa delle LDL negli stadi iniziali dell'aterosclerosi nell’uomo. I dati disponibili Inducono a credere che le LDL subiscano alterazioni ossldative in vivo e che le LDL modificate per ossidazione (Ox-LDL) possano Indurre i'eterogenesi attraverso una serie di meccanismi quali l’aumento dell’assorbimento nei macrofagi tessutali (attraverso ii recettore scavenger), che provoca l’accumulo del lipidi e l’attività’ chemlotattlca dei monodtl, e la citotossldta’ per le cellule endotellall della parete arteriosa.

La capacita’ antiossidante della Iercanidipina e’ stata valutata mediante Incubazione delle LDL con 20 pM di Cu<++ >in presenza e assenza di diverse concentrazioni dei composti in esame (0,0i pM - 50 pM).

L’ossidazione delle LDL e’ stata seguita mediante monitoraggio della formazione di dlene coniugato a 234 nm. Le condizioni sperimentali sono le seguenti. Si Isolano le LDL (d = i,0i9-i,063) dal plasma umano raggruppatomediante ultracentrifugazione sequenziale a 4'C e 40.000 rpm in un rotore 50Ti, usando una ultracentrifuga L5-50 (Beckman, Palo Alto, CA). Si dlallzzano quindi contro NaCl 0,i5M contenente lo 0,0i% di acido etilendiaminotetraacetico e avente pH 7,4, si sterilizzano per filtrazione attraverso filtro millipore da 0,2 pM e si conservano a 4<*>C in atmosfera di azoto, al buio, fino al momento dell’uso (massimo 3 settimane). Prima dell’uso si dlallzzano contro soluzione fisiologica tamponata con fosfato priva di acido etilendiaminotetraacetico, pH 7.4, in colonne Sephadex G-25 (PD-i0, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svezia) e quindi si filtrano attraverso un filtro sterile da 0,22 pM. Si ossidano le LDL in soluzione fisiologica tamponata con fosfato (50 pg di iipoproteina/mL) mediante Incubazione a 25‘C con 20 pM di CuSO4 per 3 ore. Si prepara la soluzione di Iercanidipina come soluzionemadre 10<-2>M in metanolo da addizionare come soluzione etanollca (massimo i% v/v) prima dell’aggiunta del rame.

Per valutare l’effetto della Iercanidipina sull’ossidazione delle LDL si provvede al monitoraggio continuo della formazione di dlene coniugato e alla registrazione dell’aumento dell’estinzione a 234 nm a intervalli di 5 minuti per un periodo di tre ore contro un bianco di soluzione fisiologica tamponata con fosfato, usando un spettrofotometro UV (Beckman DU 640) a lettura continua e un alimentatore automatico da 6 celle.

Si calcola il tempo di latenza dell’inizio dell'ossidazione come Intercetta tra la retta della pendenza massima della fase di propagazione e la base, in cui l’estinzione e’ quella del tempo 0. I risultati sono riportati nella Tabella 3.

TABELLA 3

Effetto sul tempo di latenza dell’ossidazione delle LDL

* P < 0.05 ** P < 0,0i Come si nota dalla Tabella 3, i0 μΜ di lercanidipina racemo raddoppiano la fase di latenza dell’ossidazione delle LDL: l’effetto del composto e’ correlato alla concentrazione. L’attività’ degli enantlomeri e’ comparabile a quella del racemo.

La proprietà’ antiossidante della lercanidipina e dei suol enantlomeri e’ stata Investigata anche sull’ossidazione cellula-mediata. Questo e’ stato valutato Incubando LDL Ubere da acido etllendiamlnotetracetlco in condizioni sterili con 5 μΜ di Cu<H >(i00 μg di Apo B/mL) in presenza di cellule ATCC TIB 67 J774A.i o alternativamente di cellule EAhy-926. L’ossidazione viene bloccata dopo 22 ore di Incubazione aggiungendo al terreno idrossitoluene butllato (concentrazione finale 40 μΜ) disciolto in etanolo. Il grado di perossldazlone lipidica e’ valutato determinando l’Inibizione percentuale del prodotti di decomposizione aldeldlca mediante ii test dell’acido tiobarbiturico (A.N. Henna et al., Blochem. Pharmacol. 45, 753 (i993)).

In breve, a 0,250 mL di campione Incubato si aggiungono 0,750 mL di acido tricloroacetlco (0,20% p/v) seguiti da 0,750 mL di acido tiobarbiturico (0,67% p/v). Si riscaldano i campioni a 100°C per 20 minuti e si provvede poi al raffreddamento e alla centrifugazione. S1 calcolano gli equivalenti di malondlaldeide usando come standard i,i,3,3-tetrametossipropano.

I risultati di cui alla Figura 5, ottenuti con cellule J774, dimostrano che la Iercanidipina e i suol enantlomerl sono efficaci nel ridurre l’ossidazione delle LDL. I risultati della Figura 6, ottenuti con cellule EAhy-926 che condividono molte delle proprietà’ delle cellule endotellall, dimostrano che la Iercanidipina riduce l’ossidazione delle LDL in un range di 10-100 μΜ.

Nel suddetti esperimenti di ossidazione cellulo-mediata gli effetti della lercanldlpina sono stati studiati dopo 22 ore di incubazione. Al fine di studiare la ragione della minore potenza dimostrata dalla lercanidiplna in queste condizioni, e’ stato controllato ii grado di perossldazlone lipidica in presenza di 30 μΗ di lercanidiplna a diversi Intervalli prelevando campioni del terreno di incubazione e misurando i composti di ossidazione come sopra.

