ES2197233T3 - Acido araquidonico, procedimientos de produccion y uso del mismo. - Google Patents
Acido araquidonico, procedimientos de produccion y uso del mismo.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCESOS PARA LA PRODUCCION DE ACEITES QUE CONTIENEN ACIDO ARAQUIDONICO, PREFERIBLEMENTE EXENTOS DE ACIDO EICOSAPENTANOICO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A COMPOSICIONES QUE CONTIENEN ACEITES CON CANTIDADES MUY ALTAS DE ACIDO ARAQUIDONICO EN FORMA DE TRIGLICERIDOS, Y A USOS DE DICHOS ACEITES. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, SE CULTIVA MORTIERELLA ALPINA UTILIZANDO CONDICIONES QUE PRODUCEN ACEITE DE TRIGLICERIDOS CON NIVELES PARTICULARMENTE ELEVADOS DE RESIDUOS DE ACIDO ARAQUIDONICO, DE FORMA QUE SE RECOGE LA BIOMASA Y EL ACEITE SE EXTRAE, SE RECUPERA Y SE UTILIZA COMO ADITIVO PARA FORMULAS INFANTILES.
Description
Ácido araquidónico, procedimientos de producción
y uso del mismo.
Esta invención se refiere a un procedimiento para
la producción de un aceite que contiene ácido araquidónico, a un
aceite fúngico de triglicéridos no modificado que contiene ácido
araquidónico y a los usos de dicho aceite.
El ácido araquidónico (ARA) es un ácido graso
poliinsaturado (PUFA) de cadena larga de la clase
omega-6 (ácido 5, 8, 11,
14-eicosatetraenoico, es decir, 20:4). El ARA es
el OUFA de C_{20} más abundante en el cuerpo humano. Es
particularmente prevalente en órganos, músculos y en tejidos
sanguíneos, desempeñando un papel fundamental como lípido
estructural asociado predominantemente con fosfolípidos en sangre,
hígado, músculo y otros sistemas de órganos mayores. Además de su
papel principal como lípido estructural el ARA es también el
precursor directo para varios eicosanoides circulatorios, como por
ejemplo la prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), la prostaciclina
I_{2} (PGI_{2}), el tromboxano A_{2} (TxA_{2}) y los
leucotrienos B_{4} (LTB_{4}) y C_{4} (LTC_{4}). Estos
eicosanoides muestran efectos reguladores en el metabolismo de
lipoproteínas, reología sanguínea, tono vascular, función
leucocitaria y activación de plaquetas.
A pesar de su importancia en el metabolismo
humano, el ARA no se puede sintetizar de novo en humanos. El
ARA se sintetiza por elongación y desaturación de ácido linoleico
(ALO), un ácido graso esencial. Este procedimiento requiere de la
presencia de la enzima \Delta6-desaturasa, una
enzima presente en el cuerpo humano en bajos niveles (Burre et
al., Lipids, 25:354-356 (1990)). De
acuerdo con esto, la mayoría del ARA se debe proporcionar en la
dieta, y ésta es especialmente importante durante las épocas de
crecimiento corporal muy rápido, como por ejemplo la infancia.
Durante el primer año de su vida, un lactante
puede duplicar o triplicar su peso. Como consecuencia, se requieren
elevados niveles de ARA en la dieta. Para satisfacer esta demanda
en aumento, la leche materna humana contiene elevados niveles de ARA
(Sanders et al., Am. J. Clin. Nutr.,
31:805-813 (1978)). El ARA es el PUFA de C_{20}
más extendido en la leche materna. Muchas de aquellas madres,
especialmente las vegetarianas, que alimentan a sus bebés dándoles
el pecho, se beneficiarían con ARA adicional en la dieta. Sin
embargo, muchas madres no dan el pecho a sus bebés, o no les dan el
pecho durante el período completo del crecimiento rápido del bebé,
eligiendo en su lugar utilizar una fórmula para lactantes.
El Solicitante no conoce fórmulas infantiles
comerciales que contengan ARA en forma de triglicérido. La patente
de EE.UU. nº 4.670.285 (Clandinin et al.) describe los
requerimientos de los lactantes en lo referente a ácidos grasos
incluyendo el ARA. Para proporcionar estos ácidos grasos, Clandinin
et al. sugieren una mezcla de yema de huevo, aceite de
pescado o fosfolípidos de células sanguíneas rojas y aceites
vegetales como el componente graso de una fórmula para lactantes
propuesta. Sin embargo, el aceite de pescado contiene elevadas
cantidades de ácido eicosapentaenoico (AEP). Se sabe que el AEP
reduce la síntesis de ARA en lactantes (Carlson, et al.,
INFORM, 1:306 (1990)). De esta forma, sería deseable ser
capaces de proporcionar ARA sin proporcionar también AEP adicional.
Además, las yemas de huevo contienen una concentración relativamente
baja de ARA, tanto que la mezcla de Clandinin et al. no
resulta viable económicamente.
Como el ARA está presente en animales, pero no en
vegetales, su producción en cantidades comerciales ha permanecido
como una meta deseable, pero difícil de conseguir. Shinmen, et
al. (Microbiol. Biotech. 31.11-16 (1989))
han informado de la producción de ARA por un hongo aislado,
Mortierella alpina, usando una fermentación convencional en
tanque agitado. (Ver también la patente japonesa 1.215.245 a Shinmen
et al.). Después de cultivar, se recolectan los organismos
y se secan. Se extraen sus lípidos a partir de la biomasa fúngica
con un disolvente orgánico y se modifican químicamente
(covalentemente) los lípidos. Por ejemplo, la mezcla lipídica se
hidroliza o se convierte en ésteres de etilo y luego se combinan
con ciclodextrina previo a su uso como suplemento dietético.
Shinmen, et al. no describen o sugieren la administración de
aceites microbianos no modificados.
La Porphyridium cruentum, una microalga
roja, se puede crecer en grandes cantidades en estanques y tiene un
contenido lipídico que puede contener hasta un 40% de ARA (Ahem,
et al. Biotech Bioeng. 25:1057-1070 (1983)).
Desafortunadamente, el ARA se asocia fundamentalmente con
galactolípidos, un lípido polar complejo no presente en la leche
materna. De esta forma, no sólo se produce el ARA total utilizable a
una fracción de un uno por ciento de biomasa, sino que la forma
del ARA no es adecuada para uso como aditivo en una fórmula para
lactantes sin modificación adicional.
La patente de EE.UU. nº 4.870.011 (Suzuki et
al.) describe un procedimiento para obtener lípidos como por
ejemplo el ácido \gamma-linolénico procedente del
hongo del género Mortierella. El ácido
\gamma-linolénico se purifica a partir de la
mezcla de lípidos contenida en el hongo.
El documento DE 3603000ª1 (Milupa) describe una
mezcla grasa de ácidos altamente poliinsaturados y su uso como el
componente graso de una fórmula para lactantes. La mezcla grasa
tiene un alto contenido en ARA y en ácido docosahexanoico (ADH) en
una relación de 2,5:1 respectivamente, así como un alto contenido en
colesterol. Las fuentes de ácidos grasos se enumeran como son
ciertos tipos de macroalgas, aceites de pescado, grasas de órganos
de res o cerdo o aceite de yema de huevo altamente refinado. Se
dice que una fuente de ADH y de ARA son las macroalgas del tipo
facofitas y rodofitas. No hay sugerencia de usar ningún microbio
como una fuente de aceite. Los aceites de algas y de pescado
incluyen típicamente AEP que reduce la síntesis de ARA in
vivo. De forma adicional, el aceite de yema de huevo altamente
refinado no es una fuente económica de ARA. Además, no hay una
descripción en eso de un aditivo concentrado en ARA para suplementar
fórmulas infantiles pre-existentes.
El documento WO92/13086 describe la preparación y
uso de aceites fúngicos de Pythium insidiosum en forma de
aditivos para una fórmula para lactantes. Los aceites contienen de
un 30% a un 35% de ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico no
detectable.
H. Yamaha et al. En ``Industrial
Applications of Single Cell Oils'', D. Kyle et al.,
Editores, AOCS, Champaign, IL, páginas 118-138
(1992) describe el uso de microorganismos fúngicos, especialmente
Mortierella alpina, para la producción de ARA, AEP y otros
ácidos grasos poliinsaturados. Se describen aceites fúngicos que
contienen hasta aproximadamente un 65% de ARA.
De acuerdo con esto, permanece la necesidad de un
procedimiento económico, viable comercialmente para producir ARA,
preferiblemente sin producción contaminante de EPA. Es un objeto de
la presente invención satisfacer esa necesidad.
Es objeto adicional de la invención proporcionar
un aditivo, y una fuente para ese aditivo, para usar en una fórmula
para lactantes de forma que os niveles de ARA en la fórmula se
aproximen a aquellos niveles en la leche materna humana.
Es un objeto adicional de esta invención
proporcionar un aceite fúngico que contiene ARA para uso en
productos enterales, parenterales o dérmicos.
Esta invención se refiere a la producción y uso
de aceite fúngico que contiene ácido araquidónico (ARASCO) y a las
composiciones que contienen tales aceites. El aceite se puede
referir como aceite de organismo unicelular. Los hongos se cultivan
en condiciones de producción de aceite, se recogen y el aceite se
extrae y se recupera. El aceite, sin modificación química adicional,
se puede usar directamente o proporcionar ARA suplementario a
personas que requieren tal, incluyendo bebés recién nacidos, mujeres
embarazadas o que dan de mamar o personas que muestran patologías de
deficiencia en ARA. Las ventajas de esta invención incluyen su
facilidad de producción, elevada pureza y falta de cantidades
detectables de EPA.
La presente invención proporciona:
un procedimiento para la producción de un aceite
que contiene ácido araquidónico (ARA) como se define en la
reivindicación 1;
un aceite fúngico de triglicéridos no modificado
como se define en la reivindicación;
un procedimiento para proporcionar triglicéridos
que contienen ARA a una fórmula para lactantes como se define en la
reivindicación 10;
una fórmula para lactantes que comprende
triglicéridos que contienen ARA como se define en la reivindicación
11;
un procedimiento para la preparación de un
compuesto farmacéutico para proporcionar ARA suplementario como se
define en la reivindicación 12; y
una composición cosmética como se define en la
reivindicación 22.
``ARA'' y ``AEP'' también se usan en esta memoria
descriptiva para referirse a residuos de ácido araquidónico y ácido
eicosapentaenoico, respectivamente, cuando los residuos se
esterifican a glicerol como parte de un triglicérido de acilo graso
o un fosfolípido. Del modo que se usa en esta memoria descriptiva,
una composición está ``esencialmente libre de AEP'' cuando la
cantidad residual de AEP en la composición es menos que la cantidad
que reduciría la síntesis de ARA cuando la composición se usa como
un suplemento nutricional. La presente invención tiene éxito en
proporcionar una fuente económica de ácido araquidónico (ARA).
