FI117442B - Arakidonihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö - Google Patents

Arakidonihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI117442B
FI117442B FI972829A FI972829A FI117442B FI 117442 B FI117442 B FI 117442B FI 972829 A FI972829 A FI 972829A FI 972829 A FI972829 A FI 972829A FI 117442 B FI117442 B FI 117442B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ara
oil
arachidonic acid
amount
hours
Prior art date
Application number
FI972829A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI972829A (fi
FI972829A0 (fi
Inventor
David J Kyle
Original Assignee
Martek Biosciences Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23449013&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI117442(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Martek Biosciences Corp filed Critical Martek Biosciences Corp
Publication of FI972829A0 publication Critical patent/FI972829A0/fi
Publication of FI972829A publication Critical patent/FI972829A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI117442B publication Critical patent/FI117442B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/04—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing non-milk fats but no non-milk proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/92—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof
    • A61K8/922—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof of vegetable origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Description

117442 :·:·*Ι
Arakidonihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö
Keksinnön ala
Keksintö liittyy arakidonihapon valmistamiseen, arakidonihappoa si-5 sältäviin koostumuksiin ja näiden käyttömuotoihin.
Keksinnön tausta
Arakidonihappo (ARA) on pitkäketjuinen omega-6-ryhmään kuuluva ΐ monityydyttymätön rasvahappo (PUFA) (5,8,11,14-eikosatetraeenihappo, toisin sanoen 20:4). ARA on ihmisruumiissa runsaimpana esiintyvä C20-PUFA.
10 Sitä esiintyy erityisen runsaasti elin-, lihas- ja verikudoksissa ja sen pääasiallisena tehtävänä on toimia rakenteellisena lipidinä, joka assosioituu pääasiassa veressä, maksassa, lihaksessa ja muissa tärkeimmissä elinjärjestelmissä esiintyviin fosfolipideihin. Sen lisäksi, että ARAn pääasiallisimpana tehtävänä on toimia rakenteellisena lipidinä, se on myös useiden kiertävässä f 15 veressä esiintyvien eikosenoidien, kuten prostaglandiini E2:n (PGE2), prosta- 1 sykliini l2:n (PGI2), tromboksaani A2:n (TxA2) ja leukotrieenien B4 (LTB4) ja -C4 (LTC4) välitön esiaste. Näillä eikosenoideilla on lipoproteiinimetaboliaan, veren
«M
Teologiaan, verisuonten tonukseen, leukosyyttien toimintaan ja verihiutaleiden • · :.*·· aktivoitumiseen kohdistuvia säätelyvaikutuksia. > 20 Huolimatta siitä, että ARA on tärkeä ihmisen metabolialle, ihmisillä ei ole kykyä syntetoida tätä de novo -reaktiotietä. ARAa syntetoituu välttämät- t tömän rasvahapon, linoleiinihapon (LOA), pidentymisen ja desaturoitumisen kautta. Tämän tapahtumiselle tarvitaan ihmisruumiissa pieninä määrinä esiintyvää entsyymiä, A6-desaturaasia, Burre, et ai., Lipids 25 (1990) 354- 356.
25 Tämän mukaisesti pääosa ARAsta on saatava ruokavaliosta ja tämä on erityi-sen tärkeää ruumiin nopean kasvun vaiheissa, kuten vauvaiässä.
• · *·;·* Pikkuvauvojen paino voi ensimmäisen elinvuoden aikana kaksin- kertaistua tai kolminkertaistua. Tämän johdosta ruokavalion täytyy sisältää ta- :***: vallista runsaammin ARAa. Tämän lisääntyneen tarpeen tyydyttämiseksi ihmi- ··* # 30 sen rintamaidon ARA-pitoisuudet ovat korkeita. Sanders, et ai., Am. J. Clin.
*:!:* Nutr. 31 (1978) 805- 813. Cao-PUFA-molekyyleistä on rintamaidossa eniten
• · V
**··* ARAa. Imettävistä äideistä erityisesti kasvissyöjät voisivat hyötyä ravinnon tarjoamasta ARA-ylimäärästä. Monet äideistä eivät kuitenkaan imetä vauvo-jaan tai lopettavat imetyksen ennen kuin lapsi on ohittanut nopean kasvun vai-35 heen ja turvautuvat mieluummin äidinmaidonvastikkeen käyttöön.
117442 2 Tämän patenttihakemuksen tekijän tiedossa ei ole yhtään kaupallista äidinmaidonvastiketta, joka sisältäisi triglyseridimuodossa olevaa ARAa. US-patenttijulkaisussa nro 4 670 285 (Clandinin, et ai.), joka on liitetty tähän f keksintöön siihen oikeuttavien säännösten nojalla, kuvataan vauvaikäisten 5 rasvahappotarvetta, ARAn tarve mukaan luettuna. Clandinin, et ai. ehdottavat munankeltuaisen, kalaöljyn tai punasolujen fosfolipidien ja kasviöljyjen seoksen käyttöä ehdottamansa äidinmaidonvastikkeen rasvakomponenttina, josta näitä rasvahappoja saataisiin. Kalaöljy sisältää kuitenkin suuria määriä eikosa-pentaanihappoa (EPÄ). EPAn tiedetään heikentävän ARAn synteesiä pikku-10 lapsilla. Carlson, et ai., Inform 1 (1990) 306. Siten olisi haluttua kyetä saamaan käyttöön ARAa ilman ylimääräistä EPAa. Lisäksi kananmunankeltuaisten sisältämä ARA-konsentraatio on suhteellisen pieni, joten Clandinin et al:n seoksella ei ole taloudellista tulevaisuutta.
Koska ARAa esiintyy eläinöljyissä, mutta ei kasvisöljyissä, sen tuo- 15 tanto kaupallisina määrinä on jäänyt tavoiteltavaksi mutta saavuttamattomaksi päämääräksi. Shinmen, et ai., Microbiol. Biotech. 31 (1989) 11 - 16, ovat ra- r' portoineet, että eristetty sieni, Mortierella alpina, tuottaa ARAa käytettäessä tavanomaista fermentointia sekoitettavassa säiliössä. (Tätä kysymystä on myös käsitelty Shinmen, et al:n japanilaisessa patenttijulkaisussa 1 215 245.) .·*·. 20 Organismit otetaan kasvatuksen jälkeen talteen, ne kuivataan ja niiden lipidit • · · *; " eristetään sienen biomassasta orgaanisella liuottimena ja lipidit modifioidaan l • · · *·*·[ kemiallisesti (kovalenttisesti). Esimerkiksi lipidiseos hydrolysoidaan tai muun- > *.*·: netaan etyyliestereiksi ja nämä yhdistetään seuraavaksi syklodekstriiniin, min- f • · ·. it : ’· kä jälkeen niitä käytetään ruokavalion täydentämiseen. Shinmen et ai. eivät |
• · · · · ' -iT
ί#ϊ : 25 kuvaa eivätkä ehdota modifioimattomien mikrobiöljyjen antamista. ?
Punaista mikrolevää, Porphyridium cruentumia, voidaan kasvattaa f : lammikoissa suurina määrinä ja sen lipidikoostumus voi sisältää jopa 40 % .**·. ARAa. Ahern, et ai., Biotech. Bioeng. 25 (1983) 1057- 1070. Valitettavasti ..·* ARA assosioituu pääasiassa galaktolipideihin, jotka ovat monimutkaisia polaa- : ** 30 risia lipidejä, jota ei esiinny rintamaidossa. Levä ei ainoastaan muodosta bio- ? ··* massastaan kokonaisuudessaan enempää kuin yhden prosentin käytettävissä : olevaa ARAa vaan ARA on muodoltaan myös sellaista, ettei se sovellu käy- • · * .···. tettäväksi lisäaineeksi äidinmaidonvastikkeessa ilman jatkomodifiointia.
US-patenttijulkaisussa nro 4 870 011 (Suzuki et ai.) kuvataan me-35 netelmää lipidien, kuten γ-linoleenihapon, saamiseksi käyttöön Mortierella-su- 3 117442
vun sienistä, γ-linoleenihappo puhdistetaan sienten sisältämien lipidien seoksesta. P
Julkaisussa DE 3 603 000 A1 (Milupa) kuvataan erittäin moni- r tyydyttymättömien rasvahappojen seosta ja sen käyttöä äidinmaidonvastik-5 keen rasvakomponenttina. Rasvaseos sisältää runsaasti ARAa ja dokosa-heksaani (DHA) -happoja suhteessa 2,5:1, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna, ja siinä on runsaasti kolesterolia. Rasvahappojen lähtömateriaaleiksi on lueteltu tietyn tyyppiset makrolevät, kalaöljyt, elimistä peräisin olevat rasvat, jotka ovat peräisin naudoista ja sioista, tai kananmunankeltuaisesta saatava 10 erittäin puhdistettu öljy. DHAn ja ARAn lähteiksi mainitaan makrolevät, jotka ovat tyypiltään fekofyyttejä ja rodofyyttejä. Julkaisussa ei ehdoteta minkään mikrobin käyttöä öljyn lähteenä. Levä- ja kalaöljyt sisältävät tyypillisesti myös | EPAa, joka heikentää ARAn synteesiä in vivo -olosuhteissa. Lisäksi kananmunan keltuaisesta saatava erittäin puhdistettu öljy ei ole ARAn lähtömateriaalina 15 taloudellinen. Lisäksi julkaisussa ei kuvata ARAn suhteen konsentroitua lisäainetta olemassa olevia äidinmaidonvastiketta täydentävänä aineena. - Tämän mukaisesti on olemassa tarvetta saada käyttöön taloudellinen, kaupallisesti käytettävissä oleva menetelmä ARAn valmistamiseksi, edul- ... lisesti tuottamatta samanaikaisesti EPAa. Tämän keksinnön tavoitteena on • · *:*·; 20 tämän tarpeen tyydyttäminen. ^ • « · *♦ ” Tämän keksinnön tavoitteena on lisäksi saattaa käyttöön lisäaine, ja *·*.* tämän lisäaineen lähtömateriaali, jotka on tarkoitettu käytettäväksi äidinmai- • ψ **.*·: donvastikkeessa siten, että äidinmaidonvastikkeen ARA-pitoisuudet lähentyvät • · • *·· ihmisen rintamaidon pitoisuuksia.
:T: 25 Tämän keksinnön tavoitteena on lisäksi saattaa käyttöön ARAa si sältävä sieniöljy, joka on tarkoitettu enteraalisiin, parenteraalisiin tai dermaali- . siin tuotteisiin.
• * * ··* * · ·
Keksinnön yhteenveto | ·* .··’"'* • “·· Tämä keksintö liittyy arakidonihappoa sisältävän sieniöljyn 30 (ARASCO) valmistamiseen ja käyttöön, ja näitä öljyjä sisältäviin koostumuk- . I·. siin. Tätä öljyä voidaan nimittää yksisoluöljyksi. Sieniä kasvatetaan olosuh- • · · Y.l teissä, joissa muodostuu öljyä, ne kootaan talteen ja öljy uutetaan ja otetaan ***·’ talteen. Öljyä voidaan käyttää kemiallisesti pidemmälle modifioimatta suoraan siten, että siitä saadaan ARAa täydentävä tuote tämän tarpeessa oleville hen-35 kiloille, mukaan lukien vastasyntyneet, raskaana olevat tai imettävät naiset tai
potilaat, joilla esiintyy ARAn puutoksesta johtuvia patologisia tiloja. Tämän I
4 1 1 7442 keksinnön etuja ovat se, että ARAa on mahdollista tuottaa vaivattomasti, sen puhtausaste on korkea eikä siinä esiinny havaittavia määriä EPAa.
Edullisten sovellutusmuotojen yksityiskohtainen selitys "ARAa" ja "EPAa" käytetään myös tässä keksinnössä tarkoittamaan lf\ 5 arakidonihappo- ja eikosapentaanihapporyhmiä, mainitussa järjestyksessä il- ^ moitettuna, jossa ryhmät on esteröity glyseroliin osana rasva-asyylitriglyseridiä tai -fosfolipidiä. Tässä keksinnössä koostumus on "olennaisesti sellainen, että siinä ei esiinny EPAa" silloin, kun koostumuksen sisältämä jäljellä oleva EPAn määrä on alle se määrä, joka estäisi ARAn synteesiä koostumusta ravinnon li-10 säaineena käytettäessä. Tässä keksinnössä on saatu myönteiset tulokset ara-kidonihapon (ARA) taloudellisen lähtömateriaalin aikaansaamisessa.
Yhdessä sovellutusmuodossa tämä keksintö liittyy menetelmään > arakidonihappoa sisältävän sieniöljyn (ARASCO) valmistamiseksi, joka öljy ei olennaisesti sisällä lainkaan eikosapentaanihappoa (EPÄ). Tässä keksinnössä - 15 "ei olennaisesti sisällä" tarkoittaa sitä, että öljy sisältää EPAa vähemmän kuin noin viidenneksen sisältämänsä ARAn määrästä. Tätä öljyä, yksisoluöljyä, voidaan antaa suoraan modifioimattomassa muodossa. Tässä keksinnössä "mo-difioimaton" tarkoittaa sitä, että rasvahappojen, tai itse öljyjen, kemiallisia omi-*·*·* naisuuksia ei ole muutettu kovalenttisesti. Siten esimerkiksi ARASCOn tai 1 • · r *.*·: 20 ARAn väliaikainen modifiointi siten, että nämä palautuisivat ennalleen öljyn \v nauttimisen jälkeen, ei jää tämän keksinnön suojapiirin ulkopuolelle.
Tämän keksinnön mukaisista modifioimattomista sieniöljyistä saa- > daan triglyseridejä, joissa suhteellisen suuri osa rasvahapporyhmiä on ARAa :*·*. (rasvahapporyhmistä on edullisesti vähintään 40 % ARAa, ja ryhmistä on edul- ^ • 1 '2* 25 lisemmin vähintään 50 % ARAa), ja ARA-ryhmien ja EPA-ryhmien välinen suh- . .·. de on myös suuri (vähintään 5:1, edullisesti vähintään 20:1, w/w). Tällaista * · · y.‘.t luonnollisista materiaalilähteistä peräisin olevaa öljyä ei ole ennen tätä keksin- *"’ töä kuvattu. Vaikkakin tällaisen koostumuksen mukaisia triglyseridejä voidaan • * , 'ί • *·· syntetoida kemiallisesti (esimerkiksi esteröimällä runsaasti ARAa sisältävien : 30 vapaiden rasvahappojen seoksia tai transesteröimällä tällainen rasva- . X happoseos etyyliestereillä), voi rasvahapposeoksen käsittely (esimerkiksi puh- • · · ΪΛ' distus, esteröinti tai jokin muu näitä vastaava toimenpide) tuottaa haitallisia si- **·’ vutuotteita. Tästä poiketen tämän keksinnön mukaisesta menetelmästä saa daan käyttöön koostumukseltaan haluttuja triglyseridejä käyttämällä uuttoa 35 luonnosta peräisin olevista materiaalilähteistä.
t:;| 5 117442 (Ο 'to
£ > 05 CO
o » ° o n o o_ iq ^ n‘ co ^ 2 to" r--" cd in cm" 't 1- v cm" - r·'- ID IT) O S ^ : ö , , ο" o" T-- cm" °l .
