HUT67711A

HUT67711A - Tetrahydropyrimidine derivatives and pharmaceutical compositions comprising them

Info

Publication number: HUT67711A
Application number: HU9300251A
Authority: HU
Inventors: Aviva Lepidot; Livia Inbar; Yosef Aloni; Edna Ben-Asher
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1992-01-30
Filing date: 1993-01-29
Publication date: 1995-04-28
Also published as: EP0845539A1; ZA93652B; IL100810A0; US5789414A; ATE169339T1; EP0553884A1; IL100810A; AU3213993A; NZ245797A; CN1080172A; DE69320075T2; JPH0717864A; HU9300251D0; DE69320075D1; EP0553884B1; CA2088390A1

Description

A találmány tárgya tisztított tetrahidropirimidinszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények. Részletesebben a találmány olyan tetrahidropirimidin-származékokra vonatkozik, melyek képesek a DNS-t megvédeni a DNS—kötő szerek, kémiai karcinogének és mutagének károsító hatásától és a sugárzástól.

Az aktinomicinek, melyek a rák-kemoterápiában alkalmazott antitumor—antibiotikumok egyik osztályát képezik, megakadályozzák a sejt replikációját oly módon, hogy beékelődnek az egy síkban •fekvő DNS-bázispárok közé, és így meggátolják a kettős hélix lecsavarodását, valamint gátolják a transzkripciót, vagyis a DNS-függő RNS-szintézist, mind in vivő, mind in vitro körülmények között. Feltételezik, hogy az in vivő vagy in vitro transzkripció gátlása úgy történik, hogy a kémiai szer a DNS-hez kötődik és gátolja az RNS polimeráz működését az elongáció alatt. A DNS-be beékelődő vegyületekről, úgymint az aktinc-micin D-ről és a daunomicinről kimutatták hogy befolyásolják a

DNS másodlagos szerkezetét.

Az aktinomicin

D (a továbbiakban

ActD), amelyet dáktinomicinnek is hívnak, és az adriamicin jól ismert antitumor—antibiotikumok. Azonban nagyfokú toxicitásuk megakadályozza általános alkalmazásukat a rák-kemoterápiában. Felettébb kívána tos lenne az ActD és más antitumor- és citotoxikus antibiotikumok toxicitásának lecsökkentése, hogy így hatékonyan lehessen alkalmazni őket az antitumor—terápiában.

A szabadalmi bejelentés feltalálói két, korábban nem ismert metabolikus tetrahidropirimidin-származékot találtak, úgymint a 2-metil-4-karboxi-5-hidroxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidint (a továbbiakban THP(A)-val jelölve) és a 2-metil-4-karboxit, • · • ·4 •4··· •4

3,4,5,6-tetrahidropirimidint (a továbbiakban THP(B)), melyek egy ActD-termelő gram-pozitív aktinomicetában, a Streptomyces parvulusban halmozódnak fel intracellulárisan. A fent említett származékokat in vitro és in vivő

NMR-visgálatokkai azonosították, de nem izolálták és tisztították őket [Inbar, és A. Lapidot,

J. Bacteriol. 170, 4055 (1988a); Inbar, L. és

Lapidot,

J. Bioi. Chem. 263, 16014-16022 (1988b); Inbar, L. és

A.

Lapidot,

J. Bacteriol. 173,

7790 (1991)]

THP(B)—t tiszta formában már korábban kivonták egy extrém halofil baktérium, az Ectothiorhodospira halochloris tenyészetéből. A vegyületet ectoin-nak nevezték el, és ozmoregulációs funkciót tulajdonitottak neki [E. A. Galinski, Η. P.

rfeiffer és H. G. Truper, Eur. J. Biochem. 149, 135 (1985)]. A

THP(B).CH₅0H kristályokat vízmentes metanollal kristályosftották ki CW. Scuh., H. Puff, E. A. Galinski és H

G.

Truper, Z. Naturforsch. 40c, 780-784 (1985)]. Az ectoint, amely egy ciklusos aminosav, később többféle, extrém sótartalmú élőhe lyeken előforduló sókedvelő és sótűrő eubaktériumban is elongata, Deleya halophila.

Halomonas haemophila, Bacterium Ba , Vibrio costicola és Brevibacterium lineus baktóriumokban

Ezeknek. a baktóriumoknak a természetes környezete a sós vagy szódás tavak, tengeri sótermelő telepek, tengerparti lagúnák vagy tengervíz, mely helyeket a legtöbb halofil élesztő, alga és gomba az ozmotikus egyensúly fenntartása érdekében szervetlen ionokat, úgymint K⁺-t, Na⁺-t és Cl~-t valamint alacsony molekulatömegű »

semleges nem-ionos szerves molekulákat halmoz fel.

Az emlí-4tett szerves molekulák nagyobb osztályait következő csoportok képviselik;

poliolok, cukrok, néhány aminosav, betainek és ectoinek. Ezeket az oldott anyagokat kompatibilis oldott anyagoknak nevezik, mert kiegyenlítik az ozmotikus nyomást és, a definíció szerint, kompatibilisek a sej tanyag cserével

A kompatibilis oldott anyagok, ideértve az ectoint is, az ozmotikus funkció mellett védő hatást fejtenek ki az enzimekre, például melegítéssel, fagyasztással és szemben

A. Wolfahrt, J. Ssverin és E.

A. Balinski

Mi crobiol,

136, 705-712 (1990); R. Regev,

I. Peri, H.

Gilboa és

Avi-Dor,

Arch. Biochim

Jicphys. 278,

106-112 (1990); P.

Peters, E. A

Balinski és H.

3. Truper, FEMS Microbiology Letters and

157-162

Applied

Malaca szabadéi mi kémiai (1990); E. A

Balinski és K. Lippert Beneral

Aspects of Halofilic Microorganisms erk.), Plenum Fre szintézisét, és (Rodriquez351—358 (1991)1.

publikált hozták az kémiai j apán ectoin ágens, mezőgazdasági szerves elektronikus anyagok köztes termékeként alkalmazható. Egyetlen korábbi szakirodalomból sem került nyilvánosságra a THP(A) és a THP(B) gyógyászati hatása és különösen nem a DNS-károsodás elleni védőhatása.

Feltételezhető, hogy az ActD—termelő baktériumok és a halofil eubaktériumok önvédelmi stratégiája hasonló. Nagyon sok tanulmány foglalkozott azzal a kérdéssel, hogy az antibiotikumtermelő baktériumok hogyan kerülik el az önpusztítást. Ismeretes, hogy azokban a különböző szervezetekben, amelyek endogén antibio·♦· · • * * · • ·»· ···· • · ·« · *

tikumot termelnek, ezen antibiotikumok célhelyei rezisztensek, bár sok esetben e rezisztencia alapját még nem teljesen tisztázták. Eddig csak az antibiotikum célhelyeinek néhány önmódosító mechanizmusát jellemezték. Azokban az esetekben, amelyeknél az antibiotikum-szintézis a protein-szintézis része, az önvédelem a riboszómális RNS-célhely specifikus metilációjától függ. Bár az antibiotikumok azon képességét, hogy a cél-DNS-hez kötődjék, eddig még nem sikerült meggátolni.

Az ActD hatásos inhibitora a DNS-dependens RNS szintézisnek. Mivel az S. parvulus normálisan a fejlődése során ActD-t termel, RNS-szintézis mecy végbe az antibiotikum készítéssel egyidőben. Ez csak úgy lehetséges, ha a sejt a transzkripciós rendszere ActD-vel szemben rezisztens.

Hasonlóan, a halofil mikroorganizmusoknál a sejtek lényeges tulajdonsága a transzkripciós rendszer magas elektrolitkoncentrációvá 1 szembeni rezisztenciája. Mivel a DNS fiziológiás pH-η egy igen erősen töltött polianion, kationok veszik körül, amelyek a proteinek DNS-hez történő kötődésekor kiszorulnak, a DNS felszínéről. Az ozmoreguláció-kutatás egy megoldandó feladata annak a kiderítése, hogy in vivő a halofil baktériumokban hogyan pufferolt a DNS-protein kölcsönhatás a sejt ionkoncentrációiában végbemenő fluktuáció ellentétes hatásával szemben. Szükségszerűi, hogy a halofil baktériumok valamilyen túlélési stratégiát alkalmazzanak, hogy elkerüljék a makromolekulák magas intracelluláris Na-ion-koncentrációnál bekövetkező szerkezeti rendellenességeit. A Streptomyces genus különböző antibiotikum-termelő vonalait izolálták talajból, miután a talaj sótartalmát lokálisan módosították. Feltételezhető, hogy ezekben a mikroorganizmusokban az ···· ·♦·« * *>

antibiotikus és az ozmotikus stresszre adott válasz szabályozásá ban hasonló mechanizmusok, működnek.

Az antibiotikum—termelő organizmusok önvédelmi mechanizmusának tisztázásánál NMR—technikák alkalmazásával intracellulá— ris változásokat figyeltek meg. A S. parvulus ActD kontrolimechanizmusának tanulmányozásakor azonosították a THP(A)-t és a THP(B)-t, és Úgy találták, hogy azok intracellulárisan halmozódnak fel [Inbar, L. és A. Lapidot (1988a)]. Jelöléses kísérletekkel megállapították, hogy a THP-k nem prekurzorai az ActD-nek [Inbar, L. és A. Lapidot (1988b)]. A találmány szerint izolált és tisztított THP(A)-ról és THP(B)-ről NMR-rel és röntgen-krissztallográfiával kimutattuk, hogy a THP-k fél-szék konformációjú zwitterionos molekulát képeznek (1. ábra).

