DE10047444A1

DE10047444A1 - Verfahren zur Trennung und hochreinen Isolierung von niedermolekularen, strukturell ähnlichen Verbindungen insbesondere von Tetrahydropyrimidinderivaten wie z.B. 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarbonsäuren (Ectoine) und deren Spaltprodukte

Info

Publication number: DE10047444A1
Application number: DE2000147444
Authority: DE
Inventors: Frank Gieselmann; Achim Epping; Andreas Jupke; Henner Schmidt-Traub; Silke Juenemann
Original assignee: Bitop Gesellschaft fur Biotechnische Optimierung mbH
Current assignee: Bitop Gesellschaft fur Biotechnische Optimierung mbH
Priority date: 2000-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2002-04-11
Also published as: AU2002210513A1; WO2002024664A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Trennung und hochreine Isolierung von niedermolekularen, strukturell ähnlichen Verbindungen insbesondere von Tetrahydropyrimidinderivaten wie z. B. 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarbonsäuren (Ectoine) und deren Spaltprodukte. Diese Verbindungen sind auch in hochkonzentrierter Form mit dem Zellstoffwechsel kompatibel und zeichnen sich dadurch aus, daß sie Biomoleküle unter verschiedenen Streßbedingungen stabilisieren. DOLLAR A Bei ihrer biotechnischen Herstellung werden stets Derivatgemische unterschiedlicher Zusammensetzung aus den Mikroorganismen gewonnen. Durch chemische Veränderung, z. B. alkalische Hydrolyse, von Ectoinen werden als Spaltprodukte Gemische verschiedener Aminosäuren gewonnen. DOLLAR A Durch die erfindungsgemäße Verwendung von diskontinuierlichen oder kontinuierlichen chromatographischen Verfahren oder der fraktionierenden Kristallisation oder eine Kopplung dieser Verfahren können diese Komponenten getrennt und bis zu einer Reinheit von >= 99,9% erhalten werden. Gemäß der Erfindung können die Trennungen ohne oder mit stark vermindertem Einsatz von organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden.

Description

Anwendungsgebiet

Niedermolekulare, strukturell ähnliche Verbindungen, insbesondere Tetrahydropyrimidinderivate wie z. B. 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4- pyrimidincarbonsäuren (Ectoine) und deren Spaltprodukte sind Aminosäurederivate, die zur Klasse der kompatiblen Solute gehören. Sie sind auch in hochkonzentrierter Form mit dem Zellstoffwechsel kompatibel und zeichnen sich dadurch aus, daß sie Biomoleküle unter verschiedenen Streßbedingungen stabilisieren. Diese Wirkung weist auf ein großes Anwendungspotential in pharmazeutischen und kosmetischen Bereichen hin.

Stand der Technik

Es ist bekannt, daß Kompatible Solute, z. B. Ectoine von einer Vielzahl von Mikroorganismen wie z. B. extremophile Bakterien und Actinomyceten synthetisiert werden. Die biotechnische Gewinnung der Kompatiblen Solute wie z. B. Ectoine aus den Organismen kann durch chemische Extraktion, mechanischen Zellaufschluß oder durch Melken der Bakterien erfolgen. In den sich anschließenden Aufarbeitungsverfahren werden die Substanzen über Querstromfiltration, Elektrodialyse, organische Kationenaustauscher und Extraktion von Zellresten, Salzen sowie hoch- und niedermolekularen Verunreinigungen befreit und durch Auskristallisieren als Feststoff gewonnen.

Durch Variation verschiedener Verfahrensparameter in der Fermentation kann die Produktzusammensetzung variiert werden. Bei der Herstellung der Kompatiblen Solute (z. B. Ectoine oder Firoine) werden daher stets Produktgemische unterschiedlicher Zusammensetzung gewonnen. Ein Verfahren zur Auftrennung der Gemische und zur Isolierung sowohl von Ectoin als auch Hydroxyectoin mit Spezifikationen von ≧ 99,9% Reinheit existiert bisher nicht.

Durch alkalische Hydrolyse von Ectoinen lassen sich verschiedene Aminosäuren als Spaltprodukte synthetisieren. Bei der Herstellung dieser Verbindungen fallen stets Produktgemische unterschiedlicher Zusammensetzung an. Eine Methode zur effektiven Trennung der verschiedenen Komponenten existiert bislang nicht.

Nachteile des Standes der Technik

Bei den nach dem Stand der Technik durchgeführten Verfahren werden Produktgemische von Kompatiblen Soluten, z. B. Tetrahydropyrimidinderivate oder deren Spaltprodukten unterschiedlicher Zusammensetzung erhalten.

Eine Trennung der Produktgemische ist nach dem Stand der Technik nur unter großen Ausbeuteverlusten möglich.

Die Verfahren gemäß des Standes der Technik ermöglichen keine Herstellung von Tetrahydropyrimidinderivaten und deren Spaltprodukten mit einer Reinheit von ≧ 99,9%.

Die Verfahren gemäß des Standes der Technik zur Isolierung der Einzelsubstanzen zeichnen sich durch eine geringe Produktivität und Effektivität aus.

Die Verfahren gemäß des Standes der Technik sind für den technischen Maßstab nicht geeignet.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das eine effektive Abtrennung von niedermolekularen, strukturell ähnlichen Verbindungen insbesondere von Tetrahydropyrimidinderivaten wie z. B. 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarbonsäuren (Ectoine) und deren Spaltprodukte von Nebenkomponenten sowie eine hochreine Isolierung dieser Substanzen mit hohen Ausbeuten beinhaltet.

