FI102540B - Kelatoivan ryhmän sisältäviä somatostatiinipeptidijohdannaisia diagnos tista käyttöä varten - Google Patents

Description

102540

KELATOIVAN RYHMÄN SISÄLTÄVIÄ SOMATOSTATIINIPEPTIDIJOHDANNAISIA DIAGNOSTISTA KÄYTTÖÄ VARTEN

Keksintö koskee polypeptidjohdannaisia, menetelmää niiden valmistamiseksi, niiden käyttöä diagnos-5 tisina aineina ja niitä sisältäviä diagnoosipakkauk- sia.

Parin viime vuoden aikana on osoitettu, että suuri määrä somatostatiinireseptoreita esiintyy suuressa määrässä ihmisen kasvaimia, esim. aivolisäkkeen 10 kasvaimissa, keskushermoston kasvaimissa, rintakasvai-missa, maha-suolihaimakasvaimissa ja niiden metastaaseissa. Jotkut niistä ovat pieniä tai hidaskasvuisia kasvannaisia, joita on vaikea täsmällisesti paikallistaa tavanomaisin diagnostisin menetelmin.

15 Somatostatiinireseptoreiden havainnollistami nen in vitro on tehty kasvainkudoksen autoradiografi-alla käyttäen radiojodattua somatostatiinia tai soma-tostatiinianalogeja, esim. [125I-Tyru] somatostatiini-14 (Taylor, J.E. et. ai., Life Science (1988) 43: 20 421), tai [125I-Tyr3] SMS 201-995 sanotaan myös [125I] 204-090 (Reubi, J.C. et. ai., Brain Res. (1987) 406: 891; Reubi, J.C. et. ai., J. Clin. Endocr. Metab.

(1987) 65: 1127; Reubi, J.C. et. ai., Cancer Res.

(1987) 47: 551; Reubi, J.C. et. ai., Cancer Res.

25 (1987) 47: 5758) .

Julkaisuissa GB 2 109 407, EP-patenttihake- muksissa 35765, 38546, 103049, 174853, 233619, 238196, FI-patenttijulkaisussa 81263 ja US-patenttijulkaisussa 4 287 362 on esitetty terapeuttiseen tai diagnostiseen 30 käyttöön tarkoitettuja konjugaatteja, joissa aktiivi-" j seen aineeseen on liitetty kelatoiva ryhmä, johon on puolestaan liitetty sopiva osoitettavissa oleva alkuaine. Julkaisuissa aktiivisena aineena on esitetty proteiini, esim. ihmisen seerumialbumiini, vasta-aine, 35 kuten karsinoembryoantigeenin (CEA) vastainen vasta-aine, tai vasta-aineen fragmentti, antibiootti, hormo- 2 102540 ni, sakkaridi, rasvahappo jne. Julkaisussa EP 248506 on kuvattu menetelmä metalli-ionin liittämiseksi proteiiniin tai polypeptidiin. Menetelmässä metalli-ioni liitetään ko. aktiiviseen aineeseen kelatoivan ryhmän 5 välityksellä. Esimerkkeinä esitetään vasta-aineita, polypeptideistä on vain yleinen maininta.

Ko. julkaisuille on yhteistä, että niissä esitetyt proteiinit, vasta-aineet, entsyymit jne. ovat suuria molekyylejä, joilla on suuri molekyylipaino, ja 10 ne sisältävät lukuisia reaktiivisia sivuketjuja, joita voidaan käyttää kelatoivan ryhmän liitoskohtana, esim. amino-, karboksi-, SH-ryhmiä jne. Nämä ryhmät ovat jakautuneena satunnaisesti kaikkialle proteiinin tms. rakenteessa. Reaktio esim. proteiinin ja kelatoivan 15 aineen välillä tuottaa yleensä satunnaisesti substitu-oituneen proteiinin. Tällöin on epäselvää, mihin kela-toivat ryhmät ovat liittyneet ja kuinka monta kelatoi-vaa ryhmää on liittynyt yhteen molekyyliin. Satunnaisesta substituutiosta johtuen leimatuilla proteiineil-20 la ja vasta-aineilla on monia epäkohtia: niiden huono homogeenisuus ja toistettavuus aiheuttaa ongelmia, niiden puhdistus on ongelmallista, niiltä puuttuu herkkyys pienikokoisille kasvaimille, vasta-aineen kyky sitoutua antigeeniin alenee jne.

25 Uusia somatostatiinipeptideja, jotka ovat : käyttökelpoisia diagnostisina aineina ja joita voidaan merkitä in vivo diagnostiikkaa varten, on nyt keksitty.

Keksinnön mukaisesti tuodaan esille somatos-30 tatiinipeptidi, jossa on vähintään yksi osoitettavissa . olevan alkuaineen kanssa kelatoiva ryhmä, tämä kela- toiva ryhmä on sidottu mainitun peptidin aminoryhmään, ja tällä aminoryhmällä ei ole merkittävää sitoutumis-affiniteettia somatostatiinireseptoreihin.

35 Näihin yhdisteisiin viitataan tämän jälkeen keksinnön mukaisina ligandeina. Ne omaavat yhden kelatoivan ryhmän, joka voi reagoida osoitettavissa olevan 3 102540 alkuaineen kanssa, esim. radionuklidin, röntgensäteitä läpäisemättömän alkuaineen tai paramagneettisen ionin kanssa, muodostaakseen kompleksin ja voivat lisäksi sitoutua somatostatiinireseptoreihin, jotka ovat esim.

5 kasvaimien tai metastaasien ilmentämiä tai yli-ilmentämiä.

Kelatoiva ryhmä on sidottu kovalentilla sidoksella peptidin aminoryhmään.

Kelatoiva ryhmä on edullisesti sidottu soma-10 tostatiinipeptidin terminaaliseen N-aminoryhmään.

Keksinnön mukaisesti kelatoiva ryhmä voi olla sidottu joko suoraan tai epäsuorasti, esim. tilaa vievän ryhmän avulla, somatostatiinipeptidin aminoryhmään .

15 Yksi ligandiryhmä on sellainen, jossa kela toiva ryhmä on sidottu suoraan somatostatiinipeptidin aminoryhmään.

Toinen ligandiryhmä on sellainen, jossa kelatoiva ryhmä on sidottu epäsuorasti siltasidoksella tai 20 tilaa vievällä ryhmällä somatostatiinipeptidin aminoryhmään.

Edullisesti kelatoiva ryhmä on sidottu amidi-sidoksella peptidiin.

Termi somatostatiinipeptidi tarkoittaa luon-25 nossa esiintyvää somatostatiinia (tetradekapeptidi) ja : sen analogeja tai johdannaisia.

Johdannaisilla tai analogeilla, kuten tässä termejä käytetään, tarkoitetaan jokaista suoraketjuis-ta tai syklistä polypeptidia, joka on johdettu luon-30 nossa esiintyvästä tetradekapeptidista somatostatii-nista, jossa yksi tai useampi aminohappoyksikkö on poistettu ja/tai korvattu yhdellä tai useammalla toisella aminohapporadikaalilla ja/tai jossa yksi tai useampi funktionaalinen ryhmä on korvattu yhdellä tai 35 useammalla funktionaalisella ryhmällä ja/tai yksi tai useampi ryhmä on korvattu yhdellä tai useammalla muulla isosteerisellä ryhmällä. Tavallisesti termi kattaa 4 102540 biologisesti aktiivisen peptidin kaikki modifioidut johdannaiset, jotka osoittavat kvalitatiivisesti samanlaisen tehon kun ei-modifioitu somatostatiinipepti-di, esim. ne sitoutuvat somatostatiinireseptoreihin ja 5 vähentävät hormonieritystä.

