CN101153298B - 发酵生产低神经酸、epa含量的花生四烯酸油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产含低神经酸、低二十碳五烯酸(EPA)的花生四烯酸油脂的方法。本发明的方法选用深黄被孢霉为出发菌株，经菌种活化、摇瓶菌种制备、发酵，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。采用深黄被孢霉作为发酵生产菌种，油脂生产能力可以提高1-3倍，花生四烯酸产量可以提高1-3倍；发酵条件简单，发酵过程利于控制；可以获得高品质的花生四烯酸混合油脂；低神经酸、低二十碳五烯酸(EPA)。
Description
技术领域
本发明属于生物技术，具体涉及一种生产含低神经酸、低二十碳五烯酸(EPA)的花生四烯酸油脂的方法。
背景技术
花生四烯酸，英文为Arachidonic acid，简称AA，是5，8，11，14-二十碳四烯酸，它是一种人体必需脂肪酸，属于n-6系列的多不饱和脂肪酸，简记为20∶4(n-6)大量研究表明，人体缺乏多不饱和脂肪酸将引起机体功能失调，导致某些疾病，而补充多不饱和脂肪酸则可预防或治疗这些疾病，如婴儿缺乏花生四烯酸和DHA，可造成永久性智力低下和视力障碍，6-12岁儿童的皮肤瘙痒、眼角干燥、上课注意力不集中，数学成绩下降等症状与其血浆中花生四烯酸和DHA含量低有明显的正相关。同时研究表明，花生四烯酸对高血压、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防和治疗也有显著的效果。世界卫生组织和国际粮农组织针对人类花生四烯酸摄入量的不足，建议在婴儿配方奶粉中添加花生四烯酸，提高婴幼儿的健康水平。因此，花生四烯酸既是一种营养强化剂，同时也是人类重要的保健品。目前市场销售的花生四烯酸产品，主要从深海鱼油中提取，由于原料的限制，花生四烯酸含量低且很不稳定，而且产量低、成本高，无法进行规模化生产。近年来，马泰克生物科学有限公司在中国申请了一项专利，公开号：CN1175976A(名称：花生四烯酸及其生产和使用方法)，它采用高山被孢霉菌种，通过发酵法进行生产，但仍然存在菌种活性低、油脂产量低、花生四烯酸生产能力低等缺点。武汉烯王生物工程有限公司在中国申请了一项专利，公开号：CN1362522A(名称：用离子束生物工程诱变菌生产含花生四烯酸油脂的方法)，它采用经离子注入法诱变筛选的一株高山被孢霉菌种，通过发酵法进行生产，但因采用了离子注入法诱变菌进行生产，不为消费者所认同。而且目前所有公开的专利文献均未对所生产的花生四烯酸混合油脂中的神经酸的含量进行限制，而经研究表明神经酸对婴幼儿的发育具有不良影响，国外的消费群体已对花生四烯酸混合油脂中的神经酸含量提出了限量要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，该方法得到的产品具有花生四烯酸含量高，神经酸、二十碳五烯酸(EPA)含量低的特点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，其特征在于它包括如下步骤：
1)、菌种活化：
制备活化培养基：200g马铃薯，水1000ml，10-20g葡萄糖，17-20g琼脂，5-10g氮源；
所述的氮源包括但不限于酵母膏、酵母粉、花生粉、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、硝酸钾或硝酸钠；
将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，25-28℃，培养箱湿度40-50％，培养3-4天，得活化菌种，备用；
2)摇瓶菌种制备：
将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：18-20g/L葡萄糖，10-15g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.4-0.6VVM，摇床转速为100-250rpm，培养温度为20-30℃，振荡培养3-5天；从培养箱中取出后置于4-10℃条件下保持60-120min，得摇瓶菌种，备用；
3)发酵：
将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的8-20％，发酵培养基的最佳配方为：葡萄糖10-30g/L，酵母膏10-20g/L，硝酸钠1g/L；用1-5mol/L的酸(硫酸、草酸或柠檬酸等)或碱(氢氧化钠或氨水等)调节pH至5.5-7；通入洁净压缩空气，通气量为0.4-0.6VVM；转速100-200rpm，压力0.01-0.05Mpa，温度20-30℃，期间每隔24h补充10g/L的碳源，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养7-9天，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。
从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法包括：a、干法以抽真空加热脱水的方式烘干菌体，经粉碎后以有机溶剂萃取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)；b、湿法以湿的菌体直接破壁后有机溶剂萃取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)。
有机溶剂为正己烷或丁烷等。
所得产品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)中，包含至少约60％(质量)甘油三脂形式的花生四烯酸，EPA的含量不超过花生四烯酸含量的十五分之一，神经酸的含量不超过总油脂(产品)质量含量的3％。
采用上述技术方案，使得本发明与已有技术相比具有以下优点：
1、采用深黄被孢霉作为发酵生产菌种，油脂生产能力可以提高1-3倍，花生四烯酸产量可以提高1-3倍。
2、发酵条件简单，发酵过程利于控制。
3、可以获得高品质的花生四烯酸混合油脂。
4、低神经酸、低二十碳五烯酸(EPA)。
该方法所用得产品是人类，特别是婴幼儿群体的一种营养强化剂，是一种重要的保健品。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
本发明所提供的深黄被孢霉(Mortierella isabellina)，为一株经自然分离筛选得到的野生菌种，已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：3.3410；为市售产品。