En una realización, esta invención se refiere a
un procedimiento para la producción de un ácido fúngico que contiene
ácido araquidónico (ARASCO) el cual está sustancialmente libre de
ácido eicosapentaenoico (AEP). Del modo que se usa en esta memoria
descriptiva, ``sustancialmente libre'' significa que el AEP está
presente en menos de aproximadamente una quinta parte de la cantidad
de ARA en el aceite. Este aceite, un aceite de organismo unicelular,
se puede administrar directamente, en una forma no modificada. Del
modo que se usa en esta memoria descriptiva, ``no modificado''
significa que las propiedades químicas de los ácidos grasos, o de
los mismos aceites, no se han alterado covalentemente. De esta
forma, por ejemplo, una modificación temporal del ARASCO o del ARA
que se pudiese revertir después de la absorción del aceite, no
estaría tras el alcance de esta invención.
Los aceites fúngicos no modificados de acuerdo
con esta invención proporcionan triglicéridos en los que una
proporción relativamente elevada de residuos de ácidos grasos son
ARA (al menos el 50% de los residuos son ARA) y la relación de
residuos de ARA a residuos de AEP es también alta (al menos 10:1,
preferiblemente al menos 20:1, peso/peso). No se ha descrito tal
aceite procedente de fuentes naturales previo a esta invención.
Mientras que los triglicéridos con tal composición se pueden
sintetizar químicamente (por ejemplo, esterificando mezclas de
ácidos grasos libres ricas en ARA o transesterificando con ésteres
de etilo de tal mezcla de ácidos grasos), la manipulación de la
mezcla de ácidos grasos (por ejemplo, purificación, esterificación,
etc.) puede introducir productos secundarios no deseados. En
contraste, el procedimiento de esta invención proporciona
triglicéridos que tienen la composición deseada por extracción de
fuentes naturales.
De aquellas especies fúngicas que previamente han
tenido caracterizados sus ácidos grasos, se han encontrado que la
mayoría no producen ARA (Weete, T.D., Fungal Lipid
Biochemistry, Plenum Press, N.Y. (1974)). De estas especies que
producen ARA, muchas, incluyendo todas las especies de
Pythium previamente caracterizadas, producen cantidades
significativas de ácido eicosapentaenoico (AEP) además de ARA. La
Tabla 1 muestra el perfil de ácidos grasos de P. Insidiosum
así como el perfil de ácidos grasos de otras especies de
hongos.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|r|r|r|r|r|r|r|r|r|}\hline\multicolumn{10}{|c|}{Ácido graso}\\\hline Especies \+ 14:0 \+ 16:0 \+ 16:1 \+ 18:1 \+ 18:2 \+ 18:3 \+ 20.4 \+ 20:5 \+ Grasa \\ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ \+ total \\\hline Mortierella alpina \+ - \+ 8,2 \+ - \+ 33,5 \+ 16,3 \+ 23,3 \+ 13,0 \+ - \+ 3,0 \\\hline Mortierella elongata \+ 2,0 \+ 13,2 \+ - \+ 26,6 \+ 11,9 \+ 13,2 \+ 13,8 \+ 2,4 \+ 4,0 \\\hline Mortierella isabellina \+ 0,3 \+ 15,7 \+ 0,8 \+ 55,8 \+ 11,1 \+ 9,0 \+ - \+ - \+ 7,3 \\\hline Mortierella parasitica \+ 7,4 \+ 19,1 \+ 1,9 \+ 6,3 \+ 24,5 \+ 12,5 \+ 10,5 \+ 10,5 \+ 9,3 \\\hline Pythium catenulatum \+ 6,5 \+ 9,9 \+ 10,3 \+ 21,1 \+ 18,5 \+ 3,5 \+ 13,4 \+ 10,9 \+ 5,0 \\\hline Pythium coloratum \+ 13,6 \+ 9,9 \+ - \+ 14,7 \+ 10,9 \+ 2,5 \+ 24,3 \+ 21,7 \+ 2,2 \\\hline Pythium gracile \+ 14,7 \+ 9,1 \+ 2,2 \+ 14,8 \+ 12,6 \+ 3,6 \+ 22,1 \+ 5,7 \+ 4,5 \\\hline Pythium irregulare \+ 10,3 \+ 15,4 \+ 6,9 \+ 12,3 \+ 21,0 \+ 3,9 \+ 10,6 \+ 12,4 \+ 11,9 \\\hline Pythium ultimum \+ 9,5 \+ 16,7 \+ 10,5 \+ 17,1 \+ 20,7 \+ 1,3 \+ 9,0 \+ 6,9 \+ 13,3 \\\hline Pythium insidiosum \+ 9,5 \+ 11,4 \+ 12,1 \+ 1,0 \+ 8,3 \+ 9,3 \+ 31,9 \+ \+ 2,8 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Como con los aceites de pescado, los elevados
niveles de AEP en suplementos dietéticos dan lugar a una reducción
de la capacidad para formar ARA a partir del ácido linoleico (ALO)
de la dieta.
De acuerdo con esto, la Mortierella alpina
se usa en el procedimiento de la presente invención. Esta especie
está comercialmente disponible y está en depósito con el American
Type Culture Collective en Rockville, Maryland con el número de
acceso 42430.
Uno de los problemas significativos con una
realización de la presente invención sobreviene en la reducción de
la biosíntesis de ARA en lactantes provocado por la presencia de
niveles aumentados en la dieta de AEP. Este problema se puede
corregir proporcionando ARA para su uso en una fórmula para
lactantes a niveles sustancialmente similares a aquellos
encontrados en la leche materna humana. Típicamente en la leche
materna humana, la relación de ARA:AEP es aproximadamente 20:1. La
presente invención contempla específicamente la producción de un
aceite microbiano que proporcione una cantidad suficiente de ARA
para superar los efectos negativos del AEP dietético.
Preferiblemente, el uso del aceite que contiene ARA dará lugar a una
relación ARA:AEP de al menos aproximadamente 5:1.
Más preferiblemente, la relación será de al menos
aproximadamente 10:1, y lo más preferiblemente será de al menos
aproximadamente 20:1. Como se puede ver, cuanto más alta es la
cantidad de ARA en el producto final, con respecto a la cantidad de
AEP, más deseable es el resultado.
En el procedimiento de la presente invención, los
hongos se cultivan en condiciones de cultivo adecuadas de
producción de aceites que contienen ARA, con la realización de un
perfil de pH como se explica posteriormente. En general, las
técnicas de cultivo de hongos son bien conocidas por los expertos
en la técnica, y aquellas técnicas se pueden aplicar al
procedimiento de la presente invención. Por ejemplo, el cultivo de
una cantidad de inoculación de hongos puede darse en cultivo
sumergido en matraces de agitación. Los matraces se proporcionan
con un medio de crecimiento, sembrados con micelio fúngico y
crecidos en un agitador vaivén durante aproximadamente tres a cuatro
días.
La composición del medio de crecimiento puede
variar pero siempre contiene fuentes de carbono y nitrógeno. Una
fuente de carbono preferida es la glucosa, cantidades de la cual
pueden extenderse de aproximadamente 10 a 100 gramos de glucosa por
litro de medio de crecimiento. Típicamente se utilizan
aproximadamente 15 gramos/litro para el cultivo en los matraces de
agitación. La cantidad puede variar dependiendo de la densidad
deseada del cultivo final. Otras fuentes de carbono que se pueden
usar incluyen melazas, jarabe de maíz con alto contenido en
fructosa, almidón hidrolizado o cualquier otra fuente de carbono
convencional de bajo coste usada en procesos de fermentación. Los
expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las cantidades
adecuadas de estas fuentes de carbono. Generalmente, se necesita
añadir carbono adicional durante el curso del cultivo. Esto se debe
a que los organismos tanto carbono añadirlo todo en un modo
discontinuo podría resultar no manejable.
El nitrógeno se proporciona típicamente en la
forma de extracto de levadura en una concentración de
aproximadamente 2 a aproximadamente 15 gramos de extracto por litro
de medio de crecimiento. Preferiblemente, se proporcionan cuatro
gramos por litro. Se pueden usar otras fuentes de nitrógeno,
incluyendo peptona, triptona, licor de maíz impregnado, harina de
soja, proteína vegetal hidrolizada, etc. Los expertos en la
técnica pueden determinar fácilmente la cantidad que hay que añadir
de estas fuentes. El nitrógeno se puede añadir en un modo
discontinuo, es decir, todo al mismo tiempo antes del cultivo.
Después del cultivo durante 3-4
días a una temperatura adecuada, típicamente de aproximadamente 25 a
30ºC, ha crecido una cantidad de hongos, lo que es suficiente para
uso en forma de inóculo en un fermentador de tanque agitado
convencional (FTA). Los expertos en la técnica conocen tales
fermentadores y están comercialmente disponibles. La fermentación
se puede llevar a cabo en modos de fermentación discontinuo,
alimentación discontinua o continuo. Preferiblemente, el FTA se
equipa con una rueda de paletas marina, aunque también se puede
usar un motor de turbina de tipo Rushton.
El fermentador se prepara añadiendo las fuentes
de carbono y nitrógeno deseadas. Por ejemplo, se puede preparar un
fermentador de 1,5 litros mezclando aproximadamente 50 gramos de
glucosa y aproximadamente 15 gramos de extracto de levadura por
litro de agua del grifo. Como se ha discutido previamente, se pueden
usar otras fuentes de carbono o nitrógeno o mezclas de las
mismas.
Se debería esterilizar el reactor que contiene la
solución de nutrientes, por ejemplo, calentando antes de la
inoculación. Después de calentar a aproximadamente 30ºC se puede
añadir el inóculo e iniciar el cultivo. El intercambio de gases se
proporciona burbujeando aire. La velocidad de burbujeo de aire puede
variar, pero se fija preferiblemente de aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 4,0 VVM (volumen de aire por volumen del
fermentador por minuto). Preferiblemente el nivel de oxígeno
disuelto se conserva de aproximadamente un 10% a aproximadamente un
50% del valor de saturación del aire de la disolución. De acuerdo
con esto, se pueden requerir ajustes en la velocidad de burbujeo
durante el cultivo. La rueda de paletas proporciona la agitación. La
velocidad de agitación del extremo se fija preferiblemente dentro
del intervalo de aproximadamente 50 cm/sg a aproximadamente 500
cm/sg, preferiblemente de aproximadamente 100 a 200 cm/sg.
En general, la cantidad de inóculo puede variar.
Típicamente, se puede usar de aproximadamente un 2% a
aproximadamente un 10% por volumen de inóculo. Preferiblemente, se
puede usar aproximadamente un 5% en volumen de inóculo en un tren
de siembra de fermentador.
Se debían controlar los niveles de nutrientes.
