HUT53375A

HUT53375A - Process for producing peptide derivatives

Info

Publication number: HUT53375A
Application number: HU896359A
Authority: HU
Inventors: Rainer Albert; Janos Pless; Steven W J Lamberts; Eric P Krenning
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1988-12-05
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 1990-10-28
Also published as: CH678329A5; FI102540B1; AU4587189A; KR900009697A; NL194828B; DK612689A; CA2004532A1; NL8902981A; ES2023533A6; AU633859B2; CA2004532C; GB2225579B; HU896359D0; SE508799C2; FR2639947A1; JP2726320B2; SE8904087D0; HU211468A9; GB2225579A; LU87633A1

Description

A találmány tárgyát polipeptidek előállítására szolgáló eljárás, ezen polipeptideket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint ezen gyógyszerkészítmények alkalmazására, különösen szomatosztatin-receptort hordozó tumorok kezelésére vagy in vivő kimutatására szolgáló módszer képezik.

Az utóbbi években számos daganatos megbetegedés (például az agyalapi mirigy, a központi idegrendszer, az emlők

4' vagy a hasnyálmirigy tumorai, illetve ezek áttételei) esetében mutatták ki, hogy a tumorsejtek szomatosztatin-receptorokat hordoznak. Az ilyen tumorok többsége kicsiny és lassan növekszik, ezért kimutatásuk és lokalizálásuk a hagyományos diagnosztikai módszerekkel nehézkes vagy megoldhatatlan.

A szomatosztatin-receptorok in vitro kimutatása a daganatos szövetekben autoradiográfiával történik radioaktív jódizotóppal jelzett szomatosztatin vagy szomatosztatin-analógok, például [¹²⁵I-TYR¹¹]-SZOMATOSZTATIN-14 [Taylor és mtsai, Life Sci., 43, 421 (1988)] vagy [^²^ ]-204-090-nek is

125 3 nevezett [ I-Tyr ] SMS 201-995 [Reubi, J.C. és mtsai, Brain Rés., 406, 891 (1987); Reubi, J.C. és mtsai, J.Clin. Endocr. Metab., 65, 1127 (1987); Reubi, J.C. és mtsai, Cancer Rés., 47, 551 és 5758 (1987)] segítségével. Olyan szomatosztatin-peptideket azonban, amelyekkel az in vivő diagnózis vagy éppen a terápia megvalósítható lenne, még senki sem talált.

Kutatásaink során azt találtuk, hogy a fenti célnak megfelelnek az olyan szomatosztatin-jellegű peptidek, amelyeknek legalább egy kelátképző, valamely kimutatható elem atomjainak hordozására képes, a peptidlánchoz egy aminocsoporton keresztül kapcsolódó csoportja van, feltéve, hogy az igy lekötött aminocsoportnak nincs lényeges szerepe a peptidnek a szomatosztatin-receptorhoz való affinitásában. Az ilyen, a találmány tárgyát képező vegyületeket a továbbiakban ligendumoknak nevezzük.

A találmány szerinti ligandumok ezek szerint olyan vegyü letek, amelyeknek egy kelátképző, valamely kimutatható (pl. radioaktív, sugárelnyelő vagy paramágneses) elem atomjait komplex alakjában megkötni képes csoportjuk van, és amelyek képesek a tumorsejtek szomatosztatin-receptoraihoz szelektíven kötődni.

A kelátképző csoport kovalens kötéssel kapcsolódik a peptidlánc aninocsoport jához, előnyösen a szomatosztatin-peptid terminális aminocsoportjához. A kelátképző csoport kapcsolódhat közvetlenül vagy egy áthidaló csoporton keresztül* az aminocsoport nitrogénatomjához. Ennek megfelelően a találmány szerinti ligandumok két csoportba sorolhatók: az egyik csoportba tartozó ligandumok esetében a kelátképző csoport közvetlenül kapcsolódik a szomatosztatin-peptid aminocsoport jához , a másik csoportba tartozó ligandumok esetében pedig egy áthidaló-térkitöltő csoporton keresztül. A kelátképző csoport előnyösen peptid-kötéssel kapcsolódik a peptidlánchoz.

A szomatosztatin-peptidek kifejezés alatt a természetes szomatosztatint (ami egy tetradekapeptid), a származékait és analógjait értjük. Származékok és analógok alatt mindazokat a nyiltláncu vagy ci klikus polipeptideket értjük, amelyek a tér mészetes tetradekapeptidb ŐL vezethetők le egy vagy több aminosav kihagyásával és/vagy más aminosavakra való kicserélésével, és/vagy ahol a természetes polipeptid funkciós csoportja(i ) t más funkciós csoport(ok)ra vagy nem-funkciós csoportja(i)t más, az előbbiekkel izoszterikus csoport(ok)ra cserélték. A fenti kifejezés alatt tehát mindazokat avegyületeket értjük, amelyek szerkezete különbözik a természetes szomatosztatinétól, de biológiai aktivitásuk hasonló, azaz képesek kötődni a szomatosztatin-receptorhoz és csökkenteni a szomatotróp hormon elválasztását.

Ismertek ciklikus, áthidalt-ciklikus és nyiltláncu szórnatosztatin-analógok; ilyen vegyületeket és előállításukra szolgáló eljárásokat tartalmaznak az EP-A 1295, 29579, 215171, 203031, 214872, 298732 és 277419 szabadalmi leírások.

A találmány szerint előnyös ligandumok azok, amelyek a következő szomatosztatin-analógokból származtathatók:

A. Az (I) általános képletű szmatosztatin-analógok, ahol

A 1-12 szénatomos alkil-, 7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport vagy olyan RCO- általános képletű csoport, ahol

i) R hidrogénatom, 1-11 szénatomos alkil-, fenil- vagy

7-10 szénatomos fenil-alkil-csoport; vagy ii) RCO-

a) L- vagy D-fenilalanin maradék, adott esetben a gyűrűben szubsztituálva fluor-, klór- vagy brómatommal, nitro-, amino-, hidroxi-, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal;

b) egy természetes vagy szintetikus alfa-aminosav maradéka, ami eltér az a) alatt meghatározottól, vagy egy megfelelő D-aminosav maradéka; vagy

c) egy dipeptid maradék, amelyben az aminosavak lehetnek

... . ··♦··♦·· • ····· ·« •·· ··» · ··· ····

- 5 azonosak vagy különbözőek és megfelelnek az a) és/vagy b) alatt meghatározottaknak, és ahol az a) vagy b) szerinti aminosav maradékok alfa-aminocsoportja vagy a c) szerinti dipeptid maradékok terminális aminocsoportja adott esetben egysezresen vagy kétszeresen hel ettesitve lehet 1-12 szénatomos alkilcsoporttal, vagy 1-8 szénatomos alkanoil-csoporttal lehet szubsztituálva;

A' hidrogénatom, 1-12 szénatomos alkil- vagy 7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport;

és Y₂ jelenthetnek együtt egy közvetlen kötést, vagy jelentésük egymástól függetlenül hidrogénatom vagy az (1), (2), (3), (4) vagy (5) általános képletű csoportok bármelyike, amelyekben

R_a metil- vagy etilcsoportot,

Rb hidrogénatomot, metil- vagy etilcsoportot,

R_c 1-6 szénatomos alkilcsoportot,

R_d a természetes vagy szintetikus aminosav alfa-szénatomjához csatlakozó csoportot (ami lehet hidrogénatom is) ,

R_e 1-5 szénatomos alkilcsoportot,

R_a, és Rfc, egymástól függetlenül hidrogénatomot, metil- vagy etilcsoportot,

Rg és Rg egymástól függetlenül hidrogén- vagy halogénatomot,

1-3 szénatomos alkil- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoportot jelenthet, és m =1,2,3 vagy 4, η = 1, 2, 3, 4 vagy 5,

