HU229777B1 - Plants which synthesise a modified starch, process for the production thereof and modified starch - Google Patents

Description

Módosított keményítőt. szintetisál6 növények, átok előáll xtásáre szolgain eljárás: és a módosított keményítő á jelen találmány tárgyai. kemény1tőszemesékhez: kötött fehérjékét kódoló: nukleiosav molekulák, valamint eljárások és rekombináns DNS molekulák transzgeníkus növényi sejtek és mődosi tolt keményítőt szintetizáló növények előállítására, mely módosításokkal a keményítő viszkozitása tulajdonságai és foszfáttartalma megvádtozik. A találmány tárgya ezen eljárások eredményeként létrejött .növényi sejkekre és növényekre, valamint a transzgenlkns növényi sejtekből és növényekből nyerhető kemény 1 tőre Is vonatkozik..

A psiiezacharidők közé tartozó keményitőt, mely a növények legfontosabb tartaléktápanyaga, nemcsak az élelmiszerekben hasznosítjak, hanem megüjoiő anyagként jelentős szerepet játszik az ipari termékek, előállításában is. Ezen nyersanyag lehető: legtöbb területen történő felhasználásának lehetővé tételéhez szükséges az anyagok széles választékának előállításé., valamint ezen anyagokat ügy keli kialakítani, hogy az megfeleljen a foidolgozőipar változó igényesnek.

Bár a keményítő kémzailag homogén, alapvető építőkővé a glükóz, mégsem jelent egy homogén nyersanyagot. Inkább különböző tiporná molekulák kompion keveréke, melyek különböznek egymástól a polimerÍrásié fokában es a glükóz láncok elágazásának mértékében. Megkülönböztetünk arnilós keménytΦ Φ:

χν ««««; «« »«χ « « « Φ Φ χ Φ « ν Φχ x*« * Φ X > Φ Φ.

*»»» ♦ ♦ φ* «**

Λ rőt, o? egy alapvetően el ágazásmentes poli.mer, melyet a*) 1,4-glíkozidős kötéssel összekapcsolt glükóz molekulák alt.

„ kötnek, és amilopektiu keményítőt, mely ezzel szemben töboéksvésbé elágazó glükőzláncek keveréke- Az elágazásokat a1,S~giikozidős kötések alakit)ak ki.

é keményítő molekuláris felépítése, melyet főleg at elágazások mértéke, at amiióz/amilöpektin arány, az átlag iánonossz és a foszfáosoportok előfordulása határoz meg, fontos szerepet játszik funkcionális tulajdonságaiban, ebből következően vizes oldataiban, való viselkedésében. Jelentős funkcionális tulajdonság például a keményítő oldhatósága, rét rogradáciös hajlama, ti leképző képessége, vi szkon.;, fása, szintartósága, csirizképző tulajdonságai, úgymint a kötődési és zagasztási tulajdonságok, vaiamint hideggel szembeni ellenállása,. A. kemény1kő szemeseméir e te szi n t én j elentős lehet a különböző- felhasználási formákban,, hagy amliőztarfcalmú keményítő előállítása különös jelentőséggel bír. Továbbá a módosított keményítőt tartalmazó növényi sejtek bizonyos körülmények között előnyösen megváltoztathatják a növényi sejt viselkedését, lélöátl lehetségessé válhat a keményítő lebontásénak csökkentese a keményítőt tartalmazó szervek, mint. például magok és gumók, tárolása során, továbbá feldolgozásukat megelőzően, igy például keménye r.Öki nyerés előtt. Továbbá bizonyos érdeklődés mutatkozik módosított keményítő eiőállikására, mely a növényi sejtsket és növényi szerveket alkalmasabbá tenné a további feldolgozásra, ilyen például a pattogatott kukorica vagy krumpliból készített «* «« »»»* »* «Φ*<

« .* X X ·> « φ * ♦ ♦«·« » * « * * Φ X «>«-> χ««<χ χ* χχ «·>:« burgonyaszirom, vagy as ugyancsak krumpli ibői készíteti tőség bn i,. ropogós burgonya vagy burgonyapor kés z 1 késére. Különös érdeklődés mutatkozik a keményítő feljavít ásóban a csökkent ’’hideg-édes edés” megvalósít ás anak területén, azaz a tossz?;. ideig tartó, alacsony hőmérsékleten történő tárolás során a redukált cukrok (főleg a glükóz) kibocsátásának csökkenteséreElőírásszerűén a burgonya?·, gyakran 4-8 3^c~on tároljak a tárolás során fellépő keményítő lebomlás minimalizálása érdekében. Az ilyenkor felszabaduló redukáló cukrok, különösen a glukóz, nemkívánt bámuláshoz vezet (úgynevezett Maillato reakcióhoz3 a rősejbni, és a ropogós burgonya e_: leállítás áfo a n ,

A növényekből izolálható keményítőt gyakran alkalmassá teszik bizonyos ipari, célra kémiai módosításokkal, melyek általában időigényesek és költségesek. Ezért igény van olyan lehetőségek megtalálására,, mellyel a feldolgozóipar követei.menyeinek eleget í?évő, keményítőt szintetizáló növényt á>l 11 thatunk elő.

Ilyen növények előállítására szolgáló hagyományos eljárások a klasszikus növénynemesihősi es a mutánsok létrehozására szolgáló módszerek. így például megváltozott, viszkozitású keményi.tef színbe tizélö: 'kukorica mutánst állítottak elő az 5,331,1 OS számú amerikai szabadalom szerzői, és egy kukorica változatot (oazy maize) hoztak létre növénynemesitősi módszerekkel, mely majdnem! 130 i-ban ami lopekt. ínból ál lő keményt főt szintetizált ; Akartka és belsőn: dómmal of Sioiogícal őuemistry 241, 22Ő0—22ŐŐ(léin)) . Továbbá burgonya

ΦΦ -χ·χ χχφφ .φφ ΦΦ» Α * Φ < Φ X » Φ

X Φ * X» X « <· * X Φ « Φ «· χ»*Φ ΦΦ χφ χ« φ* φφφ

4:

és borsó- mutánsokat írtak le, melyek nagymennyiségő amiiőzt tartalmazó: keményítőt szintéitzáitak (kukoricában elérte a 70 Ó-ot, míg borsóban az 50 e-otj . Eddig eteket a mutánsokat molekuláris szinten még nem jeilemezték, és énért nem vált iehe/tővé az ezeknek megfelelő mutánsok előállítása más kemény1tőt raktár o tó növénye kben,

Alternatívaként, megváltoztatott tulajdonságú keményítőt szintetizáló növényeket elő leket áliitani a rekombináns DbS technika essközeivei, Például különféle esetekben leírták burgonyanövények rekombináns átalakítását megváltoztatott tulaj aonságö keményítő s z inteti tárására { dó 72/1 .376; WO 72/14827] . á. rekombináns technikák seinasznáiáeános 1-17 stekveneiák szükségek, melyek géntermékei befolyásolják a keményttö szintézisét, a keményítő módosulását vagy a kemény i t ö 1ebem1á s á t.

Ezért a jelen találmány alapjául szolgáló probléma a nukleinsav molekulák és: eljárások biztosítása, melyek lene révé teszik a növények megváltoztatását úgy, hogy olyan keményítőt szintetizáljanak, amely suiönbozza a. természetes köz élmények; ke rőté a növényekben szintetizált keményé tetőz, fizikai és/vagy kémiai sajátságaiban, legyen magas amiiozt a teáimé, és így aikaimasatöá váljon mind általános,· mind. k ú ion leges célra történő fe 1 h a s ζ n ál á s o kr a .,

Ezt a problémát ' * m .v forrnak bízóéitásával, melyeket az igénypontokban írtunk le.

Ezért a jelen találmány a 2~es számú amlnosavszekvencíávai rendelnéző fehérjét kódoló nukleinsav molekulákra ♦ * ΛΑ

Λ· * * ·» Φ * * Φ

Χ· * Φ ♦ * 9 * Φ

Φ ί * >· Φ < ' χ«ΛΪ ΦΦΧΦ «« ΦΦ ♦ΑΧ vonatkozik., ilyen fehérjék jelen vásznak a növényi sejtek p l a s z t 1 d í a iba η, k ö t ö d n e k a k e ra é ,n y í t ö s ε érac s é k he zvs 1 amin t szabadon, azaz oldható formában is megtalálhatdk. .írsoherlchis so.Zi-ban történő expressziéjokkor az ilyen fehérjék, enzímatikus aktivitása a sejtekben szinte tizál.édö· glikogén foozforilezését megnövelik. Szén fehérjék molekulatömege 140-160 kb tartományba esik, melyet SDS gélelektr o f o r é z i s se .1 1 e h e t mégha táros n i .

A jelen találmány továbbá olyan nukleinsav molekulákra is vonatkozik, melyek az 1-es szekvenciaszámon feltüntetett szekvenciát tartalmazzák, különösen annak kódoló régióját.

szintén a találmány tárgyát képezik a burgonya pl asztidjaiban részlegesen szemcséhez kötött fehérje molekulákat kódoló nukleonnáv molekulák, melyek hibridizálnak a találmány fentiekben említett nhkiei.nsav molekuláival, vagy ezek komplementer szálai, Ebben a szövegösszefüggésben a hibridizáció·’ kifejezés a hagyományos hibridizációs körülményeket jelenti, előnyösen a szigorú körülményeket, melyeket leírtak lambrock ás munkatársai [ samhrook és mtsai: bóiecular Clonlng: A Laboratory Kannal; 2, .kiadás, fold· dpring hathoz Press, Cold Spring Harbor, d.i, (198 S)d - A találmány nukleinsav molekuláival hibrid!záióöo nnk.lei.nsav molekulák alapvetően származhatnak bármely kzvánt szervezetből (ügymist prokarioták vagy enkarioták, előnyösen baktériumok, gombák, algák, növények, vagy állati szervezetek) , ha azok tartalmaznak ilyen nukleinsav molekulákat. Előnyben részesítjük az egyszikű vagy kétszikű növényekből, ezen beiül *> <« ««φχ »» >»χ« * X * Φ Φ Φ X * :♦ χ χ χφ χ Φ» χ Φ φ χ χ φ Φ «*»♦ φφφφ «Φ φ'φ φ Φ V a gazdaságilag hasznos: ndvényekoéd származókat, kllösösen előnyben részesítjük a keményítőt raktározó növényeket.

A találmány nokieinsav molekuláival híbridí záiódo nnkleinsav molekulákat izolálhatjuk különböző s ser véretek genomiaiis vagy cDNS könyvtáraiból,

Ezért az ilyen nukleinsav molekulák azonosítása és ibgiglása megtörténhet a találmány szerinti, molekulák es ezen molekulák részeinek felhasznál ásóval, vagy úgy is megvalósítható, hogy ezen molekulák komplementer száléit használjuk fel a standard. módszerekkel végzett hibridizációhoz | Samhrook és mtsaiΐ Molecular óloníng; A lahoxatory Msunalu 2. kiadás, óold apriny: harbor éress, Cold ópring bárhoz, Mit. Oiföibd ,

Hibridizációhoz próbaként használható például az l-es számé nukleinsav szekvencia vagy annak részét pontosan vagy lényegében tartalmazó nukleinsav molekula. A hibrid!zárniős próbaként használt Hbl szegmensek lehetnek· szintetikus DHó fragmehsek. is·, óméi veket hagyományos DIÓS szintetizáló módszerekkel késni zenek, és amelyek szekvenciája alapvetően megegyezik a találmány szerinti nnkleinsav molekula szökvénciézavaI. A t al áimány n a k magiéit1ö n akie i n s a vsze k ven e iá k h oz hiOridizáiödő gének azonos!sása és izolálása után a székven.elét meg kell határozni éé ab ezen sbékvenbha által kódolt fehérjék tulajdonságait analizálni kell.

Továbbá e jelen találmány olyan nnkleinsav molekulákra vonatkozik., melyek szekvenciáit összehasonlítva, a fentiekben említett molekulák szék vénéi ágával megáll,apátba tő, hogy he~^;

Φ4>«* generáltak a genetikai kód matt, és a növényi sejtek plasztrójaihoz részlegesen kötött fehérjét kódolnak.

A fentiekben említett nukleinsav molekulák fragmen aet.,. származékai és ailélikns változatai, melyek a fentiekben említett fehérjét kódolják, a találmány tárgyát képetek. Ennek követ kertében a nukleinsav molekulák részeként leire fragmensek elég hosszúak ahhoz,· hogy kódolják a fentiekben leírt fehérjét. Ebben a szővegősszei ügyesben a származék kifejezésre juttatja, hogy ezen molekulák szekvenciái különböznek a fentiekben említett nukleinsav molekuláktól egy vagy több helyzetben és ezen molekulák szekvenciajavai nagyfokú homeiögiát Tartatnak., itt a homológ kifejezés azt jelenti, hogy a szekvencia legalább 4ü h-ban, adott esetben legalább fö %-ban, előnyösen SO %-ban és még előnyösebben több: mint áö t-bao azonos. A fenni nukleinsav molekulák összehasonlításakor előforduló származékok deléeió, helyeftesités, inszereio vagy rekombináció eredményeként jönnek .1''^ k. £ k.- A

Továbbá a homológra azt jelenti, hogy funkcionális és/vagy htrnkfútáilb ekvivalencia, vsa: a megfelelői nukleinsav molekulák között vagy az általuk ködőit fehérjék között. A. fentiekben leire nukleinsav molekulákkal és ezen molekulák származékaival homoiögzát mutató nukleinsav molekulák általában olyan nukiernsav molekulák változatai, melyek azonos biológiai fuukolövai rendelkezzek, de szekvenciájukban mbdosultak.. Ezek a változatok lehetnek a termés zenben előfordulók, például származhatnak különböző szervezetekből.

Λ9 *♦ ΦφφΦ ΦΦ φφφ* φ * φ φ φ φ * φ * * V Φχ ΦΦΦ * Φ ΦΦΦΦ Φ

ΦΧΦΦ ΦΦΦΦ φφ ** Φ»Χ vagy lehetnek Mutánsok, mivel. mutánsok előfordulhatnak a természetben vagy szándékosan be juttathatók az élőlényekbe. Továbbá a változatok lehetnek s tiniét ikusan előállított szekvenciák.

Az aliélikus voltosatok előfordulhatnak a természetben, várává, né lehetnek szint etikuaan előáll lécéé vái.éozsi.oh vagy BS rekombináci©s technikával keszitett változatok, h találmány szerinti nukleínsav molekulák különböző változatai által kódolt fehérjék bizonyos mértékben közős fura. jdonsogokkai rendelkeznek. Enzimekéiül tásuk, molekuláién e g s < , immunná óul ai rea kció képe sségú k, köt i o rmáé l ő j u k s tb, fartorkot ezen tulajdonságok köré, ugyanúgy mint géleteké· rotoré ti kus mozgékonyságuk, kromatográfiás tnl.ajdonságaik, rlepedéni együtthatóik, oldhatóságuk, spekérdazköpiás tulajöemnágatkí ph-opt ámumu,k,, hőmérséklet optimumuk stb,.

A találmány nukleínsav molekulái alapjában véve származhatnak a kívánt fehérjéket expresszálö szervezetekből. Előnyben részesítjük a növényekből származókat, különösen a keményttőt szintetizáló és keményítőt raktározó növényekből. Különösen. előnyben részesítjük a gabonaféléket (mint például az árpát, rozsot, zabot, búzát stb), a kukoricát., a rizst, a borsót, a mentőkét, a horgonyt stb. Ezek nukleínsav molekulák eioá1irthatők a szakemberek által ismert szintetikus elv árasokkal .

A találmány nukleínsav molekulái lehetnek DhS molekulák, mint például oDES. vagy genomiális bál, valamint Ebe more knlák, « * * « * V * « ***« **♦« «•XX

X

Továbbá a találmány tárgyát képezik a génsebészet1 eljárásokban általánosan használt vektorok, különösen a piszéidét, kozmiaok, vírusok, bakteriofágok és más vektorok, melyek tartalmazzuk a találmány fentiekben említett nukieinsw m-olekuláit,

á.z egyik előnyben részesített megvalósítási formában a vektorokban található nukleinsav molekulák szabályosé elemekhez vannak hozzákötve, melyek biztosítják a transzkripciót és a transziáiható RbS szintézisét prokariota és eukar 1 s t a: s e j t e kbe n a találmány egy további megvalósítási formája, gazdasejtekre vonatkozik, különösen prokariota vagy enkaríota. sejtekre, melyeket transzformáltak és/vagy rekombínánsan manipuláltak a találmány fentiekben említett nukleinsav moiekóláival, vagy a találmány egyik vektorával, valamint as ilyen sejtekből származó sejtek tartalmazzák a találmány egy nukleinsav molekuláját vagy a találmány egy vektorát, Előnyben részesítjük a bakteriális vagy a növényi sejteket.

ázt találtak, hogy a találmány nnkleinsav molekulái által ködeit fehérjék befolyásolják a keményítő szintézisét vagy módosítását, és begy a növényi sejtekben a fehérje mennyiségében beálló változások a növény keményítő-anyaga cserejében változást okoznak, különösen a fizikai és kémiai tulajdonságaiban módos.;.tett keményítő szintézisében, a találmány nukleinsav molekuláinak' bl.z fosé tát svai lehetségessé válik, hogy rekombináns hbS technikai eszközök felt. a szn Hasával állítsunk elő módos itott kemény it őt szinte« * Φ 4 * Φ Κ « * 4 X *Φ «Φ* * Φ Φ Φ X φ » #**♦ Φ* «Φ φτ*Φ t-izálc· sövényeket, mely keményitő különbözik a vad-tiprau keményétőtől fizikai és kémiai tulajdonságaiban, Ezen cei ',··, ... ' - , ··;. ··:· molekuláit szabályozd elemekhez kapcsol tek hozzá., melyek biztosítják a növényi sej™ tekben a transzkripciót és a transzlációt, majd az igy kialakított konstrukciókat bejuttattak a növényi sejtekbe. Az előnyben részesített szabályozó elemek hetetolőgok a nukieinsav ao1eku1ához kepest.

A szakemberek által ismert eljárásokkal a transzgénikus növényi sejteket teljes növénnyé lehet regenerálni. A találmány transcyeaikas növényi sejtjeinek regenerálásával nyerhető növények szintén a jelen találmány tárgykörét képezik.

A találmány egyik tárgyköre továbbá olyan növényekre vonatkozik:, melyek tartalmazzák a fentiekben leírt transzgenikus növényi sejteket. A transzgenikus növények alapvetően lehetnek bármely kívánt növényből származók, igy lehetnek egyszikű valamint kétszikű növények. Ezek előnyösen haszonnövények, különösen előnyben részesítjük a keményítőt raktározókat, mist például a gabonaféléket (mist példáéi a rozsot, árpát, zabot, búzát stbj, a rizst, a kukoricát, a borsokat:, a maki okát, a bhsgönyát stb.

Az expresszié vagy a találmány egy nukieinsav molekulájának további, expresszioja miatt a találmány transzgenzkua növényi sejtjei, és növényei egy módositott keményítőt szintetizálnak, összevetve őket a vad-típusú sövényekből származóval, azaz a sem-transzformált növényi sejtekkel, különösen ezen keményítők vizes oldatainak viszkozitása, és/vagy fősz«Φ *»«« «Χ*Φ « X 9 9 9 9 * « ♦ 9 X #»

X * ♦ » X 9 X *»Χ» »»♦» ♦* »« «τ«* fát t a.rt.a.lmán.a.k tekintet eben, Az utóbbi általában nagyobb a transzgenikus növényi sejtekben vagy növényekben, ami megváltoztat ja a keményizö fizikai talaj őnvvságalt.

Ezért a találmány transtgénikas növényi sejtjeiből vagy növényei bel kapható keményítő szintén a jelen találmány tárgykörét képzik,

A jelen találmány egy további tárgykörébe tartozik egy a növényi sejtben szemcséhez kötötten valamint oldbatö forrná b a n je1eη1évő feb érj e e1őá11i t ás á r a s ζ.ο 1gá1ó e1j árá s, me 1 y Lehetővé veszi a találmány ην,ην ά.,;Ο\ t--ywn-n olyan körülmények közötti mely megengedi a fehérje ere-ressziöját ágy, hogy a fehérjét izolálhattak a tenyésztett sejtekből és/vagy a sejtek tenyésztolvadékából,

Továbbá a. találmány tárgya a találmány nokieinsav teIsbalái által ködeit fehérjékre, valamint a fentiekben leér Ιοί járással kapható fehérjékre is vonatkozik. Evek előnyösen a sejtmagban és a piasz tidofcban lokalizálódé gének által, kódolt fehérjék.. A piasztidofcban ezek. az enzimek szemeséhez kötött formában, valamint szabadon vannak jelen. A áoianrm teberosnm-béi származó-, tárgykörbe tartózó fehérjék SDS gélelektroförézissel liö-lhö kD msiekvúe tömegnek, és Assheiaohia^ esdi-ban törtéhö: expresszi éjak a sejtekben sziatelizálédé glikogén megnövekedett fosztoriiezéséhez vezet, á találmány egy további tárgykörébe tartoznak azok az eiienanyagok, melyek specif.1 kason képesek felismerni a rali arány fehérjéit. Evek lehetnek mono ki. őnála, s, valamint pca.ikl ónálló :ei..iena.nyago k.

♦* Xr* «·« « β «X » «

X X * * X * X Φ

X * X 4»*Χ * * * * X χ χ «♦«*««*♦ XX *♦ «XX :2

Továbbá a jelen találmány kapcsolatos olyan nukleinsav molekulákkal, melyek képesek specifikusan hibridizálni a találmány szerinti nukleinsav molekulával és legalább lu nukleotid hosszúságnak.. Ebben a szövegösszefüggésben a specifikus hibriuizálás azt jelem, hogy a hibnöizálást hagyományos hiszi biz átlós körülmények között , előnyösen a szigorú körülmények között végezzük, más fehérjéket kódoló szekvenciákkal kereszthihrldizáolö jelentős mértékben nem fordul elő. Az ilyen nukleinsav molekulák előnyösen legalább £0, előnyösebben legalább 50 és legelőnyösebben legalább löö nukleotid hosszúságúak. Az ilyen molekulakar fel lehet használni például PCR primerként, mint hibrid!záoiős próbát t w u. Λ kk ' uk’-nkik

Továbbá azt találtuk, begy lehetséges befolyásolná, a növényekben mnfotizéioöő keményítő tulajdonságait ,· csökkentve a sejtekben a találmány szerinti nukleinsav molekulák által kódolt fehérjék mennyiségét. Ezt a csökkenést belőlyáerlhat juk- például a ΤοΙΑΙηύπν nukleinsav moleknrái.nak antiszensz expresssiójával, alkalmas ribozim expresszióval v agy kos zupáé sszlova1,

Ezért egy sutiszensz Ili molekulát kódoló DNS, mely a t a 1 á. .1 má n y Db E mo 1 e ku 1 á j án a k t r an s z k r 1 p t j é ve I komp 1 eme n t e r, szintén a találmány tárgyát képzi, ahogy ezek az antiszensz molekulák is. Ennek következtében a kompiamén tart tás nem azt jelenti, hogy a kódolt RNS löö á-ban komplementer. Elegendő egy kisfoka komplementaritás is, addig amíg elegendően magas fokú ahhoz, hogy képes legyen a találmány fehérjéjének exp** ΦΦ ΦΦ*» ΦΦ «φφφ φ « φ » φ φ * φ

Φ * φ φφ ΦΦΧ

Φ « β φ X φ «Γ φ«Φφ φφφφ φφ χ« »ΦΦ π

reesziöját gátolni növényi sejtekben, As átírt RbS előnyöset, legalább 10 %-ban, előnyösebben 95 i-ban romplementer a ta1 á 1 má n y n a k 1 e in. s a v mu 1 a k u 1 á j án a k t r a n s z k r lp t j ével. A növényi sejtekben a transzkripció alatt az antis sansz hatás megvalósításához az ilyen DNS molekulák hossza 15 bázíspár, előnyösen: több mint löQ bázíspár és legelónyösebben több mint ölő bázíspár, bár általában kevesebb, bánt áőbS hasispár., előnyösen azonban rövidéhb mint 2500 bázispár.

A találmány tárgya továbbá a növényi sejtekben RNS szintésíshee vezető SAS molekulákra vonatkozik, melyek eueressz lőjakkor a növényi sejtekben fellépő koszupresssíös ind .<· a' kéz ^r vt·⁴” ' nt χ χ a leirt fehérjét kódoló találmány szerinti nukleinsav kifejeződéséi:. A ke stop rossz lö aiapeivoit valamint a megfelelő ARS szekvenciák előállítását pontosan leírták például a Wl óö/llökd számú sóadadalombanAz ilyen ©NS molekulák előnyösért a találmány rui kiéin sav molekuláinak transzkriptjeível nagyfokú homoiógíát mutató ANS-é ködőinek:. Bár ez nem teljesen szükséges abbéé, hogy a. kódoló RNS leiorőiihahő legyen fehérjévé.

A találmány egy további megvalósításí formája ríbozím aktivitásé RNS molekulát kódolő ©bő möl.éfeuiákara vonatkozik. A ríhozim specifikusan hasítja a találmány DNy molekulájának franeokriptjet, valamint az ezek kódolta RNS molekulákat.

A iibö zárnak kai a lie ikusan aktit RNS molekulák, képeseit hasítani az RNS· molekulákat és specifikus célszekveneíákat. ©bői re komb ináéi és technikákkal lehetséges megvár fgziatni a. ribozlmoA neeuiiikns: aktivitását. különböző: típusa ridőziX » «Ψ ΧΛ « » * * ♦ * β * *·$

Γ ♦ XX mofcat i.smetunk. Blőnyőseh, egy bizonyos gór trangzfcriptjenek specifikus hasi tását z^egcéizó gyakorlati alkalmazásokhoz ,· a. rihozimok kát különböző csoportjának tagjait használjuk föl. Az első csoport ribozimjaí 5- l-es íntroncsoportbe tartozz;fc. A második csoportba olyan ri.bozimok tartoznak, melyekre jellerszö az ügy neve zott fcalapáesse á motívum. A sói-RNS molekula specifikus felismerését, módosítani lehet az ezen motívum azekvencíáját szegélyező régió megváltoztatáséval. A eéirzolefcoIában, a szekvenciák bázlapémosodasazzal ezek: a szekvenciák meghatárózzák a katalitikus reakció helyzetét, és igy ast a helyet, ahol a célmolekuia hasítása lekövetkésik. Mivel egy hatékony hasításhoz a szekvenciával szemben, támasztott követelmények igen alacsony szintűek, ezért slagjában véve lehetséges spécitikue rí hoz lmokat kifejleszteni mindegeik .kívánt ÁSÓ moiekmiára..

A. találmány egy DNS molekulájának transzkriptjelt specifikusan hasító ribosímot kódoló DNS molekula el kés tízeséhez példázd egy ribozim katalitikus dóm,aknáét kódoló DNS szekvencia mindkét oldala olyan DNS szekvenciához van kapcsolva, mely a céienzim szekvenciájával homológ.

A katalitikus dom.slr.tt hónció szekvencia lehet például az, SCMo vírus szatellit DNS-ének katalitikus domainje LDavies és mtsai: Virology 17 7, 2í 6-224 (1990) ] vagy a To'oP, vírus szatellit DNS-enek része fsteinecke és mtsai: öbSO Journal lg, 1525-15.32 (1992; ; kaséi orr és Serinek: ha taré 334, 535-591 (1988)1. A katalitikus domaínt határoló DNS «* «Γ4> « * * · * « * β * * * * ♦:« «* 9 * * 8 «· * * » 99 99 9 999 «·$ ** $*>» szekve?'?oiák előnyösen a kal.áimány fentiekben leirt DNS molekulát bő I száma csak.

A jelen találmány egy további isegvalősitási formájában a fentiekben ieirt DNS molekulákat tartalmazö vektorokra vonakodik, különösen azokra, melyekben a leírt DNS molekulák a n ö vé n y i sej bekbe n t társ z k r r p c i ő t b 1 z t o s 1 t ó s z a b á 1 y ο ζ ö ©lomokhoz vannak kapcsolva.