Sykliset, sillotetut sykliset ja suoraketjui-set somatostatiinianalogiset yhdisteet ovat tunnettuja yhdisteitä. Tällaisia yhdisteitä ja niiden valmistusta selostetaan esim. patenttijulkaisuissa EP-A-1295; 10 29,579; 215,171; 203,031; 214,872; 298,732; 277,419.

Edullisia keksinnön mukaisia ligandeja ovat sellaiset, joita on johdettu seuraavista somatostatii-nianalogeista: 15 A. Kaavan I mukaisia analogeja CHz-S-Yi Y2-S-CH2 I I (I)

RCO-NH-CH-CO-B-C-Lys-E-NH-CH-G

20 jossa RCO- on a) L- tai D-fenyylialaniinitähde, johon on mahdollisesti rengassubstituoitu F, Cl, Br, 25 N02, NH2, OH, C1_3alkyyli ja/tai C1.3alkoksi, • - - tai D-Trp tai 3-(2-naftyyli)-D-Ala

Yj. ja Y2 ovat yhdessä suora sidos tai Y1 ja Y2 ovat toisistaan riippumatta vety 30 B on -Phe-, johon on valinnaisesti rengas substituoitu halogeeni, N02, NH2, OH, C1.3alkyyli ja/tai C1.3alkoksi (mukaan lukien pentafluorialaniini) tai B-naftyyli-Ala, 35 C on (L)-Trp- tai (D)-Trp-, 5 102540 E on Thr, Ser, Vai, Phe tai Ile G on ryhmä, jolla on kaava 5 -CON<^ R12 jossa 10 Rn on vety tai Ci^alkyyli, r12 on vety, Ci_3alkyyli tai ryhmä, jolla on kaava - CH (R13) - Xi, R13 on CH2OH, -(CH2)2-OH, -(CH2)3-OH, -CH(CH3)OH, isobutyyli tai butyyli tai on Trp:n tai β-15 Nairn α-hiiliatomiin liittynyt substituentti, X-l on ryhmä, jolla on kaava -CH2OR10 tai - CONR14R35, jossa 20 Rio on vety tai fysiologisesti hyväksyttävän, fysiologisesti hydrolysoituvan esterin tähde r14 on vety tai Ci_3alkyyli ja r15 on vety tai Ci-3alkyyli, 25 ehdolla, että i kun Ri2 on -CH(Ri3)-Xi, niin Rn on vety tai metyyli, jolloin tähteet B ja E ovat L-konfiguraatiossa ja 2-ja 7-asemassa olevat tähteet ovat kukin toisistaan 30 riippumatta (L)- tai (D)-konfiguraatiossa.

Kaavan I mukaisissa yhdisteissä seuraavat merkitykset ovat edullisia joko kukin erikseen tai jokainen yhdistelmänä tai alayhdistelmänä: 1.1. RCO on edullisesti a'), L- tai D-fenyylialaniini 3 5 tai - tyros iini tähde, valinnaisesti mono-N-Ci_12alky-loitu. Edullisimmin a') on L- tai D-fenyylialaniini-tähde.

β 102540 1.2. RCO on α-aminohappotähde, jossa on hiilivetysivu-ketju, esim. alkyyli, jossa on 3, edullisemmin 4, tai useampia C-atomeja, esim. 7 C-atomia, naftyyli-metyyli tai heteroaryyli, esim. 3-(2- tai 1-naftyyli)-alanii- 5 ni, pyridyyli-metyyli- tai tryptofaanitähde ja mainitut tähteet ovat L- tai D-konfiguraatiossa.

1.3. Edullisimmin RCO on a) erityisesti a')· 2. B on B', jossa B' on Phe tai Tyr.

3. C on C, jossa C on (D)Trp.

10 4. E on E', jossa E’ on Vai tai Thr, erityisesti

Thr.

5. G on G', jossa G' on ryhmä jolla on kaava -CO-N^ , erityisesti ryhmä, jolla on kaava 15 ^Ri2 -CO-N<^ ^CH(R13)-X! (jolloin Ru = H tai CH3) . Viimemainitussa tapauksessa 20 ryhmä -CH(R13)-X1 on sopivasti L-konfiguraatiossa.

5.1. RX1 on sopivasti vety.

5.2. Koska substituentti, joka on sidottu luonnollisen aminohapon (so kaava H2N-CH (R13)-COOH) a-hiiliatomiin, R13 on sopivasti -CH2OH, -CH(CH3)-OH, isobutyyli tai 25 butyyli tai R13 on -(CH2)2-OH tai -(CH2)3-OH. Erityises-* ti se on -CH2OH tai -CH(CH3)OH.

5.3. X3 on erityisesti, ryhmä, jolla on kaava -CO-N^ 30 . tai -CH2-OR10, erityisesti kaava -CH2-OR10, ja R10 on sopivasti vety tai tarkoittaa samaa kuin kohdassa 7 alla. Edullisimmin R10 on vety.

Seuraavat yksittäiset yhdisteet kuvaavat kaa-35 van I mukaisia yhdisteitä: i i H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 7 102540 tunnetaan myös nimellä oktreotidi

I I

(D)Phe-Cys-Thr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2 I-1 5 (D)Phe-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-TrpNH2 I-1 (D)Trp-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH2 I-1 10 (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH2 I-1 3-(2-Naftyyli)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2 I-1 15 3-(2-Naftyyli)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-β-

Nal-NH2 I-1 3-(2-Naftyyli)-(D)Ala-Cys-fi-Nal-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2 20 ,-1 (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-B-Nal-NH2 B. Kaavan II mukaisia analogeja I-1

25 H-Cys-Phe-Phe-(D)-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-ol II

[kts. Vale et. ai., Metabolism, 27, Supp, 1, 139, (1978)] I-1 H-Cys-His-His-Phe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-

30 OH III

(kts. EP-A-200,188)

Kaikkien edellä esitettyjen julkaisujen sisältö mukaanlukien, määritellyt yhdisteet sisällytetään tähän viitteenä.

35 Erityisen edullisia ovat ligandit, joita joh detaan 8 102540

I I

H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-olista.

Sopivia kelatoivia ryhmiä ovat fysiologisesti hyväksyttävät kelatoivat ryhmät, jotka voivat muodos-5 taa kompleksin todettavissa olevan alkuaineen kanssa. Edullisesti kelatoivalla ryhmällä on olennaisesti hyd-rofiilinen luonne. Esimerkkeihin kelatoivista ryhmistä sisältyvät esim. iminodikarboksyyliset ryhmät, poly-aminopolykarboksyyliset ryhmät, esim. sellaiset, joita 10 on johdettu ei-syklisistä ligandeista esim. etyleeni-diaminitetraetikkahappo (EDTA), dietyleenitriamiini-pentaetikkahappo (DTPA), etyleeniglykoli-O,0'-bis(2-aminoetyyli)-N,N,N',N'-tetraetikkahappo (EGTA), N,N'- bis(hydroksibentsyyli)etyleenidiamiini-N,N'dietikka-15 happo (HBED) ja trietyleenitetra-amiiniheksaetikka-happo (TTHA), sellaisia, joita on johdettu substituoi-dusta EDTA tai -DTPA :sta, esim. p-isotiosyanato-bentsyyli-EDTA tai -DTPA sellaisia, joita on johdettu makrosyklisistä ligandeista, esim. 1,4,7,10-tetra-20 atsasyklododedekani-Ν,Ν',N'',N'''-tetraetikkahappo (DOTA) ja 1,4,8,11-tetra-atsasyklotetradekani- Ν,Ν',Ν'', N'''-tetraetikkahappo (TETA), ja sellaisia N-substituoiduista tai C-substituoiduista makrosyklisistä amiineista mukaanlukien syklaamit johdettuja, esim. 25 kuten julkaisuissa EP 304,780 AI ja WO 89/01476-A kuvataan, kaavan IV tai V mukaiset ryhmät O 0 0.