Ρ = Ο vagy 1, q = Ο vagy 1, és r =O_fl vagy 2 lehet;

B adott esetben a fenilgyürün halogénatómmal, nitro-, amino-, hidroxi-, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált fenilalanin maradék (beleértve a pentafluor-fenil-alanint is), vagy béta-naftil-alanin maradék;

C L- vagy D-triptofán maradék, amely adott esetben az alfa-nitrogénatomon metilcsoporttal vagy a benzolgyürün halogénatommal, nitro-, amino-, hidroxi-, 1-3 szénatomos alkil és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal lehet helyettesítve ;

D lizinmaradék, az oldalláncon béta-helyzetben oxigénvagy kénatomot tartalmazó lizinmaradék, gamma- vagy delta-fluor-lizin maradék, adott esetben az alfa-nitrogénatomon metilcsoporttal helyettesítve, vagy lehet (4-amino-ciklohexil)-alanin maradék vagy (4-amino-ciklohexil)-glicin maradék;

E treonin, szerin, valin, fenilalanin, izoleucin, amino-izovajsav vagy amino-vajsav maradéka;

G az (a), (b), -COOR^ vagy -Cf^OR^Q általános képletű csoportok valamelyike, ahol

Ry hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkilcsoport, hidrogénatom vagy fiziológiásán elfogadható, in vivő hidrolizálni képes észtercsoport,

R^^ hidrogénatom, 1-3 szénatomos alkil-, fenil- vagy 7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport,

R^2 hidrogénatom, 1-3 szénatomos alkilcsoport vagy -CtKR^J-X^ általános képletű csoport, ahol

R^2 hidroxi-metil-, 2-hidroxi-etil-, 3-hidroxi-propilvagy 1-hidroxi-etilcsoport vagy egy természetes vagy szintetikus aminosav alfa-szénatomjához kapcsolódó szubsztituens (ideértve hidrogénatomot is); és

Xj_ -COOR^, -CJ^OR^q vagy (c) általános képletű csoort, ahol

R? és R_1q jelentése megegyezik a fent megadottakkal,

R^4 hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkilcsoport,

R^5 hidorgénatom, 1-3 szénatomos alkil-, fenil- vagy

7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport, és

R^6 hidrogénatom vagy hidroxicsoport, azzal a fenntartással, hogy ha R^2 jelentése -CH(R^^)-X^ általános képletű csoport, akkor ^R11 3^el^ent®^se hidrogénatom vagy metilcsoport;

B, D és E maradékok L-konfigurációjuak és á 2. és 7. helyzetű aminosav maradékok, valamint ha Υ_χ és Y₂ a (4) általános képletü csoportok, úgy ezek egymástól függetlenül D- vagy L-konfigurációjuak.

Az (I) általános képletű vegyületek esetében az A és

A' csoportokat célszerűen úgy választjuk meg, hogy avegyület a kelátképző csoport kapcsolására képes terminális iminocsoportot tartalmazzon.

Az (I) általános képletű vegyületek esetében a különböző csoportok jelentése önmagában vagy kombinációban előnyösen a következő lehet:

1. A jelentése 7-10 szénatomos fenil-alkil-, különösen fenil-etil-csoport, vagy RCO- általános képletű csoport. Előnyös, ha A RCO- általános képletű csoportot jelent.

1.1. R előnyösen 1-11 szénatomos alkil- vagy 7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport, különösen 7-10 szénatomos fenil-alkil-csoport, még előnyösebben 2-fenil-etil-csoport lehet, vagy RCOjelentése az a), b) vagy c) pontokban megadott.

1.2. Ha RCO- jelentése az a), b) vagy c) pontokban megadott, úgy az a) és b) pontok szerinti alfa-aminosav maradék aminocsoportja, vagy a c) pont szerinti dipeptid maradék terminális aminocsoportja előnyösen alkilezetlen vagy 1-12 szénatomos alkil-, különösen 1-8 szénatomos alkil-, előnyösen metilcsoporttal monoalkilezett. Legelőnyösebb, ha a terminális aminocsoport alkilezetlen.

1.3. Ha RCO- Jelentése a) pont szerinti, úgy ez előnyösen a') vagy L- vagy D-fenilalanin vagy -tirozin maradék, amelynek aminocsoportja adott esetben 1-12 szénatomos alkilcsoporttal van helyettesítve. Előnyösebb, ha a') L- vagy D-fenilalanin maradék.

• · .

• · • · · • · · · · · • · · · « ·

1.4. Ha RCO- jelentése b) vagy c) pont szerinti, úgy a csoport előnyösen lipofil. Előnyös b) pont szerinti cso portok lehetnek eszerint b’) szénhidrogén-oldalláncú, például három, előnyösen négy vagy több, például hét szénatomos alkilcsoport-oldalláncu, naftil-metil- vagy heteroaril-oldalláncu, mint a 3-(2- vagy 1-naftil)-alanin maradék vagy piridil-metil-oldalláncu alfa-aminosavak maradékai, vagy a triptofán maradék, amelyek mind lehetnek L- vagy D-konfigurációjuak. Előnyösek a c) pont szerinti olyan dipeptid maradékok, amelyek alkotó aminosavai lehetnek azonosak vagy különbözőek, és például az a') és b') szerinti aminosavak bármelyike; például a c) pont szerinti aminosav maradék lehet 3-(2-naftil)-alanin maradék.

1.5. RCO- jelentése legelőnyösebben a), különösen a') pont szerinti aminosav maradék.

2.

jelentése

B' ahol fenilalanin vagy tirozin maradéka.

3.

jelentése

C' ahol

C'

4.

jelentése

D' ahol

D'

D-triptofán maradék.

\ lizin, metil-lizin vagy (epszilon-metil)-lizin, különösen lizin maradéka.

5.

E jelentése E', ahol

E' valin vagy treonin, különösen treonin maradéka.

6. G jelentés G', ahol G' (a) általános képletű csoport, különösen (d) általános képletű csoport, amely esetben R^ hidrogénatom vagy metilcsoport lehet. Az utóbbi esetben a -CHÍR^J-X^ általános képletű csoport L-konfigurációju.

6.1. R^ előnyösen hidrogénatomot jelent.

6.2. Egy természetes [például ^N-CH(R.^ )-COOH általános • · · · • · • · · képletű] aminosav ^-szénatomjához kapcsolódó szubsztituensként előnyösen hidroxi-metil-, 1-hidroxi-etil-, izobutil-, butil-, 2-hidroxi-etil- vagy 3-hidroxi-propilcsoportot jelent. Különösen előnyös, ha R^^ hidroxi-metil- vagy 1-hidroxi-etilcsoportot jelent.

6.3. jelentése előnyösen (c) vagy -CI^-ÖRiq általános képletű csoport, különösen -CH^-OR^g általános képletű csoport, ahol R_1q jelentése előnyösen hidrogénatom. Legelőnyösebb, ha R^q hidrogénatomot jelent.

Az alábbi képletek néhány jellemző, (I) általános képletű vegyületet mutatnak be:

ι1

H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (más néven oktreotid) ι | (D)Phe-Cys-Thr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH₂

I--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1ι (D)Phe-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-TrpNH₂ ι | (D)Trp-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂

I!

(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂ ι -|

3-(2-. naftil)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH₂ l---------------------------------------------------------------------1

3-(2-1 naftil)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-3-Nal-NH₂ ι------------------------—I

3-(2- naftil)-(D)Ala-Cys-3-Nal-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH₂ ι1 (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-B-Nal-NH₂ • · · ·

Β. A (II) és (III) képlettel ábrázolt szomatosztatin-analógok.