Cuando los niveles de glucosa caen por debajo de 5 g/l, se debería
añadir glucosa adicional. Un ciclo de cultivo típico utiliza
aproximadamente 100 gramos de glucosa y aproximadamente 15 gramos de
extracto de levadura por litro. Es deseable agotar el nitrógeno
durante el curso del cultivo de forma que aumente la producción de
aceite por M. alpina.
Se puede cultivar Mortierella alpina con
un elevado contenido en aceite incluyendo elevados niveles de ARA,
en un fermentador usando niveles de nutrientes muy elevados. Se ha
descubierto inesperadamente que se pueden añadir al principio de la
fermentación niveles de nutriente que contienen nitrógeno en exceso
de ese proporcionado por 15 gramos/litro de extracto de levadura,
mientras que la cantidad total de nutriente que contiene carbono
añadido durante la fermentación es alta en comparación. La cantidad
total de nutriente de carbono, preferiblemente alimentado
continuamente o intermitentemente durante el primer
25-50% del curso del tiempo de fermentación, o en
alícuotas a varios tiempos durante la misma porción del curso del
tiempo, será preferiblemente equivalente a 75 a 300 gramos de
glucosa por litro de medio de cultivo (relación C:N \geq 5:1,
expresada como peso de glucosa:peso de extracto de levadura). En un
modo especialmente preferido, el nutriente de nitrógeno es harina
de soja, añadida a un nivel de aproximadamente 16 gramos por litro
de medio, y el nutriente de carbono está presente inicialmente a un
nivel equivalente a aproximadamente de 80 gramos de glucosa o más.
Cuando se usan elevados niveles de nutrientes de carbono y
nitrógeno, es preferible esterilizar separadamente las disoluciones
que contienen las disoluciones de los dos nutrientes. También se ha
descubierto que se puede aumentar la producción de biomasa durante
las fermentaciones que contienen elevados niveles de nutrientes de
carbono reteniendo parte del nutriente de nitrógeno y alimentando
continuamente el nutriente de nitrógeno que queda o en una o más
alícuotas durante el curso de la fermentación.
Ocasionalmente, el cultivo el cultivo producirá
una cantidad excesiva de espuma. Opcionalmente, se puede añadir un
agente antiespumante, como por ejemplo aquellos conocidos por los
expertos en la técnica, por ejemplo Mazu 310® o un aceite
vegetal.
La temperatura de cultivo puede variar. Sin
embargo, aquellos hongos que producen ARA y AEP tienden a producir
menos AEP y más ARA, cuando se cultivan a temperaturas más
elevadas. Cuando se cultiva Mortierella alpina a menos de
18ºC, comienza a producir AEP. De esta forma es preferible mantener
la temperatura a un nivel que induce la producción preferente de
ARA. Las temperaturas adecuadas son típicamente de aproximadamente
25ºC a aproximadamente 30ºC.
Preferiblemente, el cultivo continúa hasta que se
alcanza una densidad de biomasa deseada. Una biomasa deseable es
aproximadamente 25 g/l del organismo. Tal biomasa se alcanza
típicamente dentro de las 48 a 72 horas después de la inoculación. A
este tiempo, los organismos contienen típicamente de
aproximadamente un 5 a aproximadamente un 40% de lípidos complejos,
es decir, aceite, del cual, al menos un 25%, es ARA o
preferiblemente al menos un 40% de residuos de ARA en la fracción de
triglicéridos, más preferiblemente al menos un 50% de ARA en la
fracción de triglicéridos, y se pueden recoger.
La fermentación fúngica para la producción de ARA
de acuerdo con esta invención aumenta haciendo un perfil de pH del
medio, mejor que dejando el aumento de pH incontrolado. Se pueden
aumentar también las producciones manteniendo elevados los niveles
de oxígeno durante la fermentación. Estas modificaciones del
procedimiento de fermentación son especialmente efectivas cuando se
usan niveles elevados de nutrientes en el fermentador.
Cuando el nivel de nutriente de nitrógeno inicial
excede el equivalente de aproximadamente 15 gramos de extracto de
levadura por litro, u/o el nivel de nutriente de carbono excede el
equivalente de aproximadamente 150 gramos de glucosa por litro, se
puede inhibir el crecimiento de los hongos. Esta inhibición del
crecimiento se puede superar por fermentación alimentada en
discontinuo, por ejemplo dividiendo el nutriente para la
fermentación en alícuotas que se alimentan secuencialmente en el
fermentador, una vez que se han metabolizado parte o todos los
nutrientes suministrados por la alícuota previa. El beneficio de
superar la inhibición del crecimiento se puede realizar alimentando
solamente el nutriente de carbono (ver Shinmen, et al.). Se
ha descubierto que este beneficio se puede obtener también
dividiendo el nutriente total en alícuotas y alimentando las
alícuotas durante la fermentación o alimentando continuamente la
disolución de nutriente. De forma similar, se ha descubierto
inesperadamente que el beneficio se puede alcanzar alimentando el
nutriente de nitrógeno solamente a una fermentación en la que el
nutriente de carbono está presente inicialmente a un nivel alto.
Se ha descubierto inesperadamente también que se
puede mitigar la inhibición de crecimiento realizando un perfil de
pH de la fermentación, manteniendo una tensión elevada de oxígeno
en el fermentador, o ambos. Se ha descubierto que la fermentación
de M. alpina en un medio rico en nutrientes a pH bajo (pH=
5-6) da lugar a un crecimiento de biomasa mejorado
(y también a un aumento en la producción de aceite). Sin embargo,
el aceite producido en estas condiciones tiene niveles más bajos de
residuos de ARA en el aceite. De forma contraria, la fermentación a
elevado pH (pH = 7-7,5) da lugar a niveles
incrementados de ARA en el aceite, pero un crecimiento más pobre. El
procedimiento de fermentación de esta invención conlleva realizar
un perfil de pH en el que el pH es bajo durante las etapas
tempranas de la fermentación y altas durante las etapas tardías.
Las etapas tempranas incluyen períodos de crecimiento rápido
(exponencial) durante los que los nutrientes se metabolizan
rápidamente; las etapas tardías incluyen la fase estacionaria,
cuando se detiene la división celular, generalmente debido a
cantidades insuficientes de uno o más nutrientes, y se aumenta la
producción de aceite rico en ARA. La realización del perfil se
puede hacer controlando el pH del fermentador a niveles que se
establecen en dos o más pasos espaciados durante el período de
fermentación.
Se ha descubierto de forma parecida que
manteniendo el contenido de oxígeno disuelto (O.D.) del medio a
niveles elevados (por ejemplo, \geq 40% del nivel de saturación
de aire) dará lugar a una mejora de la inhibición del crecimiento
mediante niveles de nutrientes elevados y/o incremento del nivel
relativo de residuos de ARA en el aceite. El O.D. se puede
mantener a un nivel elevado incrementando la presión del recipiente
(forzando más aire hacia el espacio superior del fermentador),
incrementando la agitación (por ejemplo incrementando la velocidad
en el extremo de la rueda de paletas) e incrementando la aireación
(por ejemplo, incrementando la cantidad de aire que pasa a través
del fermentador en un tiempo dado, generalmente expresado como
incremento en VVM, volúmenes de aire por volúmenes de fermentador
por minuto) y/o incrementando el contenido de O_{2} del gas de
burbujeo. Se ha encontrado que la fermentación en estas
condiciones aumenta la utilización de carbono, dando lugar a una
concentración de biomasa final más alta y una mayor productividad
de aceite rico en ARA en el fermentador. En particular, las
fermentaciones que incorporan una o más de las modificaciones
anteriores dan lugar a la producción de aceite de triglicéridos
extraíble que tiene al menos un 40% de residuos de ARA, y
preferiblemente al menos un 50% de residuos de ARA.
En una realización particularmente preferida, el
medio de fermentación contiene nutriente de carbono equivalente a, o
por encima de 80 g/l de glucosa y nutriente de nitrógeno
equivalente a, o por encima de 15 g/l de extracto de levadura, y el
medio se ajusta a pH entre 5 y 6 posterior a la esterilización.
Después de la inoculación, el pH del medio se controla a o
ligeramente por encima de nivel inicial. Una vez que el nivel del
nutriente de carbono a caído por debajo de 60 gramos de glucosa
equivalente/litro (generalmente aproximadamente 48 horas), el punto
establecido para el control de pH se cambia a aproximadamente pH
\geq 6. A o aproximadamente el tiempo cuando la velocidad de
consumo de oxígeno (y/o la velocidad de evolución del dióxido de
carbono, VED) alcanza su máximo (generalmente después de
aproximadamente 72 horas), el punto establecido se eleva a pH entre
6,5 y 7 (generalmente de forma que aumenta, por ejemplo, a una
velocidad de aproximadamente 0,1 unidades de pH por hora). El pH se
controla luego para mantenerlo por debajo de un pH entre 7 y 7,5
para las etapas finales de la fermentación.
Para esta realización, el nivel de oxígeno
disuelto en el medio (O.D.)se mantiene cerca o por encima de un 40%
del nivel de saturación de aire, preferiblemente incrementando
secuencialmente la presión del recipiente a 0,773 Kg/cm^{2} (74,8
kPa), incrementando la agitación al equivalente de aproximadamente
una velocidad en el extremo de la rueda de paletas de 300 cm/sg e
incrementando la aireación a aproximadamente 0,5 volúmenes de aire
por volumen de fermentador por minuto. Después de un período de
crecimiento rápido y de elevado consumo de O_{2} por la
fermentación, el crecimiento (y el consumo de O_{2}) disminuirá.
En este punto se puede disminuir agitación/aireación, mientras el
O.D. se mantiene a un nivel alto, generalmente por encima de
aproximadamente un 40% de saturación de aire.
Optimizando la fermentación de Mortierella
alpina como se describe en esta memoria descriptiva, es posible
obtener producciones muy elevadas de biomasa que contiene de un 20 a
un 60% de aceite en la biomasa, donde de un 25 a un 70% en peso del
aceite son residuos de ARA en forma de triglicérido. La biomasa (y
el aceite) se pueden recoger como se describe en esta memoria
descriptiva. Preferiblemente, la biomasa se recogerá del
fermentador dentro de las 48 horas de alcanzar la máxima
productividad, medida como gramos de ARA/l/día.
La recogida se puede hacer por medio de cualquier
procedimiento adecuado tal como, por ejemplo, filtración,
centrifugación o secando con vaporizador. Se puede preferir la
filtración como consecuencia de un coste más bajo.
Después de recoger, se puede extraer la torta de
micelio. La torta de micelio se refiere a la colección de biomasa
resultante después de la recogida. La torta se puede soltar o
presionar, desmenuzar o no desmenuzar. Opcionalmente, se puede haber
eliminado el agua residual de la torta, como secando a vacío,
secando en lecho fluidizado, secando con vaporizador o por
liofilización, antes de la extracción. Si se selecciona esta
opción, es preferible usar disolventes no polares para extraer el
aceite que contiene ARA. Aunque cualquier extractante no polar es
adecuado, se prefiere el hexano.