A találmány szerint úgy találtuk, hogy a

THP(B) nemcsak a S. parvulusban van jelen, hanem

ActD-termelő mikroorganizmusokban is, úgymint

THP(A) és a közeli rokon

Streptomyces azt a

C NMR-kísérletekkel kimutattuk.

Ezek a ísérletek világosan feltárták, hogy a THP(A) és a THP(B) ezekben a sejtekben az ActD találása néhány ActD-termelő Streptomycetedben, az ActD szintézis alatti viszonylag magas intracelluláris koncentrációjuk, és az , hogy szintézisük kezdetének időpontja megegyezik az ActD szintézisének kezdetével, mind mind azt jelzik, hogy szerepet játszhatnak az ActD-termelő organizmusok önvédelmi mechanizmusában. Továbbá úgy találtuk, hogy egy in vitro transzkripciós rendszert alkalmazva [T. R. Kadesch és M. J. Chamberlin, J. Bioi. Chem. 257, 5286 (1982)], melyben az RNS polimeráz Il-t ·*·«

-Ίteljesen gátoltuk ActD—vei, a THP(A) és a THP(B) együttes hatására részlegesen helyreállt az RNS polimeráz aktivitása.

A találmány szerint úgy találtuk, hogy a THP(A) önmagában vagy a THP(A) és a THP(B) kombinálva képes megvédeni a DNS-t a restrikciós enzimek emésztésétől. Továbbá azt is lehetővé teszik, hogy az E. coli hatékonyan növekedjen magas sókoncentráció mellett vagy adriamicin jelenlétében, melyek egyébként megakadályoznák az E. coli szaporodását. Továbbá a THP(A) és a THP(B) funkció szinergetikus a. DNS-ActD komplex kialakulásának meggátlásában. A THP(A)-nak önmagában vagy egy THP(A)-t és THP(B)-t tartalmazó keveréknek van egy közvetlen hatása is az ActD jelenlétében történő transzkripcióra, amelyet egy in vivő transzk.ri pciós assay-ben mutatunk be.

A találmány tárgya THP(A)-t és/vagy THP(B)-t és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyszerkészítmények. Ezek a készítmények sajátosan megvédik a DNS-t a. nem-tumoros szövetekben a DNS-kötő szerek károsításától, úgymint a toxikus antitumor—szerektől vagy kémiai karcinegének tői, mutagénektől vagy sugárzástól, úgymint az UV-sugárzástól.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények aktív alkotórészként a 2-metil-4-karboxi-5-hidroxi-3,4 ₅ 5,6-tetrahidropirimidin ETHP(A)j, egy sója, 5-étere vagy 5-észtere és/vagy a 2— metil—4-karboxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidin ETHP(B)2 vagy egy sója közül kiválasztott tetrahidropirimidin-származékot és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaznak.

A találmány további tárgya THP(A) lényegében tiszta formában és kristályos formában, valamint a THP(B).2H_z0 kristályos forma. Ügy találtuk, hogy a só-állapotú THP(A) és

THP(B) kon.: ·*·χ χ -··.

: » * · ·* * — : ’·:· : .

formációja azonos az oldatban felvett konformációjukkal.

A találmány további tárgya egy olyan eljárás, mellyel THP(A) és THP(B) nyerhető lényegében tiszta formában. A THP(A) és a THP(B) racemát alakban vagy optikailag aktív formában létezik, úgy találtuk, hogy a találmány szerint tisztított természetes terméknek S formája van és biológiailag aktív.

A találmány további tárgyait és előnyeit a találmány leírásában mutatjuk be.

A THP(A) és a THP(B) szintetikus úton állítható elő vagy természetes forrásokból izolálható és tiszta formában szeparálható. Ilyen természetes források a Streptomyces fajok, például a S. parvulus, S. chrisomallus vagy a S. antibioticus és mutánsaik Act-termelő mikroorganizmusainak sejtkivonatai. A THP(B) izolálható és tisztítható sóstressz alatt álló sótűrő és sókedvelő baktériumokból, úgymint az Ectothiorhodospira nemzetség baktériumaiból, például az E. halc-chlorisból, E. halophilából és ezek mutánsaiból, vagy a Halomonadaceae család heterotróf halofil baktériumaiból. A THP(A) előállítható a Streptomyces fajok közül a talaj lakó mikroorganizmusokból, például a S. clavuligerusból< S. griseusból és ezek mutánsaiból kismértékű sóstressz mellett.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a THP(A)-t és a THP(B)-t ActD termelő Streptomyces törzsből izoláljuk és tisztítjuk egy, az alábbi lépéseket tartalmazó eljárással:

(a) az említett Streptomyces törzs tenyésztése megfelelő tenyésztő tápközegben (b) a sejtek összegyűjtése és sejtkivonat készítése a mosott sej tekből (c) a THP(A) és THP(B) tetrahidropirimidin származékok ···· *

elkülönítése a kísérő szénhidrátoktól, polioloktól, aminosavaktól, peptidektől és proteinektől néhány őszlopkromatográfiás szeperációs lépéssel (d) a két tetrahidropirimidin-származékot tartalmazó oldat ioncserés oszlop-kromatografálása, és (e) mindkét tetrahidropirimidin-származék eluálása különböző oldószerrel lényegében tiszta THP(A) és THP(B) nyerve.

A találmány szerint alkalmazott ActD-termelő Streptomyces törzs előnyösen a S. parvulus, pontosabban a S. parvulus ATTC 12434, mely az ATTC-nél szabadon hozzáférhető.

A sejtkivonatokat a szakirodalomból ismert eljárásokkal készítjük, például a mosott sejtpelletek vízbe történő szuszpendálásával és 100'C-on történő melegítésével vagy perklórsavas eljárással. Ezután a sejtextraktumokat ecetsavval elegyítjük, mielőtt a szeparációs eljárásoknak alávetnénk. Először a szénhidrátokat és a poliolokat távolítjuk el, például vízzel, azután az aminosavakat távolítjuk el anion-cserés kromatográfiával, és az intracelluláris peptid- és proteinszármazékokat Sephadex G25-tel. A (d) lépésben a THP(B) elválasztását a THP(A)-tól Dowex 53 W oszloppal (N'H^ forma) hajtjuk végre, és az (e) lépésben a THP(A)-t vízzel, a THP(B)-t 3M ammónium-hidroxiddal eluáljuk.

Egy másik előnyös megvalósítási módban a THP(A)-t egy talajból izolált Streptomyces törzs sejtextrakturnéból izoláljuk és tisztítjuk a fentebb leírtakhoz hasonlóan. Az eljárás a következő lépéseket tartalmazza:

(a) Az említett Streptomyces törzs tenyésztése egy alkalmas tenyésztő tápközegben 0,25-0,5 M NaCI-ben

-10«· ··♦

(b) a sejtek összegyűjtése és sejtkivonat készítése a mosott sej tekből (c) a THP(A) eltávolítása a kísérő szénhidrátoktól, aminosavaktól és proteinektől néhány oszlopkromatográfiás szeparációs lépéssel (d) a THP(A)-t tartalmazó oldat ioncserés oszlop-kromatografálása, és (e) a THP(A) eluálása vízzel és így lényegében tiszta THP(A) nyerése.

Talaj lakó Streptomyces törzsként a találmány szerint előnyösen alkalmazható a S. clavuligerus, pontosabban a S. clavuligerus NRRL 3595, amely az NNRL-nél szabadon hozzáférhető, és az S. griseus, pontosabban az S. griseus ATTC 10137, mely az ATCC-nél szerezhető be szabadon.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményekben a THP(A) és a THP(B) olyan szereves és szervetlen bázisokkal alkotott sóit alkalmazzuk, melyek fiziológiailag elfogadható sók. A THP(A) 5éterei így alacsonyabb szénatomszámú alkil-étereket és cukorrésszel alkotott étereket, például nukleotid-analógokat foglalnak magukban. Ezeket a szakirodalómban jól ismert eljárásokkal, megfelelő alkoholokkal történő reakciókkal állítjuk elő. A THP(A)

5-észterei olyan alacsony szénatomszámú alkanoil-észterekből állnak, melyeket alacsony szénatomszámú alkánsavval állítunk elő.

A TH’P(A) , THP(B) vagy ezek kombinációi a DNS-kötő szerekkel kezelt betegekben a nem-tumoros sejtek védelmére alkalmazható a DNS-kötő szer károsító hatásával szemben. DNS-kötő szer lehet bármely, a jelenlegi rák-kemoterápiában alkalmazott antitumor— antibiotikum, például daktinomicin (ActD), daunorubicin, doxorubicin (adriamicin), bleomicin, mitomicin és hasonlóak. Mivel ezek

az antitumor—antibiotikumok toxikusak a normál szövetre, a THP(A), THP(B) vagy a THP(A) és a THP(B) kombinációja lecsökkenti ezek toxikus hatását. Más antitumor—antibiotikumokat magas toxicitásuk miatt jelenleg nem alkalmaznak a rák-kemoterápiában. Az antraciklin- antibiotikumok, a cinerubin A és B toxicitása csökkenthető THP(A)-val, THP(B)—vei vagy THP(A)+THP(B)-vel, így lehetővé válik a jövőben ezek alkalmazása az antitumor—terápiábc<n .