Il H II

30 Ri-C-S- (CH2) n.-C- (TT) i-C- (IV) 35 9 102540

O O

Il II

R2-C-S- (CH2)n,-C-NH-CH20 O

Il 5 (V) R3-C-S- (CH2) n,-C-Nff il n o o 10 jossa kukin R3, R2 ja R3 toisistaan riippumatta on Ci.galkyyli, C6_8aryyli tai C7_9aryylialkyyli, jokainen valinnaisesti substituoitu substituentilla OH, C1_4al-koksi, COOH tai S03H, n' on 1 tai 2, 15 i on kokonaisluku 2-6, ja TT ovat toisistaan riippumatta a tai β aminohappoja sidottuja toisiinsa amidisidoksilla, ryhmiä, joita on johdettu bis-aminotiolijohdannai-20 sista, esim. kaavan VI mukaiset yhdisteet ÄH <VI> 25 *2Γ< n / SH HS s23 20 jossa jokainen R20' R21/ R22 js R23 toisistaan riippumatta on 30 vety tai C1.4alkyyli, - . X2 on ryhmä, joka pystyy reagoimaan peptidin N- aminoryhmän kanssa, ja m' on 2 - 3, 35 ryhmiä, joita on johdettu ditiasemikarbatsonijohdannaisista, esim. kaavan VII mukaiset yhdisteet 10 102540 f* /τ\ 5 Α ° ΗΝ ΝΗ 1 Λ; (νιι) ΗΝ^ SH HS ΝΗ jossa 10 Χ2 tarkoittaa samaa kuin edellä, ryhmiä, joita johdetaan propyleniamiinioksiimijohdannaisista, esim. kaavan VIII mukaiset yhdisteet 15 A ch23?^

ΗΝ NH

20 R24 | ^

OH OH

jossa jokainen R24, R25, R26' R27^ R2e 3a R29 toisistaan riippumatta on vety tai C1_4alkyyli ja 25 X2 ja m' tarkoittavat samaa kuin edellä, ryhmiä, joita on johdettu diamididimerkaptideista, esim. kaavan IX mukaiset yhdisteet 30 ΗΝ NH n

Y

"5 I I

35 H5CgC0 COCgH- (IX) 11 102540 jossa X3 on divalentti radikaali, joka on valinnaisesti substituoitu ja jossa on ryhmä, joka voi reagoida peptidin N-aminoryhmän kanssa, esim. C1_4alkyleeni tai 5 fenyleeni, jossa on ryhmä X2, ja Y5 on vety tai CO2R30, jossa R30 on C1_4alkyyli, tai ryhmiä, jotka saadaan johdettua porfyriineista, esim. N-bentsyyli-5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksi- 10 fenyyli)porfiini tai TPP, jossa on ryhmä X2, joka on määritelty kuten edellä.

Aryyli on edullisesti fenyyli. Aralkyyli on edullisesti bentsyyli.

Esimerkit ryhmistä X2 sisältävät radikaaleja, 15 joilla on kaava -(X4)n..-X5, jossa X4 on C^alkyleeni; tai Cx.galkyleeni, joka on valinnaisesti sidottu hiiliatomiin happiatomilla tai -NH-, n' ' on O tai 1 ja X5 on -NCS, karboksiryhmä tai tämän funktionaalinen johdannainen, esim. happohalidi, anhydridi tai hydratsi-20 di. On selvää, että X2 on sidottu yhteen hiiliatomiin -[CH2]m.- tai =CH-CH= korvaamalla yksi vetyatomi.

Kelatoiva ryhmä voi olla sitoutunut joko suoraan tai epäsuorasti somatostatiinipeptidin N-aminoryhmään. Kun se on sidottu epäsuorasti, se on 25 sopivasti sidottu siltasidoksen kautta tai tilaa vie-* vän ryhmän kautta, esimerkiksi kaavan (ai) mukaisen ryhmän kautta.

Z-r35-CO- (ai) R35 on Cx-nalkyleeni, C2.11alkenyleeni tai CH(R')~, 30 jossa R' on jäännös, joka on sidottu a- hii leen luonnolliseen tai synteettiseen a-aminohappoon, esim. vety, C^nalkyyli, bentsyyli, valinnaisesti substituoitu bentsyyli, naftyyli-metyyli, pyridyylimetyyli, 35 Z on funktionaalinen ryhmä, joka voi reagoida kovalenttisesti kelatoivan aineen kanssa.

12 102540 Z voi esimerkiksi olla ryhmä, joka voi muodostaa kelatoivan ryhmän kanssa eetteri-, esteri- tai amidisidoksen. Z on edullisesti amino.

Kelatoiva ryhmä, kun se sisältää karboksi-, 5 -SO3H- ja/tai aminoryhmiä, voi olla vapaassa tai suolan muodossa.

Edullisia kelatoivia ryhmiä ovat sellaiset, joita johdetaan polyamino-polykarboksyyliryhmistä, esim. sellaiset, joita johdetaan ryhmistä EDTA, DTPA, 10 DOTA, TETA tai substituoidusta EDTA tai DTPA. Suosi tuimpia ovat DTPArsta johdetut kelatoivat ryhmät.

Keksinnön mukaisissa ligandeissa kelatoiva ryhmä, kun se on polyfunktionaalinen, voi olla sidottuna joko yhteen somatostatiinipeptidimolekyyliin tai 15 useampaan kuin yhteen somatostatiinipeptidimolekyy- liin, esim. kahteen somatostatiinipeptidimolekyyliin.

Keksinnön mukaiset ligandit voivat olla vapaassa tai suolan muodossa. Suolat tarkoittavat hap-poadditiosuoloja, esim. orgaanisten happojen, polymee-20 risten happojen tai epäorgaanisten happojen kanssa, esim. hydrokloridit ja asetaatit, sekä suolamuotoja, joita saadaan karboksyyli- tai sulfonihapporyhmien kanssa, jotka ovat läsnä kelatoivassa ryhmässä, esim. alkalimetallisuolat, kuten natrium- tai kalium-, tai 25 substituoidut tai substituoimattomat ammoniumsuolat.

Esillä oleva keksintö koskee myös keksinnön mukaisten ligandien valmistusmenetelmää. Niitä voidaan valmistaa analogisesti tunnettujen menetelmien mukaan.

Keksinnönmukaisia ligandeja voidaan valmistaa 30 esim. seuraavasti: : a) poistamalla ainakin yksi suojaava ryhmä, joka on läsnä somatostatiinipeptidissa, jossa on kelatoiva ryhmä, tai b) sitomalla yhteen amidisidoksella kaksi peptidif-35 ragmenttia, jotka kumpikin sisältävät ainakin yhden aminohapon tai aminoalkoholin suojatussa tai suojaamattomassa muodossa ja toinen näistä sisältää kelatoi- 13 102540 van ryhmän, jossa amidisidos on sellainen, että toivottu aminohapposekvenssi saadaan, ja valinnaisesti toteuttamalla sen jälkeen vaihe a), tai c) sitomalla yhteen kelatoiva aine ja toivottu soma-5 tostatiinipeptidi suojatussa tai suojaamattomassa muodossa sellaisella tavalla, että kelatoiva ryhmä kiinnittyy peptidin toivottuun N-aminoryhmään, ja valinnaisesti toteuttamalla sen jälkeen vaihe a), tai d) poistamalla funktionaalinen ryhmä suojaamattomas-10 ta tai suojatusta peptidistä, jossa on kelatoiva ryhmä, tai muuntamalla se toiseksi funktionaaliseksi ryhmäksi niin, että saadaan toinen suojaamaton tai suojattu peptidi, jossa on kelatoiva ryhmä, ja toteuttamalla viimeksi mainitussa tapauksessa vaihe a), tai 15 e) hapettamalla somatostatiinipeptidi, joka on modifioitu kelatoivalla ryhmällä, jossa merkaptoryhmät Cys-radikaaleissa ovat vapaassa muodossa niin, että muodostuu analogi, jossa kaksi Cys-radikaalia liittyvät S-S-sillan kautta, ja regeneroimalla näin saatu 20 ligandi vapaassa muodossa tai suolan muodossa.

