PL187694B1 - Niezmodyfikowany olej trójglicerydowy z grzybów, sposób otrzymywania oleju, kompozycja dla niemowląt, sposób wytwarzania kompozycji dla niemowląt i sposób wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidonowy - Google Patents

Niezmodyfikowany olej trójglicerydowy z grzybów, sposób otrzymywania oleju, kompozycja dla niemowląt, sposób wytwarzania kompozycji dla niemowląt i sposób wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidonowy

Info

Publication number
PL187694B1
PL187694B1 PL96321208A PL32120896A PL187694B1 PL 187694 B1 PL187694 B1 PL 187694B1 PL 96321208 A PL96321208 A PL 96321208A PL 32120896 A PL32120896 A PL 32120896A PL 187694 B1 PL187694 B1 PL 187694B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
oil
ara
amount
residues
fermentation
Prior art date
Application number
PL96321208A
Other languages
English (en)
Other versions
PL321208A1 (en
Inventor
David J. Kyle
Original Assignee
Martek Biosciences Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23449013&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL187694(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Martek Biosciences Corp filed Critical Martek Biosciences Corp
Publication of PL321208A1 publication Critical patent/PL321208A1/xx
Publication of PL187694B1 publication Critical patent/PL187694B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
    • A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
    • A23C11/04—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing non-milk fats but no non-milk proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/92—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof
    • A61K8/922—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof of vegetable origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

1. Niezmodyfikowany olej trójglicerydowy z g r z y b ó w z laszcza z Mortierella sp., korzystniej z M. alpina, znam ienny tym, ze zawiera co najmniej 50% reszt kwasów tlusz- czowych stanowiacych reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowia do 1/10 ilosci ARA. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest niezmodyfikowany olej trój glicerydowy z grzybów, sposób otrzymywania oleju, kompozycja dla niemowląt, sposób wytwarzania kompozycji dla niemowląt i sposób wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidonowy.
Kwas arachidonowy (ARA) jest długołańcuchowym wielonienasyconym kwasem tłuszczowym (PUFA) klasy omega-6 (kwas 5, 8, 11, 14-eikozatetraenowy, tzn. 20:4). Kwas arachidonowy (ARA) jest najobficiej występującym w ciele ludzkim pUFa o C20. Przeważa on zwłaszcza w narządach, tkance mięśniowej i krwi, odgrywając głównie rolę strukturalnego lipidu związanego przede wszystkim z fosfolipidami we krwi, wątrobie, mięśniach i innych głównych narządach organizmu. Oprócz głównej roli jako lipidu strukturalnego, ARA jest także bezpośrednim prekursorem szeregu krążących eikozenoidów, takich jak prostaglandyna E2: (PGE2), prostacyklina I2 (PGI2), tromboksan A2 (TxA2) oraz leukotireny B4 (LTB4) i C4 (LTC4). Te eikozenoidy wykazują regulujący wpływ na metabolizm lipoprotein, reologię krwi, napięcie naczyniowe, funkcjonowanie leukocytów i aktywację płytek krwi.
Pomimo tak ważnej roli w ludzkim metabolizmie, ARA nie może być syntetyzowany w organizmach ludzkich de novo. ARA jest syntetyzowany przez wydłużenie i desaturację kwasu linolowego (LOA), który jest podstawowym kwasem tłuszczowym. Proces ten wymaga obecności enzymu A6-desaturazy, występującego w ludzkich organizmie w niskich stężeniach, Burre i wsp., Lipids, 25: 354-356 (1990). Zgodnie z tym, większość ARA musi być dostarczona w pożywieniu, co jest szczególnie ważne w czasie szybkiego wzrostu ciała, takiego jaki obserwuje się u niemowląt.
W czasie pierwszego roku życia niemowlę może podwoić lub potroić swoją wagę. W konsekwencji, w pożywieniu wymagany jest podwyższony poziom ARA. W celu zaspokojenia tego wymagania, ludzkie mleko zawiera wysoki poziom ARA, Sanders i wsp. Am. J. Clin. Nutr., 31: 805-813 (1978). ARA jest dominującym PUFA C20 w ludzkim mleku. Matki karmiące piersią swoje niemowlęta, zwłaszcza wegetarianki, odniosłyby pożytek z diety zawierającej dodatkowy ARA. Jednakże, wiele matek nie karmi piersią niemowląt lub karmi je jedynie przez część okresu szybkiego wzrostu, w zamian stosując pożywki przeznaczone dla niemowląt.
Żadna handlowa odżywka dla niemowląt znana zgłaszającemu nie zawiera ARA w postaci trój glicerydu. W patencie USA nr 4 670 285 (Clandinin i wsp.), włączonym w niniejszy patent przez zacytowanie, ujawniono zapotrzebowanie niemowląt na kwasy tłuszczowe, włącznie z ARA. W celu dostarczenia tych kwasów tłuszczowych, Clandinin i wsp. sugerują stosowanie jako składnika tłuszczowego odżywki dla niemowląt, mieszaniny żółtka jaj, oleju rybnego lub fosfolipidów z czerwonych komórek krwi i olejów roślinnych. Jednakże, olej rybny zawiera duze ilości kwasu eikozapentaenowego (EPA). Wiadomo, że EPA obniża poziom syntezy ARA u niemowląt, Carlson i wsp., INFORM, 1: 306 (1990). W związku z tym, pożądana byłaby możliwość dostarczania ARA bez EPA. Co więcej, żółtko jaj zawiera stosunkowo niskie stężenie ARA, w wyniku czego mieszanina wg Clandinina i wsp. nie jest ekonomicznie wartościowa.
Ze względu na to, że ARA występuje w olejach zwierzęcych, a nie w roślinnych, jego produkcja w handlowych ilościach jest nadal pożądana, ale do chwili obecnej niezrealizowana. Shinmen i wsp. przedstawili w opisie patentowym JP-A-01304892 produkcję ARA przez wyizolowane grzyby Mortierella alpina. przy zastosowaniu konwencjonalnej fermentacji w zbiorniku z mieszaniem (patrz również Jp-A-01215245 Shinmena i wsp.). Po hodowli, organizmy są zbierane, suszone, a ich lipidy ekstrahowane z grzybowej biomasy rozpuszczalnikiem organicznym i modyfikowane chemicznie (kowalencyjnie). Na przykład, mieszanina lipidów jest hydrolizowana lub przekształcana w estry etylowe, a następnie, przed zastosowaniem jako dodatku do pożywienia łączona z cyklodekstryną. Shinmen i wsp. nie ujawnili ani nie sugerowali podawania niezmodyfikowanych olejów z drobnoustrojów.
Porphyridium cruentum. czerwony mikroskopijny glon, który może być hodowany w dużych ilościach w stawach, zawiera lipidy w skład których wchodzi do 40% ARA, Ahem i wsp. Biotech. Bioeng. 25: 1057-1070 (1983). Niestety, ARA jest głównie związany ilościach galaktolipidami, kompleksowymi polarnymi lipidami nie występującymi w mleku ludzkim. Zatem całkowita ilość możliwego do wykorzystania ARA stanowi tylko ułamek
187 694 jednego procenta biomasy, przy czym postać ARA bez dodatkowej jego modyfikacji nie jest odpowiednia do zastosowania jako dodatek do odżywek niemowlęcych.
W opisie patentowym USA nr 4 870 011 (Suzuki i wsp.) ujawniono sposób otrzymywania lipidów, takich jak kwas γ-linolenowy z grzybów rodzaju Mortierella. Kwas γ-linolenowy jest oczyszczany z mieszaniny lipidów obecnych w grzybach.
W opisie patentowym nr DE 3603000A1 (Milupa) ujawniono mieszaninę wysokonienasyconych kwasów tłuszczowych i jej zastosowanie jako składnika tłuszczowego odżywki dla niemowląt. Mieszanina tłuszczy charakteryzuje się wysoką zawartością ARA i kwasów dokozaheksanowych (DHA) w stosunku 2,5:1, jak również wysoką zawartością cholesterolu. Podano listę źródeł kwasów tłuszczowych, takich jak pewne typy makroskopowych glonów, oleje rybne, tłuszcze z narządów wołowych i wieprzowych lub rafinowany olej z żółtek jaj. Stwierdzono, że źródłem dHa i ARA są makroskopowe glony typu faekofitów i rodofitów. Nie ma żadnych sugestii wykorzystania jakichkolwiek drobnoustrojów jako źródła oleju. Algal i oleje rybne także zwykle zawierają EPA, hamujący syntezę ARA in vivo. Dodatkowo, rafinowany olej z żółtek jaj nie jest ekonomicznym źródłem ARA. Ponadto, nie ma żadnego opisu dodatków zawierających koncentrat ARA, uzupełniających wcześniej znane odżywki dla niemowląt.
Zgodnie z powyższym, istnieje zapotrzebowanie na ekonomiczny, dostępny na skalę handlową sposób wytwarzania ARA, korzystnie bez jednoczesnego wytwarzania ePa. Celem wynalazku jest zaspokojenie tej potrzeby.
Dalszym celem wynalazku jest dostarczenie dodatku i źródła tego dodatku do stosowania w odżywce dla niemowląt, przy czym poziom ARA w odżywce powinien być zbliżony do poziomu ARA w ludzkim mleku.
Dodatkowym celem wynalazku jest dostarczenie zawierającego ARA oleju z grzybów, w celu stosowania w produktach dojelitowych, pozajelitowych lub skórnych.
Przedmiotem wynalazku jest niezmodyfikowany olej trój glicerydowy z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp, korzystniej z M. alpina, który zawiera co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowiących reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA, korzystnie ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) jest mniejsza niż ilość hamująca syntezę ARA.
Przemiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania oleju, na drodze fermentacji z użyciem Mortierella sp. zwłaszcza M. alpina, w którym to oleju co najmniej 25% reszt kwasów tłuszczowych w trój glicerydach stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA), a ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) w oleju wynosi do 1/5 ilości kwasu arachidonowego (ARA). W sposobie tym fermentację prowadzi się przy zmieniającym się pH w czasie hodowli Mortierella sp. w napowietrzanej kadzi fermentacyjnej zawierającej pożywkę pokarmową, przy czym na początku prowadzenia hodowli utrzymuje się pH pomiędzy 5 a 6, a pod koniec prowadzenia hodowli utrzymuje się pH pomiędzy 7 a 7,5; po czym zbiera się biomasę z kadzi fermentacyjnej i uzyskuje się olej. Korzystnie poziom rozpuszczonego tlenu w pożywce wynosi co najmniej 35% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem. Zgodnie z powyższym sposobem olej może być ekstrahowany z biomasy niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym, zwłaszcza heksanem, a następnie oczyszczany poprzez ekstrakcję polarnym rozpuszczalnikiem organicznym wybranym z grupy zawierającej: aceton, etanol i alkohol izopropylowy.
Inna odmiana wynalazku dotyczy sposobu otrzymywania oleju, w którym co najmniej 25% reszt kwasów tłuszczowych w trój glicerydach stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA), a ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) w oleju wynosi do 1/5 ilości kwasu arachidonowego (ARA) na drodze fermentacji z użyciem Mortierella sp. zwłaszcza M. alpina, w którym to sposobie w czasie fermentacji do pożywki dodaje się źródło węgla w ilości odpowiadającej co najmniej 80 g/litr glukozy i źródło azotu w ilości odpowiadającej co najmniej 15 g/litr ekstraktu z drożdży, po czym zbiera się biomasę z kadzi fermentacyjnej i uzyskuje się olej. Korzystnie poziom rozpuszczonego tlenu w pożywce wynosi co najmniej 35% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem. W korzystnym rozwiązaniu źródło
187 694 azotu dzieli się na dwie lub więcej części, które podaje się do kadzi fermentacyjnej w różnych czasach, przy czym co najmniej jedną część podaje się do kadzi fermentacyjnej w czasie różnym niż dodano źródło węgla do kadzi fermentacyjnej.
Olej może być ekstrahowany z biomasy niepolarnym organicznym rozpuszczalnikiem, zwłaszcza heksanem, a następnie oczyszczony poprzez ekstrakcję polarnym rozpuszczalnikiem organicznym wybranym z grupy zawierającej: aceton, etanol, alkohol izopropylowy.
Kolejne rozwiązanie wynalazku dotyczy sposobu otrzymywania oleju, w którym co najmniej 25% reszt kwasów tłuszczowych w trój glicerydach stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA), a ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) w oleju wynosi do 1/5 ilości kwasu arachidonowego (ARA); na drodze fermentacji z użyciem Mortierella sp., zwłaszcza M. alpina, w którym to sposobie w trakcie fermentacji dodaje się ilość fosforanu wzmacniającą produkcję oleju, po czym zbiera się biomasę z kadzi fermentacyjnej i uzyskuje się olej. Korzystnie poziom rozpuszczonego tlenu w pożywce wynosi co najmniej 35% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem. Olej może być ekstrahowany z biomasy niepolarnym organicznym rozpuszczalnikiem, zwłaszcza heksanem, a następnie oczyszczany poprzez ekstrakcję polarnym rozpuszczalnikiem organicznym wybranym z grupy zawierającej: aceton, etanol i alkohol izopropylowy.
Wynalazek dotyczy również kompozycji dla niemowląt zawierającej trójglicerydy zawierające reszty kwasu arachidonowego (ARA) w ilości porównywalnej do ilości w mleku kobiety. Kompozycja ta zawiera wystarczającą ilość niezmodyfikowanego oleju trójglicerydowego z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp, korzystniej z M. alpina, w którym co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów, przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kompozycji dla niemowląt zawierającej trójglicerydy zawierające reszty kwasu arachidonowego (ARA) w ilości porównywalnej do ilości w mleku kobiety, przez wprowadzenie do kompozycji oleju z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp., korzystniej M. alpina, w którym jako olej z grzybów stosuje się olej zawierający trójglicerydy, w których co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów a reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidnonowy (ARA) do podawania ludziom potrzebującym tego uzupełnienia, zwłaszcza kobietom ciężarnym lub karmiącym oraz ludziom cierpiącym na schorzenie neurologiczne takie jak opóźniona dyskineza, schizofrenia, zaburzenia peroksysomalne, albo stany chorobowe takie jak choroba wątroby, fenyloketonuria lub mukowiscydoza, przeznaczonej do stosowania jelitowego, pozajelitowego albo miejscowego, przez wprowadzenie do kompozycji oleju z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp., korzystniej M. alpina, w którym jako olej grzybowy stosuje się olej zawierający trójglicerydy, w których co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów, przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA, korzystnie w ilości dostarczającej 0,2 - 0,8 g ARA/dzień.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja kosmetyczna, zawierająca niezmodyfikowany olej z grzybów, w ilościach skutecznych do wspomagania napięcia skóry, gdy kompozycja ta jest naniesiona miejscowo, która zawiera wystarczającą ilość niezmodyfikowanego oleju trój glicerydowe go z grzybów korzystnie z Mortierella sp., a korzystniej z M. alpina, w którym co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów, przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA.