Továbbá a jelen találmány a leírt. DNS molekulákat és vektorokat tartalmazö gasdasej·tökre vonatkozik. A gazdasejtek letetnek etokartoné sejtek, mint például a baktériumok, vagy eukarfota sejtek. Az eukarlota gazdatetfek között előnyben részesitjük a növényi sejteket.

lová'öbá a jelen találmány kosaapresszzés hatásra^ vezet© egy aatiszensz RNS~t, egy rihezimof vagy egy WS-t koöblé, fentiekben leirt DNS molekulát tartalmazö transzgenikus növényi sejtekre: vonatkozik, továbbá a DNS molekula a növényi sejtekben transzkripciót biztositó DNS elemhez van kapcsolva. Ezek a transzgenikss növényt sejtek teljes növénnyé regenerálhatok a szakirodalomba;: jói ismert technikákkal. így a találmány vonatkozik olyan növényi sejtekre is, melyeket regeneráaiöva.l nyerhetünk a ieirt. transzgenikus növényi, sejtekből, valamint olyan növényekre, amelyek tartalmazzák a. ieirt transzgenikus növényi sejteket.. Maguk a. transzgenikus növények lehetnek bármely növényi faj képviselőt, előnyösek a haszonnövények, különösen a keményítőt raktározók, ahogy azt a feni torbe?; ki fe jtettők.

« * χχ χ« «* ν» **<» ♦ » ♦ + X « * X

X χ χ XX*

X « * V X X X ίί»χ χχχ» X* Χ> »«» <s á leírt DáS molekulák kódolta antxsaensz 'v5_; rrbozrm vagy koszupress·ziős RNS erpresssiöja következtében a transzgeo a. kas növényé sejtekben a találmány z)dR mo te Re Iáé áifcal kódolt tekerjék mennyisége, melyek a sejtekben endogén fórrában vannak, csökkent, begiopö módon ez a csökkenés a növényi sejtekben scinfetizálódő keményítő fizikai és kémiai tulajdonságainak drasztikus változásához vezet, különösen igaz ez ezen keményítő vizes oldatának vészkositási tulajdonságaira, tgszíátfártalmára valamint alacsony oőmérsékieten a növényi sejtek vagy növényi részek tárolásékor felszabadulö redukáló cukrok kibocsátására. A transzgenikns i.v' 'y . sejtekben szintetizálődö keményítő tulajdonságait félreértést kizáróan leírtuk az alábbiakban.

Így a leirt transzgenikus növényi sejtekből és növénye ebéi nyerhető keményítő Is a jelen találmány tárgykörét képezi.

Továbbá a találmány tárgya a leírt molekulák által kódolt artászens z RRS mo léén.Iákra, valamin t, a ribez j.m aktivttásű Rbl molekulákra és RtS^: molekulákra is vonatkozik, mélyek például, a transzkripció eszközeivel előidézhető Ιον zropre ss zi ős ha tás hoz vez etnek.

a találmány további tárgyköre el járás transzgenikus növényi. sejtek termelésére, melyek a nem-cranszforrnált sejtekhez képest módosított keményítőt termelnek. Ezen eljárás alapján a találmány udS molekulái által kódolt, endogén formában lévő fehérjék mennyisége a növényi sejtekben lec söíkfcen.

' χ « « « * « * .«'' * * * χψ«» »* *x »**

Egy előnyben részesített megvalósítási formáson ezt a csökkenést befolyásolja egy antiszensz hatás. Erre a célra a találmány 1® molekulái vagy azok részét-, kapcsolva, varnak antiszensz irányban egy a növényi sejtekben transzkripciót biztosító promoterrel, és vaioszinőieg a transzkripció terminációját, valamint a transzkrípt poliaóeniíáciőját bizton t..o termináciős jellel. A növényi sejtekben a hatékony antiszensz katás bi ztosétására. a Sééntetézálf ootisrensz köb- ne k mén ima® lö nuklootiő' boa szén ágénak ke il lennie, előnyösen legalább löö nuklaotéci és lége ion yésehhéh tön nzíkleotid hosszúnak. Továbbá az an; rsze-w kKS-. O. o’c DNS szekvenciának acmotógnak. kel i lennie a t ransz formációra kije lóit. növényé sejtre nézve. Bá.r a DOS szekvencia nagyfoké homokégést matat a növényekben endogén formában jelenievő DNS szekvenciával, mégis használható előnyösen több mint 90 %-os, előnyösebbe® több riirt 9ó f-oe bomolögéáva.l és.

találmány Sbb molekulái által köbölt fehérjék mennyiségének csökkentése., egy további megvalósítási formában, rébozémmél. befolyásolt. é ribozlmok valamint az ilyen kbő mol.ekulákaf kódoló t®. moie kn.l_:a kenet rokokók al apve tő: bakámét m fentiekben már leértek. Tznnszyenékus sejtekben á ríbozim aktivitás e.xpresszái.ásához egy ribosfmot kódoló, fentiekben leírt SbE molekulát hozzákapcsolunk a növényi sejtekben: transzkripciót biztosító DNS elemekhez, előnyösen egy promotechez és egy ternn.nátcr jelhez. 1 növényi sejtekben s z int été zá r t rébooémok a t alálmány SIS moleku la.

β Φ ΦΦ ΦΦ«Φ X* φΧΦφ

Φ Φ * « Φ X X Φ

0 φ Φχ ΦΦΦ

Φ χ * χ Φ * «

ΦΦΦΧ ΦΧ«Φ φβ ·# χ<* tfnnszkr.iptjelnek hasításához vezet, melyek a növényi sejtő kön r; endogén· formában vannak jelen..

Egy további lehetőség a találmány nnkisinssv molekulái által kódolt fehérjék mennyirégé nek csekkentésere a koszuppresarló- Ezért a találmány eljárásával kapható növényi sejtek további tárgykört jelentenek. Ereket a. növényi sejteket úgy jellemezbetjük, ioa\ emu i t i ars-y Eáő 'Kl'hdai által kódolt fehérjék mennyi réce csökkent, és a vad- típusé sejtekber köpést módosított keményítőt ssirtetaráinak.

Továbbá a találmány olyan növényeikre vonatkozik, melyek megkapnatók a leire, növényi sejtek regenerálásával, valamint a. találmány ielyt. sejtjeit tarbaImaző növényekből.

A leírt növényi sejtekből és növényekből kapható keményítő .szintén a jelen találmány tárgykörébe tartozik.. Ez a kémé nyitó kőd. önbe zik. a. nem-ér amse formáit sejtekből vágy n ö v é n ye kb ö I e 1 ő á Hízott kémé n y i t o t ö 1 f i z i. ka i é s / va g y kém 1 a x tulajdonságaiban:., érni kor a: keményítőt ős srehgsöpl ltjuk, a vad-típusú növényekből nyert keményítővel, akkor az csökkent fos zsbet.art simát mutat.. Továbbá, ezen keményítő vizes oldatai módosni t cisz közitásl bura jdotsá gokat ma tát hah...

f’H e v >ybe' részesített megvalósítasz formában a leírt keményítő foss táté a rí alma legalább Só: í-kal csökkent:, előnyösebben legalább fő ív kai és egy kúiönönee előnyös: megvár ősi tanú. formában több: mint 8G í-kal, a vaö-típesá növényekből nyert: keményít övei történő összehasonlításban.

Ezen keményítő legelőnyösebb jellemvonása, hogy vizes óí.öntána.k. viszkozitása módosult,

X* «« XX φ « * * * X Φ * φ χ Φ Χφ X· « * .« X X « « * « φ$«» *«»« ** ·»* ***

Α νίszkozifási sajátságok meghatározására szolgáló jól megalapozott vizsgálati módszer ar űnynevezeft Brabender tes z t . Ezt a tesztet például a Viskograph E-kent ismert készülekkel hajtjuk végre. Ért a készüléket többek kötött a Brabender OBG Buiaburg (németországi árusítja.

A teszt elad lépésében lényegében viz: jelenlétében a keményítőt felmelegetik, azért hegy meghatározzák, mikor kezdődik az keményitőszemcsék hidratáloöása és duzzadása. A hidrogén kötések megszűnése miatt ez a folyamat, melyet géix. ' < X. S-C \C C Ot ~ ~ 4 -x ' -x-t·' szuszpenzió viszkozitásának mérhető nevekedésével jár. Mig a gélrépzeues után a hőmérséklet további emelése a keményítő részecskék teljes feloldását eredményezi, és ezzel csökken a viszkozitás, addig a gélképződés után közvetlenül a hőmérséklet csökkentése tipikusan a viszkozitás növekedését okozza íláso 1, ábra). A Brabender teszttel kapott -görbe az idő függvényében mutatja a viszkozitás változását, ahol megfigyelhető a bemérsékietváltoztatás hatása a gél képződésen túl, majd ezután a hűtéskor,

Általánosságban megállapítsaző, hogy a Brabender görbe analízise arra szolgál, hogy meghatározzuk a csirizrepződési bemértekLetet, a melegítés alatti viezkozitási maximumot, a meghosszabbított forralás utáni viszkozitást, a hűtés alatt megnővekedett viszkozitást és a lehűtés utáni viszkozitást.

Ezek a paraméterek a keményítő minőségére, valamint a különböző alkalmazásokban való hasznosságára mutató fontos sajátságokat képviselnek.

* *

Ö *-> * β « » χ « ** Λ ♦ « » <· β t » < *

X ♦ » Φ « 9

Λ««« «β «XX bél dóul a burgonyanc vény bőd, Izslálhsto keményítő, mely növényben a találmány fehérjéinek mennyisége antíszensz hatás miatt csökkent, a vad-fipusú keményítővel szemben élesen eltérő jellemvonásokat mutatott, ácséi szemben: melegítéskor: viszkózttásábau csak' kismémbe kő cs ökkenést matat , mig hőtéseko f egy e rőté lg e sebb növekedés t matat vi s z ko z i t á s Ina n (lásd 3., 4. és 5. ábrákat),

A találmány egy előnyben részesített megvalósítási tormájában keményítőre: ven átkozik:, melynek, vizes oldata a 4., vagy az 5. ábrán felvázolt viszkozitás! jellemzőket mutatja. Különösen a 3. példában leirt körülmények között. Brabender viszkozimetsr segítségével történő mérésben,: a. vaö-tlpnsá. keményítővel szemben a módosított ktményltő az oldat melegítésékor jellegzetesen kisebb növekedést mutat:,, bt megteiémti, annak a lehetőségét, hogy keményítő felhasználásával nagymőrt,ékbet kghesnfráit ragasztókat állítsunk elő.

Továbbá, módosított keményítőnél, a maximális: viszkozitás elérése alán csak egy kisvártéka. csökkenés jelentkezik a viszkozitásban-. hás részről büféskor a viszkozitás erő teljesen nő; így a módosított keményitő viszkozitása magasabb, m iπ t a vad-1 ίpus ú n övényekb61 s z árma ző kemény11öé.

A transzgeníkus növényekben: a találmány fehérjéinek csökkentéseve}, a továbbiakban lehetővé válik keményítő termelése, ami akkor hatásos, amikor a keményítőt tartalmazó növényi részeket alacsony hőmérsékleten tároljuk különösen 1-t: és ez kevesebb redukáló cukor belssabadulásáyai jár, mint a nem-transzformait sejtekről asármaző keménye—

ΦΦΧ χ·χ χχ*Φ: #♦

Φ χ Φ: * χ φ ν φφ

Φ φ X Φ Φ φφφφ ΦΦ XX bőnél, Ez a tulajdonság különösen előnyön például olyan burgonyák biztosításakor, melyek alacsony hőmérsékleten történő tároláskor kevesebb redukáló cukrot bocsátanak ki, és így a hideg-édeeedés mértéke csökken, sz ilyen burgonyák különösen alkalmasak résejbni, ropogós burgonya vagy hasonló termékek, készítésére, ítivel a nemkívánatos bámulást reakciókat íbaiilard reakciók) elkerüljük vagy legalább is erősen csökkentjük fel has znál étkor ,

A jelen találmány egy különösen előnyben résseaitett megvarosttási formágában a találmány egy fehérjéjenek szintézise nemcsak csökkent a transzforrnáit sejtekben, hanem a keményítő szintézisében és/vagy módos Írásában résztvevő egy további éheim szintézise is kisebb mértékű. Ebben a szőve nesszé rengésben. előnyben réstesz tjük például a keményétöszemcsébez kötött keményitö-szlutet.ázt vagy az elágazást létrehozó enzimet, Meglepő módon azt találtuk, hogy a találmány fehérjéit valamint az elágazást létrehozó enzimet orsókként mértékben szintetizáló burgonyanövények az antiszenez: hatás miatt olyan keményítőt szintetizálnak, melynek tulajdonságai erőteljesen eltérnek a vad-tipusú növényekben szí n t et i zárt kémé nyit ötéi..

Amikor osszahaenni!toltuk a vad-tipusá keményttővei, megái.lapi toltuk, hogy a mő-dosított keményítő vizes oldatai nem mutatnak növekedést vrszkozitásukban melegítéskor vagy hutáskor (ve. a 6. ábrával).

Továbbá a keményítőszemsso mikroszkópos analízise meleöltés előtt és melegítés után azt mutatta, összevetve a vad«Φ ΦΦ ΦφΦΦ φ^ ΦΦΦΧ φ φ φ φ φφφ φ φ·' φ φ φφ φφφ φ φ * φ φ β φ φ X Φ Φ Φ ΦΦ * X * * Φ ΦΦΦ típusú; növényekével-, hegy az ilymődon módosított közönyt tf szemcsén. nem. nyitottak, hanem, a lap; éten véve vél tótat ionok telépt későkben . így aa a keményítő ellenáll a melegítési folyamatnak. Ha meghatározzuk az ilyen keményítő ami.ióz tartalmát a példákban leírt eljárások segítségével, akkor az amid oztartatom több mint 50 %_f előnyösebben több mint 60 % én legelőnyösebben több mint 70 1. Előnyösen az: ilyen növényekből izolált keményítő vizes oldatai a 61 ábrán feltúrteteit viszkozitásí jellegzetességekkel rendelkeznek.

á találmány ilyen magas: amiiőztartalmú keményítője szánts előnyős felhasználási biztosit: a vad-típusú sövényekből nyerhetőhőz képest. így a magas arái őztarlaÍrná keményítők nagyjsiéntőséghez a tőriák és filmek előállításában. A. magas amiiőztartalmú keményifők felhasználásával készült fóliák és filmek, melyek felhasználhatók a essmagolőipar számos terhiekén, legfontosabb előnye biológiai 1 ebont hsáé s águkban rejlik. Ezen felhasználáson túl, mely alapvetően hagyományos es petrolkémiai eljárásokkal készült polimerekre alapoz, az amriőzcak megvan egy egyedi felhasznáiási területe, mely az amiloz helixképzö sajátságán alapul. Az amiiőz által, képzett helíx belsőleg hidrofób, mig külsőleg naProfil. Ennek eredményeként az amid őzt fel lehet használod kis és nagy molekulatömegü anyagok komplexkégzésére vagy kapszulába zárására. Erre példák:

- vitaminok és anyagok molekuláris kapszulába zárása az oxidáció, párolgás, hő általi lebomlás elleni védelemre, vagy az eltolycsodás megakadáIy ozására;

X» «« ΦΦ** ΦΧ XX** φ φ X Φ X φ Φ X φ X « φφ Φ«Χ

Φ Φ * Φ Φ Φ 4

Φ«φφ ΧΦΦΦ «« XX χφφ

- aromás anyagok molekuláris kapszulába zárása oldhatóságuk, nővelese érdékében;

- mőTrágyákvpeszticidek molekuláris kapszulába zárása ®tabálizáiásokra és Írére;tott kibocsátásukra;

~ gyógyszerészeti anyagok molekuláris kapszulába zárása a dssiskontroll stabilizálására és a késleltetett preparátumok k1bο os a tá s án a k szabályozására.

áz api lóg egy másik bostos thiajdonságá az, hogy királis molekula, A kiralltás: Következtében előnyösen lehet használni immobilizáció után, például egy oszlopban az en ζην 1omereh s z é tné l a s z t á s á r a...

Továbbá meglepő módon azt találtuk, hogy a keményítő, melyet, olyan bargonyaríövenybcl. lehat izolálni, mel.yben a találmány fehérjéinek mennyisége a sejtekben csökkent mersexé a.z antissensz hatás következtében, az 1-es izotipusá iGbSdl) keményítőszemeséhez kötött keményítő-ssintetáz enzimatikus aktivitást ma tat-δ fehérjék csökkenésével kombinációban olyan jellemvonásokat mutat, mely erőteljesen eltér a vad-tipusu növényekből izolálható keményítő jellemvonásaitól. Araikor a keményítőt a vad-típusú növényekből izolálhatóval hasonlitottuk össze, akkor ennek a keményítőnek vizes oldatai, melegítés során kismértékű viszkozitás növekedést mutatnak, egy alacsony maximuma viszkozitással, valamint hűtéskor (vő. a 1. 'uiavsm mernem mrr: viszkozitásában növekedés. Ha meghatározzuk ezen keményítő amiiőz/amilobektin arányát, akkor az kapjuk, hegy ennek a keményítőnek majdnem nincs amilőztartalma. A fenti keményitő

Λ X XX ««*« 99 ΦΦΧ* <· * * ♦ Φ «· -X Φ « Φ X»χ **<>

X Φ Φ X Φ Φ Φ φφφφ «φφφ φφ φφ φ«·^ ami 1 őzt art a Ista előnyösen 5 t alatt van, el őnyö sebben 2 % alatt van.. Toveoba a találmány keményítője különbözik az ismert kemény1 tőtől, melyet transzgeníkns bnrgonyanövényekhen lehet előállítani a GB32I gén egyedüli gátlásával, rekombrnáns DNS technikák útján. Melegé tőékor et a keményítő erős viszkozi.táanövekedést matat. Előnyösen a találmány keményítőinek vizes oldatai a 7 c ábrán feltüntetett viszkozitása tulajdonságokkal rendelkeznek, A 13, példában leírt Rapid VIsco analizátor mérésr körülményeinek megfelelően végzett viszkooitásmeghaéározás att matatja, nogy a módosított keményítő a vad-típusú. keményítővel szemben melegítéskor jellemzően vízkozításában csak kismértékű növekedést mohát, de ez igy van akkor is, amikor a vaxy keményítőhöz hasonlítjuk. Ez megteremti annak lehetőségét, hogy a találmány keményítőjét felhasználjak nagymértékben koncentrált ragasztok előállításában, A módosított keményítő további ialagdomságe., begy a mamlmom viszkozitás elérése után viszkozitása csak kismértékben csökken, valamint hűtéskor szinte nem változik viszkozitása.

Növényi sejtekben az elágaztató enzim aktivitásának csökkentési lehetőségeiről, már írtak például a Wö 92/14827 és a do áo/28éö? szabadalmakban, Az 1-es ízofcipusű. (G3SS1; keme n y í tő s z emc s éh e z k ö tő11 k értén y í t ő - s z i n te. t á z akt i vi t á s án a k csökkentése végrehajtható a szakmában járatosak számára a szakirodalombon leírt módszerekkel, például antíszensz hatás segiőségével - .A burgonyába! származó GBSSl-t kódold bNS szekvenciák már ismertek [ hegersberg; értekezés, Vníversíty

ΦΦ ΦΦ ΦΦ. χφ φφ ΦΦΦ* * * φ « φ * φ φ

X Φ Φ Φ* Φ*Φ

Φ X X * Φ X φ χ * » * Φ Φ Χ Φ φΦ ΦΦ φ φφ οχ Görögne )1938} ; Visser és mtsai: alant Sci, 64, 185-192 (198 97 ; van dér Leiy és mtasar; 'tol. Gén., Génét, 223, letilt (18:91 jő .

A találmány eljárása alapvetően aikai-tatható bármely növényi faj esetén, Az egyszikű és a kétszikű növények fontosak, különösen a haszonnövények, és előnyben részesítjük a kerííénylfot raktározó növényeket/ mint például a gabonaféléket (rozs, árpa, zab, búza stb,}, a rizst, a kakoriest, a borsót, a manlökát és a burgonyát,

A találmány keretében a növényi sejtekben transzkripciót biztosító szabályozó LES eletek ^!< kifejezés alatt olyan DNS régiókat értőnk, melyek a növényi sejtekben a. franszkrlpoiő iniciálását és befejezését teszik lehetővé. A transzkripció elindulását biztosító ggs régiókat promoteremek ne ve z zűr.

A találmány fentiekben leírt különböző DNS molekuláinak ezpreaszáláaához fel letet használni bármely, a növényekben funkcionáló örömökért. Az alkalmazott növényi, fajokhoz viszonyítva a promoterek lehetnek somulégok vagy heteroiögok. Az alkalmas promoterek lehetnek folyamatos expressziét megengedik, úgymint a kelvirág mozaik vírus 35S örömesére fődell és mtsai; Natúré 313, 810:---812 (1985)] és a 'NQ94/01571 szabadalomban leint pnomoier konstrukció. Ezenkívül, lehetnek külső faktorok által meghatározott, bizonyos időben -például NGS3/07179) vagy a növény bizonyos szövetében [Stockhaus: és mtsai.:; ShBO Journal 8, 224 5-22,51 (1988)] az utánuk következő szekvenciák expressziéját biz tusitök. Előnyben részesítjük > X * * « X X X

X X X XX X * X

X X X XX X X *««#♦♦** x* XX XX* azon promoterok használatát, molyok a transzformációra kijelelt növények keményítőt raktározó részeiben aktivek. Burgonya alkalmazásakor ezek a reszel a öurgonyamagok és a targonyagunő... A burgonyanövények transz le rmaciő jához előnyösen, de nem kizárólagosan, a gamöspeolf ikus B 33-as pramotert ( kocka-Sósa és mtsai; BMBö ösornál 8, 23-29(1989);

használhatjuk.

A transzkripciót iniciálé DNS regié a promotereken kivüi tartalmazhat a transzkripció további növekedését biztosi tó DNS szekvenciákat, mint például az úgynevezett enhanoer elemeket. Tavibba a ”szabályozó DNS elemek” kifejezés tartalmazhatja a termináeiős jeleket, melyek a transzkripció pontos befejezésére és a transzkrz.pt poli-A farkának bozzáadására szolgál, mely utóbb említettről feltételezik, hogy a tranazkriphet stabilizálja. Ilyen elemeket leírtak a szakiroda lomban és a kívánalomnak megfelelően szabadon cserélhetők.. Ilyen termináeiős szekvenciákra példák a poli.ade.niiáoiós jelt tartalmazó b nem-transziáit „őszök, melyek megtolsz, cat ok a nopaiin szár tetéz génben (NOS) vagy az agrobaktérinmokböi származó okropic szrntetáz génben [di.eleb és misai: DMBO Journal 8, 23-2:9 (1989) 1, vagy a szójababból szlrmazó raktározófehérje génben, valamint a ribul.őz-1,δη i f o s z f á. t -karb ο x i. 1 á z < s s RüB1S CO) ki s a 1 eg y s é gé ne k gé n j e ib e n,

A találmány DNS molekuláinak bejuttatása növényi sejtekbe előnyösen plazmából felhasználásával történik. Azokat a plazmidokat részesitjnk előnyben, melyek a plazmád stabil integrációját biztosítják a növény genomjába.

>xx ♦ fr 9 ** » X « X * X· « X * »

X * ♦ »*♦

X * * * « X «

V*x * «V«« *♦ *:*·#

A jelen LalaIrány példáiban a pRinAR blfunkcionálIs vektort bonznál jók [Höfgen és brlimrtzer: Plánt, Sci.

66,221-230 (1990; j . So a vektor a pBinl.9 [Bevan: buciért: Acids Research 12, s711 -6? 11 : 19iá .· j oifunkcionáiis vektor szárraszéka, mely kereskeoeImi corgaros'hsn kapható (Clontech Sebőratörtéé, Inc., USA).

Felhasználhatunk bármely más növények transzformálására szolgáló vektort, smiyfce inszertárható egy expresszién kazetta, és amely bistesítja ar expressziós kazetta Integraelétet a növény genomjebe.

A magasabbrendű növényekbe történő idegen gének bejön tatásához nagyszámú klönozovektor áll rendelkezesünkre, melyek tartalmasnak asclezoclta coll repli.kációs jelet, és markergént a transtformált bakteriális sejtek szelektálásához. Ilyen vektorokra példa a pBR322, a pbC sorozat tagjai, az bllmp sorozat tagjai, a paülC18i stb, á kiránt szekvenciát integrálhattuk a vektorba alkalmas restrikciós helyek segítségével. Az igy kapott plazmidot felhasználjuk KnchericÁia coli transzformálására. A transzformáit Rsokerichia coki sejteket alkalmas táptalajon tenyésztjük, majd ezután összegyűjtjük és a sejteket 11 zárjuk. A plazmidókat standard eljárásokkal kapjuk meg.

A kapott plazmidok jellemzéséhez analizáló elzárásként általában restrikciós analízisé és szekvencia analízist használunk. bindegyik manipuláció után a plazmád DlS-t hasíthatjuk és a kapott fragmenseket más DNS szekvenciákhoz hoz z ak apó soI h a tja k.

* φ » * 9 * Φ * « X Φ Φφ Φ*»

Φ » X * * « ί

Φτ* X* **Φ

A DNS növényi sejtbe történő bejuttatására nagyszámú ' a 1 ' \ ' \u , ι 1 * e - ' Ν'.,,.- n-'y y.

a növényi sejtek transzformáoiőj a^ T-DNS-sei, felhasználva az .ggrobacterrum zűréibőlens-t vagy égrohacterinn rá.: soyeres~t a transzformációra, a protopiasztok fúziójára, injektálásra, a DNS elektr scoráclö j árz., a fi ..- ''biolisztikos'' úton történő bejuttatására, valamint további lehetőségek megvaiositására.

ΰ DNS növényi sejtekbe történő injektálásakor vagv elektroporációjakot felhasznált plazmibdal szerben nzncsenek speciális követelmények. Az egyszerű plaznüdok, mint például a \y v varm,_? felhasználna tők. Bár, ha az így transzformáit sejtből a teljes növényt regeneráljuk, akkor szelektálható .markergének jelenlété szükséges.

é. növényi sejtbe történő bejuttatás módszerétől függően további DNS szekvenciákra, lehet szükség. Ha például a Ti vagy Di. plazmidot basznál juk a növényi, sejt transzf ormáciöiához, akkor legalább a Ti és Ri plazmád T-DNS jobb szélét, bár gyakran jobb és hal szélét kell a bejuttatásra, szánt génhez határoló régióként hozzákapcsolni.

Ha Agrobacterltiít-okat használunk fél. transzformációra, akkor a bejuttatásra szánt DNS-t speciális plazmidókba, például köztes vagy brraukciónál.ss vektorokba, kell először ciánosat. A köztes vektor bejuttatható az égrobacterinm iamerácie.ns-fee kon jugáoiőval felhasználva egy segítő piacmidet, ez azután homológ rekombinációval integrálódik a Ti. vagy az Rí plazmídbs, .mivel a T-DDS szekvencia részeivel az integrálódó szekvencia hoSíOlbg. Ezek a plazmidok ráadásul a * * φ-φ * φ * »

Φ * * * φ ΦΦΦ ΦΦΦΧ *·***· **ΦΦ

Λ φ Φ 9

Φ φφ Φ«φ» φ Φ φ Φ ** ΦΛ *ΦΦ

T-PfíS transzferjéhez szükséges ars régiét is megkapják. A köztes vektorok képesek repiikáiódni az agrobaktéritonokban. Egy seg stop sasra iö lelhasználósavai a köztes vektor átjuttatható az Agrofoaccerium tisaziaeiens-be konjugációval. A bi~ funkcionális vektorok répái kálódnak mind. lécéért oöia coliban, mint agrobaktériu.mokfcan. Szelektálható mar kergénen kívül tartalmaznak kapcsoló vagy poiiiinkez régiót, melyet a T-DNS jobb és bal régiója hazáról, közvetlenül transzformálhatók agrobaktériumokba { Polster és mtsai: hol. Geo, Génét, lto, 181 -18 7 ( 19 78)) , Az ag r óba k tér i um ok t r a n.s z £ o r má 1 á s á no z hasznait plazmidok továbbá farzaimaznak szelekciós markor gént, msi.nt például az NPT II gént, mely lehetővé teszi a transzformáit baktérlomok kiválasztását. A gazdasejtként al ka imák ott agrobakiériümofcaak fartalmazniak keli egy giszmid által, hordocoié vir-régiót , A vir-régió szükséges a. TDNS átviteléhez a növényi sejtekben. További T-DNS is jelen lehet. Az igy transzformáit agrobahtérlumokst használjuk fel a. növényi sejtek itass zt ormafásához, .A növényi sejtek transzformációjához a T~ühS használatát részletesen vizsgálták és kielégítően leírták a kővetkező irodalmi hivatkozásokban; EP Ízűéin; Hoekema; The hinary klánt Geeiör ivaré®, öéfsehdrnfckerij hantéra b ,V., Aibiasserdam (1985), V, fejezet; Fraley és mtsai: Grit. Rév. Plánt. Sci. 4, 1-16 (1985); An és mtsai: EéBO Journal 4,

277-287 (1985). Néhány bifunkcionális vektor zár kereskedelmi forgalomban is kapható, .mint például a etlhll (Clontech. táboré törlés, Inc., USA).

