CS200200B2

CS200200B2 - Method of liquid processing containing blood components

Info

Publication number: CS200200B2
Application number: CS768058A
Authority: CS
Inventors: Paul G Lindroos
Original assignee: Paul G Lindroos
Priority date: 1975-12-11
Filing date: 1976-12-09
Publication date: 1980-08-29
Also published as: FR2351604B2; FI60104B; FI753503A; NL183218B; AU2004176A; SU1071208A3; DE2656157A1; DD127755A5; AU509315B2; IT1121690B; SE7513987L; GB1532848A; FR2351604A2; NZ182682A; IE49296B1; FI60104C; NL183218C; NL7613665A

Description

Vynález .se týká způsobu zpracování kapalin s obsahem krevních -složek, zejména globinu a sloučenin železa, pocházejících z hemoglobinu.The invention relates to a process for the treatment of blood-containing liquids, in particular globin and hemoglobin-derived iron compounds.

Tyto kapaliny jsou jatečným . produktem a je možno je rozdělit odstředěním na dvě kapalné fáze, a to plazmu, a dřeň červených krvinek. Tato dřeň -se někdy nazývá také krevní odpad. Tento krevní odpad obsahuje ' 70 % původního obsahu bílkovin v krvi. Hlavní část těchto bílkovin je ve formě hemoglobinu, který sestává z bílkovinné části, tj. globinu a části s obsahem železa, tj. feroproto-porfyrinu. Tato složka je příčinou specifické chuti a- barvy krve, která je červená v kapalném stavu a černá v práškovitém stavu.These liquids are carcass. product and can be separated by centrifugation into two liquid phases, plasma and red blood cell pulp. This marrow is sometimes called blood waste. This blood waste contains 70% of the original protein content in the blood. The major part of these proteins is in the form of hemoglobin, which consists of a protein part, ie a globin and a part containing iron, ie a feroprotorphyrin. This component is responsible for the specific taste and color of the blood, which is red in the liquid state and black in the powder state.

Roztok globinu je bezbarvý až slabě žlutý, globin v práškovitém -stavu je bílý až světle žlutý.The globin solution is colorless to pale yellow, the globin in the powder state is white to pale yellow.

V případě, že se ferroprotoporfyrin oddělí od hemoglobinu, přechází železo· často do dvojvaznáhO' stavu. Chlorid této- sloučeniny má název heímin a má intezívně černou barvu.When ferroprotoporphyrin is separated from hemoglobin, the iron often enters a divalent state. The chloride of this compound is called heimine and has an intensely black color.

Krevní bílkovina, a zejména globin, oddělený od železnaté složky se užívá pro svou výživnou hodnotu při výrobě krmiv a v případě, - že jsou zachovány jeho funkční vlast2 nois.ti také jako komplexotvorný prostředek.Blood protein, and in particular globin, separated from the ferrous component, is used for its nutritional value in the production of feed and, if its functional homeland is maintained, as a complexing agent.

Složka s obsahem· železa, která sestává ze čtyř pyrrolových kruhů okolo atomu železa se užívá pro svůj obsah železa v lékárenském průmyslu a při výrobě krmiv.The iron-containing component, which consists of four pyrrole rings around the iron atom, is used for its iron content in the pharmaceutical industry and in feed production.

Dřeň, červených krvinek ise zpracovává obvykle tak, že se rozdrtí buněčné membrány a získá -se roztok hemoglobinu. Zlomky buněčných membrán se pak odstraní odstředěním.The red blood cell is usually processed by crushing the cell membranes to obtain a hemoglobin solution. The cell membrane fragments are then removed by centrifugation.

Je známo v laboratorním měřítku oddělovat složku s obsahem železa od globinu chromatograficky nebo extrakcí, -při nichž se užívá rozpouštědel jako methylethylkeťonu, acetonu a dimethylformamidu.It is known on a laboratory scale to separate the iron-containing component from globin by chromatography or by extraction using solvents such as methyl ethyl ketone, acetone and dimethylformamide.

Chromatografie je méně vhodná pro použití v průmyslovém měřítku, pří provádění extrakčního způsobu je -produkt nezpůsobilý pro použití jako krmivá.Chromatography is less suitable for use on an industrial scale, and when performing the extraction process the product is unfit for use as feed.

Předmětem vynálezu je způsob zpracování kapalin s obsahem krevních složek, a to sloučenin -železa, pocházejících z hemoglobinu, bílkoviny, převážně- globinu, vyznačující se tím, že se kapalina zchladí na teplotu 0 až —20°C, přidá se kapalný ethanol až do obsahu 90 objemových %, vztaženo· na celkové množství kapaliny, pH kapaliny se upraví na hodnotu 4,5- až 1, s výhodou na 'hodnotu 2,5 až 4,5 při udržová200200 ní svrchu uvedené teploty, přičemž se s výhodou usnadní vznikající shlukování sloučenin železa přidáním anorganických solí sodíku nebo draslíku, například chloridu sodného, například ve formě vodných roztoků a vytvořené shluky sloučenin železa se oddělí, přičemž globin zůstává v roztoku, z něhož se izoluje.The present invention relates to a process for the treatment of blood-containing liquids, namely iron compounds derived from hemoglobin, a protein, predominantly globin, characterized in that the liquid is cooled to a temperature of 0 to -20 ° C, liquid ethanol is added until 90% by volume, based on the total amount of liquid, the pH of the liquid is adjusted to a value of 4.5 to 1, preferably to a value of 2.5 to 4.5 while maintaining the above-mentioned temperature, preferably facilitating the resulting agglomeration of the iron compounds by addition of inorganic salts of sodium or potassium, for example sodium chloride, for example in the form of aqueous solutions, and the agglomerates of iron compounds formed are separated, leaving the globin in the solution from which it is isolated.

