FI78304B - Nytt foerfarande foer framstaellning av klebsiella pneumonia extraherade immunsystemet stimulerande acylglykoproteiner. - Google Patents

Description

χ 78304

Uusi menetelmä Klebsiella pneumoniaestä uutettujen immuunisysteemiä stimuloivien asyyliglvkoproteiinien valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee uutta menetelmää Klebsiella pneumoniaestä uutettujen immuunisysteemiä stimuloivien asyyliglykoproteiinien valmistamiseksi.

FR-patenttijulkaisussa n:o 2 490 496 sekä eurooppalaisessa patenttijulkaisussa n:o 0 049 182 kuvataan 10 etenkin Klebsiella pneumoniaestä uutettuja, immunisystee-miä stimuloivia uusia glykoproteiineja, joille on tunnusomaista, että ne sisältävät 30-40 % proteiineja, 30-40 % neutraalisokereita, enintään 4 % glukoronihap-poa, 2-5 % aminosokereita ja niiden molekyylipaino on 15 noin 350 000 daltonia. Niissä kuvataan aivan erityisesti edellä kuvattuja proteiineja, joille on tunnusomaista, että proteiinifraktio koostuu noin 30 %:sti happamista aminohapoista ja että polysakkaridifraktio sisältää keskimäärin yhden glukoosimolekvylin 4 galaktoosimolekyy-20 liä kohti ja koostuu olennaisesti toistuvista polysakka- ridiyksiköistä, joilla on seuraavanlainen rakenne: Γ o 13 14 1 -[t^galactose ) —— galactose - glucose jossa m on yhtä kuin kokonaisluku 3,4 tai 5. Näissä 25 patenttijulkaisuissa kuvataan myös menetelmää näiden -_ glykoproteiinien valmistamiseksi, jolle on tunnusomais ta, että saatua glykoproteiiniliuosta käsitellään kvaternäärisellä ammoniumyhdisteellä, ultrasuodatetaan Klebsiella pneumoniae-viljelmien lysaateista saatu uute, 30 erotetaan vastaava supernatantti poistamalla saatu sakka, käsitellään glykoproteiinien suolaliuosta vastaavaa su-pernatanttia pienimolekyylisellä alkanolilla kylmässä, näin saadaan uusia sakka, joka liuotetaan veteen, dialy-soidaan, lyofilisoidaan, liuotetaan, geelisuodatetaan, 35 otetaan talteen ensimmäinen eluoitu fraktio, konsentroi- 2 78304 daan ja haluttaessa kuivataan.

Nämä patenttijulkaisut kuvaavat myös mainittujen glykoproteiinien immuunisysteemiä stimuloivaa vaikutusta ja niiden terapeuttista käyttöä erityisesti farmaseut-5 tisten valmisteiden muodossa.

Tutkimukset, jotka on suoritettu näiden patenttien rekisteröinnin jälkeen, ovat tehneet mahdolliseksi näiden glykoproteiinien rakenteen selvittelyn. On kyse nimenomaan glykoproteiineista, mutta vielä tarkemmin asyy-10 liglykoproteiineista, joiden polvsakkaridiketju on sitou tunut proteiiniketjun asparagiinitähteeseen kohdasta, joka on muodostunut heptoosista ja 2-keto-3-deoksiokty-losonaatista, jota seuraa asyloitu osa, joka on muodostunut ^-hydroksimyristiinihaposta, sitten N-asetyyli-15 glukosamiinista. Näiden tutkimusten avulla on myös ol lut mahdollista todistaa mainittujen glykoproteiinien antiallerginen vaikutus.

Menetelmässä esitetyistä tutkimuksista ilmenee myös, että oli mahdollista paremmin ottaa huomioon ne 20 taloudelliset vaatimukset, jotka liittyvät teollisen me netelmän toteuttamiseen, jolloin konsentroidaan saadun sakan poistamisen jälkeen talteen otettu supernatantti käyttämällä kvaternääristä ammoniumsuolaa. Tämä konsent-rointi suoritetaan edullisesti käyttämällä molekyylien 25 erottamiseen laitteita, joissa on selektiivisesti läpäi sevä kalvo, kuten ultrasuodatuslaitteita. Itse asiassa näiden laitteiden avulla on mahdollista toisaalta käsitellä pienempiä tilavuuksia menetelmän myöhemmissä vaiheissa ja toisaalta yllättävällä tavalla päästä aikai-30 semmassa menetelmässä lopuksi olleista dialyysi- ja gee- lisuodatusvaiheista.