En una realización preferida, el aceite se extrae
de la biomasa secada por trituración húmeda o precolación con
hexano virgen. El disolvente se añade generalmente a una relación
de disolvente a biomasa de aproximadamente 5:1 (peso/peso). Después
de la trituración húmeda, los sólidos se separan del extracto por
decantación o centrifugación. Es ventajoso mantener el extracto que
contiene el disolvente (mezcla de hexano y aceite) anaeróbicamente
para evitar la oxidación de los residuos de ácidos grasos
insaturados en el aceite. Se elimina el disolvente de la mezcla de
hexano y aceite para producir un aceite fúngico sin refinar.
El aceite sin refinar extraído de la biomasa
fúngica con disolventes no polares puede estar turbio,
particularmente cuando la biomasa está triturada, porque la
trituración puede liberar partículas finas como por ejemplo
fragmentos de paredes celulares u polisacáridos solubles. La
clarificación de tal aceite turbio puede llevarse a cabo
disolviendo el aceite sin refinar en disolventes más polares, tales
como acetona o alcohol. En una realización preferida, el extracto
de aceite sin refinar de los micelios fúngicos se clarifica además
por extracción/precipitación con acetona. Una mezcla de hexano y
aceite con acetona se prepara añadiendo acetona al extracto de
aceite sin refinar turbio (preferiblemente a un nivel de
aproximadamente un 20% de aceite; aproximadamente 4 volúmenes de
acetona por volumen de aceite sin refinar), mezclando enérgicamente
y dejando permanecer la mezcla durante un período suficiente para
la precipitación de las partículas finas (generalmente,
aproximadamente una hora a temperatura ambiente). La mezcla de
hexano y aceite con acetona que contiene el aceite se clarifica por
centrifugación y/o filtración y luego se elimina el disolvente para
producir un aceite fúngico clarificado con acetona. El aceite
fúngico clarificado con acetona se prefiere para procesado adicional
(por ejemplo, desengomado, blanqueamiento y desodorancia por
técnicas convencionales) porque las partículas finas producidas
durante la extracción de la biomasa fúngica interferirán con los
procedimientos de refinado si no se eliminan en la etapa de la
acetona.
Otra realización preferida conlleva la extracción
a contracorriente de la biomasa seca, la cual, se puede llevar a
cabo en unidades de extracción comercialmente disponibles, por
ejemplo, aquellas fabricadas por Crown Ironworks (Crown Mark IV) o
French, Inc., que generalmente no se usan para extraer aceites
vegetales, pero se diseñaron para extraer lodo y tierra. Aunque
las eficacias de extracción no son tan altas sin la retrituración
de la biomasa, el procedimiento de extracción a contracorriente
tiene la ventaja de producir menos ``finos'' reduciendo de ese
modo la dificultad técnica en recuperar un aceite refinado
transparente.
De forma alternativa, la torta húmeda (la cual
contiene típicamente aproximadamente de un 30 a un 50% de sólidos)
puede desmenuzarse y extraerse directamente usando disolventes
polares tales como etanol o alcohol isopropílico, o por extracción
de fluidos supercríticos con disolventes tales como CO_{2} o NO.
Preferiblemente, las tortas se desmenuzan antes de la extracción.
Ventajosamente, la presente invención permite el uso económico de
técnicas de extracción de fluidos supercríticos. McHugh, et
al., Supercritical Fluid Extraction, Butterworth (1986).
Tales técnicas son conocidas por los expertos en la técnica e
incluyen a aquellas aplicadas en el presente, por ejemplo, para
descafeinar granos de café.
Un procedimiento preferible de extracción acuosa
conlleva mezclar la biomasa del micelio con el alcohol isopropílico
como disolvente polar en una recipiente de reacción adecuada. Se
conocen tales recipientes. Es deseable el uso de tres a seis partes
de disolvente por parte de biomasa. Lo más preferiblemente, la
mezcla se realiza en nitrógeno o en presencia de antioxidantes para
prevenir la oxidación del ARA en el extracto lipídico. Del mismo
modo que se usa en esta memoria descriptiva, ``extracto lipídico'',
``aceite'', ``complejo lipídico'' y ``aceite fúngico'' se usan de
forma intercambiable.
Después de extraer, se puede filtrar la mezcla
para eliminar la biomasa del disolvente que contiene el extracto
lipídico. En este punto, la biomasa se puede recuperar y usar como
suplemento alimentario. Del mismo modo que se usa en esta memoria
descriptiva, ``suplemento alimentario'' significa alimento o aditivo
para mezclarse con alimento típico, como por ejemplo grano, etc.,
que se puede proporcionar a animales.
El disolvente se separa del extracto lipídico y
también se puede recuperar para volver a usarse, como por
evaporación en un colector adecuado, dejando lo que en esta memoria
descriptiva se refiere como el ``aceite sin refinar''. El uso de
alcohol isopropílico como el disolvente da lugar deseablemente a la
eliminación de cualquier agua residual del aceite sin refinar, ya
que la evaporación elimina el azeótropo agua/alcohol isopropílico
el cual se ha formado espontáneamente.
Mientras el aceite sin refinar se puede usar sin
tratamiento adicional, también se puede purificar aún más. Los
procedimientos tales como aquellos usados en la preparación de
lecitina a partir de productos vegetales, y conocidos por los
expertos en la técnica, se pueden usar en esta etapa de
purificación adicional. Tales procedimientos no modifican química o
covalentemente los lípidos que contienen ARA o el mismo ARA.
Las producciones varían, pero están típicamente
entre 5 gramos de fosfolípido que contiene ARA por 100 gramos de
micelios secados. En el caso de M. alpina, se pueden obtener
unos 10 a 50 gramos adicionales de triglicérido por 100 gramos de
micelios secos. Se pueden usar tanto el aceite sin refinar como el
producto refinado para administración a humanos. Ambos se
incluirán dentro de la definición de ARASCO del mismo modo que se
usa en esta memoria descriptiva.
El objeto más preferido de la invención es
proporcionar un aditivo para su uso con fórmulas para lactantes
humanas, de tal forma que la concentración de ARA en tal fórmula
se aproxime estrechamente a la concentración de ARA en leche
materna humana. La Tabla 2 compara la composición de los ácidos
grasos en ARASCO con aquellos en leche materna y en una fórmula
para lactantes que carece y que contiene ARASCO.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline Ácido graso \+ ARASCO \+ Fórmula para \+ Fórmula+aceite \+ Leche materna \\ \+ \+ lactantes ^{1} \+ \+ \\\hline 8:0 \+ - - \+ 24,1 \+ 23,6 \+ 0,35 \\\hline 10:0 \+ - - \+ 17,7 \+ 17,3 \+ 1,39 \\\hline 12:0 \+ - - \+ 14,9 \+ 14,6 \+ 6,99 \\\hline 14:0 \+ 4,6 \+ 5,8 \+ 5,8 \+ 7,96 \\\hline 16:0 \+ 16,0 \+ 6,8 \+ 7,0 \+ 19,80 \\\hline 16:1 \+ 3,2 \+ 0,2 \+ 0,3 \+ 3,20 \\\hline 18:0 \+ - - \+ 2,3 \+ 2,3 \+ 5,91 \\\hline 18:1 \+ 26,4 \+ 10,0 \+ 10,3 \+ 34,82 \\\hline 18:2n6 \+ 9,9 \+ 17,4 \+ 17,3 \+ 16,00 \\\hline 18:3n3 \+ 4,1 \+ 0,9 \+ 1,0 \+ 0,62 \\\hline 20:1 \+ 2,2 \+ 0,1 \+ 0,14 \+ 1,10 \\\hline 20:2n6 \+ - - \+ - - \+ - - \+ 0,61 \\\hline 20:3n6 \+ 1,4 \+ - - \+ 0,03 \+ 0,42 \\\hline 20:4n6 \+ 32,0 \+ - - \+ 0,64 \+ 0,59 \\\hline 20:5n3 \+ - - \+ - - \+ - - \+ 0,03 \\\hline 22:1 \+ - - \+ - - \+ - - \+ 0,10 \\\hline 22:4n6 \+ - - \+ - - \+ - - \+ 0,21 \\\hline 22:5n6 \+ - - \+ - - \+ - - \+ 0,22 \\\hline 22:6n3 \+ - - \+ - - \+ - - \+ 0,19 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
1. Simopoulis, A., Omega-3 Fatty
Acids in Health and Disease, páginas 115-156
(1990).
Como se puede ver, la cantidad de ARA presente en
la fórmula para lactantes suplementada con ARASCO se aproxima
estrechamente a los niveles de ARA en leche materna humana.
Adicionalmente, la composición total de ácidos grasos de la fórmula
para lactantes no se ha alterado significativamente por la adición
del ARASCO. Se pueden usar típicamente entre aproximadamente 50 a
aproximadamente 1000 mg de ARASCO por litro de fórmula para
lactantes. La cantidad específica de ARASCO requerida depende del
contenido en ARA. El aceite usado para suplementar la fórmula para
lactantes contiene al menos un 50% de residuos de ácidos grasos
como el ARA. Si el contenido en ARA fuera aproximadamente un 30%,
la velocidad de suplementación sería aproximadamente de 600 a 700
mg de ARASCO por litro de fórmula para lactantes. Tal velocidad
diluye los componentes grasos pre-existentes de una
fórmula para lactantes como por ejemplo Similac® (Ross
Laboratories, Columbus, Ohio) por solamente una parte de ARASCO a
cincuenta partes de aceites de la fórmula. Se pueden calcular
velocidades de dilución similares para aceites que contienen
contenidos de ARA más elevados. Preferiblemente, el ARASCO está
sustancialmente libre de AEP.
Cuando se usa Mortierella alpina en este
procedimiento, el aceite que contiene ARA es predominantemente
triglicérido. Este ARASCO es útil como aditivo en una fórmula para
lactantes. El aceite de M. alpina es probable que sea
económico de producir.
El aceite que contiene ARA de la presente
invención tiene muchos usos además de su uso como aditivo para una
fórmula para lactantes. Como saben los expertos en la técnica,
existen muchas patologías asociadas a las deficiencias de ARA, como
por ejemplo el marasmo (Vajreswari, et al.,
Metabolism 39:779-782 (1990)),
enfermedades atópicas (Melnik, B., Monatsschr. Kinderheilta,
138:162-166 (1990)), enfermedad hepática,
fenilcetonuria, esquizofrenia, discinesia tardía o varios trastornos
peroxisomales. En una realización de la presente invención, esas
patologías se tratan administrando una cantidad farmacéuticamente
efectiva del aceite de la presente invención. La cantidad
farmacéuticamente efectiva es típicamente la cantidad requerida para
normalizar el nivel de en ARA en el paciente. Los aceites con
elevado contenido en ARA descritos anteriormente son particularmente
preferidos para la suplementación para tratar tales patologías. El
aceite se puede administrar enteralmente, tópicamente o
parenteralmente, como selecciona el proveedor del cuidado de la
salud.