A (II) képletű szomatosztatin-analógot Vale és munkatársai [Metabolism, 27, Supp. 1, 139 (1978)] írták le, a (III) képletű vegyületet a 200188 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés tárgya. Hivatkozásaink kiterjednek az összes idézett közleményekben található vegyületekre is.

Különösen előnyösek azok a ligandumok, amelyek a ι π

H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol képletű vegyületből származtathatók.

Megfelelő kelátképző csoportok azok, amelyek fiziológiásán elviselhetők, és képesek egy kimutatható elem atomjainak komplex alakjában való megkötésére. A kelátképző csoportok előnyösen hidrofil jellegűek. Alkalmas kelátképző csoportok lehetnek például az imino-dikarboxil- vagy a poliamino-polikarboxilcsoportok, továbbá a nem ciklikus kelátképző vegyületekből, például az e tiLén-diamin-tetraecetsavból (EDTA), a dietilén-triamin-pentaecetsavból (DIPA), az etilénglikol-0,0'-bisz(2-amino-etil)-N,N,N'-tetraecetsavból (EGTA), az N,N'-bisz(hidroxi-benzil)-etilén-diamin-Ν,Ν'-diecetsavból (HBED) vagy a trietilén-tetramin-hexaecetsavból (TTHA) származtatható csoportok, továbbá a szubsztituált EDTA-ból vagy DTPA-ból [például a (p-izotiocianato-benzil)-EDTA-ból vagy DTPA-ból] levezethető csoportok, makrociklusos ligandumokból, például 1,4,7,10-tetraazaciklododekán-N,N',N,N'-tetraecetsavból (DOTA), 1,4,8,11-tetraazaciklotetradekán-N,N',N,N'-tetra• » · · ·· ··» · « · • ······ · • * ···· · · ··· ··* · _ ··· ···· ecetsavból (TETA), olyan N- vagy C-szubsztituált makrociklusos aminokból (beleértve ciklámokat, azaz tetraazaciklotetradekánokat is) mint amilyeneket az EP 304780 Al és a WO 89/01476-A szabadalmi leírások közölnek, származtatható csoportok, valamint a (IV) és (V) általános képletű csoportokból - amely képletekben

R^, R₂ és egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkil-,

6-8 szénatomos aril- vagy 7-9 szénatomos aril-alkilcsoportok, melyek adott esetben hidroxil-, 1-4 szénatomos alkoxi-, karboxi- vagy szulfonil-csoporttal lehetnek szubsztituálva;

n' lehet 1 vagy 2;

i lehet 2 és 6 között bármely egész szám; és

TT jelentése egymástól függetlenül alfa- vagy béta-aminosavakból álló peptidlánc származtatható csoportok, továbbá (VI) általános képletű bisz-amino-tiolszármazékokból, - a képletben

^R22 és R₂₃ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;

a peptid terminális aminocsoportjával reagálni képes csoport; és m' jelentése 2 vagy 3 levezethető csoportok, (VII) általános képletű ditio-szemikarbazon-származékokból - a képletben

X₂ jelentése megegyezik a fent megadottal levezethető csoportok, (VIII) általános képletű propilén-amin

-oxim-származékokból - a képletben ♦ *··

^24' ^25' ^26' ^R27' ^R28 ®^{s R}29 ΙθΙθΗ^θθθ egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;

X£ és m' jelentése pedig megegyezik a fent megadottakkal levezethető csoportok, (IX) általános képletű diamid-dimerkaptid-származékokból - a képletben

X^ jelentése divalens, adott esetben szubsztituált és a peptid terminális aminocsoportjával kapcsolódni képes csoportot hordozó csoport, például olyan 1-4 szénatomos alkilén- vagy feniléncsoport, amely egy jelentésű csoportot hordoz; és hidrogénatom vagy -CC^R^q általános képletű csoport, ahol

R₃₀ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport levezethető csoportok vagy olyan porfirinszármazékokból, például N-benzil-5,10,15,20-tetrakisz-(4-karboxi-fenil)-porfirinből (vagy TPP-ből) levezethető csoportok, amelyek egy jelentésű csoportot is hordoznak.

Az arilcsoport jelentése előnyösen fenilcsoport, az aril-alkilcsoport jelentése előnyösen benzilcsoport.

Az X2 csoportra példaként ~ (^χ4)_η··^—Χ5 általános képletű csoportok említhetők, amelyekben X^ jelentése 1-6 szénatomos alkiléncsoport, amely adott esetben egy oxigénatomon vagy iminocsoporton keresztül kapcsolódhat a szénatomhoz, n lehet 0 vagy 1, és X,. lehet izotiocianáto- vagy karboxilcsoport, valamint az utóbbi származékai, például savhalogenid, savanhidrid vagy savhidrazid. Magától értetődik, hogy X2 a -(^2)1^- vagy • · · ····<*· ·» ·· 4 · · · • »··»·· *

-, · · ··»· · · ··· ·♦· · *«· ···· =CH-CH= csoportok egyik szénatomjához, az egyik hidrogénatom helyére kapcsolódik.

A kelátképző csoport a szomatosztatin-peptid terminális aminocsoportjához közvetlenül vagy közvetve kapcsolódhat. Ha közvetve kapcsolódik, úgy ez előnyösen egy áthidaló vagy térkitöltő csoporton keresztül történhet, például egy Z-R^^-COáltalános képletű csoporton keresztül, ahol

R35 jelentése 1-11 szénatomos alkilén-, 2-11 szénatomos alkeniléncsoport vagy -CH(R')- általános képletű csoport, ahol R' egy természetes vagy szintetikus alfa-aminosav alfa-szénatomjáhz kapcsolódó csoport, például hidrogénatom, 1-11 szénatomos alkil-, benzil-, adott esetben szubsztituált benzil-, naftil-metil- vagy piridil-metilcsoport;

Z pedig olyan funkciós csoport, amely képes kovalensen kapcsolódni a kelátképző csoporthoz, például egy észter-, éter- vagy amidkötést képezve; előnyösen Z jelentése aminocsoport.

Ha a kelátképző csoport karboxil-,- szulfonil- és/vagy aminocsoportot tartalmaz, úgy lehet szabad vagy só formában.

Előnyösen használható kelátképző csoportok a poliamino-polikarboxil-származékok, tehát azok, amelyek az EDTA, DTPA, DOTA, TETA vagy a szubsztituált EDTA vagy DTPA származékai. Különösen előnyösek a DTPA-ból származtatott kelátképző csoportok.

«·3· ··

A találmány szerinti ligandumokban előfordulhatnak polifunkciós kelátképző csoportok is, amelyek vagy egy egyszerre egynél több, például két szomatosztatin-peptidmolekulához kapcsolódhatnak.

A találmány szerinti ligandumok létezhetnek szabad alakban vagy sók formájában. A sók egyrészt addiciós jellegű, szerves, polimer vagy szervetlen savakkal képzett sók, például hidrokloridok vagy acetátok lehetnek, másrészt a kelátképző csoportban lévő karboxil- vagy szulfonilcsoportok alkálifém-, például nátrium- vagy káliumsói, vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan ammóniumsói.

A találmány tárgyát képezi a ligandumok előállításának eljárása is.