Edellä esitetyt reaktiot voidaan tehdä analogisesti tunnettujen menetelmien kanssa, esim. kuten seuraavissa esimerkeissä selostetaan, erityisesti menetelmät a) ja c). Kun kelatoiva ryhmä on sidottu ami-25 disidoksella, tämä voidaan tehdä analogisesti menetel-· millä, joita käytetään amidin valmistukseen. Halutta essa näissä reaktioissa voidaan käyttää suojaavia ryhmiä jotka ovat sopivia käytettäväksi peptidien kanssa tai toivotuissa kelatoivissa ryhmissä funktionaalisina 30 ryhminä, jotka eivät ota osaa reaktioon. Termi suojaa-; va ryhmä käsittää myös polymeerihartsin, jossa on funktionaalisia ryhmiä.

Haluttaessa sitoa kelatoiva ryhmä peptidin terminaali N-aminoryhmään tai peptidifragmenttiin, 35 jota käytetään lähtöaineena ja joka sisältää yhden tai useamman aminoryhmän sivuketjussa, nämä sivuketjuami- 14 102540 noryhmät suojataan tavanomaisesti suojaavalla ryhmällä, esim. kuten peptidikemiassa käytetään.

Haluttaessa sitoa kelatoiva ryhmä peptidin sivuketjun aminoryhmään tai peptidifragmenttiin, jota 5 käytetään lähtöaineena, ja peptidi sisältää vapaan terminaalisen N-aminoryhmän, viimeksi mainittu suojataan tavallisesti suojaavalla ryhmällä.

Peptidifragmentti, jossa on kelatoiva ryhmä ja jota käytetään vaiheessa b) voidaan valmistaa saat-10 tamalla peptidifragmentti, joka sisältää ainakin yhden aminohapon tai aminoalkoholin suojatussa tai suojaamattomassa muodossa, reagoimaan kelatoivan aineen kanssa. Reaktio voidaan suorittaa analogisesti vaiheen c) kanssa.

15 Kaavojen IV tai V mukaiset kelatoivat ryhmät voidaan sitoa peptidiin saattamalla kaavojen IV tai V mukaiset kelatoivat aineet, O 0 0

Il II II

20 R1-C-S-(CH2)n.-C-(TT)i-C-X (IV) o o

Il H

R2-C-S-(CH2)n.-C-NH-CH2 O

25 \ « (V)

R3-C-S- (CH2) n. -C-NTT

Il I

o o 30 jossa X on aktivoiva ryhmä, joka voi muodostaa amidi-sidoksen, reagoimaan peptidin N-aminoryhmän kanssa. Reaktio voidaan suorittaa kuten julkaisussa EP 247,866 AI kuvataan.

Vaiheessa c) käytetty kelatoiva aine voi olla 35 ennestään tunnettu tai voidaan valmistaa ennestään tunnettujen menetelmien mukaan. Käytetty yhdiste on sellainen, että se sallii toivotun kelatoivan ryhmän 15 102540 viemisen somatostatiinipeptidiin, esim. polyaminopoly-karboksyylihappo, kuten on selostettu, tämän suola tai anhydridi.

Yllä olevassa menetelmässä, jos aminohapois-5 sa, peptidifragmenteissa tai peptideissä, joita käytetään lähtöaineina, kelatoiva ryhmä on siltasidoksen tai tilaa vievän ryhmän kautta sidottu peptidiin, esim. kaavan (ai) mukainen radikaali, kuten edellä on määritelty, tällaiset aminohapot, peptidifragmentit 10 tai peptidit voidaan valmistaa saattamalla vastaavat aminohapot tai peptidit, joissa ei ole silta- tai tilaa vievää ryhmää, reagoimaan tavanomaisella tavalla vastaavan siltaa muodostavan tai tilaa vievän yhdisteen kanssa, esimerkiksi hapon tai reaktiivisen happo-15 johdannaisen kanssa, joka sisältää silta- tai tilaa vievän ryhmän, esim. kaavan Z-R35-COOH mukainen happo tai tämän reaktiivinen happojohdannainen, kuten aktiivinen esteri. Esimerkkejä aktiivisista esteristä tai karboksia aktivoivista ryhmistä ovat esim. 4-20 nitrofenyyli, pentaklorifenyyli, pentafluorifenyyli, sukkiinimidyyli tai 1-hydroksi-bentsotriatsolyyli.

Vaihtoehtoisesti kelatoiva aine voidaan ensin saattaa reagoimaan sillan muodostavan tai tilaa vievän ryhmän omaavan aineen kanssa, jotta siihen saadaan 25 sillan muodostava tai tilaa vievä ryhmä, ja tämän jäl-keen se saatetaan reagoimaan tavanomaisella tavalla peptidin, peptidifragmentin tai aminohapon kanssa.

Keksinnön mukaiset ligandit voidaan puhdistaa tavanomaisella tavalla, esim. kromatograafisesti. 30 Edullisesti keksinnön mukaiset ligandit sisältävät vähemmän kuin 5 p-% peptidejä, joissa ei ole kelatoi-via ryhmiä.

Keksinnön mukaiset ligandit vapaassa muodossa tai fysiologisesti hyväksyttävien suolojen muodossa 35 ovat arvokkaita yhdisteitä. Toisen suoritusesimerkin mukaan keksinnön mukaiset ligandit voivat muodostaa kompleksin osoitettavissa olevan alkuaineen kanssa.

16 102540 Täten esillä oleva keksintö tuo myös esille keksinnön mukaiset ligandit, kuten edellä on määritelty, jotka muodostavat komplekseja osoitettavissa olevan alkuaineen kanssa (tämän jälkeen näihin viitataan 5 keksinnön mukaisina kelaatteina), vapaassa muodossa tai suolan muodossa, niiden valmistuksen sekä niiden käytön in vivo diagnostisiin tarkoituksiin.

Osoitettavissa olevalla alkuaineella tarkoitetaan jokaista alkuainetta, edullisesti metalli-10 ionia, joka osoittaa jonkin ominaisuuden, joka on osoitettavissa in vivo diagnostisissa menetelmissä esim. metalli-ioni, joka antaa osoitettavissa olevan säteilyn, tai metalli-ioni, joka pystyy vaikuttamaan NMR-relaksaatio-ominaisuuksiin.

15 Sopivia osoitettavissa olevia metalli-ioneja ovat esim. raskaat alkuaineet tai harvinaiset maame-talli-ionit, esim. kuten CAT-skannauksessa (Computer axial tomography) käytetään, paramagneettiset ionit, esim. Gd3+, Fe3+, Mn2+ ja Cr2+, fluoresoivat metalli- 20 ionit, esim. Eu3+, ja radionukleidit, esim. γ- säteilevät radionukleidit, positroneja säteilevät radionukleidit esim. 68Ga.

