PT1542670E - Composição com efeitos na prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável - Google Patents

Description

ΡΕ1542670 1

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO COM EFEITOS NA PREVENÇÃO DO DECLÍNIO, MELHORAMENTO OU AUMENTO DE RESPOSTAS NORMAIS DE APTIDÕES COGNITIVAS DE UMA PESSOA SAUDÁVEL"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, contendo, como ingredientes activos, ácido araquidónico e/ou compostos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte, e um processo para a sua produção. Mais especificamente, a invenção proporciona alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, nível de consciência e/ou capacidade discriminatória em relação a eventos seleccionados do grupo que consiste em estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos gustativos, estímulos olfactivos e estímulos somatossensoriais, que contêm, como ingredientes activos, uma ou mais espécies seleccionadas do grupo que consiste em ácido araquidónico, ésteres de álcoois de ácido araquidónico e triglicéridos, fosfolípidos ou glicolípidos contendo ácido araquidónico como parte ou todo o ácido gordo constituinte. 2 ΡΕ1542670

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A cognição é o processo de selecção de informação do ambiente externo e de a identificar claramente, e mais especificamente, de transmitir estímulos externos como estímulos visuais, auditivos, olfactivos, gustativos e somatossensoriais ao cérebro através dos orgãos sensoriais e de os processar e identificar precisamente pelo funcionamento coordenado de múltiplas regiões do cérebro.

As aptidões cognitivas consistem nos dois factores de velocidade de processamento de informações (velocidade de transformar estímulos externos) e da quantidade de recursos de processamento de informação (o nível de alocação de recursos para o processamento de informações de estímulos externos) e os efeitos da prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável de acordo com a presente invenção são, por conseguinte, entendidos como referindo-se à prevenção do declínio, melhoramento ou aumento das funções normais, como a atenção, memória, percepção, linguagem, cálculo e outras semelhantes, ao mesmo tempo que são distintos do melhoramento da função diminuída. Vários agentes terapêuticos foram pesquisados e desenvolvidos em relação à função cognitiva diminuída. Infelizmente, no entanto, não foram ainda encontrados compostos eficazes que previnam o declínio de, melhoramento 3 ΡΕ1542670 ou aumento das respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável. Isto é, embora sejam conhecidos métodos para a determinação comprometimento da função cognitiva e avaliação dos efeitos dos melhoramentos (ver, por exemplo, Nishimura, T., Takeda, M., "Diagnostic imaging of Alzheimer's dementia", páginas 27-36, Medicai View Publications (2/10/2001)), publicações médicas Vista (2001/02/10)), esses métodos não permitem a avaliação da prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais. Há portanto necessidade de meios eficazes para avaliar objectivamente as respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável de modo a desenvolver e pesquisar objectivamente agentes farmacológicos para a prevenção do declínio, melhoramento ou aumento das respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável. A atenção recentemente foi focada em potenciais do cérebro relacionados com eventos como um índice fisiológico para servir como uma avaliação objectiva da aptidão cognitiva. É possível registar a actividade eléctrica apresentada pelos neurónios através de eléctrodos ligados ao couro cabeludo humano. As ondas cerebrais de fundo são genericamente conhecidas como actividade eléctrica contínua que varia de acordo com o nível de excitação. Também está presente um potencial de acção diminuto transitório que varia em relação a um dado evento especificável. Este potencial de acção é actualmente referido como "potenciais do cérebro relacionados com 4 ΡΕ1542670 eventos" e é interpretado como o potencial induzido por estímulos internos ou externos. Os potenciais do cérebro relacionados com eventos, uma variação de potencial diminuta de cerca de 0,1 pV a várias dezenas de pV, é composto por uma série de ondas positivas e ondas negativas. A onda positiva que surge próximo de 300 msegundos para o evento de estímulo entre esta série de variação de potencial está associada à função cognitiva e é designada P300. 0 tempo para o aparecimento de P300 para um evento de estímulo é chamado latência P300 e representa a velocidade de processamento da informação (velocidade de transformação de estímulos externos), enquanto que a altura do pico a partir da linha de base é chamada a amplitude P300 e representa a quantidade de recursos de processamento de informações (o nível de alocação de recursos para o processamento de informações de estímulos externos) (ver, por exemplo, Mitamura, S., "Current Therapy", Vol. 18, No. 4, páginas 618-621, Life Medicom (2/10/2001)). Tornou-se assim possível medir objectivamente a resposta cognitiva humana por determinação dos potenciais do cérebro relacionados com eventos.

Os estímulos externos são transmitidos através de órgãos sensoriais para o cérebro, e o cérebro é a massa adiposa semelhante a tecido, cerca de 1/3 de matéria branca e 1/4 de matéria cinzenta consiste em fosfolípidos. Dado que a maior parte dos ácidos gordos poli-insaturados dos fosfolípidos que constituem as membranas das células do cérebro são o ácido araquidónico e ácido docosa-hexaenóico, 5 ΡΕ1542670 foi sugerido que estes ácidos gordos poli-insaturados podem desempenhar algum papel no aumento das aptidões de aprendizagem e memória e na prevenção ou melhoramento da demência senil. 0 ácido araquidónico e ácido docosa-hexaenóico não podem ser sintetizados de novo em animais e portanto têm de ser ingeridos a partir de alimentos directamente ou indirectamente (como ácido linoleico precursor do ácido araquidónico ou ácido a-linoleico precursor do ácido docosa-hexaenóico). A atenção foi por isso focada nos efeitos de aumento da aprendizagem e memória e efeitos de prevenção e melhoramento na demência senil por fornecimento externamente de ácido araquidónico e ácido docosa-hexaenóico. 0 ácido docosa-hexaenóico é encontrado abundantemente em fontes de óleo de peixe e foi realizada muita pesquisa sobre os seus efeitos no melhoramento da função cerebral, enquanto que foram descritas invenções relativas à sua utilização em fortalecedores da aptidão de aprendizagem, fortalecedores da memória, agentes de prevenção da demência, agentes de tratamento da demência, agentes anti-demência ou alimentos funcionais com efeitos de melhoramento da função cerebral (ver, por exemplo, publicação da patente japonesa não examinada N° 7-82146, publicação da patente japonesa não examinada N° 5-117147 e publicação da patente japonesa não examinada N° 2-49723). Além disso, foi recentemente demonstrado pelos presentes inventores que o ácido araquidónico e/ou os compostos que contêm ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte invenção melhoram o declínio da aptidão para a aprendizagem 6 ΡΕ1542670 relacionado com a idade, com base nos resultados da administração de ácido araquidónico e/ou de um composto que compreende ácido araquidónico como um ácido qordo constituinte a animais idosos submetidos a um teste do labirinto de áqua de Morris, como descrito na publicação da patente japonesa não examinada N° 2003-48831, que foi publicada em 21 de Fevereiro de 2003, intitulada "Composição que tem efeitos de prevenção ou melhoramento de patologias ou doenças causadas por hipofunção cerebral". No entanto, esta invenção especifica está direccionada para o declínio na função cerebral e nada descreve a respeito dos efeitos sobre as respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável.

Foram feitas algumas tentativas para determinar os efeitos de melhoramento de vários compostos na resposta cognitiva com base em potenciais do cérebro relacionados com eventos. Miyanaga, K. examinou a acção farmacológica de DHA sobre a função cerebral, medindo potenciais do cérebro relacionados com eventos antes e depois da administração oral de cápsulas contendo 2400 mg de DHA a 26 indivíduos saudáveis, e verificou que a latência de P300 foi significativamente reduzida e a amplitude de P300 foi significativamente aumentada (ver Miyanaga, K., "Shoku no Kagaku" [Food Science] páginas 84- 96, Korin Books (1999)) .