CM i (N I T- <- CM Ln T- CD ! rf O 00 lO C*5 T-_ (D 05 ,¾ Ö CO CO , o' 00 Tt cm" CO T-" ΐ CM 1— -r- I t— t— CM CM 05C0 CO CO CM m 66 CO co" o CM w « ® « a: T- CMt-OIt-COCMCOCOt-O) /; CM CO Ο) If) If) 05 CD O Γ"*· 66 co" T-" T-" tT co" o" cm" r-" o
T- -J-T-T— CMt-t-^-CMCMOO
T- ΙΟ CD 00 CM N- 00 CO τ-^ * · 66 rt o in" r-K m- M·" cvi n ··· v~ nCMlOtDOJ^^rrr- • · • · · *·*·* to T— CO lO ·«- : i 66 , , °° °l O , 'H °l o cm" ·. *: E *- ! I o I cm co T- T- • * 3 : *·· K? o co CM S r- M- N- o- S S" 66 ‘H co" io* os" to co" i- * ·.· : 5 ro ^ ooT-^rooo^^r· O -c - o. ro
. 9· M O 0 S CO
: : : J= $ ^ o co ^ io 0- co m ·*· (j D. i- ICMOS-COt-T-T-C3505 ··· ·> : : vt ··· <u _ • l. CO . · ·' ·*· c ro y E 4 : ·· .s | i ΐ 3 j o, % ' *:* Έ -Q. o ro Q. C 2 ·= ^ = g ·*· ^·_ rotu — ro — ro ro -— m
*"’ Ow ® « 5 C (S 8 oi .t 3 .E
Ξ S 2 2 £ S’ E E E E E E
*·· 3 ό ,ω .2? .9? o 2 3 o 3 o o 5 '$ t "t "t n 6 o !c !c 6 x: :-:k
ra « Eö' I
H ID _l 222(00.0.0.10.0.
' 'M
117442 6
Niistä sienilajeista, joiden rasvahapot on aikaisemmin luonnehdittu, on havaittu, että useimmat eivät muodosta ARAa. Weete, J. D., Fungal Lipid f:i
Biochemistry, Plenum Press, N.Y., (1974). Niistä lajeista, jotka muodostavat ARAa, tuottavat monet, mukaan lukien kaikki aikaisemmin luonnehditut Pyt-5 hium-lajit, ARAn lisäksi merkittäviä määriä eikosapentaanihappoa (EPÄ).
Taulukossa 1 on esitetty P. insidiosumin rasvahappoprofiili sekä muiden sieni- f, lajien rasvahappoprofiili. Tässä keksinnössä on tehty yllättävä löytö, että P. in-sidiosum tuottaa ARAa muodostamatta samanaikaisesti EPAa. Kuten kala-öljyjen kyseessä ollessa on asianlaita, johtavat suuret EPA-pitoisuudet ruoka-10 valiota täydentävissä aineissa siihen, että ARAn muodostamiskyky ruokavaliosta peräisin olevasta linoleiinihaposta (LOA) pienenee. Tämän mukaisesti pitää paikkansa, että vaikkakin sekä ARAa että EPAa tuottavia sienilajeja voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä, on edullista käyttää lajia, joka ei muodosta merkittäviä määriä EPAa. Tällaisia edullisia lajeja 15 ovat Pythium insidiosum ja Mortierella alpina. Molempia lajeja ovat saatavilla kaupallisesti ja ne on talletettu talletuslaitokseen American Type Culture Collective, Rockville, Maryland, ja niiden hakunumerot ovat 28 251 ja 42 340, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna. P. insidiosumia ja M. alpinaa on käy-tetty kuvaavina sienilajeja edustavina esimerkkeinä tässä patenttiselityksessä.
20 Tässä keksinnössä ajatellaan myös käytettäväksi luonnollisesti muita sieni- * I · lajeja, jotka tässä keksinnössä kuvatulla tavalla tuottavat triglyseridiä, joka si-sältää ARAa ja normaalia pienempiä määriä EPAa.
• · ·.**: Yksi merkittäviä ongelmia, joita tämän keksinnön mukainen sovel- \x ·* >4.
: *·· lutusmuoto ratkaisee, on ruokavalion sisältämien normaalia suurempien EPÄ- | ϊ 25 pitoisuuksien aikaansaama ARAn biosynteesin heikkeneminen pikkuvauvoilla :':c Tämä ongelma voidaan ratkaista saattamalla käyttöön ARAa, jota on tarkoi- : ;*· tettu käytettäväksi äidinmaidonvastikkeessa pitoisuuksissa, jotka ovat huo- « · · ' mättävässä määrin samanlaiset kuin ihmisen rintamaidosta havaitut pitoi- ..·* suudet. ARAn ja EPAn suhde on rintamaidossa tyypillisesti noin 20:1, mai- • * *· " 30 nitussa järjestyksessä ilmoitettuna. Tässä keksinnössä ajatellaan erityisesti käytettäväksi mitä tahansa mikrobiöljyä, josta saadaan käyttöön riittävä määrä • ' *' • ·*; ARAa ruokavaliosta peräisin olevan EPAn negatiivisten vaikutusten voitta- .···. miseksi. ARAa sisältävän öljyn käyttö tuottaa edullisesti ARAn ja EPAn vä liseksi suhteeksi vähintään suhteen 5:1. Tämä suhde on edullisemmin noin 35 10:1 ja se on edullisimmin vähintään noin 20:1. Kuten voidaan havaita, on lop- ' 117442 f 7 putulos sen haluttavampi mitä suurempi ARAn määrä lopputuotteessa on EPAn määrän verrattuna. f Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä sieniä kasvatetaan sopivissa ARAa sisältävää öljyä tuottavissa kasvatusolosuhteissa. Sienten 5 kasvatusmenetelmät ovat tavallisesti tämän alan ammattikokemuksen perusteella tunnettuja ja näitä menetelmiä voidaan soveltaa tämän keksinnön f mukaiseen menetelmään. Esimerkiksi ymppäykseen käytettävä sienimäärä voidaan kasvattaa uposkasvatuksena ravistelupulloissa. Pulloissa käytetään kasvatusmediumia, johon on lisätty kasvatusta varten sienimyseeliä ja tätä 10 kasvatetaan ravistelijassa noin kolmesta neljään päivää.
Kasvatusmediumin koostumus voi vaihdella mutta se sisältää aina hiilen ja typen lähteet. Edullinen hiilen lähde on glukoosi ja tämän määrät voivat olla alueella noin 10- 100 grammaa glukoosia litrassa kasvatusmediumia.
Kasvatukseen ravistelupulloissa käytetään tyypillisesti noin 15 grammaa litras-15 sa. Tämä määrä voi olla erilainen sen mukaan, mikä lopullisen viljelmän tiheyden halutaan olevan. Muita hiilen lähteitä, joita voidaan käyttää, ovat melassit, ; runsaasti fruktoosia sisältävä maissisiirappi, hydrolysoitu tärkkelys tai mikä ta- ^ hansa muu edullinen fermentaatiomenetelmissä tavanomaisesti käytetty hiilen lähde. Lisäksi P. insidiosumille voidaan hiilen lähteeksi käyttää laktoosia. Siten 20 substraattina voidaan käyttää kuoritusta maidosta valmistettua permeaattia, i * · « % *; / joka sisältää runsaasti laktoosia ja joka on hyvin edullinen hiilen lähde. Näiden • * · **'·* hiilen lähteiden sopivat määrät ovat vaikeuksitta määritettävissä tämän alan • ·
•V*: ammattikokemuksen perusteella. Ylimääräistä hiiltä on tavallisesti tarpeellista T
: *·· lisätä kasvatuksen kuluessa. Tämä johtuu siitä, että organismit käyttävät niin ·/· i 25 paljon hiiltä, että sen koko määrän lisääminen panoskasvatuksessa voisi osoittautua mahdottomaksi.
: ♦*: Typpeä käytetään tavallisesti hiivauutteen muodossa, ja sen kon- .·*·. sentraatio on noin 2- noin 15 grammaa uutetta litrassa kasvatusmediumia.
Edullisesti käytetään noin 4 grammaa litraa kohti. Voidaan käyttää muita typ- 4 J 30 pilähteitä, ja näitä ovat peptoni, tryptoni, maissin liotusvesi, soijajauho, hydro- % lysoitu kasviproteiini ja muut näitä vastaavat materiaalit. Näiden lähteiden li- : :*· sättävät määrät voidaan määrittää vaikeuksitta tämän alan ammatti- ··· .·*·. kokemuksen perusteella. Typpi voidaan lisätä panosmuodossa, toisin sanoen kaikki yhdellä kertaa ennen kasvatusta. j 35 Kun sieniä on kasvatettu 3 - 4 päivää sopivassa lämpötilassa, tyy- f piliisesti noin 25 - 30 °C:ssa, on kasvaneen sienen määrä riittävä käytettäväksi 117442 8 ymppinä tavanomaiseen sekoitettavaan säiliöfermentoriin (STF). Tällaiset fer-mentorit ovat alan ammattikokemuksen perusteella tunnettuja ja niitä on saa- f tavilla kaupallisesti. Fermentointi voidaan suorittaa panosfermentointina, jak-sottain syötettävänä panosfermentointina (fed batch) tai jatkuvana fermentoin-5 tina. STF on varustettu edullisesti siipiroottorilla (marine impeller), vaikkakin voidaan myös käyttää Rushton-tyyppistä turbiinisekoitinta.
Fermentori valmistellaan käyttökuntoon lisäämällä siihen halutut hiili-ja typpilähteet. Esimerkiksi 1,5 litran vetoinen fermentori voidaan valmistella käyttökuntoon lisäämällä litraan talousvettä noin 50 grammaa glukoosia ja 10 noin 15 grammaa hiivauutetta. Kuten aikaisemmin mainittiin, voidaan käyttää f muita hiili- tai typpilähteitä.
Ravintoliuosta sisältävä reaktori on steriloitava ennen ymppäystä esimerkiksi kuumentamalla. Kun reaktori on jäähtynyt noin 30 °C:seen, voi- f daan lisätä ymppi ja aloittaa kasvatus. Kaasujen vaihdon aikaansaamiseksi 15 käytetään ilman puhaltamista reaktoriin. Ilmaa voidaan puhaltaa eri nopeuk-silla mutta nopeus säädetään edullisesti noin 0,5:stä noin 4,0:aan VVM (ilmamäärä fermentorin tilavuutta kohti minuutissa). Liuenneen hapen pitoisuus pidetään edullisesti noin 10%:sta noin 50 %:iin ilman suhteen täydelli-' sesti kylläisen liuoksen pitoisuudesta. Tämän mukaisesti voi kasvatuksen ai-
V*! 20 kana olla tarpeellista säätää puhallusnopeutta. On haluttua käyttää sekoitusta. I
* · ♦
Sekoitukseen käytetään sekoitinta. Sekoituspään nopeus säädetään edulli- ^ sesti alueelle noin 50 cm/s - noin 500 cm/s ja edullisesti noin 100 - 200 cm/s.
• · ·.**: Ymppiä voidaan tavallisesti käyttää vaihtelevia määriä. Ymppiä voi- | : ·· daan tyypillisesti käyttää noin 2 tilavuus-%:sta noin 10 tilavuus-%:iin. Fermen- ^ :T: 25 toriin yhdistettyä ympin kasvatusta käytettäessä (seed train) voidaan käyttää edullisesti noin 5 tilavuus-% ymppiä. j : Ravinnepitoisuuksia on seurattava. Glukoosipitoisuuden laskettua ··· .···. alle 5 g/l on lisättävä uutta glukoosia. Tyypillisessä kasvatussyklissä käytetään
noin 100 grammaa glukoosia ja noin 15 grammaa hiivauutetta litraa kohti. On J
ί " 30 haluttua käyttää typpilähde loppuun kasvatuksen aikana, koska tämä voimis- • Λ m taa sienten öljyntuottoa. Tämä pitää erityisesti paikkansa käytettäessä tuo- • ·ι:'α . tanto-organismina M. alpinaa. 1 • · · .··*. Erityisen edullisessa sovellutusmuodossa voidaan Mortierella alpinaa, jonka öljypitoisuus on korkea ja joka öljy sisältää runsaasti ARAa, kas- |
35 vattaa fermentorissa erittäin suurissa ravinnepitoisuuksissa. Tässä keksin- A
nössä on tehty se yllättävä löytö, että fermentaation alussa voidaan lisätä sei- 117442 9 laisia pitoisuuksia typpipitoisia ravinteita, jotka ylittävät sen ravinnepitoisuuden, joka saadaan käyttämällä 15 grammaa hiivauutetta litraa kohti, sikäli kuin fer- $ mentaation aikana lisätty hiilipitoisen ravinteen kokonaismäärä on verrattain " korkea. Hiiliravinteen kokonaismäärä, jota edullisesti syötetään jatkuvasti tai 5 aika ajoin ensimmäisten 25 - 50 %:n aikana fermentaatioon käytetystä ajasta, tai erinä useina eri ajankohtina tällä samalla osalla fermentaatioon käytettävästä ajasta, vastaa 75 - 300 grammaa glukoosia litrassa elatusainetta (C:N -suhde >5:1, ilmoitettuna glukoosin ja hiivauutteen suhteena, w/w). Erityisen edullisessa fermentointitavassa typpiravinne on soijajauho, jota lisätään sellai-10 nen määrä, että pitoisuudeksi saadaan noin 16 grammaa litrassa mediumia, ja hiiliravinnetta käytetään aluksi pitoisuudessa, joka vastaa noin 80 grammaa glukoosia, tai tätä suuremmassa pitoisuudessa. Käytettäessä suuria hiili- ja typpiravinteiden pitoisuuksia on edullista steriloida näitä kahta ravinneliuosta sisältävät liuokset erikseen. Tässä keksinnössä on myös tehty se havainto, 15 että biomassan saantoa voidaan parantaa sellaisten fermentaatioiden kyseessä ollessa, joissa on käytetty suuria hiiliravinnepitoisuuksia, jättämällä osa typ- 4 piravinteesta varalle ja syöttämällä jäljellä olevaa typpiravinnetta jatkuvasti tai yhtenä tai useampana eränä fermentaation kuluessa.
#... Toisinaan viljelmässä muodostuu runsaasti vaahtoa. Vaahtoamisen *:·; 20 estämiseksi voidaan lisätä mahdollisesti vaahdonestoainetta, kuten jotakin tä- * · ♦ *; / män alan ammattikokemuksen perusteella tunnettua vaahdonestoainetta, *·1·1 esimerkiksi Mazu 310®:tä tai kasviöljyä.
• ·
Kasvatuslämpötilaa voidaan vaihdella. Sekä ARAa että EPAa muo- 5 • · :···„ : 1·· dostavilla sienillä on kuitenkin taipumus muodostaa vähemmän EPAa ja i : 25 enemmän ARAa kasvatettaessa niitä korkeahkoissa lämpötiloissa. Esimerkiksi
kasvatettaessa Mortierella alpinaa alle 18 °C:ssa se alkaa tuottaa EPAa. Siten I
• on edullista pitää lämpötilaa tasolla, joka indusoi ARAn muodostumista mui-··· .2·. den rasvojen kustannuksella. Sopivat lämpötilat ovat tyypillisesti noin *·1 25 °C:sta noin 30 °C:seen.
** " 30 Kasvatusta jatketaan edullisesti siihen asti, kunnes haluttu biomas- ·1♦ san tiheys saavutetaan. Haluttu biomassa on noin 25 grammaa organismia lit- 2 . rassa. Tällainen biomassa saavutetaan tyypillisesti 48- 72 tunnin kuluessa |; · · .1··. ymppäyksestä. Tällä ajankohdalla organismi sisältää tyypillisesti noin 5 - 40 % monimutkaisia lipidejä, toisin sanoen öljyä, josta noin 10-40 % on ARAa tai 35 edullisesti 40 % ARA-ryhmiä triglyseridifraktiossa, edullisemmin noin 50 % ARAa triglyseridifraktiossa ja se voidaan ottaa talteen.
10 117442
Sienen fermentaatio ARAn muodostamiseksi tämän keksinnön mukaisesti voidaan suorittaa fermentaatiomediumissa, jonka pH on noin 5-8.
• s*
Biomassan, öljyn ja ARAn saantoa M. alpina -viljelmistä voidaan parantaa ^ käyttämällä mediumin pH:n profilointia sen sijaan, että pH:n annettaisiin nous-5 ta sitä säätämättä. Saantoja voidaan parantaa myös pitämällä hapen pitoisuus fermentaation aikana korkeana. Nämä fermentaatiomenetelmän modifikaatiot * ovat erityisen tehokkaita käytettäessä fermentorissa suuria ravinnepitoisuuk- sia.