Az eljárás ismert eljárásokhoz hasonló módon valósítható meg az alábbiak szerint:

a) egy kelátképző csoportot hordozó szomatosztatin-peptidről legalább egy védőcsoportot eltávolítunk; vagy

b) összekapcsolunk két peptid-fragmentumot, amelyek mindegyike legalább egy, védett vagy nem védett aminosavat vagy aminoalkoholt tartalmaz és az egyik egy kelátképző csoportot is hordoz; a kapcsolást peptidkötésen keresztül hozzuk létre úgy, hogy a kivánt aminosav-szekvenciát kapjuk; végül szükséges esetben végrehajtjuk az a) lépést is; vagy

c) összekapcsolunk egy kelátképző vegyületet egy védett vagy nem védett szomatosztatin-peptiddel úgy, hogy a kelátképző vegyűlet a peptid kivánt aminocsoportjához kapcsolódjon, majd szükséges esetben végrehajtjuk az a) lépést is; vagy « · « ···» ·· ·· «· · w · ·

4 4 4 »4» 4

4 4444 4 * ··· «·« 4 444 4444

d) egy védett vagy nem védett, kelátképző csoportot hordozó szomatosztatin-peptidet egy másik, védett vagy nem védett, kelátképző csoportot hordozó peptiddé alakítunk át egy funkciós csoport eltávolítása vagy más funkciós csoporttá való átalakítása utján, majd szükséges esetben végrehajtjuk az a) lépést is; vagy

e) egy kelátképző csoporttal módosított szomatosztatin-peptidet, amelyben a cisztein maradékok merkaptocsoportjai szabad formában vannak, olyan analóggá oxidálunk, amelyben két cisztein maradék egy diszulfid-hidon át kapcsolódik;

és az igy kapott ligandumokat szabad alakban vagy só formájában kinyerjük.

A fenti reakciók (különösen az a) és c) lépések) ismert eljárások analógiájára hajthatók végre. Ha a kelátképző csoport peptidkötéssel kapcsolódik, úgy azt a peptidkötések kialakítására szolgáló módszerekkel hozhatjuk létre. Ha a reakcióban védőcsoportot használunk, az lehet bármilyen, a peptidkémiában szokásosan használt, az adott reakcióban részt nem vevő csoport, ide értve a funkcionális csoportokkal rendelkező műgyantákat is.

Ha a kelátképző csoportot egy olyan peptid vagy peptidfragmentum terminális aminocsoportjához kívánjuk kapcsolni, amelynek aminosav-oldalláncain is találhatók aminocsoportok, úgy az utóbbi amnocsoportokat a peptidkémiában használt bármilyen védőcsoporttal védeni kell. Ugyanezt kell tenni a peptid vagy peptid-fragmentum terminális aminocsoportjával, ha a kelátképző csoportot egy oldalláncban lévő aminocsoporthoz kívánjuk kapcsolni.

• «

A b) lépés végrehajtásához szükséges peptid-fragmentumok előállítása a c) lépés szerint vitelezhető ki.

A (IV) vagy (V) általános képletű kelátképző csoportoknak a peptidlánchoz való kapcsolása a (IV') vagy (V') általános képletű vegyületeken keresztül valósítható meg, ahol X amidkötés kialakítására képes reaktív csoportot jelent. A reakció a 247866 Al számú európai szabadalmi leírás szerint hajtható végre.

A c) lépésben alkalmazott kelátképző vegyületek ismertek vagy ismert módon előállithatók. E vegyületeknek olyanoknak kell lenniük, hogy lehetővé tegyék a kívánt kelátképző csoportoknak a szomatosztatin-peptidhez való kapcsolását, azaz - mint fentebb leírtuk - poliamino-polikarboxilszármazékok, illetve azok sói vagy anhidridjei lehetnek.

Ha a fenti lépésekben kiindulási vegyületeknek olyan aminosavakat, peptid-fragmentumokat vagy peptideket használunk, amelyekhez a kelátképző csoport a korábban leirt Z-R^-COáltalános képletű áthidaló vagy térkitöltő csoporton keresztük kapcsolódik, úgy ezeket a kiindulási vegyületeket a szokásos módon, például az aminosavaknak, peptid-fragmentumoknak vagy peptideknek egy Z-R^^-COOH általános képletű savval vagy egy reaktív savszármazékkal, például egy aktiv észterrel való reagáltafásával állíthatjuk elő. Az aktiv észterképző vagy más néven karboxil-aktiváló csoportokra példák a 4-nitro-fenil-, a pentaklór-fenil-, a pentafluor-fenil-, a szukcinimido- vagy az 1-hidroxi-benzotriazolilcsoport. Alternatív megoldásként a kelátképző vegyületet előbb az áthidaló vagy térkitöltő csoportot tartalmazó vegyülettel reagáltatjuk, majd az igy kapott vegyületet a szokásos módon kapcsoljuk a pepiidhez, peptid-fragmentumhoz vagy aminosavhoz.

A találmány szerinti ligandumok szokásos módon, például kromatográfiás módszerekkel tisztithatók. A tisztított ligandumok előnyösen kevesebb, mint 5 tömeg%, kelátképző csoportot nem hordozó peptidet tartalmaznak.

A találmány szerinti ligandumok akár szabad formában, akár sók alakjában önmagukban is értékes vegyületek. A találmány tárgyának egy további megvalósítása, ha a ligandumokból és egy kimutatható fém atomjaiból komplexet képezünk. A találmány tárgyához tartoznak tehát a találmány szerinti ligandumokból készült komplexek, - a továbbiakban kelátok -, az azok előállítására szolgáló eljárás, valamint a kelátok alkalmazásán alapuló in vivő diagnosztikai és terápiás eljárások.

A kimutatható elem kifejezés alatt bármely elemet, előnyösen azonban olyan fémionokat értünk, amelyek valamely tulajdonságuk alapján in vivő kimutathatók. Ilyen fémionok azok, amelyek kimutatható sugárzást emittálnak vagy magmágneses rezonancia-vizsgálatokra alkalmasak.

Alkalmas kimutatható elemek lehetnek azok a nehézfémek és ritkaföldfém-ionok, amelyeket a számitógépes-tomográfiás vizsgálatokban használnak; a paramágneses ionok, például Gd³⁺, Fe³⁺ vagy Cr²⁺;a fluoreszkáló fémionok, például az Eu³⁺; a radioaktív-, például alfa-, béta-, gamma- vagy pozitron-su6 8 gárzó izotópok, például a Ga.

• ·

A gamma-sugárzó izotópok közül mindazok használhatók, amelyeket más diagnosztikai eljárásokban is alkalmaznak.

A gamma-sugárzó izotópok felezési ideje 1 óra és 40 nap, előnyösen 5 óra és 4 nap, különösen előnyösen 12 óra és 3 nap között lehet. Ilyen izotópjai vannak a galliumnak, indiumnak, technéciumnak, itterbiumnak, réniumnak és talliumnak, mint η 67^, 111_T 99m_ 169„, 186„ , .

például a Ga, In, Te, Yb vagy Re. Az izotópot előnyösen a ligandum vagy az alapjául fehasznált szomatosztatin-peptid metabolizmusától függően választhatjuk meg; igen előnyösek azok a ligandumok, amelyek esetében az izotóp felezési ideje hosszabb, mint a szomatosztatin-peptidé a tumorsejtek felszínén.

A pozitron-sugárzó izotópok közül a már említettek a megfelelő.

Felezési idejük előnyösen 2,3 óra és 14,3 nap, még előnyösebben

2,3 és 100 óra között lehet. Az izotópot célszerű úgy megválasztani, hogy felezési ideje hosszabb legyen, mint a szomato sztatin-peptidé a tumorsejteken.