实施例1(摇瓶发酵)：
1)、菌种活化：
制备活化培养基：活化培养基为以马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基为基础培养基，额外添加氮源，活化培养基的配方为：200g马铃薯，水1000ml，10g葡萄糖，17g琼脂，5g酵母膏；
具体为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10g葡萄糖、17g琼脂和5g酵母膏，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml(视试管大小而定)，15磅蒸气(121℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，25℃，培养箱湿度40％，培养4天，得活化菌种，备用；
2)摇瓶菌种制备：
将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.5VVM(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，摇床转速为160rpm，培养温度为27℃，振荡培养4天；从培养箱中取出后置于4℃条件下保持60min，得摇瓶菌种，备用；
3)摇瓶发酵：
将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的10％(v/v)，摇瓶装液量为20％(摇瓶菌种和发酵培养基占摇瓶体积的20％)；发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏15g/L，硝酸钠1g/L；用2mol/L硫酸调节pH为5.5；通入洁净压缩空气，通气量为0.5VVM；转速200rpm，压力0.02Mpa，温度25℃，期间每隔24h补充10g/L的碳源(葡萄糖)，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养7天，收获菌体，得到菌体量为29.3g/L，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。
从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法为：干法以抽真空加热脱水的方式烘干菌体，经粉碎后以有机溶剂正己烷萃取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)。
成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)的油脂含量为38.7％，气相色谱检测花生四烯酸含量为57.2％，EPA含量为花生四烯酸含量的2.3％，神经酸含量为2.4％，花生四烯酸产量为6.48g/L。其中油脂中的组成成分见表1。
表1：实施例1油脂组成成分
| 脂肪酸名称 | 在油脂中的含量(％) |
| 豆蔻酸(14:0) | 0.4 |
| 棕榈酸(16:0) | 5.4 |
| 硬脂酸(18:0) | 6.8 |
| 脂肪酸名称 | 在油脂中的含量(％) |
| 油酸(18:1) | 5.7 |
| 亚油酸(18:2) | 7.6 |
| r-亚麻酸(18:3n6) | 5.5 |
| 二十烷酸(20:0) | 0.6 |
| 二十碳一烯酸(20:1) | 0.8 |
| 二十碳二烯酸(20:2) | 1.5 |
| 二高r-亚麻酸(20:3n6) | 2.4 |
| 花生四烯酸(20:4n6) | 57.2 |
| EPA | 1.3 |
| 神经酸(24:1) | 2.4 |
| 其他脂肪酸 | 2.4 |
实施例2(10L罐发酵)：
1)、菌种活化：
制备活化培养基：活化培养基为以马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基为基础培养基，额外添加氮源，活化培养基的配方为：200g马铃薯，水1000ml，15g葡萄糖，18g琼脂，7g酵母粉；
具体为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加15g葡萄糖、18g琼脂和7g酵母粉，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml(视试管大小而定)，15磅蒸气(121℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，28℃，培养箱湿度40％，培养4天，得活化菌种，备用；
2)摇瓶菌种制备：
将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：18g/L葡萄糖，10g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.4VVM(每分钟相对于单位发酵体积的通气量)，摇床转速为160rpm，培养温度为25℃，振荡培养4天；从培养箱中取出后置于4℃条件下保持60min，得摇瓶菌种，备用；
3)10L发酵罐发酵：
将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的10％，发酵罐装液量为50％(摇瓶菌种和发酵培养基占发酵罐体积的50％)；发酵培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，硝酸钠1g/L；用2mol/L硫酸调节pH为5.5；通入洁净压缩空气，通气量为0.4VVM；转速100rpm，压力0.03Mpa，温度25℃，期间每隔24h补充10g/L的葡萄糖，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养7天，收获菌体，得到菌体量为32.4g/L，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。
从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法为：干法以抽真空加热脱水的方式烘干菌体，经粉碎后以有机溶剂正己烷萃取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)。
成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)的油脂含量为48.0％，气相色谱检测花生四烯酸含量为56.3％，EPA含量为花生四烯酸含量的2.7％，神经酸含量为1.9％，花生四烯酸产量为8.76g/L。其中油脂中的组成成分见表2。