W sposobie według wynalazku grzyby są hodowane w warunkach sprzyjających wytwarzaniu oleju zawierającego ARA. Ogólnie, techniki hodowli grzybów są dobrze znane fachowcom i mogą być zastosowane do niniejszego innowacyjnego procesu. Na przykład, hodowla kolonii do zaszczepienia może być prowadzona w hodowli wgłębnej w wytrząsanej
187 694 kolbie. Kolby napełniane są pożywką, która jest zaszczepiana grzybnią, hodowaną następnie przez około trzy do czterech dni, z zastosowaniem posuwisto-zwrotnej wytrząsarki.
Skład pożywki może być różny, ale zawsze musi zawierać ona źródła węgla i azotu. Korzystnym źródłem węgla jest glukoza, w ilości mieszczącej się w zakresie około 10-100 g na litr pożywki. Dla kultur hodowlanych we wstrząsanych kolbach, zwykle używa się około 15 g/l glukozy. Ilość ta może być zmieniana, w zależności od pożądanej gęstości końcowej kultury. Innymi źródłami węgla może być melasa, syrop zbożowy o dużej zawartości fruktozy, zhydrolizowana skrobia lub dowolne inne konwencjonalne, tanie źródło węgla, stosowane w procesach fermentacyjnych. Dodatkowo, w przypadku P. insidiosum jako źródło węgla może być dostarczana laktoza. I tak, jako substrat może być stosowana serwatka, która jest bardzo tanim źródłem węgla o dużej zawartości laktozy. Odpowiednie ilości tych źródeł węgla mogą być łatwo określone przez fachowców w tej dziedzinie. Zwykle potrzebne jest dodawanie dodatkowych ilości źródła węgla w trakcie trwania hodowli. Jest to spowodowane tym, że organizmy zużywają tak duzo węgla, iż podawanie całej ilości na samym początku procesu jest niedogodne.
Azot zazwyczaj dodawany jest w postaci ekstraktu drożdży w stężeniu od około 2 do około 15 gramów ekstraktu na litr pożywki. Korzystnie podaje się około cztery gramy ekstraktu. Mogą być także używane inne źródła azotu, włączając w to pepton, trypton, ciecz pochodzącą z macerowania kukurydzy, mączkę sojową, hydrolizowane białko roślinne itp. Ilość dodawanego źródła azotu może być łatwo określona przez fachowców w tej dziedzinie. Cała ilość azotu może być jednorazowo dodawana przed rozpoczęciem hodowli.
Po 3-4 dniowej hodowli w odpowiedniej temperaturze, zwykle 25-30°C, ilość wyhodowanych grzybów jest wystarczająca do ich zastosowania jako materiał do szczepienia w konwencjonalnej kadzi fermentacyjnej z mieszaniem (STF). Takie kadzie fermentacyjne są znane fachowcom w tej dziedzinie i są dostępne w handlu. Fermentacja może być prowadzona w procesie okresowym, okresowym z uzupełnianiem i w sposób ciągły. Korzystnie STF jest wyposażona w wirnik śrubowy, chociaż może być także stosowany turbinowy wirnik typu Rushton.
Kadź fermentacyjna przygotowywana jest przez dodanie pożądanych źródeł węgla i azotu. Na przykład, 1,5 litrowa kadź fermentacyjna może być przygotowana przez wymieszanie około 50 gramów glukozy i około 15 gramów ekstraktu drożdży w litrze wody wodociągowej. Jak to uprzednio przedyskutowano, mogą być użyte inne źródła węgla lub azotu albo ich mieszanin.
Reaktor zawierający roztwór pożywki powinien być przed zaszczepieniem sterylizowany, na przykład przez ogrzewanie. Po oziębieniu do około 30°C może być dodany materiał szczepionkowy i w ten sposób rozpoczyna się hodowla. Wymiana gazów zapewniona jest przez przepuszczanie powietrza. Szybkość przepuszczania powietrza może być różna, ale korzystnie nastawiana jest na od około 0,5 ao około 4,0 VVM (objętość: powietrza na objętość kadzi fermentacyjnej na minutę). Korzystnie ilość rozpuszczonego tlenu utrzymywana jest na poziomie od około 10% do około 50% wartości przy nasyceniu powietrzem roztworu. Zgodnie z tym, w czasie hodowli może być wymagane korygowanie szybkości przepuszczania powietrza. Mieszanie roztworu jest pożądane. Mieszanie dokonuje się wirnikiem. Szybkość mieszania korzystnie mieści się w zakresie od około 30 cm/s do około 500 cm/s, korzystnie od około 100 do 200 cm/s.
Ogólnie, ilość materiału szczepionkowego może być zmienna. Zwykle stosuje się: od około 2% do około 10% objętościowych materiału szczepionkowego. Korzystnie w kadzi fermentacyjnej używane jest około 5% objętościowych materiału szczepionkowego.
Poziom materiału odżywczego powinien być kontrolowany. Jeśli zawartość glukozy spadnie poniżej 5 g/l, dodatkowa ilość glukozy powinna być dodana. W typowym cyklu hodowlanym zużywa się około 100 gramów glukozy i około 15 gramów ekstrakt drożdży na litr. Pożądane jest wyczerpanie azotu w trakcie przebiegu hodowli, ponieważ zwiększa to wytwarzanie oleju przez grzyby. Jest to szczególnie ważne jeśli produkującym organizmem jest M. alpina.
W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, w kadzi fermentacyjnej ze stosowaniem bardzo dużego stężenia materiału odżywczego hoduje się Mortierella alpina o wysokiej
187 694 zawartości oleju, włącznie z wysokim poziomem ARA. Nieoczekiwanie stwierdzono, że można dodawać na początku fermentacji materiał odżywczy zawierający azot w ilości przekraczającej 15 gramów/litr ekstraktu drożdżowego, o ile całkowita ilość dodawanego w czasie fermentacji materiału odzywczego zawierającego węgiel jest porównywalnie wysoka. Całkowita ilość materiału odżywczego zawierającego węgiel korzystnie dostarczanego w sposób ciągły lub okresowo w ciągu pierwszego okresu fermentacji wynoszącego 25-50% czasu całkowitego, albo w postaci małych ilość dodawanych wielokrotnie w tym samym przedziale czasowym, jest korzystnie równoważna 75-300 gramom glukozy na litr pożywki (stosunek C:N > 5:1, wyrażony wagowym stosunkiem glukoza: ekstrakt drożdży). W szczególnie korzystnym wykonaniu, azotowym materiałem odżywczym jest mączka sojowa, dodawana w ilości około 16 gramów na litr pożywki, a materiał odżywczy obejmujący węgiel jest na początku dodany w ilości równoważnej około 80 lub więcej gramów glukozy. Jeśli stosuje się wysokie stężenia węglowych i azotowych materiałów odżywczych, korzystnie jest oddzielne sterylizowanie roztworów zawierających te dwa materiały odżywcze. Opracowano, że wydajność biomasy może być zwiększona w przypadku fermentacji roztworów o wysokim poziomie węgla w materiale odżywczym, w wyniku dodania na początku tylko części materiału odżywczego zawierającego azot i dostarczanie pozostałej odżywki w sposób ciągły lub w postaci jednej albo wielu porcji w czasie trwania fermentacji.
Nieraz w hodowli wytwarza się w nadmiernej ilości piana. W celu zapobieżeniu pienieniu ewentualnie może być dodany środek przeciwpieniący, wybrany ze znanych fachowcom w tej dziedzinie, np. Mazu 310® lub olej roślinny.
Temperatura hodowli może być różna. Jednakże, grzyby wytwarzające zarówno ARA, jak i EPA mają tendencję produkowania mniej EPA i więcej ARA w wyższej temperaturze. Korzystne jest utrzymywanie temperatury na poziomie sprzyjającym produkcji ARA. Odpowiednia temperatura mieści się zwykle w zakresie od około 25°C do około 30°C.
Korzystnie, hodowlę prowadzi się aż do osiągnięcia pożądanej gęstości biomasy. Pożądana ilość biomasy wynosi 25 g organizmów w litrze roztworu. Taka biomasa osiągana jest w ciągu 48-72 godzin po zaszczepieniu. W tym czasie organizmy zwykle zawierają około 5 40% złożonych lipidów, to znaczy oleju, w którym korzystnie przynajmniej 50% ARA znajduje się we frakcji trój glicerydowej.
Olej według wynalazku, będący olejem pojedynczej komórki, może być podawany bezpośrednio, w postaci niezmodyfikowanej. Określenie „niezmodyfikowany” oznacza, że chemiczne właściwości kwasów tłuszczowych lub samego oleju nie były kowalencyjnie zmienione. W ten sposób na przykład, przejściowa modyfikacja kwasu arachidonowego w oleju grzybowym (ARASCO) lub ARA, która może być odwrócona po spożyciu oleju, nie wykracza poza zakres wynalazku.
Olej według wynalazku z naturalnych źródeł nie był dotychczas opisany. Chociaż trójglicerydy o takim składzie mogą być chemicznie zsyntezowane (np. przez estryfikację mieszaniny wolnych kwasów tłuszczowych o dużej zawartości ARA lub przez transestryfikację estrami etylowymi takiej mieszaniny kwasów tłuszczowych), obróbka mieszaniny kwasów tłuszczowych (np. oczyszczanie, estryfikacja itp.) może wprowadzać niechciane produkty uboczne. W przeciwieństwie do tego, sposób według wynalazku dostarcza trójglicerydy mające pożądany skład, drogą ekstrakcji ze źródeł naturalnych.
Określenia „ARA” i „EPA” są używane w niniejszym opisie także w odniesieniu odpowiednio do reszt kwasu arachidonowego i kwasu eikozapentaenowego, jeśli reszty te są zestryfikowane z glicerolem, jako część acylotrójglicerydu tłuszczowego lub fosfolipidu. W niniejszym opisie kompozycja jest „zasadniczo wolna od EPA”, jeśli resztkowa ilość EPA w kompozycji jest mniejsza niż ilość, która mogłaby obniżać poziom syntezy ARA, jeżeli kompozycja ta stosowana byłaby jako dodatek odżywczy. Wynalazek obejmuje również dostarczenie źródła kwasu arachidonowego (ARA) korzystnego pod względem ekonomicznym.
Korzyści wynalazku obejmują łatwość wytwarzania, wysoką czystość i brak wykrywalnych ilości EPA.
Stwierdzono, ze grzyby z gatunków, których kwasy tłuszczowe były uprzednio scharakteryzowane, większość nie wytwarza ARA, Weete J.D., Fungal Lipid Biochemistry, Plenum
187 694
Press, N.Y. (1974). Z tych gatunków, które wytwarzają ARA, wiele, włącznie ze wszystkimi uprzednio scharakteryzowanymi gatunkami Pythium, wytwarza obok ARA znaczne ilości kwasu eikozapentaenowego (EPA). Tabela 1 przedstawia skład kwasów tłuszczowych P. insidiosum, jak również skład kwasów tłuszczowych innych gatunków grzybów. Nieoczekiwanie stwierdzono, że P. insidiosum wytwarza ARA, bez jednoczesnej produkcji EPA. Podobnie jak w przypadku olejów rybnych, wysoki poziom EPA w dodatkach odżywek powoduje obniżenie możliwości wytwarzania aRa ze spożywanego kwasu linolowego (LOA). Zgodnie z tym, chociaż gatunki grzybów wytwarzających zarówno ARA, jak i EPA mogą być stosowane w procesie według wynalazku, korzystne jest wykorzystywanie gatunków nie wytwarzających znaczących ilości EPA. Takimi korzystnymi gatunkami są Pythium insidiosum i Mortierella alpina. Oba gatunki są dostępne w handlu i są zdeponowane w American Type Culture Collective w Rockville, Maryland, odpowiednio pod numerami 28251 i 42430. P. insidiosum i M. alpina są wykorzystywane w tym wynalazku jako reprezentatywne gatunki grzybów. Inne gatunki grzybów wytwarzające trójglicerydy zawierające ARA i zmniejszone ilości EPA objęte są również zakresem niniejszego wynalazku.
Tabela 1.
Skład kwasów tłuszczowych w kilku gatunkach grzybów
Kwasy tłuszczowe
Gatunek 14:0 16:0 16:1 18:1 18:2 18:3 20:4 20:5 Całkowity tłuszcz
Mortierella alpina — 8,2 — 33,5 16,3 23,3 13,0 — 3,0
Mortierella elongata 2,0 13,2 — 26,6 11,9 13,2 13,8 2,4 4,0
Mortierella isabellina 0,3 15,7 0,8 55,8 .11,1 9,0 — — 7,3
Saprolegnia parasitica 7,4 19,1 1,9 6,3 24,5 12,5 10,5 10,5 9,3
Pythium catenulatum 6,5 9,9 10,3 21,2 18,5 3,5 13,4 10,9 5,0
Pythium coloratum 13,6 9,9 — 14,7 10,9 2,5 24,3 21,7 2,2
Pythium gracile 14,7 9,1 2,2 14,8 12,6 3,6 22,1 5,7 4,5
Pythium irregulare 10,3 15,4 6,9 12,3 21,0 3,9 10,6 12,4 11,9
Pythium ultimum 9,5 16,7 10,5 17,1 20,7 1,3 9,0 6,9 13,3
Pythium insidiosum 9,5 11,4 12,1 1,0 8,3 9,3 31,9 — 2,8
Jednym z ważnych problemów rozwiązanych przez wynalazek jest hamowanie biosyntezy ARA u niemowląt, powodowane zwiększonym poziomem EPA w pożywieniu. Problem ten może być skorygowany przez dostarczanie w odżywkach dla niemowląt ARA, na poziomie zasadniczo podobnym do poziomu istniejącego w ludzkim mleku. Zwykle stosunek ARA:EPA w ludzkim mleku wynosi około 20:1. Korzystnie, stosowanie oleju zawierającego ARA prowadzi do uzyskania stosunku ARA:EPA wynoszącego przynajmniej około 5:1. Korzystniej, stosunek ten wynosi przynajmniej około 10:1, a najkorzystniej przynajmniej około 20:1. Im wyższa jest ilość ARA w produkcie końcowym, w porównaniu do ilości EPA, tym bardziej pożądany rezultat.