Megfelelő alfa-sugárzó izotópokat is a terápiás célokra

211 használtak közül választhatunk; ilyenek például a At vagy

A találmány szerinti kelátok a ligandumoknak a kimutatható elemek ionjaival való reakciója, célszerűen sóképzés ut • · · • · · « ján állíthatók elő. Az igy előállított sók előnyösen vízben jól oldhatók. A reakció ismert módon hatjható végre /Perrin: Organic Ligand, Chem. Data Series 22., Pergamon Press (1982); Krejcarit és Tucker, Biophys. Biochem. Rés. Com., 77, 581 (1977); Wagner és Welch, J. Nucl. Med., 20, 428 (1979)7·

A ligandumok komplexszé alakítását előnyösen azon a pH-η végezzük, amelyen a ligandum fiziológiásán stabilis.

Alternatív megoldásként a kimutatható elem ionjait egy átmeneti kelátképző vegyülettel képzett komplex formájában is oldatba vihetjük. Az átmeneti komplex termodinamikai stabilitásának kisebbnek kell lennie az adott pH mellett, mint a találmány szerinti kelátnak, igy a fémion ligandumot cserélhet. Átmeneti komplexképző vegyületként használható például a 4,5-dihidroxi-1,3-benzol-diszulfonsav (Tiron).

A találmány szerinti kelátok előállithatók úgy is, hogy a kimutatható elem ionjaival képzett komplex alakjában jelenlévő kelátképző csoportot kapcsoljuk össze a védett vagy nem védett alakban jelenlévő szórnatosztatin-peptiddel, majd a védőcsoport(ok)at leválasztjuk a vegyületről.Ugyanígy járhatunk el akkor is, ha a kelátképző csoport egy nem kimutatható fém ionjaival képzett komplexként van jelen, amikor is az előállítás utolsó tépése a fémionoknak egy kimutatható elem ionjaira való kicserélése lehet.

Egy további előállítási mód az, amikor a komplexként jelenlévő kelátképző csoportot egy peptid-fragmentummal kapcsoljuk össze, majd a szórnatosztatin-peptidet lépésenként építjük fel a korábban ismertetett módon. Ugyanezt megvalósíthatjuk egy nem kimutatható fémiont tartalmazó komplexszel is, amikor az utolsó lépés a fémionok kicserélése lesz.

Ha a kelátképző csoport a fent leirt áthidaló csoporton át kapcsolódik a peptidlánchoz, úgy az áthidaló csoportot a kapcsolódás előtt akár a peptidlánc, akár a kelátképző csoport hordozhatja.

A fent leirt reakciók ismert módon vitelezhetők ki. A kelátképző csoporttól függően a jelzettség foka elérheti a 100 %-ot, ami feleslegessé teszi a további tisztítást. Az olyan radioaktív izotópok, mint például a technécium-99m, oxiθ θ τπ dált formában, például Tc-pertechnát alakjában használhatók és redukáló körülmények között vihetők komplexbe.

Az említett reakciókat szokásos módon olyan körülmények között hajtjuk végre, hogy kizárjuk a nyomelemekkel való szenynyeződést: előnyösen ionmentesitett vizet, ultratiszta vegyszereket és 100%-os jelzettségű izotópokat használunk.

A találmány szerinti kelátok lehetnek szabad formájuak vagy sók; a sók megegyeznek a találmány szerinti ligandumok lehetséges sóival.

A találmány szerinti kelátok és gyógyszerként használható sóik egyrészt a szomatosztatin-receptorokat hordozó tumorok és áttételeik kimutatására használhatók, ha bennük a fémion paramágneses, gamma- vagy pozitron-sugárzó, másrészt az ilyen tumorok kezelésére használhatók, ha bennük a fémion alfa- vagy béta-sugárzó.

• · · ·

A találmány szerinti kelátok affinitását a tumorsejtek szomatosztatin-receptoraihoz az in vitro kötődés vizsgálatával lehet kimutatni.

Emberi emésztőrendszerből eltávolított, szomatosztatin-receptort hordozó tumort azonnal jég közé helyeztünk és 30 percen belül -80°C-on megfagyasztottuk. A fagyott szövetből Leitz 1720 kriosztáttal 10 /im-es metszeteket készítettünk, amiket tárgylemezre helyezve három napig -20°C-on tartottunk, hogy az üveglaphoz tapadásukat fokozzuk. Ezután a metszeteket 2 mmol kalcium-kloridot és 5 mmol kálium-kloridot tartalmazó 50 mmolos tris-HCl pufferben (pH=7,4) 10 percen át szobahőmérsékleten előinkubáltuk, majd kétszer két percen át ugyanilyen, de a sókat nem tartalmazó pufferrel mostuk. A találmány szerinti kelátokat 170 mmolos tris-HCl pufferben (pH=7,4) oldottuk, ami 10 g/1 marha szérum-albumint, 40 mg/1 bacitracint és az endogén proteázok gátlása érdekében 5 mmol magnézium-kloridot is tartalmazott, majd a metszeteket két órán át ebben inkubáltuk szobahőmérsékleten. Az aspecifikus kötődés meghatározása a megfelelő, nem jelölt és módosítatlan szórnatosztatin-peptiddel történt, amit 1 pmois koncentrációban használtunk. Az inkubált metszeteket öt pecig mostuk hideg inkubációs pufferrel, ami 0,25 g/1 marha szérum-albumint tartalmazott. ^Ε9Υ gyors desztillált vizes öblítés után a metszeteket hirtelen megszáritottuk és / H_7-LKB filmre helyeztük röntgen-kazettákban. Egy hetes expozíció után a filmeket előhívtuk, és azt találtuk, hogy a találmány szerinti kelátok - ebben az esetben • · ♦ radioaktív izotópot hordozó kelátok - igen jó eredményt mutatnak, mert szelektíven megjelölték a tumorsejteket anélkül, hogy a környező egészséges sejtekhez kötődtek volna, ha kon-10 -3 centrációjuk az inkubációs pufferben 10 -10 mól között volt.

A találmány szerinti kelátok affinitását a szomatosztatin-receptorokhoz in vivő is megvizsgáltuk. Beültetett hasnyálmirigy-tumort hordozó patkányok farokvénájába injekcióztuk a kelátot, majd az állatot egy gamma-detektor alá helyezve követtük a radioaktivitás eloszlását. Az élőben végzett vizsgálat után az állatokat megöltük, és a szerveik radioaktivitását külön is megmértük. 0,1-2,0 mCi radioaktivitást hordozó 1-5 /i/kg keláttal végezve a vizsgálatot azt találtuk, hogy mind a tumorok, mind a kiválasztószervek (ahol a kelát kiválasztódott) jól kimutathatók voltak.

A fentieknek megfelelően a találmány tárgyához tartozó eljárásoknak számos megvalósítási lehetőségük van, amelyek a következők:

1. Eljárás szórnatosztatin-receptort hordozó tumorok és áttételek in vivő kimutatására betegekben. A diagnosztikai eljárás két lépésből áll: a) a találmány szerinti kelát bejuttatása a beteg szervezetbe és b) a kelátot megkötni képes receptorok szervezetbeli elhelyezkedésének kimutatása.

Az in vivő diagnosztikai eljárásban felhasználható kelátok gamma- vagy pozitron-sugárzó, esetleg paramágneses fémionokkal képezett komplexek.

Az 1. eljárás kivitelezéséhez a találmány szerinti kelá • · · tokát parenterálisan, előnyösen intravénásán, injektálható oldat vagy szuszpenzió alakjában, előnyösen egyetlen injekcióval juttatjuk a vizsgált személy szervezetébe. A dózis megválasztása számos tényezőtől, igy a ligandum és a kimutatható fémion milyenségétől is függ; megfelelő az a dózis, amely a szokásos detekciós módszerekkel (például fotoscanning) jól értékelhető képet ad. Radioaktív izotóppal jelölt kelátok esetében a 0,1-50 mCi, előnyösen a 0,1-30 mCi, még előnyösebben a 0,1-20 mCi összaktivitásu dózis felel meg a fenti követelményeknek. Ilyen mértékű összaktivitást gamma-sugárzó izotópok esetében 1-200 pg ligandum hordozhat, ami 0,1-50 mCi, előnyösen 0,1-30 mCi, például 3-15 mCi Összaktivitásu fémionnal van jelölve.