表2：实施例2油脂组成成分
| 脂肪酸名称 | 在油脂中的含量(％) |
| 豆蔻酸(14:0) | 0.4 |
| 棕榈酸(16:0) | 5.5 |
| 硬脂酸(18:0) | 6.8 |
| 油酸(18:1) | 6.3 |
| 亚油酸(18:2) | 7.8 |
| r-亚麻酸(18:3n6) | 5.5 |
| 二十烷酸(20:0) | 0.6 |
| 二十碳一烯酸(20:1) | 0.8 |
| 二十碳二烯酸(20:2) | 1.5 |
| 二高r-亚麻酸(20:3n6) | 2.4 |
| 花生四烯酸(20:4n6) | 56.3 |
| EPA | 1.5 |
| 脂肪酸名称 | 在油脂中的含量(％) |
| 神经酸(24:1) | 1.9 |
| 其他脂肪酸 | 2.7 |
实施例3(50L罐发酵)：
1)、菌种活化：
制备活化培养基：活化培养基为以马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基为基础培养基，额外添加氮源，活化培养基的配方为：200g马铃薯，水1000ml，20g葡萄糖，20g琼脂，10g花生粉；
具体为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖、20g琼脂和10g花生粉，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml(视试管大小而定)，15磅蒸气(121℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，25℃，培养箱湿度50％，培养4天，得活化菌种，备用；
2)摇瓶菌种制备：
将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：20g/L葡萄糖，15g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.6VVM，摇床转速为200rpm，培养温度为28℃，振荡培养4天；从培养箱中取出后置于4℃条件下保持120min，得摇瓶菌种，备用；
3)50L发酵罐发酵：
将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的8-20％，发酵罐装液量为50％(摇瓶菌种和发酵培养基占发酵罐体积的50％)；发酵培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏13g/L，硝酸钠1g/L；用2mol/L柠檬酸调节pH为5.5；通入洁净压缩空气，通气量为0.4VVM；转速100rpm，压力0.03Mpa，温度25℃，期间每隔24h补充10g/L的葡萄糖，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养8天，收获菌体，得到菌体量为34.1g/L，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。
从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法为：湿法以湿的菌体直接破壁后有机溶剂丁烷萃取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)。
成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)的油脂含量为52.3％，气相色谱检测花生四烯酸含量为60.4％，EPA含量为花生四烯酸含量的2.3％，神经酸含量为1.7％，花生四烯酸产量为10.77g/L。其中油脂中的组成成分见表3。
表3：实施例3油脂组成成分
| 脂肪酸名称 | 在油脂中的含量(％) |
| 豆蔻酸(14:0) | 0.4 |
| 棕榈酸(16:0) | 5.5 |
| 硬脂酸(18:0) | 5.8 |
| 油酸(18:1) | 6.3 |
| 亚油酸(18:2) | 6.1 |
| r-亚麻酸(18:3n6) | 5.0 |
| 二十烷酸(20:0) | 0.6 |
| 二十碳一烯酸(20:1) | 0.8 |
| 二十碳二烯酸(20:2) | 1.5 |
| 二高r-亚麻酸(20:3n6) | 2.4 |
| 花生四烯酸(20:4n6) | 60.4 |
| EPA | 1.4 |
| 神经酸(24:1) | 1.7 |
| 其他脂肪酸 | 2.1 |
实施例4：
发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，它包括如下步骤：
1)、菌种活化：
制备活化培养基：200g马铃薯，水1000ml，10g葡萄糖，17g琼脂，5g牛肉膏；
将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，25℃，培养箱湿度40％，培养3天，得活化菌种，备用；
2)摇瓶菌种制备：
将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：18g/L葡萄糖，10g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.4VVM，摇床转速为100rpm，培养温度为20℃，振荡培养3天；从培养箱中取出后置于4℃条件下保持60min，得摇瓶菌种，备用；
3)发酵：
将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的8％，发酵培养基配方为：果糖10g/L，牛肉膏10g/L；用1-5mol/L的酸(硫酸、草酸或柠檬酸等)或碱(氢氧化钠或氨水等)调节pH至6；通入洁净压缩空气，通气量为0.4VVM；转速100rpm，压力0.01Mpa，温度20℃，期间每隔24h补充10g/L的果糖，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养7天，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。
从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法包括：干法以抽真空加热脱水的方式烘干菌体，经粉碎后以有机溶剂正己烷萃取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)。
实施例5：
发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，它包括如下步骤：