A THP(A), THP(B) vagy ezek kombinációja a kémiai karcinogénekkel , mutagénekkel - beleértve a sugárzást - szemben is alkalmazható a DNS megvédésére.

A THP(A) és a THP(B) nem toxikus az emlősökre. Egereket kezelve 1, 10 és 100 mg/100g testtömeg dózisokkal nem tapasztaltunk toxikus hatást. A THP(A)-nak és a THP(B)-nek antibiotikus aktivitása nincs, ahogy azt néhány gram-pozitív és gram-negatív baktériumtényészette1 végrehajtott teszttel kimutattuk.

A THP(A)-ból vagy egy sójából, 5-éteréből vagy 5-észteréből és a THP(B)-ből vagy sójából gyógyszerkészítményt állítunk elő, az említett vegyületek és egy gyógyászatilag aktív hordozó összekeverésével. A készítményhez adalékok, úgymint stabilizálók stb. adhatók.

A találmány magában foglalja a gyógyszerek beadásának bármely alkalmas módját, de előnyös az egyszeri intravénás injekció és az intravénás infúzió.

Azokban a találmány szerinti gyógyszerkészítményekben, melyek a THP(A)-t és THP(B)-t is tartalmaznak, ezek egymáshoz viszonyított moláris aránya változtatható. Előnyösen a találmány szerinti gyógyászati kompozíció a THP(A)—t és a

THP(B)—t

ekvimoláris mennyiségben tartalmazza.

A csak THP(A)-t, csak THP(B)-t vagy ezek kombinációit tartalmazó gyógyászati készítményben a THP(A) és a THP(B) mennyisége változtatható a beteg állapotától, a betegség súlyosságától és a beadott antitumor—szer mennyiségétől függően. Az egyik megvalósítási módban a gyógyászati készítményt az antitumor—szerhez képest feleslegben adjuk be.

A találmány szerinti gyógyászati kompozíció beadható az antitumor-antibiotikum beadása előtt, vele együtt, előnyösen a beadás után. Hatékony mennyiségben csökkenti az antitumor—szer toxikus hatását.

példákhoz, melyekkel találmányunkat csak illusztrálni kívánjuk, a következő ábrák tartoznak ábra: A tisztított THP(B) (a) és a tisztított THP(A) (500-MHz)

NMR-spektrumát ábrázolja.

és sztereokémiái konfigurációját (S forma) ábrázolja ábra: A következő proton NMR-spektrumokat mutatjuk (a) egy ActD-d(AT3CAT) 0,6:1 arányú keveréke, (b) a fenti keverékhez THP(B)-t adva 0,1:1:33 arányban, (c) a (b) szereinti spektrumot

D_a0 f oszf át-pu.f fér sugárzás általi oldószer—szupressziót alkalmazva a késleltetés alatt

Ezekhez a kísérletekhez 4,0 mM ActD törzsoldatot és 100 mM THP(A) és THF(B) törzsoldatot használtunk foszfát-pufferben. Mindegyik ⁴H NMR-kísérlethez 1,3 mg d(ATGCAT)-t alkalmaztunk 0,45 ml foszfát-pufferben.

4. ábra: Az ActD-d(ATGCAT) keverék alap-aromás proton-13 régió spektrumait (503 MHz—nél) mutatja be különböző kémiai szer : DNS aránynál - amelyet az (a-e) görbéknél jelöltünk -, és az 0:30:30 moláris arányú d(ATGCAT), THP(A) és THP(B) keverék és az ActD spektrumát különböző kémiai szer:DNS aránynál, mely arányokat az (a’-e’J görbéknél tüntettünk fel. Az (a) és (a’) kinagyított spektrumát mutatjuk be (A) és (A’)-ként. A spektrumokat pH=7—nél kaptuk (mint 3. ábránál). Az ActD—d(ATGCAT) protonrezonanciáit a spektrumon jelöltük: adenozin (belső) H2 protonjait 8,03 és 8,00 ppm-nél, adenozin (terminális) H2 protonjait 7,86 ppm-nél és a guanozin H8 protonjait 7,70 és 7,63 ppm-nél. Az ActD~d(ATGCAT) kémiai eltolódás jelei azonosak az S. C. Brown, K. Mullis, C. Levenson, R. H. Shafer [Biochemistry 23, 403 (1984)3 által leírtakkal.

5. ábra: Egy olyan radicgrammot ábrázol, melyen bemutatjuk az RNS polimeráz II transzkripciójának gátlását ActD-vel és az aktivitás helyreállítását THF(A) és THP(B) hozzáadáséval. Mindegyik sáv összetevőit a 6. táblázatban ismertetjük. A sávok relatív intenzitását a 6. táblázat szerint adtuk meg. A DNS koncentrációja 71,4 p.M volt.

6. ábra: Bemutatjuk az adriamicin DNS-szintézis gátlásának visszafordulását THP-k hatására. Sematikusan ábrázoljuk a beépült L³H3 timidint az adriamicin függvényében, melyet a grafikon alatt mutatunk be. üres négyzetek - C⁵H3 timidin béépülés az adriamicin függvényében, tele négyzetek timidin beépülés az adriamicin koncentrációjárnak függvényében THP-k (100pg/ml) jelenlétében.

7. ábra: Az aktinomicin transzkripcióra gyakorolt gátló hatásának visszafordulását mutatjuk be a THP-k hatására, HeLa WCE

rendszert alkalmazva. A transzkripciót úgynevezett pulse chase feltételek mellett hajtottuk végre, ahogy azt a 6. példában leírjuk. A DNS-t növekvő koncentrációjú THP-kkel (A+B) prein— kubáltuk 20 percig 30^eC-on, ezután aktinomicin D-t adtunk hozzá 0,4 pg/ml koncentrációban. 20 perc inkubálás után WCE-t (10 μΐ ) adtunk hozzá, és 20 percig 30^cC-on inkubáltuk. Ezután radioaktív nukleotid-keveréket adtunk hozzá az 5 perces pulse—reakcióhoz, melyet a chase-keverék hozzáadása követett, mely 10mM CTP-t tartalmazott. A transzkripciót 30 percig 30^eC-on folytattuk, ezután leállítottuk. Az RNS-t kivontuk, és a 6. példában leírt módon elemeztük. H-sáv - mólekulatömeg-markerek, C-sáv - kontroll reakció adriamicin vagy THP-k nélkül. A 0,4 pg/ml aktinomicin Dvel történt reakciók sávjait (+)-szal jelöltük, a növekvő THPkoncentrációnál (0,5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 pg/ml) kapott sávok felett a THF’-koncentrációt jelöltük. A sávok relatív intenzitását a 6. példában leírt módon becsültük meg, és a. kontroll százalékában adtuk meg (C sáv).

8. ábrás Kémiailag definiált tápközegben, kölönböző sókoncentrációknál tenyésztett S. clavuligerus extraktumok párosítatján proton természetes abuncancia C NMR (126,7 MHz) spektrumait mutatja. (A) S,5 M NaCl (B) 0,25 M NaCl (C) só nélkül. A

C csúcsok a következőket tartalmazzák: A - THP(A), Tre trehalóz, Glu - glutaminsav

9. ábra: Kémiailag definiált tápközegben, különböző sókoncentrációk mellett növesztett S. clavuligerus sejtekben lévő intracelluláris métábólitokát mutatja be a 8. ábra szerinti NMR —spektrumból kiszámítva. A glutaminsavat aminosav—analizátorral mértük, és a THP(A) és a trehalóz-értékét az NMR—spektrumból ···♦ • · · · integrálással számítottuk ki.

10. ábra: 66 órán át 0,5 M NaCl-t tartalmazó kémiailag definiált tápközegben tenyésztett S. griseus sejtkivonatainak párosítatlan proton C NMR (126,7 MHz) spektrumát mutatjuk be. A C csúcsok a következőkből állnak: A — THP(A), Tre —trehalóz, Glu - glutaminsav, Eth - etanol (a THP(A) kvantitatív mérésének érdekében hozzáadva).

11 .	ábra:	S. griseusból nyert	tisztított	THP(A)
párosítatlan	proton	ⁱ⁵C NMR (126,7 MHz) spektruma.
A találmányt	a következő példákkal	mutatjuk be a	korlátó-
zás szándéka	nélkül.
Példád

1. példa: A THP(A) és a THP(B) izolálása és tisztítása S. parvulus ATCC 12454 sejtkivonatából (a) Tenyésztés

A 4'C-on talaj-kultúrában tartott S. parvulust (ATTC 12434) NZ-amin tápközegben (Sheffield Chemicals N. Y., USA) növesztettük 2 napig 30’C-on egy forgó-rázó inkubátorban. Centrifugáltuk, majd kétszer mostuk a sejteket 0,37.-os KCl-ben, és az így kapott micélium-szuszpenzió (3%) szolgált inokulumként a kémiailag definiált tenyésztő tápközeghez (40 g D-fruktóz, 1,0 g Κ_λΗΡΟ^ , 25 mg ZnSQ, ·7Η_χ0 és 2,1 g L_-glutaminsav/1000 ml ionmentes víz, pH=7,l-en).