Kun typpiravinteen pitoisuus fermentointia aloitettaessa ylittää pi- ;; 10 toisuuden, joka vastaa noin 15 grammaa hiivauutetta litraa kohti, ja/tai hiili- ravinteen pitoisuus ylittää pitoisuuden, joka vastaa noin 150 grammaa glu- .
koosia litrassa, voi hiivan kasvu inhiboitua. Tämä kasvun inhibitio voidaan f kiertää käyttämällä syöttöpanosfermentaatiota (fed batch), esimerkiksi jaka- f maila fermentaatioon käytettävä ravinne eriin, jotka syötetään fermentoriin pe- 15 räkkäin sen jälkeen kun aikaisemmasta erästä saatu ravinne on metaboloi- tunut osaksi tai kokonaan. Edut, jotka kasvuinhibitiosta vapautuminen tuottaa, i voidaan saada syöttämällä ainoastaan hiiliravinnetta (tätä kysymystä on käsi- i telty julkaisussa Shinmen et ai.). Tässä keksinnössä on tehty se havainto, että ... tämä hyöty voidaan myös saada jakamalla ravinteet kokonaisuudessaan eriin • · *;**! 20 ja syöttämällä erät fermentaation aikana tai syöttämällä ravinneliuosta jatku- • · · *; vasti. Samalla tavoin on tehty se yllättävä löytö, että tämä etu voidaan saada | syöttämällä fermentaatioon, jossa hiili ravinteen pitoisuus fermentaatiota aloi- § • · "ΐί ·Υ·: tettaessa on suuri, pelkästään typpiravinnetta.
• *·· Tässä keksinnössä on myös tehty se hämmästyttävä havainto, että f
:T: 25 kasvun inhibitiota voidaan lieventää käyttämällä fermentaation pH:n profiloin- I
tia, pitämällä fermentorissa yllä suurta hapen osapainetta tai käyttämällä näitä ^ . molempia. Tässä keksinnössä on tehty se havainto, että fermentoitaessa M.
• · * .·*·. alpinaa runsaasti ravinteita sisältävässä mediumissa, jonka pH on matala (pH =5-6), tämä johtaa biomassan kasvun tehostumiseen (ja myöskin öl- • “ 30 jysaannon suurentumiseen). Näissä olosuhteissa muodostuneessa öljyssä oli- ;...: vat kuitenkin öljyn sisältämien ARA-ryhmien määrät melko pienet. Tästä poi- . .*. keten fermentaatio korkeassa pH-arvossa (pH = 7 - 7,5) johtaa siihen, että öljy .···. sisältää suurehkoja määriä ARAa mutta kasvu on heikompaa. Edullisessa fer- • · mentaatiotavassa tämän keksinnön mukainen fermentaatiomenetelmä sisältää 35 sen, että pH profiloidaan sellaiseksi, että se on fermentaation varhaisissa vai- :"·Λ heissä matala ja myöhäisemmissä vaiheissa korkea. Varhaiset vaiheet si- . 4 117442 11 sältävät nopean (eksponentiaalisen) kasvun vaiheet, jona aikana ravinteet metaboloituvat nopeasti; myöhempiä vaiheita ovat stationaarivaihe, jossa solun jakautuminen pysähtyy, mikä johtuu tavallisesti siitä, että yhtä tai useampaa ravinnetta ei ole riittäviä määriä, ja runsaasti ARAa sisältävän öljyn muo-5 dostuminen tehostuu. Profilointi voidaan suorittaa säätämällä fermentorin pH-arvoja tasoille, jotka säädetään kahdessa tai useammassa vaiheessa fermen-taation kuluessa.
Tässä keksinnössä on samoin tehty se havainto, että kun mediumiin liuenneen hapen määrä (D.O.) pidetään korkeana (esimerkiksi >40 % il- ^ 10 man suhteen kylläisen liuoksen määrästä), tämä johtaa suurien ravinne-pitoisuuksien aikaansaaman kasvun inhibition häviämiseen ja/tai öljyn sisältämien ARA-ryhmien suhteellisen pitoisuuden nousuun. Liuenneen hapen määrä voidaan pitää korkeana lisäämällä kasvatusastian painetta (pakottamalla enemmän ilmaa fermentorin ilmatilaan), parantamalla sekoitusta (esi-15 merkiksi suurentamalla sekoittimen kärjen nopeutta), ja lisäämällä ilmastusta (toisin sanoen lisäämällä fermentorin läpi menevän ilman määrää tietyssä 4 ajassa, joka tavallisesti ilmoitetaan VVM-yksiköissä, ilman tilavuutena fer- '% mentorin tilavuutta kohti minuutissa) ja/tai lisäämällä puhallettavan kaasun 02-... pitoisuutta. Näissä olosuhteissa suoritetun fermentaation on havaittu lisäävän • w ';··] 20 hiilen hyväksikäyttöä, mikä johtaa siihen, että fermentorissa muodostuva bio- V*: massan lopullinen konsentraatio suurenee ja runsaasti ARAa sisältävän öljyn • · ;.v muodostuminen lisääntyy. Erityisesti fermentaatiossa, joissa on käytetty yhtä ϊ.*·| tai useampaa edellä olevaa modifikaatiota, saadaan lopputulos, jonka mukaan fermentaatiossa muodostuu eristettävissä olevaa triglyseridiöljyä, joka sisältää f 25 vähintään 40 % ARA-ryhmiä ja edullisesti vähintään 50 % ARA-ryhmiä.
Erityisen edullisessa sovellutusmuodossa fermentaatiomediumin si- . sältämä hiiliravinnepitoisuus vastaa > 80 g/l glukoosia ja typpiravinnepitoisuus ,··«, vastaa > 16 g/l hiivauutetta, ja mediumin pH säädetään steriloinnin jälkeen ar- • · "* vojen 5 ja 6 välille. Kun ymppäys on suoritettu, mediumin pH pidetään sää- ·· : *·· 30 dettynä fermentaatiota alussa vallinneeseen arvoonsa tai hieman tämän ylä- puolelle. Sitten kun hiiliravinnepitoisuus on laskenut arvoon, joka on <60 . !\ grammaa glukoosiekvivalenttia litrassa (tavallisesti noin 48 tuntia), pH-säädön f .*·*. asetusarvo muutetaan arvoon, joka on likipitäen pH > 6. Ajankohtana, jolloin • * **' hapenottonopeus Oa/tai hiilidioksidin kehittymisnopeus, CER) saavuttaa mak- | 35 simiarvonsa (tavallisesti noin 72 tunnin kuluttua), tai tämän ajankohdan lähei- 4 syydessä, asetusarvo nostetaan pH-arvojen 6,5 ja 7 väliin (tämä tehdään ta 117442 12 vallisesti vähitellen, esimerkiksi nopeudella noin 0,1 pH-yksikköä tunnissa).
Tämän jälkeen pH:ta säädetään sen pitämiseksi fermentoinnin loppuvaiheiden I
aikana suunnilleen pH-arvojen 7 - 7,5 alapuolella.
Tämän sovellutusmuodon kyseessä ollessa liuenneen hapen pitoi-5 suus mediumissa (D.O.) pidetään lähellä 40% sen pitoisuudesta ilman suh- , -.) *4 teen kylläisessä liuoksessa, tai tämän yläpuolella, menetellen edullisesti siten, että kasvatusastian painetta lisätään vaiheittain arvoon 77 kPa (11 psi), sekoitusta lisätään arvoon, joka vastaa sekoittimen pään nopeutta 300 cm/s, ja ilmastusta lisätään arvoon 0,5 tilavuutta ilmaa fermentorin tilavuutta kohti mi-10 nuutissa. Kun fermentaatioseos on ohittanut nopean kasvun ja suuren 02-kulutuksen vaiheen, kasvu (ja 02:n kulutus) pienenee. Tässä vaiheessa voidaan sekoitusta/ilmastusta vähentää sikäli kuin liuenneen hapen määrä säilyy korkeana, tavallisesti yli 40 % sen määrästä ilman suhteen kylläisessä liuoksessa.
15 Optimoimalla M. alpinan fermentaatio tässä keksinnössä kuvatulla ^ tavalla on mahdollista saada erittäin suuria biomassasaantoja, joissa biomas-sa sisältää 20 - 60 % öljyä, jossa 25 - 75 paino-% öljystä on triglyseridimuo-dossa olevia ARA-ryhmiä. Biomassa Qa öljy) voidaan ottaa talteen tässä keksinnössä kuvatulla tavalla. Biomassa otetaan edullisesti talteen fermentorista ... 20 48 tunnin kuluessa siitä, kun fermentaatiossa on saavutettu maksimaalinen • · ··' ri *;··[ tuotantotaso, joka on määritetty grammoina ARAa litrassa päivää kohti. i *· " Organismi voidaan ottaa talteen millä tahansa sopivalla menetel- • · *’.·*.* mällä, kuten esimerkiksi suodattamalla, sentrifugoimalla tai sumutuskuivaa- Λ • · 1 j· maila. Pienehköjen kustannusten vuoksi voi suodatus olla edullista. >
f*.. 25 Kun organismi on otettu talteen, voidaan myseelikakku uuttaa. My- I
:T: seelikakku tarkoittaa talteenoton jälkeen saatua talteenotettua biomassaa.
Kakku voi olla irtonainen tai puristettu, murennettu tai murentamaton. Kakusta . .·. voi olla mahdollisesti poistettu kaikki jäljellä oleva vesi, kuten käyttämällä en- .···. nen uuttoa vakuumikuivausta, leijukuivausta, sumutuskuivausta tai kylmä- , 30 kuivausta. Jos tätä vaihtoehtoa käytetään, on ARAa sisältävän öljyn uuttami- : **· seksi edullista käyttää ei-polaarisia liuottimia. Vaikkakin mikä tahansa ei- * · · **..,·* polaarinen uuttoaine on sopiva, on heksaani edullinen. s . .·. Edullisessa sovellutusmuodossa öljy uutetaan kuivatusta biomas- sasta märkäjauhatuksella tai perkoloimalla juuri tislatun heksaanin avulla. Liu- i • · - £ 35 otinta lisätään tavallisesti siten, että liuottimen ja biomassan väliseksi suhteek- f si saadaan noin 5:1 (w/w). Kiinteät materiaalit erotetaan märkäjauhatuksen 117442 13 jälkeen uutteesta dekantoimalla tai sentrifugoimalla. On edullista pitää liuotinta sisältävä uute (misella) anaerobisena öljyn sisältämien tyydyttymättömien ras- ..¾ vahapporyhmien hapettumisen välttämiseksi. Misellasta poistetaan liuotin ^ puhdistamattoman sieniöljyn aikaansaamiseksi.
5 Sienibiomassasta ei-polaarisilla liuottimilla uutettu puhdistamaton öljy voi olla hahtuvamaista, erityisesti silloin, kun biomassa on jauhettua, koska ? jauhatus voi vapauttaa hienojakoisia partikkeleita, kuten solun seinämän fragmentteja ja liukoisia polysakkarideja. Tällaisen hahtuvamaisen öljyn selkeyttäminen voidaan suorittaa liuottamalla puhdistamaton öljy melko polaarisiin liuot- £ 10 timiin, kuten asetoniin tai alkoholiin. Edullisessa sovellutusmuodossa sienimy-seelin puhdistamaton öljyuute selkeytetään edelleen käyttämällä asetoniuut-toa/saostusta. Asetonimisella valmistetaan lisäämällä asetonia hahtuvamai-seen puhdistamattomaan öljyuutteeseen (edullisesti siten, että öljypitoisuu-deksi saadaan noin 20 %; toisin sanoen noin 4 tilavuusosaa asetonia yhtä 15 puhdistamattoman öljyn tilavuusosaa kohti), sekoittamalla seosta huolellisesti ja antamalla seoksen jäädä paikoilleen riittävän pitkäksi aikaa, jotta hienot j partikkelit saostuvat (tavallisesti huoneenlämpötilaa lähellä olevassa lämpötilassa). Öljypitoinen asetonimisella selkeytetään sentrifugoimalla ja/tai suodattamalla ja liuotin poistetaan tämän jälkeen asetonilla selkeytetyn sieniöljyn ai- ... 20 kaansaamiseksi. Asetonilla selkeytetty sieniöljy on edullinen käytettäväksi jät- • · V?' *;··* komuokkaukseen (esimerkiksi hartsin poistoon, valkaisuun ja hajunpoistoon *·’*:* tavanomaisten menetelmien avulla), koska sienibiomassan uuttamisen aikana j • * ~ *\v muodostuneet hienojakoiset fraktiot häiritsevät raffinointimenetelmää, jos niitä • · ·’.*·· ei poisteta asetonivaiheessa.
25 Vielä yksi edullinen sovellutusmuoto sisältää kuivan biomassan f
vastavirtauuton, joka voidaan suorittaa kaupallisesti saatavilla olevissa uutto- I
laitteissa, esimerkiksi Crown Ironworks -yhtiön valmistamassa laitteessa . .·. (Crown Mark IV ) tai French, Inc. -yhtiön valmistamassa laiteteessa, joita ei ta-
vallisesti käytetä kasviöljyjen eristämiseen vaan jotka on suunniteltu lian ja H
• · ^ 30 mullan erottamiseen. Vaikkakin uuttotehokkuudet eivät biomassan uudelleen- » * : ’·* jauhatuksen puuttuessa ole kovin suuria, on vastavirtauuttomenetelmällä se ·*..*·* etu, että siinä syntyy pienempi määrä "hienojakoisia fraktioita", mikä tämän . !*. ansiosta vähentää puhtaan raffinoidun öljyn talteenottamiseen liittyviä teknisiä • · · *" vaikeuksia. j 35 Vaihtoehtoisesti kostea kakku (joka tyypillisesti sisältää noin 30- 50 % kiintoaineita), voidaan murentaa ja uuttaa suoraan käyttäen polaarisia 117442 14 liuottimia, kuten etanolia tai isopropyylialkoholia, tai ylikriittistä nesteuuttoa liuottimilla, C02:lla tai NO:lla. Kakut murennetaan edullisesti ennen uuttoa. Tä- | män keksinnön avulla on mahdollista käyttää edullisesti taloudellisesti yli- - kriittisen nesteen käyttöön perustuvia uuttomenetelmiä. McHugh, et ai., Su-5 percritical Fluid Extraction, Butterworth (1986). Nämä menetelmät ovat alan ammattikokemuksen perusteella tunnettuja ja niitä ovat menetelmät, joita ny- f kyisin käytetään esimerkiksi kahvipapujen kofeiinin poistoon.
Edullinen vesipitoinen uuttomenetelmä sisältää sen, että myseeli-biomassa yhdistetään polaariseen isopropyylialkoholi-liuottimeen sopivassa 10 reaktioastiassa. Tällaiset astiat ovat tunnettuja. On haluttua käyttää kolmesta kuuteen osaa liuotinta kutakin biomassan osaa kohti. Yhdistäminen suoritetaan edullisesti typen alla tai antioksidanttien läsnä ollessa lipidiuutteen sisältämän ARAn hapettumisen ehkäisemiseksi. Tässä keksinnössä termejä "lipidiuute", "öljy”, "lipidikompleksi" ja "sieniöljy" käytetään toisiaan vastaavina 15 termeinä.
Seos voidaan uuton jälkeen suodattaa biomassan poistamiseksi li-pidiuutetta sisältävästä liuottimesta. Tässä vaiheessa biomassa voidaan ottaa talteen ja käyttää elintarvikkeiden lisäaineena. Tässä keksinnössä "elintarvikkeiden lisäaine" tarkoittaa rehua tai lisäainetta, joka on määrä yhdistää ... 20 tyypilliseen rehuun, kuten jyviin ja muihin näitä vastaaviin materiaaleihin, joita | • · ' >! *···* voidaan antaa eläimille. έ • · · ·:.> :.’*i Liuotin erotetaan lipidiuutteesta ja tämä voidaan myös ottaa talteen • · . * v.; käytettäväksi uudelleen, kuten käyttämällä haihdutusta sopivaan talteenottoas- ·*.*.: tiaan, minkä jäljelle jää materiaalia, josta tässä keksinnössä käytetään nimitys- ί 25 tä "puhdistamaton öljy". Isopropyylialkoholin käytöllä liuottimena on se haluttu * · : % piirre, että se johtaa lopputulokseen, jossa jäljellä oleva vesi saadaan poistu- -¾ maan puhdistamattomasta öljystä kokonaan, koska haihtuminen poistaa spon- . taanisti muodostuneen veden ja isopropyylialkoholin aseotrooppisen seoksen.