No entanto, devido a uma falta de resultados comparativos com amostras de placebo, não foi possível estabelecer uma correlação entre os níveis sanguíneos de DHA e os resultados de P300. Num ensaio de administração prolongada 7 ΡΕ1542670 com a administração diária de cápsulas contendo 900 mg de DHA a 97 indivíduos geriátricos saudáveis durante 6 meses, não foi observada alteração em P300, deixando assim incerteza sobre a eficácia do DHA.

Assim, enquanto que o ácido docosa-hexaenóico é considerado como apresentando um efeito de melhoramento na aptidão de aprendizagem, o facto de que não terem sido encontrados resultados eficazes em termos de potenciais do cérebro relacionados com eventos como um índice da aptidão cognitiva significa que ainda não está claro se o ácido araquidónico e/ou compostos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte são ou não eficazes para a prevenção do declínio, melhoramento e aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável.

McGahon et al. (Neuroscience, Vol. 94, N° 1, páginas 305-314) descrevem suplementação dietética com ácidos gordos ω-3, DHA em particular, em ratos. Observa-se algum melhoramento na deterioração da potenciação de longa duração do hipocampo em ratos alimentados com uma dieta suplementada por ácidos gordos ω-3, DHA em particular, em óleo de atum.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Problemas a ser resolvidos pela invenção

Consequentemente, tem sido ardentemente desejado ΡΕ1542670 desenvolver compostos que impeçam o declínio das, melhorem ou aumentem as, respostas normais de velocidade de processamento de informação (velocidade de transformação de estímulos externos) e a quantidade de recursos de processamento de informação (o nível de atribuição de recursos para o processamento de informação de estímulos externos), como os dois factores de aptidões coqnitivas, e que sejam altamente adequadas para produtos farmacêuticos, bem como produtos alimentares, com efeitos secundários mínimos.

Meios para resolver os problemas A presente invenção proporciona portanto composições de acordo com a reivindicação 1, alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, contendo, como ingredientes activos, ácido araquidónico e/ou compostos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte. Mais especificamente, a invenção proporciona composições, alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, nível de consciência e/ou aptidão discriminatória em relação a eventos (estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos gustativos, estímulos olfactivos, estímulos somatossensoriais) , que contêm como substâncias activas uma ou mais espécies seleccionadas do grupo que consiste em ácido araquidónico, os ésteres de álcoois do ácido 9 ΡΕ1542670 araquidónico e triglicéridos, fosfolípidos ou glicolípidos compreendendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte.

Como resultado da investigação diligente com o objectivo de elucidar os efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável pelo ácido araquidónico e ou compostos compreendendo ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte, os presentes inventores constataram surpreendentemente um efeito do ácido araquidónico e/ou compostos compreendendo ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte, com base na avaliação utilizando como um índice os potenciais do cérebro relacionados com eventos.

Os presentes inventores também conseguiram realizar a produção industrial microbiana de triglicéridos contendo pelo menos 10% em peso de ácido araquidónico, e elucidaram os efeitos desses triglicéridos em ensaios de efeitos de acordo com a invenção.

Os presentes inventores conseguiram ainda fazer a produção enzimática de óleos e gorduras contendo triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 e ácido araquidónico ligado à posição 2, e elucidaram os efeitos desses triglicéridos em ensaios de efeitos de acordo com a invenção. 10 ΡΕ1542670 A presente invenção proporciona, portanto, composições, alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, contendo como ingredientes activos ácido araquidónico e/ou compostos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte. Mais especificamente, a invenção proporciona alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, nível de consciência e/ou aptidão discriminatória em relação a eventos (estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos gustativos, estímulos olfactivos, estímulos somatossensoriais), que contêm como ingredientes activos uma ou mais espécies seleccionadas do grupo que consiste em ácido araquidónico, ésteres de álcoois do ácido araquidónico e triglicéridos, fosfolípidos ou glicolípidos compreendendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte.

De acordo com a invenção, é possível proporcionar alimentos e bebidas tendo efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, que contêm como ingredientes activos ácido araquidónico e/ou compostos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte, pelo que a invenção é particularmente útil na sociedade moderna.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um gráfico de barras que mostra as 11 ΡΕ1542670 alterações dos níveis de ácido araquidónico em fosfolípidos séricos antes e depois da ingestão de cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico e cápsulas contendo azeite (cápsulas de placebo). A Fig. 2 é um gráfico de linhas que mostra alterações da latência de P300 antes e depois da ingestão de cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico e cápsulas contendo azeite (cápsulas de placebo). A Fig. 3 é um gráfico de linhas que mostra alterações da amplitude de P300 antes e depois da ingestão de cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico e cápsulas contendo azeite (cápsulas de placebo).

Fig. 4 é um par de gráficos de pontos que mostram a correlação entre P300 (latência e amplitude de P300) e os níveis de ácido araquidónico em fosfolípidos séricos.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições, alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, compreendendo como ingredientes activos ácido araquidónico e/ou compostos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte.

As composiçoes da invenção têm efeitos de 12 ΡΕ1542670 prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável, ou dito de outra forma, têm efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais do nível de sensibilização de uma pessoa saudável e têm efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidão discriminatória de uma pessoa saudável em relação a eventos (estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos gustativos, estímulos olfactivos, estímulos somatossensoriais) e são capazes de apresentar os seus efeitos em alimentos ou bebidas, produtos farmacêuticos, produtos farmacêuticos de venda livre e outros semelhantes. Os efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável também são eficazes como alimentos ou bebidas, produtos farmacêuticos e produtos farmacêuticos de venda livre concebidos para fins de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de funções normais como a atenção, memória, percepção, linguagem, cálculo e outras semelhantes, e como alimentos ou bebidas, alimentos dietéticos, alimentos funcionais, alimentos especiais para cuidados de saúde, alimentos para lactentes, alimentos geriátricos, etc. concebidos para fins de manter ou aumentar a concentração, manter a atenção, desanuviar a cabeça ou estimular a mente, rejuvenescimento e outros semelhantes.

Os ingredientes activos de acordo com a invenção podem ser, em vez de ácido araquidónico livre, quaisquer 13 ΡΕ1542670 compostos tendo ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte. Os compostos tendo ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte incluem sais do ácido araquidónico como os sais de cálcio e de sódio, ou ésteres de álcoois do ácido araquidónico como éster metilico do ácido araquidónico, éster etílico do ácido araquidónico e outros semelhantes. Também podem ser utilizados triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos, fosfolípidos ou glicolípidos contendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte.

Para aplicação num produto alimentar, o ácido araquidónico está preferencialmente na forma de triglicéridos ou os fosfolípidos e especialmente triglicéridos. Embora virtualmente não sejam conhecidas fontes naturais de triglicéridos contendo ácido araquidónico (ou triglicéridos incluindo triglicéridos com ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte) , os presentes inventores conseguiram efectuar a utilização industrial de triglicéridos contendo ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte e foram os primeiros a elucidar o efeito do ingrediente activo da invenção em seres humanos por administração prolongada a seres humanos e análise de potenciais do cérebro relacionados com eventos, permitindo a avaliação objectiva de capacidades cognitivas, e demonstrar que tem um efeito de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável. 14 ΡΕ1542670

De acordo com a presente invenção, portanto, podem ser utilizados triglicéridos que incluem triglicéridos em que parte ou a totalidade dos ácidos gordos constituintes são ácido araquidónico como o ingrediente activo da presente invenção (triglicéridos contendo ácido araquidónico). Para aplicação em produtos alimentares, os triglicéridos contendo ácido araquidónico estão preferencialmente na forma de óleos ou gorduras (triglicéridos) em que a proporção de ácido araquidónico é de pelo menos 20% em peso (p/p), preferencialmente de pelo menos 30% em peso e, mais preferencialmente, de pelo menos 40% em peso dos ácidos gordos totais dos triglicéridos. De acordo com a invenção, portanto, podem ser utilizados quaisquer óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico obtidos por cultura de microrganismos capazes de produzir o mesmo.