Näin siis tämän keksinnön kohteena on uusi menetelmä sellaisten glykoproteiinien valmistamiseksi, jotka *: on kuvattu FR-patentissa n:o 2 490 496, sekä EP-patentis- 35 sa n:o 0 049 182.

3 78304

Keksinnön kohteena on tarkemmin sanottuna menetelmä glykoproteiinien valmistamiseksi valmistamalla puhdistettu glykoproteiiniliuos ultrasuodattamalla Klebsiella penu-moniae-viljelmien lysaattiuute, käsittelemällä saatua 5 liuosta käsitellään kvaternäärisellä ammoniumhalogenidil-la ja erottamalla supernatantti poistamalla näin saatu saostuma, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että supernatantti konsentroidaan käyttämällä ainakin yhtä ultra-suodatinta molekyylien erottamiseen, konsentraattia käsi-10 tellään kylmässä ainakin yhdellä alemmalla alkanolilla, ja että näin saatu saostuma erotetaan ja tarvittaessa pestään ainakin yhdellä alemmalla alkanolilla ja kuivataan.

Tämä uusi menetelmä on hämmästyttävästi parempi kuin aikaisempi tapa, koska sen avulla päästään erityisesti 15 kahdesta pitkästä ja kalliista vaiheesta sekä voidaan vähentää käsiteltäviä alkanoli tilavuuksia.

Konsentrointi voidaan suorittaa tavanomaisilla mole-kyylierotusmenetelmillä, erityisesti käyttämällä läpäisevyydeltään selektiivisiä kalvoja, etenkin ultrasuodattimia. 20 Selektiivisesti läpäiseviä kalvoja voi olla luon teeltaan erilaisia. Ne voivat olla selluloosa-asetaattia kuten kaivotyypit HF-U (Dow chemicals), HF-U (Kalle Chemie), SEPA-CA (Osmonics) tai SM (Sartorius). Ne voivat olla polyelektrolyyttipohjäisiä, kuten kaivotyypit UM 25 (Amicon) tai IRIS 3042 (Rhone-Poluenc) . Ne voivat olla myös polysufonipohjaisia kuten kaivotyypit H10P (Amicon ja Romicon), SEPÄ PS (Osmonics) tai IRIS 3022 (Rhone-Poulenc). Ne voivat olla myös polyamidipohjäisiä kuten kaivotyypit BM tai BHF (Berghof), pohjaltaan aromaattisia 30 polymeerejä kuten kaivotyypit PM, MX tai HF (Amicon tai Romicon), pohjaltaan vinyylikloridi- ja akrylonitriiliko-polymeerejä, substituoituja polyolefiinejä tai vielä sekamuotoja, pohjaltaan polysulfoneja polyetyleenikantajän pinnalla kuten kaivotyypit PT (Millipore) .

35 Nämä kalvot voivat olla tasoina, putkina tai vielä *. ; onttoina kuituina tai spiraaleina.

4 78304

Jotta saataisiin haluttuja asyyliglykoproteiineja puhtaana, käytetään mieluiten ultrasuodattimia, joiden suodatuskynnys on kalibroitu molekyylipainoille, jotka voivat olla 5000:sta 100 000 daltoniin.

5 Menetelmän parhaissa toteuttamisolosuhteissa käy tetään ultrasuodattimia etenkin polysulfonipohjäisinä, onttoina kuituina, joiden suodatuskynnys on 5000 daltonia.

Käytetään siis edullisesti kalvotyyppejä H10P, joita valmistavat yhtiöt Amicon ja Romicon.