I risultati sono riportati nella Figura 7, e si può’ chiaramente vedere che 30 pM di Iercanidipina esercitano un'Inibizione molto alta sull’ossidazione lipidica dopo i0 ore di Incubazione. Tale risultato conferma l'opinione che la lercanidiplna, al tempo giusto, può' essere altrettanto potente sull’ossidazione cellulo-medlata delle LDL di quanto lo e' sull'ossidazione mediata da Cu++.

La lercanldlpina si dimostra la piu’ potente 1,4-diidropiridine controllata finora con questi saggi, con una potenza di un ordine di grandezza superiore a quella della Iacidipina, la piu’ potente, in questo quadro sperimentale, tra i composti i,4-diidropiridinici precedentemente noti.

Effetti antiiportensivi nel cane iperteso Gii effetti antilpertenslvl della somministrazione orale della lercanldlpina e del suol enantlomerl e’ valutata nel cane Iperteso renale.

Sono stati utilizzati cani maschi Beagle del peso di i2-i3 Kg e di 1-3 anni di età provenienti dall'allevamento Nossan (Italia).

L’ipertensione cronica e’ Indotta per costrizione bilaterale dell’arteria renale secondo ii metodo di Goldblatt.

Nel corso di due differenti Interventi chirurgici, effettuati ad un mese di distanza uno dall’altro, entrambe le arterie renali sono state costrette sotto anestesia da barbiturici (35 mg/kg i.v.) con anelli d’argento rlducendo ii lume di circa ii 60-70%. Dopo due mesi

dall’ultimo Intervento, si e’ Instaurata una Ipertensione renale sperimentale e gli animali sono pronti per l’Impianto di un catetere. In anestesia da sodio pentobarbltal (35 mg/kg i.v.)> in condizioni sterili, i cani sono cateterizzati inserendo una cannula (PE 200 Clay Adams) nell’aorta ascendente attraverso l’arteria carotide comune destra. Il catetere e' esteriorizzato sotto cute sul retro del collo, riempito con soluzione salina eparinizzata e lavato giornalmente per prevenire ii coagulo. Dopo una settimana di convalescenza dall’Intervento, gli animali sono collegati a un trasduttore di pressione HP i290P collegato ad un amplificatore HP8805B di un poligrafo multicanale Hewlett Packard HP 7700, al fine di monltorare la pressione arteriosa. La frequenza cardiaca e’ calcolata manualmente dalla traccia di pressione.

Tutti gli animali sono stati alternativamente trattati con placebo, Iercan1dipina e i suol enantlomerl (R)- ed (S)-.

I composti sono somministrati per via orale mediante sonda gastrica asettica (Pores Serlat - Francia). I composti sono sospesi in Methocel A4C acquoso (0.5%) contenente antlschluma M10 (i0%). Il volume somministrato e’ i mL/kg. Il mezzo sospendente e’ usato come placebo. La pressione arteriosa viene continuamente registrata nel corso dell’esperimento iniziando 30 min. prima e terminando 8 ore dopo la somministrazione.

La Iercanidipina e la (S)-iercanidipina Inducono un abbassamento della pressione arteriosa dose-correlato. I valori di DE25 (dose che Induce ii 25% di abbassamento nella pressione dlastollca al picco di effetto) sono calcolati per regressione lineare e riassunti nella seguente Tabella 4.

TABELLA 4

L.F. limiti ficiuciali

La (S)-lercanidipina mostra l’attività antiiportensiva piu’ potente, dimostrando di essere due volte più’ efficace del racemo, mentre i’enantlomero (R) fino a 30 mg/kg non Influenza la pressione sanguigna (diminuzione della DBP Inferiore al i0%).

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di un composto di formula generale I dove Ph rappresenta un gruppo fenilico, Ar rappresenta un gruppo 2-nitrofenilico, 3-nitrofenilico, 2,3-diclorofenilico o benzofurazan-4-ilico, A rappresenta un gruppo alchilenlco a catena ramificata con 3-6 atomi di carbonio, R rappresenta un gruppo aìchHlco a catena lineare o ramificata con i-6 atomi di carbonio, alternativamente monosostltulto da un gruppo alcossl con i-6 atomi di carbonio, R1 rappresenta un atomo di Idrogeno, un gruppo idrossi o un gruppo alchillco con 1-4 atomi di carbonio, e R2 rappresenta un atomo di Idrogeno o un gruppo metilico, o uno stereoIsomero, un sale, idrato o solvato di tale composto, per la preparazione di farmaci per la prevenzione, l’arresto e la regressione della degenerazione ateroseierotica delle pareti arteriose del paziente.
2. 2. Uso di lercanldiplna, (S)-lercanidipina, (R)-iercanidipina o del loro sali, Idrati o solvati per la preparazione di farmaci per la prevenzione, l’arresto e la regressione della degenerazione aterosclerotica delle pareti arteriose del paziente.
3. 3. Uso secondo le rivendicazioni i e 2 per la preparazione di farmaci contenenti un veicolo farmaceuticamente accettabile.
4. 4. Uso secondo le rivendicazioni precedenti per la preparazione di un medicamento in forma adatta alla somministrazione orale.
5. 5. Uso secondo la rivendicazione 4 per la preparazione di un medicamento contenente dal 5 al 70% del composto.
6. 6. Uso secondo le rivendicazioni 4 o 5 per la preparazione di un medicamento contenente da i a 200 mg del composto per singola dose.
7. 7. Uso secondo le rivendicazioni da i a 3 per la preparazione di un medicamento in forma adatta alla somministrazione parenterale.
8. 8. Uso secondo la rivendicazione 7 per la preparazione di un medicamento contenente dallo 0,5 al 30% del composto.
9. 9. Uso secondo le rivendicazioni 7 ed 8 per la preparazione di un medicamento contenente da 0,5 a i00 mg di composto per singola dose.