Takto získaný globin je vzhledem k jeho čistotě možno . užít v potravinářství.The globin thus obtained is possible due to its purity. used in the food industry.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno snadno- oddělit složku s obsahem železa od globinu a tak využít globin pro krmné ' účely a železnatou složku pro výrobu krmiv a léků.Thus, by the method of the invention, it is possible to readily separate the iron-containing component from the globin, thereby utilizing globin for feed and the ferrous component for the production of feed and medicaments.

Roztok hemoglobinu se smísí s ethanolem a vodou a pak se okyselí na pH nižší než 4,5. Ferroprotoporfyrin se oddělí od hemoglobinu ve formě různých sloučenin s obsahem železa, které mají černou barvu. Chlorid ve formě trojvazného železa, tzv. hemin pravděpodobně tvoří hlavní část výsledných sloučenin železa. Je také možno·· předpokládat polymeraci, adsorpci nebo reakci s krevními složkami, zejména bílkovinou.The hemoglobin solution is mixed with ethanol and water and then acidified to a pH of less than 4.5. Ferroprotoporphyrin is separated from hemoglobin in the form of various iron-containing compounds having a black color. The trivalent iron chloride, the so-called hemin, probably constitutes the major part of the resulting iron compounds. Polymerization, adsorption or reaction with blood components, particularly protein, may also be envisaged.

V případě dostatečně vysoké koncentrace sloučenin s obsahem železa a při vyšším obsahu · ethanolu v roztoku než 40 objemových o/o tvoří sloučeniny železa shluky, které je možno· oddělit od roztoku. Bílkovina, v první řadě globin zůstává v roztoku v rozpuštěném stavu.If the concentration of the iron-containing compounds is sufficiently high and the ethanol content in the solution is higher than 40 vol / vol, the iron compounds form clusters which can be separated from the solution. Protein, first of all globin remains in solution in the dissolved state.

V případě, že se zvýší koncentrace železa, například přidáním soli, je možno dosáhnout většího shlukování sloučenin železa a tím· vysrážení bílkovinné složky.If the iron concentration is increased, for example by the addition of salt, a greater agglomeration of the iron compounds and thus the precipitation of the protein component can be achieved.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je možno po snížení hodnoty pH tuto hodnoitu znovu zvýšit, čímž se dosáhne objemné sraženiny krevních složek, zejména bílkoviny s rekonstrukcí hemoglobinu ze· složky s obsahem železa a z globinu. Při tomto srážení dochází k adsorpci předem dispergované sloučeniny železa, výslednou sraženinu je možno snadno společně s touto sloučeninou oddělit od roztoku.According to a preferred embodiment of the method according to the invention, after the pH has been lowered, this value can be increased again to obtain a voluminous clot of blood components, in particular a protein with the reconstruction of hemoglobin from an iron-containing component and a globin. This precipitation adsorbs the pre-dispersed iron compound, the resulting precipitate being readily separated from the solution together with the compound.

Oddělení je možno dosáhnout zejména přidáním dalšího absorpčního materiálu, například fragmentů buněčných stěn červených krvinek.Separation may be achieved, in particular, by the addition of additional absorbent material, for example, red blood cell cell wall fragments.

Vysrážení části bílkoviny, zejména hemoglobinu se současnou adsorpci složky s obsahem železa je možno dosáhnout také zvýšením obsahu ethanolu se současným snížením teploty.The precipitation of a portion of the protein, especially hemoglobin, with the simultaneous adsorption of the iron-containing component, can also be achieved by increasing the ethanol content while reducing the temperature.

Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu je možno malý podíl ethanolu nahradit methanolem, propanolem, isopropanolem, butanolem, ethylenglykolem, glycerinem, ethylacetátem nebo acetonem, přičemž se dosáhne téhož účinku.In another embodiment of the process of the invention, a small proportion of ethanol can be replaced by methanol, propanol, isopropanol, butanol, ethylene glycol, glycerine, ethyl acetate or acetone, with the same effect.

Snížením pH se dosáhne úplnějšího štěpení hemoglobinu a shlukování sloučenin železa, současně však · dochází k poruše funkčních vlastností bílkoviny a pravděpodobně ke zvýšené polymeraci sloučenin s obsahem železa. Při vyšším pH k těmto jevům nedochází, zvyšuje se však množství sraženiny bílkoviny se složkami · železa.By lowering the pH, more complete cleavage of hemoglobin and agglomeration of iron compounds is achieved, but at the same time, the functional properties of the protein are impaired and probably increased polymerization of the iron-containing compounds. At higher pH, these phenomena do not occur, but the amount of protein precipitate with iron components increases.

Funkční vlastnosti těchto sloučenin je možno· nejsnáze udržet tak, že se kapalina udržuje s výhodou při teplotě nižší než —5 °C.The functional properties of these compounds are most easily maintained by maintaining the liquid preferably at a temperature below -5 ° C.

Barva reakční směsi za uvedených podmínek je černá až hnědočerná. Po · odstředění této směsi při 10 000 g se získá intenzívně černá pasta s obsahem většiny sloučenin železa z · původní směsi. Supernatant byl světle žlutý až světle hnědý a obsahuje většinu bílkovin. Toto zbarvení supernatantu je známkou úplného oddělení bílkoviny od sloučenin s obsahem železa.The color of the reaction mixture under the above conditions is black to brown-black. After centrifugation of this mixture at 10,000 g, an intensely black paste containing most iron compounds is obtained from the original mixture. The supernatant was light yellow to light brown and contains most proteins. This coloring of the supernatant indicates complete separation of the protein from the iron-containing compounds.