A specifikus aktivitás az izotóp milyenségétől függ: indium esetében az alacsonyabb, technécium esetében a magasabb értékek az előnyösebbek.

A kelát feldusulását a tumorszövetben bármilyen, a radiológiában általában használt eljárással illetve berendezéssel kimutathatjuk, igy álló vagy körmozgó gamma-kamerákkal - előnyösen számitógépes képfeldolgozással -, pozitron emissziós tomográfiával (PÉT) vagy számitógépes tomográfiával (CAT).

A találmány szerinti kelátok a szervezetből a veséken át ürülnek ki és nem halmozódnak fel a májban.

2. Eljárás a szórnatosztatin-receptort hordozó tumorok és áttételek in vivő kezelésére. Az ilyen kezelésre szoruló betegek szervezetébe a találmány szerinti kelátoknak terápiásán hatékony mennyiségét juttatjuk.

• ·

Az in vivő kezelés céljára felhasználható kelátok alfavagy béta-sugárzó fémionokkal képzett komplexek.

A találmány szerinti kelátok terápiásán hatékony dózisa természetesen több tényezőtől, igy a tumor méretétől, a kelát minőségétől, azaz a tumorszövetben mutatott felezési idejétől, valamint a terápia céljától is függ. Célszerűen a dózist a radioaktivitásnak a szervezet és a tumorszövet között mérhető megoszlása alapján lehet kiszámítani. A megfelelő dózis a 0,1-3,0 mCi/testtömeg kg/nap határ-ok között van, például 1,0-3,0 mCi, előnyösen 1,0-1,5 mCi/testtömeg kg/nap. Ezt az összaktivitást 1-200 pg ligandum hordozhatja, amit szokásos módon, napi négy egyenlő részletben juttatunk a beteg szervezetébe.

Az alfa- vagy béta-sugárzó kelátok bármely szokásos módon, elsősorban páréntérálisan adagolhatók, például injektálható oldat vagy szuszpendzió formájában. Előnyös az infúzióban, 30-60 percen keresztül történő adagolás. A tumor elhelyezkedésétől függően, ahhoz a lehető legközelebb történjen az adagolás, például katéter segítségével. Az adagolás módjának megválasztása a kelát disszociációs fokától és a kiürülés sebességétől is függhet.

A találmány szerinti kelátok használhatók szabad alakban vagy farmakológiailag elfogadható sóik formájában. Ezek a sók ismert módon állíthatók elő és a szabad vegyülettel azonos specifikus aktivitásuak. A kelátok, különösen a radioaktivitással jelzett kelátok előnyösen közvetlenül az adagolás előtt készíthetők el.

A találmány szerinti kelátok a rosszindulatú daganatok számos formájának, például az agyalapi mirigy, a hasnyálmirigy és az emésztőcsatorna, a központi idegrendszer, az emlők, a dülmirigy, a petefészek vagy a vastagbél daganatainak, az aprósejtes tüdőkarcinómának, a paragangliómáknak, a pajzsmirigy-karcinómának, a mielomáknak, valamint ezek áttételeinek kimutatására és gyógyítására használhatók.

A találmány szerinti eljárás egy további megvalósítási módja, amikor egy gamma-sugárzó kelátot a vesék működésének vizsgálatára használunk.

Öt egérnek egyenként 0,1 ml térfogatban 1 mCi radioaktivitást hordozó kelátot adtunk be intravénásán, majd az állatok vizeletét felfogtuk. 10 és 120 perc múlva az állatokat kloroformmal narkotizáltuk, a húgyvezetékeiket lekötöttük és a veséket szokásos módon, gamma-kamerával vizsgáltuk. 0,1-30 mCi összaktivitás értékek között ez a technika jó minőségű képet adott a kiválasztórendszerről.

A módszer használható a veseműködés in vivő vizsgálatára is, ha a vizsgált személy szervezetébe megfelelő mennyiségű gamma-sugárzó kelátot injekciózunk és a vesék működését gammadetektorral folyamatosan követjük.

A találmány tárgyához tartoznak továbbá azok a gyógyszerkészítmények, amelyek szabad alakban vagy farmakológiai szempontból elfogadható sók formájában, farmakológiai szempontból elfogadható hordozó vagy oldószerekkel együtt tartalmaz zák • · · · • · ·«· · · · • ······ · • · ···· · · «·· ·«♦ · ··· ····

1. a találmány szerinti ligandumokat, vagy a

2. találmány szerinti kelátokat.

Az ilyen gyógyszerkészítmények a szokásos eljárásokkal állíthatók elő. Forgalomba hozataluk történhet külön csomagolásban, ami a ligandumot, valamint a kelát elkészítéséhez és használatához szükséges Írott utasítást tartalmazza, de történhet ikercsomagolásban is, ahol a ligandum mellett a kelát elkészítéséhez szükséges fémionok is jelen vannak. A hordozóvagy oldószer kiszerelése célszerűen adagolási egységekben történhet.

A következő példákban a találmány szerinti ligandumok előállítását mutatjuk be. A megadott [d] -értékek (optikai

D forgatóképesség) korrigálatlanok. A példákban használt rövidítések a következők: Boc = terc-butoxi-karbonil;

TFA - trifluor-ecetsav;

DTPA = dietilén-triamin-pentaacetil, ill.

-ecetsav

Fmoc = (9-fluorenil-metoxi)-karbonil

1. példa

DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol előállítása

1,1 g (1 mmol) (D) Pne-Cys-Phe- (D) Trp- (epszilon-Boc) Ly s-Thr-Cys-Thr-ol szabad bázist 1 dioxán:viz =1:1 tf. arányú elegyben oldunk és 5 g nátrium-hidrogén-karbonáttal reagáltatunk. Állandó keverés közben 520 mg DTPÁ-dianhídridet adagolunk az elegyhez, 30 percig keverjük, majd fagyasztva szárítjuk. A maradékot 250 ml vízben feloldjuk, az oldat pH-ját 2,5-re állít • ·· · * · ·· ·· · · • · · · · · · juk be tömény sósavval. A kicsapódott terméket szűréssel kinyerjük, mossuk és foszfor-pentoxid fölött megszáritjuk. Szilikagél oszlopon történt elválasztás után két terméket kapunk: 230 mg DTPA-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-(epszilon-Boc)Lys-Thr—Cys-Thr-ol monomér peptidet és 500 mg DTPA-/(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-(epszilon-Boc)Lys-Thr-Cys-Thr-ol7₂ megfelelő dimér peptidet.

A monomér peptid 200 mg-ját 3 ml TFA-ban oldjuk, majd 5 perc szobahőmérsékleten való állás után diizopropil-éterrel kicsapjuk, szűrjük, és a csapadékot megszáritjuk. Duolit ioncserélővel történő sótalanitás és liofilizálás után a kívánt termék 150 mg-ját kapjuk.

O A [c/J - -26,6° (C= 1; 95%-os etanol) .

d

A kiindulási vegyületet a következő módon lehet előállítani:

I--------—--------------------1

a) H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(Boc)-Thr-Cys-Thr-ol

100 ml dimetil-formamidban feloldott 10 g H-(D)Phe|------------------------------------------------------------------------------------------------1

-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ol-acetáthoz cseppenként hozzáadunk 30 ml dimetil-formamidban oldott 2,25 g di-terc-butil-dikarbonátot szobahőmérsékleten. További két óra után az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot 200 ml diizopropil-éterben oldjuk. A keletkezett csapadékot szűrővel kinyerjük, diizopropil-éterrel mossuk és megszáritjuk. A nyersterméket szilikagél oszlopon tisztítjuk (az eluens diklór-metán:metanol= 9:1 elegye); a kívánt termék fehér por.