Diagnostisiin menetelmiin sopiviin radio-nuklideihin kuuluvat γ-säteilevät radionuklidit. γ-25 säteilevillä radionukleideilla on edullisesti puoliin- • tumisaika, joka on 1 h - 40 pv, edullisesti 5 h - 4 pv, edullisimmin 12 h - 3 pv. Esimerkkejä ovat radionukleidit, joita saadaan galliumista, indiumista, tek-netiumista, ytterbiumista, reniumista ja talliumista, 30 esim. 67Ga, luIn, 99mTc, 169Yb ja 186Re. Edullisesti γ- radionuklidi valitaan riippuen siitä, mitä keksinnön mukaisen ligandin metaboliaa tai somatostatiinipepti-dia käytetään. Edullisimmin keksinnön mukainen ligandi on kelatoitunut γ-radionukleidin kanssa, jolla on pi-35 dempi puoliintumisaika kuin somatostatiinipeptidin puoliintumisaika kasvaimessa.

17 102540

Muita radionuklideja, jotka ovat sopivia käytettäväksi kuvantamisessa, ovat positroneja säteilevät radionukleidit, esim. kuten edellä on selostettu.

Keksinnön mukaisia kelaatteja voidaan valmis-5 taa saattamalla ligandi reagoimaan vastaavan osoitettavissa . olevan alkuaineen antavan yhdisteen kanssa, esim. metallisuola, sopivasti vesiliukoinen suola. Reaktio voidaan suorittaa analogisesti tunnettujen menetelmien mukaan, esim. kuten on selostettu julkai-10 suissa: Perrin, Organic Ligang, Chemical Data Series 22. NY Pergamon Press (1982); Krejcarit ja Tucker, Biophys. Biochem. Res. Corn. 77: 581 (1977) ja Wagner ja Welch, J. Nucl. Med. 20: 428 (1979).

Edullisimmin ligandin kompleksi muodostetaan 15 pH:ssa, jossa keksinnön mukainen ligandi on fysiologisesti stabiili.

Vaihtoehtoisesti osoitettavissa oleva alkuaine voidaan tuoda liuokseen kompleksoituna toiseen apu-kelatoivaan aineeseen, esim. kelatoiva aine, joka muo-20 dostaa kelaattikompleksin, joka tekee alkuaineen liukoiseksi ligandin fysiologisessa pH:ssa, mutta on ter-modynaamisesti vähemmän stabiili kuin kelaatti. Esimerkkinä tällaisesta apukelatoivasta aineesta on 4,5-dihydroksi-1,3-bentseeni-disulfonihappo (Tiron). Täl-25 laisessa menetelmässä osoitettavissa oleva alkuaine vaihtaa ligandia.

Keksinnön mukaiset kelaatit voidaan myös valmistaa liittämällä yhteen kelatoiva aine, kompleksoituna osoitettavissa olevaan alkuaineeseen, ja suoja-30 tussa tai suojaamattomassa muodossa oleva somatosta-. tiinipeptidi, ja jos halutaan poistamalla ainakin yksi läsnäoleva suojaava ryhmä. Sama reaktio voidaan toteuttaa, kun kelatoiva aine muodostaa kompleksin ei-osoitettavissa olevan metalli-ionin kanssa, ja tämän 35 jälkeen saatavassa kompleksisessa peptidissä metalli-ioni voidaan korvata toivotulla osoitettavissa olevalla alkuaineella.

18 102540

Keksinnön mukaiset kelaatit voidaan myös valmistaa liittämällä yhteen kelatoiva aine, kompleksoi-tuna osoitettavissa olevan alkuaineeseen, ja somatos-tatiinipeptidifragmentti, joka sisältää ainakin yhden 5 aminohapon suojatussa tai suojaamattomassa muodossa, ja sitten jatkamalla peptidisynteesiä vaihe vaiheelta, kunnes lopullinen peptidisekvenssi saadaan, ja jos toivotaan, poistetaan ainakin yksi suojaava läsnäoleva ryhmä. Osoitetavissa olevan alkuaineen sijasta kela-10 toiva aine voi muodostaa kompleksin ei-osoitettavissa olevan metallin kanssa, ja tämä metalli voidaan korvata osoitettavissa olevaan alkuaineeseen lopullisessa kompleksissa somatostatiinipeptidissa.

Kun kelatoiva ryhmä on kiinnittynyt somatos-15 tatiinipeptidiin sillan muodostavan sidoksen tai tilaa vievän ryhmän kautta, esim. kaavan (ai) mukaisen radikaalin kautta, kuten edellä on kuvattu, sillan muodostava sidos tai tilaa vievä ryhmä voi olla joko somatostatiinipeptidissa tai peptidifragmentissa tai kela-20 toivassa aineessa.

Edellä mainitut reaktiot voidaan toteuttaa analogisesti tunnettujen menetelmien mukaan. Riippuen läsnäolevasta kelatoivasta ryhmästä, leimauksen teho voi olla lähellä 100 % niin, että puhdistusta ei tar-25 vita. Radionukleideja, kuten teknetium-99m, voidaan käyttää hapetetussa muodossa, esim. Tc-99m pertekne-aatti, joka voidaan kompleksoida pelkistävissä olosuhteissa .

Edellä mainitut reaktiot toteutetaan tavan-30 omaisesti olosuhteissa, joissa vältetään hivenmetalli- i kontaminaatiota. Edullisesti tislattua deionisoitua vettä, ultrapuhtaita reagensseja, kelaatioasteradioak-tiivisuutta jne. käytetään vähentämään hivenmetallin vaikutuksia.

35 Keksinnön mukaiset kelaatit voivat esim. olla vapaassa tai suolan muodossa. Suolat käsittävät hap-poadditiosuolat esim. orgaanisten happojen, polymee- 19 102540 risten happojen tai epäorgaanisten happojen kanssa, esim. hydrokloridit ja asetaatit, sekä suolamuodot, joita saadaan molekyylissä läsnäolevista karboksyyli-happoryhmistä, jotka eivät ota osaa kelaatin muodos-5 tukseen, esim. alkalimetallisuolat, kuten natrium- tai kalium-, tai substituoidut tai substituoimattomat am-moniumsuolat.

Keksinnön mukaiset kelaatit ja niiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat ovat käyttökelpoisia 10 joko kuvantamisaineena, esim. somatostatiinireseptori-positiivisten kasvainten ja metastaasien visualisoinnissa muodostettaessa niistä komplekseja paramagneet-tisen, γ-säteilevän metalli-ionin tai positroneja säteilevän radionuklidin kanssa.

15 Erityisesti keksinnön mukaiset kelaatit osoittavat affiniteettia somatostatiinireseptoreihin, jotka ovat kasvainten ja metastaasien ilmentymiä tai yli-ilmentymiä, kuten on osoitettu in vitro sitovissa kokeissa.

20 Somatostatiinireseptoripositiivinen kasvain, joka on peräisin ihmisen ruuansulatuskanavasta, pois tetaan potilaasta ja laitetaan välittömästi jäihin ja jäähdytetään maksimaalisen 30 min viiveen sisällä -80°C. Lisäksi autoradiografiaa varten tämä jäätynyt 25 materiaali leikataan kryostaatilla (Leitz 1720) 10 μπι viipaleiksi, laitetaan esipuhdistetulle mikroskooppi-lasille ja säilytetään - 20°C ainakin 3 päivää, jotta kudoksen adheesio lasiin paranisi. Viipaleet esi-inkuboidaan Tris-HCl puskurissa (50mM, pH 7,4), sisäl-30 täen CaCl2 (2mM) ja KC1 (5mM), 10 min huoneen lämpöti-. lassa ja pestään tämän jälkeen kahdesti 2 min samalla ’ puskurilla ilman suolojen lisäystä. Viipaleet inkuboi- daan tämän jälkeen keksinnön mukaisella kelaatilla 2 h huoneen lämpötilassa Tris-HCl puskurissa (170 mM, pH 35 7,4), joka sisältää nautaseerumialbumiinia (10 g/1), basitrasiinia (40 mg/1) ja MgCl2 (5 mM) endogeenisen proteaasin estämiseksi. Ei-spesifinen sitoutuminen 20 102540 määritellään lisäämällä vastaavaa leimaamatonta, modi-fioimatonta somatostatiinipeptidia 1 μΜ konsentraati-ossa. Inkuboidut viipaleet pestään kahdesti 5 min kylmällä elatuspuskurilla sisältäen 0,25 g/1 BSA. Lyhyen 5 tislattuun veteen kastamisen jälkeen, ylimääräisten suolojen poistamiseksi, viipaleet kuivataan nopeasti ja tarkistetaan [3H]-LKB filmille. Noin viikon altis-tusajan kuluttua röntgensädekaseteissa havaitaan, että keksinnön mukaiset kelaatit, esim. radionuklidikelaat-10 ti, antavat erittäin hyviä tuloksia leimatessaan kasvainkudoksen ilman, että ympäröivä terve kudos lei-maantuu, kun sitä lisätään konsentraatiossa 10"10 - 10'3 M.