Shluky sloučenin s obsahem železa je možno ze směsi oddělit běžným způsobem, například odstředěním, usazením, pomocí cyklonu, filtrací, ultrafiltrací, a adsorpci na objemný nebo pevný materiál.Clusters of iron-containing compounds can be separated from the mixture in a conventional manner, for example by centrifugation, settling, cyclone filtration, ultrafiltration, and adsorption to bulk or solid material.

Bílkovinu je možno získat z roztoku běžným způsobem, například vysrážením, adsor.pcí na pevný nebo· objemný materiál, odpařením roztoku, sušením, zahuštěním ultrafiltrací nebo· lyofilizací.The protein may be recovered from the solution in a conventional manner, for example by precipitation, adsorption to a solid or bulky material, evaporation of the solution, drying, concentration by ultrafiltration or lyophilization.

Bílkovina v roztoku po oddělení od shluků sloučenin s obsahem železa za uvedených podmínek je vzhledem k obsahu železa, barvě a chuti vhodná pro· krmné účely.The protein in solution after separation from clusters of iron-containing compounds under the above conditions is suitable for feeding purposes due to the iron content, color and taste.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.The invention will be illustrated by the following examples.

Příklad 1Example 1

Dřeň červených krvinek z jatečně krve s citronanem sodným proti srážení se smísí s ethanolem a vedou, takže dojde k rozrušení buněných membrán. Zlomky těchto membrán se odstraní odstředěním. Výsledný roztok hemoglobinu obsahuje 15 % sušiny,· převážně hemoglobinu, 33 objemových proč, ethanolu a zbytek vody. Směs měla pH 5,3 a temně červenou barvu.The pulp of red blood cells from carcass blood with sodium citrate to coagulate is mixed with ethanol and led to disrupt cell membranes. Fractions of these membranes are removed by centrifugation. The resulting hemoglobin solution contains 15% dry matter, mainly hemoglobin, 33 volume% why, ethanol and the rest of the water. The mixture had a pH of 5.3 and a deep red color.

g této směsi se zchladí na teplotu —12 st. Celsia v kádince, načež se po kapkách přidá za stálého· míchání a chlazení roztok 0,5 ml 1 M · kyseliny chlorovodíkové a 10 ml 96% ethanolu při teplotě —12 °C. Po· skončeném přidávání je teplota· vzniklé směsi —12 °C a hodnota pH 3,1. Směs má obsah ethanolu 78 · objemových %.g of this mixture was cooled to -12 ° C. Celsius in a beaker, then a solution of 0.5 ml of 1 M hydrochloric acid and 10 ml of 96% ethanol is added dropwise with stirring and cooling at -12 ° C. After the addition was complete, the temperature of the resulting mixture was -12 ° C and the pH was 3.1. The mixture has an ethanol content of 78% by volume.

Hodnota pH se stanoví tak, že vzorky směsi se ředí 3 objemy vody před stanovením. *The pH is determined by diluting the samples with 3 volumes of water prior to determination. *

Hnědočerně zbarvená směs se odstředí při 27 000 g 10 minut v Sorvallově odstředivce při teplotě —12 °C. Získá se černá pasta s obsahem 1,5 g sušiny (2,9 %) a světle hnědý supernatant. Supernatant se doplní vodou na 50 % a jeho pH se upraví na 7,5, čímž dojde při · teplotě — 70 °C ke vzniku světle šedé sraženiny, která se odstraní odstředěním, čímž se získá 0,95 g šedé pasty s obsahem 28 % sušiny.The brown-black mixture is centrifuged at 27,000 g for 10 minutes in a Sorvall centrifuge at -12 ° C. A black paste containing 1.5 g of dry matter (2.9%) and a light brown supernatant is obtained. The supernatant was made up to 50% with water and adjusted to pH 7.5 to give a light gray precipitate at -70 ° C, which was removed by centrifugation to give 0.95 g of a gray paste containing 28% dry matter.

Analýzou je možno prokázat, že šedá pas200200 ta sestává z bílkoviny s obsahem 5% železa v hemoglobinu.The analysis shows that gray pass200200 is composed of a protein containing 5% iron in hemoglobin.

Černá pasta obsahuje většinu sloučenin s obsahem železa pocházejících z hemoglobinu. Tyto látky mají pravděpodobně formu heminu.Black paste contains most of the iron-containing compounds derived from hemoglobin. These substances are probably in the form of hemin.

Příklad 2 g roztoku hemo-globinu, stejného jako v příkladu 1 se při teplotě —7 °C za stálého míchání a chlazení po kapkách přidávají do kádinky s roztokem. 0,45 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové, 7,5 ml vody a 10 ml 96 objemových % ethanolu při teplotě —7 st. Celsia. Po skončeném přidávání je teiplota směsi —6 °C a pH 3,3. Obisah ethanolu ve směsi stoupne na 50 objemových %.Example 2 g of a hemoglobin solution as in Example 1 are added dropwise to the solution beaker at -7 ° C with stirring and cooling. 0.45 ml of 1M hydrochloric acid, 7.5 ml of water and 10 ml of 96 vol% ethanol at -7 ° C. Celsius. After the addition was complete, the temperature of the mixture was -6 ° C and pH 3.3. The ethanol content of the mixture rises to 50% by volume.

Hnědočerná isměs se odstředí 10 minut při 10 000 g, čímž se získá černá pasta s obsahem sušiny 0,03 g a světle hnědý supeirnatant.The brown-black mixture is centrifuged at 10,000 g for 10 minutes to give a black paste containing 0.03 g solids and a light brown supernatant.

Tento supernatant se rozdělí na dva stejné díly. Z jednoho dílu se získá při pH 7,5 šedá sraženina, která se odstředí, čímž se získá 0,12 g isušiny.This supernatant is divided into two equal portions. A gray precipitate was obtained in one portion at pH 7.5, which was centrifuged to give 0.12 g of dry matter.