(b) Sejtkivonat készítése

Az S. parvulus sejtek kivonatait 1 liter S. parvulus • · • · · ·

tenyésztő tápközegből állítottuk elő. A sejteket centrifugálással (500 g-nél 5 percig) gyűjtöttük össze 4*C körül. A sejteket kétszer mostuk 0,2X-os KC1 oldattal, hogy a tápközeg maradékát el távolítsuk. Az intracelluláris extraktumot úgy kaptuk, hogy a mosott sejtpelletet 10 ml vízbe szuszpendáltűk, és 15 percig 100^eC-on melegítettük, vagy a perkloridsavas eljárást alkalmaztuk [L. Inbar és A. Lapidot, (19SSa)J. A felülúszót 15 000 g-nél 15 perces centrifugálással különítettük el, és csökkentett nyomás alatt 1 ml-re koncentrál tűk.

(c) THP(A) és THP(B) elkülönítése S. parvulus sejtkivonatából

A sejtkivonat-mintákat 4 térfogatrész ecetsavval kevertük össze a Dowex 53 W kromatográfiával történő szeparálás előtt. Az oszlopot ionmentes vízzel mostuk (az őszloptérfogat ötszörösével) a szénhidrátok és pcliolok e1távo1ítására. Az aminosava.kat, THP(A)-t és THP(B)-t 3M NH CH-val eluáltuk. Az ammóniát teljesen elpárologtattuk, és a maradékot pH=5-re állítottuk be.

és Dowex 1 anioncserélő (acetát-típusú) kromatográfiával szeparáltuk.

A savas aminosavak, úgymint a glutaminsav az oszlophoz kötődve maradtak.

A THP(A)-t és a iHF'(B)-t vízzel oldottuk le.

(d)

A THP(A) és a THP(B) elkülönítése a peptidektől és proteinektől

A (c) lépésben nyert THP(A) és THP(B) elegyét 43 ml

Sephadex G-25 oszlopra vittük fel. Az oszlopot vízzel mostuk. Az első frakciók tartalmazták a peptideket és az alacsony molekulatömegű proteineket (sárga színnel), és a THP(A) és a THP(B) ezután eluálódott

44 4

4 4»

-17(e) A THP(A) elkülönítése a THP(B)-től

A (d) lépésben nyert THP(A)+THP(B) keverékét 4 térfogatrész ecetsavval elegyítettük, mielőtt 70ml Dowex 50 W x 8 (NH^-forma) oszlopra felvittük. A THP(A)-t egy kis mennyiségű THP(B)-vel együtt vízzel eluáltuk. A THP(B)-t egy kis mennyiségű THP(A)-val együtt 3M ammónium-hidroxiddal szorítottuk ki. Az eljárást mégegyszer megismételve a THP(A) teljesen elkülöníthető volt a THP(E)-tŐl. A THP(B) frakciója egy kis mennyiségű alanint is tartalmazott. A második frakciót pH=2-re állítittuk be (HCl-lel), és egy 70 ml-es Dowex 1 anioncserélő (OH-forma) kromatográfiával választottuk el. Az oszlopot vízzel mostuk, és a THP(B)-t 150 ml IZ-os hangyasavval szorítottuk ki (az alanint 600 ml 17.-os hangyasavval eluáltuk). A tisztított THP(A) és THP(B) H NMR spektrumát az lb. illetve az la. ábrákon mutatjuk be. A molekulaszel— kezetek a 2. ábrán láthatók.

2. példa: A THP(A) és a THP(B) kristályosítása

(a)	Az 1. példa szerint kapott tiszta THP(A)-t forró
etanolbán	oldottuk fel, és az oldatot szárítóban, benzol-gőzben
tárol tűk,	hogy kristályok alakuljanak ki. Átlátszó, hasábalakú,
3,2 x 0,1	x 0,05 mm-es kristályokat gyűjtöttünk össze a röntgen

kristályszerkezet-analízishez. Triconális ( C₆· HfoN^Clj ) kristályszerkezetet állapítottunk meg P3_X tércsoporttál. A kristályok kötéshosszát az 1. illetve a 2. táblázatban mutatjuk be. Úgy találtuk, hogy a A THP(A) sztereckémiai konfigurációja S-forma.

(b) Az 1. példa szerint nyert tiszta THP(B)-t etanolban oldottuk, és az oldathoz néhány csepp metilén-kloridot adtunk. Az oldatot hagytuk lassan párologni. Néhány nap múlva kristályok tűntek fel az oldatban. 0,4 x 0,3 x 0,2 mm-es színes, átlátszó, ·♦··

-18·· · 9 « • · • · · • · ·· · hasábalakú kristályokat gyűjtöttünk össze a röntgen-kristályszerkezet-analízishez . A _χ0] kristályszerkezet tetragonális, PA. tércsoportokkal. A kristályok. kötéshosszait és kötésszögeit az 1. illetve a 2. táblázatban mutatjuk be. Úgy találtuk, hogy a THP(B) sztereokémiái konfigurációja S-forma.

1. táblázat

	Kötéshosszak
	THP(B)
C(2)-N(l)	1.303	(4)
C(2')-C(2)	1.487	(4)
C(4)-N(3)	1.459	(4)
C(5)-C(4)	1.522	(4)
0(8)-C(4')	1.260	(3)
C(6)-N(l)	1.456	(4)
N(3)-C(2)	1.312	(4)
C(4')-C(4)	1.529	(5)
0(7)-C(4')	1.247	(4)
C(6)-C(5)	1.508	(5)

(A)

THP(A)
C(2)-N(l)	1.311	(10)
,N(3)-C(2)	1.310	(θ)
C(4)-N(3)	1.458	(9)
C(4')-C(4)	1.545	(11)
O(9)-C(5)	1.405	(10)
O(8)-C(4')	1.217	(10)
C(6)-N(l)	1.462	(9)
C(2')-C(2)	1.499	(10)
C(5)-C(4)	1.527	(12)
C(6)-C(5)	1.519	(10)
O(7)-C(4')	1.272	(9)

2. táblázat

Kötésszögek (fok)

THP(B)

C(6)-N(l)-C(2) 123.7 N(3)-C(2)-N(l) 121.5 C(4)-N(3)-C(2) 122.4 C(5)-C(4)-N(3) 108.9 O(7)-C(4') —C (4) 116.5 O(8)-C(4^/)-0(7) 126.0 C(5)-C(6)-N(1) 109.1 C(2')-C(2)-C(2') 118.8 N(3)-C(2)-C(2’) 119.7 C(4')-C(4)-N(3) 112.9 C(5)-C(4)-C(4') 110.4 O(8)-C(4')-C(4) 117.5 C(6)-C(5)-C(4) 109.6

THP(A) (3) C(6)-N(l)-C(2) (3) C(2')-C(2)-N(l) (3) C(4)—N(3)—C(2) (3) C(4')-C(4)-N(3) (3) C(6)-C(5)-C(4) (3) O(9)-C(5)-C(6) (3) O(7)-C(4')-C(4) (3) O(8)-C(4')-0(7) (3) N(3)-C(2)-N(l) (3) C(2')-C(2)-N(3) (3) C(5)-C(4)-N(3) (3) O(9)-C(5)-C(4) (2) C(5)-C(6)-N(l)

O(8)-C(4')-C(4)

121.5(6)

118.1 (6)

124.2(6)

113.5(7)

109.4(7)

108.8 (6)

111.9 (7)

127.8 (7)

121.7 (7)

120.2(7)

109.5(6)

111.3(6)

108.6(6)

120.2 (6) »··· · • · • · · • ·· · «

3. példa; Az ActD kötődése oligonukleotidokhoz THP(A) és

THP(B) jelenlétében - NMR—vizsgálatok

Az ActD DNS-kötésének tanulmányozása igen nagy érdeklődésre tart számot, mivel feltételezhetően ez az alapja antitumor—aktivitásának. Kézenfekvőnek tűnik, hogy a fenoxazongyűrűhöz kapcsolódó peptidláncok felelősek nagyrészt azért, hogy az ActD a DNS GpC helyeihez kötődik. A részletes megoldás érdekébe szerkezet-modellező kutatásokat végeztek az ActD és a d(ATGCAT) 1:1 arányú komplexével [Lybrand és mtsai, J. Mól. Bioi. 191, 495-507, (1986)].

A THP-k DNS-kötési módját ActD jelenlétében vagy hiányában vizsgáltuk NMR-spektrcszkópiával. A következő okok miatt a d(ATGCAT) oligonuk1eotidot választottuk ehhez a vizsgálathoz: egyedi kötőhelyet tartalmaz az ActD számára, elegendően hosszú ahhoz, hogy kölcsönhatásba lépjen az ActD pentapeptid -laktonjaival, az ActD-d(ATGCAT) kinetikája elegendően lassú, és megfelelően utánozza az ActD-DNS asszociáció kinetikáját CS. C.

Brown,	K. Múl 1 is, C.	Levenson, R. H. Ghafer,	Biochemistry 23,
403 (1984);	Ν. Z hou,	T. L. James és R. H.	Shafer, Bioche-
mistry	28,		(1989)]. A DNS-THP(A) és	(B) komplexekkel

folytatott vizsgálatok azt is jelzik, hogy a THP(A) és a THP(B) köti az oligonukleotidot, és nagymértékben megakadályozza, hogy az komplexet képezzen az ActD-vel.

