FI60104C - Saett att ur en blandning erhaollen vid spaltning av hemoglobinet i de roeda blodkropparna separera s k jaernkomponent fraon proteinet - Google Patents

Description

«35^*1 Γα 1 KUULUTUSJULKAISU Λ . Λ .

LJ (11) UTLÄGCNINGSSKRIFT 601 04 C W i-aLcnri^delat^7 " ^ ^ ^ " (S1) Kv.ik.3/int.a.3 A 23 J 1/06 SUOMI—FIN LAND <*) Pwanttihakamu· PMMttmBknlng 753503 (22) Hak*ml*pthrl — Arwttknlnpdag 12.12.75 ' ' (23) Alkupllvt—GHtighttsdag 12.12.75 (41) Tullut JullclMksl — BIMt offwitllg 12 06 77 Μπω. i. r.U.ttHh.llltM. NBMMkripMM „ k.K|.IU«.

FAtMlt· OCn regist*rstyr«lMn AntOkin utlagd och utl.*krtft*n publtorad 31.08.8l (32)(33)(31) «uelkeu·—Bogird prtorttoc 11.12.75

Ruotsi-Sverige(SE) 7513987_3 (71)(72) Paul Göran Sigvard Lindroos, Eriksgatan 37 > 20100 Abo 10,

Suomi-Finland(FI) (7*0 Oy Kolster Ab . (5U) Sätt att ur en blandning erhällen vid spaltning av hemoglobi-net i de röda blodkropparna separera s.k. järnkomponent frän proteinet - Menetelmä nk. rautakomponentin ja proteiinin erottamiseksi punaisten verisolujen hemoglobiinia lohkaisemalla saadusta seoksesta Föreliggande uppfinning avser ett sätt att ur en blandning innehallande järnföreningar, kallade järnkomponent, och blodprotein, främst globin, och erhallen vid spaltning av hemoglobinet i de röda blodkropparna, separera järnkomponenten frän proteinet, varvid blandningen tillsättes dehydratiserings-medel, lämpligen etanol, i en sadan mängd, att den totala halten av dehydratiseringsmedel i vätskan uppgär tili ätminstone 40 volym-%, företrädesvis ätminstone 70 volym-%, räknat pä den totala vätskemängden, och blandningens pH inställes pä ett värde lägre än 4,5, företrädesvis pä ett värde av frän 2,5 tili 4,5, varvid uppkommer en fällning av järnkomponent.

60104

Utgängsämnet erhälles ur slaktblod sora separeras genom en enkel centrifugering i sinä tvä vätskefaser, plasma och röd blodkroppsgröt, den senare även kallad spillblod. Spillblodet halier ca 70 % av blodets totala proteininnehäll. Huvuddelen av detta protein föreligger i form av hemoglobin som sammansättes av en proteindel, globin, och en järnförening, ferroprotoporfyrin. Denna järnförening ger blodet dess speciella smak och färg, röd i vätskeform och svart i pulverform.

En lösning av globin är färglös till svagt gulfärgad, globin i pulverform är vitt till ljusgult.

Da ferroprotoporfyrin spaltas av frän hemoglobin övergär järnet ofta i ferriform, kloriden av denna järnförening kallas hemin och har en intensiv svart färg.

Blodprotein, främst globin, som befriats pa denna järnförening och därmed pä härav kommande smak och färg, finner användning i livsmedelsindustrin pä grund av sitt näringsvärde och, om de funktionella egenskaperna bevarats, även som textureringsmedel.

Järnföreningen, som uppbyggs av fyra pyrrolringar runt järnatomen och i vilken järnet är i sä kallad hembunden form finner användning som järnberikningsmedel i livsmedels- och läkemelsindustrin.

I den finska ansökan 75 1643 har beskrivits ett förfarande för separering av järnkomponenten och globinet. Det kända förfa-raftdet gär ut pä att separera globinet frän järnkomponenten, som härstammar frän järnprotoporfyrinet (hemoglobinet). Den kända separationen sker i tvä steg. Först avfiltreras en del av järn-komponenten, och därefter utfälles globinet sä, att kvarvarande järnkomponent hälles i lösning i finfördelad form. Silunda är järnkomponenten svär att tillvarataga.