[<*]^ = 29,8° (c = 1,28; dimetil-formamid) .

D ·*·· ·♦ ·· ··· * ·· ······ « • ····· ·· ··· ··· · ··· ···*

2. példa

DTPA-(DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol)^ előállítása '* Az 1. példa szerint előállított dimér peptidről az 1.

példa a) pontja szerint eltávolitva a Boc védőcsoportot, a kívánt vegyületet kapjuk.

[ο<]2θ = -24,5° )c=0,55; 95%-os etanol).

3. példa ι ι

H₂ N- ( CHa} 5-CO-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol előállítása

a) 0,56 g H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-(Boc)Lys-Thr-Cys-Thr-ol peptidet, 0,5 mmol Fmoc-epszilon-amino-kapronsavat és 115 mg hidroxi-benzotriazolt oldunk 10 ml dimetil-formamidban és -30°C-ra hütjük. Az oldathoz 5 ml dimetil-formamidban oldott 115 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk, engedjük szobahőmérsékletre melegedni, és 24 órán át állni hagyjuk. A csapadék alakjában megjelenő diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, a szűrletet tízszeres térfogatra hígítjuk. A kicsapódott terméket szűréssel kinyerjük, mossuk, és foszforpentoxid fölött megszáritjuk, majd további tisztítás nélkül használjuk fel a következő lépésben.

b) Az Fmoc csoport lehasitása

Az a) lépés szerint nyert termék 0,5 g-ját 5 ml dimetil-f ormamid:piperidin = 4:1 térfogatarányu keverékében feloldjuk, szobahőmérsékleten 10 percig keverjük, majd hozzáadunk 100 ml diizopropil-étert. A kicsapódott terméket szűréssel kinyerjük, mossuk és szárítjuk, majd további tisztítás nélkül használjuk fel.

···· «·

c) A Boc-csoport lehasitása

A b) lépésben kapott termék 300 mg-ját feloldjuk 5 ml TFA-ban, 5 percig keverjük, majd 50 ml diizopropil-étert adunk hozzá. 2 ml dietil-éteres sósavoldat hozzáadása után a termék kicsapódik; kiszűrjük, mossuk és vákuumban szárítjuk.

A terméket először szilikagél oszlopon kromatográfiával (eluensként kloroform:metanol:viz:etanol= 7:3:0,5:0,5 térfogatarányú keverékkel), majd Duolit oszlopon való sómentesitéssel (grádiens= viz:etanol= 95:5 - viz:dioxán:etanol= 45:50:5) tisztítjuk. Liofilizálás után a kívánt termék (acetát alakjában) fehér por.

[<Χ]2θ = -32° (c= 0,5; 95%-os etanol).

D

A kapott terméket a DTPA-val az 1. vagy 2. példában megadott módon reagáltathatjuk.

4. példa

DTPA-(béta)Alá-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol előállítása

A kívánt ligandumot az 1. és 3. példában leirt módon állítjuk elő.

[ο<]2θ = -14,8° (c=0,5; 95%-os etanol).

5. példa

111 z F-——————————<

In izotóppal jelölt DTPA-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol kelát előállítása mg DTPA-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol peptidet 5 ml 0,01 molos ecetsav oldatban feloldunk, az oldatot 0,22 jum-es Millex-GV szűrőn szűrjük, és 0,1 ml-es adagokra • ««t • 9 ·· « · · ♦ • · e * · «9 · • · ···· · * ·*· 99» · 999 9999 osztva -20°C-on tároljuk. A ^^InCl^-oldatot (Amersham, mCi/100 /11) 0,5 molos nátrium-acetát oldattal azonos térfogatúra hígítjuk, majd a jelölést a ligandum és az InCl^-oldat szobahőmérsékleten történő elegyítésével végezzük el. A kapott kelát-oldatot végül HEPES pufferrel (pH = 7,4) 10 θ mól koncentrációjúra hígítjuk.

6. példa ⁹°Y izotóppal jelölt DTPA-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol kelát előállítása

A ⁹θΥ izotópot egy ⁹θδΓ-⁹θΥ izotópgenerátorral állítjuk elő [Chinol és Hnatowich, J. Nucl. Med., 28, 1465-1470

Q Λ ‘ (1987)]. Az 1,0 mCi összaffinitásu Y izotópot 50 ul steril

0,5 molos ecetsav-oldatban adjuk az 5 ml 0,01 molos ecetsav-oldatban feloldott 1 mg ligandumhoz, majd az elegyet 30 perc-1 óra időtartamra állni hagyjuk szobahőmérsékleten, hogy a kelátképződés maximálisan végbemenjen.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás szomatosztatin-peptidek - amely peptidek leg- alább egy, valamely kimutatható elem atomjait komplexként megkötni képes kelátképző csoportot hordoznak, amely kelátképző csoportok a peptidek egy aminocsoportjához közvetlenül vagy közvetve kapcsolódnak és amely aminocsoportnak nincs kimutatható szerepe a peptidek szomatosztatin-receptor iránti affinitásában - valamint ezen peptidek sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy kelátképző csoportot hordozó szomatosztatin-peptidről legalább egy védőcsoportot eltávolítunk; vagy

b) összekapcsolunk két peptid-fragmentumot, amelyek mindegyike legalább egy, védett vagy nem védett aminosavat vagy aminoalkoholt tartalmaz és az egyik egy kelátképző csoportot is hordoz; a kapcsolást peptidkötésen keresztül hozzuk létre úgy, hogy a kívánt aminosav-szekvenciát kapjuk; végül szükséges esetben végrehajtjuk az a) lépést is; vagy

c) összekapcsolunk egy kelátképző vegyületet egy védett vagy nem védett szomatosztatin-peptiddel úgy, hogy a kelátképző vegyület a peptid kívánt aminocsoportjához kapcsolódjon, majd szükséges esetben végrehajtjuk az a) lépést is; vagy

d) egy védett vagy nem védett, kelátképző csoportot hordozó szomatosztatin-peptidet egy másik, védett vagy nem védett, kelátképző csoportot hordozó peptiddé alakítunk át egy funkciós csoport eltávolítása vagy más funkciós csoporttá való átalakítása utján, majd szükséges esetben végrehajtjuk az a) lépést is; vagy • · · ·

e) θζίΥ kelatképző csoporttal módosított szomatosztatin-

-peptidet, amelyben a cisztein maradékok merkaptocsoportjai szabad formában vannak, olyan analóggá oxidálunk, amelyben két cisztein maradék egy diszulfid-hidon át kapcsolódik;

és az igy kapott ligandumokat szabad alakban vagy só formájában kinyerjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy ahol a kelátképző csoport közvetve kapcsolódik a peptidlánchoz, ott ez egy Z-R^-CO- általános képletű áthidaló csoporton keresztül történik a képletben

R3,- 1-11 szénatomos ’alkilén-, 2-11 szénatomos alkenilénvagy -CH(R')-csoport, ahol R' egy természetes vagy szintetikus alfa-aminosav oldallánca,

Z pedig olyan funkciós csoport lehet, amely képes kovalensen kapcsolódni a kelátképző csoporthoz amely csoportot egy ilyen csoportot még nem hordozó peptidhez vagy peptid-fragmentumhoz kapcsolunk, majd ezután egy kelátképző csoporthoz, majd az igy módosított, védett vagy védőcsoportot nem hordozó peptid-fragmentumokat úgy kapcsoljuk össze, hogy a kelátképző csoport a peptid kívánt aminocsoportján helyezkedjen el, végül szükséges esetben legalább egy védőcsoportot eltávolítunk a pepiidről.