Como exemplos de microrganismos capazes de produzir óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico, pode mencionar-se os microrganismos que pertencem ao género Mortierella, Conidiobolus, Pythlum, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium ou Saprolegnia. Como microrganismos pertencentes ao género Mortierella subgénero Mortierella podem ser mencionados Mortierella elongata, Mortierella exígua, Mortierella hygrophila, Mortierella alpina e outros semelhantes. Especificamente, podem ser mencionadas estirpes como Mortierella elongata IF08570, Mortierella exígua IF08571, 15 ΡΕ1542670

Mortierella hygrophila IF05941, Mortierella alpina IF08568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68, etc.

Todas estas estirpes estão disponíveis sem restrições do Institute for Fermentation, Osaka (IFO), da American Type Culture Collection (ATCC) e do Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS). Além disso, pode utilizar-se a estirpe Mortierella elongata SAM0219 (FERM P-8703) (FERM BP-1239) separada do solo pelo grupo de investigação dos presentes inventores.

Para a cultura das estirpes utilizadas para a invenção, os esporos, hifas ou células de uma solução de cultura inicial obtida por pré-cultura são inoculados em meio líquido ou sólido para a cultura principal. No caso de um meio líquido, a fonte de carbono utilizada pode ser qualquer uma geralmente utilizada como glucose, frutose, xilose, sacarose, maltose, amido solubilizado, melaço, glicerol ou manitol, embora não haja nenhuma limitação quanto a estes. Como fontes de azoto pode utilizar-se fontes de azoto orgânico, incluindo fontes de azoto naturais como peptona, extracto de levedura, extracto de malte, extracto de carne, ácido casamínico, água de maceração do milho, proteína de soja, soja desengordurada, farinha de sementes de algodão ou outras semelhantes, bem como ureia, e fontes de azoto inorgânico como nitrato de sódio, nitrato de amónio e sulfato de amónio. Se 16 ΡΕ1542670 necessário, também podem ser utilizadas fontes de nutrientes vestigiais incluindo sais inorgânicos como sais de ácido fosfórico, sulfato de magnésio, sulfato de ferro e sulfato de cobre ou vitaminas. Estes componentes do meio não estão particularmente restringidos desde gue estejam em concentrações que não inibam o crescimento dos microrganismos. Na prática, a fonte de carbono vai geralmente ser adicionada numa guantidade total de 0,1-40% em peso (p/v) e preferencialmente 1-25% em peso (p/v). A adição inicial de fonte de azoto pode ser a 0,1-10% em peso (p/v) e preferencialmente 0,1-6% em peso (p/v), com adição de mais da fonte de azoto durante a cultura se desejado. Óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo pelo menos 45% em peso (p/p) de ácido araquidónico podem ser preparados como o ingrediente activo para a invenção por controlo da concentração de fonte de carbono no meio. A cultura produz células na fase de crescimento até ao dia 2-4 da cultura e células na fase de acumulação de óleo/gordura após o dia 2-4 de cultura. A concentração inicial de fonte de carbono é de 1-8% em peso e preferencialmente de 1-4% em peso e a fonte de carbono é adicionada sucessivamente só durante os periodos iniciais da fase de crescimento das células e da fase de acumulação de óleo/gordura, até uma adição de fonte de carbono sucessiva total de 2-20% em peso e preferencialmente de 5-15% em peso. A adição sucessiva da fonte de carbono durante os periodos iniciais da fase de crescimento celular e da fase de acumulação de óleo/gordura é baseada na 17 ΡΕ1542670 concentração da fonte de azoto inicial, para uma concentração de fonte de carbono de zero no meio a partir do 7o dia de cultura, preferencialmente a partir do 6o dia de cultura e mais preferencialmente a partir do 4o dia de cultura, para se obter óleos ou gorduras (triglicéridos) compreendendo pelo menos 45% em peso de ácido araquidónico, como um ingrediente activo de acordo com a invenção. A temperatura de cultura para o microrganismo produtor de ácido araquidónico vai diferir dependendo do microrganismo, mas pode ser de 5-40°C e preferencialmente de 20-30°C, ou as células podem ser cultivadas a 20-30°C para crescimento e a cultura continuar a 5-20°C para produzir ácidos gordos insaturados. Essa gestão de temperaturas também pode ser utilizada para aumentar a proporção de ácidos gordos poli-insaturados entre os ácidos gordos produzidos. O pH do meio pode ser de 4-10, e preferencialmente de 5-9, e o método de cultura pode ser cultura submersa, cultura com agitação ou cultura estacionária. A cultura vai geralmente ser realizada durante 2-30 dias, preferencialmente durante 5-20 dias e mais preferencialmente durante 5-15 dias.

Como um meio para aumentar a proporção de ácido araquidónico nos óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico que não o controlo da concentração da fonte de carbono no meio, os óleos ou gorduras contendo ácido araquidónico podem ser hidrolisados selectivamente para se obter óleos ou gorduras ricos em ácido 18 ΡΕ1542670 araquidónico. As lipases utilizadas para hidrólise selectiva não são especificas para posições dos triglicéridos e, como a actividade hidrolitica é mais baixa em proporção para o número de ligações duplas, as ligações éster dos ácidos gordos que não forem as dos ácidos gordos poli-insaturados são hidrolisadas. Além disso, a transesterificação ocorre entre os triglicéridos de PUFA produzidos, resultando em triglicéridos com ácidos gordos poli-insaturados aumentados (ver, por exemplo, "Enhancement of Arachidonic Acid: Selective Hydrolysis of a Single-Cell Oil from Mortierella with Candida cylindracea lipase", J. Am. Oil Chem. Soc., 72, páginas 1323-1327, AOCS Press (1998)). Assim, os óleos ou gorduras (triglicéridos) ricos em ácido araquidónico obtidos por hidrólise selectiva de óleos ou gorduras contendo ácido araquidónico podem ser utilizados como ingredientes activos de acordo com a invenção. É preferida uma maior proporção de ácido araquidónico é o preferido em relação aos ácidos gordos totais nos óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico da invenção de modo a minimizar os efeitos dos outros ácidos gordos, mas não há nenhuma restrição a uma proporção elevada e, na prática, a quantidade absoluta de ácido araquidónico pode colocar um problema para aplicação em produtos alimentares, embora os óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico a 10% em peso ou mais possam ser utilizados na prática.

Como triglicéridos compreendendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo 19 ΡΕ1542670 constituinte de acordo com a invenção podem ser utilizados triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 e ácido araquidónico ligados à posição 2. Também podem ser utilizados óleos ou gorduras (triglicéridos) compreendendo pelo menos 5 por cento molar, preferencialmente pelo menos 10 por cento molar, mais preferencialmente pelo menos 20 por cento molar e mais preferencialmente ainda pelo menos 30 por cento molar de triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 e ácido araquidónico ligados à posição 2. Os ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 dos triglicéridos podem ser seleccionados de ácidos gordos com 6 a 12 átomos de carbono. Como exemplos de ácidos gordos com 6 a 12 átomos de carbono podem ser mencionados o ácido caprilico e o ácido cáprico, sendo preferido o 1,3-capriloí1-2-araquidonoí1-glicerol (daqui em diante referido como "=8A8").

Os triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 e ácido araquidónico ligado na posição 2 são mais adequadas como óleos ou gorduras (triglicéridos) para pessoas idosas. Os óleos ou gorduras (triglicéridos) ingeridos são geralmente hidrolisados por lipases pancreáticas ao entrar no intestino delgado e uma vez que as lipases pancreáticas são do tipo específico para as posições 1,3, as posições 1,3 dos triglicéridos são clivadas para dar duas moléculas de ácido gordos livres ao mesmo tempo que produzem uma molécula de 2-monoacilglicérido (MG). Uma vez que o 2-MG tem solubilidade 20 ΡΕ1542670 de ácido biliar muito elevada e é altamente absorvível, os ácidos gordos da posição 2 são geralmente considerados como sendo melhor absorvidos. Além disso, o 2-MG apresenta acção tensoactiva quando dissolvido em ácidos biliares e por isso funciona para aumentar a absorção dos ácidos gordos livres. Os ácidos gordos livres e o 2-MG formam então micelas dos complexos de ácidos biliares com colesterol ou fosfolípidos e são absorvidos pelas células epiteliais intestinais, resultando na ressíntese de triacilgliceróis e finalmente libertação na linfa como quilomicra. No entanto, as propriedades de ácidos gordos das lipases pancreáticas são mais elevadas para os ácidos gordos saturados, ao passo que o ácido araquidónico é clivado menos eficiente. Um problema adicional é que a actividade da lipase pancreática é inferior em idosos, de tal forma que os óleos ou gorduras (triglicéridos) ideais são triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados nas posições 1,3 e ácido araquidónico ligado na posição 2.

Um processo de produção específico para triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 e ácido araquidónico ligado na posição 2 é um processo de produção em que é deixada actuar lipase só nas ligações éster 1,3 de triglicéridos na presença de óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico e ácidos gordos de cadeia média. O óleo ou a gordura (triglicéridos) utilizado como o material de partida consiste em triglicéridos com 21 ΡΕ1542670 ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte, e quando a proporção de ácido araquidónico é elevada em relação aos ácidos gordos totais dos triglicéridos, é utilizada uma temperatura de 30-50°C e preferencialmente 40-50°C que é superior à temperatura normal de reacção da enzima de 20-30°C, de modo a evitar redução no rendimento da reacção devido ao aumento no óleo ou gordura (o material de partida triglicérido e os triglicéridos em que só um dos ácidos gordos na posição 1,3 é um ácido gordo de cadeia média) que não reagiu.

Como lipases que actuam especificamente nas ligações éster da posição 1,3 de triglicéridos podem ser mencionadas as produzidas por microrganismos pertencentes ao género Rhizopus, Rhizomucor, Aspergillus ou outros semelhantes, bem como as lipases pancreáticas de porco. Essas lipases podem ser as disponíveis comercialmente. Exemplos seus incluem lipase de Rhizopus delemar (Talipase, produto de Tanabe Seiyaku), lipase de Rhizomucor miehei (Ribozyme IM por Novo Nordisk Co., Ltd.) e lipase de Aspergillus niger (Lipase A, produto de Amano Enzyme Co., Ltd.), sem limitação particular a estas enzimas, uma vez que podem ser utilizadas quaisquer lipases de tipo específico da posição 1,3. A forma em que a lipase é utilizada é preferencialmente como uma lipase imobilizada num suporte imobilizante, de modo a conferir estabilidade térmica à enzima dado que a temperatura da reacção é de 30 °C ou 22 ΡΕ1542670 superior e preferencialmente 40°C ou superior para uma eficiência de reacção aumentada. Resinas altamente porosas são utilizadas como suportes de imobilização e pode referir-se suportes de resinas de permuta iónica com poros de pelo menos cerca de 100 angstroms, como Dowex MARATHON WBA (marca comercial da Dow Chemical).

Um peso de 0,5 a 20 vezes de solução aquosa da lipase do tipo especifico para a posição 1,3 em relação ao suporte de imobilização é ai suspenso, e uma quantidade 2 a 5 vezes de acetona fria (por exemplo, -80°C) em relação à suspensão é adicionada lentamente com agitação para formar um precipitado. O precipitado é seco a pressão reduzida para preparar a enzima imobilizada. Como um método mais simples, uma quantidade de 0,05 a 0,4 vezes a de lipase de tipo especifico para a ligação 1,3 em relação ao suporte imobilizante é dissolvida numa quantidade mínima de água, e depois solução é misturada com o suporte de imobilização enquanto se agita e a mistura é seca a pressão reduzida para preparar a enzima imobilizada. Este procedimento resulta na imobilização de aproximadamente 90% da lipase no suporte, mas com absolutamente nenhuma exibição de actividade de transesterificação, e portanto a enzima imobilizada pode ser activada e proporcionada para produção mais eficiente por pré-tratamento no substrato (matéria-prima óleo ou gordura e ácidos gordos de cadeia média) contendo 1 a 10% em peso (p/v) de água, e preferencialmente no substrato contendo 1 a 3% em peso de água. 23 ΡΕ1542670 A quantidade de água adicionada ao sistema reaccional é extremamente importante, dependendo do tipo de enzima, uma vez que a transesterificação não vai decorrer na ausência de água, enquanto que um excesso de água provoca a hidrólise e um rendimento reduzido de glicéridos (com diglicéridos e monoglicéridos a ser produzidos por hidrólise). Nesses casos, no entanto, a enzima imobilizada activada por pré-tratamento pode ser utilizada para diminuir a importância da quantidade de água adicionada ao sistema reaccional, permitindo que a reacção de transesterificação ocorra eficientemente mesmo num sistema não contendo água. Além disso, o tipo de agente enzimático também pode ser seleccionado para permitir a omissão de pré-tratamento.

Assim, por utilização de uma enzima imobilizada resistente ao calor e aumentando a temperatura da reacção enzimática, é possível produzir eficientemente triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados nas posições 1,3 e ácido araquidónico ligado na posição 2 sem redução da eficiência da reacção, mesmo no caso de óleos ou gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico com baixa reactividade para lipases de tipo específico para as posições 1,3. 0 processo para a produção de alimentos e bebidas com efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de aptidões cognitivas de uma pessoa saudável utiliza ácido araquidónico e/ou um composto - 24 - ΡΕ1542670 com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte, quer só quer em mistura com um material de alimento ou bebida contendo essencialmente nenhum, ou apenas uma quantidade vestigial de ácido araquidónico. Aqui, "quantidade vestigial" significa que o ácido araquidónico está presente no material de alimento ou bebida mas numa quantidade que não atinge a ingestão diária de ácido araquidónico de acordo com a invenção, tal como aqui descrito adiante, se a composição de alimento for ingerida por um indivíduo. Óleos e gorduras (triglicéridos) contendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte tem possibilidades ilimitadas para utilização como matérias-primas e aditivos em alimentos, bebidas, produtos farmacêuticos e fármacos de venda livre. Além disso, não há limitações quanto à finalidade ou quantidades da sua utilização.

Como exemplos de composições alimentares podem ser mencionados produtos alimentares comuns bem como alimentos funcionais, suplementos nutricionais, alimentos maternos ou alimentos geriátricos. Como exemplos de produtos alimentares contendo óleos ou gorduras podem ser mencionados alimentos naturais que originalmente contêm óleos e gorduras, como carne, peixe e frutos secos, produtos alimentares com óleos e gorduras adicionados durante a preparação, como sopas, produtos alimentares que utilizam óleos ou gorduras como meios de aquecimento como 25 ΡΕ1542670 donuts, produtos alimentares à base de óleos ou gorduras como manteiga, produtos alimentares processados com óleos ou gorduras adicionadas durante o processamento, como biscoitos, ou produtos alimentares pulverizados ou revestidos com óleos ou gorduras durante o processamento final, como biscoitos rijos. Também podem ser adicionados a alimentos fermentados ou bebidas que não contêm óleos ou gorduras. Também podem estar na forma de produtos alimentares funcionais, produtos farmacêuticos ou fármacos de venda livre e, por exemplo, na forma de nutrientes entéricos, pós, grânulos, pastilhas, soluções orais, suspensões, emulsões, xaropes ou outros semelhantes. A composição da invenção também pode conter, para além do ingrediente activo da invenção, vários veículos e aditivos vulgarmente utilizados em alimentos e bebidas, produtos farmacêuticos ou fármacos de venda livre. Em particular, preferencialmente contém antioxidantes para evitar a oxidação do ingrediente activo da invenção. Como anti-oxidantes podem ser mencionados anti-oxidantes naturais como tocoferóis, derivados de flavona, filodulcina, ácido kójico, derivados do ácido gálhico, catequinas, ácido fukíico, gossipol, derivados de pirazina, sesamol, guaiaol, ácido guaíaco, ácido p-cumárico, ácido nordi-hidroguaiático, esteróis, terpenos, bases de ácidos nucleicos, carotenóides, lenhanos e outros semelhantes, e anti-oxidantes sintéticos como éster palmítico do ácido ascórbico, éster esteárico do ácido ascórbico, butil-hidroxianisole (BHA), butil-hidroxitolueno (BHT), mono-t- 26 ΡΕ1542670 butil-hidroquinona (TBHQ) e 4-hidroximetil-2,6-di-t-butilfenol (HMBP). Como tocoferóis podem ser mencionados a-tocoferol, β-tocoferol, γ-tocoferol, δ-tocoferol, ε-tocoferol, ξ-tocoferol, η-tocoferol e ésteres de tocoferol (tocoferol ácido acético, etc.) Como exemplos de carote-nóides podem ser mencionados β-caroteno, cantaxantina, astaxantina e outros semelhantes.

Como suportes a ser utilizados na composição da presente invenção para além do ingrediente activo da presente invenção, podem ser mencionados vários tipos de suportes de transporte, extensores, diluentes, agentes de enchimento, agentes dispersantes, excipientes, solventes aglutinantes (por exemplo, água, etanol ou óleos vegetais), auxiliares de solubilização, tampões, aceleradores de dissolução, agentes gelificantes, agentes de suspensão, farinha de trigo, farinha de arroz, amido, amido de milho, polissacáridos, proteínas do leite, colagénio, óleo de arroz, lecitina e outros semelhantes. Como exemplos de aditivos podem ser mencionadas vitaminas, edulcorantes, ácidos orgânicos, agentes corantes, aromatizantes, agentes de desumidificação, fibras, electrólitos, minerais, nutrientes, anti-oxidantes, conservantes, agentes aromáticos, humidificadores, extractos naturais alimentares, extractos vegetais e outros semelhantes, embora não exista limitação a estes. O principal componente medicinal do ácido araqui-dónico ou do composto com ácido araquidónico como um ácido 27 ΡΕ1542670 gordo constituinte é o ácido araquidónico. A ingestão diária de ácido araquidónico a partir de alimentos é referido como sendo 0,14 g na região de Kanto, Japão e 0,19-0,20 g na região de Kansai, Japão (ver "Shishitsu Eiyogaku" [Lipid Nutrition] 4, editado por Japan Society for Lipid Nutrition Editing Committee, páginas 73-82 (1995) ISN 1343-4594 CODEN: SHEIFG), e portanto o ácido araquidónico tem de ser ingerido numa quantidade correspondente ou maior. Assim, a ingestão diária de ácido araquidónico ou de um composto com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte de acordo com a invenção para um adulto (60 kg de peso corporal, por exemplo) é de 0,001-20 g, preferencialmente 0,01-10 g, mais preferencialmente 0,05-5 g e mais preferencialmente ainda 0,1-2 g, em termos de ácido araquidónico.

Quando o ingrediente activo da presente invenção é efectivamente utilizado num produto alimentar ou bebida, a quantidade absoluta de ácido araquidónico no produto alimentar também é importante. No entanto, uma vez que a quantidade absoluta no alimento ou bebida também varia dependendo da quantidade de ingestão do alimento ou bebida, o produto alimentar preferencialmente contém os trigli-céridos, incluindo triglicéridos com ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte, numa quantidade de pelo menos 0,0003% em peso, preferencialmente pelo menos 0,003% em peso e mais preferencialmente pelo menos 0,03% em peso em termos de ácido araquidónico. Quando triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados nas posições 1,3 e ácido 28 ΡΕ1542670 araquidónico ligado na posição 2 são adicionados a um alimento ou bebida, a quantidade dos triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados nas posições 1,3 e ácido araquidónico ligado na posição 2 é de pelo menos 0,001% em peso, preferencialmente pelo menos 0,01% em peso e mais preferencialmente pelo menos 0,1% em peso.

Quando a composição da invenção é utilizada como um produto farmacêutico, pode ser produzida por um método comum de fabrico de medicamentos, por exemplo, um método descrito na Farmacopeia Japonesa, ou um método nele baseado.

Quando a composição da invenção é utilizada como um produto farmacêutico, o teor do ingrediente activo na composição não está particularmente restringido, desde que o objecto da invenção seja alcançado, e a proporção de mistura pode ser como considerado apropriado.

Quando a composição da invenção é utilizada como um produto farmacêutico, é preferencialmente administrado em dosagens unitárias, sendo particularmente preferida a administração oral. As doses da composição da invenção vão diferir dependendo da idade, peso corporal e sintomas do doente e do número de vezes administrada, e por exemplo, o ácido araquidónico e/ou composto com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte de acordo a invenção pode normalmente ser administrada a cerca de 0,001-20 g, preferencialmente cerca de 0,01-10 g, mais preferencialmente cerca de 0,05-5 g e ainda mais preferencialmente 29 ΡΕ1542670 cerca de 0,1-2 g em termos de ácido araquidónico por dia para um adulto (cerca de 60 kg), em doses divididas de 1 a 3 vezes por dia.

Os principais ácidos gordos das membranas fosfo-lipidicas do cérebro são ácido araquidónico e ácido docosa-hexaenóico e portanto a composição da invenção é preferencialmente uma associação de ácido araquidónico e ácido docosa-hexaenóico tendo em consideração a manutenção do equilíbrio. Genericamente falando, o ácido araquidónico (ácido gordo insaturado n-6) e o ácido docosa-hexaenóico (ácido gordo insaturado n-3) são biossintetizados pela mesma enzima a partir de ácido linoleico e ácido a-linolénico, respectivamente. Quando o ácido araquidónico é administrado só, por conseguinte, a biossíntese de ácido docosa-hexaenóico é inibida. Inversamente, quando o ácido docosa-hexaenóico é administrado só, a biossíntese do ácido araquidónico é inibida. De modo a evitar esses desequilíbrios, é preferido que o ácido araquidónico e o ácido docosa-hexaenóico sejam consumidos em associação. Além disso, como a proporção de ácido eicosapentaenóico é muito baixa em membranas fosfolipídicas do cérebro, a associação preferencialmente contém virtualmente nenhum ácido eicosapentaenóico. Por conseguinte, preferencialmente não contém nenhum ácido eicosapentanóico ou apenas até 1%. A composição mais preferencialmente contém virtualmente nenhum ácido eicosapentaenóico com o ácido araquidónico e o ácido docosa-hexaenóico. A associação de ácido araquidónico e ácido docosa-hexaenóico também preferencialmente tem uma proporção de ácido araquidónico/ácido docosa-hexaenóico (em 30 ΡΕ1542670 peso) na gama de 0,1-15 e preferencialmente na gama de 0,25-10. Os mais preferidos são os alimentos e bebidas que contêm ácido eicosapentaenóico a não mais do que 1/5 (em massa) do ácido araquidónico.

As composições alimentares da invenção para alimentos ou bebidas, alimentos dietéticos, alimentos funcionais, alimentos especiais para cuidados de saúde, alimentos geriátricos e outros semelhantes incluem os que são comercializados utilizando recipientes de embalagem e/ou ferramentas de merchandising de composições de alimentos (por exemplo, folhetos ou outros semelhantes) que descrevem ou de outra forma indicam que as composições e/ou componentes da composição têm efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento das aptidões cognitivas, ou dito de forma diferente, que têm efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais do nível de consciência de uma pessoa saudável, efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de capacidade de discriminação de uma pessoa saudável em relação a eventos (estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos gustativos, estímulos olfactivos, estímulos somatossensoriais) e efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de funções normais como atenção, memória, percepção, linguagem, cálculo e outros semelhantes, bem como tendo efeitos de manutenção ou aumento da concentração, manutenção da atenção, desanuviamento da cabeça ou estimulação da mente, rejuvenescimento e outros semelhantes. 31 ΡΕ1542670

EXEMPLOS A presente invenção vai agora ser explicada em mais pormenor através dos exemplos seguintes.

Exemplo 1

Processo de produção para triglicéridos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte

Mortierella alpina foi utilizada como uma estirpe produtora de ácido araquidónico. Uma porção de 6 kL de meio contendo 1,8% de glucose, 3 , 1% de farinha de soja desengordurada, 0,1% de óleo de soja, 0, 3% de KH2P04, 0,1% de Na2S04, 0, 05% de CaCl2.2H20 e 0,05% de MgCl2.6H20 foi preparada num recipiente de cultura de 10 kL e o pH inicial foi ajustado para 6,0. Após inoculação de 30 L da solução de cultura, foi realizada a cultura submersa durante 8 dias em condições de temperatura de 26°C, 360 m3/h de arejamento e 200 kPa de pressão interior. A rotação foi ajustada para manter uma concentração de oxigénio dissolvido de 10-15 ppm. Além disso, a concentração de glucose do meio foi ajustada por alimentação para estar na gama de 1-2,5% até ao 4o dia e 0,5-1% depois disso (em que as percentagens são baseadas em peso (p/v)). Depois de completada a cultura, seguida por filtração e secagem, as células contendo triglicéridos com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte foram recolhidas, o óleo/gordura foi obtido a partir das células obtidas por extracção com hexano e o 32 ΡΕ1542670 óleo/gordura comestível foi submetido a um passo de purificação (degomagem, desacidificação, destilação com vapor, descoloração) para se obter 150 kg de triglicéridos contendo ácido araquidónico (com ácido araquidónico ligado a quaisquer posições dos triglicéridos). 0 óleo/gordura (triglicérido) obtido foi metilesterifiçado e o éster metílico de ácido gordo resultante foi analisado por cromatografia em fase gasosa, que revelou uma proporção de ácido araquidónico de 40,84% dos ácidos gordos totais. Os teores de ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido γ-linolénico e ácido dihomo-γ-linolénico foram 11,63%, 7,45%, 7,73%, 9,14%, 2,23% e 3,27%, respectivamente. 0 óleo/gordura (triglicérido) contendo ácido araquidónico foi etilesterifiçado e 99% de éster etílico do ácido araquidónico foi separado e purificado a partir da mistura de ésteres etílicos de ácidos gordos compreendendo 40% de éster etílico do ácido araquidónico, por cromatografia líquida de alto desempenho corrente.

Exemplo 2

Produção de triglicéridos incluindo pelo menos 5% de triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados nas posições 1,3 e ácido araquidónico ligado na posição 2 (8A8)

Após suspensão de 100 g de um suporte de resina de permuta iónica (Dowex MARATHON WBA™: Dow Chemical) em 80 33 ΡΕ1542670 mL de solução aquosa a 12,5% de lipase de Rhizopus delemar (Talipase em pó, produto de Tanabe Seiyaku), a suspensão foi seca a pressão reduzida para se obter a lipase imobilizada.

Em seguida, fez-se reagir 80 g do triglicérido contendo 40% em peso de ácido araquidónico obtido no Exemplo 1 (TGA40S) , 160 g de ácido caprilico, 12 g da lipase imobilizada anteriormente referida e 4,8 mL de água a 30°C durante 48 horas com agitação (130 rpm). Depois de completada a reacção, a mistura reaccional foi removida para se obter a lipase imobilizada activada.

Uma porção de 10 g da enzima imobilizada (lipase de Rhizopus delemar, suporte: Dowex MARATHON WBA™) foi empacotada numa coluna de vidro encamisada (1,8 x 12,5 cm, volume de 31,8 mL) e um óleo misto contendo o TGA40S obtido no Exemplo 1 e ácido caprilico numa proporção de 1:2 foi passado através da coluna a um caudal fixo (4 mL/h) para reacção continua para se obter 400 g de óleo/gordura que reagiu. A temperatura da coluna era de 40-41°C. 0 ácido caprilico que não reagiu e os ácidos gordos livres foram removidos do óleo/gordura que reagiu por destilação molecular, e o óleo/gordura comestível foi submetido a um passo de purificação (degomagem, desacidificação, destilação com vapor, descoloração) para se obter óleo/gordura (triglicéridos) contendo 8A8. O teor de 8A8 do óleo/gordura (triglicéridos) contendo 8A8 era de 31,6%, determinado por cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alto 34 ΡΕ1542670 desempenho. (As proporções de 8P8, 808, 8L8, 8G8 e 8D8 eram de 0,6, 7,9, 15,1, 5,2 e 48%, respectivamente. Os ácidos gordos P, 0, L, G e D ligados à posição 2 do triglicérido representam ácido palmitico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido γ-linolénico e ácido di-homo-y-linolénico, respec-tivamente, 8P8 é 1,3-capriloil -2-palmitoleíl-glicerol, 808 é 1,3-capriloil-2-oleoíl-glicerol, 8L8 é 1,3-capriloíl-2-linoleoíl-glicerol, 8G8 é 1,3-capriloí1-2-y-linolenoí1-glicerol e 8D8 é 1,3-capriloí1-2-di-homo-y-linolenoíl-glicerol). A separação e purificação por cromatografia líquida de alto desempenho de acordo com um protocolo estabelecido deu 96 por cento molar de 8A8 a partir do óleo/gordura (triglicéridos) contendo 8A8 obtido.

Exemplo 3

Produção de cápsulas de teste

Adicionou-se água a 100 partes em peso de gelatina e 35 partes em peso de glicerina de qualidade alimentar para dissolução a 50-60°C para preparar um revestimento de gelatina com uma viscosidade de 2000 cp. Em seguida, 0,05% em peso de óleo de vitamina E foi misturado com o óleo/gordura (triglicéridos) contendo ácido araqui-dónico obtido no Exemplo 1 para preparar a Carga de Enchimento 1. Separadamente, misturou-se 0,05% em peso de óleo de vitamina E com óleo/gordura (triglicéridos), contendo 32 por cento molar de 8A8 obtido no Exemplo 2 para preparar a Carga de Enchimento 2. A Carga de Enchimento 1 foi utilizada para a moldagem e secagem de cápsulas por um 35 ΡΕ1542670 método corrente para o fabrico de cápsulas moles contendo 200 mg de enchimento por cápsula (cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico) enquanto s Carga de Enchimento 2 foi também utilizada para a moldagem e secagem de cápsulas por um método corrente para o fabrico de cápsulas moles contendo 200 mg de enchimento por cápsula (cápsulas de óleo alimentar contendo 8A8). Cápsulas moles contendo azeite como a carga de enchimento foram também fabricadas como cápsulas de placebo para um ensaio em seres humanos.

Exemplo 4

Ensaio de ingestão de cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico para determinar efeitos sobre as respostas cognitivas em indivíduos saudáveis

Os potenciais do cérebro (ERP) relacionados com eventos foram medidos por tarefas audíveis (ou discriminação auditiva) de acordo com as directrizes de medição dos potenciais evocados estabelecidos pelo Evoked Potential Examination Standards Committee da Japan Society of Clinicai Neurophysiology. Especificamente, um foi utilizado paradigma extravagante auditivo para a medição de ERP e ambas as orelhas do indivíduo de teste foram estimuladas por dois tons puros nas frequências de 1000 Hz e 2000 Hz através de auriculares numa proporção de 1:4 e em ordem aleatória, e o indivíduo foi instruído a pressionar um botão disponibilizado quando o tom de 2000 Hz foi ouvido e a contar o número de vezes ouvido. A intensidade do tom 36 ΡΕ1542670 era de 90 dB, a duração era de 100 msegundos e o intervalo entre os estímulos foi aleatório entre 1000-3000 msegundos. O número aproximado de estimulações no ensaio real foi de 200 por experiência e a duração do ensaio foi de cerca de 10 minutos. O ensaio foi realizado em 2 experiências e foram determinados os potenciais do cérebro relacionados com eventos. Foram registadas electroencefalografias (EEGs) utilizando eléctrodos de Ag-AgCl, de que a resistência é não superior a 5 kQ, colocados em três pontos ao longo da linha média do couro cabeludo (Fz, Cz e Pz, de acordo com deslocamentos 10-20 internacionais) e eléctrodos de referência em ambos os lóbulos das orelhas.