Vaikkakin puhdistamatonta öljyä voidaan käyttää ilman jatkokäsitte- | • · «Λ? 30 lyä, se voidaan myös puhdistaa edelleen. Tässä ylimääräisessä puhdistus- -¾ • · : ’·· vaiheessa voidaan käyttää menetelmiä, kuten menetelmiä, joita käytetään le- ' ·**."*: sitiinin valmistamisessa kasvistuotteista ja jotka ovat alan ammattikoke- . ]·. muksella tunnettuja. Nämä menetelmät eivät modifioi kemiallisesti eivätkä ko- • · · \\\ valenttisesti ARAa sisältäviä lipidejä eivätkä itse ARAa.
“** 35 Saannot ovat vaihtelevia, mutta ne ovat tyypillisesti noin 5 grammaa f ARAa sisältävää fosfolipidiä 100 grammasta kuivattua myseeliä. M. alpinan '{.
15 1 1 7442 kyseessä ollessa voidaan saada ylimääräinen 10-50 gramman määrä trigly-seridiä sadassa grammassa kuivaa myseeliä. Joko puhdistamatonta öljyä tai ί puhdistettua tuotetta voidaan käyttää annettavaksi ihmisille. Näiden kummankin on määrä sisältyä tässä keksinnössä käytettyyn termin ARASCO mää-5 ritelmään.
Tämän keksinnön edullisin kohde on saattaa käyttöön lisäaine, joka on tarkoitettu käytettäväksi äidinmaidonvastikkeissa siten, että ARAn konsent-raatio tällaisessa äidinmaidonvastikkeessa vastaa läheisesti ihmisen rintamaidon ARA-konsentraatiota. Taulukossa 2 on verrattu ARASCOn sisältämien 4 10 rasvahappojen koostumusta rintamaidon sisältämien rasvahappojen koostumukseen sekä äidinmaidonvastikkeeseen, josta puuttuu ja joka sisältää ARASCOa.
_itl • · 1 2 3 · ·' 4 • « ·.·;»; *·..· . "s * · · ·..'·? • · 1·’ • · • 1 · • · · * « • · • · · • · ! ! • · * 1 ··· • 1 · • · · · .· • · · • 1 1 • · · * · ♦ - • · * · 1 ···...
• · • ·
♦ M
* 1 « • · - 1' * · • · 1 · · 2 • · ·
(M
3
· S
: : :? • 1 · 117442 16
Taulukko 2 , • · At
Sieniöljytuotteiden ja äidinmaidon rasvahappokoostumus
Rasvahappo ARASCO Äidinmaidon- Äidinmaidon- Rintamaito vastike vastike + öljy 8.0 - 24,1 23,6 0,35 10:0 - 17,7 17,3 1,39 12:0 -- 14,9 14,6 6,99 14:0 4,6 5,8 5,8 7,96 . * 16:0 16,0 6,8 7,0 19,80 16:1 3,2 0,2 0,3 3,20 .
18:0 - 2,3 2,3 5,91 18:1 26,4 10,0 10,3 34,82 ί 18:2n6 9,9 17,4 17,3 16,00 18:3n3 4,1 0,9 1,0 0,62 20:1 2,2 0,1 0,14 1,10 20:2n6 - - - 0,61 v 20:3n6 1,4 - 0,03 0,42 20:4n6 32,0 - 0,64 0,59 20:5n3 - - -- 0,03 ,··*.
22:1 .. .. .. 0,10 * 22:4n6 - - 0,21 ·*.*·.*·· 22:5n6 - — - 0,22 22:6n3 -- - - 0,19 ·· • · * ·· ...
1Simopoulis, A., Omega-3 Fatty acids in Health and Disease pp. 115- 156 4 5 (1990).
• · · *“·* Kuten voidaan havaita, on ARASCOIIa täydennetyssä äidinmaidon- ^ vastikkeen sisältämän ARAn määrä hyvin lähellä ihmisen rintamaidon sisältä- ·*·.. miä ARA-pitoisuuksia. Lisäksi ARASCOn lisäys ei ole muuttanut merkittävästi .*··. äidinmaidonvastikkeen kokonaisrasvahappokoostumusta. Voidaan käyttää ·* 10 tyypillisesti noin 50- noin 100 mg ARASCOa litrassa äidinmaidonvastiketta.
· · *»·* Vaadittu tietty nimenomainen ARASCOn määrä on riippuvainen ARA- pitoisuudesta. Tämä voi vaihdella noin 10:stä noin 70 %:iin öljyn sisältämistä f rasvahapoista. ARA-pitoisuus on tyypillisesti kuitenkin 30 - 50 %. Äidinmaidonvastikkeen täydentämiseen käytetty öljy sisältää edullisesti vähintään 40 % - 117442 17 rasvahapporyhmiä ARAn muodossa, edullisemmin vähintään 50 % ARA-ryhminä. Silloin kun ARA-pitoisuus on noin 30 %, on erityisen edullinen täy- : dentämiseen käytettävä määrä noin 600 - 700 mg ARASCOa litrassa äidin- k maidonvastiketta. Tällainen määrä laimentaa äidinmaidonvastikkeen, kuten 5 Similac® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) olemassa olevia rasvakompo-nentteja ainoastaan yhdellä osalla ARASCOa viidessäkymmenessä osassa äidinmaidonvastikkeen öljyjä. ARA-pitoisuudeltaan suuremmista öljyistä voidaan laskennallisin keinoin saada selville niittä vastaavat laimentumissuhteet.
ARASCO ei edullisesti sisällä olennaisesti lainkaan EPAa. » 10 Kun edellä kuvatussa menetelmässä käytetään Pythium insi- !
diosumia, on uutettu ARAa sisältävä öljy pääasiassa fosfolipidiä. Tässä kek- J
sinnössä on kuitenkin tehty se havainto, että tässä keksinnössä kuvatulla tavalla kasvatetusta P. insidiosumista voidaan myös saada talteen merkittävä määrä runsaasti ARA-ryhmiä sisältävää triglyseridiä. Kun tässä menetelmässä 15 käytetään Mortierella alpinaa, on ARAa sisältävä öljy pääasiassa triglyseridiä.
Molemmat ARASCOn muodot ovat käyttökelpoisia äidinmaidonvastikkeeseen lisättävinä lisäaineina. Edellisestä ei saada äidinmaidonvastikkeeseen ainoas- 1 taan ARAa vaan myös emulgointiainetta, toisin sanoen fosfatidyylikoliinia, jota lisätään tavallisesti kaupallisiin äidinmaidonvastikkeisiin. M. alpinasta peräisin 20 olevan öljyn valmistus on todennäköisesti taloudellisempaa.
• · · Tämän keksinnön mukaisella ARAa sisältävällä öljyllä on monia -jj •V·: käyttömuotoja sen lisäksi, että sitä käytetään lisäaineena äidinmaidonvastik- · ·**:*: keessa. Kuten alan ammattikokemuksen perusteella on tunnettua, liittyy ARAn puutoksiin patologisia tiloja, kuten marasmia [Vajreswari, et ai., Metabolism 39 ·*·„ 25 (1990) 779 - 782], atooppisia sairauksia [Melnik, B., Monatsschr. Kinderheilta • 138 (1990) 162 - 166], maksasairautta, fenyyliketonuriaa, tardiivia dyskinesiaa tai useita erilaisia peroksisomaalisia sairauksia. Yhdessä tämän keksinnön so- . .. vellutusmuodossa näitä patologisia tiloja hoidetaan antamalla potilaalle farma- • · · ; seuttisesti tehokas määrä tämän keksinnön mukaista öljyä. Farmaseuttisesti r; **;·* 30 tehokas määrä on tyypillisesti se määrä, joka tarvitaan normalisoimaan ARAn • *·. pitoisuus potilaan seerumissa. Erityisen edullisia tällaisten patologisten tilojen :***: hoitamiseen tarkoitettaviksi täydennysravinteiksi ovat edellä kuvatut ARA-öljyt, erityisesti öljyt, joissa esiintyy vähintään 40 % ARA-ryhmiä tai edullisemmin :!.** 50 % ARA-ryhmiä. Öljyä voidaan antaa enteraalisesti, paikallisesti tai parente- • *
*···' 35 raalisesti terveydenhoitopalvelun tuottajan valitsemalla tavalla. J
'18' 117442
Kapselointi, sellaisena kuin se on tunnettua tämän alan ammattikokemuksen perusteella, on tehokas enteraalinen annostelumenetelmä. Sieni-öljyä sisältäviä kapseleita voidaan antaa henkilöille, jotka tarvitsevat tai jotka haluavat ruokavalionsa täydennykseksi ARAa. Tällainen menetelmä on erityi-5 sen tehokas ARAn antamiseksi raskaana oleville tai imettäville naisille.
Niissä tapauksissa, joissa ARASCOa annetaan patologisiin tiloihin liittyvän ARAn puutteen torjumiseksi, on annettava farmaseuttisesti tehokas määrä. Tämä määrä on tarpeettomia kokeiluihin turvautumatta mahdollista määrittää alan ammattikokemuksen perusteella. Tämä määrä on tyypillisesti ξ 10 0,5- 2,0 g päivässä, joka määrä normalisoi tavallisesti seerumin ARA- pitoisuuden.
Vielä yksi tämän keksinnön sovellutusmuoto koskee kosmeettisia koostumuksia, jotka sisältävät ARASCOa, kuten tässä keksinnössä kuvattuja runsaasti ARAa sisältäviä öljyjä. Kosmeettiset koostumukset tarkoittavat näitä 15 yhdisteitä, joita käytetään kosmeettisina aineina. Edullinen esimerkki tällaisesta koostumuksesta on ryppyvoide. Tällaiset kosmeettiset koostumukset tarjoavat tehokkaan keinon ARAn levittämiseksi paikallisesti iholle, millä on tarkoitus edistää ihon kiinteyden säilymistä.
Kun tämä keksintö on kuvattu yleisellä tasolla, esitetään seuraavat 20 sitä rajoittamattomat esimerkit sen kuvaamiseksi yksityiskohtaisemmin. / • · · Λ
· -’V
• # • · · : Esimerkki 1 • *· *: * · P. insidiosumin lipidin valmistus ja lisääminen äidinmaidonvastikkee- ^ * · seen > • * · .· ϋ * » ·’· 80 litran vetoiseen (kokonaistilavuus) fermentoriin yhdistettiin 51 lit- ; |, .*:*. 25 raa talousvettä, 1,2 kg glukoosia, 240 grammaa hiivauutetta ja 15 ml Mazu 210S® -vaahdonestoainetta. Fermentori steriloitiin 121 °C:ssa 45 minuuttia.
. Steriloinnin kuluessa lisättiin ylimääräinen 5 litraa kondenssivettä. pH säädet- • I » tiin arvoon 6,2 ja fermentoriin lisättiin noin 1 litra ymppiä (solutiheys 5-10 g/l), • · *·;·* Pythium indisiosumia (ATCC #28 251). Ravistelunopeus säädettiin arvoon • *.. 30 125 kierrosta minuutissa (roottorin kärjen nopeus 250 cm/s) ja ilmastuksen määrä asetettiin arvoon 30 litraa minuutissa [1 SCFM (standardi kuutiojalkaa , \ minuutissa)]. Kun reaktori oli ollut käynnissä 24 tuntia, ilmastuksen määrä ko- • · · .
“I liotettiin arvoon 80 litraa minuutissa (3 SCFM). Kun reaktori oli ollut käynnissä , ***** 28 tuntia, siihen lisättiin vielä 2 litraa 50-%:ista glukoosisiirappia (1 kg glukoo- a 35 siä). Kun reaktori oli ollut käynnissä 50 tuntia, sen sisältö koottiin talteen, mistä ^ Λ 19 117442 saatiin märkäpainoksi noin 2,2 kg (kuivapaino noin 15 g litraa kohti). Talteen otettu biomassa puristettiin kakuksi, jonka kiintoainepitoisuus oli suuri (50 % kiintoaineita) imusuodattimella, minkä jälkeen se kylmäkuivattiin. Kuivattu bio- if massa jauhettiin huhmareella ja männällä ja uutettiin 1 litralla heksaania kuta-5 kin kuivan biomassan 200 grammaa kohti huoneenlämmössä seosta jatkuvasti sekoittaen kahden tunnin ajan. Tämän jälkeen seos suodatettiin ja suodos ! haihdutettiin, mistä saatiin noin 5-6 grammaa puhdistamatonta öljyä kutakin f kuivan biomassan 100 grammaa kohti. Tämän jälkeen biomassa uutettiin uudelleen 1 litralla etanolia kutakin kuivan biomassan 20 grammaa kohti yhden i 10 tunnin ajan huoneenlämmössä, suodatettiin ja liuotin haihdutettiin, mistä saa- § tiin ylimääräinen 22 gramman suuruinen erä puhdistamatonta öljyä kutakin kuivan biomassan 100 grammaa kohti. Toinen fraktio oli pääasiassa fosfolipi- -¾ dejä, kun taas ensimmäinen fraktio sisälsi fosfolipidien ja triglyseridien seosta.
Yhdistetystä fraktiosta saatiin öljyä, joka sisälsi noin 30 -35 % arakidonihappoa 15 eikä lainkaan havaittavissa olevaa EPAa. Tätä öljyä lisättiin pisaroittain kau- | palliseen äidinmaidonvastike-tuotteeseen, SIMILAC® (Ross Laboratories, s
Columbus, Ohio) käyttäen täydentämiseen 60 mg:n määrää valmistetun mediumin litraa kohti.
Esimerkki 2 ϊ ·'*'*: 20 M. alpina -lipidin valmistus ja lisääminen äidinmaidonvastikkeeseen • .
•V·· Mortierella alpinaa (ATCC #42 430) kasvatettiin kahden litran ra-
:Y; vistelupullossa, joka sisälsi 1 litran talousvettä ja 20 grammaa peruna-glu- Y
:*\j koosi-mediumia. Pulloa pidettiin ravistelussa vaakatasossa pyörivällä liikkeellä * ja sitä pidettiin 25 °C:ssa seitsemän päivän ajan. Kun biomassa oli otettu tai- - 25 teen sentrifugoimalla, se kylmäkuivattiin, mistä saatiin noin 8 grammaa run- | • * 'f- säästi lipidiä sisältävää myseeliä. Myseeli uutettiin käyttäen heksaania kuten , esimerkissä 1 ja tässä oli tuloksena noin 2,4 g puhdistamatonta öljyä. Tämä f i .*.*.* öljy sisältää noin 23 % arakidonihappoa ja sitä lisättiin kaupalliseen Similac®- • · *·;** äidinmaidonvastikkeeseen pisaroittain konsentraatioissa 1000 mg litraa kohti.
• · • ·
• M
,*··· 30 Esimerkki 3 • Ϊ *, Arakidonihapon tuotanto suuressa mittakaavassa M. alpinaa käyttäen • « · ."Y Ymppifermentoriin, joka sisältää GYE-mediumia (50 g/l glukoosia ja -¾ '···' 6 g/l Tastone 154:ää) ympätään M. alpinaa. Fermentaatiolämpötila asetetaan arvoon 28 °C, alkuvaiheessa käytettävä ravistelu arvoon 130 - 160 cm/s, alku- i f 117442 20 vaiheessa käytettävä fermentoriastian paine 40 kPa:ksi (6 psi:ksi) ja alkuvai- 1 heessa käytettävä ilmastuksen määrä arvoon 0,25 WM. pH säädetään ennen sterilointia arvoon 5,0 ja fermentaatioseoksen pH säädetään fermentaation aloittamiseksi steriloinnin jälkeen arvoon 5,5. Mediumin pH pidetään arvossa 5 > 5,5 käyttämällä 8 N NaOH:ta. Happipitoisuus pidetään liuenneen hapen määrässä, joka on >40 %, säätämällä ravistelua/ilmastusta seuraavassa järjestyksessä: fermentoriastian paine nostetaan arvoon 77 kPa (11 psi), ravis-telunopeutta lisätään arvoon 175 cm/s roottorin kärjen nopeutena ilmoitettuna; ja ilmastus nostetaan arvoon 0,5 WM. Vaahdon muodostuminen estetään li-10 säämällä tarvittaessa Dow 1520-US -vaahdonestoainetta. (Mediumiin on lisättävä ennen sterilointia vaahtoamisen estämiseksi noin 0,1 ml/l vaahdones- · toainetta). .