Druihá část se smísí s 5 ml ethanolu a 0,2 ml chloridu sodného ve foirmě 10% vodného¹ roztoku za stálého míchání a chlazení. Dále se podrobí ulitrafiltraci >při teplotě —6°C v přístroji Ami-con Diaflo-cell při použití membrány XM 300. Filtrát má světle žlutou barvu, membrána se potáhne tmavým filmem. Z filtrátu se po zředění vodou na obsah 50 ’% při <pH 7,5 získá bílá až světleš-edá sraženina, která váží po usušení 0,11 g.The other part is mixed with 5 ml of ethanol and 0.2 ml of sodium chloride in a 10% aqueous ¹ solution with stirring and cooling. It is further subjected to ulitrafiltration at -6 ° C in an Ami-con Diaflo-cell using an XM 300 membrane. The filtrate is light yellow in color, the membrane is coated with a dark film. A white to light gray precipitate is obtained from the filtrate after dilution with water to 50% at pH 7.5, which weighs 0.11 g after drying.

Příklad 3 g roztoku hemoglobinu z příkladu 1 se při teplotě — 4°C po kapkách přidá za stálého chlazení do kádinky s 0,45 ml ledové vody kyseliny octové, 0,8 ml vody a 5 ml ethanolu o koncentraci 9o objemových proč, při teplotě —4 °C. Po skončeném přidávání je teplota směsi —4 °C a pH 3,8. Obsah ethanolu ve směsi stoupne na 62 objemových %.EXAMPLE 3 g of the hemoglobin solution of Example 1 are added dropwise to a beaker of 0.45 ml of glacial acetic acid, 0.8 ml of water and 5 ml of ethanol at 9o by volume, at -4 DEG C., while cooling. -4 ° C. After the addition was complete, the temperature of the mixture was -4 ° C and pH 3.8. The ethanol content of the mixture rose to 62% by volume.

Černohnědá isměs se odstředí 10 minut při 27 00Ю g, čímž se získá černá pasta s obsahem 0,11 g sušiny a světle hnědý supernatant.The black-brown mixture is centrifuged at 27 00Ю g for 10 minutes to give a black paste containing 0.11 g solids and a light brown supernatant.

Ze supernatantu se po zředění vodou až do obsahu 50 % při pH 7,5 získá světle hnědá až šedá sraženina, která se odstředí a usuší, čímž se získá 0,25 g sušiny.A light brown to gray precipitate is obtained from the supernatant after dilution with water up to 50% at pH 7.5, which is centrifuged and dried to give 0.25 g of dry matter.

Příklad 4 g roztoku hemoglobinu z příkladu 1 o teplotě — 8 °C se po kapkách přidá za stálého chlazení do kádinky, která obsahujeEXAMPLE 4 g of the hemoglobin solution of Example 1 at -8 [deg.] C. are added dropwise while cooling to a beaker containing

0,45 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové, 0,2 ml chloridu sodného ve formě 20% vodného roztoku a 10 ml 96% ethanolu o teplotě —15°C. Po skončeném přidávání je teplota —10 °C a pH 3,3. Obsah ethanolu ve směsi stoupne na 77 objemových %.0.45 ml of 1M hydrochloric acid, 0.2 ml of sodium chloride in the form of a 20% aqueous solution and 10 ml of 96% ethanol at -15 ° C. After the addition was complete, the temperature was -10 ° C and pH 3.3. The ethanol content of the mixture rose to 77% by volume.

Černohnědá směs se 10 minut odstředí při 10 00Ό g, čímž se získá černá pasta, s obsahem sušiny 0,09 g a světle žlutý až světle hnědý supernatant.The black-brown mixture is centrifuged at 10,000µg for 10 minutes to give a black paste with a dry matter content of 0.09g and a pale yellow to light brown supernatant.

Ze supernatantu se po zředění vodou na objem. 5i0 % při pH 7,5 získá šedá sraženina, která se oddělí odstředěním a usuší, čímž se získá 0,30 g sušiny.From the supernatant, dilute with water to volume. 50% at pH 7.5 gave a gray precipitate which was collected by centrifugation and dried to give 0.30 g of dry matter.

Příklad 5 ml 96-% ethanolu se po kapkách přidá za stálého chlazení a míchání do· kádinky s obsahem 3 g roztoku hemoglobinu stejného· složení jako v příkladu 1. Teplota směsi je —10°C. Do vzniklé suspenze hemoglobinu sa po kapkách přidá za stálého- míchání a -chlazení 0,4 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové ve 3 ml 90% ethanolu. Po skončeném přidávání je teplota —10 °C a pH 3,4. Obsah ethanolu ve směsi stoupne na 77 objemových %.EXAMPLE 5 ml of 96% ethanol was added dropwise with constant cooling and stirring to a beaker containing 3 g of a hemoglobin solution of the same composition as in Example 1. The temperature of the mixture was -10 ° C. 0.4 ml of 1M hydrochloric acid in 3 ml of 90% ethanol is added dropwise to the resulting hemoglobin suspension while stirring and cooling. After the addition was complete, the temperature was -10 ° C and pH 3.4. The ethanol content of the mixture rose to 77% by volume.

Černohnědá siměs se odstředí 10 minut při 20 000 g, čímž se získá černá pasta s obsahem 0,08 g sušiny a světle hnědý supernatant.The black-brown simes were centrifuged for 10 minutes at 20,000 g to give a black paste containing 0.08 g dry matter and a light brown supernatant.