Det nya förfarandet gär ut pä att bilda agglomerat av järnkomponenten av sädan natur, att de pä ett enkelt sätt läter sig avskiljas tämligen kvantitativt. Enligt det nya förfarandet uppnäs en adsorption av finfördelade partiklar av järnkomponenten pä blodsubstans, huvudsakligen troligen blodprotein i fast form, varvid lätt avseparerbara agglomerat uppstär, varigenont järrikomponenten kan 3 60104 tillvaratagas tämligen kvantitativet. Det är viktigt ur ekonomisk synpunkt att utbytet av järnkomponenten är högt.

Kännetecknande för det nya förfarandet är, att en agglomerering av fällningen ästadkommes pä följande sätt: pH-värdet i blandningen höjes tili högst 4, 5, en vid spaltningen av blodkropparna erhällen cellmembranfragmentmassa tillsättes , eller etanol tili en total halt av dehydratiserande medel av högst 90 volym-% tillsättes och eventuellt samtidigt temperaturen sänkes, varefter agglomereringen eventuellt ytter-ligare accentueras genom tillsats av oorganiska eller organiska salter, säsom natrium- eller kaliumsalter, t.ex. natriumklorid, t.ex. i form av vattenlösningar, och därefter avskiljes agglomeraten av järnkomponenten, och det i löst form kvarvarande globinet till-varatages pä i och för sig känt sätt.

De bildade järnkomponentagglomeraten är stabila och hällfasta, och kan centrifugeras och filtreras i teknisk skala, utan att de bryts sönder i smä partiklar som ej läter sig avskiljas.

Da blodprotein, varmed avses även cellmembranfragmenten, lägger sig runt järnkomponenten, erhälles dessutom ett skydd mot oxidation (oxidationen leder tili en inaktivering av järnkomponenten, och är alltsä icke önskvärd). Järnkomponenten, som troligen tili största delen bestär av hemin, är avsedd att användas säsom läkemedel mot järnbrist, och den är i framställningsskedet kärislig_ för oxidation.

Hittills har det inte funnits nägot förfarande att pä ett ur teknisk och ekonomisk synpunkt realiserbart sätt avskilja järnprotoporfyrinet ur hemoglobin sä, att hemin och globin erhälles i en kvalitet, som är användbar för läke- och livsmedelsändamäl.

Med det nya förfarandet kan man avskilja järnkomponenten tämligen kvantitativt, med upp tili 99 % utbyte, och man erhäller dä en ovanvätska, som är nästan färglös och som innehäller en järnmängd lägre än 1 % av i hemoglobinet förefintligt järn.

Det väsentligaste för förfarandet enligt uppfinningen är sälunda bildandet av ett stabilt och lätt avseparerbart agglomerat: av fällningen, vilket ästadkommes genom att a) blandningens pH höjes tili högst 4,5, eller 60104 b) blandningen tillsättes. vid spjälkning av blodceller erhällen cellmembranfragmentmassa , eller c) etanol tillsättes, tills dehydratiseringsmedlets totala halt uppgär till högst 90 volym-%, varvid möjligen sara-tidigt temperaturen sänkes.

Den angivna höjningen av blandningens pH till högst 4,5 kommer självfallet i fraga främst i de fall utgängs-blandningens pH är lägt, dvs. 2,5-3,5. I fall att pH redan frän början är 4,5, ästadkommes agglomereringen genom att tillsätta cellmembranfragmentmassa·eller etanol.

Vid förfarandet enligt uppfinningen är det lämpligt att före etanoltillsatsen och pH-sänkningen nedkyla blandningen tili en temperatur av mellan 0 och -20°C. Härigenom bevaras proteinets funktionella egenskaper utöver dess näringsvärde.

Vid förfarandet kan mindre delar av etanolen ersättas med metanol, propanol, isopropanol, butanol, etylenglykol, glycerin, etylacetat eller aceton, varvid samma effekt erhälles.