Ymppi siirretään ymppäysfermentorista pääfermentoriin 12 tunnin > kuluessa sen jälkeen kun pH on noussut arvoon 6,0 yläpuolelle.
15 Pääfermentori sisältää GYE-mediumia (50 g/l glukoosia ja 6g/l
Tastone 154:ää); glukoosi steriloidaan erikseen ja lisätään pääfermentoriin steriloinnin jälkeen. Fermentorin lämpötila asetetaan arvoon 28 °C, aloitettaessa käytettävä ravistelu arvoon 160 cm/s, aloitettaessa käytettävä fermentoriastian paine 40 kPa:ksi (6 psi:ksi) ja aloitettaessa käytettävä ilmastuksen mää-20 rä arvoon 0,15 VVM. Aloitettaessa käytettävä pH säädetään steriloinnin jäi- I
• · · keen arvoon 5,5 ja mediumin pH pidetään arvossa > 5,5 käyttämällä 8 N Na- * · \*·: OH:ta. pH:n annetaan kohota stationaarivaiheen aikana (tämä alkaa noin f ϊV: 24 tuntia ymppäyksestä) mutta se pidetään arvon 6,8 alapuolella lisäämällä H2S04:ää. Happipitoisuus pidetään liuenneen hapen arvossa, joka on > 40 %, f • · ·*· 25 lisäämällä fermentoriastian paine vaiheittain arvoon 77 kPa (11 psi) lisäämällä :;i • · .r sekoitusnopeutta arvoon 175 cm/s ilmoitettuna roottorin kärjen nopeutena, ja * lisäämällä ilmastusta arvoon 0,5 VVM. Vaahtoaminen estetään lisäämällä tarvittaessa Dow-1520-US -vaahdonestoainetta. (Vaahdonestoainetta on lisät-tävä vaahtoamisen estämiseksi mediumiin noin 0,1 ml/l).
**;·* 30 Viljelmästä otetaan näytteitä joka 12. tunti biomassan ja rasva- j**.. happojen analysoimiseksi ja talteenotto aloitetaan 3 - 4 päivää siitä, kun pH on noussut arvoon 6,5. Kuivan biomassan tiheyden on oltava > 8,5 g/l. Elatus- ? aineen glukoosikonsentraation on pitänyt pudota arvosta 50 g/l arvoon >25 g/l. Elatusaine käsitellään soluja talteenotettaessa kokonaisuudessaan 1, • · ''-'f **··* 35 kuppisentrifugilla myseelin erottamiseksi käytetystä mediumista ja biomassa ? kuivataan.
117442 21
Esimerkki 4 M. alpinasta saatavat biomassan saannon parantaminen - ensimmäinen ^ ajo M. alpinaa kasvatettiin sekoitettavissa 201 säiliöfermentoreissa, jot-5 ka oli ympätty esimerkissä 3 kuvatun menetelmän mukaisesta ravistelu-pulloviljelmästä. Kun M. alpinaa kasvatettiin mediumissa joka sisälsi 65 g/l glukoosia (Staleydex) ja 6 g/l hiivauutetta (Tastone 154), saatiin biomassaa muodostumaan 12 g/l. Kun 16 tunnin kohdalla lisättiin vielä 6 g/l Tastone154:ää, saatiin biomassaa muodostumaan 18 g/l. 1 10 Esimerkki 5 M. alpinasta saatavan biomassan saannon parantaminen - toinen ajo : . 3
Suoritettiin kokeita, joilla tähdättiin biomassan lisäämiseen vielä tästäkin lisäämällä uutta Tastone154:ää. Nämä kokeet koostuivat 2 x 20 I fer- mentaatioseoksista, joissa sieniä pidettiin 168 tuntia. Molempien näiden fer- 15 mentaatioiden kyseessä ollessa oli glukoosikonsentraatio fermentaatiota aloi- y tettaessa 100 g/l (verrattuna esimerkin 4 mukaiseen konsentraatioon 65 g/l).
Yhteen fermentoriin lisättiin Tastone154:ää lisäyksinä, joiden määrä oli 3 x ;·** 6 g/l ja toiseen lisättiin lisäyksiä, joiden määrä oli 4 x 6 g/l. Hiivauutteesta vai- • * * ^ ; / niistettiin konsentroitu liuos, tämä autoklavoitiin ja lisättiin fermentoriin useina ϊ *·*.·* 20 eri ajankohtina steriloinnin jälkeen. ! • * · h-
Ympin valmistamiseksi ympättiin käyttöymppejä (working seeds) f ·· If : *·· (1 ml maseroitua myseeliä) kahteen pulloon, joista kumpikin sisälsi 50 ml GYE-mediumia (100 g/l Staleydexia ja 6 g/l Tastone154:ää) ja viljelmiä kasvatettiin 4 päivän ajan 28 °C:ssa ja nopeudella 150 kierrosta minuutissa. ΐ ; 25 4 päivän kasvatuksen jälkeen elatusaine sisälsi rakeistunutta biomassaa; ra- • · * * .···. keet olivat läpimitaltaan 2 - 5 mm. Kasvu oli näissä pulloissa oletettua hitaam-
..·* paa mahdollisesti siitä syystä, että glukoosin konsentraatio oli suurempi. Bio- J
* a : t" massaa maseroitiin 2x 3 sekunnin ajan Waring-sekoittimessa ja kumpaankin *...·* kahdesta 2,8 l:n Fehrnbach-ymppäyspullosta, joiden nettotilavuus oli 800 ml, * ; 30 lisättiin 25 ml maseraattia. (Aikaisemmissa kokeissa oli käytetty 10 ml mase- • * · * ί ;·**: raattia. Ympin määrää suurennettiin, koska ymppäyspullossa käytettiin pie-
nempää biomassan tiheyttä ja koska suuremman glukoosikonsentraation vuoksi kasvun Fehrnbach-pulloissa odotettiin olevan hitaampaa). Fehrnbach- J
pullojen medium oli glukoosi (Staleydex) 100 g/l ja hiivauute (Tastone154), f 35 8 g/l. Glukoosi ja hiivauute autoklavoitiin erikseen 40 minuutin ajan. Ymppifer- ; \ : 22 117442 mentaation lämpötila pidettiin 28 °C:ssa ja ravistelunopeus oli 100-150 kierrosta minuutissa.
Fehrnbach-pulloissa suoritetun 44 tunnin kasvatuksen jälkeen ymp-pi siirrettiin kahteen 20 litran fermentoriin. Ymppi oli erittäin irtonaisten hyyfi-5 aggregaattien muodossa ja biomassan tiheys oli noin 5,2 g/l.
Asemissa 14 ja 15 sijaitsevat fermentorit, jotka sisälsivät 1,6 kg (10 %) glukoosia (Staleydex), ja Mazu 204 -vaahdonestoainetta (1,6 g liuotet- -i tuna 12,5 litraan R0-H20:ta), steriloitiin 45 minuuttia 122°C:ssa. Tämän jälkeen kumpaankin fermentoriin lisättiin (tunnin 0 kohdalla) 800 ml ymppiä 10 (5 %). Fermentorin käyttömuuttujat olivat: Lämpötila 28 °C,
pH: tämä oli säädetty arvoon 5,5 käyttäen 2 N NaOH:ta ja 2 N
H2S04:ää,
Ilmastus: 0,5 WM, 15 Vastapaine: 20 kPa (0,2 baaria)
Ravistelunopeus (aluksi): 80 cm/s, ja liuenneen hapen määrä: tämä säädeltiin arvoon, joka oli yli 40 %.
Asema 14: 3 x 6 g/l Tastone 154:ää ·...·* Hiivauutetta (Tastone 154:ää) liuotettiin konsentraatioon 96 g/l ja ·*.'·/ 20 tämä autoklavoitiin 1 tunnin ajan. Hiivauutesyötteet, joita käytettiin 3X11 suu- ruisia määriä (1,8 %), lisättiin 0., 20. ja 26. tunnin kohdalla. > 15. tunnin kohdalla liuenneen hapen määrä laski alle 40 %:iin ja ra- r * · ·*. vistelunopeutta lisättiin vähitellen arvoon 175 cm/s aikavälillä 15- 22 tuntia. ^ • Tämän jälkeen liuenneen hapen määrää säädettiin lisäämällä ilmavirtaan hap- • · · 25 pea; happea lisättiin ilmavirtaan aikavälillä 23 - 72 tuntia. Ravistelunopeutta li- ? . sättiin vielä 36 tunnin kohdalta alkaen sen varmistamiseksi, että sisältö se- koittui kunnolla. 48 tuntiin mennessä oli ravistelunopeutta lisätty arvoon ϊ · *;** 200 cm/s; 72 tuntiin mennessä arvoon 250 cm/s ja 80 tuntiin mennessä ar- • ·.. voon 280 cm/s. 120. tunnin kohdalla ravistelunopeus nostettiin arvoon f :*··. 30 290 cm/s, jotta lämpötilaa olisi saatu säädettyä kunnollisesti. 144. tunnin koh- * 4 \ dalla ravistelunopeus laskettiin arvoon 280 cm/s. Γ *.*;* Asema 15: 4 x 6 g/l Tastone 154:ää ' i · ···* Hiivauutetta (Tastone 154), jota käytettiin 384 g, liuotettiin konsent raatioon 96 g/l ja tätä autoklavoitiin 1 tunnin ajan. Hiivauutteen lisäykset, joi-35 den määrät olivat 4x11, (2,4 %), tehtiin 0., 20., 26. ja 32. tunnin kohdalla. * 117442 23 •w
Liuenneen hapen määrä laski 16 tunnin kohdalla alle 40 %:iin ja ra-vistelunopeus nostettiin 23. tuntiin mennessä vähitellen arvoon 175 cm/s. Tämän jälkeen liuenneen hapen määrää säädettiin yli 40 %:ksi lisäämällä ilmavirtaan happea; happea lisättiin ilmavirtaan aikavälillä 23 - 72 tuntia. Ravistelu-5 nopeutta lisättiin vielä 36 tunnin kohdalta alkaen sen varmistamiseksi, että sisältö sekoittui kunnolla. 48 tuntiin mennessä oli ravistelunopeus nostettu arvoon 210 cm/s; 72 tuntiin mennessä arvoon 260 cm/s ja 80 tuntiin mennessä arvoon 290 cm/s. 90 tunnin kohdalla ravistelunopeus laskettiin arvoon 280 cm/s ja 144 tunnin kohdalla ravistelunopeus laskettiin arvoon 260 cm/s.
10 Havainnot:
Molemmissa fermentoreissa oleva biomassa oli ympättäessä erittäin irtonaisten hahtuvaisten hyyfiaggregaattien muodossa. Rakeita alkoi muodostua 24 tuntiin mennessä. Rakeet olivat pieniä (1-3 mm) ja ne sisälsivät pienen keskusytimen ja suuren irtonaisen ääriosan. 48 tunnin kohdalla rakeet 15 olivat suurempia ja ne olivat tarkkarajaisempia. 72 tunnin kohdalla ääriosat olivat kapeampia ja monet irralliset hyyfifragmentit osoittivat, että rakeet olivat fragmentoitumassa. 168 tuntiin mennessä olivat rakeiden ytimet läpimitaltaan 0,5-2 mm, ääriosat olivat kaventuneet ja hyyfit aggregoitumassa paksuiksi säikeiksi, ja esiintyi monia kondensoituneita hyyfiaggregaatteja.
20 Fermentoreissa esiintyi erittäin vähäistä vaahtoamista ensimmäis- ten 24 tunnin aikana. Tämän jälkeen vaahtoaminen lisääntyi ja se estettiin li- f : säämällä käsin vaahdonestoainetta vaahtokerroksen korkeuden noustessa yli :·. 2-4 cm. Vaahtoaminen heikkeni jonkin verran 48 tuntiin mennessä vaikkakin - *·;. sitä esiintyi ajoittain. Vaahtoamista ulostulosuodattimiin esiintyi kummassakin 7
» · I
25 fermentorissa ainoastaan kerran näiden fermentaatioiden aikana. Fermentaa- ; . ‘.:ä . tioihin tarvittiin noin 150 ml vaahdonestoainetta, -f j · » ΐ ;;;* Molempien fermentorien nestepatsaan päälle kertyi huomattava *··.·’ määrä yhteen tarttunutta biomassaa. Tämä ei ole harvinainen ongelma fer- • * f mentoitaessa myseelejä pienissä fermentoreissa, joiden pinta-alan ja tilavuu- | ·***. 30 den suhde on suuri. Yhteen tarttuneen biomassan määrä asemassa 15 näytti • · · * *. lisääntyvän ensimmäisten 24 tunnin aikana, kun pienestä tilavuudesta oli seu- ; · · ;;;* rauksena huomattavaa räiskymistä (nestepinta laski lähelle ylintä roottoria).
Lopullinen tilavuus fermentorissa 168 tunnin jälkeen oli noin 13 litraa.
Mikroskoopilla tarkasteltaessa elatusaineessa osoittautui esiintyvän 35 72 tuntiin mennessä paljon jätettä ja jonkin verran merkkejä vaurioituneista ja atrofioituneista sienten kärjistä oli havaittavissa. Sytoplasman osoitettiin sisäl- 117442 24 tavan öljypisaroita 168 tunnin kohdalla suoritettua niilinpunavärjäystä käyttämällä. öljypisarat olivat erittäin pieniä ja lukuisia, mistä poiketen havaittiin toisinaan suuria öljypisaroita. Biomassan ja Öljyn saanto sekä hiilen ja typen hy- 1 väksikäyttö on esitetty taulukossa 3.
5 Taulukko 3
Fermentaation eteneminen ajan suhteen
Asema 14 3 x 6 g/l hiivauutetta
Loki- Glukoosi NH3 Kuiva- öljy- ARA- Tuotanto- tunti paino pitoisuus pitoisuus kyky (g/l) (mM) (g/l) (kuiva- (% öljyä) (g öljyä/l paino-%) päivässä) - 0 105,0 3,0 0,4 24 97,4 5,9 3,3 4,8% 23,5% 0,16 48 73,7 0 18,3% 7,9% 23,4% 0,72 72 60,3 0 21,0 14,4% 25,4% 1,01 96 48,0 0 22,3 18,3% 27,5% 1,02 120 40,0 25,2 21,1 % 29,4% 1,06 144 34,7 26,6 21,8% 30,9% 0,97 | 168 29,0 27,5 26,1 % 31,3% 1,03 -
♦ · V
:’· : Asema 15 • *: > .*·. 4x6 g/l hiivauutetta .·;· Loki- Glukoosi NH3 Kuiva- Öljy- ARA- Tuotanto- '· *.· : . ' tunti paino pitoisuus pitoisuus kyky .·’ . (g/l) (mM) (g/l) (kuiva- (% öljyä) (g öljyä/l • ♦ · ;;;* paino-%) päivässä) ·’·;··* 0 109,0 2,9,1 0,4 24 103,0 5,1 3,4 4,3% 21,9% 0,15
48 74,1 0,3 23,6 6,8% 23,1% 0,80 I
. \ 72 51,4 0 29,8 10,3% 23,9% 1,02 96 40,0 0 32,7 120 27,9 31,7 18,2% 26,6% 1,15 144 19,8 33,5 20,7% 28,1% 1,16 168 11,0 29,9 21,7% 29,9% 0,93 j 117442 25
Esimerkki 6 M. alpinasta peräisin olevan biomassan saannon parantaminen - kolmas ajo Tällä koesarjalla yritettiin lisätä edelleen muodostuneen tuotteen 5 määrää lisäämällä fosfaatin ja mineraalien pitoisuuksia. Menettely oli olennaisesti samanlaista kuin mitä käytettiin esimerkissä 5, lukuunottamatta sitä, että glukoosi ja Mazu 204 -vaahdonestoaine liuotettiin 12,5 l:n sijaan 11,5l:aan R0-H20:ta tilan jättämiseksi suolaliuoksille, jotka lisättiin 30. tunnin kohdalla.
Asemaan 14 lisättiin ylimääräinen määrä Fe:tä, Zn:ää ja Cu.ta; asemaan 15 li-10 sättiin ylimääräinen määrä fosfaattia sekä Fe:tä, Zn:ää ja Cu:ta.
Asema 14: 3 x 6 g/l Tastone154:ää |
Hiivauute liuotettiin 3 x 1 l:n suuruisissa erissä konsentraatioon 1 96 g/l ja autoklavoitiin 1 tunnin ajan. Yhden litran eriä hiivauuteliuosta lisättiin 0., 22. ja 28. tunnin kohdalla. Hiilidioksidin muodostumisnopeus (CER, fermen- -Λ 15 torissa olevaa metabolianopeutta osoittava suure) lisääntyi eksponentiaalisesti -* 22. ja 28. tunnin kohdalla ja fermentaatioseos oli juuri alkanut tarvita emästä.
Syötteenä käytetyt suolat sisälsivät: O FeCI36H20:ta 480 mg 7 ¾
ZnS04 7H20:ta 240 mg J
20 CuS04 5 H20:ta 16 mg . 7 * : FeCU liuotettiin 1 litraan sitruunahappoa, jonka konsentraatio oli . *; :·, 5 g/l. Jäljellä olevat suolat lisättiin ja pH säädettiin arvoon 4,5 NaOHdla. Syöt- £ : ·· ,...t teenä käytetyt suolat lisättiin 30. tunnin kohdalla.