Keksinnön mukaisten kelaattien affiniteetti 15 somatostatiinireseptoreille voidaan myös osoittaa in vivo kokeilla.

Rotille, joilla on transplantoitavia eksok-riinipankreaattisia somatostätiinireseptoripositiivi-siä kasvaimia, annetaan intravenöösi-injektio keksin-20 nön mukaista kelaattia. Injektiokohta on penislaskimo. Välittömästi annostuksen jälkeen eläimet asetetaan gammakameran kollimaattorille, ja radiokaktivisuuden jakautumista eläimissä tarkkaillaan eri aikavälein.

Radioaktiivisuuden biojakautuminen voidaan 25 myös määritellä tappamalla sarja tällä tavalla käsiteltyjä rottia ja määrittelemällä elimien radioaktiivisuus. Keksinnön mukaisen kelaatin, esim. radionu-klidikelaatti, esim. γ-säteilevä kelaattiannostuksen jälkeen, annos 1-5 pg/kg ligandia leimattu 0,1 - 2 30 mCi radionuklidilla, kasvaimen sijainti tulee havait-; tavaksi yhdessä elimien kanssa, joissa eritys oleelli sesti tapahtuu.

Täten keksintö tuo esille spesifisissä tai vaihtoehtoisissa suoritusesimerkkeissä myös menetel-35 mät: 21 102540 1. Menetelmä in vivo somatostatiinireseptoripositii-visten kasvaimien tai metastaasien osoittamiseksi kohteissa, jolloin a) keksinnön mukainen kelaatti annetaan kohteelle ja b) mainitun kelaatin kohteina käy-5 tettyjen reseptoreiden sijainti merkitään muistiin.

Keksinnön mukaiset kelaatit, joita käytetään keksinnön mukaisessa in vivo menetelmässä, ovat sellaisia, jotka muodostavat komplekseja γ-säteilevän radionuklidin, positroneja säteilevän radionuklidin 10 tai paramagneettisen metalli-ionin kanssa, esim. kuten edellä on osoitettu.

Keksinnön mukaiset kelaatit, joita käytetään kuvantamisaineina menetelmässä (1) voidaan annostella parenteraalisesti, edullisesti suoraan laskimoon, 15 esim. injektoitavina liuosmuotona tai suspensiona, edullisesti kertainjektiona. Tarkoituksenmukainen annos vaihtelee tietysti riippuen esim. siitä, mitä li-gandia ja osoitettavissa olevaa alkuainetta, esim. radionuklidia käytetään. Sopiva injisoitava annos on 20 alueella, joka mahdollistaa kuvantamisen alalla tunnettujen fotoskanning- menetelmien käytön. Kun radio-leimattua keksinnön mukaista kelaattia käytetään, sitä voidaan edullisesti antaa annoksena, jossa radioaktiivisuus on 0,1 - 50 mCi, sopivasti 0,1 - 30 mCi, sopi-25 vammin 0,1 - 20 mCi. Kuten on osoitettu, annosmäärä :· voi olla 1 - 200 μg ligandia leimattu 0,1 - 50 mCi, sopivasti 0,1 - 30 mCi, esim. 3-15 mCi, γ-säteilevää radionuklidia, riippuen siitä, mitä γ-säteilevää ra-dionukleidia käytetään. Esimerkiksi käytettäessä In, 30 on edullista käyttää matalampaa radioaktiviteettia, kun taas käytettäessä Te, on edullista käyttää radio-aktiviteettia, joka on ylärajalla.

Kelaatin rikastumista kasvaimien paikoilla voidaan seurata vastaavalla kuvantamistekniikalla, 35 esim. käyttämällä ydinlääkekuvantamisvälineistöä, esimerkiksi skanneria, γ-kameraa, pyörivää γ-kameraa, edullisesti ' tietokoneen avustamana; PET-skanneria 22 102540 (Positron emission tomography) ; MRI-laitetta tai CAT skanning-laitetta.

Keksinnön mukaiset kelaatit, esim. suurin osa γ-säteilevistä kelaateista, erittyvät olennaisesti 5 munuaisten kautta eivätkä keräänny maksaan.

Keksinnön mukaisia kelaatteja voidaan annostaa vapaassa muodossa tai fysiologisesti hyväksyttävän suolan muodossa. Tällaisia suoloja voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin ja ne osoittavat aktiviteetin, 10 joka on samaa suuruusluokkaa kuin vapailla yhdisteillä .

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät keksinnön mukaiset kelaatit voidaan sopivasti valmistaa juuri ennen antoa kohteelle, so 15 radioleimaus toivotulla osoitettavissa olevalla metal li-ionilla, erityisesti toivotulla γ-radionuklidilla, voidaan suorittaa juuri ennen annostusta.

Keksinnön mukaiset kelaatit voivat olla sopivia kasvainten kuvantamisessa, kuten aivolisäke-, ma-20 hasuolihaima-, keskushermosto-, rinta-, eturauhas-, munasarja- tai paksusuolikasvaimet, pienisoluinen keuhkosyöpä, paragangliokudoskasvaimet, neuroblastoo-ma, peokromosytooma (lisämunuaisytimen kromaffiinikas-vain), medullaari tyroidi karsinoma, myeloma, jne. 25 sekä näiden metastaasit.

Keksinnön lisäsovellutuksen mukaisia γ-säteileviä keksinnön mukaisia kelaatteja voidaan myös käyttää kuvantamisaineina munuaisten toiminnan arvioinnissa .

30 Viiden hiiren ryhmiä käytettiin. Jokaiseen hiireen injisoidaan suoraan laskimoon, yhteen hännän .. laskimoon, 0,1 ml sisältäen 1 mCi keksinnön mukaista kelaattia. Hiiret laitetaan tämän jälkeen metabolisiin häkkeihin eritetyn virtsan keräämistä varten. 10 ja 35 120 min injektion jälkeen virtsaputket sidotaan ja hiiret nukutettiin kloroformilla. Virtsaa muodostava systeemi kuvannetaan käyttäen tavallista kuvantamis- 23 102540 tekniikkaa. Tässä kokeessa γ-säteilevät keksinnön mukaiset kelaatit parantavat munuaiserityksen kuvantamista, jos niitä annetaan 0,1 - 30 mCi annoksina.

Täten esillä olevaa keksintöä voidaan käyttää 5 munuaisten toiminnan arvioimisessa in vivo kohteessa, jolloin kohteelle annetaan tehokas määrä γ-säteilevää kelaattia ja munuaisten toiminta rekisteröidään.

Toisen keksinnön sovelluksen mukaan muodostetaan: 10 i. diagnostinen koostumus sisältäen keksinnön mukaisen ligandin vapaassa tai fysiologisesti hyväksyttävän suolan muodossa yhdessä yhden tai useamman farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai tämän lai-mennusaineen kanssa; 15 ii. diagnostinen koostumus sisältäen keksinnön mukaisen kelaatin vapaassa muodossa tai farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodossa yhdessä yhden tai useamman farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai tämän laimennusaineen kanssa.