Vid lägre pH fas en mera fullständig uppspaltning av hemoglobin och agglomerering av järnföreningar men samtidigt en förstöring av de funktionella egenskaperna hos proteinet och troligen en ökad polymerisering av järnföreningarna. Vid högre pH avtar dessa företeelser medan utfällningen av protein till-sammans med järnagglomeraten ökar.

Reaktionsblandningen sora fas under de i patentkraven angivna betingelserna är svart till brunsvart. Vid centrifugering av blandningen vid 10 000 x g fas en intensivt svart pasta innehallande huvuddelen av blandningens järnföreningar. Ovanvätskan är ljusgul till ljusbrun och halier huvuddelen av blandningens protein. Färgen pä ovanvätskan är en indikering pä i hur hög grad protein och järnförening har separerats fran varandra.

Proteinet kan tillvaratagas ur lösningen pä konventionellt sätt, som genom utfällning, adsorption pä voluminöst eller fast material, indunstning av lösningen, torkning, koncentrering av lösningen genom ultrafiltering och koncentrering av lösningen genom frysning. Det sälunda erhällna proteinet är lämpligt beträffande järnhalt, färg och smak för mänga livsmedelsändamal.

5 60104

Uppfinningen skall i det .följande belysas medelst nägra utföringsexempel.

Exempel 1 Röd blodkroppsgröt frän slaktblod med Na-citrat som antikoaguleringsmedel behandlades med etanol och vatten sa att cellmembranen sprängdes. Cellmembranfragmenten centrifugerades av. Den sälunda erhällna hemoglobinlösningen höll 15 % torr-subbstans, huvudsakligen hemoglobin, 33 volymprocent etanol och resten vatten, pH-värdet var 5,3 och färgen mörkröd. 6 ml 96— volymprocentig etanol droppades under omrörning och kylning i en bägare med 3g hemoglobinlösning,

Temperaturen var -10°C. I denna hemoglobinsuspension droppades under omrörning och kylning 0,4 ml 1 M saltsyra i 3 ml 96 volymprocentig etanol. Efter tillsatsen var temperaturen -10°C och pH-värdet 3,4. Etanolhalten i blandningen uppgick till 77 volymprocent .

Den brunsvarta blandningen centrifugerades vid 20 000 x g i 10 min, varvid erhölls en svart pasta med en mängd torr-substans av 0,08 g och en ljusbrun ovanvätska.

0,19 ml 0,5 M natriumhydroxid i 10 ml 96 volymprocentig etanol droppades under kylning och omrörning i ovanvätskan. Efter tillsatsen var temperaturen -10°C och pH-värdet 4,35. Etanolhalten i blandningen uppgick till 85 volymprocent.

Den bildade fällningen, en fraktion av blodprotein med adsorberade järnföreningar, avcentrifugerades och gav en svart och röd pasta med en torrsubstansmängd av 0,08 g.

Ur den ytterst svagt gulfärgade ovanvätskan fälldes efter vattentillsats tili vattenhalt 50 % och pH-förhöjning tili 7,5 under kylning en ljusgrä fällning, som efter avcentrifugering och torkning gav 0,22 g torrsubstans.

Exempel 2 3 g hemoglobinlösning (med data som i exempel 1) med en temperatur av -8°C droppades under omrörning och kylning i en bägare med en lösning av 0,45 ml 1 M saltsyra och 10 ml 96 volymprocentig etanol med en temperatur av -8°C. Efter tillsatsen var temperaturen -8°C och pH-värdet 3,3. Etanolhalten i blandningen uppgick tili 78 volymprocent.

60104

Den brunsvarta blandningen centrifugerades vid 10 000 x g i 10 min, varvid erhölls en svart pasta med en torrsubstans-mängd av 0,06 g och en ljusbrun ovanvätska.

1 ml av en suspension med 0,1 g röd blodkroppsgröt i lika delar etanol och vatien med en temperatur av -8°C och pH

5,3 droppades under omrörning och kylning i ovanvätskan. Efter tillsatsen var temperaturen -8°C och etanolhalten uppgick tili 75 volymprocent.