La encapsulación, como la conocen los expertos en
la técnica, es un procedimiento efectivo de administración enteral.
Las cápsulas que contienen el aceite fúngico se pueden
administrar a aquellas personas que requieren o desean
suplementación de ARA en la dieta. Tal procedimiento es
particularmente efectivo para administrar ARA a mujeres embarazadas
o que amamantan a lactantes.
En los casos donde se administra ARASCO para
combatir la deficiencia de ARA asociada a patologías, se debería
administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva. Los expertos
en la técnica pueden determinar esta cantidad sin experimentación
indebida. Esta cantidad es típicamente 0,5 a 2,0 g/día, lo que
generalmente normalizará el nivel en suero de ARA.
Otra realización de la presente invención
conlleva composiciones cosméticas que contienen ARASCO, como por
ejemplo los aceites con alto contenido en ARA descritos en esta
memoria descriptiva. Las composiciones cosméticas se refieren a
aquellos compuestos aplicados como cosméticos. Un ejemplo preferido
de tal composición es una crema para las arrugas. Tales
composiciones cosméticas proporcionan un medio efectivo para
aplicar el ARA tópicamente a la piel para ayudar a mantener el tono
de la piel.
Habiéndose descrito la invención de forma
general, se establecen los siguientes ejemplos específicos no
limitantes para ilustrar aún más la invención. Los Ejemplos 1 y 2
son ejemplos de la técnica anterior tomados del documento
WO92/13086. Los Ejemplos 3 a 6 no están de acuerdo con la invención
pero incluyen material útil para el entendimiento del Ejemplo 7. El
Ejemplo 7 está de acuerdo con la invención.
Ejemplo 1 (técnica
anterior)
En un fermentador de 80 litros (volumen bruto) se
mezclaron 51 litros de agua del grifo, 1,2 kg de glucosa, 240
gramos de extracto de levadura y 15 ml de agente antiespumante MAZU
210S®. El fermentador se esterilizó a 121ºC durante 45 minutos. Se
añadieron 5 litros más de agua de condensación durante el
procedimiento de esterilización. El pH se ajustó a 6,2, y luego se
añadió 1 litro de inóculo (a una densidad celular de 5 a 10 g/l)
de Pythium insidiosum (ATCC #28251). La velocidad de agitación se
ajustó a 125 RPM (250 cm/sg de velocidad del extremo) y la velocidad
de aireación se ajustó a 0,028 m^{3} por minuto (1 PCME (pie
cúbico por minuto estándar)). En la hora 24 en la operación se
incrementó la velocidad de aireación a 0,084 m^{3} por minuto (3
PCME). En la hora 28 se añadieron 2 litros más de jarabe de glucosa
al 50% (1 kg de glucosa). En la hora 50 se recolectó el
fermentador, dando lugar a una producción de aproximadamente 2,2 kg
en peso húmedo (aproximadamente 15 g de peso seco) por litro. La
biomasa recogida se apretó hasta una torta con alto contenido en
sólidos (50% de sólidos) en un filtro de succión antes de secar por
congelación. La biomasa secada se trituró con un mortero y maja y
se extrajo con un litro de hexano por 200 gramos de biomasa seca a
temperatura ambiente en condiciones de agitación durante dos horas.
La mezcla se filtró después y el filtrado se evaporó para producir
aproximadamente de 5 a 6 gramos de aceite sin refinar por 100
gramos de biomasa seca. La biomasa se reextrajo luego con un litro
de etanol por 20 gramos de biomasa seca durante una hora a
temperatura ambiente, se filtró, y el disolvente se evaporó
produciendo 22 gramos más de aceite sin refinar por 100 gramos de
biomasa seca. La segunda fracción era predominantemente fosfolípidos
mientras que la primera fracción contenía una mezcla de
fosfolípidos y triglicéridos. Las fracciones combinadas produjeron
un aceite que contenía aproximadamente de un 30 a un 35% de ácido
araquidónico y AEP no detectable. Este aceite se añadió gota a gota
a la fórmula para lactantes comercial producto Similac® (Ross
Laboratories, Columbus, Ohio) a una velocidad de suplementación de
60 mg por litro de medio preparado.
\newpage
Ejemplo 2 (técnica
anterior)
Se creció Mortierella alpina (ATCC #42430)
en un matraz de agitación de 2 litros que contenía 1 litro de agua
del grifo y 20 gramos de medio de dextrosa de patata. El matraz
estaba con agitación orbital constante y se mantuvo a 25ºCdurante
siete días. Después de recoger por centrifugación, la biomasa se
secó por congelación produciendo aproximadamente 8 gramos de
micelios ricos en lípidos. Los micelios se extrajo usando hexano
como en el ejemplo #1 y se produjeron aproximadamente 2,4 gramos de
aceite sin refinar. El aceite contiene aproximadamente un 23% de
ácido araquidónico y se añadió a la fórmula comercial Similac® gota
a gota en concentraciones de 1000 mg por litro.
Ejemplo 3 (no de acuerdo con la
invención)
Se inocula el fermentador de inoculación que
contiene medio GYE (50 g/l de dextrosa y 6 g/l de Tastona 154) con
M. alpina. La temperatura de fermentación se fija a 28ºC,
agitación inicial de 130 a 160 cm/sg, presión inicial del
recipiente a 0,422 kg/cm^{2} (40,8 kPa) y velocidad de aireación
inicial a 0,25 VVM. El pH se fija a 5,0 antes de la
esterilización, y el pH inicial de la fermentación se fija a 5,5
después de la esterilización. El medio se mantiene a un pH igual o
por encima de 5,5 con NaOH 8N. El nivel de oxígeno se mantiene a un
O.D. igual o por encima de un 40% estableciendo la
agitación/aireación en la siguiente secuencia: incrementar la
presión del recipiente a 0,773 kg/cm^{2} (74,8 kPa); incrementar
la agitación a una velocidad en el extremo de la rueda de paletas
de 175 cm/sg; e incrementar la aireación a 0,5 VVM. La formación de
espuma se controla por adición de agentes antiespumante Dow
1520-US, como sea necesario. (Se deberían añadir al
medio aproximadamente 0,1 ml/l del agente antiespumante antes de la
esterilización para ayudar a prevenir la formación de espuma).
Transferir el inóculo del fermentador de siembra
al fermentador principal dentro de las 12 horas después de que el
pH suba a aproximadamente 6,0.
El fermentador principal contiene medio GYE (50
g/l de dextrosa y 6 g/l de Tastona 154); la glucosa se esteriliza
de forma separada y se añade al fermentador principal después de
la esterilización. La temperatura del fermentador se fija a 28ºC,
agitación inicial a 160 cm/sg, presión inicial del recipiente a
0,422 kg/cm^{2} (40,8 kPa) y velocidad de aireación inicial a
0,15 VVM. El pH inicial se fija a 5,5 y se mantiene a un pH igual o
por encima de 5,5 con NaOH 8N. Se deja subir el pH durante la fase
estacionaria (comenzando aproximadamente24 horas después de la
inoculación), pero se mantiene por debajo de pH 6,8 con adición de
H_{2}SO_{4}. El nivel de oxígeno se mantiene a un O.D. igual o
por encima de un 40% incrementando secuencialmente la presión del
recipiente a 0,773 kg/cm^{2} (74,8 kPa), incrementando la
agitación a 175 cm/sg de velocidad en el extremo de la rueda de
paletas, e incrementando la aireación a 0,5 VVM. La formación de
espuma se controla por adición de agente antiespumante Dow
1520-US, como sea necesario. (Se deberían añadir al
medio aproximadamente 0,1 ml/l del agente antiespumante antes de la
esterilización para ayudar a prevenir la formación de espuma).
Se toman muestras del cultivo cada 12 horas para
análisis de biomasa y de ácidos grasos, y la recogida se inicia a
los 3-4 días después de que el pH sube a 6,5. La
densidad de biomasa seca debería ser igual o por encima de 8,5 g/l.
La concentración de glucosa en el caldo debería haber caído de 50
g/l a igual o por encima de 25 g/l. En la recogida, el caldo de
cultivo completo pasa a través de una centrífuga de cesta para
separar los micelios del medio gastado, y se seca la biomasa.
Ejemplo 4 (no de acuerdo con la
invención)
Se cultivó M. alpina en fermentadores de
tanque agitado de 20 l, inoculado desde el cultivo del matraz de
agitación, de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3. El
cultivo de M. alpina en 65 g/l de glucosa (Staleydex), y 6
g/l de extracto de levadura (Tastona 154), dio lugar a la
producción de 12 g/l de biomasa. La adición de 6 g/l adicionales de
Tastona 154 a las 16 horas, dio lugar a la producción de 18 g/l de
biomasa.
Ejemplo 5 (no de acuerdo con la
invención)
Los experimentos se llevaron a cabo en un intento
de incrementar aún más la biomasa mediante adiciones adicionales de
Tastona 154. Estos experimentos constaban de 2 fermentaciones de 20
l, de 168 horas de residencia. Para ambas fermentaciones, la
concentración de glucosa inicial era 100 g/l (como se compara con 65
g/l para el Ejemplo 4). Un fermentador recibía tres adiciones de 6
g/l de Tastona 154, y el otro recibía 4 adiciones de 6 g/l. El
extracto de levadura se realizó en forma de disolución concentrada,
se trató en autoclave, y se añadió al fermentador a varios tiempos
después de la esterilización.
Para preparar el inóculo, se inocularon los
sembrados de trabajo (1 ml de micelio macerado) en 2 matraces,
conteniendo cada uno 50 ml de medio GYE (100 g/l de Staleydex, 6
g/l de Tastona 154), y se crecieron durante 4 días a 28ºC y a 150
rpm. Después de 4 días de crecimiento, el caldo contenía biomasa
sedimentada; los sedimentos tenían un diámetro de 2 a 5 mm. El
crecimiento en estos matraces fue más lento de lo esperado,
posiblemente debido a la mayor concentración de glucosa. Se maceró
la biomasa durante 3 segundos 2 veces en un mezclador Waring, y se
usaron 25 ml de macerado para inocular 800 ml de volumen neto en
cada uno de los matraces de inóculo Fernbach de 2,8 l. (En
experimentos anteriores, se habían usado 10 ml de macerado. La
cantidad de inóculo se incrementó, como consecuencia de la
densidad más baja en el matraz de siembra, y porque se esperaba que
el crecimiento podía ser más lento en los Fernbachs, debido a la
concentración más alta de glucosa). El medio en los matraces
Fernbach era 100 g/l de dextrosa (Staleydex) y 8 g/l de extracto de
levadura (Tastona 154). La dextrosa y el extracto de levadura se
trataron en autoclave de forma separada durante 40 minutos. La
temperatura de fermentación del sembrado se mantuvo a 28ºC y a una
agitación de 100 rpm a 150 rpm.