Jeśli początkowa zawartość azotowego materiału odżywczego przekracza równoważność 15 gramów ekstraktu drożdżowego na litr i/lub zawartość węglowego materiału odżywczego przekracza równoważność około 150 gramów glukozy na litr, wzrost grzybów może być zahamowany. To zahamowanie wzrostu może być przezwyciężone przez fermentacje istniejącego uzupełnianiem składników, na przykład przez dzielenie materiału odżywczego do fermentacji na małe porcje, dostarczane kolejno do kadzi fermentacyjnej, po przemianie metabolicznej całej partii poprzednio dodanego materiału odżywczego. Przezwyciężenie zaha10
187 694 mowania wzrostu może być dokonane przez dostarczanie tylko węglowego materiału odżywczego (patrz Shinmen i wsp.). Stwierdzono, że może to być także uzyskane przez podzielenie całkowitego materiału odżywczego na porcje i dostarczanie ich podczas trwania fermentacji, albo przez dostarczanie roztworu odżywczego w sposób ciągły. Podobnie nieoczekiwanie odkryto, że korzyści te można osiągnąć przez dostarczanie tylko azotowego materiału odżywczego do roztworu fermentacyjnego, w którym zawartość węglowego materiału odżywczego jest wysoka na początku procesu.
Nieoczekiwanie stwierdzono również, że zahamowanie wzrostu może być złagodzone przez kontrolowane sterowanie pH roztworu fermentacyjnego, przez utrzymywanie wysokiej prężności tlenu w roztworze, albo przez jedno i drugie. Stwierdzono, że fermentacja M. alpina w pożywce o wysokiej zawartości materiału odżywczego przy niskim pH (pH = 5-6) prowadzi do zwiększonego wzrostu biomasy (i także do zwiększonej wydajności oleju). Jednakże, olej wytwarzany w tych warunkach ma niską zawartość reszt ARA. Przeciwnie, fermentacja przy wysokim pH (pH = 7-7,5) prowadzi do zwiększonej zawartości ARA w oleju, ale do słabszego wzrostu. W korzystnym sposobie prowadzenia procesu, fermentacja według wynalazku obejmuje kontrolowane sterowanie pH, w którym we wczesnych etapach fermentacji pH jest niskie, a w późniejszych wysokie. Wczesne etapy obejmują szybki (wykładniczy) wzrost, w czasie którego materiały odżywcze podlegają szybkiemu metabolizmowi. Późniejsze etapy obejmują fazę stacjonarną, w której podział komórek ulega zatrzymaniu, zwykle ze względu na niewystarczającą ilość jednego lub obu substratów odżywczych i następuje zwiększone wytwarzanie oleju bogatego w ARA. Sterowanie może być dokonywane przez kontrolę pH roztworu fermentacyjnego i jego korektę w dwóch lub w większej liczbie etapów rozłożonych w czasie.
Podobnie stwierdzono, że utrzymywanie zawartości rozpuszczonego tlenu w pożywce (D.O.) na wysokim poziomie (np. > 40% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem) prowadzi do złagodzenia zahamowania wzrostu przy wysokiej zawartości materiału odżywczego i/lub do wzrostu względnej zawartości grup ARA w oleju. D.O. może być utrzymywane na wysokim poziomie przez zwiększenie ciśnienia w naczyniu (wprowadzenie więcej powietrza do głowicy kadzi fermentacyjnej), zwiększenie mieszania (np. zwiększając szybkość wirnika), zwiększenie napowietrzenia (to znaczy, zwiększenie ilości powietrza przechodzącego przez kadź fermentacyjną w danym czasie, zwykle wyrażone we wzroście VVM - objętość powietrza na objętość kadzi na minutę) i/lub przez wzrost zawartości O2 w przepuszczanym gazie. Stwierdzono, że fermentacja w tych warunkach zwiększa wykorzystanie węgla, prowadzące do większego końcowego stężenia biomasy i większej wydajności oleju bogatego w ARA. W szczególności, fermentacja obejmująca jedną lub więcej powyższych modyfikacji prowadzi do wytwarzania poddającego się ekstrakcji oleju trójglicerydowego, mającego przynajmniej 50% grup ARA.
W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku pożywka fermentacyjna zawiera węglowy materiał odżywczy równoważny > 80 g/l glukozy i azotowy materiał odżywczy równoważny >15 g/l ekstraktu drożdżowego, przy czym pH pożywki po sterylizacji zostało doprowadzone do wartości między 5 a 6. Po zaszczepieniu, pH pożywki utrzymywane jest na poziomie początkowym lub nieznacznie powyżej. Po spadku zawartości węglowego materiału odżywczego do poziomu równoważnego < 60 gramów glukozy/litr (zwykle około 48 godzin), wartość utrzymywanego pH zmienia się na około > 6. W momencie (albo w pobliżu tego momentu), w którym szybkość pobierania tlenu (i/lub szybkość wydzielania dwutlenku węgla - CER) osiąga maksimum (zwykle po około 72 godzinach), utrzymywane pH podnosi się do wartości między 6,5 a 7 (zwykle stopniowo, np. z szybkością 0,1 jednostki pH na godzinę). Następnie, dla końcowych etapów fermentacji pH jest utrzymywane pomiędzy około pH 7-7,5.
W tym wykonaniu wynalazku, zawartość rozpuszczonego w pożywce tlenu (D.O.) jest utrzymywana w pobliżu lub powyżej 40% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem, korzystnie przez wzrost ciśnienia w naczyniu do 0,77 atm. (11 psi), zwiększając mieszanie do równoważnego około 300 cm/sek szybkości końcówki wirnika i zwiększając napowietrzenie do około 0,5 objętości powietrza na objętość kadzi fermentacyjnej na minutę. Po okresie szybkiego wzrostu i wysokiego pobierania O2 w czasie fermentacji, wzrost (i po187 694 bieranie O2) będzie się zmniejszał. Od tego momentu mieszanie/napowietrzanie może być zmniejszone, przy czym cały czas D.O. musi być utrzymywane na wysokim poziomie, zazwyczaj powyżej około 40% ilości tlenu zawartego w pożywce.
W wyniku optymalizacji fermentacji M. alpina jak opisano powyżej, możliwe jest otrzymanie bardzo wysokiej wydajności biomasy zawierającej 20 - 60 % oleju w biomasie, w której 25 - 70% wagowych oleju stanowi reszty ARA w postaci trój glicerydów. Biomasa (i olej) może być zbierany jak opisano poniżej. Korzystnie biomasa będzie zbierana z kadzi fermentacyjnej w ciągu 48 godzin od osiągnięcia maksymum wydajności, mierzonej jako gramy ARA/litr/dzień.
Zbiór może być prowadzony dowolną odpowiednią, metodą taką jak na przykład sączenie, wirowanie lub suszenie rozpyłowe. Ze względu na najniższe koszty korzystny jest zbiór przez sączenie.
Po zbiorze, placek z grzybni może być poddany ekstrakcji. Placek z grzybni dotyczy całej biomasy otrzymanej po zbiorze. Placek może być luźny lub prasowany, rozdrobniony lub nierozdrobniony. W innym rozwiązaniu placek może mieć całą pozostałą wodę usuniętą przez suszenie próżniowe, suszenie w złożu fluidalnym, suszenie rozpyłowe lub liofilizację przed ekstrakcją. Jeśli ta możliwość została wybrana, korzystne jest zastosowanie do ekstrakcji oleju zawierającego ARA niepolarnych rozpuszczalników. Każdy niepolarny rozpuszczalnik może być stosowany, ale najkorzystniej heksan.
W korzystnym rozwiązaniu, olej jest ekstrahowany z wysuszonej biomasy przez mielenie na mokro lub perkolację niemodyfikowanym heksanem. Rozpuszczalnik jest zazwyczaj dodawany w stosunku około 5 : 1 rozpuszczalnik do biomasy (udział masowy). Po mieleniu na mokro elementy stałe są oddzielane od ekstraktu przez dekantację lub wirowanie. Korzystne jest utrzymywanie ekstraktu zawierającego rozpuszczalnik (miscela) bez dostępu powietrza, aby uniknąć utleniania nienasyconych grup kwasów tłuszczowych w oleju. W celu wytworzenia surowego oleju grzybowego z misceli usuwany jest rozpuszczalnik.
Surowy olej ekstrahowany z grzybowej biomasy niepolamymi rozpuszczalnikami może być mętny, szczególnie jeśli biomasa jest mielona, ponieważ mielenie może uwalniać drobne cząstki, takie jak fragmenty ścian komórkowych i rozpuszczalne polisacharydy. Taki mętny olej może być sklarowany przez rozpuszczenie surowego oleju w bardziej polarnych rozpuszczalnikach, takich jak aceton lub alkohol. W korzystnym wykonaniu wynalazku ekstrakt surowego oleju z grzybni jest klarowany przez ekstrakcję acetonową/wytrącanie. Acetonowa miscela jest wytwarzana przez dodanie acetonu do ekstraktu surowego oleju (korzystnie do poziomu około 20% oleju, tzn. około 4 objętości acetonu na jedną objętość surowego oleju), staranne wymieszanie i pozostawienie mieszaniny na czas wystarczający do wytrącenia drobnych cząstek (zwykle około godziny w temperaturze pokojowej). Zawierająca olej acetonowa miscela jest klarowana przez odwirowanie i/lub sączenie, po czym usuwany jest rozpuszczalnik z wytworzeniem grzybowego oleju oczyszczonego acetonem. Grzybowy olej oczyszczony acetonem preferowany jest w dalszej obróbce (np. odśluzowywanie, bielenie i dezodoryzacja konwencjonalnymi metodami), ponieważ drobne cząstki powstające podczas ekstrakcji biomasy przeszkadzają w procesach oczyszczania, jeśli nie są usunięte w etapie acetonowym.
Inne korzystne wykonanie wynalazku obejmuje ekstrakcję suchej masy w przeciwprądzie. Ekstrakcja w przeciwprądzie może być prowadzona w urządzeniach ekstrakcyjnych dostępnych w handlu, na przykład produkowanych przez Crown Ironworks (Crown Mark IV) lub French, Inc. Urządzenia te zwykle nie są stosowane do ekstrakcji olejów roślinnych, ale są przeznaczone do ekstrakcji brudu i zanieczyszczeń. Chociaż wydajności ekstrakcji nie są tak wysokie jak w przypadku mielenia biomasy, korzystną cechą ekstrakcji w przeciwprądzie jest wytwarzanie mniejszej ilości drobnych cząstek, przez co zmniejszają się techniczne trudności przy otrzymywaniu sklarowanego, oczyszczonego oleju.
Alternatywnie, mokry placek (zawierający zwykle około 34-50% ciał stałych) może być pokruszony i bezpośrednio ekstrahowany rozpuszczalnikiem polarnym, takim jak etanol lub alkohol izopropylowy, albo poddawany ekstrakcji cieczami w stanie nadkrytycznym, takimi jak CO2 lub NO2. Korzystnie, placki przed ekstrakcją są kruszone. Zaletą wynalazku jest to, że umożliwia wykorzystanie oszczędnej metody ekstrakcji w cieczy nadkrytycznej, McHugh
187 694 i wsp., „Supercritical Fluid Extraction”, Buttercvorth (1986). Takie metody znane są fachowcom w tej dziedzinie i są stosowane na przykład do dekofeinacji ziaren kawy.
Korzystny sposób wodnej ekstrakcji obejmuje zmieszanie grzybowej biomasy z polarnym rozpuszczalnikiem, jakim jest alkohol izopropylowy, w odpowiednim kociołku reakcyjnym. Takie kociołki są znane. Pożądane jest stosowanie trzech do sześciu części rozpuszczalnika na jedną część biomasy. W celu przeciwdziałania utlenianiu ARA w lipidowym ekstrakcie, najkorzystniej zmieszanie biomasy z rozpuszczalnikiem dokonywane jest w atmosferze azotu lub w obecności antyutleniaczy. Określenia „lipidowy ekstrakt”, „olej”, „kompleks lipidowy” i „olej grzybowy” używane są tutaj wymiennie.
Po ekstrakcji mieszanina może być przesączona, w celu usunięcia biomasy z rozpuszczalnika zawierającego lipidowy ekstrakt. W tym momencie biomasa może być odzyskana i użyta jako dodatek do pożywienia. „Dodatek do pożywienia” oznacza paszę lub dodatek przeznaczony do wymieszania z typową paszą, taką jak zboże itp., przeznaczoną dla zwierząt.
Rozpuszczalnik jest oddzielany od lipidowego ekstraktu i może być także odzyskany dla ponownego użycia, przez odparowanie do odpowiedniego kolektora, przy czym pozostałość określa się jako „surowy olej”. Zastosowanie alkoholu izopropylowego jako rozpuszczalnika prowadzi do usunięcia resztkowych ilości wody z surowego oleju, ponieważ odparowywany jest azeotrop woda/alkohol izopropylowy, tworzący się w ekstrakcie spontanicznie.
Chociaż surowy olej może być używany bez dalszej przeróbki, to jednak może być także dalej oczyszczany. Procesy, stosowane przy wytwarzaniu lecytyny z produktów roślinnych, znane fachowcom w tej dziedzinie, mogą być także wykorzystywane w tym dodatkowym etapie oczyszczania. Takie procesy nie modyfikują chemicznie lub kowalencyjnie lipidów zawierających ARA lub samego ARA.
Wydajność jest różna, ale zwykle wynosi około 5 gramów fosfolipidów zawierających ARA na 100 gramów suszonej grzybni. W przypadku M. alpina może być otrzymane dodatkowe 10-50 gramów trój glicerydu na 100 gramów suszonej grzybni. Ludziom może być podawany zarówno surowy olej, jak i oczyszczony produkt. Oba wytwarzane produkty objęte są używanym w tym opisie określeniem ARASCO.
Najważniejszym celem wynalazku jest dostarczenie dodatku stosowanego do odżywek dla niemowląt, takiego że stężenie ARA w odżywce bardzo zbliża się do stężenia ARA w ludzkim mleku. W tabeli 2 porównano skład kwasów tłuszczowych w ARASCO, ze składem takich kwasów w ludzkim mleku oraz w odżywkach dla niemowląt nie zawierających i zawierających ARASCO.
Tabela 2.