Lösung der Aufgabe

Überraschend wurde nun gefunden, daß durch diskontinuierliche oder kontinuierliche chromatographische Verfahren oder fraktionierende Kristallisation oder eine optimale Kopplung dieser Verfahren niedermolekulare, strukturell ähnliche Verbindungen insbesondere Tetrahydropyrimidinderivate wie z. B. 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl4- pyrimidincarbonsäuren (Ectoine) und deren Spaltprodukte in hoher Reinheit gewonnen werden können.

Vorteile der Erfindung

Die Erfindung gewährleistet die Gewinnung von Tetrahydropyrimidinderivaten und deren Spaltprodukten mit hoher Ausbeute und in einer Reinheit von ≧ 99,9%.

Die Erfindung gewährleistet eine Reduktion der Anzahl der Trennoperationen für die genannten Substanzen.

Die Erfindung ermöglicht es, flexibel auf vom Markt gestellte Reinheitsanforderungen zu reagieren.

Die Erfindung ermöglicht die Gewinnung der reinen Verbindungen mit hoher Produktivität und gewährleistet damit die Wirtschaftlichkeit des Gesamtprozesses.

Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß der chromatographische Prozeß mit wäßrigen Eluenten ohne oder mit stark vermindertem Einsatz von organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden kann.

Beispielbeschreibung (A) Chromatographie

Im folgenden wird ein diskontinuierliches HPLC-(Hochleistungsflüssig chromatographie)-Verfahren beschrieben, das die Zielkomponenten Ectoin und Hydroxyectoin unter Ausnutzung ihrer unterschiedlichen Adsorptionsneigung auftrennt. Nach den im Stand der Technik beschriebenen Aufarbeitungsverfahren liegen die Ectoine in geringen Konzentrationen (< 10 g/l,) in wässriger Lösung vor. Als Elutionsmittel für die chromatographische Trennung wird vollentsalztes Wasser gewählt. Als stationäre Phase werden RP18-Materialien eingesetzt. Diese sind in eine 25 × 125 mm temperierbare Edelstahlsäule gepackt, die vor Beginn der Trennung mit mindestens 40 Säulenvolumina vollentsalztem Wasser in das thermodynamische Gleichgewicht gebracht wird. Die Trennung erfolgt bei einem Druck von 50 bar und einem Durchflussvolumenstrom von 10 ml/min. Bereits bei dreifacher Durchströmung der beschriebenen Säule können Reinheiten von 99,9% erreicht werden. Dabei wird zunächst die zuerst eluierende Komponente Hydroxyectoin aufgefangen, im Anschluss daran das unpolarere Ectoin. Die Detektion des Substanzgemisches erfolgt mit einem UV-Detektor bei einer Wellenfänge von 243 nm.

(B) Kristallisation]

Nachfolgend wird ein diskontinuierliches Verfahren nach dem Prinzip der fraktionierenden Kristallisation beschrieben, welches die Zielkomponenten Ectoin und Hydroxyectoin unter Ausnutzung ihrer unterschiedlichen Löslickeiten in flüssigen Medien auftrennt. Als Lösungsmittel wird hier Methanol gewählt. Ausgehend von einer Gemischkonzentration der genannten Substanzen von 4 g/l, wird in einem 500 ml Glaskolben bei 15°C eine Verdampfungskristallisation unter Wasserstrahlvakuum durchgeführt bis sich das Gesamtvolumen auf 70 ml reduziert hat. Anschließend wird das auskristallisierte Hydroxyectoin abfiltriert. Auf diese Weise können 1,95 g hochreines (≧ 99,9%) Hydroxyectoin gewonnen werden. Nach Temperaturerhöhung wird in einem zweiten Schritt eine Verdampfungskristallisation bei 55°C unter Wasserstrahlvakuum durchgeführt bis sich das Volumen auf 10 ml reduziert hat. Dabei werden 1,5 g reines Ectoin auskristallisiert. Die noch geringe Mengen an Ectoin und Hydroxyectoin enthaltende Restlösung wird dem Feed wieder zugemischt.

Claims

1. Verfahren zur Trennung und hochreinen Isolierung von niedermolekularen, strukturell ähnlichen Verbindungen insbesondere von Tetrahydropyrimidinderivaten und deren Spaltprodukte aus wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanzfraktionen in einem geeigneten Phasensystem nach dem Prinzip der Adsorptionschromatographie trennt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chromatographische Trennung adsorptiv an chemisch modifizierten Kieselgelen durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbentien Umkehrphasenmaterialien (RP18, RP8) eingesetzt werden.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbentien mittelpolare Phasenmaterialien (CN, NH₂) eingesetzt werden.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß wäßrige Eluenten oder wäßrige Eluenten mit Anteil organischer Lösungsmittel eingesetzt werden.

6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie diskontinuierlich oder kontinuierlich betrieben werden.

7. Verfahren zur Trennung und hochreinen Isolierung von niedermolekularen, strukturell ähnlichen Verbindungen insbesondere von Tetrahydropyrimidinderivaten und deren Spaltprodukte aus wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanzfraktionen in einem geeignetem Lösungsmittel nach dem Prinzip der fraktionierten Verdampfungskristallisation trennt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionierte Kristallisation in reinem Methanol oder wäßrigen Methanollösungen durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionierte Kristallisation mehrstufig auf verschiedenen Temperaturniveaus durchgeführt wird.

10. Verfahren zur Trennung und hochreinen Isolierung von niedermolekularen, strukturell ähnlichen Verbindungen insbesondere von Tetrahydropyrimidinderivaten und deren Spaltprodukte aus wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9 mehrstufig kombiniert werden.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionierte Kristallisation gemäß den Ansprüchen 7 bis 9 im Anschluß an die Adsorptionschromatographie nach Ansprüchen 1 bis 6 betrieben wird.

12. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die beschriebenen Trennverfahren mit einem vorangehenden Aufreinigungsschritt nach dem Prinzip der Ionenchromatographie kombiniert werden.