FI63243C - Saett att separera blodets hemoglobin till hem och globin - Google Patents

Description

63243

Tapa erottaa veren hemoglobiini heiniksi ja globiiniksi Sätt att separera blodets hemoglobin till hem ooh globin Tämä keksintö kohdistuu tapaan erottaa veren hemoglobiini hemiksi ja globiiniksi suspendoimalla verestä erotetut verisolut happamaan vesiliuokseen, jossa hemoglobiini hydrolysoituu hemiksi ja globiiniksi, saostamalla hemi ja erottamalla sakka globiinin vesiliuoksesta.

Veri sisältää tunnetusti rautaa ja pääosa tästä raudasta esiintyy rautaprotoporfyriininä hemoglobiinissa. Kun plasma erotetaan verestä, jää verisolufraktioon noin 80 % koko veren sisältämistä proteiineista. Verisolufraktio sisältää noin 38 % raakaproteiinia, jonka kuiva-aineesta hemoglobiini muodostaa noin 80 % naudalla ja sialla noin 87 %. Hemoglobiini sisältää 6 % hemiä, joka edelleen sisältää noin 9 % rautaa ja loput 94 % on globiinia. Kiinnostus orgaaniseen hemi-rautaan on suuresti lisääntynyt, koska sen eräissä tutkimuksissa on todettu absorboituvan suolistossa paremmin kuin epäorgaanisten rautayhdisteiden. Lisäksi monilla epäorgaanisilla rautayhdisteillä on havaittu olevan haittavaikutuksia. Verisolufraktion voimakkaan värin, hajun ja maun sekä huonon säilyvyyden johdosta sen käyttö sellaisenaan rautalääk-keenä ei tule kysymykseen.

Laboratoriomittakaavassa on aikaisemmin hemi erotettu globii-nista kromatograafisesti tai uuttamalla, jolloin liuottimina on käytetty metyyli-etyyliketonia, asetonia ja dimetyyliform-amidia.

Liuotinmenetelmien soveltaminen teknillisessä mittakaavassa aiheuttaa huomattavan korkeat liuotin- ja sen regeneroin-tikustannukset.

Lisäksi käytettävät liuottimet ovat hyvin tulenarkoja ja liuotinjäämien poistaminen lopputuotteista on osoittautunut hankalaksi, mikäli lopputuotteita käytetään rehuna, ravintoaineina tai lääkeaineina.

63243

Ruotsalaisesta kuulutusjulkaisusta 7 407 882-5 tunnetaan menetelmä hemin erottamiseksi globiinista, jossa hapanta hemo-globiiniliuosta jäähdytetään ja siihen lisätään suuri määrä etanolia kahdessa vaiheessa globiinin saostamiseksi ja erottamiseksi sentrifugoimalla. Tämänkin menetelmän epäkohtana on se, että joudutaan käyttämään suuria määriä liuotinta, joka lopuksi on poistettava lopputuotteista. Lisäksi työskentely on suoritettava matalissa lämpötiloissa, joka aiheuttaa huomattavat lisäkustannukset.

Ennestään on myös tunnettua erottaa veren globiini heinistä kromatograafisesti karboksimetyyliselluloosan avulla. Tässä menetelmässä hemolysoitu ja happohydrolysoitu verisolufrak-tio johdetaan karboksimetyyliselluloosalla täytetyn ionin-vaihtokolonnin lävitse, jolloin hemi adsorboituu karboksime-tyyliselluloosaan. Tällä menetelmällä saadaan kuitenkin niin pieniä määriä hemiä erotetuksi globiinista käytettyyn karb-oksimetyyliselluloosamäärään nähden, että tämä menetelmä ei sovellu tekniseen tuotantomittakaavaan.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on aikaansaada tapa erottaa veren hemoglobiini hemiksi ja globiiniksi, jossa edellä mainitut epäkohdat on eliminoitu ja jossa lopputuotteena saadaan hemiä sisältävä tuote, joka sellaisenaan soveltuu käytettäväksi raaka-aineena rautalääkkeen valmistuksessa, sekä globiiniproteiinia, jota voidaan käyttää ravintoaineen tai rehun aineosana ilman liuottimista aiheutuvia haittoja.

Keksinnön pääasialliset tunnusmerkit ilmenevät oheisesta patenttivaatimuksesta 1.