2Ö

A növényi sejtekbe történő ü bevitelre: alkalmazható: & vver.y; explantá rumok együttenyész tése ee Agr oiaoteriom tnme.fuoiens-sel vagy az: ágrobacserion .rhisogenes-sei. A fertőzőt c növényi anyagokból (például lévé Ida- rabok, s sár képietek, gyökerek, de szintén lehetnek protcpiasrtok vagy tenyésztett növényi sejtek azuazpenziől) az egész növény regensrálható alkalmas tápkeregben, amely tariaimazhat a transzformált sejtek, szelekciójához antibiotikenne·kat vagy biocidekát, As igy kapott növények esetén vizsgálhatok a bejártán n ne DNS jelenlétére nézve.

Ha egyeser a bejutlatoár DNS integrálódott a növényi sejt genoríjába, akkor ez általában stabilis, és a DNS-t az eredetileg: transzformált sejt utódai is tartalmazzák,. A bejuttatott DNS rendszerest szelekcióm markért tartalmaz, mely a transzformált sejtet réziáétenssé teszi egy htonlíra. vagy ant iblotlkumra, úgymint kanamleinre, G 418-ra, bieomieinre, bigromieinre, roszfinotricinre és másokra. Ezért az egyedileg választott marker a transzformáit sejtek szelekcióját biztosítja a bejuttatásra használt DNS-t nem zártálmázé sejtekhez képest.

A transzformált sejtek a növényeknél szokásos módon nőnek. [BrCermiek és mtsai: Hant Gall keports 5, ál-éé (198 8 5 1, Az eredményül kapott növényi sejtek normálisan f. onyészt hét ők és kérész terhet ők a tr anczformáoiövai nyert génetikai információt vagy más genetikai információt tartalmazó növényekkel. Ezen folyamatok eredményeként kapott

X 0 0*

0 0 * * X 0 »0

XX 0 * ν «

X «»Χ »

«00 hibrid egyedek rendelkeznek a fenotipvsnak megfelelő jellemven ásókkal.

Két vagy több generációt keli tenyésztenünk,. hogy biztosak legyünk a fanotipnaos jellemzők stabil fennmaradásában és átvitelében, A magokat össze kell ahhoz gyűjteni, begy megbizonyosodjunk a megfelelő fenotipnsos vagy más < o b?n η i ' m -. g<' < I

A találmány növényi sejtjeiből, vagy növényeiből kapott keményítő tulajdonságainál fogva nemcsak az itt mér említett épbe i f i,kos cé:i.ok;ra használható:, de: ettő l el térő knlőnbÖző^: ipari célokra is.

Alapjában a keményítő felhasználásának lehetőségei, feloszthatok két nagy területre. Az első terület tartalmazza a keményítő hidrolízis termékeit és az úgynevezett natív kémé nyí tőket... A hidroiiziá kazméhek főleg en sima ti ruhán vágy kérnial eljárásokkal nyeri glükóz és glükán vegyületek. Ezek felhasználhatok további, eljárásokban, mint például farmontácföban és kémiai mőőosétásokban, Ebben a tekintetben jelentősége lehet, hogy a hidrolízisei? eljárások egyszerűen és kis költséggel kivi tel eshetők. Jelenleg ezt alapvetően amiiogXokozidán alkalmazásával enzimatlküsets végzik, A költségek. csökkentése érdekébe?:) meggondolásra éroe;res, hogy a hidrolízis vécrenajbasához kevesebb enzimet használjunk, mivel a keményítő fe lépitóséden változások történtek, például a szemcse felülete megnőtt, a használt enzimek hozzáférhetőségét behatárolö kevesebb elágazás miatt vagy a terheli

X* 4» »»♦» XX X* X »

«. * χ χ * « x * * « * «X ♦ XX χ χ χ χ * X * *χΧΧ χχ*χ XX *->' * ** felépítés megváltozása következtében az emészthetőség megjövő 1 t,

Az égynevezett natív keményítő használatát, melyet polimer struktúrája miatt használunk, további két terhiéire oszthatjuk;

(a) As élelmiszerként történő hasznosítás területe;

A keményítő klasszikus adalékanyag különböző élelmiszerekben, melyekben alapvetően a vizes adalékanyagok kötésiére szolgál, és/vagy moy v z-mdot t .. -... k?z 'v -.v y,· regeövekedett gél képzést ekoz. Fontos és jellegzetes tulajdonságok a következők: az áramlási és szorpoiös viselkedés, a duzzadás.! és eoizizképződési hőmérséklet, a viszkezítási és sűrűsödési teljesítmény, a keményítő oldhatósága, áttetszősége és e paszta felépítése, bő-, nyírás- és savtörő képessege, vísszaaiakniáaí, hajlama, filmképzési képessege, fag y a s. z t ás s a 1 / felen godé s se 1 s zeniben i e 11 e ró llö képe s s ege, emészthetősége, valamint kompiexképzési képessége szervetlen és szerves ionokkal.

(b) A nem-élelmiszerként történő hasznosítás terhieoei:

A keményítő másik fő alkalmazási területe a segédszerként történd felhasználása különbözd termelési eljárásokban vagy adalékanyagként technikai termékekben. A keményítő segédszerzőnt történő használatának fő aikslmazásr területei mindenek előtt a papír- és ksrtonpapír-ipar. Szén a területen a keményítőt főleg retenoiőra (a szilárd részek visszatartása) , ragasztóanyagaként, és finom részecskéknél sűrítő anyagaként as dehidratálő szerként használják. Ezenkívül a χ ♦ φφ Φ:χ*Φ χ* **** φ *. « A Φ Λ Φ' * ♦ * Φ ΦΧ *** * * < Φ * X *

ΦΧ * * X «ΦΦ »* VV * ** keményítő előnyös tulajdonságait is hasznosítjak, reint például a feszességét, a keménységét, az épségét, a ragadását,, a felületi fényét, a simaságát, a szakítószilárdságát, valamint f e 1 ül e tei/d.

A papír előállításának folyamatában megkülönbőz téthetünk négy területet, nevezetesen felületi, bevonási, tömegben való és szórással történő: alkalmazási területet.

A felületi keseléssel kapcsolatban a keményítővel szembeni követelmények körött alapvető a fényesség fokának mértéke, a megfelelő viszkozitás, a nagymértékű viezkozitási stabilitás, a jő fiimkégzö hajiam, valamint a kismértékű porképződés. Szilárd felület bevonásakor a megfelelő viszkozitás, a nagyfokú kötőképesség, valamint a nagyfoka affinitás a pigmentekhez fontos szerepet játszik. Adalékanyagként, tömegben valő alkalmazáskor a gyors, egységes, veszteség nélküli diszperzió, nagy mechanikai stabilitás és a papírgép teljes retenciőja nagy jelentőségű, A 'keményítő szórással történő felhasználásakor a szilárd anyag megfelelő összetétele, a nagy viszkozitás, valamint a nagyfokú kötődési képesség szintén jeienteséggei bír.

Az ipari haszüosátás egyik fő területe a ragasztöiparban van, ahol a következő négy részre oszthatjuk a reményire alkalmazásának területeit: a tiszta keményítő· ragasztóként történő felhasználása, a speciális vegyszerekkel előállított keményito ragasztóként történő felhasználása, a szintetikus gyanták és polimerek diszperzióinak előállóra savó z a keményítő adalékanyagként történő felhasználása.

♦ Φ ♦**« ** **** φ Μ Φ e > Φ » X * φ « Φφ ΦΧ« φ « φ φ * X * ««Α Φ φ*ΦΦ «X ♦* * *« valamint. a keményítő extenderként történő felhasználása. A keményítő alapé kötőanyagok őö %-át a hullámpapir kartonok, a papírzacskók., a peplrzzákot, a papír és az alominíum vegyes anyagok, a dobozok és a nedvesíthető ragasztók levelekre, bélyegekre stb. teszik ki.,

A keoényirö segedsserkénfc és adalékanyagként, történő felhasználásénak egy másik lehetősége a szövetek és a textilipari termékek előállításában van, A textiliparon bein! különbség tehető a következő négy tértiét alkalmazásai között: a keményítő felkasználgsa mint ragasztóanyag, azaz segődstorsétt a rostok elsimítására ős erősítésére, amivel a szövés alatti húzőerö ellen védelmet nyújt, valamint a szövés alatti kopási ellenállást nővérig mint textil minőségét ie'jleszto ágens főleg a mirősésrombolő előkezelések étán, ágyéi nt a iébérí.tés:, a szári tat: stb,.;: mint sőtltőszer a festékpaszta előállításában, megakadályozva a festék diffúziódat; és mint adalékanyag a varrófonál felvetésére.

Továbbá a. keményítő £elnasználhátö az építőanyagokban adalékanyagként, Erre az egyik példa a grosttáblák készítése, melyekben a híg malterral összekevert keményítő a vízzel pasztát alkot, a gipsz felületére kzaiffnnöál, és igy a tábla kartonpaplr részéhez kötődik, A másik alkalmazási terület, sorkor bozzéaogák a vakolatanyagbez és ásványi szálakhoz, A késztekeveri betonban a keményítőt a kötési folyamat fékezésére használják.

Továbbá , a keményítő előnyös a talaj stabilÍz ázáséta szolgáié eszközök előállításában, melyek mesterséges talajΧ« ΦΦ Φ>*Φ X* **** <. Φ X X Φ X » *

Φ ♦ > 5« ΦΦΦ

Φ Χ· X X Φ * * **** **** ^4β ** *** j 3 cserénél & talajrászeoakáket ideiglenesen megvédik a víztől. Jelenlegi tadásunk alapján keményítőt és polimer emulziókat tartalmazd termékek koetíaciója ugyanolyannak tekinthető az eróziót és a kérgesedest csökkentő hatáséban, mint az eddig használt termékek, azzal a különbséggel, hogy figyelemre.....

méltóan clesőbbek

A kéményitó haszöcsitésónak egy másik területe a novényvédőszer készítmények specifikus tulajdonságainak módosítása. Példán! keményítőket hasznainak, a növényvédő szerek és műtrágyák nedvesítő tulajbonságainsk javítására, az aktív alkotórészek dozirozott kibocsátására, a folyékony, illékony es/vagy szagos aktív alkotórészek mikrokristályos, stabilis, deformálható állapotú anyagokká történő konverziójára, összeférhetetlen ósszetélelek keverésére és a csökkent szétesés érdekében a hatás idetartaménak megnyújtására.

A keményítő feihaszné.lhsté a gyógyszerek készítésébe:;, az orvostudományban, valamint a kozmetikai iparban is. A gyógyszeriparban a keményítő^ a tabletták kötőanyagaként vagy a kapss/uiákban a kötőanyag hígítására használható. Továbbá, a keményítő alkalmas a tabletták szétesésének elősegítésére, névéi nyeléskor folyadékot abszorbeál és egy rövid ide után úgy meghúzzad, hogy az aktív alkotórész kijut belőle. Minőségi okok miatt az alkalmazás további területei, a gyógysert elfolyósítő és a sebfértötlenitö porok. A kozmetikumok területén a. keményítő például relnaaznáinatő púder adnia ks .svanként, úgytsint az illatszerek és a szalicil sav. A *ΧΨ« ««#* ♦OS *.* « « * *

V «χ *«* « X ♦ * * φ* χ*χ keményítő egy viszonylag széles körű felhasználási terüiene a fogkrém gyártásában van.

A keményítő· felhasználása adalékanyagként a szánban és brikettek előállításában szintén megfontolásra érdemes. A keményítő adásával a szén mennyiségileg összeállnán és/vagy jőmznöségó briketté válhat, igy a keményítő a brikett idő előtti szétesését megakadályozza. A hús sütéséhez használt szán 4-6 1 adalék keményítőt tartalmaz, a kalárias szén .0, i~ 0,5 i~ot. Továbbá a reményi tő siralmas kötőágens, mivel a szénhez vagy á briketthez aö.va figyeismremeltőan csökkenti a t óm i kun a nyago k felhős ga t a gát ·.

Továbbá, a keményítő fiokkuiensfeént ércek és a szén híg iszapjának feldolgozásában is. felhasználható.

A keményítő felhasználásának egy másik területe az, amikor a keményítőt az öntés folyamatában használt anyagokhoz adalékanyagként alkalmazzuk. A különböző öntési eljárásokban az öntvény magját homokból készítik, összekeverve különböző szükséges kötőanyagokkal. hatjainkban a legáita1ánosabban használt kokőanyag a bentonit/ melyet módosított keményítövei, főieg duzzadd keményitővel, kevernek.

A keményítő adagolás célja az áramlási ellenállás növelése, valamint a kötöoro javítása.. Továbbá a_: duzzadó keményítők eleget tehetnek az előállítási folyamat több előfeltételének, úgymint a hideg vízben megvalósuló díszper·gihatóságnak, a rehidzálhatöságnsk, a homokkal történő jó feeverbetöoégmek és a nagymennyiségű viz lekötési képessegene m.

X * Φ Φ φ φ * φ ΦΦ X Φ »*♦»

ΦΦ φφ φ Φφ φ φ « ♦:* Φ-* «ΦΦ * **« :«

ΦΦΦ

A gumigyártásban a keményítő felhasználható a technikai és az optikai minőség fejlesztésére, űrre a magyarázat a j ani tett felületi fényben, fogásban éa külalakban, van . Ennek éteekében a keményítőt a hideg-voikanizácrő előtt dísztérgátjak a gumiaoyagok ragadós gumírozott fel színén. A keményítő fai használható a gumi nyomtathatósagának javításéra

X s „

A módosított keményíró alkalmazásának egy másik férőié te a bőrbelyettesitők előállírásában van.

A műanyagpiacon, a következő alkalmazási területek merülnek lei; a keményítőből származó termékek integrációja a termelési eljárásba (a keményítő töltő szerepű, nincs közvetlen kötés a szintetikus polimer és a keményítő kötőtt) vagy alternafivaként a keményítőből származó termékek integrációja a polimerek termelésébe -a. keményítő és a polimer stabilis kötést képez).

A keményítő csupán töltőanyagként nem versenyezhet más anyaggal, mint például a tálkámmá!. Aás a helyzet, ha a keményítő specifikus tulajdoassgal hatékonnyá válnak, és a végtermék tulajdonságának profilja így alapjában megváltóul . ' ' u * , e ’ ' η ' j t ' felhasználásának egyik példája, a. nelletilén. Ennek érdekében a keményítőt és a szintetikus polimert. 1:1 arányban egyesítő z koetpreasziős eszközökkel kialakítva egy mester adagot, melyből különböző terméket állítanak elő általános technikákkal felhasználva a szemcsés polietilént. A keményítő infcegráoiőja a polietilén filmekbe a következő tulajdonΦΦΧΧ X«φ« »««« φ« χ φ Φ Φ Φ φφ »βί

ΦΦ** X

Φ» ΦΦ ΦΦ* ságoK előnyös; megváltozását eredményezheti: az anyag megnővekodett permeabiiizását üreges testekbe, a vizpára megnövekedő sz porosaid. 1 Írását, az antisztatikus sajátság javulását, az anti-blokkoiö viselkedés javulását, valamint a vizes festékekkel történd nyomtathatóság növekedését.

A keményítő másik felhasználási lehetősége a poiiuretán habokban van. h kerté nyitó származékok adaptációja, valamint a termelési· technikák optimalizáciöja miatt lehetséges a reakciót spécit ikusan szabályozni a keményítő hidronil-csoportjaí és a szintetikus polimerek között. A keményítő használatával az eredményül kapott poiiuretán. filmek a következő sajátságokat mutatják: csökkent koeficieusü termállá tágulást, csökkent zsugorodó képességet, javított nyomás/tenziő viselkedést, megnövekedett vizpára permesbilítást a víziéivé tel változása nélkül, csökkent gyűlékönyságot és repedést sűrűséget a gyúlékony részek leesése nélkül, nincsenek halogenidek és csökkent mértékű a kopás. A jelenleg még létező hátrányok között a csökkent nyomást és ütésállóságot keli megemu i t eni..

A fiimtermékek fejlesztése nem az egyedüli lehetőség. A szilárd műanyagtermékeket is, mint pálcául az edényeket, tányérokat és tálakat, elő lehet áliitani több mint öv á keményiuö: felhasználva. Továbbá a keményi td/polimer keverékek azzal az előnnyel járnak, hogy biológiailag sokkal könnyebben lebonthatok.

Továbbá, a nagyfokú vizkötő képesség kever kerteden, a keményítő a beültetésre használt polimeréknél rendkívül »» ** **»« »« « φ Φ X Φ * ·* * « φ κ ** »** φ « Φ X 0 * * χ*Φ« φψΦΦ Φ» χ* Χ*«

Η fontos szerepet játszik. Szék a termékek keményitö vázzal és a beültetésre használt szintetikus monomer oldalrács struktúrával rendelkeznek a sugárirányé lánc-mechanizmus alapelvének megfelelően, A jelenleg rendelkezésre állá beültetésre használt polimerek jellemzője, hogy tökéletesített kötődési és megtartási képességük révén a keményítő grammonként lobé g vizet képes megtartani magas viszkozitási érték mellett, Az utóbbi néhány évben ezeket a szuper asszcvbecseket főleg az egészségügy területén, például pelenka es lepedő termékekben, valamint a mezőgazdasági szektorban, mint példás! maggoiyócskák eltel 1ifásában használtak t el.

.A rekombináns DNS technikával módosított éj keményítők használatában döntő egyrészről a felépítés, a víztartalom, a f ehér j startalom, a lipibt.arta.Iori, a rost tart alom, a hamui foszfát tartalom, az amiiőz/amilopektín arány, a relatív moláris tömeg megoszlása, az elágazások mennyisége, a szemcseméret és az alak, valamint a kristályosodás; másrészről a kővetkező tulajdonságok, melyek megnyilvánulnak az alábbi sajátságokbanu áramlási és szorpoiös viselkedésben, esirizképzödési hőmérsékletben, viszkozitásban, sűrűsödési képességben, oldhatóságban, a paszta lé lépilésében, áttetszőségben, hő, nyírási és savval szembeni ellenálléképességben, viaszaaiakulásí hajdúmban, gél kialakítási képességben, ellenálló képességben fagyssztássai/feiengedéssel szemben, kerge, ex képző képességben, jődkbtő képességben, ’ c --v ' ' k<m-w-e lse ~, adhéziós erőben, enzimstabilizálásX ΦΦ ΦΦ Λ Φ 9 4 ΦΦ Φ X

Φ Φ Φ φ φ φ φ Φ φ * φ φφ ΦΧ* ν Φ Φ Φ * Φ Φ φφ X Φ < Φ ΦΦ X * ΦΦ Φ Φ Φ bán, emész tbc tőzegben és r ea kei ő késze égben, A légiígyelemreméitőbb jellemvonás a viszkozitás.

e ·. i ·. , „ p ·> ' ¢. sejtjeiből nyert módosított keményítő ki indulási anyaga lehet további kémiai módosításoknak, mely további minőségi javulást eredményezhet az előzőekben leírt alkalmazási területek némelyikében. Ezek a kémiai módosítások alapvetően ismertek a szakmában járatosak szármára. Ezer az előnyben részesített módosítások

- savas kezeléssel, ~ oxidációval és

- észtereséssei (foszfát, nitrát, szulfát, xantát,· acetát és nitrát keményítőt kialakulásához vezet, hás szerves savak is felhasznalhatők az észterezéshez.)_r

- a keményítő-éterek előállításához (keményítö-alkii-éter, O-aiii I-éter, hídroxi a 1 ki i-é ter, ö-ka rboxime ti 1 ··é ter, E~ tartalmú keményítő éterek és E-taztalmi keményítő éterek),

- a kérésztkötéses keményítők előállításához,

-- a beültetésre szolgáló keményítő polimerek előállításához.

A találmány tárgya olyan szaporitönyagokra. i,s vonatkozik, 'úgymint magokra, gyümölcsökre, vágadékokra, gumókra vagy gyökerekre, amelyek tartalmazzák a találmány sejtjeit.

Letétek;

A jelen találmányban élőár Ütött és használt piazmidokat letétbe helyeztük a Deutsche Sammiung von Míkroorganismen und Delikul tarén-óéi (DSh, a mikroorgani zmusok német gyűjteménye, Braunscheeig, 'Németország) a nemzetközileg el*« φφ * Φ « 5

Φ *

ΦΦΦ* φΧ»<

Φβ ΦΦ

Φ

ΦΦ X φΦΦ φΧΦΦ φ φ ♦ « ΦΦΧ φ φ

Φ« χ*« fogadott letéti szervnél, mely felhatalmazást összhangban var a Budapesti Szerződés mikroorganizmusokra vonatkozó nemzetközi. letétfeehelyezési és szabadalmaztatás! megszorításaival (a letétbehelyezés száma és idege):

pBá.nAR Hyg plazmád	(DSM	9505}	kW 10/20;
pd d-sntá-BF plazmád	(DSM	-514 6;	(90/03/20;
pénz plazmád	ábSM	10225)	íáá/Ov/OMO

A használt táptalajok és oldatok:

BÍvodón puf f én j

5 a·:'··': irts (pH ^::: 3, 3}

25Ö mM giioán<

Diai1z1shez puffer:

mM Triz-HCl (pH == 7,0Sö mM fed mM EDTA

Μ, 7 mM h'-mar kapf netesoá fi, 5 mM AMuF hehe r j apu £ f e r :

0 mM n á t r i um - f o s z £ á t p u £ f e r · ρ H - 7 , 2)

0 mM itDl’A

0,5 mM FMSF

Iá, 7 mM k-merkaptretsnol **** «« φ * φ

φ« *φ dugod- o l dat:

g XT 6 g

1800 md kétszer desztillált vízben oldva x SSC;

178,3 g NaCl

88,2 g nátrium-cdtrát

1000 ml kétszer desztillált vízben oldva, pH - 7,Q, 10 H RaOH-val állítva, x KBb:

0 8 rab áb d S rad nátrium-'nitrát iá rdé EDTA pH m 7,0 , db EB puff cr

0,25 mM nátrlom-fősztát poftér (pH~7,2) % 3D8 mM EDTA % ESA (vegyesé;.

ezután röviden ismer te tjük az. ábrákat:

Az 1. ábra bemutatta a poáS-abti-Rt piazmidot.

A plazmid a következő fragmenseket tartalmazza:

A - az A fragmens a kelvirág mozaik vírus (CaCV) 3SS promaterét tartaímazza, et a CaMC 3906-7437 nukleotidjaiböl áld ) Erabck. es mtsai; Cell 21, 285-2 94 (1983)j .

« « ❖ * * « * «......

« * » ** *** * * :»· « * * ií **** ♦ «** ** ** *«*

Β ~ a. Β ftagmens hozzávetőleg 1341 bázispárt taiiAlsisz: a. pRLl Asp-718 fragmenséböl. A, pronozernez viszonyított iránya antisoonsz. A nyíl jelzi a nyitott olvasási koréi irányát,

C - a G trsgrans tsrtalwszs a: ii pia zmiá pTíACSS 1-Bdő—ának 11149---11 jég rnkleniíöjsit | Sióién és mtsai::: BAB© Journal 3, SIS--046 011349] , á 3. ábra bemntaiga a pB33“antí~Bk plazmídot,

A plazmád a következő fragmenseket tartalmazta:

— az A foagmert tartalmazza a Goiango tabaroram-ööi •származó- B33 pataiín gén B33 promoterjét ( boeha-Sósa és mtsai:: BMB© Journal 3, 13^29(19394 3 .

B ~ a S fragmens: hozzávetőleg 1919: bá.zis:pá,rt: tartalmaz a: yB.ll Aenli.l fzaymsnseből. A pnomoterhez viszonyított iránya, antíszensz, A nyii jóin:!, a nyitott; olvasási kőiét irányát,.

C- = a G fráymsn.s tartalmazza a II platóid gliAGBb 1-EBI-érák 1,1748-11939 nokleotidjalt [ Gíelen és mtsai: EMBO Journal 3, 315-843(1984)j ,

A 3. ábra bematátgo a nem-transz tormáit béslrée brr— gehyáből sz ária: zó: vizez keményít bordát Brabender görbéiéi:, melyet Vi s kogragh-E típusú Brabendér visz kézinétőrrel vettünk, fel. (lásd 3. példát isi.

Az alábbi kifejezések jelentése a. kővetkező:

Dtehm - torz lő, [SE] - Brabender egység.

Ben - bdmérseklot,

A - a csirítképzés kezdete, a nanlvrom vi sz közi tás.

Φ χ φφ φφ··» *·. Φ X φ φ φ Φ χ χ Φ φ χ φ: Φ * φ χ φ Φφ *»* * φ φ Φ Φ X Φ

ΦΦΧ* XΦΦΦ Φ* ** ***

C n ς v : ui- \tzdtto,
b a babésb	idő kezdete.
E - a hűtési	idő vége.
F - a végső!	>ö C° periódus vége.

A kék vonal a viszkozitást jelöli, A vörös vonal a hőmérsékletet jelölő.,

A 4, ábra bemutatja a p3.3S~anti-RL piazmiddal transzformált burgonyából számozd vizes keményitőoIdát Brabender görbéjét, melyet Viskograpb-E tipusn Brabender viszkóz!méterrel vettünk fel (lásd 8. példáz Is? ,. A rövidítések magyarázatát lásd a 3t ábránál, .«s S, ábra bemutat· ja a pBö3-ant l.-hh ylszplödal transziormált burgonyából származó: vizes kemény tudóidat Brabender görbéjét, melyet Viskograph~E típusú Brabender viszkoziméterrel vettunk fel (lásd 8. példát isi , A rieőltések magyarázatát lásd a 3, ábránál.

A g. ábra bemutatja	a bargór	iyanyövén?	zbői i	Zoláit
keményt, tő vizet oldatainak	görbéit.	melyet	Rapid	bisoo
analizátorral vettünk bei	\ Z S. *·;. t i.X ,	példát á	. s ϊ . A	vörös
vonal a hőmérsékletet jelzi,	mig a kék	; rónaiak	(1,2, 3	és 4}

a következő oldatok viszkozitását jelölik:

I... rónai: a mö-i ipari növényekből izolált keményítő,

2, vonal: a csak elágazási enzimjében gátolt növényekből izolált keményítő (vő. a bö 82/14827 számú szabadalom 1 példáyávalj, * # * *·*

3. vonal; olyan növényekből Izolált keményítő, melyet csak a találmány fehérjéinek koncontrációjában csökkennek (vö. a 6. példával},

4. vonal: a plöS-anti-Rb éa a. p3SSH~antl-BS plazmidokkal együttesen transzformait növényekből izolált keményítő (b a 12. példával):.

A t. ábra., bemehet la a bar gonyanyóvéay ékből izolált keménylbő vizes oldatainak görbéit, melyet Rapid. Vd.zco analizátorral vettünk fel (lásd 13. példát led . A vörös vonal a hőmérsékletet jelzi, mig a kék vonalak (1,2,3 és 4) a következő oldatok viszkozitását:

1. vonal.: a vad-tipuöü növényekből izolált keményítő,

2. vonal: a ónak pBod-soti-SBBoi: piszmiddai transz törxrál t növényekből {égynevezett vcny burgonya.) izolált keményítő,

3. vonal: a csak p33S-a.cti-EL plazmiődal transzformált növénye kb el izolált keményítő: (vö© át ábrával) ,

4. vonal; a pB33-ant,i-Rb és a pBuÜ-anti-GBSSI plazmidokkal e g yü t f. e s e n t r a n s z f o rrcá 11 n ö vé n yekb ö 1 í zoláit kémé n y 11 ö {vo . a 13. oá Idával! .