0,19 ml 0,5 M hydroxidu sodného v 10 ml 96% ethanolu se po kapkách přidá za stálého míchání a chlazení do supernatantu, teplota po přidání je —10 °C a pH 4,35. Obsah ethanolu ve směsi stoupne na 85 objemových %.0.19 ml of 0.5 M sodium hydroxide in 10 ml of 96% ethanol is added dropwise with stirring and cooling to the supernatant, the temperature after addition is -10 ° C and pH 4.35. The ethanol content of the mixture rose to 85% by volume.

Výsledná sraženina, která je frakcí krevní bílkoviny s adsorbovanou sloučeninou železa se odstraní odstředěním, čímž se získá černočervená pasta s obsahem 0,08 g sušiny.The resulting precipitate, which is a fraction of the blood protein with the adsorbed iron compound, is removed by centrifugation to give a black-red paste containing 0.08 g dry matter.

Z velmi světle žlutého supernatantu se po přidání vody do obsahu 50 % při zvýšení pH ma 7,5 za stálého chlazení získá světle šedá sraženina, ktorá se odstředí a Usuší, čímž se získá 0,22 g sušiny.A light gray precipitate is obtained from the very pale yellow supernatant after addition of water to 50% with a pH increase of 7.5 and under constant cooling, which is centrifuged and dried to give 0.22 g of dry matter.

Příklad 6 g roztoku hemoglobinu z příkladu 1 o teplotě —8 °C s-е po kapkách přidá za stálého míchání a chlazení do kádinky, která obsahuje 0,45 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové a 10 ml 96% ethanolu o teplotě —8 °C. Po- skončeném přidávání je teplota —8 °C a pH 3,3. Obsah ethanolu ve směsi se zvýší na 78 objemových %.EXAMPLE 6 g of the hemoglobin solution of Example 1 at -8 [deg.] C. are added dropwise with stirring and cooling to a beaker containing 0.45 ml of 1 M hydrochloric acid and 10 ml of 96% ethanol at -8 [deg.] C. . At the end of the addition, the temperature was -8 ° C and pH 3.3. The ethanol content of the mixture is increased to 78% by volume.

Hnědo-černá směs se odstředí 10 minut při 10 000 g, čímž se získá černá pasta s obsahem 0,06 g sušiny a světle hnědý supernatant.The brown-black mixture is centrifuged at 10,000 g for 10 minutes to give a black paste containing 0.06 g dry matter and a light brown supernatant.

ml suspenze s obsaheem 0,1 g dřeně červených krvinek ve stejných dílech ethanolu a vody při teplotě —8 °C a pH 5,3 se po kapkách přidá za stálého míchání a chlazení к supernatantu, po skončeném přidávání je teplota —8 °C a obsah ethanolu objemových %.ml of a suspension containing 0.1 g of red blood cell marrow in equal parts of ethanol and water at -8 ° C and pH 5.3 is added dropwise with stirring and cooling to the supernatant, after completion of the addition the temperature is -8 ° C and ethanol content by volume.

Směs se odstředí 10 minut při 10 000 g, čímž se získá malé množství černé pasty a světle hnědý až světle žlutý supematant. Ze supeirnatantu se vysráží stejně jako v příkladu 5 světle šedá sraženina, tato sraženina se odstředí a usuší, čímž se získá 0,25 g sušiny.The mixture was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes to give a small amount of black paste and a light brown to pale yellow supernatant. A light gray precipitate was precipitated from the supernatant, as in Example 5, and the precipitate was centrifuged and dried to give 0.25 g of dry matter.

Příklad 7 g roztoku hemoglobinu z příkladu 1 se při teplotě —6 °C za stálého míchání a chlazení po kapkách přidají do kádinky s obsahem 0,50 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové, 8 ml 96'% eithanolu a 2 ml glycerinu při teplotě —8 ^qC. Po skončeném přidávání je teiplota směsi —8 °C a pH 3,1. Celkové množství ethanolu a glycerinu ve směsi je 82 objemových %.Example 7 g of the hemoglobin solution of Example 1 are added dropwise to a beaker containing 0.50 ml of 1 M hydrochloric acid, 8 ml of 96% eithanol and 2 ml of glycerin at -8, at -6 ° C, with stirring and cooling. ^q C. After completion of addition, the temperature of the mixture is -8 ° C and pH 3.1. The total amount of ethanol and glycerin in the mixture is 82% by volume.

Hnědočerná směs se 10 minut odstředí při 27 000 g, čímž se získá černá pasta s obsahem 0,09 g sušiny a světle hnědý až světle žlutý supematant.The brown-black mixture is centrifuged at 27,000 g for 10 minutes to give a black paste containing 0.09 g solids and a light brown to pale yellow supernatant.

Ze supematantu se stejným způsobem jako v příkladu 5 vysráží světle žlutá sraženina, která se oddělí odstředěním a usučí, čímž se získá 0,26 g sušiny.A pale yellow precipitate precipitated from the supernatant in the same manner as in Example 5, which was collected by centrifugation and dried to give 0.26 g of dry matter.

Obdobným způsobem je možno provádět sthora uvedený postup při přidání ethylenglykolu, propanolu, iisopropanolu, .meithanolu, acetonu a ethylacetátu ve stejném množství jako glycerin. Při provádění těchto postupů byly získány stejné výsledky.In a similar manner, the above procedure can be carried out by adding ethylene glycol, propanol, isopropanol, methanol, acetone and ethyl acetate in the same amounts as glycerin. The same results were obtained when performing these procedures.