20 Tällaiset koostumukset voidaan valmistaa ta vanomaisin menetelmin.

Keksinnön mukainen koostumus voidaan myös laittaa erillisiin pakkauksiin yhdessä ohjeiden kanssa, joissa selostetaan, kuinka ligandi sekoitetaan 25 metalli-ionin kanssa ja kuinka tuloksena saatu kelaat-ti annostetaan. Sitä voidaan myös valmistaa kaksois- pakkauksen muodossa, . so yksittäispakkauksena, joka sisältää ligandia ja osoitettavissa olevaa metalli-ionia erillisinä yksikköannoksia yhdessä ohjeiden 30 kanssa, niiden sekoittamiseksi ja kelaatin annostami-.... seksi. Laimennusaine tai kantaja voivat olla läsnä yksikköannosmuodossa.

Seuraavissa esimerkeissä, kaikki lämpötilat ovat °C ja [a]D -arvot ovat korjaamattomia. Seuraavia 35 lyhennyksiä on käytetty:

Boc tert.butoksikarbonyyli TFA trifluorietikkahappo 24 102540 DTPA dietyleenitriamini-pentaetikkahappo

I I

ESIMERKKI 1: DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 5 I-1 1,1 g DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(ε-Boc) -Thr-Cys-Thr-ol vapaassa emäksessä (ImM) liuotetaan 5 1 dioksaani/H20 1/1 (v/v) ja saatetaan reagoimaan 5 g NaHC03 kanssa.

520 mg DTPA dianhydridia lisätään hitaasti sekoittaen. 10 Reaktioseosta sekoitetaan vielä 30 minuuttia ja kuiva-jäädytetaan. Jäännös liuotetaan 250 ml vettä, ja pH säädetään pH 2,5 väkevällä HCl:lla. Saostunut tuote suodatetaan pois, pestään ja kuivataan fosforipentok-sidilla. Silikageelikolonnikromatografiän jälkeen, 15 eristetään seuraavat tuotteet:

I I

230 mg DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys (ε-Boc)-Thr-Cys-Thr- ol 25 102540 I-1 10 g H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol-asetaattia ja 100 ml DMF. 2 h jälkeen huoneenlämpötilassa liuos poistetaan vakuumissa ja 200 ml di-isopropyylieetteria 5 lisätään jäännökseen. Sakka, joka muodostuu, suodatetaan pois, pestään di-isopropyylieetterillä ja kuivataan. Raakatuote puhdistetaan kromatograafisesti sili-kageelilla (eluentti: CH2Cl2/MeOH 9/1) ja eristetään tämän jälkeen valkoisena amorfina jauheena.

10 [a] D20 = 29, 8 0 (c = 1.28 DMF: ssä) .

I-1 ESIMERKKI 2: DTPA-(DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr- ol) 2 I- 15 Fraktio, joka sisältää välituotteen DTPA-DPhe-Cys-Phe l DTrp-Lys (ε-Boc)-Thr-Cys-Thr-ol)2, kuten saadaan esimerkissä 1, käsitellään, kuten edellä on selostettu vastaavan monomeerisen tuotteen kohdalla, Boc suojaavat 20 ryhmät poistetaan, jolloin saadaan otsikkoyhdiste: [<x]D20 = - 24,5 ° (c - 0,55 95 % AcOH) .

ESIMERKKI 3: H2N- (CH2) 5-CO-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-I

25 Cys-Thr-ol

I I

a. 0,56 g H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol, 0,5 mM Fmoc-e-aminokapronihappoa ja 115 mg hydroksi-bentsotriatsolia liuotetaan 10 ml DMF ja jäähdytetään 30 -30°C. Liuokseen lisätään liuos, jossa on 115 mg di- . . . sykloheksyylikarbodi-imidia ja 5 ml DMF (jäähdytetty .. -10°C) . 24 h reaktioajan jälkeen, jonka aikana seos lämpiää huoneenlämpöiseksi, saatava disykloheksyyliu-rea suodatetaan pois ja suodos laimennetaan vedellä 10 35 kertaiseen tilavuuteen. Saostunut reaktiotuote suodatetaan pois, pestään ja kuivataan fosforipentoksidil- 26 102540 la. Raakatuote käytetään ilman lisäpuhdistusta seuraa-vaan vaiheeseen.

b. Fmoc-lohkaisu 0,5 g raakatuotetta, joka on saatu liitosreaktiosta 5 (a) , käsitellään 10 min huoneen lämpötilassa 5 ml DMF/piperidiinillä 4/1 v/v (kirkas liuos) ja sekoitetaan tämän jälkeen 100 ml di-isopropyylieetteriin. Reaktiotuote, joka saostuu, suodatetaan pois, pestään ja kuivataan. Raakatuote käytetään seuraavassa vai-10 heessa ilman lisäpuhdistusta.

c. BOC lohkaisu 300 mg saatua raakatuotetta (l.b) käsitellään 5 min huoneen lämpötilassa 5 ml 100 % TFA (täysin liuennut) ja sekoitetaan tämän jälkeen 50 ml di-isopropyyli-15 eetteriin. 2 ml HCl/dietyylieetterilisäyksen jälkeen saatu sakka suodatetaan, pestään ja kuivataan korkeassa vakuumissa. Lopputuote puhdistetaan kromatograafi-sesti silikageelilla (CHCl3/Me0H/H20/Ac0H, 7/3/0,5/0,5), suola poistetaan tämän jälkeen Duolitel- 20 la (gradientti: H20/Ac0H 95/5)---H20/dioksaani/AcOH, 45/50/5).

Otsikkoyhdiste saadaan asetaattina (valkoinen lyofili-saatti).

[a] D20 = - 32 0 (c = 0,5 95 % AcOH) .

25 Saatu yhdiste voidaan käyttää reaktiossa DTPA:n kanssa esimerkkien 1 ja 2 menetelmien mukaisesti.

ESIMERKKI 4:

Seuraava ligandi voidaan valmistaa seuraamalla mene-30 telmää, jota on selostettu esimerkeissä 1 ja 3:

I I

.. DTPA-fiAla-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol.

[a]D20 = - 14,8 ° (c = 0, 5 95 % AcOH).

I- 35 ESIMERKKI 5: inIn leimattu DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys--1

Thr-Cys-Thr-ol 27 102540

I I

1 mg DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol liuotetaan 5 ml 0,01 M etikkahappoon. Saatava liuos johdetaan 0,22 μ Millex-GV suodattimen läpi ja jaetaan 0,1 5 ml annoksiin ja säilytetään -20°C. inInCl3 (Amersham, 1 mCi/100 μΐ) esilaimennetaan yhtä suureen määrään 0,5 M natriumasetaattia, ja leimaus tehdään sekoittamalla ligandi InCl3 liuokseen ja homogenisoimalla varovasti huoneenlämpötilassa.

10 HEPES puskuri, pH 7,4 lisätään tämän jälkeen liuoksen 10"6 M muodostamiseksi.

ESIMERKKI 6: 90Y leimattu DTPA-Phe-Cys-Phe-DTrp-Lys-i 15 Thr-Cys-Thr-ol 90Y saadaan 90Sr-90Y radionuklidikehittimestä. Kehitti- 90 men rakenne, eluutio ja muuttuminen [ Y]EDTA —> ase-taattikompleksi suoritetaan menetelmän mukaisesti, joka on selostettu julkaisussa M. Chinol ja D. J. Hna-20 towich J. Nucl. Med. 28, 1465 - 1470 (1987).