10 Konsentrointi suoritetaan edullisesti suunnilleen huoneen lämpötilassa, esimerkiksi 20-30°C:ssa. Se voidaan suorittaa käytettävien kalvojen valmistajan suosittelemalla tekniikalla. On mahdollista käyttää yhtä ainoata kalvoa tai useita eri kalvoja, ja konsentrointi voidaan 15 suorittaa kerran tai useammin jatkuvasti tai keskeyttäen.

Kun käytetään onttoja kuituja, konsentrointi suoritetaan mieluiten kahdella käsittelykerralla käyttämällä "wash in"-tekniikkaa, jolloin suodatuskammiosta poistuva neste korvataan pienillä molekyyleillä ja liuottamalla 20 lisäämällä liuotinta (vettä tämän keksinnön tapauksessa) suodatuskammioon.

Suotava konsentrointi on noin 5-kertainen lähtö-; liuokseen verrattuna.

.: Saatua liuosta käsitellään sitten kylmässä noin 25 4°C:ssa pienimolekulaarisella alkanolilla kuten metanolil- ;· la, etanolilla, n-propanolilla tai isopropanolilla.

Mieluiten käytetään etanolia.

Mielenkiintoisimmat tulokset on saatu käyttämällä viittä tilavuutta etanolia yhtä tilavuutta suolaliuosta 30 kohti seisottamalla yli yön +4°C:een lämpötilassa.

Sakkojen eristämiseen käytetään sitten useita tekniikoita, kuten esimerkiksi dekantointia, jonka jälkeen suodatusta, pelkkää suodatusta tai sentrifugointia.

Sakka voidaan sitten edullisesti kuivata esimer- 35 kiksi normaalipaineessa, mutta mieluiten alennetussa pai- % neessa dehydratoivan aineen kanssa tai ilman sitä. Dehydra- 5 78304 toivana aineena voidaan käyttää esimerkiksi kaliumhydrok-sidia, fosforihappoanhydridiä tai mieluiten kalsiumklo-ridia. Kuivausta voidaan edistää lämmittämällä, mieluiten alle 40°C:een lämpötilassa. Jos halutaan, sakka voi-5 daan homogenisoida tässä vaiheessa esimerkiksi mekaani sesti jauhamalla.

Sakka voidaan myös liuottaa veteen ja haihduttaa kuiviin esimerkiksi surmattamalla tai lyofilisoimalla.

Lyofilisointi suoritetaan sitten klassisella taval-10 la, esimerkiksi keskikokoisella jäädytys- ja härmistys- koneen yhdistelmällä kuten yhtiön Usifroid markkinoimalla malleilla SMU tai SMRG, suurikokoisilla lyofilisaat-toreilla kuten esimerkiksi laitteella, joka muodostuu jäädyttäjästä CAI ja härmistäjästä SMIRS, joita kumpaakin 15 markkinoi Usifroid.

Pienempiä laboratorioina lie ja voidaan myös käyttää sekä muiden yhtiöiden markkinoimia laitteita kuten Serail-yhtiön.

Tämän keksinnön kohteena olevan menetelmän lähtö-20 aineita voidaan valmistaa kuten FR-patentissa n:o 2 171 907 eli esimerkiksi viljelemällä bekteereita (Klebsiella pneumoniae CIP 52145), jotka ovat samoja kuin hakijan 29 kesäkuuta 1981 Pariisin Pasteur-Instituutissa tallettama kanta 1-163, hajottamalla bakteerit, kuivaa- 25 maila (esimerkiksi lyofilisoimalla), uuttamalla lipidi- liuottimilla, poistamalla proteiinit fysikaalisesti (esimerkiksi sentrifugoimalla), sitten ultrasuodattamalla ja kuivaamalla, esimerkiksi lyofilisoimalla.

Kun nämä glykoproteiinit on muovattu sopivan täy-30 teaineen avulla, niillä on, kuten on kuvattu FR-paten- :·. tissa n:o 2 490 496 sekä eurooppalaisessa patentissa n:o 0 049 182 sekä FR-patentissa n:o 2 171 907, huomattavia antiallergisia ominaisuuksia.