Skład kwasów tłuszczowych w produktach oleju grzybowego i w ludzkim mleku
Kwas tłuszczowy ARASCO Odżywka dla niemowląt1 Odżywka dla niemowląt + olej Ludzkie mleko
1 2 3 4 5
8:0 - 24,1 23,6 0,35
10:0 - 17,7 17,3 1,39
12:0 - 14,9 14,6 6,99
14:0 4,6 5,8 5,8 7,96
160 16,0 6,8 7,0 19,80
16: 1 3,2 0,2 0,3 3,20
18:0 - 2,3 2,3 5,91
18: 1 26,4 10,0 10,3 34,82
18 :2n6 9,9 17,4 17,3 16,00
20 : 3n3 4,1 0,9 1,0 0,62
20: 1 2,2 0,1 0,14 1,10
187 694 cd. tabeli 2
1 2 3 4 5
20 : 2n6 - - - 0,61
20 : 3n6 1,4 - 0,03 0,42
20 : 4n6 32,0 - 0,64 0,59
20 : 5n3 - - - 0,03
21 : 1 - - - 0,10
22 : 4n6 - - - 0,21
22 : 5n6 - - - 0,22
22 : 6n3 - - - 0,19
1 Simopoulis A., „Omega-3 Fatty Acids in Health and Disease”, str. 115-156 (1990).
Jak widać, ilość ARA obecnego w odżywce dla niemowląt z dodatkiem ARASCO bardzo zbliża się do poziomu ARA w ludzkim mleku. Dodatkowo, całkowity skład kwasów tłuszczowych w odzywce dla niemowląt nie zmienił się znacznie przez dodanie ARASCO. Typowo, można stosować pomiędzy około 50 do około 1000 mg ARASCO na litr odżywki. Konkretna wymagana ilość ARASCO zależy od zawartości ARA. Może się ona zmieniać od około 10 do około 70% kwasów tłuszczowych w oleju. Olej stosowany jako dodatek do odżywki dla niemowląt korzystnie zawiera przynajmniej 50% ARA jako reszty kwasów tłuszczowych. ARASCO korzystnie nie zawiera EPA.
Jeśli w opisanym procesie wykorzystywany jest Pythium insidiosum, olej zawierający ARA jest głównie fosfolipidem. Jednakże stwierdzono, że znaczne ilości trójglicerydu zawierającego dużą ilość podstawników ARA mogą być uzyskana z P. insidiosum hodowanego w opisany sposób. Jeśli w tym procesie wykorzystywany jest Mortierella alpina, olej zawierający ARA jest głównie trój glicerydem. Obie postacie ARASCO są wykorzystywane jako dodatki do odżywek dla niemowląt. Olej z P. insidiosum nie tylko dostarcza związku z ARA, ale także z emulgatorem, to jest fosfatydylocholiną, która jest zwykle dodawana do handlowych odżywek. Olej z M. alpina jest prawdopodobnie tańszy w produkcji.
Olej zawierający ARA według wynalazku ma wiele innych zastosowań, oprócz zastosowania jako dodatku do odżywek dla niemowląt. Jak wiadomo fachowcom w tej dziedzinie, jest wiele patologii związanych z brakiem ARA, takich jak kacheksja (Vajreswari i wsp., Metabolism 39:779-782 (1990)), atopia (Melnik B., Monatsschr. Kinderheilta, 138:162-166 (1990)), choroby wątroby, fenyloketonuria, schizofrenia łub powolna dyskineza. W jednym z wykonań wynalazku patologie te leczone są przez podawanie farmaceutycznie skutecznych ilości oleju według wynalazku. Zwykle, farmaceutycznie skuteczna ilość jest ilością wymaganą do normalizacji poziomu ARA w surowicy krwi u pacjentów. Szczególnie preferowane do leczenia takich patologii są oleje opisane wyżej zawierające 50% grup ARA. Olej może być podawany dojelitowo, miejscowo lub pozajelitowe, w zależności od decyzji osoby leczącej.
Umieszczenie środka leczniczego w różnego rodzaju kapsułkach jest skuteczną metodą aplikowania dojelitowego, znaną fachowcom w tej dziedzinie. Kapsułki zawierające olej grzybowy mogą być podawane osobom, u których wymagane lub pożądane jest dodawanie ARA do pożywienia. Taka metoda jest szczególnie skuteczna przy podawaniu ARA kobietom ciężarnym lub karmiącym.
W przypadkach zwalczenia patologii związanych z brakiem ARA, ARASCO powinno być podawane w ilości farmaceutycznie skutecznej. Ilość ta może być określona przez fachowców bez zbędnego eksperymentowania. Typowo wynosi 0,5-2,0 g/dzień, co zwykle normalizuje poziom ARA w surowicy krwi.
Inne wykonanie wynalazku obejmuje kosmetyczną kompozycję zawierającą ARASCO, takie jak opisane tu oleje bogate w ARA. Określenie „kosmetyczne kompozycje” odnosi się do tych związków stosowanych jako kosmetyki. Korzystnym przykładem takiej kompozycji
187 694 jest krem przeciw zmarszczkom. Takie kompozycje kosmetyczne są skutecznym środkiem miejscowej aplikacji ARA, pomagającym utrzymaniu napięcia skóry.
Przedstawione poniżej przykłady I, II i IV, są przykładami porównawczymi, a przykłady III, V, VI i VII zostały przeprowadzone zgodnie z warunkami według poszczególnych odmian wynalazku i szczegółowo objaśniają wynalazek.
Przykład I. Wytwarzanie lipidu przez P. insidiosum i dodawanie do odżywki dla niemowląt
W 80 litrowej (objętość całkowita) kadzi fermentacyjnej umieszczono 51 litrów wody wodociągowej, 1,2 kg glukozy, 240 gramów ekstraktu drożdżowego i 15 ml środka przeciwpieniącego MAZU 2105. Kadź fermentacyjną sterylizowano 45 minut w 121°C. Dodatkowe 5 litrów skroplin wody dodano podczas sterylizacji. pH mieszaniny doprowadzono do wartości 6,2 i dodano około 1 litra szczepionki (o gęstości komórek 5-10 g/l) Pythium insidiosum (ATCC nr 28251). Szybkość mieszania nastawiono na 250 obr/min (szybkość wirnika 250 cm/s), a szybkość napowietrzania na 28,3 1/min [1 SCFM (standardowa stopa sześcienna na minutę)]. W 24 godzinie procesu szybkość napowietrzania zwiększono do 84,9 1/min (3 SCFM). W 28 godzinie dodano dodatkowe 2 litry 50% (1 kg glukozy) syropu glukozowego. Po 50 godzinach zebrano hodowlę grzybów, uzyskując wydajność około 2,2 kg mokrej biomasy (w przybliżeniu 15 g suchej masy) z 1 litra. Przed liofilizacją zebraną biomasę na filtrze próżniowym wyciśnięto na placek o dużej zawartości ciał stałych (50% ciał stałych). Wysuszoną biomasę zmielono tłuczkiem w moździerzu i ekstrahowano w ciągu 2 godzin 1 litrem heksanu na 200 gramów suchej biomasy w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając. Następnie mieszaninę przesączono i przesącz odparowano, uzyskując 5-6 gramów surowego oleju ze 100 g suchej biomasy. Biomasę ponownie ekstrahowano przez 1 godzinę 1 litrem etanolu na 20 gramów suchej biomasy w temperaturze pokojowej, po czym mieszaninę przesączono i odparowano rozpuszczalnik, uzyskując dodatkowo 22 gramów surowego oleju ze 100 gramów suchej biomasy. Druga frakcja składała się głównie temperaturze fosfolipidów, podczas gdy pierwsza frakcja była mieszaniną fosfolipidów i trój glicerydów. Połączone frakcje stanowiły olej zawierający około 30-35% kwasu arachidonowego i nie zawierający wykrywalnych ilości EPA. Olej ten dodawano kroplami do handlowej odżywki dla niemowląt Similac® (Ross Laborataries, Columbus, Ohio), w ilości 60 mg na litr preparowanej odżywki.
Przykład II. Wytwarzanie lipidu przez M. alpina i jego dodawanie do odżywki dla niemowląt
Mortierella alpina (ATCC nr 42430) hodowano w 2 litrowej wytrząsanej kolbie, zawierającej 1 litr wody wodociągowej i 20 gramów pożywki z ziemniaczanej dekstrozy. Kolbę przez cały czas mieszano orbitalnie i utrzymywano w 25°C przez siedem dni. Po zebraniu biomasy przez odwirowanie, poddawano ją liofilizacji, uzyskując 8 gramów grzybni bogatej w lipidy. Grzybnię ekstrahowano heksanem jak w przykładzie I, uzyskując 2,4 g surowego oleju. Olej ten zawierał około 23% kwasu arachidonowego. Dodawano go kroplami do handlowej odżywki dla niemowląt Similac®, w ilości 1000 mg na litr.
Przykład III. Wytwarzanie kwasu arachidonowego na dużą skalę przez M. alpina
Zaszczepiającą kadź fermentacyjną zawierającą pożywkę GYE (50 g/l dekstrozy i 6 g/l Tastone 154) zaszczepiono M. alpina. Temperatura fermentacji wynosiła 28°C, początkowa szybkość mieszania 130-160 cm/s, początkowe ciśnienie w naczyniu 0,42 atm (6 psi), a początkowa szybkość napowietrzania 0,25 VVM. Przed sterylizacją pH ustawiano na 5,0, a po sterylizacji początkowe pH fermentacji wynosiło 5,5. pH pożywki utrzymywano przy wartości >5,5 za pomocą 8N NaOH. Zawartość tlenu utrzymywano przy D.O. > 40% przez następującą sekwencję nastawiania mieszania i napowietrzania: wzrost ciśnienia w naczyniu do 0,77 atm (11 psi); wzrost szybkości mieszania wirnika do 175 cm/s; oraz wzrost szybkości napowietrzania do 0,5 WM. Jeśli było to potrzebne, powstawanie piany zmniejszano dodając środek przeciwpieniący Dow 1520-US (w celu zapobieżenia pienieniu przed sterylizacją dodawano w przybliżeniu 0,1 ml/l środka przeciwpieniącego).
Szczepionkę z kadzi zaszczepiającej do głównej kadzi fermentacyjnej przenoszono w ciągu 12 godzin po podniesieniu pH do wartości powyżej 6,0.
187 694
Główna kadź fermentacyjna zawierała pożywkę GYE (50 g/l dekstrozy i 6 g/l Tastone 154), przy czym glukozę sterylizowano oddzielnie i dodawano do głównej kadzi fermentacyjnej po sterylizacji. Temperatura fermentacji wynosiła 28°C, początkowa szybkość mieszania 160 cm/sek, początkowe ciśnienie w naczyniu 0,42 atm (6 psi), a początkowa szybkość napowietrzania 0,15 VVM. Początkowe pH po sterylizacji wynosiło 5,5 i było utrzymywane przy wartości >5,5 za pomocą 8N NaOH. W fazie stacjonarnej fermentacji zezwolono na wzrost pH (początek około 24 godziny po zaszczepieniu), ale utrzymywano pH niższe niż 6,8, za pomocą roztworu H2SO4 Zawartość tlenu utrzymywano przy D.O. > 40% przez kolejne zwiększanie ciśnienia w naczyniu do 0,77 atm. (11 psi), wzrost szybkości mieszania wirnika do 175 cm/s oraz zwiększanie szybkości napowietrzania do 0,5 vVm. W razie potrzeby pienienie jest ograniczane dodatkiem środka przeciwpieniącego Dow 1520-US (w celu zapobieżenia pienieniu, przed sterylizacją powinno się dodawać w przybliżeniu 0,1 ml/l środka przeciwpieniącego).
Co 12 godzin pobierano próbki z hodowli, w celu analizy zawartości kwasów tłuszczowych i biomasy, a zbieranie biomasy rozpoczynano 3-4 dni po wzroście pH do 6,5. Zawartość suchej biomasy powinna być > 8, 5 g/l. Stężenie glukozy w pożywce powinno spaść z 50 g/l do < 25 g/l. Przy zbiorze, cała hodowla poddawana jest odwirowaniu w wirówce bębnowej, w celu oddzielenia grzybni od zużytej pożywki, po czym biomasa jest suszona.
Przykład IV. Zwiększenie wydajności biomasy z M. alpina - proces pierwszy
M. alpina hodowano w 20 1 kadzi fermentacyjnej z mieszaniem, zaszczepionej hodowlą z wstrząsanej kolby, zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie III. Hodowla M alpina na pożywce zawierającej 65 g/i glukozy (Staleydex) i 6 g/l ekstraktu drożdżowego (Tastone 154) wytworzyła 12 g/l biomasy. Dodatek dodatkowych 6 g/l Tastone 154 w 16 godzinie procesu spowodował wytworzenie 18 g/l biomasy.
Przykład V. Zwiększenie wydajności biomasy z M. alpina - proces drugi
Przeprowadzono doświadczenia próbując jeszcze więcej zwiększyć ilość biomasy, przez dodatkowe dodatki Tastone 154. Doświadczenia te przeprowadzono w czasie 168 godzin, w dwóch 20 1 kadziach fermentacyjnych. W obu kadziach początkowe stężenie glukozy wynosiło 100 g/l. (w porównaniu do 65 g/l w przykładzie N). Do jednej kadzi dodawano 3x6 g/l Tastonu 154, do drugiej 4x6 g/l. Z ekstraktu drożdżowego sporządzano stężony roztwór, sterylizowano go w autoklawie i dodawano do kadzi fermentacyjnej w różnych czasach po sterylizacji. W celu przygotowania szczepionki, posiew (1 ml zmacerowanej grzybni) wprowadzano do 2 kolb, zawierających 50 ml pożywki GYE (100 g/l Staleydex, 6 g/l Tastone 154) i hodowano hodowlę przez 4 dni w 28°C, przy 150 obr/min. Po czterech dniach hodowli pożywka zawierała grudki biomasy o średnicy 2-5 mm. Wzrost hodowli w tych kolbach był wolniejszy niż się tego spodziewano, prawdopodobnie ze względu na wyższe stężenie glukozy. Biomasę macerowano 2x3 s w mieszarce Waringa i 25 ml maceratu stosowano do zaszczepienia dwóch 2,8 1 kolb szczepionkowych Fembacha o objętości 800 ml netto (we wcześniejszych doświadczeniach używano 10 ml maceratu). Ilość szczepionki zwiększono, ze względu na niższą zawartość biomasy w posiewie i ze względu na spodziewany wolniejszy wzrost w kolbach Fembacha, spowodowany wyzszym stężeniem glukozy. Pożywką w kolbach Fembacha była dekstroza (Staleydex) 100 g/l i ekstrakt drożdżowy (Tastone 154) 8 g/l. Dekstrozę i ekstrakt drożdżowy sterylizowano oddzielnie w autoklawie przez 40 minut. Temperaturę fermentacji posiewu utrzymywano przy 28°C, a szybkość mieszania wynosiła 100 obr/min do 150 obr/min.
Po 44 godzinach hodowli w kolbach Fembacha, szczepionkę przenoszono do dwóch 20 1 kadzi fermentacyjnych. Szczepionka była w postaci bardzo luźnych agregatów strzępków grzybni, a zawartość biomasy wynosiła w przybliżeni 5,2 g/l.