* * Fermentorin ravistelunopeus oli alussa 50 cm/s alun perin suun- 25 nitellun arvon 80 cm/s sijaan, koska fermentorin sisältämän nesteen lähtötaso • * * . ;;;* (13 I) johti siihen, että ylin roottori oli juuri ja juuri pinnan alla, ja suuremmasta ? *··.** ravistelunopeudesta oli tuloksena merkittävästi enemmän räiskymistä. Liuen- neen hapen pitoisuus laski 16. tunnin kohdalla alle 40 %:iin ja ravistelu- ;***. nopeutta lisättiin vähitellen arvoon 175 cm/s 28. tuntiin mennessä. Tämän jäi- ·. 30 keen liuenneen hapen määrää säädettiin yli 40 %:ksi lisäämällä ilmavirtaan J * · ;;;* happea. Ravistelu nopeutta lisättiin vielä 46 tunnin kohdalla sen mahdollista- *···* miseksi, että sisältö sekoittui. 48 tuntiin mennessä oli ravistelunopeus nostettu arvoon 200 cm/s; 51 tuntiin mennessä arvoon 220 cm/s ; 53 tuntiin mennessä arvoon 235 cm/s ; 56 tuntiin mennessä arvoon 250 cm/s ; 57 tuntiin mennessä 35 arvoon 260 cm/s ja 70 tuntiin mennessä arvoon 280 cm/s. Sekoittuminen oli 26 117442 heikkoa vieläpä tällä sekoitusnopeudella (450 kierrosta minuutissa). Vaikkakin oli mahdollista pitää yllä minimikriteeriä "jonkin verran liikettä", oli biomassan kiertyminen erittäin hidasta, ja jotkin alueet olivat lähellä pysähtymistä. Muuta- ;i man vaahdonestoainepisaran lisääminen pienensi liuoksen päällä olevan 5 vaahdon määrää ja poisti paikallaan pysyvät taskut. Ravistelunopes alennettin 116. tunnin kohdalla arvoon 265 cm/s ja se alennettiin edelleen 120, tunnin kohdalla arvoon 250 cm/s. -
Fermentori alkoi vaahdota noin 18. tunnin kohdalla. Vaahtoaminen estettiin lisäämällä vaahdonestoainetta käsin. Vaahdonestoainetta lisättiin en-10 sin 20. tunnin kohdalla. Fermentaatioseos vaahtosi merkittävästi 24. tuntiin mennessä ja siihen oli tarpeellista lisätä säännöllisesti vaahdonestoainetta. Vaahtoaminen oli suurimmaksi osaksi lakannut 72. tuntiin mennessä. Fermen-taatio vaati kuitenkin ajoittaista vaahdonestoaineen lisäämistä.
Biomassa oli 24. tuntiin mennessä erittäin irtonaisten rakeiden (1 -15 2 mm) ja irtonaisten hyyfiaggregaattien muodossa. Esiintyy huomattavasti so- lujätettä. Biomassa oli 48. tuntiin mennessä erittäin irtonaisten hyyfiaggre- « gaattien muodossa, ytimiltään hyvin pienten ja ääriosiltaan irtonaisten erittäin pienten rakeiden (1 - 2 mm) ja sellaisten pienten kompaktien rakeiden (1-3) ·*,’*,'·· muodossa, joissa ei esiintynyt irtonaisia ääriosia. 96. tuntiin mennessä bio- .**·.: 20 massa oli kompaktien pyöreiden rakeiden (1 - 2 mm), neulamaisten rakeiden • · i (alle 0,5 mm) ja irtonaisten hyyfiaggregaattien muodossa. 144. tunnin kohdalla f • · suoritettu niilinpunavärjäys osoitti, että myseeleissä esiintyi erittäin pieniä öljy- ^ .*·. * pisaroita. ! { *t ,...t Asema 15: 3 x 6 g/l Tastone154:ää 25 Hiivauute liuotettiin konsentraatioon 96 g/l ja tätä autoklavoitiin , 1 tunnin ajan. Hiivauuteliuosta lisättiin 3x1 l:n suuruisina määrinä 0., 22. ja 26. tunnin kohdalla. CER lisääntyi eksponentiaalisesti 22 - 26 tunnin kohdalla *·..·* ja fermentaatioseos alkoi juuri vaatia emäslisäystä.
Valmistettiin syötettävä suolaseos, joka sisälsi: j—. 30 KH2P04:ää 77 g :ί ·’ FeCI36H20:ta 480 mg **;/;·* ZnS04 7H20:ta 240 mg *··.** CuS04 5 H20:ta 16 mg
FeCI3 liuotettiin 1 l:aan sitruunahappoa, jonka konsentraatio oli 5 g/l.
35 KH2P04 liuotettiin 500 ml:aan RO-vettä. Molempia liuoksia autoklavoitiin i!
' . . . L
117442 27 :';ί 1 tunnin ajan, minkä jälkeen ne jäähdytettiin 23 °C:seen, ja ne yhdistettiin.
Tämän jälkeen ne lisättiin fermentoriin 30. tunnin kohdalla.
Fermentorin ravistelunopeus oli alussa 50 cm/s alun perin suunnitellun arvon 80 cm/s sijaan, koska fermentorin sisältämän nesteen lähtötaso 5 (13 1) johti siihen, että ylin roottori oli juuri ja juuri pinnan alla ja suurempi ra vistelunopeus olisi johtanut merkittävästi voimakkaampaan räiskymiseen. Liuenneen hapen pitoisuus laski 16. tunnin kohdalla 40 % alapuolelle ja ravistelunopeus nostettiin 27 tuntiin mennessä vähitellen arvoon 175 cm/s. Tämän jälkeen liuenneen hapen määrää säädettiin yli 40 %:ksi lisäämällä ilmavirtaan 10 happea. Ravistelunopeutta lisättiin 41 tunnin kohdalla sen mahdollistamiseksi, että sisältö sekoittui vähintään minimaalisesti. 42 tuntiin mennessä oli ravistelunopeutta nostettu vielä arvoon 220 cm/s; 46 tuntiin mennessä arvoon 230 cm/s ; 51 tuntiin mennessä arvoon 235 cm/s ja 70 tuntiin mennessä arvoon 240 cm/s. Sekoittuminen oli tällä sekoitusnopeudella (410 kierrosta mi-15 nuutissa) heikosta kohtalaiseen. Sekoitus piti yllä ainoastaan mahdollisimman pientä biomassan liikettä. Sekoitusnopeus laskettiin 80. tunnin kohdalla arvoon ; 205 cm/s.
Fermentori alkoi vaahdota noin 18 tunnin kohdalla. Vaahtoaminen estettiin lisäämällä vaahdonestoainetta käsin. Vaahdonestoainetta lisättiin ensi :*·.· 20 17 tunnin kohdalla. Fermentaatioseos vaahtosi merkittävästi 20. tuntiin men- • · £
:*·*. nessä ja siihen oli tarpeellista lisätä vaahdonestoainetta säännöllisesti. Vaah- I
• «* > .·. i toaminen oli lakannut suurimmaksi osaksi 72. tuntiin mennessä. Fermen- *. *: :·. taatioseos vaati silti ajoittaista vaahdonestoaineen lisäämistä. * i ·· ... Biomassa oli 24. tuntiin mennessä erittäin irtonaisten rakeiden (1 - < 25 2 mm) muodossa ja irtonaisten hyyfiaggregaattien muodossa. Esiintyi huo- , mättävä määrä solujätettä. Biomassa 48. tuntiin mennessä muodossa, joka si- • * * ;;;* sälsi erittäin irtonaisia hyyfien aggregaatteja, ytimiltään hyvin pieniä ja äärio- **·.** siltaan irtonaisia erittäin pieniä rakeita (1 - 2 mm) sekä pieniä kompakteja ra- keitä (1 - 3), joissa ei ollut irtonaisia ääriosia. 96. tuntiin mennessä biomassa :***. 30 oli muodossa, jossa esiintyi pyöreitä rakeita, joiden läpimitta oli 1 - 2 mm ja 1 • · · *. joista monissa esiintyi irtonaisia karvamaisia ääriosia, sekä monia irtonaisia ♦ * * ;f;* hyyfien fragmentteja. 144. tunnin kohdalla suoritettu niilinpunavärjäys osoitti, • « *.··* että joissakin myseeleissä esiintyi monia hyvin pieniä öljypisaroita ja muissa myseeleissä esiintyi kauttaaltaan myöskin hyvin suuria öljypisaroita.
35 Asemassa 15, joka poikkesi asemasta 14 ainoastaan sen perusteella, että tähän oli lisätty fosfaattia, havaittiin sekoittumisen olevan parempaa | ' -¾ 117442 28 koko fermentaation ajan, tavallisesti pienemmillä sekoitusnopeuksilla. Aseman 15 biomassan morfologia oli myös "irtonaisempaa". Biomassa- ja öljysaanto * sekä hiilen hyväksikäyttö on esitetty taulukossa 4. Suuremman fosfaattipitoi-suuden sisältävälle fermentorille oli luonteenomaista, että glukoosin hyväksi-5 käyttö oli suurempaa (aseman 15 kyseessä ollessa 82 g/l verrattuna aseman 14 kyseessä ollessa saatuun arvoon 64 g/l), suurempi biomassan kerääntymi-nen ja suurien öljypisaroiden esiintyminen osissa myseelejä.
Taulukko 4
Fermentaation eteneminen ajan suhteen *
Asema 14 + suolat :
Lokitunti Glukoosi Kuiva- öljy- ARA- Tuotanto- paino pitoisuus pitoisuus kyky (g/l) (g/l) (kuiva- (öljy-%) (g öljyä/l paino-%) päivässä) ^ 0 116,0 1,1 24 101,0 1,8 1,2% 22,2% 0,02 48 84,0 14,3 6,2% 24,7% 0,44 72 60,0 24,5 10,6% 24,2% 0,87 i 96 45,0 28,2 15,5% 25,3% 1,09 | 120 34,0 28,9 18,1 % 26,6% 1,05 - ‘ 144 27,0 30,8 20,8% 27,2% 1,07 ··. Asema 15 ·,··* + suolat + fosfaatit , Lokitunti Glukoosi Kuiva- öljy- ARA- Tuotanto- *:: “ paino pitoisuus pitoisuus kyky '*;** (g/l) (g/l) (kuiva- (öljy-%) (g öljyä/l ·· • *.. paino-%) päivässä) | :**·: 0 113,0 0,4 ^ . 24 101,0 2,1 1,1 % 24,0% 0,02
48 74,0 21,7 8,1% 24,7% 0,88 I
: 72 51,0 26,2 19,9% 26,5% 1,74 * 96 31,0 30,1 25,5% 28,6% ? 120 18,0 33,8 31,7% 31,4% 2,14 144 6,0 34,5 36,0% 32,9% 2,07 117442 29
Esimerkki 7
Arakidonihappoa sisältävän M. alpina -biomassan tuotanto suuressa mittakaavassa 5 Ymppifermentori, joka sisälsi GYE-mediumia (50 g/l glukoosia ja
6 g/l Tastone154:ää) ympätään kasvatusfermentorista. Lämpötilana pidetään L
28 °C ja ravistelunopeus asetetaan aluksi arvoon 130- 160cm/s (noin 43 kierrosta minuutissa). Fermentoriastian paine on aluksi 40 kPa (6 psi) ja ilmastuksen määrä asetetaan aluksi arvoon 0,25 VVM. pH säädetään ennen 10 sterilointia arvoon 5,0, ja fermentorin pH säädetään steriloinnin jälkeen fer-mentoinnin aluksi arvoon 5,5. Mediumin happipitoisuus pidetään liuenneen hapen arvossa, joka on > 40 % käyttämällä peräkkäisiä vaiheita, jotka olivat: (i) fermentointiastian paine nostetaan arvoon 77 kPa (11 psi) (ii) ravistelunopeus nostetaan arvosta 156 arvoon 175cm/s roottorin kärjen nopeutena ilmoitet-15 tuna, ja (iii) ilmastus lisätään arvoon 0,5 WM. Vaahtoaminen estetään lisäämällä tarvittaessa vaahdonestoainetta Dow1520-US. (Noin 0,1 ml/l vaahdon-estoainetta on lisättävä mediumiin ennen sterilointia vaahtoamiseneston helpottamiseksi). Viljelmää pidetään ymppäyksen jälkeen pH-arvossa > 5,5 käyt- ***"; tämällä 8 N NaOH.’ta.
··· .·’·.· 20 Ymppifermentorin sisältö siirretään pääfermentoriin 12 tunnin ku-
• · -V
luessa siitä, kun pH on noussut arvon 6,0 yläpuolelle. Pääfermentorimedium ·..* .*. : sisältää: *· ·: :·. 80 g/l glukoosia (ADM) i · · 16 g/l soijajauhoa (ADM nutrisoy) 25 30 mg/l FeCI3*6 H20 (Sigma/AIdrich) 1,5 mg/l ZnSO„»7 HzO (Sigma/AIdrich) .
0,1 mg/l CuS04«5 H20 (Sigma/AIdrich) *·..** 1 mg/l biotiiniiä (Sigma/AIdrich) 2 mg/l tiamiini»HCI:ää (Sigma/AIdrich) f 30 2 mg/l pantoteenihappoa (hemikalsiumsuola) (Sigma/AIdrich).
• · · ·. (pH säädetään ennen sterilointia arvoon 4,8 - 5,0).
• * « O Syöttöfermentori ympätään pääfermentoriin (11,8 %). Fermentorin lämpötilaa pidetään arvossa 28 °C. Ravistelunopeus asetetaan aluksi arvoon 162 cm/s (noin 23 kierrosta minuutissa), fermentointiastian paineeksi asete- i . · ' i, 35 taan aluksi 40 kPa.ksi (6 psi.ksi) ja ilmastuksen määräksi aluksi arvo 0,15 > WM [noin 8,5 m3 tunnissa (300 SCFH)].
117442 ' ' 30 ' ; :'t
Mediumin happipitoisuus pidetään liuenneen hapen arvossa > 40 % käyttämällä i) fermentointiastian paineen kohottamista arvoon 77 kPa (11 psi), ii) ravistelunopeuden lisäämistä arvoon 300 cm/s, roottorin kärjen nopeuden : perusteella ilmoitettuna (käyttäen lisäyksiä jotka ovat noin 30 cm/s) in) ilmas-5 tuksen kohottamista arvoon 0,5 WM.
pH profiloidaan seuraavan pH:n säätöohjelman mukaisesti: • pH asetetaan aluksi arvoon 5,5 steriloinnin jälkeen. pH pidetään arvossa > 5,5 käyttämällä 8 N NaOH:ta.
• 24 - 36 tunnin kuluttua ymppäyksestä tehdään lisäys, joka on:
10 2 g/l KH2P04:ää (110 kg noin 700 l:ssa H20:ta). J
• 48 tunnin kohdalla pH:n säätöpiste asetetaan arvoon > 6,1, jos I
glukoosikonsentraatio on < 60 g/l.
• 72 tunnin kohdalla pH:n asetuspistettä ryhdytään hitaasti kohottamaan arvoon > 6,6 nopeudella noin 0,1 pH-yksikköä tunnissa.
15 «pH pidetään arvon 7,3 alapuolella lisäämällä tarvittaessa H2S04:ää. ·.
Fermentorista otetaan näytteitä biomassa- ja rasvahappoanalyysiä varten joka 12. tunti ja talteenotto aloitetaan noin 3 päivää sen jälkeen, kun pH on kohotettu arvoon >6,6 (noin 6 päivää ymppäyksestä). Kuivan biomassan :**.· 20 tiheyden on oltava > 24 g/l. Elatusaineen glukoosikonsentraation on oltava .4 laskenut arvosta 80 g/l arvoon < 14 g/l.
· : Materiaali kootaan talteen johtamalla koko elatusaine pyörivän va- :·. * kuumisuodattimen läpi myseelin erottamiseksi käytetystä mediumista.
,· ·· t .•..t Tulokset tämän esimerkin mukaisen menettelytavan mukaisesta * * 25 kahdesta tyypillisestä fermentaatioajosta on esitetty taulukoissa 5 ja 6.
' .7Γ 1 · Ί' • ^ • · · • * ♦ • · · ··* * · ' • # ··· • ♦ : ·· ·5· : : λ *·· • s • *·· * · · ··# ··· 117442 31 1
Taulukko 5 M. alpina -fermentaation eteneminen
Kasvatusmediumit = glukoosi (80 g/l) + soijajauho (16 g/l) + suolat + vitamiinit lokitunti Glukoosi NH3 Kuiva- Öljy- ARA- Tuotanto ni) (mM) paino pitoisuus pitoisuus kyky (g/l) (kuiva- (öljy-%) g öljyä/l paino-%) päivässä 0 58,0 66 43,0 : 12,6 14,9 % 33,7% 0,68 94 33,0 17,0 27,0% 40,0% 1,17 f 118 23,0 20,6 28,2% 42,6% 1,18 142 16,0 17,1 39,2% 44,2% 1,13 165 9,6 21,5 41,5% 45,5% 1,30 188 5,2 19,8 41,7% 47,3% 1,05 215 1,7 23,2 46,0% 48,9% 1,19 237 0,2 23,1 44,8% 51,2% 1,05
O
.·.. Taulukko 6 ;; *, · ·.'?? 5 M. alpina -fermentaation eteneminen f ·*** :‘,m: Kasvatusmediumit = glukoosi (65 g/L) + soijajauho (16 g/l) + suolat + vitamiinit + an- ;·. * tibiootit ·*
Glukoosi NH3 Kuiva- öljy- ARA- Tuotanto- • · (g/l) (mM) paino pitoisuus pitoisuus kyky - , (g/l) (kuiva- (öljy-%) g öljyä/l • · · ;;;* paino-%) päivässä 65 36,0 13,0 8,2 % 29,0% 0,39 | :**·; 90 23,0 12,0 18,0% 42,0% 0,58 t *; * 115 15,0 14,0 30,0% 47,0% 0,88 ] 139 9,0 15,0 32,0% 51,0% 0,83 f *’···*’ 171 4,0 17,0 36,0% 55,0% 0,86 209 1,4 12,0 36,0% 57,0% 0,50 - 243 0 14 37,0% 60,0% 0,51 ^ 187 0 13 34,0% 64,0% 0,57 f