Glykoproteiineja, joita on kuvattu ja patentoitu 35 FR-patentissa n:o 2 490 496 sekä eurooppalaisessa paten- 6 78304 tissa n:o 0 049 182 sekä kuvattu patentissa n:o 2 171 907, voidaan siis käyttää farmaseuttisten valmisteiden valmistamiseen, jotka on tarkoitettu allergisten tautien hoitoon.

5 Nämä farmaseuttiset valmisteet voivat olla esim.

kiinteinä tai liuoksina ja ihmislääketieteessä yleisesti käytetyissä farmaseuttisissa muodoissa, joita käytetään allergisten sairauksien hoidossa, kuten esim. päällystämättöminä tai päällystettyinä tabletteina, kapseleina, 10 siirappeina, aerosoleina, suppositoreina, injektoitavina valmisteina, salvoina, voiteina; niitä voidaan valmistaa tavanomaisilla menetelmillä. Vaikuttava(t) aine(et) voi(vat) olla niissä sekoitettuina farmaseuttisissa valmisteissa tavallisesti käytettäviin täyteaineisiin kuten 15 talkkiin, arabikumiin, laktoosiin, tärkkelykseen, magne- siumstearaattiin, kaakaovoihin, vedettömiin tai vesipitoisiin kantajiin, kasvi- tai eläinrasvoihin, parafiinijohdannaisiin, glykoleihin, erilaisiin vaahdottajiin, dis-persantteihin tai emulgaattoreihin, säilöntäaineisiin, 20 väriaineisiin, makuaineisiin.

Valmisteita käytetään erityisesti hengitystiealler-gioiden hoitoon kuten allergiseen nuhaan, henkitorven tai kurkunpään tulehduksiin, ihonalaisiin allergioihin kuten ihottumaan tai nokkosrokkoon, silmäallergioihin tai eri 25 syistä puhjenneisiin allergioihin: esimerkiksi eläinten pistoihin tai ruoka-aineallergioihin.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1

Liuotetaan veteen 4°C:ssa 16 tunnin aikana kon-30 sentraatiossa 10 g/1 1 kg samaa yhdistettä, jota on valmis tettu FR-patentin n:o 2 171 907 esimerkissä 1, jota on saatu käyttämällä lähtöaineena Klebsiella pneumoniae 52145 tai I 163 kantaa Pasteur-Instituutin kokoelmista. Lisätään 0,8 tilavuutta 3 % setyylitrimetyyliammoniumbro-35 midiliuosta noin 1 litra/min. ja sekoitetaan kohtalaisesti tunnin ajan. Muodostunut sakka poistetaan sentrifugoi- 7 78304 maila jatkuvasti virtausnopeudella noin 5 litraa/min 62 000 g:ssä.

Supernatantti konsentroidaan ultrasuodattamalla onttojen kuitujen läpi, joiden retentiokynnys on 5000 5 (Hollow fiber H10P5, jota myyvät Amicon ja Romicon) kahdella käsittelykierroksella suhteissa 5/1. Nopeuden ollessa 3 litraa minuutissa lisätään 6 tilavuutta 96 % etanolia ja sekoitetaan kohtalaisesti 15 minuuttia. Annetaan laskeutua, sentrifugoidaan ja huuhdellaan sakka, 10 kuivataan alle 40°C:een lämpötilassa vettä poistavan ai neen läsnäollessa, homogenisoidaan jauhamalla mekaanisesti, jolloin saadaan 200 g haluttua yhdistettä, jolla on sen yhdisteen ominaisuudet, jota on kuvattu FR-paten-tissa n:o 2 490 496 sekä eurooppalaisessa patentissa 15 n:o 0 049 182.

Esimerkki 2

Valmistettiin tabletteja, joiden koostumus on: Esimerkin 1 yhdistettä 1 mg Täyteainetta ad 100 mg 20 (Täyteaine tarkemmin: laktoosi, tärkkelys, talkki, magnesiumstearaatti).