A 3. ábra bemutatja a pRL2 plazmidot, mely tartalmazza az Rl enzimét kódoló, burgonyából származó cDBS-t teljes égé őzében

A r a1á1má nyt pé1d ákοn ke re s z 131 mu t a t j uk be.

1. A kiőnosás á klónozáshoz Rsolarickia coll pBluescript SK vektort ha a z ná l. t ünk .

χχ χ * Χ*

A növényi sejtek trmszf ormáció j óhoz a géakonstrukciökát pBinAR bi fankor ös_: vert árba ( betgen és bilim!ezer; Pláné Sci, ujj, 2 21-230 {1990 )j és B33-Hyg-be klónoztuk .

2. A oa k töri um t örzsek

A Bluescript. vektor es a pEinAR és a B33-Hyg konstrukcióshoz az Űsoherichia col.; DHS« törzset használtuk (Bet.be.sda Research Laborétőrien, Gaitbersburgh., ISA; .

A pl a z m 1. co k t r. a n s z f o rm á c i ó j á t buzgó n y a n övén y e kb s Agrobec tórium tuznefaciens C38C1 pGV2280 törzs felhasználásával· hajtottuk végre (bébi sere és mtsai: buciéic Acids Re s e a r c t 13 , 777 - 4 7 8 8 (i 8 3 5) ]

3. Az Ay.rebf5eterluöí turné rá ele na transz formáé löö a:

A. DNS átvitelt noigen és hílimit zer módszere szerinti közvetlen transzformációval végeztük [Pofgén és hrlimitzer; hnoleic Acids Research 16, 9877(1383)), A transzformált piazmid BhS-t Bimbóim és Doly módszere alapján izoláltuk {Bimbóim és Boly: buci.ere Acids Research 7, 1513-152 3(1.979}

| és arkalmas	restrikciós	emésztés	után
géléie k t ro torét i kásán	analizáltuk.
i. A burgonyák transz.	: orrhoz oz a;
A burgonyák transziorméciőjához a	burgonya	steril
tenyészetének (doianum tuberosutp Désirée	fajta) 10	kis le-

veiét szikével megsértettük és 10 ml MS tápközegbe {Murashige és Skoog: Bhysicd, Plaht 15, 173-497Q962; ] helyeztük, mely 2 3 szacharózt és 50 pl egy éjszakán át szelektiv körülmények között növesztett Agroöacterfízm turnézaccere tenyészetet tartalmazott< 3-5 perces gyenge keverés után a keveréket 2 napra sötétbe tel ver tűk. A kaiiusz. indukcióhoz a leveleket 1,6 % glükózt, 5 mg/ml naf ti 1ecet savat, 0,2 mg/l benz.·.i-sminopnrin t, 250 mg/i clatorant, 50 mg/i kanamioint vagy 1 mg/i hígromiéin B-t és 0,8 % Bacto ugart tartalmazó MS tápfcöregbe tettük, bl-on 3000 Ion melletti· egy hétig tartó inkubáiás után a leveleket a gyökér· indukálásához 1,0 1 glukózt, 1,4 mg/l reatin ricctt, 20 mg/ml naftil-ecetsavat, 20 mg/i gibfeereiiinoavat, 250 mg/l ciaíorunt, 50 mg/l kaaamícrnt vagy 3 mg/i higromioin B-t és 0,S % Dacia ugart taréelmaró MS t , ^r« tn \ ' Ί\ν

5. A DNS fragmense/ radioaktív jelölése:

A DNS fragmenseket DNS raudom-primer jelölő készlettel (Boebringer, Németország) a gyártó információinak megfelelően χadieu kelten jelöltük.

ö> A Noti/ern-blob átálltfar

Az RNS-t a növények levélszövetéből standard eljárási sémák feihaernálásával izoláltuk- Sö pl RNS-t agarőz gélen szétválasztottunk (1,5 1 agaróz, 1 x NEM paffer, 10,6 1 formaldehid} . A gélt röviddel a gél. futásának befejezése után mostuk. Az RNS-t átvittük Ryhond N nylon membránra (Amersham, DK} kapilláris lenyomatulácsai, 20 x SSC-t használva. A membránt ezek után 2 óráig 80 bf-on szárítottuk.

MSED pu .Cserben a membránt eióhioridízáituk 2 őréig, 68 bi-on, es ezután radioaktivan jelölt próba jelenlétében, NBBB púifarben, egy éjszakán ét, 03 b>on hibridiráltűk.

7. A növények fenntartána:

ΪΧ «« ΦΦΧΦ ΦΦΦΧ . φ χ. φ X Φ Φ Φ φ Φ Φ Φφ XX Φ φ X φ Φ * X * .φ·Φ β««χ χχ ** ΦΦΦ

4S

A búrgonyanévényekét üvegházban tartottuk a következő körülmények között;

megvilágítási idő: 16 őrs, 2.500 lux és 22 Ö, sötét periódus: 8 éra, 15 ^cC-on, páratartaium: 6ö %,

8, Az abilóz/ami iopektin arány -súgna tarozása b a rg ο n y a n áve n y e kb ö 1 n y e r. t k e mén y i t őbö 1:

A keményítőt fotrgcnyanóvényekből izoláltuk standard módszerekkel és az amilőz/amiiopektin arányt HovenkampHermeiink és munkatársai által leírt módszerrel határoztuk meo( Hovenksmp-Hermsl.ink és mtsai ΐ eotáto Aesearob 31, 241id v iiáSS/i .

9. A gittem, fruktéz és szacharóz meghatározása:

A glükóz-, Irvktoz- és/vagy szacharóz tartalom meghatározásához a hurgonysgumő egy kis darabkáját -körülbelül lé mm átmérőjűi lefagyasztottuk folyékony nitrogénben és közvetlenéi ezután extraháituk 30 percig 80 C°~on 0,5 ml 1.0 mM HBPBS-t (pH 7,5} és 80 térfogati etanolt tartalmazó oldattal . Az oldha tó komponenseke t tartalmazó tálalná zőt kinyertük és térfogatát meghatároztuk.. A feinlészot használtuk fel az oldható cukrok mennyiségi meghatározásához, Az oldható cukrok. mennyiségi meghatározását a következő összetételé reákο1ókeverékben hajtottuk végre:

180, 0 mö imidazol/hei /gk ==^: 1, 91 i , 5 mtl dyC'lg

0,8 idd PAPP*

1, 3 mP _: A í I?

000*

X 0

Χ0Φ

0

Φ0* « * 0' «·»♦♦· , ί <

♦ 1 * 0 0

Χ·*rö-öö al minta l, ö egység giükőz-ü-foszfét-dehidrogani z (élesztőből) ,

A reakciőkeveréket inkobáituk szobahőmérsékleten 5 percig. A közvetlenül ezután kővetkező cukormeghatározásc Standard fotometriáé eljárásokkal végeztük, az abszorpczot 34 0 nm-en mértük azt után egymás után hoz ráadtok a köve t vevőket:

1,0 egység élesztőből származó heaokinázt (a glükóztartalom meghatározásához) ,

1,0 egység élesztőből származó foszfoglükoizomerázt (a frukt ő z t a r t a i cm me ej ha t á r o z á s áh ο z} é s

1,0 egység élesztőből származó ínvertazt (a szacharóztartalom meghatározásához).

1, Példa

A___rétén y11 ö s zenesébe z kötött fehérjék r ζ oIá iá s a ι ,_tj, ., μ _?r euy: t ct öl

A kemény 11 Ős z eme séhe z kötö 11 feh.érjék© t. e 1 e kt r oe 1 uc 1 öval izoláltuk burgonyakeízényítőből, agy olyan eincios készületben.

lódéi 422 Electre Eluter” (B10.RAD laboré· tori.es Inc, , USA) készülék alapján kész etettek, de figyelemreméltöan nagyobb térfogattal rendelkezik (hozzávetőleg 2öG ml) . 25 g szárított, kemény feloldottunk az élőerős pofiét bon (a végtérfogat EO mi). A keményítő olyan burgonyába! származott, mely majdnem csak amilőzmentes kemény.! tőt szintetizál, mivel ebben a növényben az 1-es izotipusu (GB S -SI) k emé n y 1 t c s ? emeséhe s k ö t c d ő k s m é n y i t ő -szintet á z t kódold DNS ontiszensz módon expressssálödott. A sznszpenziót főimélégitettük 70-80 C°~ro vízfürdőben. Közvetlenül ezután 72,07 g nrean adtunk hozzá, (a. vág kon cent ráció 8 ti) és feltőitcitük 180 Tfíl-ro az eluoíös pufíerrel. A keményítőt állandó keveréssel feloldottuk, és így ez esirízes állagot nyert. A fehérjéket kinyertük az oldatból egy éjszakán át történő alekérőéInclévai fíüO 1; 50—69 mAj . A szaszpendáit részecskéket eltávolltottűk rövid centrifugáiással. A fa— laiüszöf diaíisáltuk 1 fő-oa háromszor 1 óráig dialízis pnfferrel szemben. Közvetlenül ezután meghatároztuk a. fehérjeoldat térfogatát. A fehérjéket kicsaptok smmőninm-szoltát hozráadásával ía végéoncetráeiő 90 1) állandó keverés mellett δ C°-on, 1 kicsapódott fehérjéket leüiepitettok eentríragéigsasi és bei vet tők fshéajGpntferben 2. Példa

A kentényitőszenscsékhez kötődő fehérjéket kódoló cDNS

S^: zeky e ηο,Ι,Ι,Ι· szooogl f ágg_: ég- iz o Iái ága.

Az 1. példa szerint izolált fehérjéket felhasználtuk nyel abban po.11.Iloné lis ellenanyag előállítására, melyek specifikusan felismerik a keaényitőszemoséhez kötődött fehérjéket .

Ilyen ellen, G .m felhasználásával ezután szűrtünk egy cDNS espreoszzöo könyvtárat a keményitcazercoéhez kötődött fehér jére nézve; standard eljárásokkal.

♦ χ χ*

X X X * »χ*χ χχχχ χχχ χ **** *♦** χ Χχ XXX χ X XX X χχ χ» XXX ér expzeasziős könyvtárat a következő eljárással késetté ttok:

A poli-{A”j-mRbS-t Izoláltuk, a ^,:Serclina fajtáié burgonya: gumójából. Kiindulva a poli-íA^) -oőbS-bei cöbŐ-t készítettünk őubler és Hoffmann eljárásával [ Gábler és Holfmann; Gene 25, 213-269;1983j j , felhasználva egy Xhol TOli go d(t)lS 2 rímem. Ezt a DNS-t vágtuk Χηοΐ-gyei, majd hozzáadtuk az Kaoal-linkért éa Irányítottan ligaltok EcoRIgyei. és Ahol--gyei emésztett lambda Iá? II vektorba, Ezzel a mőoszerrei hozzávetőleg aödÖOO giakkof tartalmazó cDNS könyvtárat kaptunk, zielyet szűrtünk a keméryltőszemcséhez kötődő fehérjék ellen készítem políkl.onáli s ellenanyaggal.

á fégpiakkok analíziséhez átvittük azokat nitrobellulöz membránokra, melyeket előzőleg inknbáltnnk lö női 1PTG oldatban öö-tét Síi perein, majd srurőpsgizöo megszárltottnk. Az átvitel 37 ö°-on történt öö percig. A membránokat ezután 3d dered g szobahémér sékleten í akübádf uk bt okkor őt tagé abbéd és mostuk S-lö percig TEST pufferben.. A membránokat a keményítőszemoséhez kö tődő fehérje ellen képzett poliklonális ellenanyagot megfelelő koncentrációban tartalmaző ormiban egy érát szobahőmérsékleten vagy In órát 4 C°-on zárattuk. A. poliklónális ellenanyagok által felismert fehérjét expresszálő pl átkok azonosítását Blöthlng detection kit tor rabbit antibodies RPd 23” készlettel íAmersham OK} végeztük el a gyártó előírásainak megfelelően.

«Φ χ·Χ ΦΦΦΦ ΧΦ *ΧΧ * « Φ φ » Φ χ * * φ « » Φχ ΦΦΦ

Φ -φ Φ X Φ .Φ Φ

ΧΦΦΦ «XX* Φ* ** X»*

Α poiikionálls ellenanyagok által felismert fehérje expressziós cWS könyvtárának tág klórjait tovább tisztitortok standard rsödszerek felhasználásával.

In vivő kivágási mód szeszei az Esol/eri csia coli ki οποίον. megkaptuk a pozitív fágkIonok közti, melyek tartalmazzák a pbiuescript kettősszálu plazmádét a megfelelő nóNS inszertbel. őgy alkalmas kiön mezeiének és restrikciós mistázatinak ellenőrzése után a pHll-et továofc analizáltak.

3. óé Ica

A pb 11 plazmid cDdS isszertjének szekvsnclaanallzise

A 2. példa szerint nyert Esete ?:d sála coli kidobói a pRLl plazmádét izoláltok, és a oDUS inssersiójának egyik s z e k v e-η cl a rés rét standard elvára, sokkal mégha táró z to k, felhasználva a. didczoxisnkleotíd módszert ( Sanger és mtsai; broceedings of the baricsal Acaderny of Sciesoe, USA 74,

63-5467(1977)], Az leszerelő hossza körülbelül 24 50 bp. A rshzleot.i.dszekvenciának egy részét, valamint a belőle származó amloosavszekvesciát a 3-as illetve a 9-es szekvenciaszámon tettük közzé,

A szekvenclaanaiizis és a szekvencia összehasonlítása ismert DÚS székácselét kai azt motetta, hogy a 3-so számon jelzett szekvencia üj, és az eddig ismert szekvenciákkal nem mutat szignifikáns cönológiát. Továbbá a szekvenclaanaiizis azt mutatta, hogy a cDNS lőszert csak egy részleges oDNS darab, melyből az 5’-végi kődoiö régió hiányzik.

ΦΦ Φ*>ίφ φ * φ φ» φφφ * * ΦΦ

Φ φ « X φ * φ χ **·♦·♦ φ«φφ

4.Példa

A kemény 1 tőt zeneséhez kötődő fehérjét kódoló teljes obbS izolálása éa azonosítása föl aram zene rónán--tői

A pRLI plazmid részleges oDdl lőszertjének megfelelő teljes eféb izolálásához egy tevéből cDM könyvtárat készltettánk. Ez egy védősejt specifikus oDNS könyvtár öolumru tuberooum-böi, melyet a következőképpen hoztunk létre:

Először a úeslrée fajtájú burgonyanövény leveleinek epidermisz darabkáit készítettük el [ üedrich és mtsai: Plánt. Physiod 8 5, 118 ílsSájj összegyűj tve hozzávetőleg 50 darab levelet üvegházban tartott hathetes faurgonyanövényekröl. A levelek központi erét eltávolitottuk. Közvetlenül ezután a leveleket négyszer 15 másodpercig' hidegen összezúztuk ”Staríng turmixban (1 liter térfogatú) desztillált vízben, a legnagyobb fokozaton... A. szuszpenziót ezután 22ö g.m ly ütőered nylon szűrőn szűrtük (Nykoit, Zürich, Svájc)· és többször mostuk hideg desztillált viszel. A szuszpenziót magát zlö pm-es nylon szűrön szűrtük át, és intenziven, mostuk jég.<.<{ t , isi o..i·. .. ú i , ,.e í~. i terr s~ rs-tcke V négyszer 15 másodperéig Összezúztuk egy kisebb ” bering*’ turmixban (250 sd.-os térfogatú) desztillált vízben, jégen, sáaesbnyabh fokozaton. A szuszpenziót 22ö um-es nylon szúrón szűrtük át és intenziven mostuk jéghideg desztillált vízzel, Az epidermisz darabkákat (maradék) mikroszkóposán megvizsgál zuk a mezofrl sejtek 'jelenlétére nézve, na szennyezésként jelen voltak mezofil sejtek, akkor a turminoiégt a kisméretű ^!t bor ingé túr ml xban me g í ómét el tűk', φφφφ

Φ

ΦΧΧ

Φ *

ΦΦΦ

Φφ φΧ φ φ φ X φ φ φ * «φφφ φφφφ φφ φφ » *

ΦΦ X*

Az epidermisz darabkákban levő védoeejtek eIroncsolásit folyékony nitrogénben történő poritássai értük el egy lehűtött dérisosésseben, hozzávetőleg két éra alatt. A véhősejtek feltörésének ellenőrzéséhez rendszeresen mintákat vettünk es mikrőszképesen vizsgáltuk azokat. Két éra után, vagy ha már elegendően nagymennyiségű védősejt szőr.roncsoleoott, a kapott port reákelőcsőbe (Sö ml-es térfogatáé toltőttűk és felszoszpenőáitufc GTC pufferben bChirgvin és mtsai: Biochem IS, izéi-52ás(197 9)} . A sznszpenziót centrifsvaitok és a feiülöszőt szűrtük Airsolofh-on (Cslbiochem, ba Jolin, California) . A szűri etet 16 éráig ultraoentrí ingái tok, ahogy azt az irodalomban leírták ( Gllsin és mtsai:: Brcchemistry 13 2:633-2C33 } i 974} ; és dornex és mtsai:: J. Clin. Invés. 77, 1902-1961(1986)] , Centrífugálás után az RNS preoiprtátnmof feloldottuk 150 pl GTC pufferben. Az KűS-t kicsaptuk 0,üu térfogatnyi 1 M ecetsav és 0,7 térfogatnyi etanol hozzáadásával. Az RKS-t centrifugáiással összegyűjtöttük és az üledéket mostuk 3 M. nátrium-acetátot (pH ^:::: 9, §n és 7ö % etanolt _A-tattal. A 173-; megszánltottűk és feloldottuk DSPC-vel kezelt vízben,

Az izolált RhS-bői a poii-(A⁺)-mRNS-t izoláltuk két standard eljárással. A poii- (Α'Β •-mRbS-böl. kiindulva a cDNS-t Gablez és Hoffmann eljárásával (Gabiét és Hoffmann: Gene 25, 263-269(1983)] állítottuk elő az Xho Ι-oligo diádig primer segítségével. Ezt a 113-t vágtuk Khoi-gyel majd hozzáadtuk az EcoRI-Iiokert és irányítottan ligáitok BcoEl-gyel és Ahol-gyei emésztett i/nrbhs ZAk II vektorba (Siratagene Crnbh, ** ♦ * *

Φ««Φ 9« «VX9 * * Χ· * φ X» *ΦΦ

Φ Φ Α * * κ* φΆ »««

Keilderberg, Németország>, A fágfegek bepakcl&sát Gigapack II Goid készlet (Stratagene Gmbh, Herlderberg, Németország· felhasználásával végeztek a gyártó előírásai szerint.

Az ilyen cDNS könyvtárból a páll plazmid. cDNS .'.?.szerttel hiteidizálódó iágklőnokat izoláltuk és tisztítottuk, standard eljárásokkal. In váró kivágási módszerrel megkaptuk a pozitív fágklónok közűi az ásoberichia coll klótokat, melyek tartalmazzák a pBluescrípt ketfcősszálu plazmidot a megfelelő cDNS inszerttel. Az részérték méretének és restrikciós mintázatának ellenőrzése után az alkalmas klánokat vizsgáltuk restrikciós térképezéssel és szekvenciájak analízisével. Sgy megfelelő klönbői izoláltuk a pRLz plazmidot ÍDStí 10225), mely tartalmazza a keményítőszeneséhez kötődő fehérjét kódoló teljes cDNG-t,.

. Példa.

A pRL2 plazmid cDNS inszertgének s zekvenclaanald zlse:

A y.R1.2 plazmád cDNS inszert lének nnkieozrdszekvenciá iát at 3. példában leírt módon határoztuk meg. Az inszert hossza kSőő bp. A. nukleotídszekvenciát és a belőle származtatható amlnosavszekvenoiát az 1-es és/vagy 2~es szekvenoiaszámon mutattuk be. A kővetkezőkben az ennek megfelelő gént kire uccu hívjuk.

5, Példa

A_ p35S~an.ti~.RL plazmid megszerkesztése és bejuttatása.....a burgonyanővény genomjaha φφ ***♦ Φ X X Φ ·« φ φ *

X Φ φ Φ

ΦΦΦΦ φφφφ #χ

Φ φ ΦΦΦΧ ' Φ Φ .

φφ ΧΦΦ * Φ φφ φφφ

Ar Asp7u8 restrikciós endonukleáz segítségévei egy hozzávetőleg 1830 hp nagyságú DNS fragmenst rzoiáituuk á pB.Li plazmádból. Sr megfelel a 3. szekvenciaszámon jelzett DNS szekvenciának és tartalmaz egy nyitott leolvasási keretet. A fragmenst 1igáitok az Asp?18 restrikciós endonukleázzal vágott phinAR bifunkcionál is vektorba [hőfgen és hiiimitzeru Plánt Sói. 56, 221-230 (1990}] . Ez a vektor a pSi η19 [Sevaη: Νη οIe i c kei de Heseat eh 12, 8711-8721(1981)] bi tünde i opál.is: vektor származéka, A ppEiuAR vektort a kővetkezőképpen hoztuk létre:

Az 529 bp hosszúságé A fragmenst, mely tartalmazza a kei varán mozaik vírus ) 35S promoterét, azaz a CaKV

0901-7997 snkioutidiait :[ drauck és mtsai:: Ceil 21, 285~

294(198013 í izoláltuk a pDNSl plazmádból | Hietrzak és mtsai: h..cl\ ^Aa ._s, 5857-58681 mint egy EcoBJ/Hpnl fragmenst és ligáitok a pBiulá plazmád pöliiink.erének EcoRI és Apui helyébe. így kaptuk a pSrniá-A piazmidot,

A Avul! és Bzndlrl restrikciós sndouukleázok segítségévei egy 192 bp nagyságú fragmenst izoláltunk a pACAlo piazmldboi [ Kerrera-Ssfrelia és mtsai: Natúré 303, 209-213] , mely tartalmazza a pliACdS Ti-piazmld T-DNS 3. génjének pel iádén 1 léc ró s jelét [ ere len és mtsai.: EMEG Journal 3, 8358élj , a 11749-11939 a:nkragtedókáé. Hintán, a Avul helyhez: hozzáadtuk az. Sphl linkért, a fragmenst ligáitok a pasin 19-A piazéiő: Sphl és hindi 11 helye kosé. Ezzel megkaptuk a painAH plazmidot.

*** Φ

Φ

ΦΦ* «

ΦΦΦ

ΦΦ φ* ΧΧΦ* φφ Φ Φ X 0 Φ Φ * « φ » φ*

Φ 4 X 0 Φ Φ «ΦΦ* φ*ΧΦ ΦΦ ΦΦ

A rekombináns vektorok, restrikciós és szekvencia anaIzzzsével asonositott.uk azokat, melyekben a DNS fragmens úgy ínszertálodott a vektorba, begy a pELl-boi származó oDkS inszert kódolt régiójának része kapcsolva van a 35B promoPerrel antiszense irányban. Az eredményűi kapott piasmidoi,, a poüS-anti-Rt-t, az 1. ábrán mutatjuk be.

A oDNS fragmens imsoertálásávsl egy expressziós kazettát hoztunk létre, mely tartalmazza az .A, 5 és C francon se kot. :

Az 529 bp bosszúsága A fragmens tartalmazza a kelvirág mozaik vírus (CabV) 3 3S promoterét, Az A fragmens tartalmazza a CaMV 6999-7437 nokieoéidy alt [' Francé és mtsai : Cell 21, 285-294 (1980)) .

A határolt; régiókon kivöi a B fragmens: tartalmazza a pFLl plazmád cDNS inszertjenek fehérjét kódoló részét. Ezt a. pRLI plazmádból egy Asp718 szegmensként izoláltuk a fentiekben leirt módon és fuzionáltuk a 255 promoéerrei, antis z e ns; z i r á n y b a n .

A C fragmens (192 bp) tartalmazza a pliACHS Ti-plazmid l-DFS 3, génjének poiiadeniiáoics jelét lézeren és mtsai: BHB0^: Journal 3, 83 5-846(1934)) .

A p3 5b-«nt.i-nL plutmid hozzávetőleg 12,8 kb nagyságú.

A pl azmidet agrobakbériumok által közvetített transzformációval juttattuk be burgonyanövényekbe, ahogy a fentiekben azt leírtuk. A transzé ormait, növényeket üvegházi kerélmények késett tenyésztettük, φφφβ φ * φ * «φφφ «φφφ φ«*φ -φφ φ φ φ φ φ« φ φ φ φ

Φ φφφ bor fcfte.r'ö lenyom® tolás i tódsz.arre.l a.ná.1.1 -záIva a teljes ESS—t, a cllll- re komplementer traaszocucc el tűnésére nézve, megbirceyosodtunt a növények genetikai módosításának sikeréről. Erre a célra a transzformált növények lóvéiéiból izoláltuk a teljes WS~t standard eljárásokkal és ezután elektroieretikosán szétválasztottuk azokat agaréz gélen. Ezerén átvettük nylon membránra és hibáidizártuk raeioaktívan jelzett, próbával. A próba szekvenciája megegyezik az l-es^: szekvenciával vagy annak részéve.L. A transzformált növények körülbelül 5-13 I-ában az 1-es számú szekvenciára, specifikus: esik hiányzott a Northern analízisben. A növényeket felhasználtuk a keményítő minőségének analízisére,

7. .Példa

A pEiö-anf i-RL plazmád megszerkesztése és bejuttatása a.

búrgonyanövények genomj ába

Az Asp713 restrikciós endonúkleáz: segítségével egy hozzávetőleg 1800 bp nagyságú DNS fraymenst izoláltunk, mely tartalmazza a pPLl plazmádból ízoiáit cbbS inszertjónek egy részleges nyitott leolvasási, keretez, és ligáltunk az Asp'llS restrikciós endonukleázzai vágott B33~Ryg vektorba.

A. 3 ás proraebert el távol ltot tűk a pBinAR Syg ve-fct őrből {DSM 9505) EooRl és Asp7i8 restrikciós endonukleázok segítségével. Egy körülbelül. 1526 bp nagyságú íragmenst, moly tartalmazza a B33 cromotert, izoláltunk a pdu-anti-BE plazmrdből (DSb 6146) EooRl és Asp718-as emésztéssel és beépí» « * * 9 9 * «

Λ # * **« * * * « « ♦ « :***·* ♦* «* *** tettunk az EcöBl és Asp?18 enzimekkel vágott pBinAE Hyg vektorba ÍDStl 9 010 .

A gONS fragmens B33-Eyg piazmid Asp?18 helyére történé beépítésével egy expressziét: kazettát állítottunk elé, mely tartalmazza az: A, B és G fragmenseket <4. ábra), melyek, leírása a következő:

Az A fragmens tartalmazza a óblanum tőbereáom-ból származó Brr promotert (EB 3775. 092 és Rocha-Sesa és mtsai:: MBQ Ganz sál a, 2 3-29 (19 8 9)1, határoló régión kivé! a B fragmens tartalmazza a pP.Ll plazmád tekerj ót kódoló eDNS inszerilének egy részét. Ezt a fragmenst. a pRLl-böl Aspvls endonu. kieáz za1 izoláltuk a fentiekben leírtaknak megfelelően és fuzionáltuk a 333-Eygbe an t i szene z: 1 r án y bm .

t_t,r''c *-íi⁺ ma ti \- y- '-'ί

BEE A. zenjének poiiadeniiáciős jelét í eleien és mtsai:: ENBQ db u r n.a 1 G, 835-898(1981) f ,

A pB33-antí-RL plazmáé hozzávetőleges saérete 12,8 kb,

A plazmidot agrobaktérrumok által közvetített transzformációval bejuttattuk hurgenyancvényekbe, ahogy azt a fentiekben leírtuk.. A transzformált sejteket egész növénnyé regeneráltuk, A transzformált növényeket üvegházi kőrolmények' koz ott tényé estettük,

Northern lényemétolása módszerrel analizálva a teljes RNS-t, a cBNS-re komp lemen far transz kripták eltűnésére nézve, megbizonyosodtunk a növények genetikai módosításának éttéréről. Erre a célra a transzformált növények gumóiból ♦ ♦ φφ» «- X ♦ > * ··♦: »»·.