Keksinnön mukaan plasmasta erotettu verisolufraktio hemoly-soidaan laimentamalla se vedellä ja happohydrolysoidaan säätämällä sen pH-arvo alle 3:n globiinin ja hemin välisten sidosten katkaisemiseksi. Sen jälkeen hemi saostetaan happamasta vesiliuoksesta lisäämällä siihen karboksimetyyliselluloosan (CMC) vesiliuosta ja edullisesti niin, että painosuhde 63243 CMC/globiini on vähintään 1:10, edullisesti kuitenkin korkeintaan 2:10. Hemin sisältämä rauta muodostaa tällöin todennäköisesti koordinaatiosidoksen CMC:n karboksyyliryhmien kanssa, jotka keksinnössä käytetyllä pH-alueella ovat täysin protonoituneet. Saostunut hemi-CMC-kompleksi erotetaan lopuksi globiiniproteiiniliuoksesta esimerkiksi sentrifugoi-malla.

Keksintöä selostetaan alla lähemmin esimerkkien avulla. Esimerkki 1

Plasmasta erotettu hemoglobiinia sisältävä verisolufraktio laimennetaan vesimäärällä, jonka paino on vähintään kaksinkertainen verisolufraktion painoon nähden ja saadun liuoksen pH säädetään niin alhaiseksi lisäämällä 0,1 M HClrää, että kun tähän liuokseen lisätään CMC-vesiliuosta, vesiliuoksen pH jää alle 3:n. Karboksimetyyliselluloosan vesiliuosta lisätään niin paljon, että karboksimetyyliselluloosan ja glo-biiniproteiinin painosuhde vesiliuoksessa on noin 1:10. Muodostunut sakka erotetaan liuoksesta sentrifugoimalla (8000 g, 15 min). Sakka sisältää 1,8 % rautaa ja vaalea liuos enintään 0,07 % rautaa kuiva-aineen painosta laskettuna.

Esimerkki 2

Veriplasmasta erotetut hemoglobiinia sisältävät verisolut lietetään veteen (painosuhde 1:2). Liuoksen pH säädetään 1 M HCl:llä arvoon 1,5 ja happamaan vesiliuokseen lisätään viisinkertainen tilavuus 0,3 %;sta karboksimetyyliselluloosan vesiliuosta, jolloin CMC:n ja globiiniproteiinin painosuhde vesiliuoksessa on 2:10. Seoksen annetaan seistä 15 min ja erotetaan saostunut hemi-CMC-kompleksi globiiniproteiiniliuoksesta sentrifugoimalla 1/2 h (8000 g). Proteiinifraktio sisältää noin 70 % alkuperäisistä globiiniproteiineista ja sen kuiva-aineista alle 0,05 paino-% on rautaa.

Esimerkki 3

Plasmasta erotetut verisolut laimennetaan vedellä (painosuhde 4 63243 1:3). Liuoksen pH säädetään 1 M HCl:llä. l,5:ksi ja lisä" tään 4 x liuoksen tilavuus 0,3 %:sta karboksimetyylisel-luloosan vesiliuosta, jolloin CMC;n ja globiiniproteiinin painosuhde on 1,9:10. Seoksen annetaan seistä 15 min ja erotetaan saostunut hemi-CMC-kompleksi globiiniproteiiniliuok-sesta sentrifugoimalla 1/2 h (8000 g). Proteiinifraktio sisältää noin 70 paino-% alkuperäisistä globiiniproteiineista ja sen kuiva-aineista alle 0,06 paino-% on rautaa.

Esimerkki 4

Plasmasta erotetut verisolut laimennetaan vedellä (painosuhde 1:4), Liuoksen pH säädetään 1 M suolahapon vesiliuoksella arvoon 1,5 ja lisätään kolminkertainen tilavuus 0,35 %:sta CMC-vesiliuosta, jolloin CMC;n ja globiinin painosuhde on vesiliuoksessa 1,7; 10. Seoksen annetaan seistä 15 min ja erotetaan saostunut hemi-CMC-kompleksi proteiiniliuokses-ta sentrifugoimalla 1/2 h (8000 g). Globiiniproteiinifrak-tio sisältää noin 80 % alkuperäisistä proteiineista ja sen kuiva-aineista ainoastaan noin Q,07 paino-% on rautaa.

Claims (3)

5 63243

1. Tapa erottaa veren hemoglobiini hemiksi ja globiiniksi suspendoimalla verestä erotetut verisolut happamaan vesiliuokseen , saostamalla hemi ja erottamalla sakka globiinin vesi-liuoksesta, tunnettu siitä, että happamaan vesiliuokseen lisätään karboksimetyyliselluloosaa hemi-CMC-komplek-sin saostamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen tapa, tunnettu siitä, että happamaan vesiliuokseen lisätään niin paljon karboksimetyyliselluloosan vesiliuosta, että painosuhde CMC/globiini on ainakin 1:10, edullisesti kuitenkin korkeintaan 2:10.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen tapa, tunnet-t u siitä, että happaman vesiliuoksen pH pidetään arvossa korkeintaan noin 3 hemin saostuksen aikana.