Příklad 8Example 8

Do roztoku 20 ml ethanolu o koncentraci 96 objemových % a 1,1 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové o teplotě —12 °C se po kapkách přidá za stálého míchání a chlazení 5 g roztoku hemoglobinu, stejného jako· v příkladu 1. Po skončeném přidávání je pHTo a solution of 20 ml of 96 vol% ethanol and 1.1 ml of 1 M hydrochloric acid at -12 ° C was added dropwise with stirring and cooling, 5 g of hemoglobin solution, as in Example 1. After the addition was complete, pH

2,9 a teplota —12 °C. Obsah ethanolu ve směsi stoupne na 80 objemových %. Hnědočerná směs se 10 minu/t odstředí při 27 000 g, čímž se získá 2,2 g černé pasty s obsahem 2,7 % sušiny a světle hnědý supernatant. Tento supematant má gelo-vltou konzistenci.2.9 and -12 ° C. The ethanol content of the mixture rose to 80% by volume. The brown-black mixture is centrifuged at 27,000 g for 10 min / t to give 2.2 g of a black paste containing 2.7% solids and a light brown supernatant. This supernatant has a gel-like consistency.

Do· supeirnatantu se po kapkách, tpřidá za stálého míchání a chlazení 70 ml chladného 96% eithanolu a pak 0,8 ml 40% vodného roztoku síranu amonného a 8 ml vody. Po skončeném přidávání je teplota —6 °C. Sraženina se oddělí odstředěním 10 minut •při 8000 g, čímž se získá 1,7 g bílé pasty s obsahem 36 % sušiny.70 ml of cold 96% eithanol and then 0.8 ml of a 40% aqueous ammonium sulfate solution and 8 ml of water are added dropwise to the supernatant. After the addition is complete, the temperature is -6 ° C. The precipitate was collected by centrifugation at 8000 g for 10 minutes to give 1.7 g of a white paste containing 36% solids.

Příklad 9 g roztoku hemoglobinu, stejného jako v příkladu 1 o teplotě +8 °C se po kapkách přidá za stálého míchání do kádinky s obsahem 0,80 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové, 2 ml vody a 10 ml 96% ethanolu o teplotě +2 °C. Po skončeném přidávání je teplota -J-8 °C a pH 2,5. Obsah ethanolu ve směsi stoupne na 67 objemových %.Example 9 g of a hemoglobin solution of the same temperature as in Example 1 at + 8 ° C are added dropwise with stirring to a beaker containing 0.80 ml of 1 M hydrochloric acid, 2 ml of water and 10 ml of 96% ethanol at +2 Noc: 2 ° C. After complete addition, the temperature is -8 ° C and pH 2.5. The ethanol content of the mixture rose to 67% by volume.

Hnědočerná směis se odstředí 10 minut při 2,7 0010 g při teplotě Ц-8°С, čímž se získá černá pasta s obsahem 0,06 g sušiny a žlutý supeirnatant.The brown-black mixture is centrifuged for 10 minutes at 2.7 0010 g at Ц-8 ° С to give a black paste containing 0.06 g solids and a yellow supernatant.

Ze supematantu se vysráží obdobným způsobem Jako v příkladu 5 světle šedá sraženina, která se oddělí odstředěním a usuší, čímž se získá 0,27 g sušiny.A light gray precipitate was precipitated from the supernatant in a similar manner to Example 5, which was collected by centrifugation and dried to give 0.27 g of dry matter.

Příklad 10 g roztoku hemoglobinu stejného- složení jako v příkladu 1 o teplotě —12 °C se po· kapkách přidá za stálého míchání a chlazení do kádinky s obsahem 0,35 ml 2 M kyseliny chlorovodíkové a 5 ml absolutního eithanolu při teplotě —12 °C. Po skončeném přidávání je teplota —12 °C a pH 2,9.Example 10 g of a solution of hemoglobin of the same composition as in example 1 at -12 ° C are added dropwise with stirring and cooling to a beaker containing 0.35 ml of 2M hydrochloric acid and 5 ml of absolute eithanol at -12 ° C. After addition was complete, the temperature was -12 ° C and pH 2.9.

Obsah ethanolu ve směsi je 71 objemových %. Hnědočerný roztok se odstředí 10 minut při 27 000 g při teplotě —12 °C, číirnž se získá černá pasta s obsahem 0,07 g sušiny a světle žlutý supernatanit.The ethanol content of the mixture is 71% by volume. The brown-black solution is centrifuged for 10 minutes at 27,000 g at -12 ° C to give a black paste containing 0.07 g solids and a pale yellow supernatant.

Do supematantu se za stálého míchání a chlazení po kapkách přidá při teplotě —18 st. Celsia 15 ml 90% ethanolu. Po skončeném přidávání je teplota směsi —18 °C. Obsah eithanolu ve směsi stoupne na 86 objemových %.The supernatant was added dropwise at -18 ° C with stirring and cooling. Celsius 15 ml 90% ethanol. After the addition was complete, the temperature of the mixture was -18 ° C. The eithanol content of the mixture rises to 86% by volume.

Po 10 minutách stání při teplotě —18 °C se směs odstředí stejně jako shora, čímž se získá černá a červená pasta s obsahem 0,08 g sušiny.After standing at -18 ° C for 10 minutes, the mixture was centrifuged as above to give a black and red paste containing 0.08 g dry matter.

Slabě světle žlutý supematant se rozdělí na dva stejné díly.The slightly pale yellow supernatant is divided into two equal portions.

Z prvního dílu ise stejným způsobem jako v příkladu 5 získá světle šedá až bílá sraženina, která se odstředí a usuší, čímž se získá 0,11 g sušiny.A light gray to white precipitate was obtained from the first portion, which was centrifuged and dried to give 0.11 g of dry solid.