χ ♦ * φ· Φ Φ standard eljárásokkal izoláltuk a. teljes RP5~t és ezután agarbz gélen elektrezoretikusan szétválasztottak azokat. Ezután átvittük nylon membránra és hibddizáitok radlcaktivan jelzett p ni;;.. A próba s zek véne iá ja: meg egyezik az l~es szekvenciával vagy annak részévéi. A transsf-órtólt η 'Ον'· Ί ' 2 í. d ~~i ' -el c. ~'O CcM '<? „ specifikus esik hiányzott a Northern analízisben. Ezen növények gumóidéi a keményítőt izoláltuk és analizáltuk a íd példában telrtaknak megfelelően, id Pálca

A t r a n s z termál t Jzu r go ny a növénye k a n a 11 z i se

A 6. és a d példa szerint transzéormait burgonyanövényéksf megvizsgáltuk áz: általuk szinfetizázt keményítő.tűin: gbonságaids nézve, hü:icnfeénd burgonya venni a k nnal ifi séf végeztük el, melyeket transzformáltunk pózS-anti-RL vagy pbli-aráréi plazmáddal ős melyek, a Pertuéra analízisben nem matattak. olyan tramsz'kripfef jelölő csikót, mely a találmány EPS szekvenciáihoz hi.br í dl zálődík, a; A keményítő vizes oldatai viszkozitásának meghatározása:

A transztormáit burgonyanövényekben szintetizált kéményílé vizes oldatai viszkozitásának meghatározásához a keményítőt standard módszerek felhasználásával Izoláltuk a plóE-anti-RL vagy a p83d~anti-R.L piasmidokkal transzformált növények gumóiból.. Mindegyik keményítőből 30 g-ot felöldobtunk sőő ml vízben, és ezt az oldatot Viakograph S φφ φφφφ φ* φ χΦΧ Φ X** (Brabender OHG, Duisburg, Németország) készülékben analizáltuk. A készüléket a gyártó ajánlásainak megfelelően mükbdtettnk. A kemény1tőtartalmu vizes oldatok viszkozitásának meghatározásához a koméryltő szuszpenziót először 5ö Ü-rói. 9 8 hG-ta melegitattuk 3 *C/perc sebességgel, Ezután a hőmérsékletet 30 percig 11 *€-on tartottak. Majd. az oldatot 96 Ü-röi 5-0 Ü-ra hütötfük 3 *C/pero sebességgel. Az egész folyamat alatt viszkozitás-meghatározást végeztünk. A mérések eredményeit görbék formájában mutatjuk be, melyekben a viszkozitást az idő függvényében ábrázoltuk a 3„, 4. és 5..

ábrákon. A 3«	ábra a vad- típusu	Dérirés faj	ta burgonya-
növényből kapott keméeydts	tipikus	Brabender	görbéjét	ma-
tatja. A 4, et	5. ábra a	p3ö3-anti-BL és a	pB33-ant	i-Bb
p 1 a z mi de k k a 1 t: r a n s zf ormi 11	be rgοn yanövényékböl	i.zoiá It	ke -
menyied tipikus	őarbender	görbéjét	mutatja. Ez	ékből a	tör-
békbői a jellem	ző értékek	ikövetkeztetbetok.
A vad-tipa	sű. no vények	jellemzi	értékel a kővetkezők	=
1. Táblázat:
Érték Ide	Forgateng	’omaték	Hőmérséklet
isi./: beaj	i M		C1°)
A; A3 ő	10, 5 ±	j '7 . '7	8S,á ± :	1, 57
B llu ŐŐ	1.338,0 ±		8 8 ,· ü ±	2,1
G lő·; 15	1413,0 ±	13, 4	98, 0
B Aon lő	ők 6,0 1	Iv, 0	áh, 0
B 5 Öv le	812/0 i	8,5	51,0

„ X * * ζ ζ «ΦΧ*

ΦΦΧ *

X Φ*

Λ

853,0 ± 5,7

Α'·4 f V

Az érzékek két különböze mérés átlagait mutatják.

Az 1, é t az az t követő 2. és 3. tábla zakókban a következő netöltéseket alkalmaztok:

A ~ a csirizképzés kezdete,

B ~ a maximális viszkozitás, o ~ a 9ö l°~os periódus kezdete/

D a hűtési idő kezdete,

B - a hűtési ide vége,

F - a végső-5ö C° periödts vége.

A p35S~anti-RL (kz-eo vonal? plazmáddal transzformált

nő vények, j e 11 e m ζ o	értékét a következek:
2, ráblázati
Érték idő	F o r g a t S n y o m a t é k	Hőmérséklet
[ min : sec)	ί ÖE|
A 0 : ö ű	SÖ, Ö	59,0
B lé: öö	820, ö	93, 0
C IS·:· IS	315, ö	9 0, Θ
b 15: IS	ce, 0	35,0
B Öű: 30	1150,0	5 Ö Ö-
F 70: 45	12ÖÖ,0	50,0

A pBÖÖ-anéi-xr <P3-as vonal) plazmáddal transzformált növények jellemző értékel a következők:

.··. ... .... ,**. _r* v *. * .# χ Φ

ÍJI«« <«»« ♦* ·** ***

3. láb1ázató brték idő min; seol k 7: ét:

Is Itt 15:

G 15; ok b 45; 15

Ő 55: 3© k vé: ü5

F or gatánvénatök	Hőmérséklet
í kbl	( c<k
1115	71, Ö
óll, 5	85, 3
aeo n	Q iá <7
A? t.' A.· f t.	,.· ? γ k?
fed í f d	3b, 0
1053,5	50,5
1Q21, 0:	55,0

5. ábrák féi.reérnnetefienúl azt mutatják, kegy a transzformált sejtekből kapott keményítő különbözik a vad-tipusú πövényákból nyert keményítőtől, mivel viszkózért sz csak igen kis mértékben csökken melegítéskor. így a transztermált növényekből származó módosított keményítő maximárrs viszkozitása melegítéskor több mint 50 %-kal kisen.c, η; int a vad típusú keményítő viszkozitása.

kötés ala.it, ezzel szemben, a transzformált növényekből izolált keményítő viszkozitása godban no, mint a vad-tlposá növények keményébőge eaeteban,

a): é keményítő f oszf ártartalmának meghatározása;.

A keményítő fősz fát tart a Imát a C-ú helyzetben lévő foszt át kötés mennyiségének mérésével kaiáróztuk meg. Srre a célra, először a keményítőt savas hidrolízissel lebontottuk.

XX* # és s glükóz-6-főszfát tartalmáé közvetlenül ezután egy enχi h<v n'> \ uu, &- t a kivetkezőkben sratatsnk be.

töő mg keményítőt tnlnbálénnk Süti ul 0,7 b Hül-ben 4 óráig löö C°-on. A savas .hidrolízis után 10 μΐ reakciőalegyet hozzáadtunk 000 ni imidazol pufferbes (löö ínM imrdazoi, :..· mM MgCly, pH ^;::: 6, 9_? 0,4 mM HAD'b ., A reakciőkeverékben a g lü ko z - ü - f o a ζ í á t tárta Ima t a g 1. ü kő z - 6 ~ f o s z iá t -de hl dr ege néz konverzióval határoztuk meg. Erre a célra 1 egység glükóz-S~ foszfát-kehidregenáz t (leneonontöc mesen taroldes eredeté (Boehringer Mannheiml) hozzáadtunk a reakolőelégyhez és a. keletkezett TADH mennyiséget meghatároztuk 340 nm-en abszorpciójának mérésével, mg keményítő glüfcóz-é-foszfát tartalmá.t a következő táblázatban tüntettük fel nem-transzformait Désítée fajta, valamint kát tzanszgenifcns sejtvonal esetében (ül (dSS-antiálé ; 0-2 t3SS~anti-Eiö y? melyeket a nOőS-anti-AL plazmáddal t r.an_:s z formált und,

4. Táblázat

bővénye k nm<	ii glukóz	-6-foszfát/mg ken	senyé t cl %
Vad·-típusé	12,89	á 1,34	löd
ki(3SS-antl~hld	2,25	± 0,41	17,
Az (3 SS ~ an t i-hl)	j η e <? -Ő	± ö	9t

χ- X » β φ φ φφ * φ * * * * * ♦ * * *

*ΦΧ

X

X**

A következő táblázat bemutatja a p333-anii~El pl ázsióéul transzformált burgonyanovények 1 rg keményítőjének glüköz-O-foszfát tartalmát, Összehasonlítva a nem-transz· formáit nérényeábc2. tfolinum svbezosum c.v. Désirée) nyert keményítővel,

5. Táblázat

dóvények	nmó I glukóz-0~ fos z fát is	;g keményítő 1
Vad:~típ-asó	0, lö i Ö , 0 3	110
7	4 , 50 ó Öi,: 73	45,
11 A	2,04 1 0,3?	20,
45	1,14 ó 0,44:	11,
31	1,21 1 0,49	12,

A 7-es, 77-es, 45—os és a 31-es növények egymástól fággetien transzéormánst képviselnek, amiket a pB33-anti-Eb piazmiddai trans z fórmáltrhk. A 37--es növény képvise li a Ív vonalai, meiyask Brabsader görbéjét az_: 5. ábrán tüntettük fel .

Az értékek azt mutatják, begy a transzoen.íkas bnrgcnyanövényekbői származó módosított keményítő: foszfát tarfalra legalább 50 %-kal alacsonyabb, mint a vad-típusa növényekből izolált 1 erényi zo foszt ártartalma..

ej á 4 l^ö-on történt tárolás ntán a gumók ginköz·, Irnktóaés s zaeharó ztarbaIma;

ΦΧ •XX* X ·*» φ

* *** .*·# φ

ΦΓ* *:* * *

Φ**

A pAéS'-anti'-EL antiszersz konstrukcióval transzformált k.ül.önbö-ző transzáén! kus vonalaktól származó gumókat, valamint a vad-sípost növények gumóit 4 C°-^:on tároltuk, vagy 20 C°~on, sötétre·'·, két hónapig. Ezután a fant lekben le írtak, szerint meghatároztak glukóz-, fruktöz- ás szacharőz-tar~ talmukat. Két transzgenikus növény a következő reprezentatív e r teke két a őt a . Tábl.ázat

	élpköt	Frontot Szaor	laröz
	tő Cb> 4 C°	20 0°	4 C° 20: C°	4 Cl
tad-típusa
?·.· Dás izéé	1,81 Só, 4	0, 52	52,8 8,5	13,1
T ránéz gemíku-S
15, vonal	z,, x.z: '31 v	ős 15	7, ö 7, 5	10, 1
T r ann z géni kn s
11. vonal	5 se y z	0:, 75	7,5 5,2	g , g
A táblázatban	megadott értékek a	öexoz vagy a	szachsroz/g

Í r 1 ss' - t ömege t, mét a tg á k...

A 5. táblázat értékeiből nyilvánvalóvá válik., hogy a gumókban réihalmozödö redukál.<1 dukrek mennyisége éigyé.lámreméltoan kevesebb, miét a 1 C°-on tárolt vaö-tinasu növénye káéi ,

Mindent egybevetve a transzgenikus növényekből izolált módosított komé nyitó' hasonlít a vád-110001 bukót les növénybői származó keményítőre. Bár összevetve azzal, előnyösebb

♦ **» φ

*φ *

♦

X*»* az íze és az állaga, igy alkalmsabb a kúlenköző nlolmisserekben körtémé felhasználásra..

u.réiön &.....gébé......élétéi é......nPNS rn szertjének expresszi ója......űs eke ri thr a eol í —bán

a) A háttér inmsejtek transzformáéiéja;

A pnbz piazmid eDéS Inszert expressziedának érdekében az éscheriekia coli DHS-α törzsének sejtjeit először pACAC plazmáddal transzietmáituk. Sz a piazmid tartalmaz egy .£ sem e r 1 eb i a c o i i ·· tó 1 s z á ram z ó A n ? - g 1 a k ό ζ - ρ i r c £ o a z f o r i1 á z t iAGF-áz; kódoló téS frangmenat a lac 2 prometer szabályozása alatt. A fragmerst Dral/laell fragmensként izoláltuk a pEcA15 vektorból, melynek mérete 1,7 kb félller-Röber; értekezés, fu Berlin (1 992)} , és. miután fel tol töt tűk, ragadós. '-»'t < >’>e t^t _ rniili .mm telt 'nlAkS' vem^mo..

A.z Aér-áz exprasszieja eredményeként a transzformált Eacberichia coli sejtekben ró a glikogén szintézise. Az igy transzfermáit sejteket a. következőkben Esebericbia coii-Kl s e j te knek fogjuk hívni.

A pRb2 piazmid ebbS-e által kódolt fehérje erzimaktivitásának mAghatároeásábrz az. Bát:éeri.cb.ia ettli-hl sejteket transzformáltuk a pH12 plazmáddal. A pAGAC, valamint a péti plazmidot tartalmazó transzfermáit Eeeierzelia coli sejteket ezentúl ssehereobia eoJi~E2 sejteknek hívjakt

A piazmid DNS bejuttatása a raktérlamsentekbe danatan módszerével történt [ darabén és mtsai; o. Mól, Bioi.. 166, * χ* * * * -t

XX* X X φ » χ

X

557-550 (1933)1 . A transzformait o5cro.r.icn.la coli sejteket agarlemezekre szélesítettük, mely összetétele a kővetkező: a 77 szilárd táptalaj tartalmaz;

1,5 3 ka ele a gazt, red nátrium-f oszd át puffért (pH ~ ff fi ,

1,0: 3 g t ö kör i, pg/ml kroramfenikolt (az ikonért otia co.:.o~Ki sejtek esetében), vagy

10: pg/mr kloramfenlkelt és 10 ng/ml amipicállint az Esohericnia coíi-n? sejtek tenyésztéséhez.

Az Őschericáia coli ŐH5« törzsénél, sej fjeit, melyeket a pRlé t pACAC plazmiöokkal transzformáltunk (üeeherichiu ucdi-Kz sejtek) és kontrollként csak pACAC plazmáddal fősoberichia cudl-Kl sejtek)· tenyésztettük agar lemezeken. A kö-lönheu© tenyészetek által termelt glikogént megvizsgál tok a fosztoriléeiö mértékének .szempontjából (a glükóz molekula C-6-os helyzetében) a következőkben leírt, eljárás segítb) A bakteriális glikogén izolálása:

A bakteriális glikogén izolálásához a transzformáció irtán kinőtt baktérium kolóniákat lemostuk mind a 0 agarlemezröl (135 mm átmérőjű).. lemezenként 5 ml 77 táplálás jai, A. baktérium esuszpenziöt loöö n g-vel 5 percig centrlfugáitok, Az: üledéket felvettük 10 m.l 77 táptalajban. .A baktériumok szétroncsolásákoz 2-szeres terfog&tnyi roncsold oldatot (0,2 / betűt; 1 % SDS) adtunk és inkubáltuk szobahőmérsékleten 5 percig centrifugáltuk. Háromszoros térfogat sbas, etanol hozzáadása urát 4 C°-on 30 percig Ínkubáltuk és közvetlenek ezután 8ŐöO z g-vel 13 percig centrifugáitok, a glikogén igy kiülepedett. Ezután as üledéket mostak 100 cd. ?0 t-os etanolial és ágra ülepítettük oentrileválással (lö percig 8tOö g-vei} , A mosási folyamatot négyszer megismételtük,.

c) A teljes giiregéntartaíom meghatározása.:

Az izolált és leülepedett glikogént erőssor lebontottuk egyszerű glükóz molekulákra savas hidroiizisael (az üledéket feloldottuk 2 mi 0,7 molfl üCl-ben és 4 óráig 100 liot Ínkubáltuk, Az oldat glükózzá.::almát egy keményítő teszt enzirastikns reakciójának 340 o-en történő totemetzikus szárée 't„ ü a vtn _ a t u\ : -»<· , a gyártó (boe&r inger Mannheim} előírásainak megtel élőén.

A reakelő-pnffér a. következőket tartalmaztau

IDŐ md döfő (pb - 7, öl md dgőly

A md EbiA

Ιϊ , ϋ iád hAEE md All egyse g g 1 ü kő 2_:- ő- fos s. f á t - dehidrogen á z

A mérést egység hexokináz.

ő^G?~on baj tót fák végre Ο μΐ gi ü köző idatbán:, cd A glükőz-6-fosztás tartalom meghatározása:

**«* Φ_Λ

Φ «·* φ .9.

Φ**« ****

ΦΦ**

Φ

A C-Ő helyzetben a foszforiiált qlukcmolekulák tártálmának meghatározásához a kököntöző baktér1umtenyészetek egyenlő mennyiségeit vertük. A savas hidrolízissel (lásd fent? glükóz molekulákra lebontott glikogén oldat semiegesitésérs azonos térfogatú 0,1 mol/i KOH-t adtunk az oldatáén .

A reakslöytffér a következőkéi tartalmazta: löö mM íáOPS iph === 7,5) mü tágéi g mM EDTA tg Tg md HADD

2. e g y s é g óm 1 g 1ö k é z -1 - f o s z f á t - de h 1 dr og e n á z .

A mérést 25 C°-en hajtottuk végre lön-150 μ.1 glokozol dórban.

et _s-kt?,,tv „te c.J< μρ xickó 'Ό : «-n azonos rtasa:

A baktériamsejlekben szintetizált glikogén foszfáttartalmának meghatározási eredményei ért mutatják, hogy a pACAú f phie tüazmi dákkal irat se formált öaohoplonia ősül sejtek glikogénje 2§f i 25 %—es nőve kedést: matat; a glukóz T-f-oa helyzetében, ha összehasonlítjuk a kontroli reakcióval, (a pAGAC píazmiddal transzformált fscherfehis toll sejtekkel ) (lásd a következő táblázatot),

Ssoaeriohla coli. sültek glukőz-l-ioszfatáz:

glikogénben lévő glükóz

Asenorfodia eodl-úl 1 : Htúb ± 11 Sö)

Es oh e r .bor z a ee .ii - Rd

TI : (1570 ± 5905

A.z itt jelzett fosztorilezés mértéke legalább 5 mérés átlaga, mely 5 egymástól független traneztormaszóból és a g11 bogé t izolálástól indáit ki,

18, óéi, de.

A p dó ó - a n 11 -· Rh ρ I az mi d _ 9.ntegrác.iój'a a p35SH-attl~BE piazmlödal kontó, náci óban a burgonyandvényék getomjába:

A pdől-anzi~5! plazmidot a 8, példában leírtaknak megteietöen kosták .létra. A pdöER-antí—íSE plagmid e'iöáiló.·tását leírtak a W) 8ö/87d5S száré szabadalom 3, példájában. Mindkét plazmidot egymás után bejuttattak borgonyanövényerbe, agröbaktérlomokkal közvetztett transzformációval, a fentiekben leírtaknak megr ele.lóénÍrre a óéira' a pdééh—azitk-BE plazmidot először burgonyanövényekbe transzformáltuk. A teljes növényt regeneráltuk és kiválasztottuk azokat, melyek az elágattető enzimet csökkent mértékben expresszálIák. Ezután a paSo-anti-Rl plazmidot transzformáltuk az elágaztató: enzimet már ősökként mértékben expresssálő tranesgenikus növényekbe. A. transzformált sejtekből a transzgenlkus növényeket újból regenerál.tűk és a transzformáit növényeket tényésztettük, üvegházi körülmények között. Analizálva a teljes RNS-t egy RNS lenyomateiási analízisben az elágaztató enzim cöNS-ével vagy az RR , ike-ow.. 1 komplementer trsnszkriptek eltűnésére nézve, megái lapítottuk a növények genetikán, módosításának sikerét az elágaztató enzim nagymértékben csökkent expresszién a, valamint az EL gén nagymértékben csökkent expresszzöja tekintetében. Erre a célra a transzformált növények leveleiből· a teljes KES-t izoláltuk a leint módszerekkel, és közvetlenéi ezután gélelektroforéziseel átjuttattuk egy membránra, hibridizáituk egy radioaktivan jelölt próbával, melynek szekvenciája megegyezik az 1es szekvenciával vagy annak egy részévéi, és ezután hibricizáltuk egy radioaktívan jelölt próbával, melynek szekvenciája megegyezik sz elágaztató enzim szekvenciájával vagy annak egy részévei (vő, bO 32/1482:'?; 1, példa) . A transz!ormait ne'venyek körülbelül 5 — 10 1-ában az 1-es számú .szekvenciának specifikus oranszkriptjére jellemző esik, valamint az elágaztató enzim cEES-ének (vö. dO 92/11827) specifikus transxkriptjére jellemző esik hiányzott az Rhs lenyomatóiásó anaüzieben. Szakét a növényeket, melyeket R4 növényeknek neveztünk, felhasználtuk a gumókban lévő keményítő minőségi anaiizi sere.

11. eéida

A _ PB 3 3 - a n t i -RE........éhézmld.........integrációja a pB33-ant 1-GESSl plazmáddal kombinációban a burgonyanövények genomjafca

A pB33-anti-RE oiazm.idot a ?, példában leírtaknak megfeueiöen ál.Iít:©atgk ele, A pBaŐ-anti-EESSI plazmidc^ft a következőképpen hoztuk létre:

A .:P?5?:..i f obsrcsur-böl származó 333-as patatín osztályú I-es gén promoter régiójának órai/órai fragmsnsét, mely tartalmazza a -ISiz-oől éli-io található nukleotidokat

X X X

X * X «XXX X X í Eocha-Soss: és messe: EMBO Journal 8, 25-2 9 U98 9;] , ligáink a pöül9 plazmid Smal helyébe. As eredményül kapott plazmádból a p.romoter fragmensz 1 igái tűk a pBi.nl 9 pl nemid [Bevan: Huclehe Acids üesearch 12, B71.1-8721 (1984) j polilinker régiójába Eeobl/Hindin fr agm.enskenc. Közvetlenül ezután a. bőién tg noeroson í Hergersőerq: értekezés, University of ü o i o g n e {19 8 8)) G Β B SI g é n jenek 1181 - 2 511 - n u k 1 e o 11 d j á 1 g t a r t ó 3’ btoRi ttagmenaéé ligáitok az eredményül kapott plazmád Ecokü helyébe. Mindkét plazmádat egymás után. bejuttattuk bu rgen y and vén y e kbe ag r ob a k t e r i nme kka 1. kö z ve t ítélt t r a n sz £ ormácíővai, ahogy asz leírtuk a 10. példában. A transzformált sejteket egész növénnyé regeneráltuk és a transzformáit növényeket. üvegházi körülmények között tenyésztettük, bortherh ienyomatoiásí módszerrel analizálva a teljes RKa-t, a két cDliS-re komplementer transzkrlptek eltűnésére nézve, megbizonyosodtunk a_: növények genetikai módosításának sikeréről. Erre a célra a transzformált növények gumóiból Izoláltuk a teljes >iiS-t Standard eljárásokkal és ezután elektroferotikusán szétválasztottuk őket agarőz gélen, ezután átvittük nylon membránra^ és nibridiz&ltuk radíoaktivan. jelzett próbával, melynek szekvenciája megegyezik az l-es sz.ek.venoiával vagy annak egy részévei.. Ezek után ugyanazokat a membránokat hibrid!záltuk egy radioaktívan jelölt próbával, melynek szekvenciája megegyezik a GBBS1 gén [ Hergersberg: értekezés, üníversity of üologne {Í988jj szekvenciájával vagy annak, egy részével, é. transztermáit növények kerülőéiül 5-1Θ %-ában a találmányban leírt opps*Φ XX «ΦΦΧ < * Φ Φ ♦ φ * Φ * * X Φ φ «

ΦΦΦ. Λ «φ ΦΦ <φ ♦ ΦΦ φ * Φ *

Φ ΦΧΦ χ φ

Φ Φφ* tel vagy a GBBSI eDRG~aei hífetidízálő transzkrrpteket jelölő csikók hiányoztak az RNS lenyomatolási analízisben. Az így létrehozott R2~nak nevezett r ovenyek gumóiból a keményítőt izoláltuk és analizáltuk.

12, bélbe t tu - g G e g o .-w m

A 10. példa szerint, transzformáit burgonyanövényeket megvizsgáltuk az általuk szintetizált reményire tulajdonsága.zr a nézve. Az analízist különböző buronya fajtáknál eá.vé gazdák, mely eket trarárformáitünk puáS-AOti-Rh és p35SHanti-SE pla.zmi dokkal, és amelyek többé nem, vagy csak igen kis mér té kben mutatnak olyan· osfkokat, melyek a találmány DNS szekvenciáival vagy az elágaztató enzim oDNS-ének trans z kripje ive1 hibri diz á1n ak RNS 1e nyomatο1á s i ana1i z i sben

a) A keményítő vizes oldatai viszkózatásának meghatározása

A transzéormait burgonyából nyerhető keményítő vizes oldatainak viszkozitás meghatározására a keményítőt izoláltuk a p35S-a.nti.~Rt és a p35S.H-anti.~BE plazma dokkal transzformait növények gumóiból standard módszerek telhasználásával. Mindegyik keményítőből 2 g~ot feloldottunk 25 mi Egö-ban és az igy kapott oldatot mértük egy Rapid visco analizátorban íNenpozt Scientifío Rty Lfd., invesáment Support Group, Warriesooö NSM 21.02, Ausztrália) . A készüléket a gyártó utasításainak megfelelően használtok. A kémé.....

**♦* «X nyitó vizes oldatának viszkoziráar.eghutárczásához a keményítő szasstanzáét először felmelegitettek 50 C°-rŐI 90 íá'-rs. 12 C° /perces sebességgel, A hőmérsékletet 95 C°-on üartoftuk 2,5 percig. Ezután az: oldatot lehűtettük 95 C°~ről 50 C°~ra 12 C°/perces sebességgel. Az egész folyamat alatt a viszkézitást mérték. Az ilyen mérések reprezentatív ered-

menyeit	gö rtoe	a l ak j ában	tettük közzé,	melyen a	viszkozitást
az idő	függvényében: ábrázditük. A ö.	ábra. egy	tipikus RVA
QOT.O6 t	mutat,	melyet a	késírég fajta	vad-tiprsó	burgonyából
izolált	kémén/	yiüő ad.	A 2. és 3.	vonal egy	tipikus RVA
görbét	mutat,	melyet a	p3 5SH-ant1-BE	Ilietőieg	a p35S~anri~

ét pla.zmídokkal transzformáit növények gumóiból izolálz keményítő ad. A_: 1, vonal sgy tipikus RkA görbét mutat, me l ye t a plöSk-anti-BR,. valamin t a p 3 5S:-a^::H t í“ RI, plazmidokkal kombináltan transz/fozwált nova nyék gumói hői a Zoláit keményítő ad, .A 4, vonalra jellemző, hogy nem: mutat hőmérsékletfüggő viszkóz!t á sn öve k e dé s t, b; ,. ju v t. „ ) '5 ’ - “

A transzformált búrgúnyanővények gumóiból származó ke me n y 11 ő t meg v i 2 s g á 11 u k am ί 1 ő z / am11ορ e k t ί n a r á n y u k r a n é z ve.. Az R4-1 növényi vonal {a 0. ábra 4.. vonala) am.il őzt artaima több mint lö á. Az üé - 3 növényi vonal amliőz érteke 2! 1 volt, míg a Désirés. fajta vad-rrpusu keményítő amilózrartalmáf lé és 24 1 közöttinek mértük.