Foi identificado o potencial positivo máximo entre 250-600 msegundos desde o início da simulação auditiva de baixa frequência a ser apercebida (um tom de 2000 Hz nesta experiência) como o componente P300 intrínseco que varia na avaliação da atenção selectiva ou resposta cognitiva, o tempo a partir do início da estimulação foi registado como a latência de P300 (velocidade de transmissão da estimulação) e a altura do potencial desde a linha de base foi registada como a amplitude de P300 (a quantidade de recursos de processamento de informações). 0 ensaio humano para a invenção foi realizado com a devida consideração para aderir ao espírito da Declaração de Helsínquia.

Após a explicação para consentimento à participação no ensaio, a participação, 12 indivíduos saudáveis 37 ΡΕ1542670 com consentimento (sem tomar medicação, sem resultados anormais em análises de sangue e sem enfartes como determinado por tomografia computarizada (CT) craniana) foram divididos em dois grupos A e B (A: n=7, B: n=5). Durante um período de um mês, ao grupo A foram administradas três das cápsulas de óleo comestível contendo ácido araquidónico preparadas no Exemplo 3 (80 mg/cápsula de ácido araquidónico) para um consumo diário de ácido araquidónico de 240 mg, enquanto que ao grupo B foram administradas três cápsulas de placebo. Os potenciais do cérebro relacionados com eventos foram medidos antes e depois da ingestão das cápsulas e analisou-se a latência e a amplitude de P300. Aos participantes nos Grupos A e B foram então retiradas as cápsulas durante um período de limpeza de um mês. Após o período de limpeza, ao grupo A foi administrado placebo e ao Grupo B foram administradas durante um mês as cápsulas de óleo comestível contendo ácido araquidónico e os potenciais do cérebro relacionados com eventos foram medidos da mesma maneira antes e depois da ingestão das cápsulas (ensaio duplamento cego, cruzado).

Colheu-se sangue no momento da determinação dos potenciais do cérebro relacionados com eventos e os lípidos totais foram extraídos do soro de cada participante pelo método de Folch. Os lípidos foram fraccionados por cromatografia em camada fina, a fracção de fosfolípidos foi recolhida, a água foi removida por destilação azeotrópica com etanol e foi realizada a análise por cromatografia em fase gasosa após a conversão em éster metílico do ácido 38 ΡΕ1542670 gordo com HC1 a 10%-metanol, para determinar o teor de ácido araquidónico dos fosfolípidos do soro. A Fig. 1 mostra as alterações do teor de ácido araquidónico em fosfolípidos séricos antes e depois da ingestão das cápsulas. Os teores de ácido araquidónico dos fosfolípidos de soro dos indivíduos que ingeriram cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico foram significativamente aumentados após a ingestão das cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico, enquanto que o teor de ácido araquidónico dos fosfolípidos do soro de indivíduos que ingeriram as cápsulas de placebo ficaram inalterados antes e depois da ingestão das cápsulas de placebo. A Fig. 2 e a Fig. 3 mostram alterações da latência e amplitude de P300 antes e depois da ingestão das cápsulas. A latência de P300 foi significativamente reduzida em 12,3 msegundos e a amplitude de P300 foi significativamente aumentada em 1,9 pV com a ingestão das cápsulas de óleo alimentar contendo ácido araquidónico em comparação com as cápsulas de placebo. São conhecidos o encurtamento normal da latência de P300 de 1,8 msegundos/ano e a diminuição normal da amplitude de P300 de 0,2 pV/ano (Goodin D. S. et al., 1978) e portanto os resultados deste ensaio indicam um rejuvenescimento médio para respostas cognitivas dos indivíduos de 6,8 anos com base na latência de P300 e de 9,5 anos com base na amplitude de P300. 39 ΡΕ1542670

Em seguida, a correlação entre ο P300 (latência de P300 e amplitude de P300) e o nível sérico de ácido araquidónico (fosfolipido) foi determinado por uma curva de primeira ordem com base no método dos mínimos quadrados utilizando um total de 48 dados obtidos por medição de cada um dos 12 indivíduos por 4 vezes (Fig. 4). Para a latência de P300, verificou-se uma correlação significativa (coeficiente de correlação R = -0,27) entre os níveis de ácido araquidónico, com latências mais curtas resultantes de níveis aumentados de ácido araquidónico. Também para a amplitude de P300, verificou-se uma correlação significativa (coeficiente de correlação R = -0,49) entre os níveis de ácido araquidónico, com maiores amplitudes de P300 resultantes de níveis aumentados de ácido araquidónico. Isto constitui a primeira demonstração do melhoramento da resposta cognitiva por ingestão de óleo alimentar contendo ácido araquidónico e a primeira prova do ácido araquidónico como a causa do efeito.

Exemplo 5

Ensaio de ingestão de cápsulas de óleo alimentar contendo 8A8 para determinar os efeitos sobre as respostas cognitivas em indivíduos saudáveis

Após a explicação para o consentimento para participação no ensaio da mesma forma que no Exemplo 4, 16 indivíduos saudáveis que deram consentimento (sem tomar medicação, sem resultados anormais de análises do sangue e 40 ΡΕ1542670 sem enfartes como determinado por tomografia computarizada (TC) craniana) foram divididos em dois grupos A e B ( n=8 para cada grupo). Durante um período de um mês, ao grupo A foram administradas três cápsulas de óleo alimentar contendo 8A8 preparadas no Exemplo 3 (72 mg/cápsula de ácido araquidónico), enquanto que ao grupo B foram administradas três cápsulas de placebo, e por medição dos potenciais do cérebro relacionados com eventos e registo da latência e amplitude antes e depois da ingestão das cápsulas (ensaio duplamente cego, cruzado), verificou-se que a latência de P300 estava significativamente encurtada em 16,3 msegundos e a amplitude de P300 aumentada significativamente em 2,4 pV devido à ingestão das cápsulas de óleo alimentar contendo 8A8. Estes resultados indicam um rejuvenescimento médio para respostas cognitivas dos indivíduos de 9,1 anos com base na latência de P300 e de 12,0 anos com base na amplitude de P300.

Exemplo 6

Preparação de cápsulas contendo óleo/gordura (triglicéridos) com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte

Adicionou-se água a 100 partes em peso de gelatina e 35 partes em peso de glicerina de qualidade alimentar para dissolução a 50-60°C para preparar um revestimento de gelatina com uma viscosidade de 2000 cp. Em seguida, misturou-se 50% em peso de óleo/gordura (triglicéridos) contendo ácido araquidónico obtido no 41 ΡΕ1542670

Exemplo 1 com 50% em peso de óleo de peixe (óleo de atum compreendendo ácido eicosapentaenóico e ácido docosa-hexaenóico numa proporção de 5,1% e 26,5%, respectivamente, dos ácidos gordos totais), e esta foi combinada com 0,05% em peso de óleo de vitamina E para preparar Carga de

Enchimento 3. Separadamente, misturou-se 80% em peso do óleo/gordura (triglicéridos) contendo ácido araquidónico com 20% em peso de óleo de peixe (óleo de atum, compreendendo ácido eicosapentaenóico e ácido docosa-hexaenóico numa proporção de 5,1% e 26,5%, respectivamente, dos ácidos gordos totais) e esta foi combinada com 0,05% em peso de óleo de vitamina E para preparar Carga de Enchimento 4. O éster etílico do ácido araquidónico a 99% obtido no Exemplo 1 foi também combinado com 0,05% em peso de óleo de vitamina E para se obter a Carga de Enchimento 5. As Cargas de Enchimento 3-5 foram utilizadas para a moldagem e secagem de cápsulas através de um método corrente para o fabrico de cápsulas moles contendo 200 mg de enchimento por cápsula.