Kadzie fermentacyjne na stacjach 14 i 15, zawierające 1,6 kg (10%) dekstrozy (Staleydex) i środek przeciwpieniący Mazu 204 (1,6 g rozpuszczone w 12,5 1 R.O. H2O), sterylizowano przez 45 minut w 122°C. Następnie 800 ml szczepionki (5%) dodano do każdej kadzi fermentacyjnej (godzina 0). Parametry fermentacji były następujące: temperatura: 28 °C, pH: wartość 5,5 utrzymywana za pomocą2N NaOH i 2n H2SO4 napowietrzanie: 0,5 VVM, ciśnienie wsteczne: 0,2 bara,
187 694 mieszanie (początkowe) 80 cm/s,
D.O.: utrzymywane powyżej 40%.
Stacja 14: 3 x 6 g/l Tastone 154
Ekstrakt drożdżowy (Tastone 154) rozpuszczono do stężenia 96 g/l i sterylizowano w autoklawie przez 1 godz. Ekstrakt drożdżowy dodawano w ilości 3x11 (1,8%) w godzinie 0, 20 i 26.
W 15 godzinie D.O. spadło poniżej 40% i stopniowo zwiększano mieszanie do 175 cm/s, w czasie od godziny 15-tej do 22-giej. Następnie korygowano D.O. przez doprowadzenie tlenu do strumienia przepuszczanego powietrza. Tlen dodawano od godz. 23-ej do 72-giej. Od 36-tej godziny szybkość mieszania znów zwiększono, dla zapewnienia właściwego wymieszania. W 48-ej godzinie zwiększono szybkość mieszania do 200 cm/s, w 72-giej do 250 cm/s i w 80-tej do 280. W 120-tej godzinie szybkość mieszania zwiększono do 290 cm/s, w celu ułatwienia odpowiedniej kontroli temperatury. W 144-tej godzinie szybkość mieszania zmniejszono do 280 cm/s.
Stacja 15. 4 x 6 g/l Tastone 154
384 g ekstraktu drożdżowego (Tastone 154) rozpuszczono do stężenia 96 g/l i sterylizowano w autoklawie przez 1 godz. Ekstrakt drożdżowy dodawano w ilości 4 x 11 (2,4%) w godzinie 0,20, 26 i 32.
W 16 godzinie D.O. spadło poniżej 40% i stopniowo zwiększano mieszanie do 175 cm/s, w czasie do godziny 23-ciej. Następnie utrzymywano D.O. na poziomie powyżej 40%, przez doprowadzenie tlenu do strumienia przepuszczanego powietrza. Tlen dodawano od godz. 23-ej do 72-giej. Od 36-tej godziny szybkość mieszania znów zwiększono, dla zapewnienia właściwego wymieszania. W 48-ej godzinie zwiększono szybkość mieszania do 210 cm/s, w 72-giej do 260 cm/s i w 80-tej do 290 cm/s. W 90-tej godzinie szybkość mieszania zmniejszono do 280 cm/s, a w 144-tej do 260 cm/s.
Obserwacje:
W momencie zaszczepienia biomasa w obu kadziach fermentacyjnych była w postaci agregatów bardzo luźnych, pierzastych strzępków grzybni. W 24-tej godzinie zaczęły tworzyć się grudki. Grudki były bardzo małe (1-3 mm), z małym centralnym rdzeniem i szerokimi, luźnymi obrzeżami. W 48-ej godzinie grudki były większe i lepiej zdefiniowane. W 72-ej godzinie obrzeże stało się węzsze, a obecność wielu luźnych, pierzastych fragmentów grzybni wskazywała na to, że grudki uległy rozbiciu. W 168-ej godzinie rdzenie grudek miały średnicę 0,5 do 2 mm, obrzeża były zmniejszone, a strzępki grzybni skupiały się w grube pasma oraz widoczna była duża liczba skondensowanych agregatów grzybni.
W ciągu pierwszych 24 godzin kadzie fermentacyjne pieniły się nieznacznie. Ilość piany następnie się zwiększała i była ograniczana przez ręczne dodawanie środka przeciwpieniącego, jeśli wysokość piany była większa niż 2-4 cm. Piana zmniejszyła się około 48-ej godziny, chociaż obserwowano sporadyczne zwiększanie się jej ilości. W czasie fermentacji w obu kadziach piana jeden raz znalazła się w wyjściu do filtra. Fermentacje wymagały w przybliżeniu 150 ml środka przeciwpieniącego.
W głowicach obu kadzi zbierała się znaczna ilość powstającej biomasy. Nie jest to rzadki problem przy fermentacji grzybowej w małych kadziach o dużym stosunku powierzchnia/objętość. Ilość zbierającej się biomasy w stacji 15 wydawała się narastać w ciągu ostatnich 24 godzin procesu, kiedy obniżony poziom objętości powodował rozpryskiwanie się mieszaniny (poziom cieczy zbliżył się do końcówki wirnika). Końcowa objętość w kadzi po 168 godzinach wynosiła około 13 litrów.
Mikroskopowe badania wykazały, ze po 72 godzinach w pożywce pojawiło się dużo rozmaitych szczątków i pewne objawy świadczące o uszkodzeniu i zaniku ścianek grzybów. W 168-ej godzinie stwierdzono obecność oleistych kropelek w cytoplazmie. Kropelki były bardzo małe i liczne, w przeciwieństwie do dużych kropli oleju, które są czasami widoczne. Wydajność biomasy i oleju oraz wykorzystanie węgla i azotu przedstawiono w tabeli 3.
187 694
Tabela 3.
Przebieg fermentacji Stacja 14 3x6 g/l ekstraktu drożdżowego
Godzina Glukoza (g/l) NH3 (mM) Sucha masa (g/l) Zawartość oleju (% suchej masy) Zawartość ARA (% oleju) Produktywność (g oleju/l/d)
0 105,0 3,0 0,4
24 97,4 5,9 3,3 4,8% 23,5% 0,16
48 73,7 0 18,3 7,9% 23,4% 0,72
72 60,3 0 21,0 14,4% 25,4% 1,01
96 48,0 0 22,3 18,3% 27,5% 1,02
120 40,0 25,2 21,1% 29,4% 1,06
144 34,7 26,6 21,8% 34,9% 0,97
168 29,0 27,5 26,1% 31,3% 1,03
Stacja 15. 4 x 6 g/l ekstraktu drożdżowego
Godzina Glukoza (g/l) nh3 (mM) Sucha masa (g/l) Zawartość oleju (% suchej masy) Zawartość ARA (% oleju) Produktywność (g oleju/l/d)
0 109,0 2,9 0,4
24 103,0 5,1 3,4 4,3% 21,9% 0,15
48 74,1 0,3 23,6 6,8% 23,1% 0,80
72 51,4 0 29,8 10,3% 23,9% 1,02
96 40,0 0 32,7
120 27,9 31,7 18,2% 26,6% 1,15
144 19,8 33,5 20,7% 28,1% 1,16
168 11,0 29,9 21,7% 29,9% 0,93
Przykład VI. Zwiększenie wydajności biomasy z M. alpina - proces trzeci
Celem tego zestawu eksperymentów jest próba dalszego powiększenia ilości uzyskiwanego produktu przez zwiększenie poziomu fosforanów i minerałów. Procedura była zasadniczo taka jak w przykładzie V, z wyjątkiem tego, że dekstrozę i środek przeciwpieniący Mazu 204 rozpuszczono w 11,5 1 R.O. HaO, a nie w 12,5 1, w celu pozostawienia miejsca na roztwory soli, które dodawano w godzinie 30-tej, W stacji 14 dodawano dodatkowo Fe, Zn i Cu, w stacji 15 oprócz Fe, Zn i Cu dodawano dodatkowo fosforany.
Stacja 14. 3 x 6 g/l Tastone 154
Ekstrakt drożdżowy rozpuszczono do stężenia 96 g/l i sterylizowano w autoklawie przez 1 godz. Jednolitrowe dawki ekstraktu drożdżowego dodawano w godzinie 0, 20 i 28. W 22-ej i 28-ej godzinie szybkość uwalniania dwutlenku węgla (CER, wskaźnik szybkości metabolizmu w kadzi fermentacyjnej) wzrastała wykładniczo i fermentacja zaczynała wymagać dodatku zasady.
Wprowadzane sole zawierały:
FeChćHzO 4 8 0 mg
ZnSO47H2O 2 4 0 mg
CuSO45H2O 1 6 mg
187 694
FeCf, rozpuszczono w 1 1 roztworu kwasu cytrynowego o stężeniu 5 g/l. Do powstałego roztworu dodano pozostałe sole i za pomocą NaOH doprowadzono pH do wartości 4,5. Roztwór sterylizowano w autoklawie przez 1 godzinę. Zasilanie w sole dokonano w 30-tej godzinie.
Początkowa szybkość mieszania w kadzi fermentacyjnej wynosiła 50 cm/s, a nie 80 cm/s jak to było zaplanowane, ponieważ początkowy poziom cieczy w kadzi (13 1) powodował, że wierzchołek wirnika był ledwo zanurzony i wyższa szybkość mieszania powodowała znacznie większe rozbryzgiwanie. W 16-tej godzinie D.O. spadł poniżej 40% i mieszanie zwiększano stopniowo do 175 cm/s w 28-ej godzinie. D.O. utrzymywano następnie powyżej 40% przez dodawanie tlenu do strumienia powietrza. W 46-ej godzinie szybkość mieszania zwiększono do 190 cm/s, w celu polepszenia mieszania. Mieszanie dalej zwiększano do 200 cm/s w 48-godzinie, do 220 cm/s w 1-szej godzinie, do 235 cm/s w 53-ciej godzinie, do 250 cm/s w 65-tej godzinie, do 260 cm/s w 57-ej godzinie i do 280 cm/s w 70-tej godzinie. Chociaż minimalne kryterium „pewnego ruchu” było spełnione, obracanie biomasy było bardzo powolne i pewne obszary bliskie były bezruchu. Dodanie kilku kropel środka przeciwpieniącego zmniejszało pianę w głowicy i usuwało kieszenie bezruchu. W 116-tej godzinie szybkość mieszania zmniejszono do 265 cm/s, a w 120-tej godzinie zmniejszono ją dalej do 250 cm/s.
Zawartość kadzi zaczęła się pienić w przybliżeniu w 18-tej godzinie. Pienienie było ograniczane ręcznym dodawaniem środka przeciwpieniącego. Środek ten po raz pierwszy dodany był w 20-tej godzinie. Do godziny 24-tej pożywka ulegająca fermentacji pieniła się w znacznym stopniu i wymagała regularnego dodawania środka przeciwpieniącego. Do godziny 72-giej pienienie w znacznym stopniu się zmniejszyło. Jednakże proces fermentacji od czasu do czasu wymagał dodania środka przeciwpieniącego.
Do 24 godziny procesu biomasa miała postać bardzo luźnych grudek (1-2 mm) i luźnych agregatów strzępków grzybni. Znaczna była ilość szczątków komórek. Do godziny 48-ej biomasa miała postać bardzo luźnych agregatów strzępków grzybni, bardzo małych grudek (1-2 mm) o małych rdzeniach i luźnych obrzeżach i małych zwartych grudkach (1-3), bez luźnych obrzeży. Do godziny 96-tej biomasa miała postać zwartych, okrągłych grudek (1-2 mm), grudek igłowatych (mniej niż 0,5 mm) i luźnych agregatów strzępków grzybni. W 144 godzinie można było w grzybni stwierdzić obecność wielu bardzo małych kropelek oleju.
Stacja 15. 3 x 6 g/l Tastone 154
Ekstrakt drożdżowy rozpuszczono do stężenia 96 g/l i sterylizowano w autoklawie przez 1 godz. Jednolitrowe dawki ekstraktu drożdzowego dodawano w godzinie 0, 22 i 26. W 22-ej i 26ej godzinie CER wzrastała wykładniczo i fermentacja zaczynała wymagać dodatku zasady.
Wprowadzane sole zawierały:
KH2PO4
FeCls6H2O
H2SO47H2O
CuSO45H2O g
mg mg mg
FeCl3 rozpuszczono w 500 ml roztworu kwasu cytrynowego o stężeniu 5g/l. Do powstałego roztworu dodano pozostałe sole i za pomocą NaOH ustawiono wartość pH na 4,5. KH2PO4 rozpuszczono w 500 ml wody R.O. Oba roztwory sterylizowano w autoklawie przez 1 godzinę, przed połączeniem ze sobą oziębiono do 23°C i dodano do kadzi fermentacyjnej w 30-tej godzinie.
Początkowa szybkość mieszania w kadzi fermentacyjnej wynosiła 50 cm/s, a nie 80 cm/s jak to było zaplanowane, ponieważ ponieważ początkowy poziom cieczy w kadzi (13 1) powodował, że wierzchołek wirnika był ledwo zanurzony i wyższa szybkość mieszania powodowała znacznie większe rozbryzgiwanie. W 16-tej godzinie D.O. spadł poniżej 40% i mieszanie zwiększano stopniowo do 175 cm/s w 27-ej godzinie. D.O. otrzymywano następnie powyżej 40% przez dodawanie tlenu do strumienia powietrza. W 41-ej godzinie szybkość mieszania zwiększono do 200 cm/s, w celu polepszenia mieszania. Mieszanie dalej zwiększano do 220 cm/s w 42-godzinie, do 230 cm/s w 46-szej godzinie, do 235 cm/s w 51-szej godzinie i do 240 cm/s w 70-tej godzinie. Przy tej szybkości mieszania (410 obr/min) mieszanie była słabe lub umiarkowane. Minimalny poziom ruchu biomasy był utrzymany. W 80 godzinie szybkość mieszania zmniejszono do 205 cm/s.
187 694
Zawartość kadzi zaczęła się pienić w przybliżeniu w 18-tej godzinie. Pienienie było ograniczane ręcznym dodawaniem środka przeciwpieniącego. Środek ten po raz pierwszy dodany był w 17-tej godzinie. Do godziny 20-tej pożywka ulegająca fermentacji pieniła się w znacznym stopniu i wymagała regularnego dodawania środka przeciwpieniącego. Do godziny 72-giej pienienie w znacznym stopniu się zmniejszyło. Jednakże proces fermentacji od czasu do czasu wymagał dodania środka przeciwpieniącego.
Do 24 godziny procesu biomasa miała postać bardzo luźnych grudek (1-2 mm) i luźnych agregatów strzępków grzybni. Znaczna była ilość szczątków komórek. Do godziny 48-ej biomasa miała postać bardzo luźnych agregatów strzępków grzybni, bardzo małych grudek (1-2 mmm) o bardzo małych rdzeniach i luźnych obrzeżach i małych zwartych grudek (1-3), bez luźnych obrzeży. Do godziny 96-tej biomasa miała postać zwartych, okrągłych grudek o średnicy 1 -2 mm, wiele z nich z luźnymi, włoskowatymi obrzeżami i wielu luźnych fragmentów grzybni. W 144 godzinie można było stwierdzić obecność wielu bardzo małych kropelek oleju w części grzybni i bardzo dużych kropli oleju w innych fragmentach grzybni.