Blandningen centrifugerades vid 10 000 x g i 10 min, varvid erhölls en mindre mängd svart pasta och en 1jusbrun-1jusgul ovanvätska. Ur ovan-vätskan fälldes pä samma sätt sotii i exempel 1 en ljusgrä fällning som efter avcentrifugering och torkning gav 0,25 g torrsubstans.

Exempel 3 3 g hemoglobinlösning (med data som i exempel 1) med en temperatur av -12°C droppades under omrörning och kylning i en bägare med en lösning av 0,35 ml 2 M saltsyra och 5 ml absolut etanol med en temperatur av -12°C. Efter tillsatsen var temperaturen -12°C och pH-värdet 2,9. Etanolhalten i blandningen uppgick tili 71 volymprocent. Den brunsvarta blandningen centrifugerades vid 27 000 x g i 10 min vid -12°C, varvid erhölls en svart pasta«ed en mängd torrsubstans av 0,07 g och en ljusgul ovanvätska.

15 ml 96 volymprocentig etanol med en temperatur av -18°C droppades i ovanvätskan under omrörning och kylning. Efter tillsatsen var temperaturen -18°C. Etanolhalten i blandningen uppgick tili 86 volymprocent.

Efter 10 timmar vid -18°C centrifugerades blandningen enligt ovan, varvid erhölls en svart och röd pasta med en mängd torrsubstans av 0,08 g.

Den ytterst svagt ljusgult färgade ovanvätskan delades i tvä lika delar.

Ur den ena delen fälldes pä samma sätt som i exempel 1 en ljusgrä - vit fällning som efter avcentrifugering och torkning gav 0,11 g torrsubstans.

Den andra delen ultrafiltrerades i en Amicon Diaflo-cell med membran PM 10 vid -8°C. Konoontratet försattes med 10 ml vatten 7 60104 av 0°C och filtrerades. Den salunda avetanoliserade protein-lösningen neutraliserades och torkades och gav 0,06 g torr-subbtans.

Claims (3)

8 60104

1. Sätt att ur en blandning innehällande j ärnföreningar, kallade järn-komponent, och blodprotein, främst globin, och erhällen vid spaltning av hemo-globinet i de röda blodkropparna, separera järnkomponenten frän proteinet, varvid blandningen tili sätt es dehydratiseri.ngsmedelf lämpligen etanol, i en sadan mängd, att den totala hait en av dehydratiseringsmedel i vätskan uppgär tili ätminstone Uo volym-#, företrädesvis ätminstone TO volym-#, räknat pä den totala vätske-mängden, och blandningens pH inställes pa ett värde lägre än k,5, företrädesvis pä ett värde av frän 2,5 till U,5, varvid uppkommer en fällning av järnkomponent, kannet ecknat därav, att en agglcmerering av fällningen ästadkommes pä följande sätt: pH värdet i blandningen höjes tili högst ^,5, en vid spaltningen av blodkropparna erhällen cellmembranfragmentmassa tillsättes seller etanol tili en total halt av dehydratiserande medel av högst 90 volym-% tillsättes och eventuellt samtidigt tanperaturen sänkes, varefter agglomereringen eventuellt ytterligare accentueras genom tillsats av oorganiska eller organiska salter, säsom natrium- eller kaliumsalter, t.ex. natriumklorid, t.ex. i form av vattenlösningar, och därefter avskiljes agglomeraten av järnkomponenten, och det i löst form kvarvarande globinet tillvaratages pä i och för sig känt sätt.

2. Sätt enligt patentkravet l,kännetecknat därav, att järn-komponenten avskiljes ur blandningen genom centrifugering, cyklonförfarande, filtrering, ultrafiltrering, sedimentering eller adsorption pä voluminöst eller fast material.

3. Sätt enligt patentkraven 1 och 2, kännet ecknat därav, att vätskan för e etanoltillsatsen och pH-sänkningen nedkyles tili en temperat ur av mellan -20°C och 0°C och att denna temperatur upprätthälles under hela den fortsatta hehandlingen.