FI113861B

FI113861B - Parannettu menetelmä 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]-isokinoliini-5,10-dionin ja sen dimaleaattisuolan syntetisoimiseksi

Info

Publication number: FI113861B
Application number: FI963864A
Authority: FI
Inventors: Silvano Spinelli; Roberto Didomenico
Original assignee: Novuspharma Spa
Priority date: 1994-03-28
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2004-06-30
Also published as: CZ276796A3; JP3151462B2; HU223311B1; CN1130199C; MX9603994A; AU679627B2; CA2186485C; CZ285139B6; US5506232A; CN1282738A; PT752857E; HUT75654A; AU1958995A; CZ598A3; ES2159313T3; DK0752857T3; CA2186485A1; WO1995026189A1; NO307564B1; EP0752857A1

Description

113861

Parannettu menetelmä 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]-isokinoliini-5,10-dionin ja sen dimaleaattisuolan syntetisoi-miseksi - Förbättrad metod för syntetisering av 6,9-bis[(2-aminoetyl)amino]benso[g]isokinolin-5,10-dion och dess dima-5 leatsalt

Tausta

Keksinnön ala 10 Mitoksantroni (Mitox), kasvaimia vastustava 1,4-bis(aminoal-kyyliamino)antraseeni-9,10-dioni on tällä hetkellä saavuttamassa tärkeän sijan verisyöpien ja imukudoskasvaimien kliinisessä käsittelyssä samoin kuin pitkälle edenneiden rinta- ja munasarjasyöpien yhdistelmähoidossa. Vaikka Mitox-valmisteel-15 la on parantunut siedettävyysprofiili verrattuna doksorubi- siiniin (DX) ja muihin antrasykliineihin, tämä lääke ei ole vailla merkittäviä myrkyllisiä sivuvaikutuksia, erityisesti niitä, jotka liittyvät luuytimen kasvun pysähtymiseen ja sy-dänmyrkyllisyyteen. Erityisesti verentungoksen aiheuttama 20 sydänkohtaus on vakava kliininen huolenaihe potilailla, joita on aikaisemmin hoidettu antrasykliineillä (mitoksantronin ·· terapeuttisen ja toksikologisen profiilin tuoreen katsauksen . suhteen katso: Faulds, D.; Balfour, J.A.; Chrisp, P.; Langt- ry, H.D. "Mitoxantrone, a Review of its Pharmacodynamic and .! ’25 Pharmacokinetic Properties, and Therapeutic Potential in the • 1 ' ; Chemotherapy of Cancer", Drugs 1991, 41, 400 - 449).

1 · ’ Mitox-valmisteen solujen tuhoamismekanismit ovat luonteeltaan todennäköisesti monimuotoisia: monet tutkimukset antavat ole-30 ttaa tunkeutumista DNA-rakenteeseen pääasiallisena solutapah- tumana. Nukleiinihapon tiivistymistä ja DNA-topoisomeraasi : II-aktiivisuuden häirintää, jotka johtavat proteiiniin liit- : tyvän DNA-säikeen murtumiin, on myös ehdotettu kriittisiksi tapahtumiksi, jotka johtavat Mitox-valmisteen aiheuttamaan ’;135 solukuolemaan. Kasvaimia vastustavien antraseeni-9,10-dioni- '···' en, Mitox mukaanluettuna aiheuttama solujen tuhoutuminen on 2 113861 luettu myös hapettavan aineenvaihdunnan syyksi, joka johtaa vapaiden radikaalien muodostumisesen, jotka kykenevät DNA:n alkylointiin ja/tai DNA:n pilkkoutumiseen, mikä johtaa proteiiniin liittymättömän DNA-säikeen murtumisiin. Yleisesti ar-5 vellaan kuitenkin, että kinoniryhmityksen redoksikierto on todennäköisesti verrannollisempi Mitox-valmisteen sydänmyr-kyllisiin sivuvaikutuksiin kuin sen kasvaimia vastustavan aktiivisuuden mekanismiin. Mitox- ja DX-valmisteiden sydän-myrkyllisyys on yhdistetty myös viereisten hydroksyyli- ja 10 kinoniryhmien metallinkelatointikykyyn. Lääke-metallikom- pleksien muodostuminen saattaisi parantaa hapettumis-pelkis-tymiskiertoa metallikatalysoidun tyyppisellä reaktiolla (Shipp, N.G.; Dorr, R.T.; Alberts, D.S.; Dawson, B.V.; Hendrix, M. "Characterization of experimental mitoxantrone car-15 diotoxicity and its partial inhibition by ICRF-187 in cultured neonatal rat heart cells", