ES2197233T3 - Acido araquidonico, procedimientos de produccion y uso del mismo. - Google Patents

Acido araquidonico, procedimientos de produccion y uso del mismo.

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ES2197233T3 ES96904435T ES96904435T ES2197233T3 ES 2197233 T3 ES2197233 T3 ES 2197233T3 ES 96904435 T ES96904435 T ES 96904435T ES 96904435 T ES96904435 T ES 96904435T ES 2197233 T3 ES2197233 T3 ES 2197233T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCESOS PARA LA PRODUCCION DE ACEITES QUE CONTIENEN ACIDO ARAQUIDONICO, PREFERIBLEMENTE EXENTOS DE ACIDO EICOSAPENTANOICO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A COMPOSICIONES QUE CONTIENEN ACEITES CON CANTIDADES MUY ALTAS DE ACIDO ARAQUIDONICO EN FORMA DE TRIGLICERIDOS, Y A USOS DE DICHOS ACEITES. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, SE CULTIVA MORTIERELLA ALPINA UTILIZANDO CONDICIONES QUE PRODUCEN ACEITE DE TRIGLICERIDOS CON NIVELES PARTICULARMENTE ELEVADOS DE RESIDUOS DE ACIDO ARAQUIDONICO, DE FORMA QUE SE RECOGE LA BIOMASA Y EL ACEITE SE EXTRAE, SE RECUPERA Y SE UTILIZA COMO ADITIVO PARA FORMULAS INFANTILES.

Description

Ácido araquidónico, procedimientos de producción y uso del mismo.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un procedimiento para la producción de un aceite que contiene ácido araquidónico, a un aceite fúngico de triglicéridos no modificado que contiene ácido araquidónico y a los usos de dicho aceite.
Antecedentes de la invención
El ácido araquidónico (ARA) es un ácido graso poliinsaturado (PUFA) de cadena larga de la clase omega-6 (ácido 5, 8, 11, 14-eicosatetraenoico, es decir, 20:4). El ARA es el OUFA de C_{20} más abundante en el cuerpo humano. Es particularmente prevalente en órganos, músculos y en tejidos sanguíneos, desempeñando un papel fundamental como lípido estructural asociado predominantemente con fosfolípidos en sangre, hígado, músculo y otros sistemas de órganos mayores. Además de su papel principal como lípido estructural el ARA es también el precursor directo para varios eicosanoides circulatorios, como por ejemplo la prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), la prostaciclina I_{2} (PGI_{2}), el tromboxano A_{2} (TxA_{2}) y los leucotrienos B_{4} (LTB_{4}) y C_{4} (LTC_{4}). Estos eicosanoides muestran efectos reguladores en el metabolismo de lipoproteínas, reología sanguínea, tono vascular, función leucocitaria y activación de plaquetas.
A pesar de su importancia en el metabolismo humano, el ARA no se puede sintetizar de novo en humanos. El ARA se sintetiza por elongación y desaturación de ácido linoleico (ALO), un ácido graso esencial. Este procedimiento requiere de la presencia de la enzima \Delta6-desaturasa, una enzima presente en el cuerpo humano en bajos niveles (Burre et al., Lipids, 25:354-356 (1990)). De acuerdo con esto, la mayoría del ARA se debe proporcionar en la dieta, y ésta es especialmente importante durante las épocas de crecimiento corporal muy rápido, como por ejemplo la infancia.
Durante el primer año de su vida, un lactante puede duplicar o triplicar su peso. Como consecuencia, se requieren elevados niveles de ARA en la dieta. Para satisfacer esta demanda en aumento, la leche materna humana contiene elevados niveles de ARA (Sanders et al., Am. J. Clin. Nutr., 31:805-813 (1978)). El ARA es el PUFA de C_{20} más extendido en la leche materna. Muchas de aquellas madres, especialmente las vegetarianas, que alimentan a sus bebés dándoles el pecho, se beneficiarían con ARA adicional en la dieta. Sin embargo, muchas madres no dan el pecho a sus bebés, o no les dan el pecho durante el período completo del crecimiento rápido del bebé, eligiendo en su lugar utilizar una fórmula para lactantes.
El Solicitante no conoce fórmulas infantiles comerciales que contengan ARA en forma de triglicérido. La patente de EE.UU. nº 4.670.285 (Clandinin et al.) describe los requerimientos de los lactantes en lo referente a ácidos grasos incluyendo el ARA. Para proporcionar estos ácidos grasos, Clandinin et al. sugieren una mezcla de yema de huevo, aceite de pescado o fosfolípidos de células sanguíneas rojas y aceites vegetales como el componente graso de una fórmula para lactantes propuesta. Sin embargo, el aceite de pescado contiene elevadas cantidades de ácido eicosapentaenoico (AEP). Se sabe que el AEP reduce la síntesis de ARA en lactantes (Carlson, et al., INFORM, 1:306 (1990)). De esta forma, sería deseable ser capaces de proporcionar ARA sin proporcionar también AEP adicional. Además, las yemas de huevo contienen una concentración relativamente baja de ARA, tanto que la mezcla de Clandinin et al. no resulta viable económicamente.
Como el ARA está presente en animales, pero no en vegetales, su producción en cantidades comerciales ha permanecido como una meta deseable, pero difícil de conseguir. Shinmen, et al. (Microbiol. Biotech. 31.11-16 (1989)) han informado de la producción de ARA por un hongo aislado, Mortierella alpina, usando una fermentación convencional en tanque agitado. (Ver también la patente japonesa 1.215.245 a Shinmen et al.). Después de cultivar, se recolectan los organismos y se secan. Se extraen sus lípidos a partir de la biomasa fúngica con un disolvente orgánico y se modifican químicamente (covalentemente) los lípidos. Por ejemplo, la mezcla lipídica se hidroliza o se convierte en ésteres de etilo y luego se combinan con ciclodextrina previo a su uso como suplemento dietético. Shinmen, et al. no describen o sugieren la administración de aceites microbianos no modificados.
La Porphyridium cruentum, una microalga roja, se puede crecer en grandes cantidades en estanques y tiene un contenido lipídico que puede contener hasta un 40% de ARA (Ahem, et al. Biotech Bioeng. 25:1057-1070 (1983)). Desafortunadamente, el ARA se asocia fundamentalmente con galactolípidos, un lípido polar complejo no presente en la leche materna. De esta forma, no sólo se produce el ARA total utilizable a una fracción de un uno por ciento de biomasa, sino que la forma del ARA no es adecuada para uso como aditivo en una fórmula para lactantes sin modificación adicional.
La patente de EE.UU. nº 4.870.011 (Suzuki et al.) describe un procedimiento para obtener lípidos como por ejemplo el ácido \gamma-linolénico procedente del hongo del género Mortierella. El ácido \gamma-linolénico se purifica a partir de la mezcla de lípidos contenida en el hongo.
El documento DE 3603000ª1 (Milupa) describe una mezcla grasa de ácidos altamente poliinsaturados y su uso como el componente graso de una fórmula para lactantes. La mezcla grasa tiene un alto contenido en ARA y en ácido docosahexanoico (ADH) en una relación de 2,5:1 respectivamente, así como un alto contenido en colesterol. Las fuentes de ácidos grasos se enumeran como son ciertos tipos de macroalgas, aceites de pescado, grasas de órganos de res o cerdo o aceite de yema de huevo altamente refinado. Se dice que una fuente de ADH y de ARA son las macroalgas del tipo facofitas y rodofitas. No hay sugerencia de usar ningún microbio como una fuente de aceite. Los aceites de algas y de pescado incluyen típicamente AEP que reduce la síntesis de ARA in vivo. De forma adicional, el aceite de yema de huevo altamente refinado no es una fuente económica de ARA. Además, no hay una descripción en eso de un aditivo concentrado en ARA para suplementar fórmulas infantiles pre-existentes.
El documento WO92/13086 describe la preparación y uso de aceites fúngicos de Pythium insidiosum en forma de aditivos para una fórmula para lactantes. Los aceites contienen de un 30% a un 35% de ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico no detectable.
H. Yamaha et al. En ``Industrial Applications of Single Cell Oils'', D. Kyle et al., Editores, AOCS, Champaign, IL, páginas 118-138 (1992) describe el uso de microorganismos fúngicos, especialmente Mortierella alpina, para la producción de ARA, AEP y otros ácidos grasos poliinsaturados. Se describen aceites fúngicos que contienen hasta aproximadamente un 65% de ARA.
De acuerdo con esto, permanece la necesidad de un procedimiento económico, viable comercialmente para producir ARA, preferiblemente sin producción contaminante de EPA. Es un objeto de la presente invención satisfacer esa necesidad.
Es objeto adicional de la invención proporcionar un aditivo, y una fuente para ese aditivo, para usar en una fórmula para lactantes de forma que os niveles de ARA en la fórmula se aproximen a aquellos niveles en la leche materna humana.
Es un objeto adicional de esta invención proporcionar un aceite fúngico que contiene ARA para uso en productos enterales, parenterales o dérmicos.
Sumario de la invención
Esta invención se refiere a la producción y uso de aceite fúngico que contiene ácido araquidónico (ARASCO) y a las composiciones que contienen tales aceites. El aceite se puede referir como aceite de organismo unicelular. Los hongos se cultivan en condiciones de producción de aceite, se recogen y el aceite se extrae y se recupera. El aceite, sin modificación química adicional, se puede usar directamente o proporcionar ARA suplementario a personas que requieren tal, incluyendo bebés recién nacidos, mujeres embarazadas o que dan de mamar o personas que muestran patologías de deficiencia en ARA. Las ventajas de esta invención incluyen su facilidad de producción, elevada pureza y falta de cantidades detectables de EPA.
La presente invención proporciona:
un procedimiento para la producción de un aceite que contiene ácido araquidónico (ARA) como se define en la reivindicación 1;
un aceite fúngico de triglicéridos no modificado como se define en la reivindicación;
un procedimiento para proporcionar triglicéridos que contienen ARA a una fórmula para lactantes como se define en la reivindicación 10;
una fórmula para lactantes que comprende triglicéridos que contienen ARA como se define en la reivindicación 11;
un procedimiento para la preparación de un compuesto farmacéutico para proporcionar ARA suplementario como se define en la reivindicación 12; y
una composición cosmética como se define en la reivindicación 22.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
``ARA'' y ``AEP'' también se usan en esta memoria descriptiva para referirse a residuos de ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico, respectivamente, cuando los residuos se esterifican a glicerol como parte de un triglicérido de acilo graso o un fosfolípido. Del modo que se usa en esta memoria descriptiva, una composición está ``esencialmente libre de AEP'' cuando la cantidad residual de AEP en la composición es menos que la cantidad que reduciría la síntesis de ARA cuando la composición se usa como un suplemento nutricional. La presente invención tiene éxito en proporcionar una fuente económica de ácido araquidónico (ARA).
En una realización, esta invención se refiere a un procedimiento para la producción de un ácido fúngico que contiene ácido araquidónico (ARASCO) el cual está sustancialmente libre de ácido eicosapentaenoico (AEP). Del modo que se usa en esta memoria descriptiva, ``sustancialmente libre'' significa que el AEP está presente en menos de aproximadamente una quinta parte de la cantidad de ARA en el aceite. Este aceite, un aceite de organismo unicelular, se puede administrar directamente, en una forma no modificada. Del modo que se usa en esta memoria descriptiva, ``no modificado'' significa que las propiedades químicas de los ácidos grasos, o de los mismos aceites, no se han alterado covalentemente. De esta forma, por ejemplo, una modificación temporal del ARASCO o del ARA que se pudiese revertir después de la absorción del aceite, no estaría tras el alcance de esta invención.
Los aceites fúngicos no modificados de acuerdo con esta invención proporcionan triglicéridos en los que una proporción relativamente elevada de residuos de ácidos grasos son ARA (al menos el 50% de los residuos son ARA) y la relación de residuos de ARA a residuos de AEP es también alta (al menos 10:1, preferiblemente al menos 20:1, peso/peso). No se ha descrito tal aceite procedente de fuentes naturales previo a esta invención. Mientras que los triglicéridos con tal composición se pueden sintetizar químicamente (por ejemplo, esterificando mezclas de ácidos grasos libres ricas en ARA o transesterificando con ésteres de etilo de tal mezcla de ácidos grasos), la manipulación de la mezcla de ácidos grasos (por ejemplo, purificación, esterificación, etc.) puede introducir productos secundarios no deseados. En contraste, el procedimiento de esta invención proporciona triglicéridos que tienen la composición deseada por extracción de fuentes naturales.
De aquellas especies fúngicas que previamente han tenido caracterizados sus ácidos grasos, se han encontrado que la mayoría no producen ARA (Weete, T.D., Fungal Lipid Biochemistry, Plenum Press, N.Y. (1974)). De estas especies que producen ARA, muchas, incluyendo todas las especies de Pythium previamente caracterizadas, producen cantidades significativas de ácido eicosapentaenoico (AEP) además de ARA. La Tabla 1 muestra el perfil de ácidos grasos de P. Insidiosum así como el perfil de ácidos grasos de otras especies de hongos.
TABLA 1 Composición de ácidos grasos de varias especies fúngicas
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|r|r|r|r|r|r|r|r|r|}\hline\multicolumn{10}{|c|}{Ácido
graso}\\\hline  Especies  \+ 14:0  \+ 16:0  \+ 16:1  \+ 18:1  \+
18:2  \+ 18:3  \+ 20.4  \+ 20:5  \+ Grasa \\   \+  \+  \+  \+  \+ 
\+  \+  \+  \+ total \\\hline   Mortierella alpina   \+ -  \+
8,2  \+ -  \+ 33,5  \+ 16,3  \+ 23,3  \+ 13,0  \+ -  \+ 3,0 \\\hline
  Mortierella elongata   \+ 2,0  \+ 13,2  \+ -  \+ 26,6  \+
11,9  \+ 13,2  \+ 13,8  \+ 2,4  \+  4,0 \\\hline   Mortierella
isabellina   \+ 0,3  \+ 15,7  \+ 0,8  \+ 55,8  \+ 11,1  \+ 9,0 
\+ -  \+ -  \+  7,3 \\\hline   Mortierella parasitica   \+ 7,4 
\+ 19,1  \+ 1,9  \+ 6,3  \+ 24,5  \+ 12,5  \+ 10,5  \+  10,5  \+ 9,3
\\\hline   Pythium catenulatum   \+ 6,5  \+ 9,9  \+ 10,3  \+
21,1  \+ 18,5  \+ 3,5  \+ 13,4  \+ 10,9   \+ 5,0 \\\hline 
 Pythium coloratum   \+ 13,6  \+ 9,9  \+ -  \+ 14,7  \+ 10,9 
\+ 2,5  \+ 24,3  \+ 21,7  \+  2,2 \\\hline   Pythium gracile  
\+ 14,7  \+ 9,1  \+ 2,2  \+ 14,8  \+ 12,6  \+ 3,6  \+ 22,1  \+ 5,7 
\+ 4,5 \\\hline   Pythium irregulare   \+ 10,3  \+ 15,4  \+ 6,9
 \+ 12,3  \+ 21,0  \+ 3,9  \+ 10,6  \+ 12,4   \+ 11,9 \\\hline 
 Pythium ultimum    \+ 9,5  \+ 16,7  \+ 10,5  \+ 17,1  \+ 20,7 
\+ 1,3  \+ 9,0  \+ 6,9  \+  13,3 \\\hline   Pythium insidiosum 
 \+ 9,5  \+ 11,4  \+ 12,1  \+ 1,0  \+ 8,3  \+ 9,3  \+ 31,9  \+  \+
2,8
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como con los aceites de pescado, los elevados niveles de AEP en suplementos dietéticos dan lugar a una reducción de la capacidad para formar ARA a partir del ácido linoleico (ALO) de la dieta.
De acuerdo con esto, la Mortierella alpina se usa en el procedimiento de la presente invención. Esta especie está comercialmente disponible y está en depósito con el American Type Culture Collective en Rockville, Maryland con el número de acceso 42430.
Uno de los problemas significativos con una realización de la presente invención sobreviene en la reducción de la biosíntesis de ARA en lactantes provocado por la presencia de niveles aumentados en la dieta de AEP. Este problema se puede corregir proporcionando ARA para su uso en una fórmula para lactantes a niveles sustancialmente similares a aquellos encontrados en la leche materna humana. Típicamente en la leche materna humana, la relación de ARA:AEP es aproximadamente 20:1. La presente invención contempla específicamente la producción de un aceite microbiano que proporcione una cantidad suficiente de ARA para superar los efectos negativos del AEP dietético. Preferiblemente, el uso del aceite que contiene ARA dará lugar a una relación ARA:AEP de al menos aproximadamente 5:1.
Más preferiblemente, la relación será de al menos aproximadamente 10:1, y lo más preferiblemente será de al menos aproximadamente 20:1. Como se puede ver, cuanto más alta es la cantidad de ARA en el producto final, con respecto a la cantidad de AEP, más deseable es el resultado.
En el procedimiento de la presente invención, los hongos se cultivan en condiciones de cultivo adecuadas de producción de aceites que contienen ARA, con la realización de un perfil de pH como se explica posteriormente. En general, las técnicas de cultivo de hongos son bien conocidas por los expertos en la técnica, y aquellas técnicas se pueden aplicar al procedimiento de la presente invención. Por ejemplo, el cultivo de una cantidad de inoculación de hongos puede darse en cultivo sumergido en matraces de agitación. Los matraces se proporcionan con un medio de crecimiento, sembrados con micelio fúngico y crecidos en un agitador vaivén durante aproximadamente tres a cuatro días.
La composición del medio de crecimiento puede variar pero siempre contiene fuentes de carbono y nitrógeno. Una fuente de carbono preferida es la glucosa, cantidades de la cual pueden extenderse de aproximadamente 10 a 100 gramos de glucosa por litro de medio de crecimiento. Típicamente se utilizan aproximadamente 15 gramos/litro para el cultivo en los matraces de agitación. La cantidad puede variar dependiendo de la densidad deseada del cultivo final. Otras fuentes de carbono que se pueden usar incluyen melazas, jarabe de maíz con alto contenido en fructosa, almidón hidrolizado o cualquier otra fuente de carbono convencional de bajo coste usada en procesos de fermentación. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las cantidades adecuadas de estas fuentes de carbono. Generalmente, se necesita añadir carbono adicional durante el curso del cultivo. Esto se debe a que los organismos tanto carbono añadirlo todo en un modo discontinuo podría resultar no manejable.
El nitrógeno se proporciona típicamente en la forma de extracto de levadura en una concentración de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 gramos de extracto por litro de medio de crecimiento. Preferiblemente, se proporcionan cuatro gramos por litro. Se pueden usar otras fuentes de nitrógeno, incluyendo peptona, triptona, licor de maíz impregnado, harina de soja, proteína vegetal hidrolizada, etc. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la cantidad que hay que añadir de estas fuentes. El nitrógeno se puede añadir en un modo discontinuo, es decir, todo al mismo tiempo antes del cultivo.
Después del cultivo durante 3-4 días a una temperatura adecuada, típicamente de aproximadamente 25 a 30ºC, ha crecido una cantidad de hongos, lo que es suficiente para uso en forma de inóculo en un fermentador de tanque agitado convencional (FTA). Los expertos en la técnica conocen tales fermentadores y están comercialmente disponibles. La fermentación se puede llevar a cabo en modos de fermentación discontinuo, alimentación discontinua o continuo. Preferiblemente, el FTA se equipa con una rueda de paletas marina, aunque también se puede usar un motor de turbina de tipo Rushton.
El fermentador se prepara añadiendo las fuentes de carbono y nitrógeno deseadas. Por ejemplo, se puede preparar un fermentador de 1,5 litros mezclando aproximadamente 50 gramos de glucosa y aproximadamente 15 gramos de extracto de levadura por litro de agua del grifo. Como se ha discutido previamente, se pueden usar otras fuentes de carbono o nitrógeno o mezclas de las mismas.
Se debería esterilizar el reactor que contiene la solución de nutrientes, por ejemplo, calentando antes de la inoculación. Después de calentar a aproximadamente 30ºC se puede añadir el inóculo e iniciar el cultivo. El intercambio de gases se proporciona burbujeando aire. La velocidad de burbujeo de aire puede variar, pero se fija preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4,0 VVM (volumen de aire por volumen del fermentador por minuto). Preferiblemente el nivel de oxígeno disuelto se conserva de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 50% del valor de saturación del aire de la disolución. De acuerdo con esto, se pueden requerir ajustes en la velocidad de burbujeo durante el cultivo. La rueda de paletas proporciona la agitación. La velocidad de agitación del extremo se fija preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 50 cm/sg a aproximadamente 500 cm/sg, preferiblemente de aproximadamente 100 a 200 cm/sg.
En general, la cantidad de inóculo puede variar. Típicamente, se puede usar de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 10% por volumen de inóculo. Preferiblemente, se puede usar aproximadamente un 5% en volumen de inóculo en un tren de siembra de fermentador.
Se debían controlar los niveles de nutrientes. Cuando los niveles de glucosa caen por debajo de 5 g/l, se debería añadir glucosa adicional. Un ciclo de cultivo típico utiliza aproximadamente 100 gramos de glucosa y aproximadamente 15 gramos de extracto de levadura por litro. Es deseable agotar el nitrógeno durante el curso del cultivo de forma que aumente la producción de aceite por M. alpina.
Se puede cultivar Mortierella alpina con un elevado contenido en aceite incluyendo elevados niveles de ARA, en un fermentador usando niveles de nutrientes muy elevados. Se ha descubierto inesperadamente que se pueden añadir al principio de la fermentación niveles de nutriente que contienen nitrógeno en exceso de ese proporcionado por 15 gramos/litro de extracto de levadura, mientras que la cantidad total de nutriente que contiene carbono añadido durante la fermentación es alta en comparación. La cantidad total de nutriente de carbono, preferiblemente alimentado continuamente o intermitentemente durante el primer 25-50% del curso del tiempo de fermentación, o en alícuotas a varios tiempos durante la misma porción del curso del tiempo, será preferiblemente equivalente a 75 a 300 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo (relación C:N \geq 5:1, expresada como peso de glucosa:peso de extracto de levadura). En un modo especialmente preferido, el nutriente de nitrógeno es harina de soja, añadida a un nivel de aproximadamente 16 gramos por litro de medio, y el nutriente de carbono está presente inicialmente a un nivel equivalente a aproximadamente de 80 gramos de glucosa o más. Cuando se usan elevados niveles de nutrientes de carbono y nitrógeno, es preferible esterilizar separadamente las disoluciones que contienen las disoluciones de los dos nutrientes. También se ha descubierto que se puede aumentar la producción de biomasa durante las fermentaciones que contienen elevados niveles de nutrientes de carbono reteniendo parte del nutriente de nitrógeno y alimentando continuamente el nutriente de nitrógeno que queda o en una o más alícuotas durante el curso de la fermentación.
Ocasionalmente, el cultivo el cultivo producirá una cantidad excesiva de espuma. Opcionalmente, se puede añadir un agente antiespumante, como por ejemplo aquellos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo Mazu 310® o un aceite vegetal.
La temperatura de cultivo puede variar. Sin embargo, aquellos hongos que producen ARA y AEP tienden a producir menos AEP y más ARA, cuando se cultivan a temperaturas más elevadas. Cuando se cultiva Mortierella alpina a menos de 18ºC, comienza a producir AEP. De esta forma es preferible mantener la temperatura a un nivel que induce la producción preferente de ARA. Las temperaturas adecuadas son típicamente de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 30ºC.
Preferiblemente, el cultivo continúa hasta que se alcanza una densidad de biomasa deseada. Una biomasa deseable es aproximadamente 25 g/l del organismo. Tal biomasa se alcanza típicamente dentro de las 48 a 72 horas después de la inoculación. A este tiempo, los organismos contienen típicamente de aproximadamente un 5 a aproximadamente un 40% de lípidos complejos, es decir, aceite, del cual, al menos un 25%, es ARA o preferiblemente al menos un 40% de residuos de ARA en la fracción de triglicéridos, más preferiblemente al menos un 50% de ARA en la fracción de triglicéridos, y se pueden recoger.
La fermentación fúngica para la producción de ARA de acuerdo con esta invención aumenta haciendo un perfil de pH del medio, mejor que dejando el aumento de pH incontrolado. Se pueden aumentar también las producciones manteniendo elevados los niveles de oxígeno durante la fermentación. Estas modificaciones del procedimiento de fermentación son especialmente efectivas cuando se usan niveles elevados de nutrientes en el fermentador.
Cuando el nivel de nutriente de nitrógeno inicial excede el equivalente de aproximadamente 15 gramos de extracto de levadura por litro, u/o el nivel de nutriente de carbono excede el equivalente de aproximadamente 150 gramos de glucosa por litro, se puede inhibir el crecimiento de los hongos. Esta inhibición del crecimiento se puede superar por fermentación alimentada en discontinuo, por ejemplo dividiendo el nutriente para la fermentación en alícuotas que se alimentan secuencialmente en el fermentador, una vez que se han metabolizado parte o todos los nutrientes suministrados por la alícuota previa. El beneficio de superar la inhibición del crecimiento se puede realizar alimentando solamente el nutriente de carbono (ver Shinmen, et al.). Se ha descubierto que este beneficio se puede obtener también dividiendo el nutriente total en alícuotas y alimentando las alícuotas durante la fermentación o alimentando continuamente la disolución de nutriente. De forma similar, se ha descubierto inesperadamente que el beneficio se puede alcanzar alimentando el nutriente de nitrógeno solamente a una fermentación en la que el nutriente de carbono está presente inicialmente a un nivel alto.
Se ha descubierto inesperadamente también que se puede mitigar la inhibición de crecimiento realizando un perfil de pH de la fermentación, manteniendo una tensión elevada de oxígeno en el fermentador, o ambos. Se ha descubierto que la fermentación de M. alpina en un medio rico en nutrientes a pH bajo (pH= 5-6) da lugar a un crecimiento de biomasa mejorado (y también a un aumento en la producción de aceite). Sin embargo, el aceite producido en estas condiciones tiene niveles más bajos de residuos de ARA en el aceite. De forma contraria, la fermentación a elevado pH (pH = 7-7,5) da lugar a niveles incrementados de ARA en el aceite, pero un crecimiento más pobre. El procedimiento de fermentación de esta invención conlleva realizar un perfil de pH en el que el pH es bajo durante las etapas tempranas de la fermentación y altas durante las etapas tardías. Las etapas tempranas incluyen períodos de crecimiento rápido (exponencial) durante los que los nutrientes se metabolizan rápidamente; las etapas tardías incluyen la fase estacionaria, cuando se detiene la división celular, generalmente debido a cantidades insuficientes de uno o más nutrientes, y se aumenta la producción de aceite rico en ARA. La realización del perfil se puede hacer controlando el pH del fermentador a niveles que se establecen en dos o más pasos espaciados durante el período de fermentación.
Se ha descubierto de forma parecida que manteniendo el contenido de oxígeno disuelto (O.D.) del medio a niveles elevados (por ejemplo, \geq 40% del nivel de saturación de aire) dará lugar a una mejora de la inhibición del crecimiento mediante niveles de nutrientes elevados y/o incremento del nivel relativo de residuos de ARA en el aceite. El O.D. se puede mantener a un nivel elevado incrementando la presión del recipiente (forzando más aire hacia el espacio superior del fermentador), incrementando la agitación (por ejemplo incrementando la velocidad en el extremo de la rueda de paletas) e incrementando la aireación (por ejemplo, incrementando la cantidad de aire que pasa a través del fermentador en un tiempo dado, generalmente expresado como incremento en VVM, volúmenes de aire por volúmenes de fermentador por minuto) y/o incrementando el contenido de O_{2} del gas de burbujeo. Se ha encontrado que la fermentación en estas condiciones aumenta la utilización de carbono, dando lugar a una concentración de biomasa final más alta y una mayor productividad de aceite rico en ARA en el fermentador. En particular, las fermentaciones que incorporan una o más de las modificaciones anteriores dan lugar a la producción de aceite de triglicéridos extraíble que tiene al menos un 40% de residuos de ARA, y preferiblemente al menos un 50% de residuos de ARA.
En una realización particularmente preferida, el medio de fermentación contiene nutriente de carbono equivalente a, o por encima de 80 g/l de glucosa y nutriente de nitrógeno equivalente a, o por encima de 15 g/l de extracto de levadura, y el medio se ajusta a pH entre 5 y 6 posterior a la esterilización. Después de la inoculación, el pH del medio se controla a o ligeramente por encima de nivel inicial. Una vez que el nivel del nutriente de carbono a caído por debajo de 60 gramos de glucosa equivalente/litro (generalmente aproximadamente 48 horas), el punto establecido para el control de pH se cambia a aproximadamente pH \geq 6. A o aproximadamente el tiempo cuando la velocidad de consumo de oxígeno (y/o la velocidad de evolución del dióxido de carbono, VED) alcanza su máximo (generalmente después de aproximadamente 72 horas), el punto establecido se eleva a pH entre 6,5 y 7 (generalmente de forma que aumenta, por ejemplo, a una velocidad de aproximadamente 0,1 unidades de pH por hora). El pH se controla luego para mantenerlo por debajo de un pH entre 7 y 7,5 para las etapas finales de la fermentación.
Para esta realización, el nivel de oxígeno disuelto en el medio (O.D.)se mantiene cerca o por encima de un 40% del nivel de saturación de aire, preferiblemente incrementando secuencialmente la presión del recipiente a 0,773 Kg/cm^{2} (74,8 kPa), incrementando la agitación al equivalente de aproximadamente una velocidad en el extremo de la rueda de paletas de 300 cm/sg e incrementando la aireación a aproximadamente 0,5 volúmenes de aire por volumen de fermentador por minuto. Después de un período de crecimiento rápido y de elevado consumo de O_{2} por la fermentación, el crecimiento (y el consumo de O_{2}) disminuirá. En este punto se puede disminuir agitación/aireación, mientras el O.D. se mantiene a un nivel alto, generalmente por encima de aproximadamente un 40% de saturación de aire.
Optimizando la fermentación de Mortierella alpina como se describe en esta memoria descriptiva, es posible obtener producciones muy elevadas de biomasa que contiene de un 20 a un 60% de aceite en la biomasa, donde de un 25 a un 70% en peso del aceite son residuos de ARA en forma de triglicérido. La biomasa (y el aceite) se pueden recoger como se describe en esta memoria descriptiva. Preferiblemente, la biomasa se recogerá del fermentador dentro de las 48 horas de alcanzar la máxima productividad, medida como gramos de ARA/l/día.
La recogida se puede hacer por medio de cualquier procedimiento adecuado tal como, por ejemplo, filtración, centrifugación o secando con vaporizador. Se puede preferir la filtración como consecuencia de un coste más bajo.
Después de recoger, se puede extraer la torta de micelio. La torta de micelio se refiere a la colección de biomasa resultante después de la recogida. La torta se puede soltar o presionar, desmenuzar o no desmenuzar. Opcionalmente, se puede haber eliminado el agua residual de la torta, como secando a vacío, secando en lecho fluidizado, secando con vaporizador o por liofilización, antes de la extracción. Si se selecciona esta opción, es preferible usar disolventes no polares para extraer el aceite que contiene ARA. Aunque cualquier extractante no polar es adecuado, se prefiere el hexano.
En una realización preferida, el aceite se extrae de la biomasa secada por trituración húmeda o precolación con hexano virgen. El disolvente se añade generalmente a una relación de disolvente a biomasa de aproximadamente 5:1 (peso/peso). Después de la trituración húmeda, los sólidos se separan del extracto por decantación o centrifugación. Es ventajoso mantener el extracto que contiene el disolvente (mezcla de hexano y aceite) anaeróbicamente para evitar la oxidación de los residuos de ácidos grasos insaturados en el aceite. Se elimina el disolvente de la mezcla de hexano y aceite para producir un aceite fúngico sin refinar.
El aceite sin refinar extraído de la biomasa fúngica con disolventes no polares puede estar turbio, particularmente cuando la biomasa está triturada, porque la trituración puede liberar partículas finas como por ejemplo fragmentos de paredes celulares u polisacáridos solubles. La clarificación de tal aceite turbio puede llevarse a cabo disolviendo el aceite sin refinar en disolventes más polares, tales como acetona o alcohol. En una realización preferida, el extracto de aceite sin refinar de los micelios fúngicos se clarifica además por extracción/precipitación con acetona. Una mezcla de hexano y aceite con acetona se prepara añadiendo acetona al extracto de aceite sin refinar turbio (preferiblemente a un nivel de aproximadamente un 20% de aceite; aproximadamente 4 volúmenes de acetona por volumen de aceite sin refinar), mezclando enérgicamente y dejando permanecer la mezcla durante un período suficiente para la precipitación de las partículas finas (generalmente, aproximadamente una hora a temperatura ambiente). La mezcla de hexano y aceite con acetona que contiene el aceite se clarifica por centrifugación y/o filtración y luego se elimina el disolvente para producir un aceite fúngico clarificado con acetona. El aceite fúngico clarificado con acetona se prefiere para procesado adicional (por ejemplo, desengomado, blanqueamiento y desodorancia por técnicas convencionales) porque las partículas finas producidas durante la extracción de la biomasa fúngica interferirán con los procedimientos de refinado si no se eliminan en la etapa de la acetona.
Otra realización preferida conlleva la extracción a contracorriente de la biomasa seca, la cual, se puede llevar a cabo en unidades de extracción comercialmente disponibles, por ejemplo, aquellas fabricadas por Crown Ironworks (Crown Mark IV) o French, Inc., que generalmente no se usan para extraer aceites vegetales, pero se diseñaron para extraer lodo y tierra. Aunque las eficacias de extracción no son tan altas sin la retrituración de la biomasa, el procedimiento de extracción a contracorriente tiene la ventaja de producir menos ``finos'' reduciendo de ese modo la dificultad técnica en recuperar un aceite refinado transparente.
De forma alternativa, la torta húmeda (la cual contiene típicamente aproximadamente de un 30 a un 50% de sólidos) puede desmenuzarse y extraerse directamente usando disolventes polares tales como etanol o alcohol isopropílico, o por extracción de fluidos supercríticos con disolventes tales como CO_{2} o NO. Preferiblemente, las tortas se desmenuzan antes de la extracción. Ventajosamente, la presente invención permite el uso económico de técnicas de extracción de fluidos supercríticos. McHugh, et al., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth (1986). Tales técnicas son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen a aquellas aplicadas en el presente, por ejemplo, para descafeinar granos de café.
Un procedimiento preferible de extracción acuosa conlleva mezclar la biomasa del micelio con el alcohol isopropílico como disolvente polar en una recipiente de reacción adecuada. Se conocen tales recipientes. Es deseable el uso de tres a seis partes de disolvente por parte de biomasa. Lo más preferiblemente, la mezcla se realiza en nitrógeno o en presencia de antioxidantes para prevenir la oxidación del ARA en el extracto lipídico. Del mismo modo que se usa en esta memoria descriptiva, ``extracto lipídico'', ``aceite'', ``complejo lipídico'' y ``aceite fúngico'' se usan de forma intercambiable.
Después de extraer, se puede filtrar la mezcla para eliminar la biomasa del disolvente que contiene el extracto lipídico. En este punto, la biomasa se puede recuperar y usar como suplemento alimentario. Del mismo modo que se usa en esta memoria descriptiva, ``suplemento alimentario'' significa alimento o aditivo para mezclarse con alimento típico, como por ejemplo grano, etc., que se puede proporcionar a animales.
El disolvente se separa del extracto lipídico y también se puede recuperar para volver a usarse, como por evaporación en un colector adecuado, dejando lo que en esta memoria descriptiva se refiere como el ``aceite sin refinar''. El uso de alcohol isopropílico como el disolvente da lugar deseablemente a la eliminación de cualquier agua residual del aceite sin refinar, ya que la evaporación elimina el azeótropo agua/alcohol isopropílico el cual se ha formado espontáneamente.
Mientras el aceite sin refinar se puede usar sin tratamiento adicional, también se puede purificar aún más. Los procedimientos tales como aquellos usados en la preparación de lecitina a partir de productos vegetales, y conocidos por los expertos en la técnica, se pueden usar en esta etapa de purificación adicional. Tales procedimientos no modifican química o covalentemente los lípidos que contienen ARA o el mismo ARA.
Las producciones varían, pero están típicamente entre 5 gramos de fosfolípido que contiene ARA por 100 gramos de micelios secados. En el caso de M. alpina, se pueden obtener unos 10 a 50 gramos adicionales de triglicérido por 100 gramos de micelios secos. Se pueden usar tanto el aceite sin refinar como el producto refinado para administración a humanos. Ambos se incluirán dentro de la definición de ARASCO del mismo modo que se usa en esta memoria descriptiva.
El objeto más preferido de la invención es proporcionar un aditivo para su uso con fórmulas para lactantes humanas, de tal forma que la concentración de ARA en tal fórmula se aproxime estrechamente a la concentración de ARA en leche materna humana. La Tabla 2 compara la composición de los ácidos grasos en ARASCO con aquellos en leche materna y en una fórmula para lactantes que carece y que contiene ARASCO.
TABLA 2 Composición de ácidos grasos de productos de aceites fúngicos y leche materna
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline
 Ácido graso  \+ ARASCO  \+ Fórmula para  \+ Fórmula+aceite  \+
Leche materna \\   \+  \+ lactantes ^{1}  \+ \+ \\\hline  8:0  \+
-  -  \+ 24,1  \+ 23,6  \+ 0,35 \\\hline  10:0  \+ -  - 
\+ 17,7  \+ 17,3  \+ 1,39 \\\hline  12:0  \+ -  -  \+ 14,9  \+
14,6  \+ 6,99 \\\hline  14:0  \+ 4,6  \+ 5,8  \+ 5,8  \+ 7,96
\\\hline  16:0  \+ 16,0  \+ 6,8  \+ 7,0  \+ 19,80 \\\hline  16:1  \+
3,2  \+ 0,2  \+ 0,3  \+ 3,20 \\\hline  18:0  \+ -  -  \+ 2,3 
\+ 2,3  \+ 5,91 \\\hline  18:1  \+ 26,4  \+ 10,0  \+ 10,3  \+ 34,82
\\\hline  18:2n6  \+ 9,9  \+ 17,4  \+ 17,3  \+ 16,00 \\\hline 
18:3n3  \+ 4,1  \+ 0,9  \+ 1,0  \+ 0,62 \\\hline  20:1  \+ 2,2  \+
0,1  \+ 0,14  \+ 1,10 \\\hline  20:2n6  \+ -  -  \+ -  - 
\+ -  -  \+ 0,61 \\\hline  20:3n6  \+ 1,4  \+ -  -  \+
0,03  \+ 0,42 \\\hline  20:4n6  \+ 32,0  \+ -  -  \+ 0,64  \+
0,59 \\\hline  20:5n3  \+ -  -  \+ -  -  \+ -  -  \+
0,03 \\\hline  22:1  \+ -  -  \+ -  -  \+ -  -  \+
0,10 \\\hline  22:4n6  \+ -  -  \+ -  -  \+ -  -  \+
0,21 \\\hline  22:5n6  \+ -  -  \+ -  -  \+ -  -  \+
0,22 \\\hline  22:6n3  \+ -  -  \+ -  -  \+ -  -  \+
0,19
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
1. Simopoulis, A., Omega-3 Fatty Acids in Health and Disease, páginas 115-156 (1990).
Como se puede ver, la cantidad de ARA presente en la fórmula para lactantes suplementada con ARASCO se aproxima estrechamente a los niveles de ARA en leche materna humana. Adicionalmente, la composición total de ácidos grasos de la fórmula para lactantes no se ha alterado significativamente por la adición del ARASCO. Se pueden usar típicamente entre aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 mg de ARASCO por litro de fórmula para lactantes. La cantidad específica de ARASCO requerida depende del contenido en ARA. El aceite usado para suplementar la fórmula para lactantes contiene al menos un 50% de residuos de ácidos grasos como el ARA. Si el contenido en ARA fuera aproximadamente un 30%, la velocidad de suplementación sería aproximadamente de 600 a 700 mg de ARASCO por litro de fórmula para lactantes. Tal velocidad diluye los componentes grasos pre-existentes de una fórmula para lactantes como por ejemplo Similac® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) por solamente una parte de ARASCO a cincuenta partes de aceites de la fórmula. Se pueden calcular velocidades de dilución similares para aceites que contienen contenidos de ARA más elevados. Preferiblemente, el ARASCO está sustancialmente libre de AEP.
Cuando se usa Mortierella alpina en este procedimiento, el aceite que contiene ARA es predominantemente triglicérido. Este ARASCO es útil como aditivo en una fórmula para lactantes. El aceite de M. alpina es probable que sea económico de producir.
El aceite que contiene ARA de la presente invención tiene muchos usos además de su uso como aditivo para una fórmula para lactantes. Como saben los expertos en la técnica, existen muchas patologías asociadas a las deficiencias de ARA, como por ejemplo el marasmo (Vajreswari, et al., Metabolism 39:779-782 (1990)), enfermedades atópicas (Melnik, B., Monatsschr. Kinderheilta, 138:162-166 (1990)), enfermedad hepática, fenilcetonuria, esquizofrenia, discinesia tardía o varios trastornos peroxisomales. En una realización de la presente invención, esas patologías se tratan administrando una cantidad farmacéuticamente efectiva del aceite de la presente invención. La cantidad farmacéuticamente efectiva es típicamente la cantidad requerida para normalizar el nivel de en ARA en el paciente. Los aceites con elevado contenido en ARA descritos anteriormente son particularmente preferidos para la suplementación para tratar tales patologías. El aceite se puede administrar enteralmente, tópicamente o parenteralmente, como selecciona el proveedor del cuidado de la salud.
La encapsulación, como la conocen los expertos en la técnica, es un procedimiento efectivo de administración enteral. Las cápsulas que contienen el aceite fúngico se pueden administrar a aquellas personas que requieren o desean suplementación de ARA en la dieta. Tal procedimiento es particularmente efectivo para administrar ARA a mujeres embarazadas o que amamantan a lactantes.
En los casos donde se administra ARASCO para combatir la deficiencia de ARA asociada a patologías, se debería administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva. Los expertos en la técnica pueden determinar esta cantidad sin experimentación indebida. Esta cantidad es típicamente 0,5 a 2,0 g/día, lo que generalmente normalizará el nivel en suero de ARA.
Otra realización de la presente invención conlleva composiciones cosméticas que contienen ARASCO, como por ejemplo los aceites con alto contenido en ARA descritos en esta memoria descriptiva. Las composiciones cosméticas se refieren a aquellos compuestos aplicados como cosméticos. Un ejemplo preferido de tal composición es una crema para las arrugas. Tales composiciones cosméticas proporcionan un medio efectivo para aplicar el ARA tópicamente a la piel para ayudar a mantener el tono de la piel.
Habiéndose descrito la invención de forma general, se establecen los siguientes ejemplos específicos no limitantes para ilustrar aún más la invención. Los Ejemplos 1 y 2 son ejemplos de la técnica anterior tomados del documento WO92/13086. Los Ejemplos 3 a 6 no están de acuerdo con la invención pero incluyen material útil para el entendimiento del Ejemplo 7. El Ejemplo 7 está de acuerdo con la invención.
Ejemplo 1 (técnica anterior)
Preparación de lípido de P. Insidiosum y adición a una fórmula para lactantes
En un fermentador de 80 litros (volumen bruto) se mezclaron 51 litros de agua del grifo, 1,2 kg de glucosa, 240 gramos de extracto de levadura y 15 ml de agente antiespumante MAZU 210S®. El fermentador se esterilizó a 121ºC durante 45 minutos. Se añadieron 5 litros más de agua de condensación durante el procedimiento de esterilización. El pH se ajustó a 6,2, y luego se añadió 1 litro de inóculo (a una densidad celular de 5 a 10 g/l) de Pythium insidiosum (ATCC #28251). La velocidad de agitación se ajustó a 125 RPM (250 cm/sg de velocidad del extremo) y la velocidad de aireación se ajustó a 0,028 m^{3} por minuto (1 PCME (pie cúbico por minuto estándar)). En la hora 24 en la operación se incrementó la velocidad de aireación a 0,084 m^{3} por minuto (3 PCME). En la hora 28 se añadieron 2 litros más de jarabe de glucosa al 50% (1 kg de glucosa). En la hora 50 se recolectó el fermentador, dando lugar a una producción de aproximadamente 2,2 kg en peso húmedo (aproximadamente 15 g de peso seco) por litro. La biomasa recogida se apretó hasta una torta con alto contenido en sólidos (50% de sólidos) en un filtro de succión antes de secar por congelación. La biomasa secada se trituró con un mortero y maja y se extrajo con un litro de hexano por 200 gramos de biomasa seca a temperatura ambiente en condiciones de agitación durante dos horas. La mezcla se filtró después y el filtrado se evaporó para producir aproximadamente de 5 a 6 gramos de aceite sin refinar por 100 gramos de biomasa seca. La biomasa se reextrajo luego con un litro de etanol por 20 gramos de biomasa seca durante una hora a temperatura ambiente, se filtró, y el disolvente se evaporó produciendo 22 gramos más de aceite sin refinar por 100 gramos de biomasa seca. La segunda fracción era predominantemente fosfolípidos mientras que la primera fracción contenía una mezcla de fosfolípidos y triglicéridos. Las fracciones combinadas produjeron un aceite que contenía aproximadamente de un 30 a un 35% de ácido araquidónico y AEP no detectable. Este aceite se añadió gota a gota a la fórmula para lactantes comercial producto Similac® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) a una velocidad de suplementación de 60 mg por litro de medio preparado.
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Ejemplo 2 (técnica anterior)
Preparación de lípido de M. alpina y adición a una fórmula para lactantes
Se creció Mortierella alpina (ATCC #42430) en un matraz de agitación de 2 litros que contenía 1 litro de agua del grifo y 20 gramos de medio de dextrosa de patata. El matraz estaba con agitación orbital constante y se mantuvo a 25ºCdurante siete días. Después de recoger por centrifugación, la biomasa se secó por congelación produciendo aproximadamente 8 gramos de micelios ricos en lípidos. Los micelios se extrajo usando hexano como en el ejemplo #1 y se produjeron aproximadamente 2,4 gramos de aceite sin refinar. El aceite contiene aproximadamente un 23% de ácido araquidónico y se añadió a la fórmula comercial Similac® gota a gota en concentraciones de 1000 mg por litro.
Ejemplo 3 (no de acuerdo con la invención)
Producción a gran escala de ácido araquidónico por M. alpina
Se inocula el fermentador de inoculación que contiene medio GYE (50 g/l de dextrosa y 6 g/l de Tastona 154) con M. alpina. La temperatura de fermentación se fija a 28ºC, agitación inicial de 130 a 160 cm/sg, presión inicial del recipiente a 0,422 kg/cm^{2} (40,8 kPa) y velocidad de aireación inicial a 0,25 VVM. El pH se fija a 5,0 antes de la esterilización, y el pH inicial de la fermentación se fija a 5,5 después de la esterilización. El medio se mantiene a un pH igual o por encima de 5,5 con NaOH 8N. El nivel de oxígeno se mantiene a un O.D. igual o por encima de un 40% estableciendo la agitación/aireación en la siguiente secuencia: incrementar la presión del recipiente a 0,773 kg/cm^{2} (74,8 kPa); incrementar la agitación a una velocidad en el extremo de la rueda de paletas de 175 cm/sg; e incrementar la aireación a 0,5 VVM. La formación de espuma se controla por adición de agentes antiespumante Dow 1520-US, como sea necesario. (Se deberían añadir al medio aproximadamente 0,1 ml/l del agente antiespumante antes de la esterilización para ayudar a prevenir la formación de espuma).
Transferir el inóculo del fermentador de siembra al fermentador principal dentro de las 12 horas después de que el pH suba a aproximadamente 6,0.
El fermentador principal contiene medio GYE (50 g/l de dextrosa y 6 g/l de Tastona 154); la glucosa se esteriliza de forma separada y se añade al fermentador principal después de la esterilización. La temperatura del fermentador se fija a 28ºC, agitación inicial a 160 cm/sg, presión inicial del recipiente a 0,422 kg/cm^{2} (40,8 kPa) y velocidad de aireación inicial a 0,15 VVM. El pH inicial se fija a 5,5 y se mantiene a un pH igual o por encima de 5,5 con NaOH 8N. Se deja subir el pH durante la fase estacionaria (comenzando aproximadamente24 horas después de la inoculación), pero se mantiene por debajo de pH 6,8 con adición de H_{2}SO_{4}. El nivel de oxígeno se mantiene a un O.D. igual o por encima de un 40% incrementando secuencialmente la presión del recipiente a 0,773 kg/cm^{2} (74,8 kPa), incrementando la agitación a 175 cm/sg de velocidad en el extremo de la rueda de paletas, e incrementando la aireación a 0,5 VVM. La formación de espuma se controla por adición de agente antiespumante Dow 1520-US, como sea necesario. (Se deberían añadir al medio aproximadamente 0,1 ml/l del agente antiespumante antes de la esterilización para ayudar a prevenir la formación de espuma).
Se toman muestras del cultivo cada 12 horas para análisis de biomasa y de ácidos grasos, y la recogida se inicia a los 3-4 días después de que el pH sube a 6,5. La densidad de biomasa seca debería ser igual o por encima de 8,5 g/l. La concentración de glucosa en el caldo debería haber caído de 50 g/l a igual o por encima de 25 g/l. En la recogida, el caldo de cultivo completo pasa a través de una centrífuga de cesta para separar los micelios del medio gastado, y se seca la biomasa.
Ejemplo 4 (no de acuerdo con la invención)
Producción aumentada de biomasa a partir de M. alpina - primera ronda
Se cultivó M. alpina en fermentadores de tanque agitado de 20 l, inoculado desde el cultivo del matraz de agitación, de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. El cultivo de M. alpina en 65 g/l de glucosa (Staleydex), y 6 g/l de extracto de levadura (Tastona 154), dio lugar a la producción de 12 g/l de biomasa. La adición de 6 g/l adicionales de Tastona 154 a las 16 horas, dio lugar a la producción de 18 g/l de biomasa.
Ejemplo 5 (no de acuerdo con la invención)
Producción aumentada de biomasa a partir de M. alpina - segunda ronda
Los experimentos se llevaron a cabo en un intento de incrementar aún más la biomasa mediante adiciones adicionales de Tastona 154. Estos experimentos constaban de 2 fermentaciones de 20 l, de 168 horas de residencia. Para ambas fermentaciones, la concentración de glucosa inicial era 100 g/l (como se compara con 65 g/l para el Ejemplo 4). Un fermentador recibía tres adiciones de 6 g/l de Tastona 154, y el otro recibía 4 adiciones de 6 g/l. El extracto de levadura se realizó en forma de disolución concentrada, se trató en autoclave, y se añadió al fermentador a varios tiempos después de la esterilización.
Para preparar el inóculo, se inocularon los sembrados de trabajo (1 ml de micelio macerado) en 2 matraces, conteniendo cada uno 50 ml de medio GYE (100 g/l de Staleydex, 6 g/l de Tastona 154), y se crecieron durante 4 días a 28ºC y a 150 rpm. Después de 4 días de crecimiento, el caldo contenía biomasa sedimentada; los sedimentos tenían un diámetro de 2 a 5 mm. El crecimiento en estos matraces fue más lento de lo esperado, posiblemente debido a la mayor concentración de glucosa. Se maceró la biomasa durante 3 segundos 2 veces en un mezclador Waring, y se usaron 25 ml de macerado para inocular 800 ml de volumen neto en cada uno de los matraces de inóculo Fernbach de 2,8 l. (En experimentos anteriores, se habían usado 10 ml de macerado. La cantidad de inóculo se incrementó, como consecuencia de la densidad más baja en el matraz de siembra, y porque se esperaba que el crecimiento podía ser más lento en los Fernbachs, debido a la concentración más alta de glucosa). El medio en los matraces Fernbach era 100 g/l de dextrosa (Staleydex) y 8 g/l de extracto de levadura (Tastona 154). La dextrosa y el extracto de levadura se trataron en autoclave de forma separada durante 40 minutos. La temperatura de fermentación del sembrado se mantuvo a 28ºC y a una agitación de 100 rpm a 150 rpm.
Después de 44 horas de cultivo en los matraces Fernbach, el inóculo se transfirió a dos fermentadores de 20 l. El inóculo estaba en la forma de agregados de hifas muy sueltos y la densidad de la biomasa era aproximadamente 5,2 g/l.
Los fermentadores en las estaciones 14 y 15, que contenían 1,6 kg (10%) de dextrosa (Staleydex) y agente antiespumante Mazu 204 (1,6 g, disueltos en 12,5 l de agua R.O.), se esterilizaron durante 45 minutos a 122ºC. Se añadieron luego 800 ml de inóculo (5%) a cada fermentador (a las 0 horas). Los parámetros de operación de los fermentadores eran:
temperatura: 28ºC,
pH: controlado a 5,5 con NaOH 2N y H_{2}SO_{4}2N,
aireación: 0,5 VVM,
contrapresión : 20 kPa
agitación (inicial): 80 cm/sg, y
O.D.. controlado por encima de un 40%.
Estación 14: 3 X 6 g/l de Tastona 154
El extracto de levadura (Tastona 154) de disolvió a una concentración de 96 g/l y se trató en autoclave durante 1 hora. Se hicieron 3 alimentaciones de extracto de levadura de 1 l (1,8%) a las 0, 20 y 26 horas.
A las 15 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40% y se incrementó la agitación gradualmente a 175 cm/sg de 15 a 22 horas. El O.D. se controló luego corrigiendo el flujo de aire con oxígeno; el oxígeno se añadió al flujo de aire de 23 a 72 horas. Comenzando a las 36 horas, la agitación se incrementó aún más para asegurar una mezcla apropiada. A las 48 horas, la agitación se había incrementado a 200 cm/sg; a las 72 horas, a 250 cm/sg; y a las 80 horas, a 280 cm/sg. A las 120 horas, la agitación se incrementó a 290 cm/sg para promocionar un control adecuado de la temperatura. A las 144 horas, la agitación se redujo a 280 cm/sg.
Estación 15: 4 X 6 g/l de Tastona 154
Se disolvieron 384 g del extracto de levadura (Tastona 154) en 96 g/l, y se trataron en autoclave durante 1 hora. Se hicieron adiciones de extracto de levadura en 4 cantidades de 1 l (2,4%) a las 0, 20, 26 y 32 horas.
A las 16 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40% y la agitación se incrementó gradualmente a 175 cm/sg a las 23 horas. El O.D. se controló luego por encima de un 40%corrigiendo el flujo de aire con oxígeno; el oxígeno se añadió al flujo de aire de 23 a 72 horas. Comenzando a las 36 horas, la agitación se incrementó aún más para asegurar una mezcla apropiada. A las 48 horas, la agitación se había incrementado a 210 cm/sg; a las 72 horas, a 260 cm/sg; y a las 80 horas, a 290 cm/sg. A las 90 horas, se redujo la agitación a 280 cm/sg, y a las 144 horas, se redujo a 260 cm/sg.
Observaciones
En la inoculación, la biomasa en los dos fermentadores estaba en la forma de agregados muy sueltos en forma de pluma. A las 24 horas, se comenzaron a formar los sedimentos. Los sedimentos eran pequeños (de 1 a 3 mm), con núcleos centrales pequeños y periferias amplias sueltas. A las 48 horas, los sedimentos eran más grandes y mejor definidos. A las 72 horas, las periferias eran más estrechas, y la presencia de muchos fragmentos sueltos indicaba que los fragmentos estaban fragmentándose. A las 168 horas, los núcleos de los sedimentos tenían un diámetro de 0,5 a 2 mm, se redujeron las periferias con la agregación de hifas en hebras gruesas y se dieron muchos agregados de hifas condensadas.
Los fermentadores produjeron espuma sólo ligeramente durante las primeras 24 horas. La cantidad de formación de espuma se incrementó luego y se controló por adición manual de un agente antiespumante cuando la espuma superior era mayor de 2 a 4 cm. La formación de espuma había disminuido de alguna forma a las 48 horas, aunque se dieron brotes esporádicos. En ambos fermentadores se formó espuma en los filtros de salida una vez durante el curso de las fermentaciones. Las fermentaciones requirieron aproximadamente 150 ml de agente antiespumante.
Ambos fermentadores acumulaban una cantidad considerable de biomasa acumulada en el espacio superior. Éste es un problema común con fermentación de micelios en fermentadores pequeños con relaciones grandes de área superficial/volumen. La cantidad de biomasa acumulada en la Estación 15 parecía aumentar durante las últimas 24 horas, cuando el nivel de volumen reducido dio lugar a una cantidad considerable de salpicadura (el nivel de líquido se estaba aproximando al tope del propulsor). El volumen final en los fermentadores después de 168 horas fue de aproximadamente 13 l.
Un examen microscópico mostró que, a las 72 horas, había muchos residuos presentes en el caldo de cultivo, y había alguna evidencia de extremos fúngicos dañados y atrofiados. La presencia de gotitas de aceite en el citoplasma se demostró por tinción con rojo nilo a las 168 horas. Las gotitas de aceite eran pequeñas y numerosas, en contraste con las grandes gotas de aceite vistas algunas veces. La producción de biomasa y de aceite, junto con la utilización de carbono y nitrógeno se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3 Curso de los tiempos de fermentación
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|r|r|r|r|r|r|r|}\hline\multicolumn{7}{|c|}{Estación
14}\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{3 X 6 g/l de E.L.}\\\hline  Registro
 \+ Glucosa  \+ NH _{3}   \+ Peso seco  \+ Contenido  \+ Contenido 
\+  Productividad \\  de horas  \+  \+  \+  \+ en aceite  \+ en ARA
\+ \\\hline   \+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (mM) 
\+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (% de peso  \+ (% de aceite)  \+ (g
 aceite/l/d) \\   \+  \+  \+  \+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+
\\\hline  0  \+ 105,0  \+ 3,0  \+ 0,4 \+ \+ \+ \\\hline  24  \+ 97,4
 \+ 5,9  \+ 3,3  \+ 4,8%  \+ 23,5%  \+ 0,16 \\\hline  48  \+ 73,7 
\+ 0  \+ 18,3  \+ 7,9%  \+ 23,4%  \+ 0,72 \\\hline  72  \+ 60,3  \+
0  \+ 21,0  \+ 14,4%  \+ 25,4%  \+ 1,01 \\\hline  96  \+ 48,0  \+ 0 
\+ 22,3  \+ 18,3%  \+ 27,5%  \+ 1,02 \\\hline  120  \+ 40,0  \+  \+
25,2  \+ 21,1%  \+ 29,4%  \+ 1,06 \\\hline  144  \+ 34,7  \+  \+
26,6  \+ 21,8%  \+ 30,9%  \+ 0,97 \\\hline  168  \+ 29,0  \+  \+
27,5  \+ 26,1%  \+ 31,3%  \+ 1,03
\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{ \relax }\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{Estación
15}\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{4 X 6 g/l de E.L.}\\\hline  
Registro  \+ Glucosa  \+ NH _{3}   \+ Peso seco  \+ Contenido  \+
Contenido  \+  Productividad \\  de horas  \+  \+  \+  \+ en aceite 
\+ en ARA \+ \\\hline   \+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (mM) 
\+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (% de peso  \+ (% de aceite)  \+ (g
 aceite/l/d) \\   \+  \+  \+  \+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+
\\\hline  0  \+ 109,0  \+ 2,9  \+ 0,4 \+ \+ \+ \\\hline  24  \+
103,0  \+ 5,1  \+ 3,4  \+ 4,3%  \+ 21,9%  \+ 0,15 \\\hline  48  \+
74,1  \+ 0,3  \+ 23,6  \+ 6,8%  \+ 23,1%  \+ 0,80 \\\hline  72  \+
51,4  \+ 0  \+ 29,8  \+ 10,3%  \+ 23,9%  \+ 1,02 \\\hline  96  \+
40,0  \+ 0  \+ 32,7 \+ \+ \+ \\\hline  120  \+ 27,9  \+  \+ 31,7  \+
18,2%  \+ 26,6%  \+ 1,15 \\\hline  144  \+ 19,8  \+  \+ 33,5  \+
20,7%  \+ 28,1%  \+ 1,16 \\\hline  168  \+ 11,0  \+  \+ 29,9  \+
21,7%  \+ 29,9%  \+ 0,93
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 6 (no de acuerdo con la invención)
Producción aumentada de biomasa a partir de M. alpina - tercera ronda
Esta serie de experimentos intentó incrementar aún más la cantidad de producto obtenido incrementando los niveles de fosfato y minerales. El procedimiento fue esencialmente aquel del Ejemplo 5, excepto que la dextrosa y el agente antiespumante Mazu 204 se disolvieron en 11,5 l de H_{2}O R.O., en lugar de 12,5 l, para las soluciones salinas que se añadieron a las 30 horas. La estación 14 recibió Fe adicional, Zn y Cu; la estación 15 recibió fosfato adicional, así como Fe, Zn y Cu.
Estación 14: 3 X 6 g/l de Tastona 154
Se disolvió el extracto de levadura en 96 g/l, en tres cantidades de 1 l, y se trató en autoclave durante 1 hora. Se añadieron alícuotas de un litro de la solución de extracto de levadura a las 0, 22 y 28 horas. A las 22 y 28 horas, la velocidad de evolución del dióxido de carbono (VED, una indicación de la velocidad metabólica en el fermentador) crecía exponencialmente, y la fermentación acababa de comenzar a requerir base. Las sales de alimento contenían:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 FeCl _{3}  \+ \qquad  480 mg\cr  ZnSO _{4}\cdot 7H _{2} O \+ \qquad
240 mg\cr  CuSO _{4}\cdot 5H _{2} O \+  \qquad 16
mg\cr}
El FeCl_{3} se disolvió en 1 l de ácido cítrico 5 g/l. Se añadieron las sales que quedaban, y el pH se ajustó a 4,5 con NaOH. La solución se trató en autoclave durante 1 hora. Las sales de alimento se añadieron a las 30 horas.
La velocidad de agitación inicial para el fermentador era 50 cm/sg, en lugar de 80 cm/sg, como se planeó originalmente, porque el nivel inicial de líquido en el fermentador (13 l) dio lugar a que el tope del motor a penas se sumergiera, y la mayor velocidad de agitación dio lugar significativamente a más salpicadura. A las 16 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40%, y la velocidad se incrementó gradualmente a 175 cm/sg a las 28 horas. El O.D. se controló luego por encima de un 45% para corregir el flujo de aire con oxígeno. A las 46 horas, la agitación se incrementó a 190 cm/sg para permitir la mezcla. La agitación se incrementó aún más a 200 cm/sg a las 48 horas, a 220 cm/sg a las 51 horas, a 235 cm/sg a las 53 horas, a 250 cm/sg a las 56 horas, a 260 cm/sg a las 57 horas y a 280 cm/sg a las 70 horas. Incluso a esta velocidad de agitación (450 rpm), la mezcla era pobre. Mientras que se mantuvo un mínimo criterio de ``algún movimiento'', el recambio de biomasa era muy lento, y algunas áreas se estancaron. La adición de unas pocas gotas de agente antiespumante redujeron la espuma de la parte superior, y se eliminaron bolsillos de estancamiento. A las 116 horas, se redujo la agitación a 265 cm/sg y a las 120 horas, se había reducido aún más a 250 cm/sg.
El fermentador comenzó a formar espuma aproximadamente a las 18 horas. La formación de espuma se controlaba por adición manual de agente antiespumante. El agente antiespumante se añadió primero a las 20 horas. A las 24 horas, la fermentación estaba generando espuma de forma significativa, y requirió de adición regular de agente antiespumante. A las 72 horas, la formación de espuma había amainado considerablemente. Sin embargo, la fermentación todavía requería la adición ocasional de agente antiespumante.
A las 24 horas, la biomasa estaba en la forma de sedimentos muy sueltos (1 a 2 mm) y de agregados de hifas sueltos. Había una cantidad considerable de residuos celulares. A las 48 horas, la biomasa estaba en forma de agregados de hifas muy sueltos, sedimentos muy pequeños (1 a 2 mm) con núcleos muy pequeños y periferias sueltas, y sedimentos compactos pequeños (1 a 3 mm) sin periferias sueltas. A las 96 horas, la biomasa estaba en forma de sedimentos redondos compactos (1 a 2 mm), sedimentos en forma de aguja (menos de 0,5 mm), y de agregados de hifas sueltos. La tinción con rojo nilo a las 144 horas mostró la presencia de muchas gotas de aceite muy pequeñas en los micelios.
Estación 15: 3 X 6 g/l de Tastona 154
El extracto de levadura se disolvió en 96 g/l, y se trató en autoclave durante 1 hora. La disolución de extracto de levadura se añadió en tres cantidades de 1 la las 0, 22 y 26 horas. A las 22 y 26 horas, el VED crecía exponencialmente y la fermentación acababa de empezar a requerir base.
Se preparó una sal de alimento que contenía:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  KH _{2}  PO _{4}   \+ \qquad 77 g\cr  FeCl _{3}     \+ \qquad 480
mg\cr  ZnSO _{4}\cdot 7H _{2} O \+ \qquad  240 mg\cr 
CuSO _{4}\cdot 5H _{2} O  \+ \qquad 16
mg\cr}
El FeCl_{3} se disolvió en 500 ml de ácido cítrico 5 g/l. Se añadieron las sales que quedaban, y el pH se ajustó a 4,5 con NaOH. Ambas soluciones se trataron en autoclave durante 1 hora y luego se enfriaron a 23ºC antes de combinarse y añadirse al fermentador a las 30 horas.
La velocidad de agitación inicial en el fermentador era 50 cm/sg, en lugar de 80 cm/sg, como se planeó originalmente, porque el nivel inicial de líquido en el fermentador (13 l) dio lugar a que el tope del motor a penas se sumergiera, y la mayor velocidad de agitación dio lugar significativamente a más salpicadura. A las 16 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40%, y la velocidad se incrementó gradualmente a 175 cm/sg a las 27 horas. El O.D. se controló luego por encima de un 40% para corregir el flujo de aire con oxígeno. A las 41 horas, la agitación se incrementó a 200 cm/sg para considerar al menos un mínima cantidad de mezcla. La agitación se incrementó aún más a 220 cm/sg a las 42 horas, a 230 cm/sg a las 46 horas, a 235 cm/sg a las 51 horas y a 240 cm/sg a las 70 horas. A esta velocidad de agitación (410 rpm), la mezcla estaba sólo pobremente clara. Se mantuvo un nivel mínimo de movimiento de biomasa. A las 80 horas, la agitación se redujo a 205 cm/sg.
El fermentador comenzó a formar espuma aproximadamente a las 18 horas. La formación de espuma se controlaba por adición manual de agente antiespumante. El agente antiespumante se añadió primero a las 17 horas. A las 20 horas, la fermentación estaba generando espuma de forma significativa, y requirió de adición regular de agente antiespumante. A las 72 horas, la formación de espuma había amainado considerablemente. Sin embargo, la fermentación todavía requería la adición ocasional de agente antiespumante.
A las 24 horas, la biomasa estaba en la forma de sedimentos muy sueltos (1 a 2 mm) y de agregados de hifas sueltos. Había una cantidad considerable de residuos celulares. A las 48 horas, la biomasa estaba en forma de agregados de hifas muy sueltos, sedimentos muy pequeños (1 a 2 mm) con núcleos muy pequeños y perifierias sueltas, y sedimentos compactos pequeños (1 a 3 mm) sin periferias sueltas. A las 96 horas, la biomasa estaba en forma de sedimentos redondos compactos, de 1 a 2 mm de diámetro, muchos con periferias sueltas con aspectos de pelos y muchos fragmentos de hifas sueltos. La tinción con rojo nilo a las 144 horas mostró la presencia de muchas gotas de aceite muy pequeñas en los micelios. La tinción con el rojo nilo a las 144 horas mostró la presencia de muchas gotas de aceite muy pequeñas en algunos micelios, y también la presencia de gotas de aceite muy grandes a lo largo de otros micelios.
La Estación 15, la cual difería de la estación 14 solamente en la adición de fosfato, mostró una mejor mezcla a lo largo de la fermentación a velocidades de agitación generalmente más bajas. La estación 15 también mostraba una morfología de la biomasa ``más suelta''. La producción de biomasa y de aceite, así como la utilización del carbono están en la Tabla 4. La utilización de mayores cantidades de glucosa (82 g/l para la Estación 15 comparado con 64 g/l para la Estación 14), mayor acumulación de biomasa, y presencia de gotas de aceite más grandes en porciones de los micelios caracterizaban el fermentador que contenía mayor cantidad de fosfato.
TABLA 4 Curso de los tiempos de fermentación
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|r|r|r|r|r|r|}\hline\multicolumn{6}{|c|}{Estación
14}\\\hline\multicolumn{6}{|c|}{+ Sales}\\\hline  Registro  \+
Glucosa  \+ Peso seco  \+ Contenido  \+ Contenido  \+ Productividad
\\  de horas  \+  \+  \+ en aceite  \+ en ARA \+ \\\hline  
\+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (% de
peso  \+ (% de aceite)  \+ (g aceite/l/d) \\   \+  \+ 
\+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+ \\\hline  0  \+ 116,0  \+ 1,1 \+
\+ \+ \\\hline  24  \+ 101,0  \+ 1,8  \+ 1,2%  \+ 22,2%  \+ 0,02
\\\hline  48  \+ 84,0  \+ 14,3  \+ 6,2%  \+ 24,7%  \+ 0,44 \\\hline 
72  \+ 60,0  \+ 24,5  \+ 10,6%  \+ 24,2%  \+ 0,87 \\\hline  96  \+
45,0  \+ 28,2  \+ 15,5%  \+ 25,3%  \+ 1,09 \\\hline  120  \+ 34,0 
\+ 28,9  \+ 18,1%  \+ 26,6%  \+ 1,05 \\\hline  144  \+ 27,0  \+ 30,8
 \+ 20,8%  \+ 27,2%  \+ 1,07
\\\hline\multicolumn{6}{|c|}{ \relax }\\\hline\multicolumn{6}{|c|}{Estación
15}\\\hline\multicolumn{6}{|c|}{+ Sales + Fosfatos}\\\hline  
Registro  \+ Glucosa  \+ Peso seco  \+ Contenido en  \+ Contenido 
\+ Productividad \\  de horas  \+  \+  \+ aceite  \+ en ARA \+
\\\hline   \+ (g/l)  \+ (g/l)  \+ (% de peso  \+ (% de aceite)  \+
(g aceite/l/d) \\   \+  \+  \+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+
\\\hline  0  \+ 113,0  \+ 0,4 \+ \+ \+ \\\hline  24  \+ 101,0  \+
2,1  \+ 1,1%  \+ 24,0%  \+ 0,02 \\\hline  48  \+ 74,0  \+ 21,7  \+
8,1%  \+ 24,7%  \+ 0,88 \\\hline  72  \+ 51,0  \+ 26,2  \+ 19,9%  \+
26,5%  \+ 1,74 \\\hline  96  \+ 31,0  \+ 30,1  \+ 25,5%  \+ 28,6% \+
\\\hline  120  \+ 18,0  \+ 33,8  \+ 31,7%  \+ 31,4%  \+ 2,14
\\\hline  144  \+ 6,0  \+ 34,5  \+ 36,0%  \+ 32,9%  \+ 2,07
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 7 (de acuerdo con la invención)
Producción a gran escala de biomasa de M. alpina que contiene ácido araquidónico
Se inocula un fermentador de siembra que contiene medio GYE (50 g/l de dextrosa y 6 g/l de Tastona 154) a partir del fermentador de propagación. La temperatura se mantiene a 28ºC y la agitación inicial se fija de 130 a 160 cm/sg (aproximadamente 43 rpm). La presión inicial del recipiente es 0,422 kg/cm^{2} (40,8 kPa) y la velocidad de aireación inicial se fija a 0,25 VVM. El pH se fija a 5,0 antes de la esterilización y luego el pH inicial del fermentador se fija a 5,5 después de la esterilización. El nivel de oxígeno en el medio se mantiene con O.D. igual o por encima de un 40% mediante la siguiente secuencia: (i) aumentar la presión del recipiente a 0,773 kg/cm^{2} (74,8 kPa), (ii) aumentar la agitación de 156 a 175 cm/sg de velocidad del extremo de la rueda de paletas, y (iii) incrementar la aireación a 0,5 VVM. La formación de espuma se controla por adición de agente antiespumante Dow 1520-US, como se necesita. (Se deberían añadir al medio aproximadamente 0,1 ml/l de agente antiespumante antes de la esterilización para ayudar a prevenir la formación de espuma). Después de la inoculación, el cultivo se mantiene a pH \geq 5,5 con NaOH 8N.
En las doce horas después de que el pH suba por encima de 6,0, los contenidos del fermentador de siembra se transfieren al fermentador principal. El medio del fermentador principal contiene:
80 g/l de dextrosa (ADM)
16 g/l de harina de soja (ADM nutrisoy)
30 mg/l de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O (Sigma/Aldrich)
1,5 mg/l deZnSO_{4}\cdot7H_{2}O (Sigma/Aldrich)
0,1 mg/l deCuSO_{4}\cdot5H_{2}O (Sigma/Aldrich)
1 mg/l de biotina (Sigma/Aldrich)
2 mg/l de tiamina\cdotHCl(Sigma/Aldrich)
2 mg/l de ácido pantoténico (sal de hemicalcio) (Sigma/Aldrich)
(El pH se fija de 4,8 a 5,0 después de la esterilización)
Se inocula el fermentador principal con el fermentador de siembra (11,8%). La temperatura del fermentador se mantiene a 28ºC. La agitación inicial se fija a 162 cm/sg (aproximadamente 23 rpm), la presión inicial del recipiente a 0,422 kg/cm^{2} (40,8 kPa) y la velocidad de aireación inicial a 0,15 VVM (aproximadamente 300 scfh).
El nivel de oxígeno en el medio se mantiene a O.D. \geq 40% i) incrementando la presión del recipiente a 0,773 kg/cm^{2} (74,8 kPa), ii) incrementando la agitación a 300 cm/sg de velocidad del extremo de la rueda de paletas (en incrementos de aproximadamente 30 cm/sg), y iii) incrementando la aireación a 0,5 VVM.
Se realiza un perfil de pH de acuerdo con el siguiente protocolo de control de pH:
\bullet
Se fija el pH inicial a 5,5 después de la esterilización. Mantener el pH a \geq 5,5 con NaOH 8N.
\bullet
A las 24 a 36 horas después de la inoculación, añadir lo siguiente: 2 g/l de KH_{2}PO_{4} (110 kg en aproximadamente 700 l de H_{2}O).
\bullet
A las 48 horas, si la concentración de dextrosa es \geq 60 g/l, cambiar el punto de ajuste del pH a \geq 6,1.
\bullet
A las 72 horas, comenzar a elevar lentamente el punto de ajuste de pH a \geq 6,6 a una velocidad de aproximadamente 0,1 unidades de pH por hora.
\bullet
Mantener el pH por debajo de 7,3 con adición de H_{2}SO_{4} si es necesario.
Se toman muestras del fermentador cada 12 horas para análisis de biomasa y ácidos grasos, y la recogida se comienza aproximadamente tres días después de la elevación de pH a \geq 6,6 (aproximadamente 6 días después de la inoculación). La densidad de la biomasa seca debería ser \geq 24 g/l. La concentración de dextrosa en el caldo debería haber caído de 80 g/l a \leq 14 g/l.
La recogida se lleva a cabo pasando todo el caldo del cultivo a través de un filtro a vacío rotatorio para separar los micelios del medio gastado.
Los resultados de dos procesos típicos de fermentación de acuerdo con el procedimiento de este Ejemplo se muestran en las Tablas 5 y 6.
TABLA 5 Progreso de la fermentación con M. Alpina
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|}\hline\multicolumn{7}{|l|}{Medios
de cultivo = glucosa (80 g/l) + harina de soja (16 g/l)
+}\\\multicolumn{7}{|l|}{sales + vitaminas}\\\hline  Registro  \+
Glucosa  \+ NH _{3}   \+ Peso  \+ Contenido en  \+ Contenido  \+ 
Productividad \\  de horas  \+ (g/l)  \+ (mM)  \+ seco  \+ aceite (%
de  \+ en ARA (%  \+ (g de \\   \+  \+  \+ (g/l)  \+ peso seco)  \+
de aceite)  \+ aceite/l/d) \\\hline  0  \+ 58,0 \+ \+ \+ \+ \+
\\\hline  66  \+ 43,0  \+  \+ 12,6  \+ 14,9%  \+ 33,7%  \+ 0,68%
\\\hline  94  \+ 33,0  \+  \+ 17,0  \+ 27,0%  \+ 40,0%  \+ 1,17%
\\\hline  118  \+ 23,0  \+  \+ 20,6  \+ 28,2%  \+ 42,6%  \+ 1,18%
\\\hline  142  \+ 16,0  \+  \+ 17,1  \+ 39,2%  \+ 44,2%  \+ 1,13%
\\\hline  165  \+ 9,6  \+  \+ 21,5  \+ 41,5%  \+ 45,5%  \+ 1,30%
\\\hline  188  \+ 5,2  \+  \+ 19,8  \+ 41,7%  \+ 47,3%  \+ 1,05%
\\\hline  215  \+ 1,7  \+  \+ 23,2  \+ 46,0%  \+ 48,9%  \+ 1,19%
\\\hline  237  \+ 0,2  \+  \+ 23,1  \+ 44,8%  \+ 51,2%  \+ 1,05%
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA 6 Progreso de la fermentación con M. Alpina
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|}\hline\multicolumn{7}{|l|}{Medios
de cultivo = glucosa (65 g/l) + harina de soja (16 g/l)
+}\\\multicolumn{7}{|l|}{sales + vitaminas + antibióticos}\\\hline 
Registro  \+ Glucosa  \+ NH _{3}   \+ Peso  \+ Contenido en  \+
Contenido  \+  Productividad \\  de horas  \+ (g/l)  \+ (mM) \+ seco
 \+ aceite (% de  \+ en ARA (%  \+ (g de \\   \+  \+  \+ (g/l)  \+
peso seco)  \+ de aceite)  \+ aceite/l/d) \\\hline  0 \+ \+ \+ \+ \+
\+ \\\hline  65  \+ 36,0  \+  \+ 13,0  \+ 8,2%  \+ 29,0%  \+ 0,39
\\\hline  90  \+ 23,0  \+  \+ 12,0  \+ 18,0%  \+ 42,0%  \+ 0,58
\\\hline  115  \+ 15,0  \+  \+ 14,0  \+ 30,0%  \+ 47,0%  \+ 0,88
\\\hline  139  \+ 9,0  \+  \+ 15,0  \+ 32,0%  \+ 51,0%  \+ 0,83
\\\hline  171  \+ 4,6  \+  \+ 17,0  \+ 36,0%  \+ 55,0%  \+ 0,86
\\\hline  209  \+ 1,4  \+  \+ 12,0  \+ 36,0%  \+ 57,0%  \+ 0,50
\\\hline  243  \+ 0  \+  \+ 14  \+ 37,0%  \+ 60,0%  \+ 0,51 \\\hline
 187  \+ 0  \+  \+ 13  \+ 34,0%  \+ 64,0%  \+ 0,57
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Claims (22)

1. Un procedimiento para la producción de un aceite que contiene ácido araquidónico, conteniendo dicho aceite triglicéridos en los que al menos un 25% de residuos de ácidos grasos son ácido araquidónico (ARA), y la cantidad de residuos de ácido eicosapentaenoico (AEP) en el aceite no es más de una quinta parte de la cantidad de residuos de ácido araquidónico (ARA), comprendiendo:
(a)
cultivar Mortierella alpina en un fermentador aireado que contiene medio de fermentación;
(b)
mantener el pH entre 5 y 6 al comienzo del cultivo;
(c)
mantener el pH entre 7 y 7,5 al final del cultivo; y
(d)
recoger la biomasa del fermentador; y
(e)
recuperar dicho aceite que contiene ácido araquidónico a partir de dicha biomasa.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que una fuente de carbono en una cantidad equivalente o mayor que 80 g/l de glucosa y una fuente de nitrógeno en una cantidad equivalente o mayor que 15 g/l de extracto de levadura se añaden al medio de fermentación durante el curso de la fermentación.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que el nivel de oxígeno disuelto en el medio de cultivo es al menos un 35% del nivel de saturación del aire.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fuente de nitrógeno se divide en dos o más alícuotas que se alimentan al interior del fermentador en tiempos diferentes, alimentándose al menos una alícuota al interior del fermentador a un tiempo diferente del tiempo al que se coloca la fuente de carbono en el fermentador.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que además el aceite sin refinar que contiene ácido araquidónico se recupera de la biomasa por extracción con un disolvente no polar y el aceite sin refinar se clarifica por extracción con un disolvente orgánico polar.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el disolvente no polar es hexano.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, en el que el disolvente polar es acetona, etanol o alcohol isopropílico.
8. Un aceite fúngico de triglicéridos no modificado obtenible a partir de M. Alpina en el que más de un 50% de los residuos de ácidos grasos son residuos de ácido araquidónico (ARA) presentes en forma de triglicéridos y en el que el aceite comprende no más de una décima parte como mucho de ácido eicosapentaenoico (AEP) como ARA.
9. El aceite de la reivindicación 8, que comprende al menos un 50% de ácido araquidónico (ARA) en forma de triglicérido y esencialmente nada de ácido eicosapentaenoico (AEP).
10. Un procedimiento para proporcionar un triglicérido que contiene ácido araquidónico (ARA) a una fórmula para lactantes, lo cual comprende añadir el aceite de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9 a una fórmula para lactantes en una cantidad suficiente para proporcionar un contenido en ácido araquidónico (ARA) que corresponda a la cantidad de ácido araquidónico (ARA) en la leche materna humana.
11. Una fórmula para lactantes que comprende un triglicérido que contiene ácido araquidónico (ARA) en una cantidad comparable a la cantidad en leche materna humana en la que se proporciona el ácido araquidónico (ARA) añadiendo una cantidad suficiente del aceite de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9 a una fórmula para lactantes.
12. Un procedimiento para la preparación de un compuesto farmacéutico para proporcionar ácido araquidónico (ARA) suplementario a un ser humano que necesite del mismo, que comprende formular el aceite de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9 en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, en el que dicho compuesto farmacéutico se formula para proporcionar una cantidad efectiva de ácido araquidónico (ARA) para proporcionar ácido araquidónico (ARA) suplementario a dicho ser humano.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho compuesto farmacéutico se formula para proporcionar de 0,2 a 0,8 gramos de ácido araquidónico (ARA)/día.
14. El procedimiento de la reivindicación 12 o de la reivindicación 13, en el que dicho compuesto farmacéutico es aceptable farmacológicamente para administración enteral.
15. El procedimiento de la reivindicación 12 o de la reivindicación 13, en el que dicho compuesto farmacéutico es aceptable farmacológicamente para administración parenteral.
16. El procedimiento de la reivindicación 12 o de la reivindicación 13, en el que dicho compuesto farmacéutico es aceptable farmacológicamente para administración tópica.
17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho ser humano es una mujer embarazada o que amamanta a un lactante.
18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho ser humano en necesidad de ácido araquidónico (ARA) suplementario sufre un trastorno neurológico.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el trastorno neurológico es discinesia tardía, esquizofrenia o trastorno peroxisomal.
20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que dicho ser humano en necesidad de ácido araquidónico (ARA) suplementario sufre una condición de enfermedad asociada con un nivel reducido de ácido araquidónico (ARA) en suero.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la enfermedad es una enfermedad hepática, fenilcetonuria o fibrosis cística.
22. Una composición cosmética que comprende el aceite de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9, en el que dicho aceite está presente en dicha composición en una cantidad efectiva para ayudar a mantener el tono de la piel cuando dicha composición se aplica tópicamente.
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