(a) A THP-k kötődése a d(ATGCAT)-hoz

A szabad d(ATGCAT)-bán és a d(ATGCAT) THP(A)-val és THP(B)-vel alkotott komplexében a nem-kicserélhető protonok kémiai eltolódásának összehasonlítását mutatja be a 3. táblázat.

·· ·♦ * « · • · · ♦

A hexamerhez THP(A)-t és THP(B)—t adva a guanozin H8 (GH8) jele 7,94 ppm-nél mutatott egy nagymértékű, alacsonyabb pályára történő kémiai eltolódást (20 mHz), az adenozin (terminális) H8 protonjai alacsonyabb pálya felé mozdultak 10 mHz-nél, míg az összes többi alap-aromás protonok csak kis változást mutattak.

(b) A THP-k kötődése az ActD-d(ATGCAT) komplexhez

THP(B)-t adva	az ActD-d(ATGCAT) komplexhez (0,64 ActD per hexamer
mólarányban)	a GH8 protonok kémiai eltolódása alacsonyabb pálya
felé történt	0,018 ppm-nél, míg az ActD-hexamer komplex adeno-
zin (belső)	H2 protonja 7,99 ppm-nél változatlan maradt (3b.

ábra). Ha THP(A)-t adtunk a komplexhez, a GH8 protonok egy további alacsonyabb pálya felé történő eltolódása volt megfigyelhető (3c. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a THP-k megkötik a szabad oligonukleotidokat még ActD jelenlétében is.

(c) Az ActD kötődése a. d(ATGCAT)-hoz

Az ActD kötődését a szabad oligonuk1eotidokhoz és az ol igonuk 1 eotid-THP komplexhez H FúMFí titrálásos technikával vizsgáltuk meg. A hexamerhez 0,16 mólekvivalens mennyiségben ActD-t adva komplex új protoncsúcsait figyelhettük meg (4b. ábra), és a csúcsok intenzitása növekedett az 1:1 ActD-d(ATGCAT) arány eléréséig (4a., b. , c. , d., e. ábra). A szabad hexamer és az ActD-hez kötött hexamer jeleinek arányait a 4. táblázat mutatja be.

(d) Az ActD kötődése a d(ATGCAT)—THP—k komplexéhez

Ha 0,16 mólekvivalens mennyiségben ActD-t adtunk a hexamet—THP-k komplexhez, az ActD-hexamer komplexnél nem figyelhettünk meg új protoncsúcsokat (4b‘. ábra), 0,32 mólekvivalens ActD hozzáadásakor pedig az ActD-hexamer komplexnek csak egy protoncsúcsa volt detektálható 8,03 ppm-nél (4c*. - ábra). Csak —21 —

amikor 0,48 mólekvivalens ActD-t adtunk a hexamer—THP—khez, akkor lehetett megkülönböztetni az ActD-hexamer új protoncsúcsait, ahogy ez a 4d ’ . , e’. ábrákon látható. Az ActD-hexamer két rezonanciája elveszett, az ActD-hexamer koplex adenozin (belső) H2 jele 7,99 ppm-nél nem detektálható a THP-k-hexamer komplex GH8ának erős.rezonanciái a miatt 7,98 ppm-nél, mig az ActD-hexamer komplex adenozin (terminális) H2 rezonanciáját elfedte a THP(B) NH protonjának ezzel egybeeső rezonanciája 7,88 ppm-nél. Az ActD-d(ATGCAT) egyensúlyi kötési tulajdonságai a THP-k jelenlétében és hiányában (4. táblázat) a szabadh^xamer és az ActD-kötött hexamer protoncsúcs-területeinek arányából vezethetők le. Mivel az ActD hexarnerhez történő kötésének alacsony értékei miatt igen nehéz volt a pontos kötési adatok megállapítása, a kötési állandókat nem sikerült meghatározni. Viszont az egyensúkyi mérések (4.ábra és 4. táblázat) demonstrálják a THP—k potenciális aktivitását a DNS ActD-beékelődés elleni védelmében, mely valószínűleg kompetitív mechanizmussal megy végbe.

3. táblázat

A d(ATGCAT) és a d(ATGCAT)-THP(A)+THP(B) nem kicserél hc-tő protonjainak alap-proton kémiai eltolódása (ppm)

Megjelölés d(ATGCAT) THP(A)+THP(B)-d(ATGCAT) Különbség fii

	Aj.·	8.330
	A*·	8.186
	G·	7.944
	THP(A) Ax^a	7.908
	THP(B) At^a	7.844
	c«	7.368
	Tx^e	7.356
	Tm·	7.251

fi 2	SÍ—52
8.330	0.000
8.203	+0.017
7.984	+0.040
7.913	0.000
7.908	0.000
7.881
7.849	+0.005
7.376	+0.008
7.356	0.000
7.256	+0.005

Adenozin (belső) H8 (Ai^e)j adenozin (terminális) H8 (At^);

/ 2 guanozin H8 (G ); adenozin (belső) H2 (Ai ); adenozin (terminális) H2 (At¹); citozin Hó (C^f); timin (belső) Hó (Ti⁶) és timin (terminális) Hó (Tt* ).

4. táblázat

Az ActD egyensúlyi kötődése a d(ATGCAT)-hoz THF'-k jelenlétében és hiányában

ActD/d(ATGCAT)	d(ATGCAT)	d(ATGCAT)-THR-k
mólaránya	(szabad/kö töt t j’^-	(szabad/kötött)'
0,16	4,9	Π « ΓΠ
0,32	1,7	3,5
0,48	0,8	2,7
0,64	0,4	1,3

(a) A szabad hexamer Ai^ (két proton/2) s kötött ActD-hexamer Ai¹ (egy proton) protoncsúcs területi aránya.

- nincs meghatározva

4. példa:In vitro transzkripciós vizsgálatok ActD je lenlétében; a THP(A) + THF(B) védőhatása (a) A transzkripció gátlása ActD-vel

Azt, hogy az ActD DNS-hez történő kötődése okozza az RNS polimerázos transzkripció gátlását T. R. Kadesch és M. J. Chamberlin EJ. Bioi. Chem. 257, 52S6 (1982)] általt leírt rendszert alkalmazva tanulmányoztuk, amelynél az emlős sejtekből tisztított polimerázok, úgymint az RNS polimeráz I, II és a HeLa sejtekből származó RNS polimeráz II képesek hatékonyan és specifikusan átírni a meghatározott dCMP-végű DNS-templátokat. Az alkalmazott dCMP-végű DNS-rendszer lehetővé teszi a polimeráz-protein transzkripciós reakciójának kvantitatív tanulmányozását más proteinfaktorok jelenléte nélkül, és így ez a rendszer alkalmas arra, hogy analizáljuk a DNS—kötő szerek közvetlen hatását a transzkripció polyamatára, és a THP(A) és THP(B) védő hatását az ActD jelenlétében történő transzkripciónál.

A DNS-dependens RNS polimeráz I-t, Il-t, ΙΙΙ-t ( pol I, pol II, illetve pol III) HeLa sejtekből tisztítottuk Hodo és Blatti által leírt módszer [Biochem, 16, 2344 (1977)J módosított elj árásával.

A templát-DNS-eket PstI restrikciós enzimmel 1 inearizáltűk 3' túlnyúló végeket létrehozva, és terminális transzferé? alkalmazásával (Boehringer Mannheim) mindkét véget dCTP farokkal egészítettük ki. Etanolos kicsapást követően a dCMP-fárokkal rendelkező DNS-eket egy második restrikciós enzimmel hasítottuk, és a kiválasztott farkazott fragmenst agaróz gélen tisztítottuk, ahogy azt T. R. Kadesch és M. J. Chamberlin leírta [J. Bioi. Chem. 257, 5286 (19S2)]. A transzkripciós reakciókeveréket 30°C-on 10 percig 15 pl transzkripciós pufferben inkubáltuk, mely 70 mM Tris-HCl-t (pH=7,9), 0,1 M NH₄Cl-t, 6mM MgCl^-t, 5mM spermidint, 10% glicerint, 0,15 mM ditiotreitolt, 0,6pg dCMP-fárokká 1 rendelkező templátot és E,5pl HeLa RNS polimerázt (3 egység) tartalmazott. Ezután 4,3 mM ATP-t, STP-t és CTP-t, 170 pM UTP-t, 20 pCi La-^Pj UTP-t tartalmazó pulse-puffért (3,5 pl) adtunk a transzkripciós reakciókeverékhez, és 20 másodpercig inkubáltuk. A transzkripció lánchosszabbító (elongációs) szakaszát 1,5 pl chase-puffer hozzáadásával indítottuk el, amely 7mM UTP-t ·· tartalmazott 0,06 pg ActD jelenlétében vagy hiányában. A transzkripciós elongációt 10 percig folytattuk, és proteináz K puffer (0,67. SDS, 25 mM Tris pH=7,9, 25 mM EDTA végső koncentráció), 200 pg/ml proteináz K és 30 pg tRNS hozzáadásával állítottuk le, és 25 percig 65^eC-on inkubáltuk. A mintát etanollal kicsaptuk, és a pelletet terhelő-pufferbe (90X formamid, 0,5 x Tris-borát puffer) reszuszpendál tűk , és 6Z-os poliakrilamid-gélen elektrofőretizál juk.. A gél-autogrammot molekuláris . dinamika számláló denzitométerrel analizáltuk, hogy meghatározzuk a sávok relatív intenzitásait. (A nukleotid-trifoszfátokat és a tRNS-t a Sigmától vásároltuk, a proteináz K-t a Boehringer Mannheimtől, és az [α-^P] CTF'-t (400 Ci/mmól ) az Amersham Internationaltói, Egyesült Királyság, szereztük be.)

Különböző ActD koncentrációnál a HeLa sejtekből származó három RNS polimeráz érzékenységét tisztított polimerázokat és a poll-nél 225 bp hosszúságú, a pol II-nél és pol Ill-nél 420 bp hosszúságú dCMF-farkazott templátot alkalmazva határoztuk meg. Azt vártuk, hogy templátokkal egy 225 nukleotidos illetve 420 nukleotidosnál nagyobb transzkriptumot kapunk, mivel az RNSpolimeráz az egyszálú farok-kettősszá1ú duplex egyedi illeszkedési helyénél kezdi a transzkripciót. Mindegyik kísérletnél a pulse-chase eljárást alkalmaztuk.

A három polimeráz ActD-vel történt transzkripció gátlásának mintázatát az 5. táblázatban foglaljuk össze, ami jelzi, hogy az enzimek is érzékenyek az ActD-re. Mikor 1 pg/ml ActD-t adunk a chase-reakció-keverékhez, csak 10-20’Z-ban fennmaradó transzkripció fordul elő, még 3-5 pg/ml koncentrációnál csak 0,1-3’Z-ban fennmaradó transzkripciót mértünk.

• · • 4··« · ·· · · • · · * .· ί **·*

-25Ezek az eredmények összhangban vannak azzal a megállapítással, hogy az ActD gátlás függ a reakciókeverék DNS-koncentrációj ától.

5. táblázat

A fennmaradó transzkripció százalékos aránya ActD jelenlétében

RNS polimeráz

Aktinomicin-D pg/ml

13 4 5

I	100	16		—
II	100	22		3
III	100	13	“7	0

(b) Az ActD gátolt transzkripció újraindítása THP(A)-val és THP(B)—vei

Az assayt olyan ActD koncentrációnál hajtottuk végre, amelynél a transzkripció gátlása meghaladta a 97X-ot; vagyis az ActD-t 3pg/mg koncentrációban alkalmaztuk. Úgy gondoltuk, hogy a THP(A)+THP(B)-bői az ActD koncentrációjánál magasabb koncentrációra van szükség a DNS-hez történő kötődésének megakadályozására, mivel feltételeztük, hogy azok általánosan védik a DNS-t, és nem csak a d(GpC) bázispárnál (bp), az ActD koncentráció pedig arányos a DNS (GpC) tartalmával. Amint az az 5. ábra 2., 6., 10.

sávjaiból és a 6. táblázatból látható, ezekben a kísérletekben a THP(A) és a THF(B) önmagában nem gátolta a transzkripciós reakciókat. Sem a THP(A) sem a TKP(B) egymagában nem hat az ActD transzkripciógátlására. (Amint az az 5. ábrán a 3-5, 7-9 sávoknál

—26— és a 6. táblázatban látható.) Viszont ha a THP(A)-t és a THP(B)-t együttesen adtunk Isi arányban, a hatásuk drámai volt. 200 μΜ koncentrációnál, 2,5 μΜ ActD jelenlétében, mely önmagában 97%ban gátolja a transzkripciót, a transzkripció 75%-a volt visszanyerhető. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a THP(A) és a THP(B) kombinációja szinergetikus DNS—védő hatást fejt ki az ActD DNS-kötésével szemben. A fentebb leirt körülmények azt mutatják, hogy a transzkripció gátlása (97%) 1 molekula ActD per 30 bp által jön létre, mivel a DNS-ActD komplex forma 1:10 arányt igényel. 75%-os transzkripcióhoz 80 molekula THP(A)+THP(B) szükséges minden egyes ActD molekulához, vagyis egy pár THP(A)+THP(B) per bp arány. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a THP(A)+THP(B) szerepet játszik a DNS védelmében az ActD kötésével szemben, és lehetővé teszi a transzkripció visz-.szaállítását ActD jelenlétében.

6. Táblázat

A fennmaradó transzkripció mértéke ActD és THP(A) és THP(B) jelenlétében

Sorszám	THP pg/ml	ActD μΜ	[3gg/ml] [2,5 μΜ]	7. transzkripció
2	THP(A)	60	400	—	100
•2*	THP(A)	10	66	4-	0.2
4	ThP (A)	30	200	-t-	0,5
5.	THP(A)	60	400	+	1,5
6	THP(B)	60	400	-	100
7	THP(B)	10	60	+	1.0
a	THP(B)	30	203	.+	2,7
9	THP(B)	60	403	+	5,1
10	THP(A+B)(1:1)	60	400	-	100
11	THP(A+B)(1:1)	10	66	+	4,6
12	THP(A+B)(1:1)	30	200	+	75,0
13c	THPÍA+B)(1:1)	0	0		0,2

-275. példa: Sejtnövekedés és kémiai szerrel történő kezelés: Az adriamicin DNS—szintézis gátlásának visszafordulása a THP-k hatására

HL60 sejteket mikrotitráló lemezeken (Nunc) RPMI tápközegben (Gibco) növesztettünk, mely 1B7. fötális borjúszérumot (Biological Laboratories — Bet Haemek ) tartalmazott. A sejteket a tápközegbe szuszpendáltűk 2x10 koncentrációban, és 100 μΐ-es alikvotokban a lemez üregeibe diszpergáltűk. 20 órás, 37^eC-on történő inkubálás után a sejteket THP-kkel (100 pg/ml) és növekvő koncentrációban, ahogy azt a 6. ábrán jelöltük, adriamicinnel kezeltük. 24 óra eltelte után £³H] timidint adtunk hozzá (1

20%-os

4'C-ra

TCA-va1 triklórecetsavval (TCA) állítottuk le, és a lemezeket helyeztük egy északára. A TCA precipitátumokat 107.-os (ISSpl) mostuk, 100μ1 IN NaOH-ba szolubi1izáltűk, és a számláláshoz üvegcsövekbe tettük, melyek toluén:Lumax (Lumac,

Hollandia)

3:2 arányú keverékéből álló szcinti 11ációs oldatot tartalmaztak. Az assaynél három párhuzamost hajtottuk végre

Amint az a 6. ábrán látható, mikor a HL60 sejteket

0,010,02 pg/ml koncentrációjú adriamicinnel kezeltük, a [³H] beépü 1 és

0-407.-ban gátlódott. THP-k hozzáadása a 100 μΐ/ml végső koncéntrációnál visszafordítóttá az adriamicin gátló hatását, és így az adriamicin jelenléte (0,01-0,02 μς/ml) el lenére a £ ² H j timidin beépülés nagyon hatékony, 107-93Z volt

Ezek az eredmények ismételten jelzik, hogy a THP(k) megvédik a DNS-t a károsító kémiai szerektől

ó. példa: Teljes HeLa-sejtkivonatot (WCE) alkalmazó in

28vitro transzkripció:

Az aktinomicin

D transzkripció-gátlásának visszafordulása THP-k hatására

A WCE-t J. L.

Manley módszere szerint állítottuk elő CB

D. Hames és S

J.

Higgins (szerk.) , Transcription and

Translation: A Practical fipproach, IRL Fress, Whasington

C., (1984)] μΐ reakcióelegy 10 μΐ WCE-t, 1 pg DNS-t

Jt mM kreatin-f oszf átot pCi CctP] CTP-t tartalmazott, és a transzkripciót 30’C-on haj tottuk végre. A reakcióelegyet a nuk1eotidkeverék hozzáadása előtt 20 percig előinkubáltűk, majd 3 perccel a radioaktív nuk1eotidok hozzáadása után (pulse-lépés) 10 mM jelöletlen CTP-t tartalmazó chase-keveréket adtunk hc-zzá, és a transzkripciót további percig folytattuk. A reakciót leállítottuk, majd az

Egy előzetes kísérletben az aktinomicin

D transzkrip ciógátlását a HeLa-WCE rendszerben ellenőriztük.

0,4 μα/ml koncentrációt alkalmaztunk, amely körülbelül 807.-os nyezett. A 7. ábrán bemutatott kísérletben világosan látható, hogy az ActD önmagában 0,4 pg/μΐ koncentrációnál a transzkripciós reakciót 807.-ban gátolja (□ és C sáv összehasonlítása). A THP-k alacsony koncéntrációban, 20 pg/ml-ig, történő hozzáadása nem hat a reakcióra, 100-230 pg/ml THP-koncentrációnál újrakezdődik a transzkripció, és eléri a kontroll 43-657.-át. Ez a kísérlet azt mutatja, hogy a THP-k (A+B) visszaszorítják a transzkripció ActD általi gátlódását, az aktinomicin D okozta 20Z-ra lecsökkent transzkripciót körülbelül 25-45Z-kal megemelve.

Ezek az eredmények továbbá azt jelzik, hogy a THP-k megvédik a DNS-t azoktól a kémiai anyagoktól, amelyek kötődnek • · hozzá. I'gy a THP-k a DNS-kötő szerek gátló hatásának visszaszorítását okozzák, és lehetővé teszik a polimerázok hatékony nukleinsav-szintézisét a kémiai szerek jelenléte ellenére is.

7. példa: A THP—k DNS-védő hatása a restrikciós enzimek emésztésével szemben

A THP-k és a DNS közötti funkcionális kölcsönhatásnak további bizonyítékául szolgál az, hogy úgy találtuk, hogy a

THP(A) és a THP(B) keveréke és a THP(A) önmagában is képes egy plazmid-DNS (pGEMIS, Promega) védelmére a restrikciós endonukleázok (EcoRI, Aval és Dral) kölcsönhatásban állnak a DNS-sel, és hatékonyan (10’⁴ M-nél ) megvédik a restrikciós enzimek által felismert hasítóhelyeket. Az eredményeket a 7. táblázatban foglaltuk össze.

Az emésztési elegyhez THP-ket adtunk a 7. táblázatban jelzett végkoncentrációban.

A pGEM10 1 pg-ját

3,2—1pH enzimmel hasítottuk 3 órán át 23 pl pufferban, ahogy azt a gyártó javasolta (New England Biolabs).

Az inkubációs idő eltel’te után 5 pl

75X glicerint, 3X brómfenolkéket és 10 mM EDTA-t megállító puffért adtunk hozzá, és a reakciókeverék 12 tartalmazó pl-ét IXos agaróz gélre vittük. A gélt etídium-bromiddal (0,5 pg/ml) festettük, UV-fénnyel láthatóvá tettük és lefotóztuk. A fényképeken a sávok relatív intenzitását molekuláris dinamika számláló denzitometriával elemeztük.

A restrikciós endonuk1eázok emésztésével szembeni védelemhez szükséges THP(A) + THP(B) minimális mennyisége 25 pg/ml és 100 pg/ml határok között található, míg 150-től 250 pg/ml-ig terjed a teljes gátláshoz szükséges mennyisége. THP(A) • « « · • · ·

-30és THP(B) jelenlétében Aval—gyei és Dral-gyel végzett összehasonlító vizsgálatából úgy tűnik, hogy az Aval aktivitás négyszer érzékenyebb a THP-k gátló hatásával szemben. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy a THP-k nagy affinitással rendelkeznek az Aval helyek GC-maradékaihoz, összehasonlítva az affinitásukat a Dral helyek AT maradékaival (lásd 7. táblázat). Az endonuk1eáz-hasítással szembeni DNS-védelemhez szükséges THP(A)+THP(B) koncentráció hasonló a DNS-hez kötődő aktinomicin D és disztamicin A mennyiségéhez,

EV. V. Nosikov, E. A. Braga, A.

Pclianovsky, Muci. Acids Rés. 3, amint azt korábban már leírták.

Karlishev, A. L. Zushe és □. L.

2293-2301 (1976),- V. V: Nosikov és B. Sain, Muci. Acids Rés. 4, 2263-2273 (1977)]

Figyelemreméltó, hogy míg a THP-k a DNS-t megvédik a restrikciós enzimek hasításával szemben, sem a THP(A) sem a THP(B) sem együttesen nincsenek hatással az RNS polimeráz aktivitására. Ez a különbség valószínűleg a kétféle enzim kötődési módjából eredhet. Az RNS polimeráz a kétszálú DNS-hez kötődik, és megkeresi a promoter helyet oly módon, hogy átmeneti hidrogénkötéseket létesít a szabadénálló hidrogén-donor és a bázispárok akceptor csoportjai között, míg az EcoRI endonukleáz a. palindrómás célhelyet ismeri fel, a DNS foszfátoerincének elektrosztatikus vonzása által, a bázispárok szétválasztása nélkül.

• · ·

-34 ü.

X X

	H 4’	c L.		N	N
			¢1	r[i
		Sít
		-X·	LL
			U-
		<e	1—			<1	ΓΓ	er-
	r-					o	Cn	ei-·
	5	íl			5	tf.	r,	r,
	•—1	T			S	Ή	s
	ε	H
	C.!			f-\|	r-H
	h’			Γ-»	g	r.—*	Sí	fS¹
	in		m	t—i	X	10	lTj	Ifi
			'ΐ	új	cn	r·.,:	*—I	1-í
			r-\|	4J	CL
	Ili		4J				<1
	_!Í		<!			<1	<1	<’
	•X		σ·		X	<	1~\|	•Xi
	Ú.I			iTi	tz	·.	«Γ.	1«,
	e			f!;		!S	£J	&
	•r-i	u.		rn
	N			C?				IS1
	c	C		»—j	g		Lfj	ι&
	ai			! .:	V	Τ'!	N	i'-l
		X-		jl	FT.
		X.		SÍ'	X
	<1	r·--		L			ΓΓ}	ex
	r·}					X	ί''··	fr-
	u		ui		57	r.	«Λ.	·.
			X:		cr	X	—1	>4
	*”:		—;	Π
	L.		·;·’
4->	4·⁴		•s’^s		— ·!	Cl	fl'J	F”.·
	Ul		D		ti	?7’	G
ru	ω			L‘			!··’>	[··’.:
	L					—·
Xí	σί						<1
Sí:		U·..				-C		<1
r—·	£	Ί·’n*..		•'/i	5.1	<	rH	<!
_r				&			CH	trp.
r-_s	f.l
			rp	-·:	r·.·
			é		rx
	>		-T	lu	*.,.	ír	Lu
	fi		•4				:·· 1	ι_':ι· - .1
	S	•_u.·
		G.^!
	T-\|
		c*··;					• ';	Γ·' !
	íii 4J	X
	r-H

Hs K u UJ ni <é ·· · ♦ <

• · ·

-328. példa: THP(A) izolálása és tisztítása S clavuligerus sej tkivonataiból (a) Növesztés tenyésztőkultárában: A S.

elavuligerust (NRRL 3585) hasonló körülmények között növesztjük, mint a S.

parvulust, ahogy azt az l.(a) példában fentebb leírtuk

S. clavuligerus spórák szuszpenzióját 207.-os glicerinben tárol tűk

-23^eC-on. A tenyészetet 103 μΐ spóraszuszpenzióval ol tottuk.

be, és két napig növesztettük fergó-rázó inkubátorban (210 ford./perc) kémiailag definiált tápközegben, mely 0,17.

élesztő kivonattal volt kiegészítve.

Centrifugái ás és 3,97.-os

NaCi-lel történő 2x-es mc-sás után a vegetatív micélium szuszpenziója (57) szolgált inokulumként egy kémiailag definiált tenyésztő közeghez. A növesztő tápközeg tártál mázott:

Mg 5(¾—t

0,3 5*/. K íHF'O^ -1 és tartalmazó törzsoldatot literenként. A nyomelemsók törzsoldata 133 mg FeSQ₄χ7Η₄0—t, ICB.mg

MnCI_a x4H₂0-t,

103ml vízben.

A sejteket 33’C-on 243 ferd./perc-nél egy forgórázó inkubátorban 253 ml-es Erlenmeyer lombikban tenyésztettük, amely ml tápközeget tarta1mázott.

A THF(A) intracellulárisan felhalmozódott, amikor NaCl-t adtunk

3,5M mennyiségben. A THF(A) nyomnyi mennyisége (8. ábra) volt gerus sejtekben, amikor 0,057. M

NaCl-ben tenyésztettük, és határozottan megnövekedett 430 pmol/g száraztömeg-re az intracelluláris tartályokban, és koncentrációja majdnem olyan magas lett, mint a

3M NaCl-ben növesztett halofil baktériumokban. Tehát a THF(A) és a THP(B) szintézisének mechanizmusa az ActD-termelő Streptomces fajokban az aktinomicin szintézisre adott válasz, és a THP(A) a (5-lak tám-termelő S. elavul igerusban a sótartalom változására adott válasz.

A S. clavuligerus képes 0,5 M NaCl-t elviselni folyékony minimál tápközegben. A tápközeg sótartalmának 0,05 M-ról 0,5 M-ra történő növekedése hatással volt a növekedési rátára, míg egy egyenletes szintnél ugyanazt az.értéket kaptuk, mint az alap tápközegnél. Az antibiotikum-termelés rendkívül érzékeny a tápközeg sótartalmára, és teljesen gátlódik 0,25 M NaCl-nél. Természetes abundancia C NMR-rel tanulmányozott anyagcsereválasz feltárta, hogy a THP(A) 18-szeresére megnövekedett (összehasonlítva az alaptápközeggel), és a trehalóz felgyülemlett, míg az intracelluláris glutamin szintje lecsökkent (S. és

9. ábra). Az intracel1uláris THP-k maximális akkumulációja a növekedés féllogaritmikus fázisában figyelhető meg, és ez arányos az NaCl-koncentráció növekedésével (400 pmól/száraz sejttömeg THP(A) 0,5 M NaCl-nél). A THP(A) a tenyésztés 86. órája után (késői lóg fázis) emésztődik el.