12, Példa ** ΧΦΦΦ Φί,

Φ'Φ X Φ φ φφφ

Az R3 növényekből származó keményítő analízise

A 11. példa, szerint transz formált onrgonyanövényekei megvizsgáltuk az általat szintetizált keményítő tulajdonságaira nézve. Az £inal íz lseket különböző horonyé fajtáknál végezték, melyeket transzformáltunk p833~anti~RL és pB33anti-GoBSI piazmidokkal, és amelyek többé nem, vagy csak igen kis 'értékben matatnak, olyan csikókat, melyek a találmány HIS szekvenciáival vagy az GS331 cDbö szekvenciájának transzkripjeivel bábuiulzáltak RAS ienyomatoiász analízisben .

aj a keményítő vizes oldatainak viszkózt Zás-meghatározása:

A transzformált bnrgonyáből nyerhető keményítő vizes oldatai viszkozitásának meghatározására a keményítőt st&ndard itőcszerek ieltasztáissávai izoláltuk a pS33-étit-EL és a uőzz-anti-GöBSf piazmidokkal kombináltan transzformált növények gumóiból- A viszkozitást Rapid Visco analizátorral batárootuk mag a. 12, példa a részében leírt, eljárással, Az, eredménye bet a 7, ábrán mutatjuk be. A 7, ábra 1, vonala egy tipikus AVA görbét mutat, melyei a Désirée fajta vad-tipusu burgonyából izolált keményítő ad- A 2, és 3, vonal agy tipikus AVA görbét mutat, molyét a p333-snti~GBBSI illetőleg a pzŐS-anti-RL piazmidokkal transzformált növények gumóiból, izolált reményizö ad. A 4, vonal egy tipikus ÉVA görbét mutat, melyet a pBzl-anti-GBBSI, valamint a pB33~anti—Rá piazmidokkal kombináltan transzformált növények gumóiból izolált keményítő ad. Érre a vonalra jellemző, hogy nem »» χ« «« ίίΐί * * Φ * 9 « Φ 9 * Φ X XS »s* * * Φ Φ * φ χ

ΦΦΦ* φφφφ Χ« «χ ΦΦΦ mutat maximum viszkozitást és 50 C°-on nem nő meg a visz-' -o . uh ' ' * μ-- t '^v< o, , (η,νχ' ^st .

kezedét után kapott ragasztó majdnem aas mutat retrogradsciőz több napi, szobahőmérsékleten történő inkubálás után.

b) Az amiioz/ara. lopektin arány meghatározása:

A transzformált buryonyanővénvekből szármanő gumókból izelált keményítőt megvizsgáltuk amllőm/amilepekfln arányára nézve. At R3-5 növényi vonal (a 7. ábra 4. vonalas amiláztartalma kevesebb mint 7 %-uak matatkozott. Az dd-d növényi vonal amiléztartalmát kevesebb mint 3 %-nak mértük. A. Désirée rajta vad-típusú keményiző amiiőztazta.Ima 12-25 i-cs vo.11..

c) A keményítő foszfáttartalmának meghatározása;

A keményítő foszfát-tartalmát a glukóz C-6-os helyzetében lévő fosztátcsoport mérérével határoztuk meg. Erre a célra a keményítőt először savas hn.drolizissei lebontottuk és a glükoz-n-foszfát tartalmát közvetlenül ezután mértük, egy enzimteszttel, ahogy azt a következőkben leírjuk.

löö: mg keményítőt inknbáu.tauk döő μΐ 0,7 mol/I Bél-ben é öráíy löd D°-on, A savas hidrolízis után lö μΐ reakciceiegyet hozzáadtunk Cöu pl imidazol mutterhez (ICO zd imidazol, 5 rét MgClg, ph - h,C, ö,4 mit NADd . A reakc töke verékben a glükóz - 3- fősz fát tarra Imát a g iá koz - S-foszíé.t-dehí d.rogenáz kon vert iéva.1 határoztuk meg. őrre a célra 1 egység glükóz-Sfoszfát-déhidrogenázt (ieuconcstoo mesenzercudes eredetű ** ** φφφ» φ* «««« * * φ φ φ φ φ φ * » β ♦♦ *φφ * * Φ χ * * φ φφφφ ΧΦΦΦ φφ φφ ΦΦ* (Boehringer öennheimj): adtunk a reakcioelegyhez és a keletkezese AADH mennyiségét meghatároztuk 310 M-e$ abszsrpclégannk mérésével.

mg keményítő giükőn-é-fosafát tartalmát a következő táblázatban tüntettük fel nem-transzformált Désirée fajtánál, valamint az 13-t én az tl-l transzgenitus sejtvonaiaknál, melyeket a pB33-anti-RL és pB33~anti-IBBS 1 ylazmiőokkai kombinációban transzformáltunk- összabascn11zásként a pB33~ant.í-ÓBBSí plazmidhal transzfermáit úgynevezett orr burgonyából üüSi-10) származó keményítőre jellemző értékeket s tinién r e 1. t an t e izük,

1. láblázat

Növények nmbl glülkór-r-fcaziát/mg keményítő %

f ab -1 ryásó	íb 80	± 0,03 1.0 Ö
R3-ő	1, 32	±	h f I8	13
B3-Ó	1,37	i	0:,10:	lé
bői-10	löy 82:	i	0,12	110

Az: alábbiakban ísrsertetjük a leírásban említett szelve n r iákat.

A SZEKVENCIÁK JECYEÉKS ii? B,tAöAbÖ3 IbBDRbAÖlÖ: i i} ÖBblŐátÖ:

:A) NÉV: Ó'ens tossman.n

OBI UTCA.: Geimer Fisaién 3 *Φ «« χ»«Φ 9+ ΦΦΦΦ X 9 Φ X X * « X

X « » X» κχχ

Φ X 9 9 *9 X «ΦΦΧ; ΦΦΛΧ φφ «φφ (C; VÁROS: Colm (Ε) OESEAG; Németország (Ε) YRÁNYÍTÓSEÁM: 14476 (ii) A TALÁLMÁNY C;KL; Módosított, keményítőt szintetizáló növények, azok e.löállátására szolgáló eljárás és a mödosi tótt keményítő iiii) A SŰÜKVERCTÁR SÜÁNA: 4 (ivi SEÁMÍTÖGEPES FORMA:

ÍAi A. ÍÍORbÖE© TÍENSA:: ELOÉEÉ LEMEN;

(E) STÁMTTGLEE: TRM' PO· EGMRATTBILIS

ÍC) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS

CD) PROGRAK: PATENT LE REARASE #1,0, VERSION #L,38 jELAi

1. s z ára 6. s: z e kven c í a v ári a t (ii A. székyendia jeliémzbá,:· (A) Hossz: 4856 bázispár (B? Típus: noLleotid (C} 5zá111ρta: egye z á1á (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: uiNS mRNS-ze (vl) Eredeti Kor zás:

(E) Szervezet: Soianam: iuöerosum (0} Törzs: Cl V. Se ro1ina »»«Φ X«Λ* ♦ 9* XX9X

X 9 9 X * *9 99X *9*9 X so (:.) Tulajdonság:

< E ) X é v / k η 1 cs : C Ö:S^: (I) Lokalizáció: 105,,4497 (ai) A szekvencia Leírása: 1. száma szekvencia

CATCTTCATC CAATTTCTCG AACCTTCTTC GCTAATTTCC TCCTTTCTTC ACTCAAAATC Sö_;

GACGTTTCTA GCTGAACTTG AGTGAATTAA CCCASTSCCA SCAT ATC ATT aat TCC 210

Me;:. Ser Asn Ser

sva sec ta;;	aac tts ctg tag sas	GCA.	TTC CTA ACC TCA ACA CTG TTS	'i 6 4
Leu Giy Arin	Asn Leu Leu Tyr Síin	Giy	Phe Len Thr Ser Thr Val Leu
s	lö		IS 2 0
caa cat Aaa	ACT AGA ATS ATT süt	CCT	TGT GTT GGA GGC AAT TCT TTG:	222
Glv K:. s i.-ys·.	Ser .Arg Tle Ser Pro	Pro	Cys Val Giy Giy Asn Ser Leu
	is		30 3S
ΪΤΤ CAA CAA	caa cts acc tcs aaa	TCA	CCT TTA TCA ACT GAG TTT CGA	20 0
Phe Cin Cin	Cin Vsi. A~ Ser- uyS	Ser	Pro Len ser Thr Gin Phe Arg
	40	45	SO
GGT AAC ATS	tta c: cts cag aaa	AAC	AAA ATA CCT ATG GAA AAG AAG	3Ö8
3 ly Asn Arg	Len Lys Vai cin .Lys	Lf'yr«?	Lys He Pro Mer Glu Lys Lys
SS	Sö		SS
TÖT GGT TTT	TCT AGT TCT CCT CAT	GOT	CTA CTT ACC ACT GAT AGG TCT	3 56
Arg Alá 5h®	Ser Ser Ser? Pro His	Aia	Vai Len Thr Thr Asp Thr Ser
73	5		8'3
íCC’a GáO Caá	GGA GAA AA.G TGG AGT	CTA	GGG GCG AAT ATT GAG CTA CAG	404
Ser slu Leu	Alá Glu Lys Phe Ser	Leu	Giy Giy Asn Tle Glu Leu Gin
SS	30		25 100
gtt sas ttt	AGG SÓT CCC ACT TCA.	GGT	GAT GTG TGG TTT GTC GAT TTT	4.52
Val Asp Val	Arg Pro Pro Thr Ser	Cly	Asp Val Ser Phe Vei Asp Phe
	200		11ö iiS
CAA cea AOA	AAT GGT A3T GAT AAA	CTG	TTT TTG CAC TGG CGG GCA GTA	500
Sin Val Thr	Asn oly Ser Asp Lys	XuŐ Ví	The Leu His Trp Giy Aia Vei
	12 0	12 S	1.30
AAA TTG CSC	AAA CAA ACA TGG TCT	OTT	CCC AAT CAT CCT CCA GAT CCG	543
Lys Ahe Giy	Lys Cin Thr Trp Ser	Len	Pro Asn Asp Arg Pro Asp Giy
TAS	140		14.5
ACC AAA CTG	TAS AAC AAC AAA GCA	CTT	AGA ACT CCA TTT GTT AAA TCT	5 6^6

ΦΦ» Φ « φ φφ * Φ * ΦΦΦ

Thr

S V Λ 3 30

Val

Tyr

Lys

Asn

Lys 25 S

Ais

Len

Arg

Thr

Pro 150

Phe Val

Lys

Ser

GGG

--.,.-. ,-.;·

AAG

ATC

CTG

AGA

CTG

GAG:

ATA

CCA

GAC

ACT

GCT

ATC

CAA

t~> 44;

Ciy XS.5

Per

Asn

Ser

lle

Len 170

Arg

Len

Sin

Tls

Arg 175

Asp

Thr

Alá

lle

Glo 180

CCT

ATT

GAG

TTT

CTC

ATA

TAG

GAT

gaa

CCG

GAG

CAT

AAa.

TGG:

.ATA

AAG

7 & 2.

Alá

X le

Glo

Phe

Len TAS

He

Tyr

Asp

Gin

Alá ISO

His:

Asp

Lys

Trp

Ha 1.95

Lys;

AAT

AAT

GGT

GGT

AAT

TTT

CGT

GTC

AAA

TTG

TCA

AGA

AAA

GAG

ATA

GCA

740

Asn

Asn

Gly

GXy 200

Áss

Phe

.Arg

Val

Lys 205

Leú

Sor

Arg

Lys

Gin 210

He

Arg

GGC

GCA

GAT

7.V ·.

TCT

GTT

CCT

GAG

GAG

CTT GTA

GAG

ATC

CAA

TGA

TAT

788

Gly

tea

Asp 2 0 3

Val

Ser

Val

Pro

Cin: :.m0

Glo:

Loo

Val

Glo

Xis 27 5

Gin

Ser

Tyr

TTC

AGG

TGG

GAG

AGG

AAG

GCA

AAA

GAG

AAT

TAG

CGC

CCT

GAG

AnA

GAG

835

Len

A:<y 2:30

Trp

Gin

Arg

Lys

Gly Lys; 2.35

Glo

Asn

Tyr

Prés 2:40

Pro

Gin

Lys

Gin

AAG

GAG

GAA

TAT

GAG GCT

GCT

GGA

ACT

CTG

GTA

CAG

GAC

GAA

ATA

CCT

884

ey>3 245

Cln

Cin

Tyr

52:.

Alá 250

W a

Arg

Thr

Val

Lan 255:

Cin

Glo

Gin

He

Alá 250

CGT

GGT

GGT

TCG

ATA

GAG

GAC

ATT

GGA

GGA.

AGG

GTA

ACA

AAA

AGT

AAT

332

Arg

Gly

Alá

Ser

lle 255

Gin

Asp

Ha

Arg

Alá 270

Arg

Aon

Thr

Lys

Thr 275

.Vs:::.

GAT

AAA

AGT

GAA

AGG

AAA

ί;.·.'': .--ΐ

GAG

CCT

CTT CAT

GTA

ACA

AAG

AGT

CAT

580

ASp:

Lys

Ser

Gin 23 0

Ser

lys

Cin

Cin

Pro 285

Loo

His

Val

Thr

Lys 28 0

Ser

Asp

ATA

CGT

GAT

GAC

CTT

GGC

CAA

GGA

CAA

GGT

TAC

ATT

.AGG

TGG

GAG

AAA

1028

Tls

Pro

Asp 293

Asp

X.exi.

Al.a

Glo

Alá 3 00

Glo

Alá

Tyr

Ti. a

Arg 305

Trp.

Gin.

Lys

GCA

GGA

AAG

CCG

AAG

TAT

CGT

GCA

GAA:

AAG

GAA

ATT

G.V

GAA

CTG

CAA

1:075

A Is

Gly 3 IS

Lys

Pro

Asn

Tyr

Ars 315

Pro

Gin

Lys

Gin

He 320

Glo

Cin

Len

Glo

GAA

GCA

ACA

.AGA

GAA

TTG

CAA

GTT

GAG

GTT

GAG

AAA

GGC

ATT

AGG

CTT

112 4

Gin

Alá

A.ry

Asp

Gin

Len

Sió

lan

Gin

Lan

Gin

Lys

Gly

lle

Thr

Lett

32 3

330

335

340

vAT

GAG

TTG

CGG

aAA

AGG

ATT

ACA

AAA

GGG

GAG

ATA

AAA

ACT

AAG

GTG

1172

Asp

Gin

Les

Arg

Lys 34 5

Thr

lis

Thr

cys

Gly 35:0

Gin

As

xys

Thr

Lys 35

Val

$2 χ* «Χ«« «« * » « X ♦

0:.¾.¾

AAC

CAC

CTG

AAA

AGA

AGT

TCT

TTT

GCC

GTT

GAA

AGA

ATC

CAA

AGA

1220

Glu

Lys

Ele

Leu 360

Lys

Arg

Ser

Ser

Pha 3 SS

Alá

Val

Glu

Arg

Lle 370

Gin

Arg

AAO

AAG

AGA

GAG

TTT

GGG

CAT

CTT

ATT

AAT

AAG

TAT

ACT

TCC

AGT

CCT

12 SS

LyS

Lys

Arc 3 75

Asn

Phe

Giy

Ele

Lsu 30 0

Lle

Asn

Lys

Gys.

Thr 385

Ser

Ser

Pro

GCA

GTA

CAA

GTA

GAA

AAG

GTC

TTG

GAA

GAA

CCA

CCA

GCC

TTA

TCT

AAA

13 IS

Alá

Val 3 90

SlL

Val

Gin

Lys

Val 3 SS

Lan

Glu

Glu

Pro

Pro 400

Alá

LítStl

Ser

Lys

Aló

AAC

CTG

TAT

GCC

AAG

GAG

AAG

GAG

GAC

CAG

ATT

GAT

GAT

CCG

ATC

12 04

lle 4 OS

Lys

Lse

Tyr

Alá

Lys 410

GI a

Lys?

Glu

Glu

Gin 445

Lle

Asp

Asp

Pro

lle 420

CTA

AAT

AAA

AAk~

ATC

TTT

AAG

GTC

GAT

GAT

GGG

CAG

CTA

CTG:

GTA.

CTG

1 - · 2

Leu

Asn

Lye

Lys

XI s 42 5

Phe

Lys

Val.

7%sp

Asp 430

Giy

Glu

Len

Leu

Val. 435

Leu

GTA

GCA

AAG

TCC

TCT

GGG

AAG -ACA,

AAA

GTA

CAT

CTA

GCT

ACA

GAT

CTG

1450

Vei

Alá

Ser 44 0

Se:

Giy

Lys

Thr

J.jV.'u 44 5

Val.

HÍS

Leu

Alá.

Thr 430

Asp

Leu

AAT

CAG

CCA

ATT

ACT

CTT

CAC

TCC

GCA

TTA

TCC

AAií ACT

CCT

GGA

GAG

15 08

Asn

Glu

Pro 4 55 :5

Lle

Thr

Leu

His

Trp 400

Alá

Len

Ser

Lys

Ser 4SS

Pro

Gl.y

Glu

TGG

ATG

GTA

CCA

CCT

TCA

AGC

ATA

TTG

CCT

CCT

GGG

TCA

ATT

ATT

TTA

15555

Trp

Tefc 47 0

Val

Pro

Pre

Per

Ser 4 75

Lle

Leu

Pro

Pro

Cly 480

Ser

lle

Lle

Len

GAC

AAG

GCT

ccc

GAA

ACA

CCT

TTT

TCA

GCC

AGT

TCT

TCT

GAT

GGT

CTA

1004

Asp 485

Lys

Al®

Alá

Gin

Thr 4 00

Pro

Phe

Ser

Alá

Ser 4 05

Ser

Ser

Asp

Giy

Leu 500

ACT

TCT

AAG

G'IA

GAA

TCT

CTG

GAT

ATA.

GTA

ATT

ÜA?.

GAT

GGC

AAT

TTT

IS 5 2

Thr

Ser

Lys

Val.

Gin SOS

Ser-

Len

Asp

Lle

Val 5.LQ

Lle

Glu

Asp

Giy

Asn. SIS

Phe

GTG

\;ί·<.;ϊΐ3

ATG

CCA

TTT

GTT

CTT

TTC

TCT

GGT

GAA

AAA

TGG

ATT

AAG

AAG

1700

Giy

Bet

Pro 510

Phe

val

Lee

Lan

Ser 225

Giy

Glu

Lys

Trp

Lle 530

Lys

Ash

CAA

GGG

TCG

GAT

TTC

TAT

GTT

GxíG

TTC

AGT

GCT

GCA

TCC

AAA

TTA

GCA

1743

Cin

Giy

Ser SIS

Asp

Phe

Tyr

Val

Giy 540

Phe

Ser

Alá

AI®

Ser 543

Lys

Leu

Alá

CTO

AAG

GCT

GCT

GGG

GAT

GGC

AGT

GGA

ACT

GCA

AAC

TCT

TTA

CTG

GAT

1735

LeU

IjV.S

Al.a

Alá

G5.Y

Asn

Giy

Ser

Giy

Thr

Al®

Lye

Ser

Leu

Leu

Asp

ΦΧ φφ φχφφ «Φ ΦΦΧΦ * * ♦ X Φ * χ Φ φ * * φ φ «*φ ·» *«»-«* * .-<·> Χ-ΦΦΧ Φ«ΧΦ ΦΦ φφ Φ«Φ

550 555 50

ΑΑ.%.

ATA

CCA

GAT

ATC

CLvkH

ACT

GAG

GOT

CAC

AAC

TCA

TTT

αΊΧΙ

CAC

CGG

1844

Lys: 565

7. ?l

Alii

Asp

54-::0

Glu 570

Sut

Gin

Aia

Gin

Cys 57 S

Ser

Ph«

Met

His

Arg 580

TTT

.AAT

ATT

OCA

GOT

GAC

TTG

ATA

GAA

GAT

GCC

ACT

AGT

CCT

CCT

GAA

18 §2

the

Asn

1«

Alá

Alá 585

Asp

Leu

He

Glu

Asp 550

.Aia

Thr

Ser

Alá·

Ciy 595

Glu

OTT

GOT

TTT

GOT

OGA

ATT

OTT

TGG

ATG

AGG

ATC

GOT

ACA

AGG

1:94 0

Len

Oly

The

Aia. 670

Oly

lie

.Lan-

Val

Trp 605

Met

Arg

Phe

Cet

A.1 <5. 6X0

Thr

Arg

C>5A

CTG

ATA

TGG

AAC

AAA

.AAC

TAT

.AAC

ÓTA

A, Ah

CCA

CGT

CAA

ATA

AGC

1888

cin

He 615

Trp

Asn

Lys

Asn

Tyr 670

Asn

Vai

.Cys

Pro

Arg 625

Gin

Ser

AAG

GGT

CAC

GAC

AGA

CTT

ACA

GAC

TTC

TTO

CAG

AAT

CCT

TTC

ACG:

AGT

2036

Lys

Aia S3 0

Glu

Asp

Arg

Leu

Thr 615

Asp

Asn

•Leu

Gin

Asn 640

Alá

The

Thr

Ser

CAC

CCT

GAG

TAC

GGT

GAA

ATT

TTO

CGG ATC

ATT

ATG

TCA

ACT

OTT

GGA

2084

Kis 645

Pro

Gij'·

Tyr

Arg

Glu SSÖ

lie

1:·?.;

Arg

Gat

Tie 655

Két

Ser

Thr

Val

Ciy SSO

CCT

GGA

GGT

GAA

GGG

GAT

ÓTA

GGA

CAC

CGA

ATT

AGG

CAA

ATT

TTG

•Ό Ί -> C‘ ,<ι,λ Λ <:·

Arg

Oly

Oly

Glu

oly 665

Asp

Vai

Oly

Gin

Arg 670

11«

Arg

Asp

Glu

He 675

Len

GTC

ATC

ChG

AOG

AAC

AAT

GAC

TGC

AAG

CCT

GGT

ATG

ATG

GAA

GAA

TGG

210 0

val

1 is:

Gin

Arg 681

Asn

Asn

Asp

CVS:

Lys 655

Ciy

Giy

Met

Met

Cin 6 70

Glu

Trp

CAT

CAO

AAA

TTG

CAT

AAT

AAT

ACT

AGT

CCT

GAT

GAT

CTT

CTG

ATC

TCT

222 S

His

Gin

Lys SOS

Leu

Kis

i'iíiCÍ.

Asn

Thr 7:0:7

Ser

Pro

Asp

Asp

Vai 775

Vei

He

Cys

2C2<

TTA

.ITT

GAC

TAG

ATC:

AAO

AGT

OAT

TTT

GAT

CTT

CGT

OTT

TAT

22?S

Cin

.Tia 7l&

L4U

í.~

Asp

Tyr

He 715

üys

Ser

Asp

Phe

Asp 727

Len

Ciy

Vai

Tyr

TGG

AAA

ACG

CTG

AAT

GAG

AAC

CGA

ATA

ACA

AAA

GAG

CGT

GTT

TTG

AGT

2324:

Trp 75 5

Lys

Thr

Leu

Asn Glu 710

Asn

Oly

Tie

Thr

Gys 736

Cin

•Arg

Leír

Len

Ser 747

TAT

GAC

GGT

OOT

ATC

CAT

TCT

GAA

CCA

AAT

ITT

AGA

CGA

GAT

CAA

AAG:

d' G> 7

Tyr

Asp

Arg

Alá

He 45

Ki«

Ser

Gin

Prö

Asn 757

Phe

Arg

Ciy

A.£$jp

Gin 7SS

Lys

GGT

GGT

CTT

TTG:

CGT

GAT

TTA

GGT

CAC

TAT

ATG

ΑΌΑ

ACA

TTG

AAc-í

ÖO&

2420

§4 ♦ ♦** » χ < « » 00 00«τ *· X 0 -X ► 00 0ί 0

Gly

Giy

L«U

Lee 750

Arg

Asp

Len Gly

Ars 7S5

Tyr

Mer

Arg

Thr

Lep 778

Lys

Aia

GTT

GAT

TGA

GGT

GCA GAT

CTT GAG

TCT

GCT

ATT

GCA AAC

TGC

ATG

GCC

24 S 8

Val

His

Ser 775

Gly

Ais

Asp

lep

Gip '7 δ ö

Ser

Ara

lle

Asn 785

Cys

Méh

Gly

TAG

AAA

ACT

GAG

GGA

GAA

GGG

TTT

ATG

GTT

GGA

GTC

GAG

.íkx xA

AAT

GGT

2 518

Tyr

LíV.’:: 7 50

Thr

G1.P

Gly

Glrs

Gly 735

Phe

Met

Val

Gly

val 800

03 xí

Tle

Asn

Pro

GTA

TGA

GGC

TTG

CGA

TGT

GGG

TTT

GAG

GAC

GTC

CTG:

CAT

TTT

GTC

TTA

2 554

Vai 805

Ser

Gly

len.

Pro

Ser 810

Gly

Phe

Gin

Asp

lep 315

Len

His

The

Val

Leu 820

GAG

GAT

GTG

GAA

LAT

AAA

AAT

CTG

GA.A

ACT

CTT

CTT

GAG

AGA

TTG

GTA

2822

Asp

His

Val

Gi.u

Asp 825

lys

Asn

Val.

Gin

Thr 880

Len

lep

GlP

Arg

leu 835

Len

0í'Í'<3:

GGT

GGT

GAG

GAG

GTT

.%.GO·

CCC

TTG

GTT CTG

AAA

CC-A

AAG

CCT

2400:

Gin

Ara

Gry

Gin: 84.0:

Glu.

Len

Arg

.Pre

lep 845

lep.

Όΐν;

Lys

Pro

Asp 850

Asn

Arg

GTA

r\.'A>Á:<

GAT

CTG

Tj'r’VT'

TTG

GAC

ATA.

GCA

GTT

GAT

GCT

AGA

GTT

AGA

2708:

Lap.

Lys

Asp 855

Lep

Lee

Phe

Len

Asp :S 00

lie

Alá

Leu

Asp

Ser 88S

Tar

Var

Arg

AGA

GGA

GTA

GAA

AGG

GGA

TAT

GAA

GAA

TTG:

AAC

AAG

GCT

AAT

GGT

GAG

2755

Tár

Aia 8 70

Var

Gin:

Arg Giy Tyr? 875

Gj.u

Gil

Lee

Asn

Asn 880

Aia

Asn

Pro

Glu

AAA

7.10’

.ATG

TAG

TTG

ATG

TCC

GTT

GTT

GAA

AAT

GTC

GCA

CTG

TCT

2 8 02

Lys 885

Lle

Get

Tyr

Phe

lle 83 C

Ser

len

Val

lep.

Gin 835

Asn.

lep

Aia

leu

Ser 300

GTG

GAG

GAT

AAT

GAA

GAT

GTT

GTT

TAT

TGG

TTG

GÖÁ

TGG

AAT

CAA

2852

Vsa

Asp

Asp

Asn

Q: A. Αχ, 90 5

Asp

Let

Val

Tyr

Cys 810

LOP

Lys

Gly

Trp:

Asn 315

Gin

GGT

A’íí’V^Y

TGA

ATG

TCC

AAT

GGT

GGG

GAC

AAC

CAT

TGG

GCT

TTA

TTT

GCA

3 900

Ais.

Las

Ser

Mefc 82 0

Ser

Asn

Giy

Giy

Asp 32 S

Asn

Kis

Trp

Aia

Len 93 0:

Lle

Alá

AAA

GGT

(:7:/0

GTT

GAG

AGA.

AGG

GGT

CTT

GGA

CTT

GCA

AGG

AAG

GCA

OAO

2:348

lys

Aia

7a 5.3 5

Asp

Arg

Tar

Arg 810

lel

Alá

len

Alá

Ser 345

Lys:

Aia

Glu

TGG

TAC

CAT

GAG

TTA

TTG

GAG

GGA

TCT

GGC

GAA

TAT

GTA. GGA

TCA

ATA

2398

Trp

Tyr 950

His

His

Leu

Leu

Gin 855

Pro

Ser

Alá

GÍP

Tyr 38:0

lep Gly

Ser

Tle

♦ * ♦* **♦*.