Claims (22)

117442
1. Arakidonihappoa sisältävän öljyn valmistusmenetelmä, joka mainittu öljy sisältää triglyseridejä, joissa vähintään 25% rasvahapporyhmistä 5 ovat arakidonihappoa (ARA) ja öljyn sisältämien eikosapentaeenihapporyhmi-en (EPÄ) määrä ei ylitä viidesosaa arakidonihapporyhmien (ARA) määrästä, t u n n e 11 u siitä, että menetelmä käsittää sen, että (a) kasvatetaan Mortierella sp:tä elatusainetta sisältävässä ilmastetussa fermentorissa, 10 (b) pidetään pH kasvatuksen alkuvaiheessa pH-arvojen 5 ja 6 väli sellä alueella; (c) pidetään pH kasvatuksen lopussa pH-arvojen 7 ja 7,5 välisellä alueella; v (d) kootaan biomassa talteen fermentorista ja otetaan mainittu ara- 15 kidonihappoa sisältävä öljy talteen mainitusta biomassasta. -’(i
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e 11 u siitä, ..* että fermentoinnin kuluessa elatusaineeseen lisätään hiilen lähdettä määrä, joka vastaa yli 80 g/l glukoosia, ja typen lähdettä määrä, joka vastaa yli 15 g/l ... hiivauutetta. • · s· ;·'! 20
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu * i · / siitä, että elatusaineen sisältämä liuenneen hapen pitoisuus on vähintään 35. ilman kylläisyystasosta.
• · *.**: 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetelmä, f • · : *·· tunnettu siitä, että typpilähde jaetaan kahteen tai useampaan erään, jot- f, :V: 25 ka syötetään fermentoriin eri aikoina siten, että vähintään yksi erä syötetään ; fermentoriin ajankohtana, joka poikkeaa siitä ajankohdasta, jolloin hiilen läh- . dettä lisätään fermentoriin.
' • · ♦ *·· : .-·*. 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, 'y tunnettu siitä, että Mortierellaspon Mortierellaalpina. • ** 30
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 - 5 mukainen menetelmä, • · · tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää sen, että puhdistamaton arakidoni- ; happoa sisältävä öljy otetaan talteen biomassasta uuttamalla ei-polaarisella * · · .·*·. liuottimena ja puhdistamaton öljy selkeytetään uuttamalla polaarisella orgaani sella liuottimena.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, .: „ että ei-polaarinen liuotin on heksaani. ; 33 1 1 7 4 4 2
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, t u n n e tt u siitä, f että polaarinen liuos on asetoni, etanoli tai isopropyylialkoholi.
9. Modifioimaton triglyseridisieniöljy, tunnettu siitä, että yli 50 : % rasvahapporyhmistä on arakidonihapporyhmiä (ARA) triglyseridimuodossa 5 ja että öljy käsittää eikosapentaeenihappoa (EPÄ) korkeintaan kymmenesosan arakidonihapon (ARA) määrästä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen modifioimaton triglyseridisieniöljy, tunnettu siitä, että öljyn triglyseridit käsittävät vähintään 50 % arakidonihappoa (ARA) mutta eivät olennaisesti lainkaan eikosapentaeeni- 10 happoa (EPÄ).
11. Menetelmä arakidonihappoa (ARA) sisältävän triglyseridin käyt- ; tämiseksi äidinmaidonvastikkeessa, t u n n e tt u siitä, että menetelmä sisältää sen, että patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukaista modifioimatonta triglyseri-disieniöljyä lisätään äidinmaidonvastikkeeseen määrä, joka riittää saamaan ai- 15 kaan ihmisen rintamaidon sisältämää arakidonihappomäärää vastaavan araki-donihappopitoisuuden.
12. Äidinmaidonvastike, joka sisältää triglyseridiä, joka sisältää ihmisen rintamaidossa esiintyvää määrää vastaavan määrän arakidonihappoa (ARA), t u n n e tt u siitä, että arakidonihappo (ARA) on saatu lisäämällä äi- 20 dinmaidonvastikkeeseen riittävä määrä patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukaista • · * *; / modifioimatonta sieniöljyä.
*·*·* 13. Menetelmä sellaisen farmaseuttisen valmisteen valmistamisek- • * 'lii. •V*: si, joka on tarkoitettu arakidonihapon (ARA) antamiseksi ruokavalion täyden- | • · X • '·· tämiseksi sitä tarvitsevalle ihmiselle, tunnettu siitä, että menetelmä käsit- | 25 tää patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukaisen modifioimattoman sieniöljyn formu- | loimisen farmaseuttisesti hyväksyttävään annosmuotoon, jolloin mainittu far- 1 : ;*· maseuttinen valmiste on formuloitu antamaan sellaisen määrän arakidonihap- • · · .**·. poa (ARA), joka on riittävä antamaan ruokavaliota täydentävän määrän araki- ..· donihappoa (ARA) ihmiselle. a • · : 30
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu sii- I • · · tä, että mainittu farmaseuttinen koostumus on formuloitu antamaan 0,2 - 0,8 g * : arakidonihappoa (ARA) päivässä. * ♦ · ... f .**·.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tun- n e 11 u siitä, että mainittu farmaseuttinen koostumus on farmaseuttisesti hy- 35 väksyttävä enteraalisesti annettavaksi. ' *4 117442
16. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että mainittu farmaseuttinen koostumus on farmaseuttisesti hyväksyttävä parenteraalisesti annettavaksi. i
17. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tun-5 n e 11 u siitä, että mainittu farmaseuttinen koostumus on farmaseuttisesti hyväksyttävä paikallisesti annettavaksi.
18. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ihminen on raskaana oleva nainen tai " imettävä äiti.
19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13 -17 mukainen menetel- „ mä, tunnettu siitä, että mainittu arakidonihapon (ARA)täydennystä tarvitseva ihminen sairastaa neurologista tautia.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, t u n n e tt u siitä, että neurologinen tauti on tardiivi dyskinesia, skitsofrenia tai peroksisomaa- 15 linen tauti.
21. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu arakidonihapon (ARA) täydennystä tarvitseva ihminen sairastaa tautia, joka liittyy seerumin arakidonihappopitoisuuden piene- ... nemiseen. ';**! 20
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tu n nettu sii- > * f · *; " tä, että sairaus on maksasairaus, fenyyliketonuria tai kystinen fibroosi. 1 • » · • · · • t • » * · · . · . r»1. • · 1 ·" 1 • · Φ 1 : ·· * · · • · 1 • 1 · * •·φ· • φ · * 1 1 • · · • · • · · 1 i • · • φ Φ ΦΦ Sl • , iTV ! ΦΦΦ Φ Φ Φ · Φ Φ · • Φ Φ Φ Φ Φ Φ · Φ t · Φ Φ Φ · • t Φ · · 117442
FI972829A 1995-01-03 1997-07-01 Arakidonihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö FI117442B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36788195 1995-01-03
US08/367,881 US5658767A (en) 1991-01-24 1995-01-03 Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US9600182 1996-01-03
PCT/US1996/000182 WO1996021037A1 (en) 1995-01-03 1996-01-03 Arachidonic acid and methods for the production and use thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI972829A0 FI972829A0 (fi) 1997-07-01
FI972829A FI972829A (fi) 1997-09-02
FI117442B true FI117442B (fi) 2006-10-13