W stacji 15, różniącej się od stacji 14 tylko dodatkiem fosforanów, obserwowano lepsze mieszanie przez cały czas trwania fermentacji, przy ogólnie niższych szybkościach mieszadła. W stacji 15 obserwowano również znacznie „luźniejszą” morfologię biomasy. Wydajności biomasy i oleju, jak również wykorzystanie węgla przedstawiono w tabeli 4. Kadź fermentacyjną zawierającą większą ilość fosforanów charakteryzowało większe wykorzystanie glukozy (82 g/l dla stacji 15, w porównaniu do 64 g/l dla stacji 14) oraz większe gromadzenie się biomasy i obecność dużych kropli oleju w części grzybni.
Tabela 4. Przebieg fermentacji Stacja 14 + sole
Godzina Glukoza (g/l) Sucha masa (g/l) Zawartość oleju (% suchej masy) Zawartość ARA (% oleju) Produktywność (g oleju/l/d)
0 116,0 1,1
24 101,0 1,8 1,2% 22,2% 0,02
48 84,0 14,3 6,2% 24,7% 0,44
72 60,0 24,5 10,6% 24,2% 0,87
96 45,0 28,2 15,5% 25,3% 1,09
120 34,0 28,9 18,1% 26,6% 1,05
144 27,0 30,8 20,8% 27,2% 1,07
Stacja 15+ sole + fosforany
Godzina Glukoza (g/l) Sucha masa (g/l) Zawartość oleju (% suchej masy) Zawartość ARA (% oleju) Produktywność (g oleju/l/d)
0 113,0 0,4
24 101,0 2,1 1,1% 24,0% 0,02
48 74,0 21,7 8,1% 24,7% 0,88
72 51,0 26,2 19,9% 26,5% 1,74
96 31,0 30,1 25,5% 28,6%
120 18,0 33,8 31,7% 31,4% 2,14
144 6,0 34,5 36,0% 32,9 % 2,07
187 694
Przykład VII. Wytwarzanie na dużą skalę biomasy M. alpina zawierającej kwas arachidonowy
Posiewowa kadź fermentacyjna zawierająca pożywkę GYE (50 g/l dekstrozy i 6 g/l Tastone 154) jest zaszczepiana hodowlą z kadzi propagacyjnej. Temperatura fermentacji utrzymywana jest na poziomie 28°C, a początkowa szybkość mieszania na 130-160 cm/s (około 43 obr/min). Początkowe ciśnienie w naczyniu wynosiło 0,42 atm (6 psi), początkowa szybkość napowietrzania 0,25 VVM. Początkowe pH po sterylizacji wynosiło 5,5. Zawartość tlenu utrzymywano przy D.O. > 40% przez kolejne zwiększanie ciśnienia w naczyniu do 0,77 atm (11 psi); wzrost szybkości mieszania wirnika z 156 cm/s do 175 cm/s oraz zwiększanie szybkości napowietrzania do 0,5 VVM. W razie potrzeby pienienie jest ograniczane dodatkiem środka przeciwpieniącego Dow 1520-US (w celu zapobieżenia pienieniu, przed sterylizacją powinno się dodawać w przybliżeniu 0,1 ml/l środka przeciwpieniącego). Po zaszczepieniu hodowli, utrzymywano stałą wartość pH = 5,5, za pomocą 8N NaOH.
W ciągu 12 godzin po podniesieniu się pH powyżej w^Tości 6,0, aawartość kątki posiewowej przenosi się do głównej kadzi fermentacyjnej. Pożywka w głównej kadzó ffrmentacyjnej zawierała:
g/l dekstrozy (ADM) g/1 mąc zki sojo wej (ADM nuMnoy) mg/l FeCl3 · 6H2O (Sigma/Aldrich)
1,5 mg/l ZnSOą · 7 H2O (Sigma/Aldrich)
0,1 mg/l CUSO4 · 5 H2O (Sigm-/Aldrish) mg/l biotyny (Sigma/Aldrich) mg/l tiaminy · HCl (SigmalAldrich) mg/l kwasu aantotenowego wwol oółwapniawat (SigmrSAlkrichC (pci przed srzedizacją 4,8-5,0)
Pożywka w głównej kadzi fermentacyjnej zaszczepiana jest zawartością kadzi posiewowej (11,8%). Temperatura kadzi głównej utrzymywana jest na poziomie 28°C. Początkowa szybkość mieszania wynosi 162 cm/s (ok. 23 obr/min), początkowe ciśnienie 0,42 atm (6 psi) i początkowa szybkość napowietrzania 0,15 VVM (ok. 300 scfh).
Zawartość tlenu w pożywce utrzymuje się przy D.O. > 40% przez zwiększanie ciśnienia w naczyniu do 0,77 atm (11 psi); wzrost szybkości mieszania wirnika do 300 cm/s (stopniowe zwiększanie każdorazowo o wielkość 30 cm/s) oraz zwiększanie szybkości napowietrzania do 0,5 VVM.
pH jest ustalone zgodnie z poniższym protokółem zmian pH:
• Po sterylizacji ustala się pH na wartość 5,5. Utrzymuje się pH > 5,5 za pomocą 8N NaOH.
• W 24-36-ej godzinie po zaszczepieniu dodaje się 2 g/l (110 kg w ok. 700 1H2O) • W 48-ej godzinie, jeśli stężenie dekstrozy jest < 60 g/l zmienia się pH do wartości >6,1 • W 72-ej godzinie zaczyna się wolno zmieniać pH do wartości > 6,6, z szybkością ok. 0,1 jednostki pH na godzinę.
• Utrzymuje się pH poniżej 7,3, przez dodawanie w razie potrzeby H2SO4.
Co 12 godzin pobierane są próbki hodowli z kadzi fermentacyjnej, w celu analizy zawartości kwasów tłuszczowych i biomasy, a zbieranie biomasy rozpoczynane jest w około 3 dni po wzroście pH do > 6,6 (około 6 dni po zaszczepieniu). Zawartość suchej biomasy powinna być > 24 g/l. Stężenie dekstrozy w pożywce powinno spaść z 80 g/l do < 14 g/l.
Zbiór jest dokonywany przez przepuszczenie całej pożywki przez rotacyjny filtr próżniowy, w celu oddzielenia grzybni od zużytej pożywki.
Wyniki dwóch typowych procesów fermentacyjnych, zgodnych z procedurą stosowaną w tym przykładzie, przedstawiono w tabelach 5 i 6.
187 694
Tabela 5.
Przebieg fermentacji M. alpina
Pożywka hodowli = glukoza (80 g/l) + mączka sojowa (16 g/l) + sole + witaminy
Godzina Glukoza (g/l) Sucha masa (g/l) Zawartość oleju (% suchej masy) Zawartość ARA (% oleju) Produktywność (g oleju/l/d)
0 58,0
66 43,0 12,6 14,9% 33,7% 0,68
94 33,0 17,0 27,0% 40,0% 1,17
118 23,0 20,6 28,2% 42,6% 1,18
142 16,0 17,1 39,2% 44,2% 1,13
165 9,6 21,5 41,5% 45,5% 1,30
188 5,2 19,8 41,7% 47,3% 1,05
215 1,7 23,2 46,0% 48,9% 1,19
237 0,2 23,1 44,8% 51,2% 1,05
Tabela 6.
Przebieg fermentacji M. alpina
Pożywka do hodowli = glukoza (65 g/l) + mączka sojowa (16 g/l) + sole + witaminy + antybiotyki
Godzina Glukoza (g/l) Sucha masa (g/l) Zawartość oleju (% suchej masy) Zawartość ARA (% oleju) Produktywność (g oleju/l/d)
0
65 36,0 13,0 8,2% 29,0% 0,39
90 23,0 12,0 18,0% 42,0% 0,58
115 15,0 14,0 30,0% 47,0% 0,88
139 9,0 15,0 32,0% 51,0% 0,83
171 4,0 17,0 36,0% 55,0% 0,86
209 1,4 12,0 36,0% 57,0% 0,50
187 0 14 37,0% 60,0% 0,51
237 0 13 34,0% 64,0% 0,57
187 694
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (22)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Niezmodyfikowany olej trójglicerydowy z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp, korzystniej z M. alpina, znamienny tyra, że zawiera co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowiących reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA.
  2. 2. Niezmodyfikowany olej trój glicerydowy według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowiących reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów, przy czym ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) jest mniejsza niż ilość hamująca syntezę ARA.
  3. 3. Sposób otrzymywania oleju, w którym co najmniej 25% reszt kwasów tłuszczowych w trój glicerydach stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA), a ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) w oleju wynosi do 1/5 ilości kwasu arachidonowego (ARA), na drodze fermentacji z użyciem zwłaszcza Mortierella sp. korzystnie M. alpina, znamienny tym, że fermentację prowadzi się przy zmieniającym się pH w czasie hodowli w napowietrzanej kadzi fermentacyjnej zawierającej pożywkę pokarmową, przy czym na początku prowadzenia hodowli utrzymuje się pH pomiędzy 5 a 6, a pod koniec prowadzenia hodowli utrzymuje się pH pomiędzy 7 a 7,5; po czym zbiera się biomasę z kadzi fermentacyjnej i uzyskuje się olej.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że poziom rozpuszczonego tlenu w pożywce wynosi co najmniej 35% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem.
  5. 5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że olej ekstrahuje się z biomasy niepolarnym rozpuszczalnikiem organicznym, a następnie oczyszcza się poprzez ekstrakcję polarnym rozpuszczalnikiem organicznym.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako niepolarny rozpuszczalnik stosuje się heksan.
  7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako polarny rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy zawierającej: aceton, etanol i alkohol izopropylowy.
  8. 8. Sposób otrzymywania oleju, w którym co najmniej 25% reszt kwasów tłuszczowych w trój glicerydach stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA), a ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) w oleju wynosi do 1/5 ilości kwasu arachidonowego (ARA), na drodze fermentacji z użyciem zwłaszcza Mortierella sp. korzystnie M. alpina, znamienny tym, że w czasie fermentacji do pożywki dodaje się źródło węgla w ilości odpowiadającej co najmniej 80 g/litr glukozy i do pożywki hodowlanej dodaje się źródło azotu w ilości odpowiadającej co najmniej 15 g/litr ekstraktu z drożdży, po czym zbiera się biomasę z kadzi fermentacyjnej i uzyskuje się olej.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że poziom rozpuszczonego tlenu w pożywce wynosi co najmniej 35% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem.
  10. 10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że źródło azotu dzieli się na dwie lub więcej części, które podaje się do kadzi fermentacyjnej w różnych czasach, co najmniej jedną część podaje się do kadzi fermentacyjnej w czasie różnym niż dodaje się źródło węgla do kadzi fermentacyjnej.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że olej ekstrahuje się z biomasy niepolarnym organicznym rozpuszczalnikiem, a następnie oczyszcza się poprzez ekstrakcję polarnym rozpuszczalnikiem organicznym.
  12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako niepolarny rozpuszczalnik stosuje się heksan.
    187 694
  13. 13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako polarny rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy zawierającej: aceton, etanol, alkohol izopropylowy.
  14. 14. Sposób otrzymywania oleju, w którym co najmniej 25% reszt kwasów tłuszczowych w trój glicerydach stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA), a ilość reszt kwasu eikozapentaenowego (EPA) w oleju wynosi do 1/5 ilości kwasu arachidonowego (ARA); na drodze fermentacji z użyciem zwłaszcza Mortierella sp, korzystniej M. alpina, znamienny tym, że w całym okresie przebiegu fermentacji dodaje się ilość fosforanu wzmacniającą produkcję oleju, po czym zbiera się biomasę z kadzi fermentacyjnej i uzyskuje się olej.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że poziom rozpuszczonego tlenu w pożywce wynosi co najmniej 35% ilości tlenu zawartego w pożywce nasyconej powietrzem.
  16. 16. Sposób według zastrz. 14 albo 15, znamienny tym, że olej ekstrahuje się z biomasy niepolarnym organicznym rozpuszczalnikiem, po czym oczyszcza się poprzez ekstrakcję polarnym rozpuszczalnikiem organicznym.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako niepolarny rozpuszczalnik stosuje się heksan.
  18. 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako polarny rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy zawierającej: aceton, etanol i alkohol izopropylowy.
  19. 19. Kompozycja dla niemowląt zawierająca trój glicerydy zawierające reszty kwasu arachidonowego (ARA) w ilości porównywalnej do ilości w mleku kobiety, zawierająca wystarczającą ilość niezmodyfikowanego oleju trójglicerydowego z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp, korzystniej z M. alpina, znamienna tym, że zawiera olej, w którym co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trójglicerydów, przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA.
  20. 20. Sposób wytwarzania kompozycji dla niemowląt zawierającej trójglicerydy zawierające reszty kwasu arachidonowego (ARA.) w ilości porównywalnej do ilości w mleku kobiety, przez wprowadzenie do kompozycji oleju z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp. korzystniej M. alpina, znamienny tym że jako olej grzybowy stosuje się olej zawierający trójglicerydy, w których co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów, przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA.
  21. 21. Sposób wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidonowy (ARA) do podawania ludziom potrzebującym tego uzupełnienia, zwłaszcza kobietom ciężarnym lub karmiącym oraz ludziom cierpiącym na schorzenie neurologiczne takie jak opóźniona dyskineza, schizofrenia, zaburzenia peroksysomalne, albo stany chorobowe takie jak choroba wątroby, fenyloketonuria lub mukowiscydoza, przeznaczonej do stosowania jelitowego, pozajelitowego albo miejscowego, przez wprowadzenie do kompozycji oleju z grzybów zwłaszcza z Mortierella sp. korzystniej M alpina, znamienny tym, że jako olej grzybowy stosuje się olej zawierający trójglicerydy, w których co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów, przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA, korzystnie w ilości dostarczającej 0,2 - 0,8 g ARA/dzień.
  22. 22. Kompozycja kosmetyczna, zawierająca niezmodyfikowany olej z grzybów, w ilościach skutecznych do wspomagania napięcia skóry, gdy kompozycja ta jest naniesiona miejscowo, znamienna tym, że zawiera wystarczającą ilość niezmodyfikowanego oleju trójglicerydowego z grzybów korzystnie z Mortierella sp, a korzystniej z M. alpina, w którym co najmniej 50% reszt kwasów tłuszczowych stanowią reszty kwasu arachidonowego (ARA) w postaci trój glicerydów, przy czym reszty kwasu eikozapentaenowego (EPA) stanowią do 1/10 ilości ARA.