Druhý díl se podrobí ultrafiltraci (na přístroji Amicon Diaflo-Cell) při použití membrány pM 10 při teplotě —8 ^qC. Koncentrát se smísí s 10 ml vody při teplotě 0°C a zfiltruje. Roztok bílkovin, zbavený tímto způsobem ethanolu se neutralizuje a vysuší, čímž se získá 0,06 g sušiny.The second part was subjected to ultrafiltration (Amicon Diaflo the unit-cell) using a PM 10 membrane at -8 ^q C. The concentrate was mixed with 10 ml of water at 0 ° C and filtered. The ethanol-free protein solution was neutralized and dried to give 0.06 g of dry solid.

Příklad 11Example 11

Výchozí látkou byl roztok hemoglobinu, připravený stejně jako· v příkladu 1 s obsahem 12 % cukru. К 'tomuto roztoku se po kapkách přidá 0,45 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové v 5 ml 96% ethanolu (objemová %) při teplotě —10 °C za istáléiho· míchání a chlazení do nádoby, která obsahuje roztok 4 g hemoglobinu, zchlazený na —10 st. Celsia. Pak se přidá 1,4 ml 30% chloridu sodného ve formě vodného roztoku a 30 ml 40% ethanolu (objemová %) při teplotě —l,0°C. Po skončeném přidávání je teplota směsi —10 °C, pH 3,45 a obsah ethanolu 45 objemových %. Hnědavá isměs se ro-zdělí na dva stejné díly.The starting material was a hemoglobin solution prepared as in Example 1 containing 12% sugar. To this solution is added dropwise 0.45 ml of 1M hydrochloric acid in 5 ml of 96% ethanol (v / v) at -10 ° C with stirring and cooling to a vessel containing a solution of 4 g of hemoglobin cooled to —10 st. Celsius. 1.4 ml of 30% sodium chloride aqueous solution and 30 ml of 40% ethanol (v / v) at -1.0 ° C are then added. After the addition was complete, the temperature of the mixture was -10 ° C, pH 3.45, and the ethanol content was 45% (v / v). The brownish mixture is divided into two equal parts.

V druhé části směsi se přidá 1 ml suspenze 0,2 g buněčných stěn červených kr200200In the second part of the mixture, 1 ml of a suspension of 0.2 g of kr200200 red cell walls is added

I vlnek ve 45% ethanolu (objemová %) při pH 3,45 a při teplotě — 10'0 po kapkách za stálého míchání a hrubá sraženina se oddělí filtrací. Na filtračním papíře zůstane vločkovitá černá .pastovitá sraženina, filtrát je světle žlutý a čirý.The wavelet in 45% ethanol (v / v) at pH 3.45 and at -10 ° C was added dropwise with stirring and the coarse precipitate was collected by filtration. A flaky black, pasty precipitate remains on the filter paper, the filtrate is pale yellow and clear.

Z filtrátu se vysráží při . pH 7,5 bílá sraženina, z níž se po odstředění a usušení získá C,13 g sušiny.Precipitates from the filtrate at. pH 7.5 white precipitate from which, after centrifugation and drying, 13.13 g of dry matter are obtained.

Ze druhé části směisi se po filtraci stejným způsobem získá hnědý filtrát, z něhož se vysráží při pH 7,5 černohnědá sraženina s obsahem C,16 g sušiny.A brown filtrate is obtained from the second part of the mixture after filtration in the same manner, from which a black-brown precipitate containing 16 g of dry matter precipitates at pH 7.5.

Suspenze buněčné drti krevních buněk měla obsah sušiny 3C % a byla získána z krve odstředěním a slitím plazmy.The cell-pulp suspension of blood cells had a dry matter content of 3% and was obtained from the blood by centrifugation and plasma pooling.

Příklad 12Example 12

Do nádoby s obsahem 4 g roztoku hemoglobinu při teplotě —5 °C se přidá C,6 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové v 8 ml 96% ethanolu (objemová %) po kapkách za stálého míchání při teplotě —5 °C. Po· skončeném přidávání byla 'teplota — 5 °C a hodnota pH 3,C5. Obsah ethanolu byl 72 objemových '%.To a flask containing 4 g of hemoglobin solution at -5 ° C was added 0.6 ml of 1 M hydrochloric acid in 8 ml of 96% ethanol (v / v) dropwise with stirring at -5 ° C. After the addition was complete, the temperature was -5 ° C and the pH was 3.5. The ethanol content was 72% by volume.

Hnědočerná směs ise odstředí ipři 9000 g po· dobu 5 minut, čímž se získá černá pasta s obsahem 0,09 g sušiny a hnědý supernatant. K supernatantu se · jpridá 30· ml 4θ% ethanolu (objemová %) při teplotě —5·· °C při pH 3,05. Supernatant se pak rozdělí na dva stejné díly.The brown-black mixture is centrifuged at 9000 g for 5 minutes to give a black paste containing 0.09 g dry matter and a brown supernatant. 30 ml of 4% ethanol (v / v) is added to the supernatant at a temperature of -5 ° C at a pH of 3.05. The supernatant is then divided into two equal portions.

K jednomu dílu supernatantu se přidá po kapkách za stálého míchání 1 ml suspenze s obsahem 0,3 g fragmentů buněčných stěn ve 45% ethanolu /objemová %) při pH 3,05. Pak se sníží pH na 2,8 kyselinou chlorovodíkovou a zvýší se na 3,4 hydroxidem sodným. Pak se suspenze zfiltruje přes filtrační papír, na němž zůstane tmavě hnědá pastovitá sraženina, filtrát je světle žlutý, postup se provádí při teplotě — 5°C a · při pH 3,4. .·To one part of the supernatant, 1 ml of a suspension containing 0.3 g of cell wall fragments in 45% ethanol (v / v) at pH 3.05 is added dropwise with stirring. The pH was then lowered to 2.8 with hydrochloric acid and raised to 3.4 with sodium hydroxide. Then, the suspension is filtered through a filter paper on which a dark brown pasty precipitate remains, the filtrate is light yellow, the procedure is carried out at -5 ° C and pH 3.4. ·

Z ' filtrátu se vysráží při pH 7,5 bílá sraženina s obsahem 0,14 g' sušiny.A white precipitate containing 0.14 g of dry matter precipitated from the filtrate at pH 7.5.