I I

1 mg DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol liuotetaan 5 ml 0,01 M etikkahappoon ja annetaan lämmetä huoneenlämpöiseksi, ja 1,0 mCi Y 50 μΐ steriiliä 0,5 25 M asetaattia lisätään. Seos jätetään tämän jälkeen rauhaan 30 min - 1 h kelaation maksimoimiseksi.

Yksi ryhmä keksinnön mukaisia ligandeja on somatostatiinipeptidit, esim. somatostatiinianalogit, jotka sisältävät vähintään yhdessä aminohappoyksikössä 30 yhden kelatoivan ryhmän, joka on liittynyt mainittuun aminoryhmään amidisidoksella, vapaassa tai suolan muo-; dossa.

Yksi ryhmä keksinnön mukaisia kelaatteja on juuri edellä mainitut ligandit, jotka muodostavat 35 kompleksin osoitettavissa olevan alkuaineen kanssa, esim. metalli-ioni vapaassa tai suolan muodossa.

Claims (6)

23 102540

1. Kelatoivan ryhmän sisältävä somatostatii-nipeptidijohdannainen, tunnettu siitä, että se on 5 CH2-S-Y! y2-s-ch2 I .1 (I) RCO-NH-CH-CO-B-C-LyS-E-NH-CH-G 10 jossa RCO- on a) L- tai D-fenyylialaniinitähde, johon on mahdollisesti rengassubstituoitu F, Cl, Br,

15 N02, NH2, OH, Ci^alkyyli ja/tai C1.3alkoksi, tai D-Trp tai 3-(2-naftyyli)-D-Ala Yi ja Y2 ovat yhdessä suora sidos tai Υχ ja Y2 ovat toisistaan riippumatta vety 20 B on -Phe-, johon on valinnaisesti rengas substituoitu halogeeni, N02, NH2, OH, Ci-3alkyyli ja/tai Ci_3alkoksi (mukaan lukien pentafluorialaniini) tai β-naftyyli-Ala, 25 C on (L)-Trp- tai (D)-Trp-, E on Thr, Ser, Vai, Phe tai Ile 30. on ryhmä, jolla on kaava »· : /Rn -CON^ R-12 35 29 102540 jossa RX1 on vety, C1.3alkyyli, R12 on vety, Ci_3alkyyli tai ryhmä, jolla on 5 kaava -CH(R13)-X1, R13 on CH20H, -(CH2)2-OH, -(CH2)3-OH, -CH(CH3)OH, isobutyyli tai butyyli tai on Trp:n tai β-Nal:n α-hiiliatomiin liittynyt substituentti, 10 Χχ on ryhmä, jolla on kaava -CH2ORiq tai -CONR14R15, jossa R10 on vety tai fysiologisesti hyväksyttävän, fysiologisesti hydrolysoituvan esterin tähde 15 R14 on vety tai Cx^alkyyli ja R15 on vety tai Cx-salkyyli, ehdolla, että kun Ri2 on -CH(Ri3)-X1, niin Rn on vety tai metyyli, 20 jolloin tähteet B ja E ovat L-konfiguraatiossa ja 2-ja 7-asemassa olevat tähteet ovat kukin toisistaan riippumatta (L)- tai (D)-konfiguraatiossa, 25 somatostatiinipeptidillä on ainakin yksi kelatoiva ryhmä osoitettavissa olevalle alkuaineelle, liitettynä joko suoraan tai epäsuorasti tilaa vievän ryhmän kautta, jolla ryhmällä on kaava (ai)

30 H2N-R35-CO- . · jossa R35 on Ci-nalkyleeni tai -CH-, jossa R' R' on Ci-nalkyyli, bentsyyli, naf tyyli-metyyli tai 35 pyridyyli-metyyli, mainitun peptidin N-terminaaliseen aminoryhmään, 102540 ja kelatoiva ryhmä on johdettu etyleenidiamiinitetrae-tikkahaposta (EDTA), dietyleenitriamiinipentaetikkaha-posta (DTPA), etyleeniglykoli-0,0’-bis(2-aminoetyyli)-N, N,N',N'-tetraetikkahaposta (EGTA) , N,N'-bis(hyd-5 roksibentsyyli)etyleenidiamiini-N, N'-dietikkahaposta (HBED), trietyleenitetra-amiiniheksaetikkahaposta (TTHA) , substituoiduista EDTA tai -DTPA 1, 4, 7, 10- tetra-atsasyklododekaani-N,Ν', N’’,N'’’-tetraetikka-haposta (DOTA) ja 1, 4, 8, 11-tetra-atsasyklotetra- 10 dekaani-Ν,Ν',N'',N'?'-tetraetikkahaposta (TETA), vapaassa tai suolamuodossa, tai kompleksoituna osoitettavissa olevan alkuaineen kanssa, joka on fluoresoiva alkuaine, paramagneettinen ioni, positroneja säteilevä tai γ-säteilevä radionuklidi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, joka on [DTPA-Dphe1] -oktreotidi

20 SY Ύ.°* Si 1 -ιιΙΒ'ί-Γ-ΤΓ3-^^— \ HO O 0arOH (X) !=o ,s oX. 3 o 25 “V=\ =NQ| o H . vapaassa muodossa, suolamuodossa tai kompleksoituna fluoresoivan alkuaineen, paramagneettisen ionin, positroneja säteilevän tai γ-säteilevän radionuklidin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jonka osa 3i 102540 CH2-S-Yi Y2-S-CH2 I I RCO-NH-CH-CO-B-C-Lys-E-NH-CH-G on valittu ryhmästä, johon kuuluvat 5 I-1 (D)Phe-Cys-Thr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2 I--—:-1 (D)Phe-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-TrpNH2 10 Γ"-1 (D)Trp-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH2 I-1 (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH2

15 I-1 3-(2-Naftyyli)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D) Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2 I-1 3-(2-Naftyyli)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-β-20 Nal-NH2 I-1 3-(2-Naftyyli)-(D)Ala-Cys-p-Nal-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2, ja l-1 . 25 (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-p-Nal-NH2.

4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen somatostatiinipeptidijohdannaisen, joka on kompleksoi-tu osoitettavissa olevan alkuaineen kanssa, joka on valittu ryhmästä fluoresoiva alkuaine, paramagneetti-30 nen ioni, positroneja säteilevä tai γ-säteilevä radio-nuklidi, valmistamiseksi tunnettu siitä, että • kaavan I mukainen somatostatiinipeptidijohdannainen, jolla on ainakin yksi patenttivaatimuksen 1 mukainen kelatoiva ryhmä, vapaassa tai suolamuodossa tai komp-35 leksoimattomassa muodossa, reagoi fluoresoivaa alkuainetta, paramagneettisen ionin, positroneja säteilevän 102540 tai γ-säteilevän radionuklidin sisältävän yhdisteen kanssa.

5. Patenttivaatimusten 1-3 mukaisen yhdisteen, joka on osoitettavissa olevan alkuaineen kanssa 5 kompleksoidussa muodossa, jossa osoitettavissa oleva alkuaine on fluoresoiva alkuaine, paramagneettinen ioni, positroneja säteilevä tai γ-säteilevä radionu-klidi, käyttö diagnostisena aineena.

6. Diagnoosipakkaus kuvantamisainekäyttöä 10 varten, tunnettu siitä, että diagnoosipakkaus sisältää yksikköannoksia patenttivaatimusten 1-3 mukaisesta somatostatiinipeptidijohdannaisesta vapaassa muodossa tai fysiologisesti hyväksyttävän suolan muodossa tai ei-kompleksoidussa muodossa ja osoitetta-15 vissa olevan alkuaineen, joka on fluoresoiva alkuaine, paramagneettinen ioni, positroneja säteilevä tai γ-säteilevä radionuklidi. « « • · t 4 33 1 0 2 5 4 0