    * * *
    187 694
PL96321208A 1995-01-03 1996-01-03 Niezmodyfikowany olej trójglicerydowy z grzybów, sposób otrzymywania oleju, kompozycja dla niemowląt, sposób wytwarzania kompozycji dla niemowląt i sposób wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidonowy PL187694B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/367,881 US5658767A (en) 1991-01-24 1995-01-03 Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
PCT/US1996/000182 WO1996021037A1 (en) 1995-01-03 1996-01-03 Arachidonic acid and methods for the production and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL321208A1 PL321208A1 (en) 1997-11-24
PL187694B1 true PL187694B1 (pl) 2004-09-30

Family

ID=23449013

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96321208A PL187694B1 (pl) 1995-01-03 1996-01-03 Niezmodyfikowany olej trójglicerydowy z grzybów, sposób otrzymywania oleju, kompozycja dla niemowląt, sposób wytwarzania kompozycji dla niemowląt i sposób wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidonowy

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5658767A (pl)
EP (5) EP1342787A3 (pl)
JP (6) JP4014219B2 (pl)
KR (6) KR20110111327A (pl)
CN (4) CN1696300B (pl)
AT (1) ATE239088T1 (pl)
AU (1) AU713567B2 (pl)
BR (1) BR9607179B1 (pl)
CA (1) CA2209513C (pl)
DE (2) DE69627816T2 (pl)
DK (1) DK0800584T3 (pl)
EA (1) EA001036B1 (pl)
ES (1) ES2197233T3 (pl)
FI (2) FI117442B (pl)
HK (1) HK1085768A1 (pl)
NO (1) NO320117B1 (pl)
PL (1) PL187694B1 (pl)
PT (1) PT800584E (pl)
WO (1) WO1996021037A1 (pl)

Families Citing this family (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060094089A1 (en) * 1988-09-07 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) * 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US5583019A (en) 1995-01-24 1996-12-10 Omegatech Inc. Method for production of arachidonic acid
WO1996040106A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Martek Biosciences Corporation Methods for controlling highly unsaturated fatty acid content in various tissues
US6428832B2 (en) * 1996-03-26 2002-08-06 Dsm N.V. Late addition of PUFA in infant formula preparation process
WO1997035488A1 (en) † 1996-03-26 1997-10-02 Gist-Brocades B.V. Late addition of pufa in infant formula preparation process
US20030143659A1 (en) * 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
JP3995290B2 (ja) 1996-08-23 2007-10-24 サントリー株式会社 オメガ９系高度不飽和脂肪酸及びそれを含有する脂質の製造方法
JP3792309B2 (ja) † 1996-08-30 2006-07-05 サントリー株式会社 不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
JP4633204B2 (ja) * 1996-10-11 2011-02-16 サントリーホールディングス株式会社 アラキドン酸含有食用油脂およびそれを含有する食品
EP2308988A1 (en) 1996-12-27 2011-04-13 Suntory Holdings Limited Media for culturing microorganisms and process for producing unsaturated fatty acids or lipids containing the same
CN100351386C (zh) * 1997-02-20 2007-11-28 Dsm公司 用化学上确定的培养基以工业规模发酵生产有价值的化合物
US6080787A (en) * 1997-02-21 2000-06-27 Abbott Laboratories Methods for reducing the incidence of necrotizing enterocolitis
PL343902A1 (en) 1997-02-21 2001-09-10 Abbott Lab Methods of and compositions for reducing enteritis and colitis morbidity rate
EP0972844B1 (en) * 1997-03-04 2008-09-17 Suntory Limited Process for preparing highly unsaturated fatty acid and lipid containing highly unsaturated fatty acid
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US7745694B1 (en) 1997-04-11 2010-06-29 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
US5968809A (en) * 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US5948413A (en) * 1997-07-17 1999-09-07 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method and vaccine for treatment of pythiosis insidiosi in humans and lower animals
ATE230935T1 (de) * 1997-07-22 2003-02-15 Nestle Sa Lipidzusammensetzung für säuglingsnährpräparat und herstellungsverfahren
GB9802561D0 (en) * 1998-02-07 1998-04-01 Zeneca Ltd Mortierella
US20070141181A1 (en) 1998-02-13 2007-06-21 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents, anti-catabolic agents, antioxidant agents, and analgesics for protection, treatment and repair of connective tissues in humans and animals
US6797289B2 (en) 1998-02-13 2004-09-28 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents, anti-catabolic agents, antioxidant agents, and analgesics for protection, treatment and repair of connective tissues in humans and animals
US6451771B1 (en) 1999-02-12 2002-09-17 Nutramax Laboratories, Inc. Use of anabolic agents anti-catabolic agents and antioxidant agents for protection treatment and repair of connective tissues in humans and animals
EP1087669B2 (en) † 1998-06-17 2010-09-22 DSM IP Assets B.V. Marine feed composition comprising microbially derived arachidonic acid
JP2000069987A (ja) * 1998-08-28 2000-03-07 Suntory Ltd アラキドン酸含有脂質並びにジホモ−γ−リノレン酸含有脂質の製造方法
WO2000020603A1 (en) * 1998-10-05 2000-04-13 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
WO2000021524A1 (en) † 1998-10-15 2000-04-20 Dsm N.V. Pufa supplements
US6166231A (en) * 1998-12-15 2000-12-26 Martek Biosciences Corporation Two phase extraction of oil from biomass
GB9901808D0 (en) * 1999-01-27 1999-03-17 Scarista Limited Drugs for treatment of psychiatric and brain disorders
GB9916537D0 (en) * 1999-07-14 1999-09-15 Univ Hull Culture of microorganisms for the synthesis of a polyunsaturated fatty acid
ES2675517T3 (es) 2000-01-19 2018-07-11 Dsm Ip Assets B.V. Proceso de extracción sin solvente
KR20090064603A (ko) * 2000-01-28 2009-06-19 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 발효기 내에서 진핵 미생물의 고밀도 배양에 의한 고도불포화 지방산을 함유하는 지질의 증진된 생산 방법
US6495599B2 (en) 2000-04-13 2002-12-17 Abbott Laboratories Infant formulas containing long-chain polyunsaturated fatty acids and uses therof
ATE373098T1 (de) 2000-04-21 2007-09-15 Martek Biosciences Corp Trophische umwandlung von obligat phototropischen algen durch metabolische manipulation
EP1780283A1 (en) 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophic conversion of obligate photographic algae through metabolic engineering
GB0016045D0 (en) * 2000-06-29 2000-08-23 Laxdale Limited Therapeutic combinations of fatty acids
EP1178103A1 (en) * 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Purifying crude pufa oils
EP1178118A1 (en) * 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
GB2377455A (en) * 2001-02-09 2003-01-15 Univ Hull Method of culturing crypthecodinium cohnii
US7538238B2 (en) * 2001-07-02 2009-05-26 Suntory Limited Production method of oil or fat containing polyunsaturated fatty acid-containing triglyceride
JP2003048831A (ja) * 2001-08-02 2003-02-21 Suntory Ltd 脳機能の低下に起因する症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物
ES2258159T3 (es) * 2001-10-19 2006-08-16 Vita Power Limited Procedimiento para producir un complemento de producto alimenticio.
DK1446210T3 (da) 2001-11-13 2007-06-04 Metanomics Gmbh Fremgangsmåde til ekstraktion og analyse af indholdsstoffer fra organisk materiale
CA2469647C (en) 2001-12-12 2011-02-15 Daniel G. Dueppen Extraction and winterization of lipids from oilseed and microbial sources
AU2002358164A1 (en) 2001-12-19 2003-06-30 Dsm Ip Assets B.V. Compositions with a chicken flavour, use and production thereof
US7211656B2 (en) * 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
JP4088097B2 (ja) * 2002-04-26 2008-05-21 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸含有脂質の製造方法
EP2368445A1 (en) 2002-06-18 2011-09-28 Martek Biosciences Corporation Stable Emulsions of Oils in Aqueous Solutions and Methods for Producing Same
WO2004009827A2 (en) * 2002-06-19 2004-01-29 Dsm Ip Assets B.V. Preparation of microbial oil containing polyunsaturated fatty acids
CN101837138B (zh) 2002-06-19 2014-05-28 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 微生物油
EP1540009B1 (en) * 2002-08-05 2011-09-28 Quanta Biosciences, Inc. Improved compositions for in vitro amplification of nucleic acids
ATE407190T1 (de) * 2002-09-04 2008-09-15 Nestec Sa Verfahren zur herstellung von einem öl, das langkettige, mehrfach ungesättigte fettsäuren aus biomassen enthält, lebensmittel, nahrungsmittelzusammensetzung, kosmetische oder pharmazeutische zusammensetzung, die dieses ölenthält
AU2003260967B2 (en) * 2002-09-13 2009-12-10 Suntory Holdings Limited Process for production of transesterified oils/fats or triglycerides
EP1542670B2 (en) * 2002-09-24 2023-07-05 Suntory Holdings Limited Composition containing arachidonic acid alone or in combination with docosahexaenoic acid for enhancing cognitive abilities in adults
US20040209953A1 (en) * 2002-12-06 2004-10-21 Wai Lee Theresa Siu-Ling Glyceride compositions and methods of making and using same
WO2004084882A1 (en) * 2003-03-27 2004-10-07 Suntory Limited Use of arachidonic acid for normalization of infradian rhythm
US20040219188A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Comer Gail M. Composition and methods for nutritional management of patients with hepatic disease
US7238482B2 (en) * 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
GB0311081D0 (en) * 2003-05-14 2003-06-18 Btg Internat Limted Treatment of neurodegenerative conditions
EP1643862A1 (en) * 2003-06-24 2006-04-12 University of Kansas Medical Center Infant formula
WO2005018632A1 (en) * 2003-08-18 2005-03-03 Btg International Limited Treatment of neurodegenerative conditions
PT1656449E (pt) 2003-08-21 2009-07-27 Monsanto Technology Llc Dessaturases dos ácidos gordos a partir de prímulas
ES2563649T3 (es) * 2003-12-30 2016-03-15 Dsm Ip Assets B.V. Proceso de desaireación
EP1731616A4 (en) * 2004-03-01 2011-08-17 Suntory Holdings Ltd PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PHOSPHOLIPID CONTAINING LONG CHAIN POLYUNSATURATED FATTY ACID AS A COMPONENT AND USE THEREOF
EP1734947B1 (en) 2004-04-16 2015-04-15 Monsanto Technology, LLC Expression of fatty acid desaturases in corn
CN102559364B (zh) * 2004-04-22 2016-08-17 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
JP2006083136A (ja) * 2004-09-17 2006-03-30 Suntory Ltd ストレスに起因する脳機能の低下およびそれに伴う症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物
JP4993852B2 (ja) 2004-09-17 2012-08-08 サントリーホールディングス株式会社 ストレスに起因する行動異常を伴う症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物
WO2006047445A2 (en) * 2004-10-22 2006-05-04 Martek Biosciences Corporation Process for preparing materials for extraction
US7198937B2 (en) * 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
CA2847960C (en) * 2004-11-04 2015-02-10 Monsanto Technology Llc Processes for preparation of oil compositions
US7550286B2 (en) * 2004-11-04 2009-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
GB0425932D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Btg Int Ltd Structured phospholipids
GB0504362D0 (en) * 2005-03-02 2005-04-06 Btg Int Ltd Cytokine modulators
GB0504333D0 (en) * 2005-03-02 2005-04-06 Btg Int Ltd Treatment of cytokine dysregulation
ES2576986T3 (es) 2005-06-07 2016-07-12 Dsm Nutritional Products Ag Microorganismos eucariotas para la producción de lípidos y antioxidantes
JP5967855B2 (ja) 2005-06-30 2016-08-10 サントリーホールディングス株式会社 日中活動量の低下および／又はうつ症状の改善作用を有する組成物
US20070082063A1 (en) * 2005-10-11 2007-04-12 Douglas Bibus Risk assessment and correction of membrane damage of the upper GI tract
US8968721B2 (en) 2005-12-28 2015-03-03 Advanced Bionutrition Corporation Delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form and methods of making same
ES2470340T3 (es) 2005-12-28 2014-06-23 Advanced Bionutrition Corporation Vehículo de administración para bacterias probi�ticas que comprende una matriz seca de polisac�ridos, sac�ridos y polioles en forma vítrea
US20070191303A1 (en) * 2006-01-19 2007-08-16 Solazyme, Inc. Polysaccharide compositions and methods of producing, screening, and formulating polysaccharide compositions
US20070166266A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for improving the health and appearance of skin
US20070167396A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-19 Solazyme, Inc. Methods and compositions for cholesterol reduction in mammals
US8277849B2 (en) * 2006-01-19 2012-10-02 Solazyme, Inc. Microalgae-derived compositions for improving the health and appearance of skin
US20090274736A1 (en) * 2006-01-19 2009-11-05 Solazyme Inc. Nutraceutical Compositions From Microalgae And Related Methods of Production And Administration
US8298548B2 (en) 2007-07-18 2012-10-30 Solazyme, Inc. Compositions for improving the health and appearance of skin
CN101500403A (zh) 2006-03-10 2009-08-05 孟山都技术有限责任公司 大豆种子和油的组成以及产生所述种子的方法
AU2007235419A1 (en) * 2006-04-03 2007-10-18 Advanced Bionutrition Corporation Feed formulations containing docosahexaenoic acid
KR20090007407A (ko) * 2006-04-11 2009-01-16 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 식품 제품 및 그의 제조 방법
US9023616B2 (en) * 2006-08-01 2015-05-05 Dsm Nutritional Products Ag Oil producing microbes and method of modification thereof
WO2008060571A2 (en) * 2006-11-13 2008-05-22 Aurora Biofuels, Inc. Methods and compositions for production and purification of biofuel from plants and microalgae
CA2673120C (en) * 2006-12-18 2012-08-07 Advanced Bionutrition Corporation A dry food product containing live probiotic