1)、菌种活化：
制备活化培养基：200g马铃薯，水1000ml，20g葡萄糖，20g琼脂，10g蛋白胨；
将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，28℃，培养箱湿度50％，培养4天，得活化菌种，备用；
2)摇瓶菌种制备：
将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：20g/L葡萄糖，15g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.6VVM，摇床转速为250rpm，培养温度为30℃，振荡培养5天；从培养箱中取出后置于10℃条件下保持120min，得摇瓶菌种，备用；
3)发酵：
将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的20％，发酵培养基配方为：乳糖30g/L，硝酸钠21g/L；用1-5mol/L的酸(硫酸、草酸或柠檬酸等)或碱(氢氧化钠或氨水等)调节pH至7；通入洁净压缩空气，通气量为0.6VVM；转速200rpm，压力0.05Mpa，温度30℃，期间每隔24h补充10g/L的乳糖，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养9天，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。
从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法包括：湿法以湿的菌体直接破壁后有机溶剂丁烷萃取制得毛油，并经精炼后制得成品(低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂)。
Claims (2)
1.发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，其特征在于它包括如下步骤：
1)、菌种活化：
制备活化培养基：200g马铃薯，水1000ml，10-20g葡萄糖，17-20g琼脂，5-10g氮源；
所述的氮源为酵母膏、酵母粉、花生粉、牛肉膏、蛋白胨、鱼粉、硝酸钾或硝酸钠；
将深黄被孢霉(Mortierella isabellina)在活化培养基斜面进行菌种活化培养，25-28℃，培养箱湿度40-50％，培养3-4天，得活化菌种，备用；
2)摇瓶菌种制备：
将活化培养基上的活化菌种用无菌水振荡洗脱后接入种子培养基摇瓶中，种子培养基摇瓶中有摇瓶培养基；摇瓶培养基配方为：18-20g/L葡萄糖，10-15g/L酵母膏；通入压缩空气，通气量为0.4-0.6VVM，摇床转速为100-250rpm，培养温度为20-30℃，振荡培养3-5天；从培养箱中取出后置于4-10℃条件下保持60-120min，得摇瓶菌种，备用；
3)发酵：
将制得的摇瓶菌种接种于有发酵培养基的摇瓶或发酵罐中进行发酵培养，接种量为摇瓶菌种所占发酵培养基体积的8-20％，发酵培养基的配方为：葡萄糖10-30g/L，酵母膏10-20g/L，硝酸钠1g/L；用1-5mol/L的酸或碱调节pH至5.5-7；通入洁净压缩空气，通气量为0.4-0.6VVM；转速100-200rpm，压力0.01-0.05Mpa，温度20-30℃，期间每隔24h补充10g/L的碳源，每48h补充1g/L的硝酸钠，发酵培养7-9天，收获菌体，从菌体中回收提取低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂；
从菌体中回收提取目低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法为下述二种之一：a、干法以抽真空加热脱水的方式烘干菌体，经粉碎后以有机溶剂萃取制得毛油，并经精炼后制得低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂；b、湿法以湿的菌体直接破壁后有机溶剂萃取制得毛油，并经精炼后制得低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂。
2.根据权利要求1所述的发酵生产低神经酸、EPA含量的花生四烯酸油脂的方法，其特征在于：有机溶剂为正己烷或丁烷。
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| JP6199580B2 (ja) * | 2013-03-04 | 2017-09-20 | ミヨシ油脂株式会社 | ネルボン酸を含む油脂組成物の製造方法、及びネルボン酸生産微生物をスクリーニングする方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1175976A (zh) * | 1995-01-03 | 1998-03-11 | 马泰克生物科学有限公司 | 花生四烯酸及其生产和使用方法 |
| CN1323904A (zh) * | 2000-05-12 | 2001-11-28 | 华中科技大学 | 花生四烯酸发酵制配方法 |
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2007
- 2007-09-07 CN CN2007100531640A patent/CN101153298B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
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| CN1175976A (zh) * | 1995-01-03 | 1998-03-11 | 马泰克生物科学有限公司 | 花生四烯酸及其生产和使用方法 |
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| 王啸，邱树毅.微生物发酵生产花生四烯酸的研究进展.中国油脂29 9.2004,29(9),37-40. |
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| 王啸等.花生四烯酸生产菌的选育.贵州工业大学学报(自然科学版)34 1.2005,34(1),56-57. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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