Ke druhé části supernatantu se přidá 1 ml 45% ethanolu (objemová %), pH se· sníží a znovu zvýší stejně jako· svrchu a po filtraci se 'tímto 'způsobem získá hnědý filtrát, z něhož se vysráží hnědá sraženina při pH 7,5. Tato sraženina obsahuje 0·,18 g sušiny.1 ml of 45% ethanol (v / v) is added to the second part of the supernatant, the pH is lowered and raised again as above, and after filtration a brown filtrate is obtained, from which a brown precipitate precipitates at pH 7.5 . This precipitate contains 0.18 g of dry matter.

Buněčné fragmenty byly připraveny působením ethanolu a vody ve stejném poměru na suspenzi krevních buněk při pH 5,15 a při teplotě —4°C, takže došlo· k rozrušení buněčné membrány. Fragmenty buněčné membrány byly odděleny odstředěním a opakovaně promyty vodou, čímž byla získána šedohnědá pastovitá sraženina s obsahem 23 % sušiny a 8 % sušiny ze suspenze krevních buněk.Cell fragments were prepared by treatment of ethanol and water in equal proportions on the suspension of blood cells at pH 5.15 and at a temperature of -4 ° C, thus disrupting the cell membrane. The cell membrane fragments were collected by centrifugation and washed repeatedly with water to obtain a gray-brown paste precipitate containing 23% solids and 8% solids from the blood cell suspension.

Příklad 13Example 13

Ke 2 g suspenze krevních buněk, získané odstředěním krve ipři teplotě 0 °C se ;po kapkách přidá za stálého· chlazení a. míchání roztok 1,10 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové, 3,0 ml vody, 13 ml 96% ethanolu (objemová %) a 1,8 ml 30% chloridu sodného ve vodném roztoku . při teplotě —10 °C. Po skončeném. přidávání je teplota —5 °C a hodnota pH 3,2. Obsah ethanolu ve směsi je 60 objemových %. Hnědočerná směs se odstředí při 9000 g po dobu 10^! minut, čímž se získá černá pastovitá usazenina s obsahem 0,19 g sušiny a mimoto žlutý · supernatant.To a 2 g blood cell suspension obtained by centrifugation of blood at 0 ° C, a solution of 1.10 ml of 1M hydrochloric acid, 3.0 ml of water, 13 ml of 96% ethanol (v / v) is added dropwise while stirring and stirring. %) and 1.8 ml of 30% sodium chloride in aqueous solution. at -10 ° C. After done. the addition is at a temperature of -5 ° C and a pH of 3.2. The ethanol content of the mixture is 60% by volume. The brown-black mixture is centrifuged at 9000 g for 10 ^min. minutes to give a black pasty deposit containing 0.19 g of dry matter and a yellow supernatant.

Ze supernatantu se vysráží při pH 7,5 světle šedá .sraženina, z níž .se po odstředění získá šedý pastovitý. produkt s obsahem 0,43 g sušiny.A light gray precipitate precipitated from the supernatant at pH 7.5, from which a gray pasty was obtained after centrifugation. product containing 0.43 g dry matter.

Claims

Process for the treatment of blood-containing liquids, namely iron compounds derived from hemoglobin, a protein, predominantly globin, characterized in that the liquid is cooled to a temperature of 0 to -20 ° C, adding liquid ethanol until content of 90 vol% based ¹ 'to the total quantity of liquid, pH of the liquid was adjusted to about 4.5 to 1, preferably to 2.5 to 4.5 when in the above-cdržtování uveedeTié temperature being preferably formed make agglomeration of the iron compounds by addition of inorganic salts of sodium or potassium, for example sodium chloride, for example in the form of aqueous solutions, and the formed agglomerates of iron compounds are separated, leaving the globin in the solution from which it is isolated.

2. The method of claim 1, wherein the pH is in a mixture with the contents. The agglomerates of iron compounds before their separation are not increased or increased to a maximum of 4.5 after separation and the blood protein fraction precipitated together with the iron compounds or adsorbed iron compounds is separated from the mixture.

3. The method of claim 1, wherein a small amount of red blood cell marrow is added to the mixture containing the iron compound clusters before or after separation, and the flocculated material comprising cell membrane fragments together with iron compounds which are these fragments absorbed from the mixture are separated.

4. The process of claim 1, wherein 0-20% ethanol is replaced by glycerine, thylene glycol, methanol, acetone, ethyl acetate, propanol, isopropanol or butanol.

.

5. A process according to claim 1, wherein the iron compounds are isolated from the mixture by centrifugation, cyclone filtration, ultrafiltration, settling, or absorption into a bulk or solid material.

6. A method according to any one of claims 1 to 3, wherein the protein is recovered from the solution by precipitation, adsorption to a solid or bulk material, ultrafiltration, evaporation of the solution, drying or lyophilization.

7. Process according to claim 1, characterized in that the ethanol content of the mixture containing the clusters of iron compounds is increased to 90% by volume before or after their separation, preferably simultaneously. lowering the temperature and thus precipitating the blood protein fraction containing iron compounds in the form of mixtures or in adsorbed form is separated from the mixture.

8. The method of item 1. . characterized in that the liquid is cooled to 0 to -20 ° C before addition of ethanol and lowering the pH and maintained at this temperature during further processing.