Family

ID=23449013

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI972829A FI117442B (fi) 1995-01-03 1997-07-01 Arakidonihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö
FI20060617A FI120648B (fi) 1995-01-03 2006-06-26 Menetelmä arakidonihapon valmistamiseksi

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20060617A FI120648B (fi) 1995-01-03 2006-06-26 Menetelmä arakidonihapon valmistamiseksi

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5658767A (fi)
EP (5) EP2322642A3 (fi)
JP (6) JP4014219B2 (fi)
KR (6) KR20120073363A (fi)
CN (4) CN101560529B (fi)
AT (1) ATE239088T1 (fi)
AU (1) AU713567B2 (fi)
BR (1) BR9607179B1 (fi)
CA (1) CA2209513C (fi)
DE (2) DE69627816T2 (fi)
DK (1) DK0800584T3 (fi)
EA (1) EA001036B1 (fi)
ES (1) ES2197233T3 (fi)
FI (2) FI117442B (fi)
HK (1) HK1085768A1 (fi)
NO (1) NO320117B1 (fi)
PL (1) PL187694B1 (fi)
PT (1) PT800584E (fi)
WO (1) WO1996021037A1 (fi)

Families Citing this family (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060094089A1 (en) * 1988-09-07 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) * 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US5583019A (en) 1995-01-24 1996-12-10 Omegatech Inc. Method for production of arachidonic acid
EP1886679A3 (en) * 1995-06-07 2008-05-28 Martek Biosciences Corporation Methods for controlling highly unsaturated fatty acid content in various tissues
US6428832B2 (en) * 1996-03-26 2002-08-06 Dsm N.V. Late addition of PUFA in infant formula preparation process
ES2463815T3 (es) † 1996-03-26 2014-05-29 Dsm Ip Assets B.V. Agregado tardío de pufa en el transcurso del proceso de preparación de una leche maternizada
US20030143659A1 (en) * 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
JP3995290B2 (ja) 1996-08-23 2007-10-24 サントリー株式会社 オメガ９系高度不飽和脂肪酸及びそれを含有する脂質の製造方法
JP3792309B2 (ja) 1996-08-30 2006-07-05 サントリー株式会社 不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
JP4633204B2 (ja) * 1996-10-11 2011-02-16 サントリーホールディングス株式会社 アラキドン酸含有食用油脂およびそれを含有する食品
JP4197744B2 (ja) 1996-12-27 2008-12-17 サントリー株式会社 微生物培養用培地、並びに不飽和脂肪酸またはこれを含有する脂質の製造方法
CZ299290B6 (cs) * 1997-02-20 2008-06-11 Dsm Ip Assets B.V. Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia
US6080787A (en) * 1997-02-21 2000-06-27 Abbott Laboratories Methods for reducing the incidence of necrotizing enterocolitis
EP1039892B1 (en) 1997-02-21 2004-04-28 Abbott Laboratories Use of polyunsaturated fatty acids for reducing the incidence of necrotizing enterocolitis
DE69840022D1 (de) * 1997-03-04 2008-10-30 Suntory Ltd Verfahren zur herstellung von hochungesättigten fettsäuren und hochungesättigte fettsäuren enthaltendes lipid
US7745694B1 (en) 1997-04-11 2010-06-29 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US5968809A (en) * 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US5948413A (en) * 1997-07-17 1999-09-07 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and vaccine for treatment of pythiosis insidiosi in humans and lower animals
ES2188855T3 (es) * 1997-07-22 2003-07-01 Nestle Sa Composicion lipida para formula infantil y procedimiento de preparacion.
GB9802561D0 (en) * 1998-02-07 1998-04-01 Zeneca Ltd Mortierella
US20070141181A1 (en) * 1998-02-13 2007-06-21 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents, anti-catabolic agents, antioxidant agents, and analgesics for protection, treatment and repair of connective tissues in humans and animals
US6451771B1 (en) 1999-02-12 2002-09-17 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents anti-catabolic agents and antioxidant agents for protection treatment and repair of connective tissues in humans and animals
US6797289B2 (en) 1998-02-13 2004-09-28 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents, anti-catabolic agents, antioxidant agents, and analgesics for protection, treatment and repair of connective tissues in humans and animals
DK1087669T4 (da) † 1998-06-17 2010-11-29 Dsm Ip Assets Bv Havdyrfodersammensætning omfattende mikrobielt afledt arachidonsyre
JP2000069987A (ja) * 1998-08-28 2000-03-07 Suntory Ltd アラキドン酸含有脂質並びにジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の製造方法
AU6503699A (en) * 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
DE69935995T3 (de) * 1998-10-15 2011-02-10 Dsm Ip Assets B.V. Polyungesättigen fettsäuren nährungsergänzung
US6166231A (en) * 1998-12-15 2000-12-26 Martek Biosciences Corporation Two phase extraction of oil from biomass
GB9901808D0 (en) * 1999-01-27 1999-03-17 Scarista Limited Drugs for treatment of psychiatric and brain disorders
GB9916537D0 (en) * 1999-07-14 1999-09-15 Univ Hull Culture of microorganisms for the synthesis of a polyunsaturated fatty acid
EP2295595B1 (en) * 2000-01-19 2019-05-01 DSM IP Assets B.V. Solventless extraction process
DE60130737T3 (de) * 2000-01-28 2016-01-14 Dsm Ip Assets B.V. Verstärkte Produktion von Lipiden enthaltend mehrfachungesättigte Fettsäuren durch hochdichte Kulturen von eukariotischen Mikroben in Gärvorrichtungen
US6596302B2 (en) 2000-04-13 2003-07-22 Abbott Laboratories Infant formulas containing long-chain polyunsaturated fatty acids and uses thereof
PT1276885E (pt) 2000-04-21 2007-10-26 Martek Biosciences Corp Conversão trófica de algas fototróficas estritas, através de engenharia metabólica
EP1780283A1 (en) 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
GB0016045D0 (en) * 2000-06-29 2000-08-23 Laxdale Limited Therapeutic combinations of fatty acids
EP1178118A1 (en) * 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
EP1178103A1 (en) * 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Purifying crude pufa oils
GB2377455A (en) * 2001-02-09 2003-01-15 Univ Hull Method of culturing crypthecodinium cohnii
JPWO2003004667A1 (ja) 2001-07-02 2004-10-28 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリドを含む油脂の製造方法
JP2003048831A (ja) 2001-08-02 2003-02-21 Suntory Ltd 脳機能の低下に起因する症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物
DE60209767T2 (de) * 2001-10-19 2006-08-17 Vita Power Ltd. Nahrungsmittelzusatzstoff und verfahren zur herstellung eines nahrungsmittelzusatzstoffes
DE50209503D1 (de) 2001-11-13 2007-03-29 Metanomics Gmbh Verfahren zur extraktion und analyse von inhaltsstoffen aus organischem material
EP2261312A1 (en) * 2001-12-12 2010-12-15 Martek Biosciences Corporation Extraction and Winterization of Lipids from Oilseed and Microbial Sources
US7390521B2 (en) 2001-12-19 2008-06-24 Dsm Ip Assets B.V. Compositions with a chicken flavour, use and production thereof
US7211656B2 (en) * 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
JP4088097B2 (ja) * 2002-04-26 2008-05-21 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法
CA2489391A1 (en) 2002-06-18 2003-12-24 Martek Biosciences Corporation Stable emulsions of oils in aqueous solutions and methods for producing same
JP2005529621A (ja) 2002-06-19 2005-10-06 デーエスエム イーペー アセッツ ベスローテン フェンノートシャップ 微生物細胞及び微生物油の低温殺菌方法
EA013051B1 (ru) * 2002-06-19 2010-02-26 ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. Масло из микробных клеток, композиция, содержащая масло, и способ получения масла
EP1540009B1 (en) * 2002-08-05 2011-09-28 Quanta Biosciences, Inc. Improved compositions for in vitro amplification of nucleic acids
PT1396533E (pt) * 2002-09-04 2008-10-28 Nestec Sa Processo de preparação de um óleo contendo um ou mais ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa provenientes de biomassa e alimento, composição nutricional, cosmética ou farmacêutica que o contém
US7998712B2 (en) * 2002-09-13 2011-08-16 Suntory Holdings Limited Process for production of transesterified oils/fats or triglycerides
PT1542670E (pt) * 2002-09-24 2013-07-11 Suntory Holdings Ltd Composição com efeitos na prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável
US20040209953A1 (en) * 2002-12-06 2004-10-21 Wai Lee Theresa Siu-Ling Glyceride compositions and methods of making and using same
CN101843610A (zh) * 2003-03-27 2010-09-29 三得利控股株式会社 花生四烯酸在制备具有使超昼夜节律正常化作用的组合物中的用途
US20040219188A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Comer Gail M. Composition and methods for nutritional management of patients with hepatic disease
US7238482B2 (en) * 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
GB0311081D0 (en) * 2003-05-14 2003-06-18 Btg Internat Limted Treatment of neurodegenerative conditions
CA2530170A1 (en) * 2003-06-24 2005-01-06 University Of Kansas Medical Center Infant formula
DE112004001520B4 (de) * 2003-08-18 2008-04-10 Btg International Ltd. Verwendung eines Lipidglyzerids festgelegter Struktur zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der multiplen Sklerose
MXPA06002028A (es) 2003-08-21 2006-05-17 Monsanto Technology Llc Desaturasas de acido graso de primula.
BRPI0418239B1 (pt) * 2003-12-30 2013-10-01 processo de desaeraÇço
CA2558255C (en) * 2004-03-01 2014-01-14 Suntory Limited Process for producing phospholipid containing long chain polyunsaturated fatty acid as constituent thereof and utilization of the same
CA2562548C (en) 2004-04-16 2019-08-20 Monsanto Technology Llc Expression of fatty acid desaturases in corn
CN102559364B (zh) * 2004-04-22 2016-08-17 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
JP2006083136A (ja) * 2004-09-17 2006-03-30 Suntory Ltd ストレスに起因する脳機能の低下およびそれに伴う症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物
JP4993852B2 (ja) 2004-09-17 2012-08-08 サントリーホールディングス株式会社 ストレスに起因する行動異常を伴う症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物
US7678931B2 (en) 2004-10-22 2010-03-16 Martek Biosciences Corporation Process for preparing materials for extraction
US7198937B2 (en) * 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7588931B2 (en) * 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
BRPI0517095B1 (pt) * 2004-11-04 2018-05-29 Monsanto Technology Llc Processo para preparação de uma composição de óleo
GB0425932D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Btg Int Ltd Structured phospholipids
GB0504362D0 (en) * 2005-03-02 2005-04-06 Btg Int Ltd Cytokine modulators
GB0504333D0 (en) * 2005-03-02 2005-04-06 Btg Int Ltd Treatment of cytokine dysregulation
ES2909600T3 (es) 2005-06-07 2022-05-09 Dsm Nutritional Products Ag Microorganismos eucarióticos para producir lípidos y antioxidantes
JP5967855B2 (ja) 2005-06-30 2016-08-10 サントリーホールディングス株式会社 日中活動量の低下および／又はうつ症状の改善作用を有する組成物
US20070082063A1 (en) * 2005-10-11 2007-04-12 Douglas Bibus Risk assessment and correction of membrane damage of the upper GI tract
US8968721B2 (en) 2005-12-28 2015-03-03 Advanced Bionutrition Corporation Delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form and methods of making same
EP1973406B1 (en) 2005-12-28 2014-03-12 Advanced Bionutrition Corporation A delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form
US20070167396A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for cholesterol reduction in mammals
US20070166266A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for improving the health and appearance of skin
US8298548B2 (en) 2007-07-18 2012-10-30 Solazyme, Inc. Compositions for improving the health and appearance of skin
US20090274736A1 (en) * 2006-01-19 2009-11-05 Solazyme Inc. Nutraceutical Compositions From Microalgae And Related Methods of Production And Administration
US8277849B2 (en) * 2006-01-19 2012-10-02 Solazyme, Inc. Microalgae-derived compositions for improving the health and appearance of skin
US20070191303A1 (en) * 2006-01-19 2007-08-16 Solazyme, Inc. Polysaccharide compositions and methods of producing, screening, and formulating polysaccharide compositions
WO2007106728A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
AU2007235419A1 (en) * 2006-04-03 2007-10-18 Advanced Bionutrition Corporation Feed formulations containing docosahexaenoic acid
TW200806184A (en) * 2006-04-11 2008-02-01 Martek Biosciences Corp Food products comprising long chain polyunsaturated fatty acids and methods for preparing the same
US9023616B2 (en) * 2006-08-01 2015-05-05 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and method of modification thereof
WO2008060571A2 (en) * 2006-11-13 2008-05-22 Aurora Biofuels, Inc. Methods and compositions for production and purification of biofuel from plants and microalgae
CA2673120C (en) * 2006-12-18 2012-08-07 Advanced Bionutrition Corporation A dry food product containing live probiotic
KR101578498B1 (ko) * 2006-12-28 2015-12-18 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 신경 재생제
JP5101894B2 (ja) * 2007-01-15 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US8013215B2 (en) * 2007-02-12 2011-09-06 E.I. Du Pont De Nemours And Company Production of arachidonic acid in oilseed plants
MX2010000263A (es) * 2007-06-29 2010-03-11 Martek Biosciences Corp Produccion y purificacion de esteres de acidos grasos poliinsaturados.
CN101109015B (zh) * 2007-07-09 2011-05-04 南京工业大学 花生四烯酸油脂的制备方法
CN101113410B (zh) * 2007-07-09 2010-05-19 南京工业大学 一种高山被孢霉及其应用
CN101153298B (zh) * 2007-09-07 2010-11-24 武汉麦可得生物技术有限公司 发酵生产低神经酸、epa含量的花生四烯酸油脂的方法
US8202713B2 (en) * 2008-05-19 2012-06-19 Zhiyou Wen Producing eicosapentaenoic acid (EPA) from biodiesel-derived crude glycerol
US8927522B2 (en) 2008-10-14 2015-01-06 Solazyme, Inc. Microalgal polysaccharide compositions
WO2010054322A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Solazyme, Inc. Cosmetic compositions comprising microalgal components
US8940340B2 (en) * 2009-01-22 2015-01-27 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for maintaining the dominance of Nannochloropsis in an algae cultivation system
US8143051B2 (en) * 2009-02-04 2012-03-27 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for maintaining the dominance and increasing the biomass production of nannochloropsis in an algae cultivation system
WO2010097809A2 (en) * 2009-02-25 2010-09-02 V.B. Medicare Pvt. Ltd. Improved methods for fermentative production of docosahexaenoic acid
WO2010111565A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Advanced Bionutrition Corporation Microparticulated vaccines for the oral or nasal vaccination and boostering of animals including fish
US9187778B2 (en) 2009-05-04 2015-11-17 Aurora Algae, Inc. Efficient light harvesting
PL2435554T3 (pl) 2009-05-26 2018-01-31 Advanced Bionutrition Corp Stabilna kompozycja suchego proszku zawierająca biologicznie aktywne mikroorganizmy i/lub materiały bioaktywne i sposoby jej wykonania
US8865452B2 (en) * 2009-06-15 2014-10-21 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for extracting lipids from wet algal biomass
US8769867B2 (en) * 2009-06-16 2014-07-08 Aurora Algae, Inc. Systems, methods, and media for circulating fluid in an algae cultivation pond
US9101942B2 (en) * 2009-06-16 2015-08-11 Aurora Algae, Inc. Clarification of suspensions
EP2272383A1 (en) 2009-06-22 2011-01-12 SBAE Industries NV Composition Comprising Omega-7 and/or Omega-4 Fatty Acids
US20100325948A1 (en) * 2009-06-29 2010-12-30 Mehran Parsheh Systems, methods, and media for circulating and carbonating fluid in an algae cultivation pond
US8747930B2 (en) * 2009-06-29 2014-06-10 Aurora Algae, Inc. Siliceous particles
US9480271B2 (en) 2009-09-15 2016-11-01 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
US8765983B2 (en) * 2009-10-30 2014-07-01 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for extracting lipids from and dehydrating wet algal biomass
US8748160B2 (en) * 2009-12-04 2014-06-10 Aurora Alage, Inc. Backward-facing step
US9504750B2 (en) 2010-01-28 2016-11-29 Advanced Bionutrition Corporation Stabilizing composition for biological materials
SG182317A1 (en) 2010-01-28 2012-08-30 Advanced Bionutrition Corp Dry glassy composition comprising a bioactive material
US8211309B2 (en) 2010-04-06 2012-07-03 Heliae Development, Llc Extraction of proteins by a two solvent method
US8115022B2 (en) 2010-04-06 2012-02-14 Heliae Development, Llc Methods of producing biofuels, chlorophylls and carotenoids
US8211308B2 (en) 2010-04-06 2012-07-03 Heliae Development, Llc Extraction of polar lipids by a two solvent method
US8475660B2 (en) 2010-04-06 2013-07-02 Heliae Development, Llc Extraction of polar lipids by a two solvent method
WO2011127127A2 (en) 2010-04-06 2011-10-13 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Extraction with fractionation of oil and co-products from oleaginous material
SG184437A1 (en) 2010-04-06 2012-11-29 Heliae Dev Llc Methods of and systems for isolating carotenoids and omega- 3 rich oils from algae
US8202425B2 (en) 2010-04-06 2012-06-19 Heliae Development, Llc Extraction of neutral lipids by a two solvent method
US8308951B1 (en) 2010-04-06 2012-11-13 Heliae Development, Llc Extraction of proteins by a two solvent method
US8313648B2 (en) 2010-04-06 2012-11-20 Heliae Development, Llc Methods of and systems for producing biofuels from algal oil
US8273248B1 (en) 2010-04-06 2012-09-25 Heliae Development, Llc Extraction of neutral lipids by a two solvent method
US20110263709A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for obtaining polyunsaturated fatty acid-containing compositions from microbial biomass
EP3617318A1 (en) 2010-06-01 2020-03-04 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
US9023625B2 (en) 2010-06-14 2015-05-05 Io-Mega Holding Corporation Methods for production of algae derived oils
CN101870915B (zh) * 2010-06-30 2012-07-04 南京工业大学 水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺
PL2603100T3 (pl) 2010-08-13 2019-06-28 Advanced Bionutrition Corp. Kompozycja stabilizująca przechowywanie na sucho materiałów biologicznych
WO2012056502A1 (ja) 2010-10-29 2012-05-03 大和製衡株式会社 組合せ秤
US9375028B2 (en) 2010-12-09 2016-06-28 Mead Johnson Nutrition Company Compositions and methods for nutrient delivery
EP2668284B1 (en) * 2011-01-28 2014-10-15 Amyris, Inc. Gel-encapsulated microcolony screening
WO2012118173A1 (ja) * 2011-03-03 2012-09-07 日本水産株式会社 リパーゼによる高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
US8926844B2 (en) 2011-03-29 2015-01-06 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for processing algae cultivation fluid
US8569530B2 (en) 2011-04-01 2013-10-29 Aurora Algae, Inc. Conversion of saponifiable lipids into fatty esters
US8752329B2 (en) 2011-04-29 2014-06-17 Aurora Algae, Inc. Optimization of circulation of fluid in an algae cultivation pond
US8365462B2 (en) 2011-05-31 2013-02-05 Heliae Development, Llc V-Trough photobioreactor systems
USD682637S1 (en) 2011-06-10 2013-05-21 Heliae Development, Llc Aquaculture vessel
USD679965S1 (en) 2011-06-10 2013-04-16 Heliae Development, Llc Aquaculture vessel
USD661164S1 (en) 2011-06-10 2012-06-05 Heliae Development, Llc Aquaculture vessel
CN102925502A (zh) * 2011-08-10 2013-02-13 嘉必优生物工程（湖北）有限公司 利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法
US9200236B2 (en) 2011-11-17 2015-12-01 Heliae Development, Llc Omega 7 rich compositions and methods of isolating omega 7 fatty acids
CN102703332B (zh) * 2012-06-19 2013-08-07 南京工业大学 一株产花生四烯酸油脂的菌株及其应用
CN103667068A (zh) * 2012-09-14 2014-03-26 罗盖特兄弟公司 一种由微生物（单细胞真菌高山被孢霉）产生的富含花生四烯酸的油及其制备工艺
CN102925503B (zh) * 2012-09-26 2014-08-06 内蒙古金达威药业有限公司 利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法
CN103805517B (zh) * 2012-11-14 2019-03-08 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 高山被孢霉的分离的新菌株及其应用
DK2970926T3 (en) 2013-03-13 2018-04-16 Dsm Nutritional Products Ag GENMANIPULATION OF MICROorganisms
US9651304B1 (en) 2013-03-14 2017-05-16 Green Recovery Technologies, LLC Pretreatment of biomass prior to separation of saturated biomass
US9266973B2 (en) 2013-03-15 2016-02-23 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for utilizing and recovering chitosan to process biological material
US9597280B2 (en) 2013-05-15 2017-03-21 Terravia Holdings, Inc. Cosmetic compositions comprising microalgal oil
JP6619229B2 (ja) * 2013-08-22 2019-12-11 協和発酵バイオ株式会社 アラキドン酸生産ポリケチドシンターゼ及びその利用
CN103602648B (zh) * 2013-12-04 2016-03-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺
JP2017504318A (ja) 2013-12-20 2017-02-09 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 微生物細胞から微生物油を入手するための方法
US11124736B2 (en) 2013-12-20 2021-09-21 Dsm Ip Assets B.V. Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
CN105960235B (zh) 2013-12-20 2021-01-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于从微生物细胞获得微生物油的方法
KR20240001258A (ko) 2013-12-20 2024-01-03 마라 리뉴어블즈 코퍼레이션 미생물로부터 오일을 회수하는 방법
CA2934491C (en) 2013-12-20 2023-09-26 Dsm Ip Assets B.V. Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
KR102435268B1 (ko) 2013-12-20 2022-08-22 디에스엠 뉴트리셔널 프라덕츠 아게 미생물로부터 오일을 회수하는 방법
US10888104B2 (en) 2014-09-23 2021-01-12 Jost Chemical Co. Fatty acid composition and method for fortifying nutritional products with fatty acids
AR104042A1 (es) 2015-03-26 2017-06-21 Mara Renewables Corp Producción de alta densidad de biomasa y aceite utilizando glicerol en bruto
CA2991707C (en) 2015-07-13 2023-08-01 MARA Renewables Corporation Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon
CA2994112C (en) 2015-07-29 2023-08-08 Advanced Bionutrition Corp. Stable dry probiotic compositions for special dietary uses
US10851395B2 (en) 2016-06-10 2020-12-01 MARA Renewables Corporation Method of making lipids with improved cold flow properties
KR102145032B1 (ko) * 2017-04-26 2020-08-14 주식회사 엘지생활건강 모르티에렐라 오일을 포함하는 화장료 조성물
US10513718B2 (en) 2017-06-06 2019-12-24 City University Of Hong Kong Method of producing polyunsaturated fatty acid
CN107418982B (zh) * 2017-09-25 2020-05-08 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种低氯丙醇微生物油脂及其制备方法
BR112020019931A2 (pt) * 2018-03-30 2021-03-30 Dsm Ip Assets B.V. Método de redução de emulsão através da manutenção de uma baixa concentração de carboidrato
CN109266698B (zh) * 2018-05-17 2022-10-28 梁云 被孢霉属微生物油脂中脂肪酸组合物成分调整的方法
CN108410916A (zh) * 2018-05-30 2018-08-17 湖北福星生物科技有限公司 花生四烯酸油脂的生产方法
CN110747239B (zh) * 2019-11-26 2021-06-22 瞿瀚鹏 富含Sn-2位ARA的微生物油脂及其制备方法和应用
CN117730810A (zh) * 2024-01-24 2024-03-22 广东海洋大学 橄榄油在提高东风螺幼虫变态率和/或存活率中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4280379A (en) * 1980-01-11 1981-07-28 Chow Kirk K Reversihble ratchet drive
US4670285A (en) 1982-08-06 1987-06-02 The University Of Toronto Innovations Foundation Infant formula
DE3587044T2 (de) 1985-01-22 1993-06-03 Agency Ind Science Techn Verfahren zur herstellung von lipiden aus fungusmassen.
DE3603000A1 (de) * 1986-01-31 1987-08-06 Milupa Ag Neue polyensaeure-reiche fettmischung und deren verwendung bei der herstellung von saeuglingsnahrungen
JPS6438007A (en) * 1987-04-28 1989-02-08 Lion Corp Skin external preparation
JP2697834B2 (ja) * 1988-02-02 1998-01-14 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸成分添加人工乳
JP2723243B2 (ja) * 1988-02-25 1998-03-09 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸添加動物飼料
JPH01228486A (ja) * 1988-03-09 1989-09-12 Suntory Ltd 奇数鎖高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
PH11992043811B1 (en) * 1991-01-24 2002-08-22 Martek Corp Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
JPH05163142A (ja) * 1991-12-17 1993-06-29 Tokiwa Yakuhin Kogyo Kk 肝障害の予防または治療用アラキドン酸含有組成物
JP3354608B2 (ja) 1992-11-16 2002-12-09 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
ATE264099T1 (de) * 1993-06-09 2004-04-15 Martek Biosciences Corp Für die behandlung neurologischer erkrankungen nützliche methoden und pharmazeutische zusammensetzungen

Also Published As

Publication number Publication date
AU713567B2 (en) 1999-12-02
PT800584E (pt) 2003-09-30
KR101163298B1 (ko) 2012-07-05
KR20120073363A (ko) 2012-07-04
CN1696300A (zh) 2005-11-16
EP2322641A3 (en) 2011-05-25
CN1175976B (zh) 2011-07-13
DK0800584T3 (da) 2003-08-04
DE69627816D1 (de) 2003-06-05
JP2013116123A (ja) 2013-06-13
NO973085L (no) 1997-09-03
CA2209513C (en) 2002-05-28
EP1342787A3 (en) 2003-10-08
KR20080068761A (ko) 2008-07-23
US5658767A (en) 1997-08-19
ES2197233T3 (es) 2004-01-01
JP4014219B2 (ja) 2007-11-28
ATE239088T1 (de) 2003-05-15
FI20060617A (fi) 2006-06-26
HK1085768A1 (en) 2006-09-01
EP1342787A2 (en) 2003-09-10
FI120648B (fi) 2010-01-15
KR101033741B1 (ko) 2011-05-09
EP0800584B1 (en) 2003-05-02
CN102399831A (zh) 2012-04-04
KR20110111327A (ko) 2011-10-10
EA199700090A1 (ru) 1997-12-30
PL321208A1 (en) 1997-11-24
EP2322642A3 (en) 2011-05-25
FI972829A (fi) 1997-09-02
KR20060096168A (ko) 2006-09-07
KR20100023977A (ko) 2010-03-04
FI972829A0 (fi) 1997-07-01
CN101560529A (zh) 2009-10-21
NO973085D0 (no) 1997-07-02
CN1175976A (zh) 1998-03-11
WO1996021037A1 (en) 1996-07-11
CN101560529B (zh) 2015-02-04
NO320117B1 (no) 2005-10-31
EP2322640A2 (en) 2011-05-18
BR9607179B1 (pt) 2009-01-13
EP0800584A1 (en) 1997-10-15
KR20140114068A (ko) 2014-09-25
JP2009149910A (ja) 2009-07-09
EP2322640A3 (en) 2011-05-25
MX9705078A (es) 1997-10-31
JP5281026B2 (ja) 2013-09-04
JP2006180877A (ja) 2006-07-13
DE69627816T2 (de) 2004-01-22
DE800584T1 (de) 1999-05-06
BR9607179A (pt) 1997-11-11
JP2007319161A (ja) 2007-12-13
CA2209513A1 (en) 1996-07-11
JPH10512444A (ja) 1998-12-02
EA001036B1 (ru) 2000-08-28
EP2322642A2 (en) 2011-05-18
PL187694B1 (pl) 2004-09-30
JP2010178745A (ja) 2010-08-19
CN1696300B (zh) 2011-11-09
AU4854296A (en) 1996-07-24
EP2322641A2 (en) 2011-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI117442B (fi) Arakidonihappo ja menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö
CA2101273C (en) Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
MXPA97005078A (en) Araquidonic acid and methods for the production and use of my

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 117442

Country of ref document: FI

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: DSM IP ASSETS B.V.

MM Patent lapsed