(b) Sejtkivonatok előállítása

A S. clavuligerus sejtek sejtkivonatát 1 liter S. clavuligerus tenyészku1túrájából állítottuk elő. A sejteket centrifugálással (580 g-nél 5 percig) körülbelül 4'C-on összegyűjtöttük, és kétszer mostuk 0,2*X KCl-oldattal , hogy eltávolítsuk a tápközeg fennmaradó részét. Az intracelluláris extraktumokat a mosott sejtpellet 10 ml vízbe történő szuszpendálásával és 15 percig 180*C-ra történő hevítésével kaptuk. A felülúszót 15 perces 15 080 x g-n történő centrifugálással elkülönítettük, és csökkentett nyomás alatt 1 ml-re koncentráltuk.

(c) A THP(A) elkülönítése S. clavuligerus sejtkivonatából A sejtextraktum-mintákat 4 térfogat 1 M ecetsavval elegyítettük a Dowex 50 W-vel történő kromatografáláshoz. Az oszlopot ionmentes vízzel mostuk (az őszloptérfogat ötszörös mennyiségével) a szénhidrátok és a poliolok el távolítására. A glutamátot és a THP(A)-t 3 M NH OH-val eluáltuk. Az ammóniát teljesen elpárologtattuk, és a maradékot pH=5-re beállítva Dowex 1 anioncserés (acetát-forma), kromatográfiával különítettük el. A glutaminsav az anioncserélő-oszlophoz kötődve maradt, míg a THP(A)-t vízzel eluáltűk.

(d) THP(A) kristályosítása

A fentebb nyert tiszta THP(A)-t forró metanolban oldottuk, és az oldatot desszikátorban hagytuk benzén-gőz mellett kristályosodni. A kristályok 7 nap múlva jelentek meg. Az átlátszó, prizma-alakú 0,2 x 0,1 x 0,05 mm-es kristályokat összegyűjtöttük a röntgensugaras szerkezet-analízishez.

9. példa: THP(A) izolálása és tisztítása S. griseus sejtkivonatból

Streptomyces griseust (ATCC 10137) agat—tápközegen (YM) tenyésztettük, mely 17. malátakivonatot, B,47 élesztőkivonatot,

0,0017 CaCl -t, 27 baktoagart és 1 ml nyomelem-sókat tartalmazó törzsoldatot tartalmazott literenként. A fermentációs tápközeg (FM) a következőket tartalmazta: 1,07 glicerin, 0,27 L-aszparagin, 0,067 MgSO^, 2,97 NaCl, 0,357 K_XHPO_A, 0,687 ΚΗχΡΟ*, és 1 ml nyomelemsókat tartalmazó törzsoldat literenként. A nyomelemsó törzsoldat 100 mg FeSOy, x 7ΗχΟ-ί, 100 mg CoCl -t tartalmazott 100 ♦ · · · · ·♦· · • · ml vízben. A csíráztató tápközeg (SM) az FM-hez képest további

0,15 élesztőkivonatot és 0,17. NH^Cl-t tartalmazott.

Az	inokulum előállítására a törzseket, mint spóraképző
kultúrát	YM agar lapokon tároltuk szobahőmérsékleten. A
csíráztató	tápközeget (200 ml 1 literes Erlenmeyer—lombikban) 1

ml szuszpenzióval oltottuk be, melyet a lemezről 5 ml sóoldattal

mostuk le

steril körülmények között. A sejteket 30’C-on 210

fordulat/perc-nél fcrgó-rázó inkubátorban 3ó órán át tenyésztettük (végső DDr*o = 3,1).

Fermentáció. A csírakultúrából a sejteket 15 000 g-s centrifugálással gyűjtöttük össze, sóoldattal mostuk és a sejt-

pe1 leteket	szövethomogenizátorban sóoldatban homogenizáltuk.
Végül ez a	szuszpenzió szolgált az 1 liter FM tápközeg inokulu-
maként az	5 literes Erlenmeyer-lombikban (,430) . A sejteket

33^eC-on tenyésztettük, és 210 fordulat/perc-nél fcrgó-rázó in

kubátorban	38 órán át tenyésztettük (végső DD^_O=1,9). A
mi cé1iumot	centrifugálással összegyűjtöttük és mostuk a THP(A)

izc1á1ásához, amelyet a fenti 8. péIda - szerint hajtottunk végre.

A S. griseus képes 1503 mg THP(A)-t/ 10 1, 0,5I“Í NaCl-t tartalmazó tenyészközeg felhalmozni, mely sokkal több, mint amit a S.

c1avu1igerussa1 kaptunk hasonló körülmények között. A 0,5 M NaCl-t tartalmazó tápközegben tenyésztett S. griseus párosítatlan proton C NMR—spektrumát mutatjuk be a 10. ábrán, és a termelt

THP(A)-t mutatjuk be a 11, ábrán tisztítás után.

♦ « · ♦ ···

-36• ·

Szabadalmi igénypontok

Claims

Szabadalmi igénypontok

1-3. igénypontok bármelyike szerinti gyógymely THP(A)-t és THF(B)-t tartalmaz

5. A 4.

igénypont szerinti gyógyszerkészítmény,

THP(A)-t és a THP(B)-t ekvimoláris mennyiségben tartalmazza

6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény a nem—tumoros szövetekben a DNS védéi mére a DNS-kötő szerek káros!tásával szemben

7, Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszer— készítmény egy antitumor-antibictikum toxikus hatásainak csökkerítésére a rák-kemoterápiában

A 7. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, ahol az antitumor—antibiotikum aktinomicin D.

—37—

9. THP(A), THP(B) vagy ezek kombinációjának alkalmazása a nem-tumoros szövetekben a DNS védelmére a DNS-kötő szerek károsításával szemben

10. THP(A), THP(B) vagy ezek kombinációjának alkalmazása a rák-kemoterápiában egy antitumor-antibiotikum toxikus hatásainak csökkentésére

Eljárás a DNS védelmére nem-tumoros szövetekben egy

DNS-kötő szer károsításával emlí tett

DNS-kötő szerrel kezelnek, mely eljárás az említett betegnek az 1-5 igénypontok bármelyike szerinti készítmény hatásos mennyiségének beadását foglalja magában.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a DNS-kötő szer egy antitumor—antibiotikum.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, ahol az antitumor— antibiotikum aktinomicin D vagy adriamicin.

14. Eljárás egy antitumor—antibiotikum toxikus hatásainak csökkentésére egy rákos betegben, akit az említett antitumor— antibiotikummal kezelnek, mely eljárás a betegnek az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény hatásos mennyiségének beadását foglalja magában.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az antitumor— antibiotikum aktinomicin D.

ló. Eljárás THP(A) és a THF(B) izolálására és tisztítására egy aktinomicin D termelő Streptomyces mikroorga nizmus sejtkivonatából, mely eljárás a következő lépésekből áll:

(a) a mikroorganizmus tenyésztése megfelelő tenyésztő tápkösegben, (b) a sejtek összegyűjtése és sejtkivonat készítése a mosott sej te k bői, (c) a THP(A) és THP(B) tetrahidropirimidin-származékok elkülönítése a kísérő szénhidrátoktól, polioloktól, aminosavaktól, peptidektől és proteinektől őszlopkromatográfiás szeperációs lépésekkel, (d) a THP(A)-t és a THP(B)-tartalmazó oldat ioncserés oszlopkrcmatografálása, és (e) a THP(A) és THP(B) eluálása különböző oldószerekkel lényegében tiszta THP(A)-t és THP(B)-t nyerve.

17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol a Streptomyces törzs S. parvulus.

18. A 16. vagy a 17. igénypont szerinti eljárás, melynél a (d) lépésben az ioncsrélő őszlop-kromatografálást egy Dowex 50 W (NH^-forma) oszlopon hajtjuk végre, és az (e) lépésben a THP(A)-t vízzel és a THP(B)-t 3 M ammónium-hidroxiddal eluáljuk.

19. Eljárás THP(A) izolálására és tisztítására kismértékű sóstressz körülményei alatt álló, talajból izolált Streptomyces mikroorganizmus sejtkivonatából, mely eljárás a következő lépésekből áll:

(a) a mikroorganizmus tenyésztése egy megfelelő tenyésztő tápközegben 0,25-0,5 M NaCl-ben, (b) a sejtek összegyűjtése és sejtkivonat készítése a mosott sej tekből, (c) a THP(A) elkülönítése a kísérő szénhidrátoktól, aminosavaktól és proteinektől néhány őszlopkromatográfiás szeparációs lépéssel, (d) a THP(A)-t tartalmazó oldat ioncserés őszlop-kromatografálása, és •ι:

• « (e) a THP(A) eluálása vízzel, lényegében tiszta THP(A)-t nyerve.

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, ahol a mikroorganizmus S. clavuligerus vagy S. griseus.

21. Lényegében tiszta 2-metil-4-karboxi-5-hidroxi-

1. Gyógyszerkészítmény, mely aktív alkotórészként legalább egy, a 2-meti1-4—karbcxi-5-hidroxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidin CTHP(A)], egy sója, 5-étere vagy 5-ésstere és a 2-metil-4karboxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidin ETHP(S)] vagy egy sója közül kiválasztott tetrahidrcpirimidin-származékot és egy Gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, mely 2- meti 1 -4-karboxi-5-hidrcxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidir.t [THP(A) ] tartalmaz.

metil-4-karboxi-3,4,5,6-tetrahidropirimidin-t

ÜTHP(B)3 tartalma z

4. Az

3,4 ,’5,6-tetrahidropirimidin , sói, 5-éterei és 5-észterei.