Después de 44 horas de cultivo en los matraces
Fernbach, el inóculo se transfirió a dos fermentadores de 20 l. El
inóculo estaba en la forma de agregados de hifas muy sueltos y la
densidad de la biomasa era aproximadamente 5,2 g/l.
Los fermentadores en las estaciones 14 y 15, que
contenían 1,6 kg (10%) de dextrosa (Staleydex) y agente
antiespumante Mazu 204 (1,6 g, disueltos en 12,5 l de agua R.O.),
se esterilizaron durante 45 minutos a 122ºC. Se añadieron luego 800
ml de inóculo (5%) a cada fermentador (a las 0 horas). Los
parámetros de operación de los fermentadores eran:
- temperatura: 28ºC,
- pH: controlado a 5,5 con NaOH 2N y H_{2}SO_{4}2N,
- aireación: 0,5 VVM,
- contrapresión : 20 kPa
- agitación (inicial): 80 cm/sg, y
- O.D.. controlado por encima de un 40%.
El extracto de levadura (Tastona 154) de disolvió
a una concentración de 96 g/l y se trató en autoclave durante 1
hora. Se hicieron 3 alimentaciones de extracto de levadura de 1 l
(1,8%) a las 0, 20 y 26 horas.
A las 15 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40%
y se incrementó la agitación gradualmente a 175 cm/sg de 15 a 22
horas. El O.D. se controló luego corrigiendo el flujo de aire con
oxígeno; el oxígeno se añadió al flujo de aire de 23 a 72 horas.
Comenzando a las 36 horas, la agitación se incrementó aún más para
asegurar una mezcla apropiada. A las 48 horas, la agitación se
había incrementado a 200 cm/sg; a las 72 horas, a 250 cm/sg; y a
las 80 horas, a 280 cm/sg. A las 120 horas, la agitación se
incrementó a 290 cm/sg para promocionar un control adecuado de la
temperatura. A las 144 horas, la agitación se redujo a 280
cm/sg.
Se disolvieron 384 g del extracto de levadura
(Tastona 154) en 96 g/l, y se trataron en autoclave durante 1 hora.
Se hicieron adiciones de extracto de levadura en 4 cantidades de 1
l (2,4%) a las 0, 20, 26 y 32 horas.
A las 16 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40%
y la agitación se incrementó gradualmente a 175 cm/sg a las 23
horas. El O.D. se controló luego por encima de un 40%corrigiendo
el flujo de aire con oxígeno; el oxígeno se añadió al flujo de aire
de 23 a 72 horas. Comenzando a las 36 horas, la agitación se
incrementó aún más para asegurar una mezcla apropiada. A las 48
horas, la agitación se había incrementado a 210 cm/sg; a las 72
horas, a 260 cm/sg; y a las 80 horas, a 290 cm/sg. A las 90 horas,
se redujo la agitación a 280 cm/sg, y a las 144 horas, se redujo a
260 cm/sg.
En la inoculación, la biomasa en los dos
fermentadores estaba en la forma de agregados muy sueltos en forma
de pluma. A las 24 horas, se comenzaron a formar los sedimentos.
Los sedimentos eran pequeños (de 1 a 3 mm), con núcleos centrales
pequeños y periferias amplias sueltas. A las 48 horas, los
sedimentos eran más grandes y mejor definidos. A las 72 horas, las
periferias eran más estrechas, y la presencia de muchos fragmentos
sueltos indicaba que los fragmentos estaban fragmentándose. A las
168 horas, los núcleos de los sedimentos tenían un diámetro de 0,5
a 2 mm, se redujeron las periferias con la agregación de hifas en
hebras gruesas y se dieron muchos agregados de hifas
condensadas.
Los fermentadores produjeron espuma sólo
ligeramente durante las primeras 24 horas. La cantidad de formación
de espuma se incrementó luego y se controló por adición manual de
un agente antiespumante cuando la espuma superior era mayor de 2 a 4
cm. La formación de espuma había disminuido de alguna forma a las
48 horas, aunque se dieron brotes esporádicos. En ambos
fermentadores se formó espuma en los filtros de salida una vez
durante el curso de las fermentaciones. Las fermentaciones
requirieron aproximadamente 150 ml de agente antiespumante.
Ambos fermentadores acumulaban una cantidad
considerable de biomasa acumulada en el espacio superior. Éste es un
problema común con fermentación de micelios en fermentadores
pequeños con relaciones grandes de área superficial/volumen. La
cantidad de biomasa acumulada en la Estación 15 parecía aumentar
durante las últimas 24 horas, cuando el nivel de volumen reducido
dio lugar a una cantidad considerable de salpicadura (el nivel de
líquido se estaba aproximando al tope del propulsor). El volumen
final en los fermentadores después de 168 horas fue de
aproximadamente 13 l.
Un examen microscópico mostró que, a las 72
horas, había muchos residuos presentes en el caldo de cultivo, y
había alguna evidencia de extremos fúngicos dañados y atrofiados.
La presencia de gotitas de aceite en el citoplasma se demostró por
tinción con rojo nilo a las 168 horas. Las gotitas de aceite eran
pequeñas y numerosas, en contraste con las grandes gotas de aceite
vistas algunas veces. La producción de biomasa y de aceite, junto
con la utilización de carbono y nitrógeno se muestran en la Tabla
3.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|r|r|r|r|r|r|r|}\hline\multicolumn{7}{|c|}{Estación 14}\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{3 X 6 g/l de E.L.}\\\hline Registro \+ Glucosa \+ NH _{3} \+ Peso seco \+ Contenido \+ Contenido \+ Productividad \\ de horas \+ \+ \+ \+ en aceite \+ en ARA \+ \\\hline \+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (mM) \+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (% de peso \+ (% de aceite) \+ (g aceite/l/d) \\ \+ \+ \+ \+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+ \\\hline 0 \+ 105,0 \+ 3,0 \+ 0,4 \+ \+ \+ \\\hline 24 \+ 97,4 \+ 5,9 \+ 3,3 \+ 4,8% \+ 23,5% \+ 0,16 \\\hline 48 \+ 73,7 \+ 0 \+ 18,3 \+ 7,9% \+ 23,4% \+ 0,72 \\\hline 72 \+ 60,3 \+ 0 \+ 21,0 \+ 14,4% \+ 25,4% \+ 1,01 \\\hline 96 \+ 48,0 \+ 0 \+ 22,3 \+ 18,3% \+ 27,5% \+ 1,02 \\\hline 120 \+ 40,0 \+ \+ 25,2 \+ 21,1% \+ 29,4% \+ 1,06 \\\hline 144 \+ 34,7 \+ \+ 26,6 \+ 21,8% \+ 30,9% \+ 0,97 \\\hline 168 \+ 29,0 \+ \+ 27,5 \+ 26,1% \+ 31,3% \+ 1,03 \\\hline\multicolumn{7}{|c|}{ \relax }\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{Estación 15}\\\hline\multicolumn{7}{|c|}{4 X 6 g/l de E.L.}\\\hline Registro \+ Glucosa \+ NH _{3} \+ Peso seco \+ Contenido \+ Contenido \+ Productividad \\ de horas \+ \+ \+ \+ en aceite \+ en ARA \+ \\\hline \+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (mM) \+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (% de peso \+ (% de aceite) \+ (g aceite/l/d) \\ \+ \+ \+ \+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+ \\\hline 0 \+ 109,0 \+ 2,9 \+ 0,4 \+ \+ \+ \\\hline 24 \+ 103,0 \+ 5,1 \+ 3,4 \+ 4,3% \+ 21,9% \+ 0,15 \\\hline 48 \+ 74,1 \+ 0,3 \+ 23,6 \+ 6,8% \+ 23,1% \+ 0,80 \\\hline 72 \+ 51,4 \+ 0 \+ 29,8 \+ 10,3% \+ 23,9% \+ 1,02 \\\hline 96 \+ 40,0 \+ 0 \+ 32,7 \+ \+ \+ \\\hline 120 \+ 27,9 \+ \+ 31,7 \+ 18,2% \+ 26,6% \+ 1,15 \\\hline 144 \+ 19,8 \+ \+ 33,5 \+ 20,7% \+ 28,1% \+ 1,16 \\\hline 168 \+ 11,0 \+ \+ 29,9 \+ 21,7% \+ 29,9% \+ 0,93 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 6 (no de acuerdo con la
invención)
Esta serie de experimentos intentó incrementar
aún más la cantidad de producto obtenido incrementando los niveles
de fosfato y minerales. El procedimiento fue esencialmente aquel del
Ejemplo 5, excepto que la dextrosa y el agente antiespumante Mazu
204 se disolvieron en 11,5 l de H_{2}O R.O., en lugar de 12,5 l,
para las soluciones salinas que se añadieron a las 30 horas. La
estación 14 recibió Fe adicional, Zn y Cu; la estación 15 recibió
fosfato adicional, así como Fe, Zn y Cu.
Se disolvió el extracto de levadura en 96 g/l, en
tres cantidades de 1 l, y se trató en autoclave durante 1 hora. Se
añadieron alícuotas de un litro de la solución de extracto de
levadura a las 0, 22 y 28 horas. A las 22 y 28 horas, la velocidad
de evolución del dióxido de carbono (VED, una indicación de la
velocidad metabólica en el fermentador) crecía exponencialmente, y
la fermentación acababa de comenzar a requerir base. Las sales de
alimento contenían:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ FeCl _{3} \+ \qquad 480 mg\cr ZnSO _{4}\cdot 7H _{2} O \+ \qquad 240 mg\cr CuSO _{4}\cdot 5H _{2} O \+ \qquad 16 mg\cr}
El FeCl_{3} se disolvió en 1 l de ácido cítrico
5 g/l. Se añadieron las sales que quedaban, y el pH se ajustó a 4,5
con NaOH. La solución se trató en autoclave durante 1 hora. Las
sales de alimento se añadieron a las 30 horas.
La velocidad de agitación inicial para el
fermentador era 50 cm/sg, en lugar de 80 cm/sg, como se planeó
originalmente, porque el nivel inicial de líquido en el fermentador
(13 l) dio lugar a que el tope del motor a penas se sumergiera, y la
mayor velocidad de agitación dio lugar significativamente a más
salpicadura. A las 16 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40%, y
la velocidad se incrementó gradualmente a 175 cm/sg a las 28 horas.
El O.D. se controló luego por encima de un 45% para corregir el
flujo de aire con oxígeno. A las 46 horas, la agitación se
incrementó a 190 cm/sg para permitir la mezcla. La agitación se
incrementó aún más a 200 cm/sg a las 48 horas, a 220 cm/sg a las 51
horas, a 235 cm/sg a las 53 horas, a 250 cm/sg a las 56 horas, a
260 cm/sg a las 57 horas y a 280 cm/sg a las 70 horas. Incluso a
esta velocidad de agitación (450 rpm), la mezcla era pobre.
Mientras que se mantuvo un mínimo criterio de ``algún movimiento'',
el recambio de biomasa era muy lento, y algunas áreas se
estancaron. La adición de unas pocas gotas de agente antiespumante
redujeron la espuma de la parte superior, y se eliminaron bolsillos
de estancamiento. A las 116 horas, se redujo la agitación a 265
cm/sg y a las 120 horas, se había reducido aún más a 250 cm/sg.
El fermentador comenzó a formar espuma
aproximadamente a las 18 horas. La formación de espuma se controlaba
por adición manual de agente antiespumante. El agente antiespumante
se añadió primero a las 20 horas. A las 24 horas, la fermentación
estaba generando espuma de forma significativa, y requirió de
adición regular de agente antiespumante. A las 72 horas, la
formación de espuma había amainado considerablemente. Sin embargo,
la fermentación todavía requería la adición ocasional de agente
antiespumante.
A las 24 horas, la biomasa estaba en la forma de
sedimentos muy sueltos (1 a 2 mm) y de agregados de hifas sueltos.
Había una cantidad considerable de residuos celulares. A las 48
horas, la biomasa estaba en forma de agregados de hifas muy sueltos,
sedimentos muy pequeños (1 a 2 mm) con núcleos muy pequeños y
periferias sueltas, y sedimentos compactos pequeños (1 a 3 mm) sin
periferias sueltas. A las 96 horas, la biomasa estaba en forma de
sedimentos redondos compactos (1 a 2 mm), sedimentos en forma de
aguja (menos de 0,5 mm), y de agregados de hifas sueltos. La
tinción con rojo nilo a las 144 horas mostró la presencia de muchas
gotas de aceite muy pequeñas en los micelios.
El extracto de levadura se disolvió en 96 g/l, y
se trató en autoclave durante 1 hora. La disolución de extracto de
levadura se añadió en tres cantidades de 1 la las 0, 22 y 26
horas. A las 22 y 26 horas, el VED crecía exponencialmente y la
fermentación acababa de empezar a requerir base.
Se preparó una sal de alimento que contenía:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ KH _{2} PO _{4} \+ \qquad 77 g\cr FeCl _{3} \+ \qquad 480 mg\cr ZnSO _{4}\cdot 7H _{2} O \+ \qquad 240 mg\cr CuSO _{4}\cdot 5H _{2} O \+ \qquad 16 mg\cr}
El FeCl_{3} se disolvió en 500 ml de ácido
cítrico 5 g/l. Se añadieron las sales que quedaban, y el pH se
ajustó a 4,5 con NaOH. Ambas soluciones se trataron en autoclave
durante 1 hora y luego se enfriaron a 23ºC antes de combinarse y
añadirse al fermentador a las 30 horas.
La velocidad de agitación inicial en el
fermentador era 50 cm/sg, en lugar de 80 cm/sg, como se planeó
originalmente, porque el nivel inicial de líquido en el fermentador
(13 l) dio lugar a que el tope del motor a penas se sumergiera, y la
mayor velocidad de agitación dio lugar significativamente a más
salpicadura. A las 16 horas, el O.D. cayó por debajo de un 40%, y
la velocidad se incrementó gradualmente a 175 cm/sg a las 27
horas. El O.D. se controló luego por encima de un 40% para corregir
el flujo de aire con oxígeno. A las 41 horas, la agitación se
incrementó a 200 cm/sg para considerar al menos un mínima cantidad
de mezcla. La agitación se incrementó aún más a 220 cm/sg a las 42
horas, a 230 cm/sg a las 46 horas, a 235 cm/sg a las 51 horas y a
240 cm/sg a las 70 horas. A esta velocidad de agitación (410 rpm),
la mezcla estaba sólo pobremente clara. Se mantuvo un nivel mínimo
de movimiento de biomasa. A las 80 horas, la agitación se redujo a
205 cm/sg.
El fermentador comenzó a formar espuma
aproximadamente a las 18 horas. La formación de espuma se
controlaba por adición manual de agente antiespumante. El agente
antiespumante se añadió primero a las 17 horas. A las 20 horas, la
fermentación estaba generando espuma de forma significativa, y
requirió de adición regular de agente antiespumante. A las 72
horas, la formación de espuma había amainado considerablemente. Sin
embargo, la fermentación todavía requería la adición ocasional de
agente antiespumante.
A las 24 horas, la biomasa estaba en la forma de
sedimentos muy sueltos (1 a 2 mm) y de agregados de hifas sueltos.
Había una cantidad considerable de residuos celulares. A las 48
horas, la biomasa estaba en forma de agregados de hifas muy sueltos,
sedimentos muy pequeños (1 a 2 mm) con núcleos muy pequeños y
perifierias sueltas, y sedimentos compactos pequeños (1 a 3 mm) sin
periferias sueltas. A las 96 horas, la biomasa estaba en forma de
sedimentos redondos compactos, de 1 a 2 mm de diámetro, muchos con
periferias sueltas con aspectos de pelos y muchos fragmentos de
hifas sueltos. La tinción con rojo nilo a las 144 horas mostró la
presencia de muchas gotas de aceite muy pequeñas en los micelios.
La tinción con el rojo nilo a las 144 horas mostró la presencia de
muchas gotas de aceite muy pequeñas en algunos micelios, y también
la presencia de gotas de aceite muy grandes a lo largo de otros
micelios.
La Estación 15, la cual difería de la estación 14
solamente en la adición de fosfato, mostró una mejor mezcla a lo
largo de la fermentación a velocidades de agitación generalmente más
bajas. La estación 15 también mostraba una morfología de la biomasa
``más suelta''. La producción de biomasa y de aceite, así como la
utilización del carbono están en la Tabla 4. La utilización de
mayores cantidades de glucosa (82 g/l para la Estación 15
comparado con 64 g/l para la Estación 14), mayor acumulación de
biomasa, y presencia de gotas de aceite más grandes en porciones de
los micelios caracterizaban el fermentador que contenía mayor
cantidad de fosfato.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|r|r|r|r|r|r|}\hline\multicolumn{6}{|c|}{Estación 14}\\\hline\multicolumn{6}{|c|}{+ Sales}\\\hline Registro \+ Glucosa \+ Peso seco \+ Contenido \+ Contenido \+ Productividad \\ de horas \+ \+ \+ en aceite \+ en ARA \+ \\\hline \+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+\multicolumn{1}{|l|}{(g/l) }\+ (% de peso \+ (% de aceite) \+ (g aceite/l/d) \\ \+ \+ \+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+ \\\hline 0 \+ 116,0 \+ 1,1 \+ \+ \+ \\\hline 24 \+ 101,0 \+ 1,8 \+ 1,2% \+ 22,2% \+ 0,02 \\\hline 48 \+ 84,0 \+ 14,3 \+ 6,2% \+ 24,7% \+ 0,44 \\\hline 72 \+ 60,0 \+ 24,5 \+ 10,6% \+ 24,2% \+ 0,87 \\\hline 96 \+ 45,0 \+ 28,2 \+ 15,5% \+ 25,3% \+ 1,09 \\\hline 120 \+ 34,0 \+ 28,9 \+ 18,1% \+ 26,6% \+ 1,05 \\\hline 144 \+ 27,0 \+ 30,8 \+ 20,8% \+ 27,2% \+ 1,07 \\\hline\multicolumn{6}{|c|}{ \relax }\\\hline\multicolumn{6}{|c|}{Estación 15}\\\hline\multicolumn{6}{|c|}{+ Sales + Fosfatos}\\\hline Registro \+ Glucosa \+ Peso seco \+ Contenido en \+ Contenido \+ Productividad \\ de horas \+ \+ \+ aceite \+ en ARA \+ \\\hline \+ (g/l) \+ (g/l) \+ (% de peso \+ (% de aceite) \+ (g aceite/l/d) \\ \+ \+ \+\multicolumn{1}{|l|}{seco)}\+ \+ \\\hline 0 \+ 113,0 \+ 0,4 \+ \+ \+ \\\hline 24 \+ 101,0 \+ 2,1 \+ 1,1% \+ 24,0% \+ 0,02 \\\hline 48 \+ 74,0 \+ 21,7 \+ 8,1% \+ 24,7% \+ 0,88 \\\hline 72 \+ 51,0 \+ 26,2 \+ 19,9% \+ 26,5% \+ 1,74 \\\hline 96 \+ 31,0 \+ 30,1 \+ 25,5% \+ 28,6% \+ \\\hline 120 \+ 18,0 \+ 33,8 \+ 31,7% \+ 31,4% \+ 2,14 \\\hline 144 \+ 6,0 \+ 34,5 \+ 36,0% \+ 32,9% \+ 2,07 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 7 (de acuerdo con la
invención)
Se inocula un fermentador de siembra que contiene
medio GYE (50 g/l de dextrosa y 6 g/l de Tastona 154) a partir del
fermentador de propagación. La temperatura se mantiene a 28ºC y la
agitación inicial se fija de 130 a 160 cm/sg (aproximadamente 43
rpm). La presión inicial del recipiente es 0,422 kg/cm^{2} (40,8
kPa) y la velocidad de aireación inicial se fija a 0,25 VVM. El pH
se fija a 5,0 antes de la esterilización y luego el pH inicial del
fermentador se fija a 5,5 después de la esterilización. El nivel de
oxígeno en el medio se mantiene con O.D. igual o por encima de un
40% mediante la siguiente secuencia: (i) aumentar la presión del
recipiente a 0,773 kg/cm^{2} (74,8 kPa), (ii) aumentar la
agitación de 156 a 175 cm/sg de velocidad del extremo de la rueda
de paletas, y (iii) incrementar la aireación a 0,5 VVM. La formación
de espuma se controla por adición de agente antiespumante Dow
1520-US, como se necesita. (Se deberían añadir al
medio aproximadamente 0,1 ml/l de agente antiespumante antes de la
esterilización para ayudar a prevenir la formación de espuma).
Después de la inoculación, el cultivo se mantiene a pH \geq 5,5
con NaOH 8N.
En las doce horas después de que el pH suba por
encima de 6,0, los contenidos del fermentador de siembra se
transfieren al fermentador principal. El medio del fermentador
principal contiene:
- 80 g/l de dextrosa (ADM)
- 16 g/l de harina de soja (ADM nutrisoy)
- 30 mg/l de FeCl_{3}\cdot6H_{2}O (Sigma/Aldrich)
- 1,5 mg/l deZnSO_{4}\cdot7H_{2}O (Sigma/Aldrich)
- 0,1 mg/l deCuSO_{4}\cdot5H_{2}O (Sigma/Aldrich)
- 1 mg/l de biotina (Sigma/Aldrich)
- 2 mg/l de tiamina\cdotHCl(Sigma/Aldrich)
- 2 mg/l de ácido pantoténico (sal de hemicalcio) (Sigma/Aldrich)
- (El pH se fija de 4,8 a 5,0 después de la esterilización)
Se inocula el fermentador principal con el
fermentador de siembra (11,8%). La temperatura del fermentador se
mantiene a 28ºC. La agitación inicial se fija a 162 cm/sg
(aproximadamente 23 rpm), la presión inicial del recipiente a 0,422
kg/cm^{2} (40,8 kPa) y la velocidad de aireación inicial a 0,15
VVM (aproximadamente 300 scfh).