Exemplo 7

Utilização em soluções de infusão de óleo

Após a combinação de 400 g de óleo/gordura (triglicéridos) contendo 96% de 8A8 obtido no Exemplo 2, 48 g de lecitina de gema de ovo purificada, 20 g de ácido oleico, 100 g de glicerina e 40 mL de soda cáustica 0,1 N e dispersão da mistura com um homogeneizador, adicionou-se água destilada para injecção até aos 4 litros. Isto foi 42 ΡΕ1542670 emulsionado com um emulsionante do tipo de pulverização a alta pressão para preparar uma emulsão de lipidos. A emulsão de lipidos foi distribuída por sacos de plástico em porções de 200 mL e submetida a tratamento de esterilização com vapor a alta pressão a 121°C durante 20 minutos para se preparar soluções de infusão de óleo.

Exemplo 8

Utilização em sumo

Uma porção de 2 g de β-ciclodextrina foi adicionada a 20 mL de uma solução de etanol aquoso a 20% e depois adicionou-se 100 mg de triglicéridos contendo ácido araquidónico obtidos no Exemplo 1 (contendo 0,05% de vitamina E) com agitação com um agitador e a mistura foi incubada a 50°C durante 2 horas. Após arrefecimento até à temperatura ambiente (aproximadamente 1 hora), continuou-se a incubação a 4°C durante 10 horas com agitação contínua. O precipitado produzido foi recolhido por separação centrífuga, e após a lavagem com n-hexano, foi liofilizado para se obter 1,8 g de um composto clatrato de ciclodextrina contendo triglicéridos contendo ácido araquidónico. Uma porção de 1 g deste pó foi uniformemente misturada com 10 L de sumo para preparar sumo contendo triglicéridos contendo ácido araquidónico.

Lisboa, 5 de Julho de 2013

Claims (25)

1. ΡΕ1542670 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição contendo ácido araquidónico e/ou um composto em que o ácido araquidónico é um ácido gordo constituinte, para utilização no tratamento de um ser humano adulto saudável para melhorar ou aumentar as respostas normais de aptidões cognitivas, ou no melhoramento, aumento ou prevenção do declínio de respostas normais de aptidões cognitivas num ser humano adulto.
2. 2. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o composto com ácido araquidónico como um ácido gordo constituinte é um éster de um álcool do ácido araquidónico ou um triglicérido, fosfolípido ou glicolípido contendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte.
3. 3. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o triglicérido contendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade do ácido gordo constituinte é um triglicérido que tem ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 e ácido araquidónico ligado à posição 2.
4. 4. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que os ácidos gordos de cadeia média são seleccionados de ácidos gordos com 6 a 12 carbonos. 2 ΡΕ1542670
5. 5. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que os ácidos gordos de cadeia média são seleccionados de ácidos gordos com 8 carbonos.
6. 6. Composição para utilização que contém tri-glicéridos, incluindo triglicéridos contendo ácido araqui-dónico como parte ou a totalidade dos ácidos gordos constituintes, para utilização no tratamento de um ser humano adulto saudável para melhorar ou aumentar as respostas normais de aptidões cognitivas, ou no melhoramento, aumento ou prevenção do declínio das respostas normais de aptidões cognitivas num ser humano adulto.
7. 7. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o teor de ácido araquidónico dos triglicéridos incluindo triglicéridos contendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade dos ácidos gordos constituintes é de pelo menos 10% em peso dos ácidos gordos totais dos triglicéridos.
8. 8. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que os triglicéridos incluindo triglicéridos contendo ácido araquidónico como parte ou a totalidade dos ácidos gordos constituintes provêm de microrganismos pertencentes ao género Mortierella.
9. 9. Composição para utilização de acordo com qualquer uma reivindicações 6 a 8, em que os triglicéridos incluindo triglicéridos contendo ácido araquidónico como 3 ΡΕ1542670 parte ou a totalidade dos ácidos gordos constituintes são triglicéridos não contendo ácido eicosapentaenóico ou contendo não mais do que 1% de ácido eicosapentaenóico.
10. 10. Composição que contém triglicéridos incluindo pelo menos 5 por cento molar de triglicéridos com ácidos gordos de cadeia média ligados nas posições 1,3 e ácido araquidónico ligado na posição 2, para utilização no tratamento de um ser humano adulto saudável para melhorar ou aumentar as respostas normais de aptidões cognitivas, ou no melhoramento, aumento ou prevenção do declínio das respostas normais de aptidões cognitivas num ser humano adulto.
11. 11. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que os ácidos gordos de cadeia média são seleccionados de ácidos gordos com 6 a 12 carbonos.
12. 12. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que os ácidos gordos de cadeia média são seleccionados de ácidos gordos com 8 carbonos.
13. 13. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 em que os referidos efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento das respostas normais de um ser humano adulto saudável são relativos à velocidade de processamento ou à velocidade de resposta em relação a eventos seleccionados de estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos olfactivos, 4 ΡΕ1542670 estímulos gustativos e estímulos somatossensoriais, como uma referida aptidão cognitiva.
14. 14. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 em que os referidos efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais de um ser humano adulto saudável são relativos à aptidão de concentração em relação a eventos seleccionados de estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos olfactivos, estímulos gustativos e estímulos somatossensoriais, como uma referida aptidão cognitiva.
15. 15. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 em que os referidos efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais são relativos ao nível de consciência de um ser humano adulto saudável, como uma referida aptidão cognitiva.
16. 16. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 em que os referidos efeitos de prevenção do declínio, melhoramento ou aumento de respostas normais são relativos à aptidão discriminatória de um ser humano adulto saudável em relação a eventos seleccionados de estímulos auditivos, estímulos visuais, estímulos olfactivos, estímulos gustativos e estímulos somatossensoriais, como uma referida aptidão cognitiva. 5 ΡΕ1542670
17. 17. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 que tem um efeito de encurtar a latência de P300 dos potenciais do cérebro relacionados com eventos (300) ou um efeito de aumentar a amplitude de P300 dos potenciais do cérebro (P300) relacionados com eventos, como um índice de resposta de aptidão cognitiva.
18. 18. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores que é uma composição alimentar ou uma composição farmacêutica.
19. 19. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 18 que é uma composição alimentar contendo ácido araquidónico e/ou um composto em que o ácido araquidónico é um ácido gordo constituinte, numa quantidade tal que a ingestão diária para um adulto é de 0,001-20 g em termos de ácido araquidónico.
20. 20. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 18 ou 19 que é uma composição alimentar que contém pelo menos 0,001% em peso de triglicéridos tendo ácidos gordos de cadeia média ligados às posições 1,3 e ácido araquidónico ligado à posição 2.
21. 21. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20 que é um alimento funcional, um suplemento alimentar nutricional, um alimento especial para cuidados de saúde ou um alimento geriátrico. 6 ΡΕ1542670
22. 22. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores que compreende ainda ácido docosa-hexaenóico e/ou um composto em que o ácido docosa-hexaenóico é um ácido gordo constituinte.
23. 23. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 22 em que o composto em que o ácido docosa-hexaenóico é um ácido gordo constituinte é um éster de álcool do ácido docosa-hexaenóico ou um triglicérido, fosfolipido ou glicolipido compreendendo ácido docosa-hexaenóico como parte ou a totalidade dos ácidos gordos constituintes.
24. 24. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 22 ou 23 em que a proporção de ácido araquidónico/ácido docosa-hexaenóico (em peso) na associação do ácido araquidónico e ácido docosa-hexaenóico está na gama de 0,1-15.
25. 25. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24 em que o ácido eicosapentaenóico também está presente na composição numa quantidade não superior a 1/5 do ácido araquidónico na composição. Lisboa, 5 de Julho de 2013