• · · ·
3· A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kelátképző csoportot tartalmazó vegyületet először egy áthidaló vagy térkitöltő csoportot tartalmazó vegyülettel reagáltatjuk, majd az igy módosított kelátképző csoportot kapcsoljuk a védett vagy védőcsoportot nem tartalmazó pepiiddel.
4. az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a szomatosztatin-peptid egy (I) általános képletü vegyület - a képletben

A 1-12 szénatomos alkil-, 7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport vagy olyan RCO- általános képletű csoport, ahol

i) R hidrogénatom, 1-11 szénatomos alkil-, fenil- vagy

7-10 szénatomos fenil-alkil-csoport; vagy ii) RCO-

a) L- vagy D-fenilalanin maradék, adott esetben a gyűrűben szubsztituálva fluor-, k’lór- vagy brómatommal, nitro-, amino-, hidroxi-, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal;

b) egy természetes vagy szintetikus alfa-aminosav maradéka, ami eltér az a) alatt meghatározottól, vagy egy megfelelő D-aminosav maradéka; vagy

c) egy dipeptid maradék, amelyben az aminosavak lehetnek azonosak vagy különbözőek és megfelelnek az a) és/vagy b) alatt meghatározottaknak, és ahol az a) vagy b) szerinti aminosav maradékok alfa-aminocsoportja vagy a c) szerinti dipeptid maradékok terminális aminocsoportja adott esetben egysezresen vagy kétszeresen • · · • · · · ··· ··· · ··· ·*··

3 5 helyettesítve lehet 1-12 szénatomos alkilcsoporttal, vagy 1-8 szénatomos alkanoil-csoporttal lehet szubsztituálva;

A' hidrogénatom, 1-12 szénatomos alkil- vagy 7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport;

és jelenthetnek együtt egy közvetlen kötést, vagy jelentésük egymástól függetlenül hidrogénatom vagy az (1), (2), (3), (4) vagy (5) általános képletű csoportok bármelyike, amelyekben

R_a metil- vagy etilcsoportot,

Rb hidrogénatomot, metil- vagy etilcsoportot,

R_c 1-6 szénatomos alkilcsoportot, a természetes vagy szintetikus aminosav alfa-szénatomjához csatlakozó csoportot (ami lehet hidrogénatom is) ,

R_e 1-5 szénatomos alkilcsoportot,

R_a, és Rfc, egymástól függetlenül hidrogénatomot, metil- vagy etilcsoportot,

Rg és Rg egymástól függetlenül hidrogén- vagy halogénatomot,

1-3 szénatomos alkil- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoportot jelenthet, és m = 1, 2, 3 vagy 4, n = 1, 2, 3, 4 vagy 5,

P =0 vagy 1, q =0 vagy 1, és r = 0, 1 vagy 2 lehet;

B adott esetben a fenilgyürün halogénatommal, nitro-, amino-, hidroxi-, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált fenilalanin maradék (beleértve a pentafluor-fenil-alanint is), vagy béta-naftil-alanin maradék;

C L- vagy D-triptofán maradék, amely adott esetben az alfa-nitrogénatomon metilcsoporttal vagy a benzolgyürün halogénatommal, nitro-, amino-, hidroxi-, 1-3 szénatomos alkil és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal lehet helyettesítve ;

D lizinmaradék, az oldalláncon béta-helyzetben oxigénvagy kénatomot tartalmazó lizinmaradék, gamma- vagy delta-fluor-lizin maradék, adott esetben az alfa-nitrogénatomon metilcsoporttal helyettesítve, vagy lehet (4-amino-ciklohexil)-alanin maradék vagy (4-amino-ciklohexil)-glicin maradék;

E treonin, szerin, valin, fenilalanin, izoleucin, amino-izovajsav vagy amino-vajsav maradéka;

G az (a), (b), -COOR? vagy -CH2OR^q általános képletű csoportok valamelyike, ahol

R_7 hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkilcsoport,

R^g hidrogénatom vagy fiziológiásán elfogadható, in vivő hidrolizálni képes észtercsoport,

R.^ hidrogénatom, 1-3 szénatomos alkil-, fehil- vagy

7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport,

R^2 hidrogénatom, 1-3 szénatomos alkilcsoport vagy általános képletű csoport, ahol

R₁₃ hidroxi-metil-, 2-hidroxi-etil-, 3-hidroxi-propilvagy 1-hidroxi-etilcsoport vagy egy természetes vagy szintetikus aminosav alfa-szénatomjához kapcsolódó szubsztituens (ideértve hidrogénatomot is); és -COOR.?, -Ct^OR^Q vagy (c) általános képletű csoort, ahol

R? és R^g jelentése megegyezik a fent megadottakkal,

R₁₄ hidrogénatom vagy 1-3 szénatomos alkilcsoport,

R^₅ hidorgénatom, 1-3 szénatomos alkil-, fenil- vagy

7-10 szénatomos fenil-alkilcsoport, és

R^g hidrogénatom vagy hidroxicsoport, azzal a fenntartással, hogy ha R12 jelentése -CH(R^₃)-X^ általános képletű csoport, akkor ^R11 Ó^elentése hidrogénatom vagy metilcsoport;

B, D és E maradékok L-konfigurációjuak és'a 2. és 7. helyzetű aminosav maradékok, valamint ha és Y₂ a (4) általános képletü csoportok, úgy ezek egymástól függetlenül D- vagy L-konfigurációjuak.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kelátképző csoport egy imino-dikarboxilvagy egy poliamino-polikarboxilsav, egy makrociklusos aminszármazék vagy a (IV) vagy (V) általános képletű csoportok valamelyike - a képletben ^R1 ' ^R2 θ’^{3 R}3 egymástól függetlenül lehetnek 1-6 szénatomos alkil-, 6-8 szénatomos aril- vagy 7-9 szénatomos aril• · · · • · · · · • · · · • · · ·

-alkilcsoportok, adott esetben bármelyik helyettesítve lehet hidroxil-, 1-4 szénatomos alkoxikarboxilvagy szulfonilcsoporttal, n' lehet 1 vagy 2 lehet 2 és 6 között bármely egész szám, peptidláncot, egy peptidkötés kialakítására képes reaktív csoportot jelent továbbá bisz-amino-tiol-, ditia-szemikarbazon-, propilén-amin-oxim-, diamid-dimerkaptid- vagy porfirinszármazék lehet, szabad alakban vagy sók formájában.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kelátképző csoport az etilén-dimain-tetraecetsav (EDTA), a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA), az etilén-glikol-0,0'-bisz(2-aminoetil)-Ν,Ν,Ν',N'-tetraecetsav (EGTA), az N,N'-bisz(hidroxi-benzil)-etiléndiamin-N,N'-diecetsav (HBED), a trietilén-tetramin-hexaecetsav (TTHA), a szubsztituált EDTAvagy DTPA-, az 1,4,7,10-tetra-aza-ciklodekán-N,N',N,N’-tetraecetsav (DOTA) vagy az 1,4,8,ll-tetra-aza-ciklotetradekán-N,N',N,N' -tetraecetsav (TETA) származéka, szábdd alakban vagy sók formájában.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a szomatosztatin-peptidnek egy kimutatható elem atomjaival képzett komplexét állítjuk elő.

···· ····
8. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kimutatható elem atomjai alfa-, béta- vagy gamma-sugárzó radioaktív atomok.