El nivel de oxígeno en el medio se mantiene a
O.D. \geq 40% i) incrementando la presión del recipiente a 0,773
kg/cm^{2} (74,8 kPa), ii) incrementando la agitación a 300 cm/sg
de velocidad del extremo de la rueda de paletas (en incrementos de
aproximadamente 30 cm/sg), y iii) incrementando la aireación a 0,5
VVM.
Se realiza un perfil de pH de acuerdo con el
siguiente protocolo de control de pH:
- \bullet
- Se fija el pH inicial a 5,5 después de la esterilización. Mantener el pH a \geq 5,5 con NaOH 8N.
- \bullet
- A las 24 a 36 horas después de la inoculación, añadir lo siguiente: 2 g/l de KH_{2}PO_{4} (110 kg en aproximadamente 700 l de H_{2}O).
- \bullet
- A las 48 horas, si la concentración de dextrosa es \geq 60 g/l, cambiar el punto de ajuste del pH a \geq 6,1.
- \bullet
- A las 72 horas, comenzar a elevar lentamente el punto de ajuste de pH a \geq 6,6 a una velocidad de aproximadamente 0,1 unidades de pH por hora.
- \bullet
- Mantener el pH por debajo de 7,3 con adición de H_{2}SO_{4} si es necesario.
Se toman muestras del fermentador cada 12 horas
para análisis de biomasa y ácidos grasos, y la recogida se comienza
aproximadamente tres días después de la elevación de pH a \geq 6,6
(aproximadamente 6 días después de la inoculación). La densidad de
la biomasa seca debería ser \geq 24 g/l. La concentración de
dextrosa en el caldo debería haber caído de 80 g/l a \leq 14
g/l.
La recogida se lleva a cabo pasando todo el caldo
del cultivo a través de un filtro a vacío rotatorio para separar los
micelios del medio gastado.
Los resultados de dos procesos típicos de
fermentación de acuerdo con el procedimiento de este Ejemplo se
muestran en las Tablas 5 y 6.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|}\hline\multicolumn{7}{|l|}{Medios de cultivo = glucosa (80 g/l) + harina de soja (16 g/l) +}\\\multicolumn{7}{|l|}{sales + vitaminas}\\\hline Registro \+ Glucosa \+ NH _{3} \+ Peso \+ Contenido en \+ Contenido \+ Productividad \\ de horas \+ (g/l) \+ (mM) \+ seco \+ aceite (% de \+ en ARA (% \+ (g de \\ \+ \+ \+ (g/l) \+ peso seco) \+ de aceite) \+ aceite/l/d) \\\hline 0 \+ 58,0 \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline 66 \+ 43,0 \+ \+ 12,6 \+ 14,9% \+ 33,7% \+ 0,68% \\\hline 94 \+ 33,0 \+ \+ 17,0 \+ 27,0% \+ 40,0% \+ 1,17% \\\hline 118 \+ 23,0 \+ \+ 20,6 \+ 28,2% \+ 42,6% \+ 1,18% \\\hline 142 \+ 16,0 \+ \+ 17,1 \+ 39,2% \+ 44,2% \+ 1,13% \\\hline 165 \+ 9,6 \+ \+ 21,5 \+ 41,5% \+ 45,5% \+ 1,30% \\\hline 188 \+ 5,2 \+ \+ 19,8 \+ 41,7% \+ 47,3% \+ 1,05% \\\hline 215 \+ 1,7 \+ \+ 23,2 \+ 46,0% \+ 48,9% \+ 1,19% \\\hline 237 \+ 0,2 \+ \+ 23,1 \+ 44,8% \+ 51,2% \+ 1,05% \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|}\hline\multicolumn{7}{|l|}{Medios de cultivo = glucosa (65 g/l) + harina de soja (16 g/l) +}\\\multicolumn{7}{|l|}{sales + vitaminas + antibióticos}\\\hline Registro \+ Glucosa \+ NH _{3} \+ Peso \+ Contenido en \+ Contenido \+ Productividad \\ de horas \+ (g/l) \+ (mM) \+ seco \+ aceite (% de \+ en ARA (% \+ (g de \\ \+ \+ \+ (g/l) \+ peso seco) \+ de aceite) \+ aceite/l/d) \\\hline 0 \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline 65 \+ 36,0 \+ \+ 13,0 \+ 8,2% \+ 29,0% \+ 0,39 \\\hline 90 \+ 23,0 \+ \+ 12,0 \+ 18,0% \+ 42,0% \+ 0,58 \\\hline 115 \+ 15,0 \+ \+ 14,0 \+ 30,0% \+ 47,0% \+ 0,88 \\\hline 139 \+ 9,0 \+ \+ 15,0 \+ 32,0% \+ 51,0% \+ 0,83 \\\hline 171 \+ 4,6 \+ \+ 17,0 \+ 36,0% \+ 55,0% \+ 0,86 \\\hline 209 \+ 1,4 \+ \+ 12,0 \+ 36,0% \+ 57,0% \+ 0,50 \\\hline 243 \+ 0 \+ \+ 14 \+ 37,0% \+ 60,0% \+ 0,51 \\\hline 187 \+ 0 \+ \+ 13 \+ 34,0% \+ 64,0% \+ 0,57 \\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Claims (22)
1. Un procedimiento para la producción de un
aceite que contiene ácido araquidónico, conteniendo dicho aceite
triglicéridos en los que al menos un 25% de residuos de ácidos
grasos son ácido araquidónico (ARA), y la cantidad de residuos de
ácido eicosapentaenoico (AEP) en el aceite no es más de una quinta
parte de la cantidad de residuos de ácido araquidónico (ARA),
comprendiendo:
- (a)
- cultivar Mortierella alpina en un fermentador aireado que contiene medio de fermentación;
- (b)
- mantener el pH entre 5 y 6 al comienzo del cultivo;
- (c)
- mantener el pH entre 7 y 7,5 al final del cultivo; y
- (d)
- recoger la biomasa del fermentador; y
- (e)
- recuperar dicho aceite que contiene ácido araquidónico a partir de dicha biomasa.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que una fuente de carbono en una cantidad equivalente o mayor que 80
g/l de glucosa y una fuente de nitrógeno en una cantidad equivalente
o mayor que 15 g/l de extracto de levadura se añaden al medio de
fermentación durante el curso de la fermentación.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de
la reivindicación 2, en el que el nivel de oxígeno disuelto en el
medio de cultivo es al menos un 35% del nivel de saturación del
aire.
4. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la fuente de nitrógeno se divide
en dos o más alícuotas que se alimentan al interior del fermentador
en tiempos diferentes, alimentándose al menos una alícuota al
interior del fermentador a un tiempo diferente del tiempo al que se
coloca la fuente de carbono en el fermentador.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que además el aceite sin refinar que
contiene ácido araquidónico se recupera de la biomasa por extracción
con un disolvente no polar y el aceite sin refinar se clarifica por
extracción con un disolvente orgánico polar.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que el disolvente no polar es hexano.
7. El procedimiento de la reivindicación 5 o de
la reivindicación 6, en el que el disolvente polar es acetona,
etanol o alcohol isopropílico.
8. Un aceite fúngico de triglicéridos no
modificado obtenible a partir de M. Alpina en el que más de
un 50% de los residuos de ácidos grasos son residuos de ácido
araquidónico (ARA) presentes en forma de triglicéridos y en el que
el aceite comprende no más de una décima parte como mucho de ácido
eicosapentaenoico (AEP) como ARA.
9. El aceite de la reivindicación 8, que
comprende al menos un 50% de ácido araquidónico (ARA) en forma de
triglicérido y esencialmente nada de ácido eicosapentaenoico
(AEP).
10. Un procedimiento para proporcionar un
triglicérido que contiene ácido araquidónico (ARA) a una fórmula
para lactantes, lo cual comprende añadir el aceite de la
reivindicación 8 o de la reivindicación 9 a una fórmula para
lactantes en una cantidad suficiente para proporcionar un contenido
en ácido araquidónico (ARA) que corresponda a la cantidad de ácido
araquidónico (ARA) en la leche materna humana.
11. Una fórmula para lactantes que comprende un
triglicérido que contiene ácido araquidónico (ARA) en una cantidad
comparable a la cantidad en leche materna humana en la que se
proporciona el ácido araquidónico (ARA) añadiendo una cantidad
suficiente del aceite de la reivindicación 8 o de la reivindicación
9 a una fórmula para lactantes.
12. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto farmacéutico para proporcionar ácido araquidónico (ARA)
suplementario a un ser humano que necesite del mismo, que comprende
formular el aceite de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9
en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, en el que
dicho compuesto farmacéutico se formula para proporcionar una
cantidad efectiva de ácido araquidónico (ARA) para proporcionar
ácido araquidónico (ARA) suplementario a dicho ser humano.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dicho compuesto farmacéutico se formula para proporcionar de
0,2 a 0,8 gramos de ácido araquidónico (ARA)/día.
14. El procedimiento de la reivindicación 12 o de
la reivindicación 13, en el que dicho compuesto farmacéutico es
aceptable farmacológicamente para administración enteral.
15. El procedimiento de la reivindicación 12 o
de la reivindicación 13, en el que dicho compuesto farmacéutico es
aceptable farmacológicamente para administración parenteral.
16. El procedimiento de la reivindicación 12 o de
la reivindicación 13, en el que dicho compuesto farmacéutico es
aceptable farmacológicamente para administración tópica.
17. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho ser humano es una mujer
embarazada o que amamanta a un lactante.
18. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho ser humano en necesidad de
ácido araquidónico (ARA) suplementario sufre un trastorno
neurológico.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que el trastorno neurológico es discinesia tardía, esquizofrenia
o trastorno peroxisomal.
20. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 12 ó 13, en el que dicho ser humano en necesidad de
ácido araquidónico (ARA) suplementario sufre una condición de
enfermedad asociada con un nivel reducido de ácido araquidónico
(ARA) en suero.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en
el que la enfermedad es una enfermedad hepática, fenilcetonuria o
fibrosis cística.
22. Una composición cosmética que comprende el
aceite de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9, en el que
dicho aceite está presente en dicha composición en una cantidad
efectiva para ayudar a mantener el tono de la piel cuando dicha
composición se aplica tópicamente.
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