Esimerkki 3

Valmistettiin aerosoleja, joista tuleva annos sisältää: 25 Esimerkin 1 yhdistettä 0,5 mg

Emulgaattoria 0,15 mg

Ponneainetta 50 mg

Esimerkki 4

Valmistettiin rasvaa, jolla on seuraava koostumus: 30 Esimerkin 1 yhdistettä 1 mg Täyteainetta: 2-oktyylidodekanolia, ketostearyylialko-holia, natriumketostearyylisulfaattia, metyyli- ja pro-pyyliparahydroksibentsoaattia, puhdistettua vettä 10 g.

β 78304

Esimerkki 5

Valmistettiin tabletteja, joiden koostumus on: FR-patentin n:o 2 171 907 esimerkin 1 mukaista yhdistettä 1 mg 5 Täyteainetta ad 100 mg (Täyteaine tarkemmin: laktoosi, tärkkelys, talkki, magnesiums tearaatti).

Antiallerginen vaikutus

Allergiset ihmiset syntetisoivat vasta-aineita 10 (Immunoglobuliini E:tä tai IgE:tä) sille allergeenille, jolle ovat herkistyneet. Nämä vasta-aineet pystyvät sitoutumaan tämän ihmisen polynukleaaristen (tai granu-losyyttien) basofiilien pinnalle ja aikaansaavat polynukleaaristen solujen kalvossa muutoksen, joka aiheuttaa 15 niiden degranuloitumisen.

Koe:

Tekniikka on peräisin Benvensisteltä Chim. Allergystä, 1981, 11, s. 1-11. Valmistetaan dekantoimal-la plasmaa, jossa on paljon polynukleaarisia basofiilejä 20 sellaisesta henkilöstä, joka on herkistynyt tietylle allergeenille, ottamalla yksi osa verta ja 9 osaa väriainetta (May-Griinwald-Giemsa) . Kontrollisuspension ja suspension, johon on lisätty tutkittavaa ainetta, annetaan reagoida saman allergeenin kanssa. Määritetään sitten 25 degranulaatioprosentti:

Kontrollisuspension basofiilien Käsitellyn suspen-% _ lukumäärä _ sio.i basofiilien _lukumäärä_'

Kontrollisuspension basofiilien lukumäärä

Antiallerginen aine vähentää polynukleaaristen 30 basofiilien degranulaatioprosenttia.

Tulokset: 1) Allergeeni: kissankarvat

Konsentraatiolla 100 ^ug esimerkin 1 yhdistettä 1 ml:ssa ei havaita degranulaatiota käsitellyssä suspen- 35 siossa, kun taas kontrollisuspensiossa havaitaan 61 % degranulaatio.

9 78304 2) Allergeeni: hyttynen kokonaisena Konsentraatiolla 2 ^ug esimerkin 1 yhdistettä tai esimerkin 1 lähtöainetta 1 ml:ssa ei käsitellyssä suspensiossa havaita degranulaatiota, kun taas kontrol-5 lisuspensiossa havaitaan 60 % degranulaatio.

Claims (6)

10 78304

1. Menetelmä glykoproteiinien valmistamiseksi valmistamalla puhdistettu glykoproteiiniliuos ultrasuodatta- 5 maila Klebsiella pneuomiae-viljelmien lysaattiuute, käsittelemällä saatua liuosta kvaternäärisellä ammoniumhaloge-nidillä ja erottamalla supernatantti sentrifugoimalla näin saatu saostuma, tunnettu siitä, että supernatantti konsentroidaan käyttämällä ainakin yhtä ultrasuodatinta 10 molekyylien erottamiseen, konsentraattia käsitellään kylmässä ainakin yhdellä alemmalla alkanolilla, ja että näin saatu saostuma erotetaan, tarvittaessa pestään ainakin yhdellä alemmalla alkanolilla ja kuivataan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -15 n e t t u siitä, että ultrasuodattimeen kuuluu yksi tai useampia läpäisevyydeltään selektiivisiä kalvoja.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään useampia ultrasuo-dattimia.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n - n e t t u siitä, että ultrasuodattimilla on suodatuskyn-nys, joka on kalibroitu molekyylipainoille 5000-100 000 daltonia.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että ultrasuodattimet ovat onttojen kuitujen muodossa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ultrasuodattimet ovat polysulfoni-pohjäisiä ja ne on kalibroitu 5000 daltonille. li