* * » φ: X * Φ

X * Φ Φ« «Φφ * X X Φφ * Φ

ΧΦΦ X φ Φ X X ΦΦ ♦♦ φ R X-

τττ	OGG Q^G GAG GaAA	TGG CCT	TTG	AAG ATA TTT ACT	GAA	GAa ATÍC ΑΤΆ. 3 04 4
Len 9 δ δ	Gly Val Asp Gin	Trp Alá 570	Lsv	Asn. Tla Phe Thr 375	Cin	Glv T1a Tle 080
C3T	GOT GGA TCA CCA	CCT TCA	TCA	TGC TCT GTT CTT	AAT	AGA CTG GAT 3002
Arg	Alá Gly Sex· Alá 985	Alá Sár	15½ Vi	Ser Ser Len Len 3 90	Asn	Ar« Leu Asp 555
CCC	CTG CT? CCG AAA	AGT CCA	AAT	CTA GGA ACT TGG	CAG	ATT ATC AGT 314 0
Arc	Val Lan Arg Lys: 1800	Thr Alá	lse	lan Gly·· Ser Trp 1005	Gin	Tle Tla Ser 1.04.0
CGA	GTT CAA GCG GTT	CCA TAT	CTT	GTC CTT GTC CAT		TTG CTT TCA 3188
Pro	Val Glv Alá Val 1918	Gly Tyr	Val Val Val Val Asp 182:0	Glv Lan Lev Ser 1025
Π'ΤΤ	CAG AAT CAA ATC	l'AC G&G	AAG	CCC ACG ATC TTA	CTA	©CA AAA TCT 3230
Val	Gin Asn Glu He 1013	Tyr Glv Lys 20C5	Pro Thr Tle Lav Val 1040	Alá Lys Ser
GTT	.A.AA. \óGA GAG G;A.G	GAA ATT	CCT	GAT CCT GCT CTT	GCG	CTG ATA AGA 3284.
Val Lys: Gly Glv Glu 1911	Glv Tis 105 0	Pro	Asp Gly Alá Val 1855	Alá	Len He Thr 108 0
CCA	CAC ATG CCA GAT	GTT CTT	TCA	CAT GTT TCT CTT	CGA	GCT AGA AAT 3332
Pro	Asp Cet ?-x Asp val Lev 1:055	Ser	Kis val Ser Val 107 0	Arg	Alá Arg Asn 1875
GGC	AAG GTT TGG TTT	GGT ACA	TGC	TTT CAT CCC AAT	ATA	TTG GCT CAG 3358
Gly	Lys Val Cys Pfes 138 0	Alá Thr	Cys	Phe Asp Pro Asn 1085	rle	Len Alá Asp 3,8:50
CTC	CAA CCA AAG GAA	GGA ACC	ATT	TTG CTC TTA aac	GCT	AGA CCT TCA 342:8
Len	Cl a Alá Lys: Glv 1.35®	Gly Arg	Tle Lav Lan Lev Lys 1100	Pro Thr Pro Ser 1105
GAG	ATA ATC TAT AGT	CAG GTG	AAT	GAG ATT GAG GTC	GAA	AGT TCA AGT 34 78.
Asp	lle He Tyr Ser 1110	Gckli VíívÁ. öl 11.15	Glu Tle Cin Lan 1121	Gin 3	Ser· Ser Ser
AAC	TTC GTA GAA GGT	GAA AGT	TCA	GGA ACA GTT AGA	TTC	GTG AAA AAG 3524
Asn Lili	Lan Val Cin Alá	Gin Thr 1110	Sár	Alá Thr Lan Arg 1135	Len	Val Lys Lys 1140
CAA	TTT GGT GGT TCT	TAG GCA	ATA.	TCA GGA. GAT GAA	TTC	AGA AGT GAA 3572
Gin	Phe Gly Gly Cys; Tyr: Alá 1145	!ls	Sfer Alá Asp Glu 1150	Phe	Thr Ser Cin 21:5 5

ATG .©TT GGA ÖCT AAA TCA GGT .,ΑΑΤ ATT GGA TAT OT AAA GGA AAA CTG

XX χ * X *» Χ*ΧΧ «ί * ♦ X X » X X X

X * χ *χ χβχ * * X X X X X « « χ χ »«φφ χχ χ» χχχ:

vet	vei	Gly	Alá Lys 1163	Ser .Arg Asn He Alá Tyr Leu Lys Gly Lys Val
11.65	1170
CCT	TCG:	TCG	GTC GLA	ATT GCT AGG TCA GTA	GCT CTT GCA TTT GGA CTG 3668
Pro	Ser	Ser Val Gly H?5	rle Pro Thr Ser Val 1135	Alá Len Pro Phe Gly Val 1.185
TTT	CAG	AAA	GTA CTT	TCA GAC CAC ATA AAT	CAG GGA CTG GCA AAA GAC 3716
»'he	Gla Lys 11 32	Vei Len	Ser Asp Asp He Asn 11S 5	Gin Gly ΉΙ Alá Lys Glu 12 03
ttc	CAA	ATT	GTC ATG	AAA AAA CTA TGT GAA	CGA GAC TTC ACG GCT GTT 3?SÁ
ÍSii no?	Gin >	I le	Leu Kei;	Lys: Lys Len Ser Gin 1210	Gly Asp Phe Ser Alá Leu 1215 1220
ggt	CAA	ATT	CCC ACA:	.«.CG GTT » GAT CTT	TCA GCA CGA GCT CAA TTS 3812:
Oly	Sin	He	Arg: Thr Thr Val Len Anp Lee. Ser Alá Pro Alá Gin Let; 12 2S 1236 1235
GTC	AAA.	SÁG	GTC AAG	GAC AAG A2G CAG GCT	TCT GCG: ATC GCT TCG CCT 3 SCO
Val	Lys	Cin	leu Lys 1210	Glu Lys Lset Gin Gly 1245	Ser Gly Mer Pro Trp Pro 12 50
GCT	GAT	GAA	GGT GCA	AAG CCC TGG GAA CAA	GCA TGC ATG GCG ATA AAA 350:5
Gly	Asp	Glu Gly Pí;c· 12.5.5	Lys; A;:« Tre Gin Gin. 1260	Aia Trp Met Aia Tle Lys 1265:
AÁG	GGG·	TCC	GCT ICA	AAA TGS AA.T CAG A.CA.	GCA TAG TTG AGC AGA AGC 3 356
Lys	Col Trp 12 70:	Aia Sor	Lys: Trp Asn Glu Arg 127 5	Alá Tyr Phe Ser Thr Arg 12 00:
AAG	CTG	AAA	CTG GAT	CAT GAC TAT CTG TGC	ATC GCT GTC CTT GTT GAA 4004
Ive Val. 12 SS	íúVS	Leu Asp	Sis Asp Tyr Lén Cys 1253	Mer Alá Val Len Val Glu 12:35 1300
	ATC	.A. ,ΐ .;&r.	AAT GCT	GAT TAT GCA TTT GTC	ATT CAC ACA ACC ÁÁC CGA 4.052
Π.	1.1 e	Se	Asn Als. Asp Tyr Als. Phe Val He Hls Thr Thr Asn Pro 13 35 1310 1315
TCT	TCC	CGA	0AC GA C	TCA GAA. AÍA TÁT GCG	CAC GTC GTC ACG GGC CTT 4100
Sár	Ser	Sic -Ί. :C	Asp Asp 132 3	Ser Gin He Tyr Alá 1323	Gin Val Val Arg Gly Leu 1330:
sec	G.;;:A.	ACA	CTT GTT	CGA uCT TAT CGA GCA	CGT CCT TTC AGT TTT ATC 4148
Cly	Cl':..;	Thr Leu Val 13 IS	Gly Aia Tyr Pro Gly 134:0	Ara Aia Len Ser Phe: He 1345
TGC	AAG	AIA	AA.G CAC	CTG AAG TCT CCT CAA	CTG TTA GGT TAC CGA AGC 4136
Cys	Lys Lys 13 50	Lys Asp	Leu Asn Ser Pro Cin 1355	Val Len Gly Tyr Pro Ser 1330

>»«♦ »φ φ*«« >· » Φ Κ Φ φ X φ » « Φ »< ΧΦΦ

Φ X X Φ Φ Φ Φ

ΦΦΦΧ φχφφ ΦΦ. φφ ΦΦ:-*

.t.xx

CCG ATC

GGC

CTT

TTC

ATA

AAA

AGA TCT

ATC

ATC TTC

CGA

TCT GAT

4244

Lys Pro Tle 136 S

Gly

Leu

Pbs Tle 13 7 0

lys

Arg Se;:

Tie Tle Pbs 13 75

Arg

Ser Asp 138:0

acc

AAT GGC

GAA

CAT

TTG

GGT

TAT GCC

GCT

GCT CSC

CTC

TAC SÁG

42 02

Se;:

As:::. Gly

Cls

Asp sas 1.385

Glu

•31/

Tyr Ala Gly 1,3:80

Ala Gly

Leu

Tyr Asp 1305

ICC

GTA CCA

ATG

GAT

CAG

GTG

CAA

AAA 3TT

GTA

ATT GAT

TAG

TCT TCC

4040

Ser

Val Pro

Nefc Asp TÁíiö

Gla

clu

Glu

Lys Val 1405

Val

Tle Asp

Tyr Ser Ser 1410

GAC

•CCA. TTG

ATA

ACT

GAT

CTT

AAG

TTC CGC

CAG

AGA ATC:

CTC

TCC AAG

4 3 8 8

Ainp

Pro lese Tle 1415

Thr

Asp

ui/

Asn Phe Arg iato

Gin

Thr Tie Lén 1425

ser Asn

ÁSS

GOT CGI

GCT

GGA.

CAT

GCT

ATC

GAG GAS

GTA

TAT GGC

TCT

CCT CAA

4 4 36

le

Ala Arg 143«

Ala

Gly

His

Alá Tie 34.33

Glu Glu

Leu

Tyr Gly 1440

Ser

Pro Gin

GAC

ATT GAS

GGT

GTA

GTG

AGC

GAT

GGA AAG

ATT

TAT GTC

GTT

CAG ACA

4484

Asp tle ele 2445

Gly:

Val

Val Arg Asp 14 SO:

Gly ly©

Tle Tyr Val 1155

Val

Cl···· Thr 146 C

AGA

CCA CAG

ATG

T GATTATATTC TCGTTGLATG

TTGTTCAGAG AAGACCACAG

45 37

Arg Pro Óla Met

ATGTSAICAT	ATTCTCATTG	TATCAGACCT	GIGACGAGTT	ACCTGATACC	TCCGATGAA3	4597
TTACCTGTAT	GATTATACCT	GATCCAAACC	CATÚACATCA	TGTTCACCTT	CAGCTATTGG	46 57
AGGAGAACTG	AGAA3TAGGA	ATTGCAATAT	GAGGAATAAT	ftASAAAAACT	TTGTAAAA.GC	4717
TAAATTAGC!	GGGTATGATA	TACGGASAAA	TGTGTAAACA	TTGTACTATA	TATACTATAT	4777
ACACACGCAT	TATGTATTCC	ATTATCCAGT	SAATAATATC	SCAGCATCAA	ACAAGAAATC	4837
CTTTGGQTGG	TTTQAAAAA					4:8.55

, számi: g sekysngí ayáalat iá) A sseWestía jellem αχ;:

(A) Gcséx' 1481 aminosav (SÍ Típus :Mia6sav

X ' Φ ♦ X 9 * V

ΦΦ '· X Φ χ φ φ ΦΦ Φ* Φ Φ Φ:

(D) Τορο16g ίο: 1ίneárí s

	fii; A molekula típusa:: fehérje	.3
(zi i	A szekvencia	leírása: 2	. e 2 a m, rn ' A < V » C l.
Per	Ser Asn	Ser Len Giy Asn	Asn Len Len	Tyr Gin Gly Phe Len	Thr
1		s	10	15
Ser	Thr Var	Lan Gin his Lys	Ser Arg He	Ser Pro Pro Cys Val	Gly
		2 0	25	30
Oly:	Asn Ser	Len Phe Gin Gin	Gj.u ITar	Ser lys Ser Pro Len	Ser
	;r$		40	45
Thr	Gin The	Arg Gly Asn Arg	Len Lys Val	Gin. Lys Lys Lys He.	Pro
	50	SS		SÖ
Mer	Orv Lys:	Lys Arg Aia Phe	Ser .ser Ser	Prö kis Alá Vél Len	Thr
6.5		7©		TS	80
Thr	Asp Thr·	Ser Ser Gin Len	Aia Gin Lys	Phe Ser Len Gly Gly	Asn.
		SS	90	SS
Iie	Gin Len	Gin Val Asp Vai	Arg Pro Pro	Thr Per Gly Asp Val	Ser'
		Itt	105	no
Phe	Va i Asp	Phe Gin Val Thr	Asn Gly Ser	Asp Lys Len Phe Len kis
	T15		r r ©	125
Trp	Gly Alá	Val Lys Phe Giy	Lys Gin Thr	Trp Ser Len Pro Asn Asp
	120	135		14©
Arg	Pro Asp	Giy Thr Lys Var	Tyr Lys Asn	Lys Aia Leu .Arg Thr	Pro
145		ISO		2 SS	ISO
Phe	Val Lys	Ser Gly Ser Asn	Ser Tie Len	Arg Len Gin .He Arg Asp
		155	170	2 7S
Thr:	Ara .Iie	Gin Alá He Gin	Phe Len He	Tyr Asp Gin Alá kis:	Asp
		23©	235	130
Lys	Trp :He	Lys Asn Asn Gly Gly Asn Phe	Arg Val Lya Len Ser	Arg
	155		2 00	2 OS
Lys	Gin He	Arg Gly Pro Asp	Val Ser Val	?::o Gin Gin Len Val	Gin
	2 10	215		22 0
He	Gin Ser	Tyr Len Arg Trp	Gin Arg Lys	Giy Lys Gin Asn Tyr	Pro
r .·.'.*		230		23 5	240
Pro	Gin Lys	Gin Lys Gin Gin	Tyr Gin Aia	Aia Arg Thr Vai Len	Gin

Glu Glu

2 1«

Alá 250

245 Arg

250

2SS

Oly Alii. Ser He 2S5

Gla

Asp Xle

Arg

Alá 370

Arg

U«u

Thr

Lye

Thr

Asn

Asp

Lys

Ser

Gin

Ser

Lys

Glu

Glu

Tro

Leu

Kis

Val

•X4 t 'v3-

280

2SS

Thr

Lys

Ser

Asp

Tie

Pr :.·

Asp

Asp

Leu

Alá

Π

Alá

Gla

Tyr

He

230

2.95

300

Arg

Trp

Glu

Lys

Alá

Oly

Lys

Tro

Asn

Tyr

Pro

Tro

Glu

Lys

Gia

rrS

3 05

310

315

320

Glu

Glu

le:..

01 a

Glu

Aia

Arg

Arg

Glu

Leu

Gla

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

32 3

33 0

335

le

Thr

Leú

Asp

Gin

Leu

Arg

Lys

Thr

r le:

Thr

Lys

Gl.y

Glu

He

340

345

350

iu yíS:

Thr

Lya

Val

Glu

Lys

Kis

Leu

Lys

Arg

Ser

Ser

Phe

Alá

Val

Glu

3 55

3S0

3 SS

Árg

He

Őla

Ara

Lys

Lys

Ara

Asp

The

Gly

Kis

Leu

He

Asa

Ly «

Tyr

370

3 75

389

Thr

Ser

Ser

Pro

Alá

Vei

Via

Val

Gin

Lys

val

Len

Glu

Glu

Pro

Pro

38 5

3S0

.3 SS

4 55

AxT<

ieu

tér

Lys

21«

Lys

Lep

Tyr

Alá

Lys

Glu

Lys

Glu

Glu

Gia

He

4 OS

4X0

415

Asp

Asp

Tro

He

Leu

Asa

Lys

Lys

He

The

Lys

Val

Asp

Asp

Gly

Glu

420

425

430

Leu

Leu

Tel

Leu

Val

illa.

Lys

Ser

Sex:

Oly

X.-ys

Thr

Lys

Val

Kis

Leu

43 5

1 >· G

445

Al a

Thr

Asp

Leu

Asn

Glu

Tro

He

Thr

Leu

Kis

T;:p Alá

Leu

Ser

Lys

ásó

4 SS

400

Ser

Pvo

Oly

Glu

Trp

Kei

Vai

He

Pro

Ser

Ser

Ils

Leu.

Pro

Tro

öly

4 es

47 0

475

480

Ser

XX e

.He

Leu

Asp

Lys

Alá

Alá

Gr u

Thr

Pro

The

Ser

Al a

Ser

Ser

485

490

435

Ser

AíSU

Gly

Leu

Thr

Ser

Lys

Val

Gia-

Ser

Leu

Asp

11«

Val

2 le

Glu

SöO

SOS

510

Asp

élv

Asn

The

Tel

Gly

Met.

Pro

Phe

Val

Leu

Leu

•Ser

Gly

Gin

Lys

5X5

520

525

Tri?

XXe

Lys

Asn

Gin.

Giy

Ser

Asp

The

Tyr

Val

Gly

The

Ser

A.Lcíi

.Alá

Φ* ΦΦ Χφφ* χφ Φ***

Φ * Φ Φ Φ φ Φ Φ

X ♦ φ *« **φ φ » φ φ φ * φ νχφφ φφφ» χφ ΦΦ φφ»

0 53S 540

Ser

Lys

Leu

Alá

Len

Lys

Aia

Aia

Gly

Asp

Gly

Ser

-4?iy

Thr

Als

Lys

54 5

550

5:5 5

560

Ser

Leu

Leu

-Gap

Lys

Tle

Alá

Asp

Met

Glu

Ser

Glu

Alá

Gin

Lys

Ser

SS 5

570

575

Phe

bet

His

Arg

Phe

Asa

lle

Ara

Al®.

Asp

Leu

Lle

Glu

Asp

Aia

Thr

58 0

SS 5

570

Ser

Als

Gly

Gin

Leu

Gly

Phe

ÁX&

Gly

lle

Leu

Val

Trp

bet

Arg

Phe

595

600

605

Met

Alá

Thr

Arg

Gin

Leu

lle

Trp

Asn

Lys

-Asn

Tyr

Asn

Val

Lys

Pro

615

615

62 0

Arg

Glu

lle

Ser

Lys

Aia

Gin.

Asp

Arg

Leu

Thr

Asp

Leu

Len

G-1-Π

Asn

02 5

630

635

640

Alá

Phe

'1®

Ser

HiS

Pro

Gin

Tyr

Arg

Gin

lle

Len

Arg

Met:

lle

bet

645

66 0

6 55

SprX

Thr

Val

Gly

Arg

Gly

Gly

Glu

Gly

Asp

Vei

Gly

Glu

Arg

Tle:

Azg

:66Ó

66 5

6 7:0

Asp

Glu

lle

Len

val

Lle

Gin

Arg

Asn

Asr:

Asp

Gye

Lys

Gly

Gly

bet

675

680

685

bee

Gin

Gin

Trp

ibe

Gin

Lys

Len

Pia:

Asn

Asa

Thr

Ser

Pro

Asp

Asp:

6 96

6 95

760

val

Val

lle:

Cys

Gin

Leu

X -í ö

Asp

Tyr

Tle

lys

Ser

Asp

Phe:

Asp

τον

710

715

720

Leu

Gly

Val

Tyr

Trp

Lys

Thr

Len

.íkSi?·.

Glu

Asn

Gly

lle

Thr

Lys:

Gin

72S

730

735

Arg

Len

Leu

Ser

Tyr

Asp

Arg

Alá

Tle

Kis

Ser

Glu

Ara

Asn

Phe

Arg

746

745

75 0:

Gly

Asp

Gin

Lys

Gly

Gry

Len

Len.

Arg

•íkví'O

Len

Giy

Kis

Tyr

Met

Arg-

55

760

705

Thr

Leu

Lys

Alá

Val

Kis

Ser

Gly

Alá.

Asp

Leu

Glu

Ser

Alá

lle

Alá

770:

775

780

Asn

Cys

Kefe

Gly

Tyr

Lys

Thr

Glu

Gly

Gin.

Gly

Phe

bet

Vsi

Gly

Val

85

7S8

706

800

Gin

lle

Asn

Pro

Val

Ser

Gly

Leu

Pro

Ser

Oly

phe

Gin

Asp

Len

Leu

SOS

«10

SIS

Kis

Phe

Val

Leu

Asp

Kis

Val

v-? 1 ü

Asp

Lys

Asn

Val

Glu

TLr

Len

Jltö ti

« Φ ** ΦΦΦΧ φΧ- ΧΧΦΦ φ * ♦ φ φ φ φ φ

Φ Φ' Φ ΦΦ Φ'Φ X * Φ φ φ φ φ

ΦΦ «Φ « Φ ΦΦ ΦΦ Χ-χ Χ ΦΦ

	ííkí 0	828	83 0
Gin	Arg Lse Lee Glu élé :8 3 5	Arg Glu Glu 840	Leu Arg Pro LeU Lén Leu Lys 84 8
Pro	Léé Asm Arg Lee Lys 850	Asp Leu Leu 8 SS	Phe Leu Asp Iie Alá Leu Asp SCO
Ser 865	Thr Val Arg Thr Alá 870	Vei Glu Arg	Giy Tyr Glu Gin Leu Asn Asn 878 880
Alá	Asn Pro Glu Lys lle 88 S	Met Tyr Phe	lle Ser Leu Vai Leu Glu Asn 890: 8 95
Leu	Alá Leu Ser Vei Asp 000	Asp Asn Glu SOS	Asp Leu Vai Tyr· Cys Len Lys 31.0
Oly	Trp Asn Gin Álé Leu SÁS	Ser Kefe Ser 820	Asn Giy Giy Asp Asa Sis Trp 92 S
Ale	Len öhe Air Lys Aia 93 0	Vél Leu Asp 935	Arg Thr Arg Leu Alá Len Aia 940
Ser 945	Lys Aia Glu Trp Tyr Ttt	A: His Len	Leu Gin Pro Cer Álé Glu Tvr 355 960
Leu	Oly Ser lle Lse Giy SOS	AÍctX 17.1:1	Trp Aia Leu Asn. lle Phe Thr 370 375
Sla	Glu lle lle: Arg Lis. 880	Giy Ser Aia .985	Alá Ser Len Ser Ser Len Leu 990
ASVÍ	Arg Leu Asp Pro Vei 835	Leu Arg Lys 1000	Thr Alá Asn Len Giy Ser Trp 10 05
Cin	lle lle Ser Pro Vei 1813	Glu Alá Vél 1018	Giy Tyr Vei Vai Val Vei Asp 102 0
Gin Leu Len Sér Vél Gla Asn Glu He 1025 1030	Tyr Glu Ly:s Pro Thr· Ti sí Leu 1035 1040
Vei	Ale Lys Ser Vai Lys 1048	Giy Glu Glu	Gin He Pre Asp Glu Aia Val 1050 1055
Álé	Leu lle Thr Pro Asp 100 0	Két Pro Asp Vél Leu Ser Sis Val Ser Vsi 1065 2070
Arg	Alá Arg Aon Oly Lys 1075	Val Cys Phe 108 0	Ale Thr Cys Phe Asp Pro Assn 1085
lle	Leu Ale Asp Leu Gin 10 80	Aia Lys Glu öly Arg lle Len Leu Leu Lys 1035 1100

Pro Thr 1X05	Pro Ser	Asp l'is Tie Tyr Ser Glu Val Asn Glu Tie Gla Leu
Tll 0	1115	112 0
Gin Ser	Ser Ser	Asa Leu Val Gin Al® Gin	Thr Ser Ai.a Thr Leu	Arg
		112 5 1130 1135
Leu Val	Lys Lys	Gin Phe Gly Gly Gys Tyr	Aia lle Ser Al® Asp	Glu
	114 0 1645	1150
Phe Thr	Ser Glu	Két Var Gly Aia Lys Sex?	Αχ-g Asn Tie Aia Tyr	Leu
	1 IS 5	1166	1155
hy;~ Gly	Lys Val	Pro Ser Ser Val Gly rie	Pro Thr Ser Val Aia	Leu
1170	1175	1156
Pro Phe	Oly Vei	Phe Glu Lys Val Leu Ser	Asp· -Asp Tie Asn Gin	Gly
118:5		1132	1135	1200
Vei Aia	Lys Gin	Leu Gin 11» Leu Met Lys	Lys Leu Ser Gin Gly	.Asp
		1205 1210 1215
Phe Sex·	.a.;e ii?*...	Gly Gin lle Arg Thr Thr	Val Leu Asp Leu Ser	Alá
	1221	5 1225	123 0
Pm A.i a	Gin Le..	Val Lys Gin Len Lys Gin	Lys Get Gin Gly Ser	Gly
	1215	1240	1.245
Két Pro	Trp Pro	Gly Asy Glu Giy Pro Lys	Árg: Trp Glu Gin Aia	Trp
X 2 S 0	1255	125 0
Mefc Alá	Tie Lys	Lys Val Trp Alá Ser Lys	Trp Asn Glu Ara Alá	Tyr
125 5		1270	1275	2.28 0
Phe Ser	Thr Arg	Lys Val Lys Leu Asp Ln	Asp Tyr Len Gys hat	Aia
		1285 12:2;	3 12 5Í	j
Val heh	Val Gi.”	Glu lle Tie Ash Aia Asp	Tyr Aia Phe Val Tie	His-
	13ÖO 1105	1310
Thr Thr	Asn Pro	Ser Ser Gly Asp Asp Ser	Glu Tie Tyr Alá Glu	Val
	1315	1.3.20	1325
Val Arg	Gly Len	Gly Gi.u Thr Leu Vei Gly	Aia. Tyr Pro Gly Arg	Aia
1330	133.5	1342
tea Ser	P he T.le	Cys Lys Lys Lys Asp Leu	Asn Ser Pro Gin val	Len
1365		1350	1355	13 5 0
Gly Tyr	Pro Sár	Lys Pro ii.e Gly Len Phe	Tie Lys Arg Ser Tie	2 le

1365 1370 13 75

Ph« Ara Ser .Asp Ser Asn Siy Gin Ásxí Lesi Glu Gly Tyr Alá Gly Aia «♦ «« ΦΧΧΦ Χ« ΦΦΦ* « * * X « X X «

X * X ** χφ«

Φ Φ X Φ Φ * Φ νφφφ «>«» «« φΧ XX*·

3.380 1385 1300

Gly Uu Tyr Au» Ser Val Pra ítet Asp	Gin	Gla Sin. tys 1405	Val	Val	lle
	1.3 35	14 GO
Asp Tyr	Ser Ser	Asp Pro te» lle Thr	Asp	Gly Asn Phe	Arg	Gin	Thr
1ΦΧ0·	3415		142 0
lla tsz	Ser Asn	iie Aid Arg Als Gly	His	Aia lle Gla	Ölu	LSU	Tyr
3 42 5		1430		1435			1440
Sfy Ser	Cm Gin	Asp lle Sin Gly Val	Val	Arg Asp Gly	lys	lle	Tyr
		144 5	14 50		145 5
Val Val	Gin Tar	Arg ?rc Gin. Get

Η« , ε ζ ότ υ s ζ e tv e η ο.: a ν ι ζ lat li) A szekvencia jeileoizdi:

(A) Boas ζ : 1918 foá z ispár í Sj Típus; OGbleotib (Cl Száltípos: egyszálú (D) Topó Xcg 1 a: lineáris fii; A molekula típusa: ckiDS isRPS-re

1i i i) Eredet1 farráa:

(b) Szervezet.: Soianum taberoaum (G) Törzs: C.v. Desiree (1) Tú l a j dón ság ·:

(I) Dáv/kulcs: CDS ig) Sgkaíizáplb;: Í,.lSőS (xf) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia

SCA SÁG TGG T&C CAT CAC TTA TTC CAG ICA TCT SCC GAA TAT t.’TA GGA

Φ» φφ *φφφ κ» ΦΦΦ X χ Φ Φ 9 Φ X φ X

X φ Φ Φ» »ΦΦ * » Φ Φ Φ χ Φ

ΦΦ* » ΦΦΧ-Φ χ« :.«:φ. «χφ

Ala

cin

Trp

Tyr

Sle

Kis

Lee

.13*2

Gla.

Arc

Ser

Aj. <3.

Gla

Tyr

Lea

Gly

ϊ

5

18

15

VGA

ATA

CTT

GGG

GTG

GAG

GAA

TGG

GGT

TTG

AA.C

ATA,

TTT

AGT

GAA

GAA

$:e :<

He

baj

Gly

Val

Asp

Gin

Trp

Ala

Len

.Asn

He

Phe;

«φ'. .... :

Gin

Gla

20

25

2 8:

ATT

ATA

GGT

GCT

GGA

TCA

GGA

GCT

TCA

TTA

TCC

TCT

CTT

CTT

AAT

AGA

Tle

Ile

Arg

.Ala

Gly

Ser

Ala

Ala

Ser

Lea

Ser

Ser

Lea.

Lea

Asn.

Ara

3 5

4 0

4:5

CTG

GAT

GTG

GTG

GTT

CGG

ÁÁÁ

AGG

GCA.