EP2098229A4 (en) * 2006-12-28 2010-03-10 Suntory Holdings Ltd NERVE REGENERATION AGENT
JP5101894B2 (ja) * 2007-01-15 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
CA2675207A1 (en) * 2007-02-12 2008-07-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of arachidonic acid in oilseed plants
JP2010532418A (ja) * 2007-06-29 2010-10-07 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション 多価不飽和脂肪酸のエステルの製造方法および精製方法
CN101113410B (zh) * 2007-07-09 2010-05-19 南京工业大学 一种高山被孢霉及其应用
CN101109015B (zh) * 2007-07-09 2011-05-04 南京工业大学 花生四烯酸油脂的制备方法
CN101153298B (zh) * 2007-09-07 2010-11-24 武汉麦可得生物技术有限公司 发酵生产低神经酸、epa含量的花生四烯酸油脂的方法
WO2009143007A2 (en) * 2008-05-19 2009-11-26 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Producing eicosapentaenoic acid (epa) from biodiesel-derived crude glycerol
US8927522B2 (en) 2008-10-14 2015-01-06 Solazyme, Inc. Microalgal polysaccharide compositions
WO2010054322A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Solazyme, Inc. Cosmetic compositions comprising microalgal components
US8940340B2 (en) * 2009-01-22 2015-01-27 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for maintaining the dominance of Nannochloropsis in an algae cultivation system
US8143051B2 (en) * 2009-02-04 2012-03-27 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for maintaining the dominance and increasing the biomass production of nannochloropsis in an algae cultivation system
US20110306102A1 (en) * 2009-02-25 2011-12-15 V. B. Medicare Pvt. Ltd. Improved methods for fermentative production of docosahexaenoic acid
ES2908047T3 (es) 2009-03-27 2022-04-27 Intervet Int Bv Vacunas en micropartículas para la vacunación oral o nasal y el refuerzo de animales incluidos los peces
US9187778B2 (en) 2009-05-04 2015-11-17 Aurora Algae, Inc. Efficient light harvesting
NZ597053A (en) 2009-05-26 2014-02-28 Advanced Bionutrition Corp Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making
US8865452B2 (en) * 2009-06-15 2014-10-21 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for extracting lipids from wet algal biomass
US9101942B2 (en) * 2009-06-16 2015-08-11 Aurora Algae, Inc. Clarification of suspensions
US8769867B2 (en) * 2009-06-16 2014-07-08 Aurora Algae, Inc. Systems, methods, and media for circulating fluid in an algae cultivation pond
EP2272383A1 (en) 2009-06-22 2011-01-12 SBAE Industries NV Composition Comprising Omega-7 and/or Omega-4 Fatty Acids
US8747930B2 (en) * 2009-06-29 2014-06-10 Aurora Algae, Inc. Siliceous particles
US20100325948A1 (en) * 2009-06-29 2010-12-30 Mehran Parsheh Systems, methods, and media for circulating and carbonating fluid in an algae cultivation pond
US9480271B2 (en) 2009-09-15 2016-11-01 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
US8765983B2 (en) * 2009-10-30 2014-07-01 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for extracting lipids from and dehydrating wet algal biomass
US8748160B2 (en) * 2009-12-04 2014-06-10 Aurora Alage, Inc. Backward-facing step
US9504750B2 (en) 2010-01-28 2016-11-29 Advanced Bionutrition Corporation Stabilizing composition for biological materials
EP2529004B1 (en) 2010-01-28 2017-06-07 Advanced Bionutrition Corporation Dry glassy composition comprising a bioactive material
EP2555633B1 (en) 2010-04-06 2014-06-11 Heliae Development LLC Selective extraction of proteins from freshwater or saltwater algae
US8202425B2 (en) 2010-04-06 2012-06-19 Heliae Development, Llc Extraction of neutral lipids by a two solvent method
WO2011127127A2 (en) 2010-04-06 2011-10-13 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Extraction with fractionation of oil and co-products from oleaginous material
US8475660B2 (en) 2010-04-06 2013-07-02 Heliae Development, Llc Extraction of polar lipids by a two solvent method
US8115022B2 (en) 2010-04-06 2012-02-14 Heliae Development, Llc Methods of producing biofuels, chlorophylls and carotenoids
US8211309B2 (en) 2010-04-06 2012-07-03 Heliae Development, Llc Extraction of proteins by a two solvent method
US8273248B1 (en) 2010-04-06 2012-09-25 Heliae Development, Llc Extraction of neutral lipids by a two solvent method
US8308951B1 (en) 2010-04-06 2012-11-13 Heliae Development, Llc Extraction of proteins by a two solvent method
US8313648B2 (en) 2010-04-06 2012-11-20 Heliae Development, Llc Methods of and systems for producing biofuels from algal oil
US8211308B2 (en) 2010-04-06 2012-07-03 Heliae Development, Llc Extraction of polar lipids by a two solvent method
EP2561050A1 (en) 2010-04-22 2013-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for obtaining polyunsaturated fatty acid-containing compositions from microbial biomass
EP3617318A1 (en) 2010-06-01 2020-03-04 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
MY163938A (en) 2010-06-14 2017-11-15 Io-Mega Holding Corp Method for the production of algae derived oils
CN101870915B (zh) * 2010-06-30 2012-07-04 南京工业大学 水酶法提取花生四烯酸油脂的工艺
CN103140145B (zh) 2010-08-13 2014-08-20 高级生物营养公司 用于生物材料的干的贮存稳定用组合物
CN103026187B (zh) 2010-10-29 2014-09-17 大和制衡株式会社 组合秤
US9375028B2 (en) * 2010-12-09 2016-06-28 Mead Johnson Nutrition Company Compositions and methods for nutrient delivery
MX2013008062A (es) * 2011-01-28 2013-08-09 Amyris Inc Seleccion de microcolonias encapsuladas en gel.
EP2682453B2 (en) * 2011-03-03 2023-03-22 Nissui Corporation Method of producing oil/fat comprising highly-unsaturated fatty acids by means of lipase
US8926844B2 (en) 2011-03-29 2015-01-06 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for processing algae cultivation fluid
US8569530B2 (en) 2011-04-01 2013-10-29 Aurora Algae, Inc. Conversion of saponifiable lipids into fatty esters
US8752329B2 (en) 2011-04-29 2014-06-17 Aurora Algae, Inc. Optimization of circulation of fluid in an algae cultivation pond
US8365462B2 (en) 2011-05-31 2013-02-05 Heliae Development, Llc V-Trough photobioreactor systems
USD682637S1 (en) 2011-06-10 2013-05-21 Heliae Development, Llc Aquaculture vessel
USD661164S1 (en) 2011-06-10 2012-06-05 Heliae Development, Llc Aquaculture vessel
USD679965S1 (en) 2011-06-10 2013-04-16 Heliae Development, Llc Aquaculture vessel
CN102925502A (zh) * 2011-08-10 2013-02-13 嘉必优生物工程（湖北）有限公司 利用高山被孢霉生产花生四烯酸油脂的工业方法
WO2013075116A2 (en) 2011-11-17 2013-05-23 Heliae Development, Llc Omega 7 rich compositions and methods of isolating omega 7 fatty acids
CN102703332B (zh) * 2012-06-19 2013-08-07 南京工业大学 一株产花生四烯酸油脂的菌株及其应用
CN103667068A (zh) * 2012-09-14 2014-03-26 罗盖特兄弟公司 一种由微生物（单细胞真菌高山被孢霉）产生的富含花生四烯酸的油及其制备工艺
CN102925503B (zh) * 2012-09-26 2014-08-06 内蒙古金达威药业有限公司 利用固料培养基培养高山被孢霉制备花生四烯酸的方法
CN103805517B (zh) * 2012-11-14 2019-03-08 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 高山被孢霉的分离的新菌株及其应用
AU2014229307B2 (en) 2013-03-13 2017-08-31 Dsm Nutritional Products Ag Engineering microorganisms
US9651304B1 (en) 2013-03-14 2017-05-16 Green Recovery Technologies, LLC Pretreatment of biomass prior to separation of saturated biomass
US9266973B2 (en) 2013-03-15 2016-02-23 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for utilizing and recovering chitosan to process biological material
WO2014186395A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Solazyme, Inc. Cosmetic compositions comprising microalgal oil
JP6619229B2 (ja) * 2013-08-22 2019-12-11 協和発酵バイオ株式会社 アラキドン酸生産ポリケチドシンターゼ及びその利用
CN103602648B (zh) * 2013-12-04 2016-03-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺
SG11201605009RA (en) 2013-12-20 2016-07-28 Dsm Ip Assets Bv Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
KR102426987B1 (ko) 2013-12-20 2022-07-28 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 미생물 세포로부터의 미생물 오일의 수득 방법
CN105829539B (zh) 2013-12-20 2023-11-10 帝斯曼营养品股份公司 从微生物中回收油的方法
AU2014369042B2 (en) 2013-12-20 2020-04-30 Dsm Ip Assets B.V. Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
ES2749002T3 (es) 2013-12-20 2020-03-18 Mara Renewables Corp Métodos de recuperación de aceite sobre microorganismos
AU2014369045B2 (en) 2013-12-20 2020-02-27 Dsm Ip Assets B.V. Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
CA2961699C (en) 2014-09-23 2022-10-11 Jost Chemical Co. Fatty acid composition and method for fortifying nutritional products with fatty acids
AR104042A1 (es) 2015-03-26 2017-06-21 Mara Renewables Corp Producción de alta densidad de biomasa y aceite utilizando glicerol en bruto
BR112018000690A2 (pt) 2015-07-13 2018-09-18 MARA Renewables Corporation micro-organismo recombinante, e, métodos para preparar um micro-organismo de metabolização de xilose e para produzir óleo.
CA2994112C (en) 2015-07-29 2023-08-08 Advanced Bionutrition Corp. Stable dry probiotic compositions for special dietary uses
US10851395B2 (en) 2016-06-10 2020-12-01 MARA Renewables Corporation Method of making lipids with improved cold flow properties
KR102145032B1 (ko) * 2017-04-26 2020-08-14 주식회사 엘지생활건강 모르티에렐라 오일을 포함하는 화장료 조성물
US10513718B2 (en) 2017-06-06 2019-12-24 City University Of Hong Kong Method of producing polyunsaturated fatty acid
CN107418982B (zh) * 2017-09-25 2020-05-08 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种低氯丙醇微生物油脂及其制备方法
CN112004935B (zh) * 2018-03-30 2024-05-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 获得微生物油的方法和通过维持低的碳水化合物浓度来减少乳液的方法
CN109266698B (zh) * 2018-05-17 2022-10-28 梁云 被孢霉属微生物油脂中脂肪酸组合物成分调整的方法
CN108410916A (zh) * 2018-05-30 2018-08-17 湖北福星生物科技有限公司 花生四烯酸油脂的生产方法
CN110747239B (zh) * 2019-11-26 2021-06-22 瞿瀚鹏 富含Sn-2位ARA的微生物油脂及其制备方法和应用
CN117730810A (zh) * 2024-01-24 2024-03-22 广东海洋大学 橄榄油在提高东风螺幼虫变态率和/或存活率中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4280379A (en) * 1980-01-11 1981-07-28 Chow Kirk K Reversihble ratchet drive
US4670285A (en) 1982-08-06 1987-06-02 The University Of Toronto Innovations Foundation Infant formula
US4870011A (en) 1985-01-22 1989-09-26 Director General Of Agency Of Industrial Science And Technology Method for obtaining lipids from fungus bodies
DE3603000A1 (de) * 1986-01-31 1987-08-06 Milupa Ag Neue polyensaeure-reiche fettmischung und deren verwendung bei der herstellung von saeuglingsnahrungen
JPS6438007A (en) * 1987-04-28 1989-02-08 Lion Corp Skin external preparation
JP2697834B2 (ja) * 1988-02-02 1998-01-14 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸成分添加人工乳
JP2723243B2 (ja) * 1988-02-25 1998-03-09 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸添加動物飼料
JPH01228486A (ja) * 1988-03-09 1989-09-12 Suntory Ltd 奇数鎖高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
PH11992043811B1 (en) * 1991-01-24 2002-08-22 Martek Corp Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
JPH05163142A (ja) * 1991-12-17 1993-06-29 Tokiwa Yakuhin Kogyo Kk 肝障害の予防または治療用アラキドン酸含有組成物
JP3354608B2 (ja) * 1992-11-16 2002-12-09 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
JPH08511533A (ja) * 1993-06-09 1996-12-03 マーテック・バイオサイエンスィズ・コーポレーション 神経学的障害の治療に有用な方法および医薬用組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2322642A2 (en) 2011-05-18
PL321208A1 (en) 1997-11-24
ES2197233T3 (es) 2004-01-01
DE800584T1 (de) 1999-05-06
NO320117B1 (no) 2005-10-31
AU713567B2 (en) 1999-12-02
EA001036B1 (ru) 2000-08-28
CN101560529A (zh) 2009-10-21
WO1996021037A1 (en) 1996-07-11
EP0800584B1 (en) 2003-05-02
CN102399831A (zh) 2012-04-04
EP2322640A3 (en) 2011-05-25
JP4014219B2 (ja) 2007-11-28
BR9607179B1 (pt) 2009-01-13
JP2010178745A (ja) 2010-08-19
FI972829A (fi) 1997-09-02
DK0800584T3 (da) 2003-08-04
US5658767A (en) 1997-08-19
KR20140114068A (ko) 2014-09-25
FI20060617A (fi) 2006-06-26
BR9607179A (pt) 1997-11-11
HK1085768A1 (en) 2006-09-01
CN101560529B (zh) 2015-02-04
FI117442B (fi) 2006-10-13
ATE239088T1 (de) 2003-05-15
AU4854296A (en) 1996-07-24
DE69627816T2 (de) 2004-01-22
EP0800584A1 (en) 1997-10-15
EP1342787A3 (en) 2003-10-08
DE69627816D1 (de) 2003-06-05
CA2209513C (en) 2002-05-28
JP2009149910A (ja) 2009-07-09
EA199700090A1 (ru) 1997-12-30
CA2209513A1 (en) 1996-07-11
EP1342787A2 (en) 2003-09-10
EP2322640A2 (en) 2011-05-18
NO973085D0 (no) 1997-07-02
JP5281026B2 (ja) 2013-09-04
JP2013116123A (ja) 2013-06-13
KR101163298B1 (ko) 2012-07-05
CN1175976B (zh) 2011-07-13
JP2006180877A (ja) 2006-07-13
EP2322642A3 (en) 2011-05-25
FI120648B (fi) 2010-01-15
MX9705078A (es) 1997-10-31
FI972829A0 (fi) 1997-07-01
NO973085L (no) 1997-09-03
CN1175976A (zh) 1998-03-11
JP2007319161A (ja) 2007-12-13
KR20120073363A (ko) 2012-07-04
EP2322641A2 (en) 2011-05-18
KR101033741B1 (ko) 2011-05-09
KR20060096168A (ko) 2006-09-07
KR20110111327A (ko) 2011-10-10
JPH10512444A (ja) 1998-12-02
CN1696300A (zh) 2005-11-16
PT800584E (pt) 2003-09-30
KR20100023977A (ko) 2010-03-04
KR20080068761A (ko) 2008-07-23
CN1696300B (zh) 2011-11-09
EP2322641A3 (en) 2011-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL187694B1 (pl) Niezmodyfikowany olej trójglicerydowy z grzybów, sposób otrzymywania oleju, kompozycja dla niemowląt, sposób wytwarzania kompozycji dla niemowląt i sposób wytwarzania kompozycji uzupełniającej kwas arachidonowy
EP0568608B1 (en) Fungal oil containing arachidonic acid, method for its preparation and composition containing said oil
MXPA97005078A (en) Araquidonic acid and methods for the production and use of my

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20130103