AAT

CT&

GGA

AGT

TGG

CAG

ATT

tea

Asp

5ro

Val

Len

Ary

lys

Thr

Asn

Lea

Siy

Ser

Trp

Gin

Tle

50

55

8 8

ATC

AGT

GGA

GTT

GAA

GCC

GTT

GGA

TAT

GTT

GTC

GTT

GTG

GAT

GAG

TTG

lie

Ser

Geo

Val

Gla

Ala

val

Gly

Tyr

Val

Val

Val.

Val

Asp

Gla

Lea.

•85

70

75

se

GTT

TCA

GTT

A<

AA'f

GAA

ATG

TAC

GAG AAG

CCC

ACG

ATC'

TTA GTA

ÖCS.

Lea

Ser

Val

Gla

Asn

Glu

He

Tyr

Gin

Lys

Pro

Thr

He

Lea

Val

Ala

SS

30

SS

AAA

TGT

GTT

AAA GGA

GAG

GAG

GAA

ATT

GCT

GAT

GGT

GCT

GTT

GCC

CTG

Í<S

Ser

Tar

Lys

Gl y

Gin.

Gla

Gin

le

Arc

Asp

Gly

éls

Val

Alá.

Lan

így

205

no

ΑΤΆ

AGA

GGA

GAC:

ATG

CGA

GAT

GTT

CTT

TCA

CAT

GTT

TGT

CTT

CGA

GCT

Tli:

Thr

.Pro·

Asp·

Get

Pro

Asp

Val

Len

Ser

His

Val

Ser-

Val

Arg

Ala

115

Π ö

125

AGA

AAT

GGG

AAG

GTT

TGG

TTT

GCT

AlA

TGC

TTT

GAT

CCC

AAT

ATA

TTG

Arg

Aen

Gly

Lys

Val

Cys

The

Ala

Thr

Cys

The

ASp

Arc

Asn

He

Len

3.20

135

3.48

GCT

GAv.

CTG

GAA

GGA

GAA

GGA

AGG

ATT

TTG

C'TC

TTA

AAG

GCT

ACA.

Ala

Asp

Lea

Gla

Als.

Lys

GXví

.\4.1 y

Ars

He

Lea

Len

Lea

Lys

Pro

Thr

145

15 8

155

ISO

GCT

TCA

GAG

ATA

ATT

TAT

AGT

GAG

GTG

AAT

GAG

ATT

GAG:

GTC

CAA

AGT

Pro

Se r

.Asp

He

He

Tyr

Ser

Öle

Val

Asn

G J.UÍ

He

Gla

Len

Gin

Ser

165

178

5.73

TCA

AGT

AAG:

TTG

GTA

GAA

GGT

CozáA.

ACT

TCA

GCA

ACA

CTT

AGA

TTG

GTG

Ser

Ser

tea

Lea

val

Gla

Ala

Gla

Thr

Ser

Ala

Thr

Len

Ara

Lea

Val

ISO

185

190

ÁAÁ

. .A-A.Q

GAA

TTT

GGT

GGT

TGT

w

GGA

ATA

TCA

GGA

GAT

GAA

TTG

ACA

tys

Lys

Gin

Phe

Gly

Gly

Cys

Tyr

A.l^

Tle

Ser

Ala

Asp

Gla

The

Thr

295

00

Η 5

285

338

584

3

528 v?S * * * * « « « φφ«φ «φφφ «Λ **

AGT GAA	.ATG GTT GGA GGT AAA TCA	GGT AAT	ATT GGA TAT	C'lC .AAA		«72
Ser Gin	Ger Val. Gly Alá Lys Ser	Arg Asn	Ile Alá Tyr	Len Lys	Gly
210	315		C & U
AAA CTG	CCT TGG TGG GTG GGA ATT	CGT AGG	TCA GTA GGT	CTT CCA	TTT	720
Los Val	Pro Ser Ser Tál Gly Ile	Pro Thr	Ser Val Aia	Len Pro	Phe
2'zS-	2S0		235		240
GCA GTC	TTT GAG AAA GTA GTT TGA	CAC GAC	ATA AAC CAG	GGA GTG	GCA	7 68
Gly Vől	The Gin Lys val Len Ser	Asp ASp	He Asn Gin	Gl y Val	Alá
	245	250		255
AAA GAG	TTG GAA ATT CTG AGA AAA	AAA GTA.	TCT GAA GGA	GAG TTT	AGG
Lys Glu	Len Gin. Iie Lsu Thr Lys	Lys Len	Ser Gin Giy	Asp Phe	Ser
	260	26 5		270
GCT GTT	GGT GAA. ATT GGC AGA AGG	GTT TTA	GAT GTT TGG	AGA CCA	GCT	864:
Alá Len	Giy Gin Ile Arg Thr Thr	Val Len	Asp Len Ser	Thr Pro	Alá
	375 280		285
GAA TTG	QTC AACk GAC CTG AAG GAG	AAG ATG	CAG GGT TGT	GGC ATG	GGT	21 A. x.
Gin Len	Val Lys Gin Len Lys: Gin	Lys fist	Gin Gly Ser	Gly Met	Pro
2 00	285		3 00
TGG GGT	GGT GAT GAA GGT GGA AAG	CGG TGG	GAA GAA GCA	TGG ATG	GCC	560
Trp Pro	Gly Asp Glu Gly .Pro Lys	Arg Trp	Gin Gin Aia	Trp Lfefc	Alá
SOS	310		32 5		326
ATA AAA	AAG GTG TGG GGT TGA AAA	TGG AAT	GAG AGA GGA	TAG TTC	AGG	1008
.T. i.;V£>	Lys Val Trp Aia Ser Lys	Trp Asn	Gin Arg Aia	Tyr Phe	Ser
	325	330		335
A CA ΑΆ·j	AAG GTG AAA CTG GAT GAT	GAG TAT	CTG TGG ATG	GGT GTG	CTT	1056
Thr Arg	Lys Val Lys Len Asp Kis	Asp Tyr	Len Cys Méh	Alá Val	Len
	340	345		350
GTT GAA	GAA ΑΤΑ ΑΤΑ AAT GGT GAT	TAT GGA	TTT GTC ATT	CAG AGA	AGC	1104
Val Gin	Gin Ile: Ile Asn Alá Asp	Tyr Alá	Phe Val Tla	Sis Thr	Thr
	7 66 360		355
AAG GGA	TCT TCG GGA GAG GAC TGA	GAA ATA	TAT GGC GAG	GTG GTC	AGG	1162
Asn Pro	Ser Ser Gly Asp Asp Ser	Gin Ile	Tyr Ma Gin	Val Val.	Arg-
3 70	375		.3 80
GGC GTT	GGG GAA AGA GTT GTT GGA	GGT TAT	GGA GGA GGT	GCT TTG	AGT	12 00
Gly Len	Gly Gin Thr Len Val Gly	Alá Tyr	Pro Gly Arg	Aia Len	Ser
sas	350		3 85		4 0ö
TTT ATG	TGG AAG AAA AAG GAT CTG	AAG TGT	CGT GAA GTG	TTA GGT	TAG	1248
Phe Ile	Gye Lys Lys Lys Asp Len	Asn Ser	Pro Gin Val.	Lan Gly Tyr

** ***« ** ***♦ ♦ *« :Χ X :Χ »χ

X X β ** ««« ♦ χ χ » κ χ χ ♦•♦•η ·<»♦·· χχ «<♦ · ··.'·<>

405

410 415

CCA .ovo	AAA	GCG ATG	GGC	OTT TTC	ATA	AAA AGA TÓT	ATC ATC TTG	GGA	17:96
Oo Ser	Lys	Pro iie	Gly	Leu Pae	Tle	Lys Arg ser	lla Tle Phe	Arg
		420			425		42 0
TCT GAT	SCO	'•'.AT <00	GAA	GAT TTG	GAA	GGT TAT ÖCC	GGT GCT GGC	CTG	1344
Ser Asn	Ser	As:a <31 y	Glu	OOy Leu	:,alu	Gly Tyr Alá.	Gly Alá Giy	Leu
	038			44 0			44 5
tag ne	AGT	GTA CCA	ATG	GAT GAG	GAG	GAA AAA GTT	GTA ATT GAT	TAG	13 32
Tyr Asp	Ser	Val Pro	Siet	Asp Glu	Glu	Glu Lys Val	Vei Iie Asp	Tyr
430				455		450
TCT TGC	GAC	CCA OVO	ATA	ACT GAT	GGT	AAC TTC CGC	GAG ACA ATC	CTG	144 0
Ser Ser	Asp	Pro Leu	Tle	Thr Asp	Gly	Asn Phe Arg	Gin: Thr Iie	Leu
•4 SS			47 0			CC		0:0
To e se	ATT	GOT CGT	GCT	GGA GAT	GCT	ATG GAG GAG	CTA TO GGC	TCT	14.88
Ser Aso	Tle	Alá Arg	Aia	Giy SÍK	Alá	11e Glu Glu	Lse Tyr Gly	Ser
		485				4 90	495
GCT OAA	3AC	ATT GAG	GGT	GTA GTG	AGG GAT GGA AAG	ATT TAT GTC	GTT	153 8
Pre Sin	Aep	lla Glu	Giy	Val Val	Arg Asp. Gly Lys	Tle Tyr Vai	Vai
		5 00			SOS		510
CAO AeÁ	AGA	CCA CAO	ATG	T GATTATATTC TGGTTGTATG	TTGTTCAGAG		1585
Gin Tár	Arg	Pro Gin	tet

sas

AAGACGAGAG	ATGTGATCAT	ATTCTOATTS	TATGAGATGT	GTGACCACTT	ACCTGATACC	164 8
TG0CATGAAG	TTACCTGTAT	GATTATAOGT	GATCCAAAGC:	CATCAOATCA.	TGTTCACCTT	1705
OAGCTATTGG	AGGAGAAGTG	AGAAGTAGGA.	ATTGCAATAT	GAGGAATAAT	AAGAAAAACT	1765
TTGTAAAAGC	TAAATTAGCT			TGTOTAAACA	TTGTACTATA	1825
TATAGTATAT	ACACACGCAT	TATGTATTGC	ATTATGOACT	GAATAATATC	gcοοοοτηζ	1883
AGAAQKJAkATC	GTTTGGGTGG	TTTCAAAAAA	AAA			1918

4. száma sze^venciaváglat ti) A szekvánGAA: jeiXemzői:

(Aj Sós ázz SAS amirossv

ΦΦΦ íí «Φ X»Φ* ΦΦ « 6 φ. » ♦ Φ Φ X » φ X ΦΦ Φ φ Φ φ « X Φ

ΧΦΦΧ Φ*Χ« Φ* X' Φ <Β ) Típus: amί sósav CD) Topológia: lineáris (ii> A voieknia típusa:: fehérje

Cxi> A szekvencia leírásai: 4. számé szekvencia

Al a 1

Gin Trp

Tv··: His 5

His

Leu Len Gin

Pro Ser Alá Glu Ty?:' Len Gly

lü

2 5

Ser

lie

Len

Oly

Val

Gin

Trp

Aia

Len

Asn

öle

Phe

Thr

Gin

Glu

20

2:5

30

A A £

Xle

Arg

Alá

aiy

Ser

Aia

Alá

Ser

Len

Ser

Ser

Len

Len

Asn

Arg

3 5

TÖ

45

Titíu

Asp

Pro

Val

Len

Arg Lys.

Thr

Aia

Asn

Len.

Gly

Ser

Trp

Gin

Lle

.50

SS

éo

a le

Ser

író

Val

Gin

Alá

Val

Gly

Tyr

Vai

Val

Val.

Val

Asp

Gin

Len

S5

”0

75

Sö

Len

Sex·

Val

Gin

Asn

Gin

lie

Tyr

Sin

Lys

Pro

Tér

He

Len

val

Alá

SS

50

95

apa

Ser

Val

Lys

Gly

Gl.u

Glu

Gin

Xle

Pro

Asp

Gly

Alá

Val

Al.a

Len

iáé

A OS

110

X le

Thr

Píré·

Asp

Pfet

Pro

Asp

Vai

Len

Ser

His

Val

Ser

Vai

Arg

Aia

11 s

120

125

Arc

Aee

Gly

Lys

Val

Cy:5

Phe

Aia

Thr

Cys

Phe

Asp

Ars/

Asn

Xle:

Leu

1SÖ

135

140

Alá

Asp

Leu

Gin

Aia

Ly·:··

Gin.

Giy Ara

AAO

Len

Len

Len

Lys

Arc

Thr

14 5

ISO

2 55

χ ε o

Pre

Ser

Asp

2 le

Xle

Tyr

Ser

Gin

Vai

Asn

G?t ’ .i

11 e

Gin

Len

Gin

Ser

115

a ?á

175

Se··:

Ser

Asn

Len

val

Gin

Aia

/Gin

Thr

Ser

Alá

Thr

Len Arg

Len

Val

ISO

IS: S

ISO

Gye

lys

Gin

Phe

Gly

Gly

Cys

Tyr

Alá

Lle

xSsít

Aia

Asp

Gin

Phe:

Thr

ms

Gfá:

2:05

Ser

Gin

est

val

öly

Aia

Lys

Ser

Arg

Asn

Xle

Aia.

2yr

Len

Lye

Gly

ere

215

3:20

ijV:.’:

Val

P rr o

Ser

Ser

Val

Gly

i J.S

Pro

Thr

Ser

Val

Aia

Len

Pro

Phe

ΧΦ

ΦΦ »»»♦ φφ ****

- Φ ' Φ * X Φ Φ χ ΦΧ ΦΦΦ

X φ X X Φ Φ

ΦΦΧ ΦΦ ΦΧ Χ*Φ

225 230· '235· 249

Giy Val

Phe

Gin

Lys 243

Var Len

Ser

Asp Asp He Asn Gin Gly Val Aia

230

255

Lys

Grn

Len.

Gin

Ile

Len

Thr

Lys

Lys

Len

Ser

Glu

Giy

Asp

Phe

Ser-

250

255

2 70

Am

Les

Gly

Glu

Tie

Thr

Thr

Vai

Len

Asp

Len

Ser

Thr

Pro

Ara

2 75

280

25 S

Gin

Le Ο-

Val

Lys

Gin

Len

Lys

Gin

Lys

Kefe.

Gin

Gly

Ser

Gly Mer

Pro

ΡΡΟ

2 SS

300

Tx-p

Pro

Gly

Asp

Gin

Giy

Pro

Lys

Arg

Hp

Glu

Gin

Alá

Trp

?4et;

Aia

3 ·5 5

310

315

323

He

Lys

Lyn

Val

Trp

Aia

Ser

Lys

Trp

Asn

Gin

Arg

Aia

T'/r

Phe

Ser

32 5

33 3

335

ite

Ara

Ays

Vai

Lys

Leu

Asp

Kis

Asp

Tyr

Len

Cys:

Met

Alá

Val

Len

343

345

350

Val

Gin

Gin

'He

11 e

Asn

Aia.

Asp

Tyr

Aia

Phe

Val

He

Kis

Thr

Thr

3 5,5

303

365

Asn.

Pro

Ser

Ser

Gly Asp

Asp

Ser

Glu

lie

Tyr

Aia

Gin

Val.

Val

Arg

310'

3 75

3 80

Oly

Geo

Gly

Gin

Thr

Leu

Val

Giy

Aia

Tyr

Pro

Giy

Arg

a r a

Len

Ser

38 3

333

3 SS

400

Phe

He

Gye

Lys

Lys

Lys

Asp

Len

Asn

Ser

Pro

g j. n

Val

Len

Gly

Tyr

405

410

415

Pro

S«r

Lys

Pro

He

Giy

Len

Phe

Tie

Lys

Arg

Ser

Tie

He

Phe

Arg

4Ώ0

425

430

Ser

Asp

Ser

Asn

Gly

Glu

Asp

Leu

Glu:

Giy

Tyr

A. . :4

Giy

.Aia

Gly

Leu

élt

443

445

Tyr

Asp

Sex;

Vai

Pro

ifet

A.sp

Glu

Gin

Glu

Lys

Vai

Val

Ile.

Asp

Tyr

450

4 55

46 3

Ser

Ser

Asp

Pro

Leu

lie

Thr

Asp

Gly

Asn

Phe

Arg

Gin

Thr

Tie

Len

46 5

473

4 75

480

Ser

Asn

lie

Ara

Arg

Aia

Gly

Kis

Alá

Ile

Gin

Glu

Len

Tyr

Giy

ser

485

430

495

Pro

Gin

Asp

He

Gin

Gly

Val

Val

Arg

Asp

Giy

Lys

He

Tyr

Vai

vai

SOS

505

510

Gin

Thr

Arg

Pro

Gin

Pfefc

φχ 99 X φ X· 9 9 9 X 9 9 X φ 9 V β> 9 9 ' X * .

9 9 9«*» 9

X 9 X * » *

ΧΧ9Χ 9.Χ9Χ ΧΦ X* ·♦♦

Claims (23)

1. 82ABADALM IGÉNYPONTOK jkleinsav molekula, amely egy olyan fehérjét kódok amely í z kötötten, valamint oldott formában van jelen, és amely mennyiségének csökkentése növény] sejtekben: csökkentett foszfáttartalmú keményítő szintéziséhez vezet, vagy amelynek E eoő-ban történő expressziója a I, és amely molekulát az sejten belöl szintetizált glikogén foszfonlezéséf alábbiak közöl vők (a) nukleínsav molekulák, amelyek olyan fehérjét kódolnak, amelynek aminosava 2. számú szekvencia Ina le:

   (bj nukiemsav molekulák, amelyek az i. számú nukleotió szekvencia ködeié régióját tartalmazzák;

   (c) nukleínsav molekulák, amelyek szekvenciája legalább 60 %-ban megegyezik az 1- sz. nukleotld: szekvencia kódoló régiójával; és em á, ahol az emlb insav molt elegendő ahhoz, hogy egy olyan fehérjét kódoljanak, amely a növényi sejtekben a kemény Itöszemcsékhez kötötten, valamint oldott tormában van jelen, és amely mennyiségének csökkentése a növényi sejtekben csökkentett foszfáttartalmu keményítő szintéziséhez vezet, vagy amelynek E co/Áhan történő expresszíöja a sejten beiül szintetizált glikogén foszfonlezéséf eredményezi.
2. 2. Az 1, igénypont (o) pontja szerinti nukleínsav molekula, amelynél a szekvencia-azonosság legalább 80 %-os.

   A 2, Igénypont szenet nukleínsav molekula, amelynél a szekvencia>h mint 90 %-os.

   10!
3. 4, Az 1-3, igénypontok bámtelyike szerinti nuklelnsav molekulát tartalmazó vektor.
4. 5, A 4, igénypont szerinti vektor, amelyben a nuklelnsav molekula az eukariota vagy proksriota sejtekben transzkripciót biztosító szabályozó elemekhez kötött.
5. 6.

   ke szerinti lemsav mo isított az 1-3. igén vagy 5. Igénypont s iyn
6. 7. Az. 1-3, igénypontok bármelyike szerinti nuklelnsav molekulával transzformáit és azt tartalmazó transzgenikus növényi sejt, amely nukieinsav molekula értelmes irányban a növényi sejtekben transzkripciót biztosító mekkel van kapcsolva.

   iyozo ele8. A 7. igénypont szerinti transzgenikus növény.

   növényi sejteket tartalmazó

   A 3, igénypont szerinti a 7. k mázzá.
7. 10, Eljárás a növényi sejtekben a keményitöszemosékhez kötötten, valamint oldott tonnában jelenlévő fehérje előállítására, amelynek során egy S, igénypont szerinti gazdasejtet a fehérje expressziöját megengedő körülmények között tenyésztünk, és amelynek során a fehérjét a sejtekből és/vagy a tenyésztöközegböl izoláljuk.
8. 11, Fehérje, amelyet az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukieinsav molekula kódol vagy amely a lö, igénypont szerinti eljárás szerint az 1-3. Igénypontok bármelyike szerinti nuklelnsav molekula expresszijével nyerhető.

   193
9. 12. Antitest, amely képes a 11, igénypont szerinti tehene specifikus felismerésére.
10. 13. DNS molekula,. amely az alábbiakat kódolja:

    (a) egy antiszensz RNS molekula, amely komplementer az 1-3. Igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula transzkriptjeívelt: vagy (b) egy ribozim aktivitású RNS molekula amely az 1~3. igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula transzkhptjeit specifikusan hasítja; vagy (c) egy RNS molekula, amely a növényi sejtekben történő expresszlójaker az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav mo'ekj’a expressziójának csökkenéséhez vezet a koszupressziős hatás következtében, és amely nagyfokú homológiáf mutat az említett nukleinsav molekula transzkriptjeível, feltéve, hogy a DNS molekula nem a gQctcaggggggttattotgctttacctag molekula (a patkány KnM gén nyolcas intronjának utolsó 30 nukleotidja) vagy a gceftgtgggaaéasftgt tagaottgggcaaa molekula (a humán TCR-gamma lánc átrendeződött V-régíója),
11. 14. A 13. Igény pont szerinti DNS molekulát tartalmazó vektor.
12. 15. A 14. igénypont szerinti vektor, amelynél a DNS molekula egy a növényi sejtekben való transzkripciót biztosító szabályozó DNS elemekkel kombinált.

    15, Gazdasejf, amely a 13, igénypont szerinti DNS molekulát vagy a 14, vagy 15, igénypont szerint) vektort tartalmazza,
13. 17. Transzgeníkus növényi sejt, amely az alábbiakat tartalmazza:

    (a) egy DNS molekula, amely egy olyan anflszensz RNS molekulát kódol, amely komplementer az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula

    103 transzkripijeiveí és amely gátolja az 1-3, Igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav sejtekben történő expresszíöját; vagy (b) egy DNS molekula, amely egy ribozim aktivitásá RNS molekulát kódot, amely az 1-3. Igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula transzkrlptjelt specifikusan hasítja; vagy (e) egy DNS molekula, amely egy olyan RNS molekulát kódol, amely a növényi sejtekben történő expressziójaksr az 1~3, igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav molekula expressziójának csökkenéséhez vezet a koszapressziés hatás következtében, és amely nagyfoké homológját mutat az említett nukleinsav molekula transzkriptielvel, a növényt sejtekben való transzkripciót biztosító szabályozó DNS elemekkel kombinálva,
14. 18. Transzgeníkus növény, ameiyet a 17, igenyoont szerinti növényi sejt regenerációjával állítunk elő, és amely a 17. Igénypont szerinti növényi sejteket tartalmazza.

    IS. RNS molekula, ameiyet a 13, igénypont szerinti DNS molekula transzkripciójával állítunk elő,
15. 20, A 18. Igénypont szerinti növények szaporítóanyaga, amely a 17. Igénypont szerinti növényi sejteket tartalmazza,
16. 21, A 18. igénypont: szerinti transzgeníkus növény, amely burgonyauövény,
17. 22, A 21, igénypont szerinti burgonyánövény gumója, amely a 17, igénypont szerinti növényi sejteket tartalmazza.

    104
18. 23. A. 22:. io· szerinő gumó, amely a vad típusú növények gumójához mutat.
19. 24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti burgonya gumó alkalmazása hasábburgonya vagy burgonyaszirom előállításéra.

    23. DNS molekula alkalmazása a 18. Igénypont szerinti transzgeníkus növény előállítására, amely DNS molekula egy olyan antiszensz RNS molekulát kódol amely komplementer az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula traoszkhptlelvel
20. 26, DNS molekula alkalmazása a 18. igénypont szerinti transzgemkos növény előállítására, amely DNS molekula: egy ribozim aktivitású RNS molekulát kódol amely az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNS molekula transzknötjeit specifikusan hasítja.
21. 27. DNS molekula alkaimazása a 18. Igénypont szerinti transzgeníkus növény ására, amely DNS molekula egy olyan RNS molekulát kódot, amely a növényi n történő expressziójakor az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti nukleínsav molekula expresszíőíának csökkenéséhez vezet a koszupresszíös hatéi , és amely n<

    őgíát mutat sz említett molekula
22. 28. Eljárás keményítő előállítására, amely keményítőt transzgeníkus növényi sejtekből vagy ilyen transzgeníkus növényi sejteket tartalmazó transzgeníkus növényekből izolálunk, amely franszgenikos növényi sejtek olyan nukleínsav molekulákkal: transzformáltak, amely nukleínsav molekulák olyan fehérjét kódolnak, amely a növényi sejtekben a keményítőszemcsékhez kötötten, valamint oldott formában van jelen, és amely mennyiségének csökkentése a növényi sejtekben csökkentett foszfátÍ05 tartalmú keményítő szintéziséhez vezet, vagy amelynek E coléban történő expressziqa a sejten beiül szintetizált glikogén foszforilezését eredményezi, és amely nukleinsav molekulát az alábbiak közül választjuk:

    (a) nukleinsav molekulák, amelyek olyan fehérjét kódolnak. amelynek aminosav» szekvenciáját a 2 , számú szekvencia írja le:

    (b) nukleinsav molekulák, amelyek az I. számé nukleotid szekvencia kódoló régióját tartalmazzák:

    (c) nukleinsav molekulák, amelyek az 1, sz, nukleotid szék olyas ö régiójával, amely nukleinsav molekulák bárját kódolnak, amely a növényi sejtekben a keményítoszemcsékhez kötötten, valamint oldott formában van jelen, és amelynek redukciója növényi sejtekben csökkentett foszíáttaftalmü keményítő szintéziséhez vezet, vagy amelynek E coEban történő ekpresszíéja a sejten balul szintetizált glikogén foszforilezését eredményezi és

    I) az (a) vagy említett fragmensek hossza e nak, amely a növénvl az of van jelen, és amely leinsav molekula ahhoz, hogy egy olyan a keményítőszemosékhez kötötten, valamint lese a növény i

    Imú keményítő szintéziséhez vezet, vagy amelynek E co/éban történő expressziója a sejten beiül szintetizált glikogén ahol az említett nukleinsav-mo; tó szabályozó DNS elemekhez való transzkripciót biztosi >9. A 28. igénypont szerinti eljárás a transzgenikus növényi sej kukorica», rizs- vagy buzanövény-sejtek.

    ;06

    Eljárás előállítására.

    ate (A) az említett növényi sejtekben egy m a b névéit tartalmazó transzgenikus nc<~

    I sejtek azzal jellemezhetők, hogy expresszije gátolt, amely fehérje a ötötten, valamint oldott formában van jelen és amely mennyiségének csökkentése a növényi sejtekben csökkentett íöszfáttartaímü keményítő szintéziséhez vezet, vagy amelynek E, ooá~ban történő expresszlöja a sejten bel öt szintetizált glikogén foszferilezéséf eredményezi, és amely fehérjét egy az alábbiak közé tartozó nukleinsav molekula kódot:

    fa) nukleinsav molekulák, amelyek olyan fehérjét kódolnak, amelynek aminosav-szekveneiáját a 2. számé szekvencia írja le:

    (b) nukleinsav molekulák, amelyek az 1, számú nukleotíd szekvencia kódold rég fej nukleinsav %-ban meg, amely nukleegyezlk az 1, sz. nukleotk ínsav molekulák olyan fehérjét kódéinak, amely a növényi sejtekben a keményltöszemcsékhez kötötten, valamint oldott formában van jelen, és aroe^: na növényi sejtekben csökkentett tOszfattartalmu vezet, vagy amelynek E coléban történő 'lója a sejten belül szintetizált glikogén foszíörtíezésél eredméés ahol a transzgenikus növényi sejtek azzal jellemezhetők, hogy (8) fi) egy expresszálodo DNS molekulát tartalmaznak, amely egy olyan antiszensz RNS molekulát kódol, amely gátolja az fa>(o) pontok szerinti nukleinsav sejtekben történő expresszióját; vagy fii) egy olyan expresszálódö DNS molekulát tartalmaznak, amely egy nbozimot kódol, amely az (a)-(c) pontok szerinti nukleinsav molekula

    107 } egy olyan expresszálódö DNS molekulát tartalmaznak amely egy olyan RNS molekulát kódot, amely a növényi sejtekben történő expresszié» jakor az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti nukieinsav molekula expresszlójának csökkenéséhez vezet a koszupressziós hatás következtében, és amely nagyfokú homológláf mutat az említett nukieinsav molekula transzkrictlelve!.
23. 31. A 30, igénypont szerinti eljárás, kukorica-, rizs- vagy bözanövény-sajtek.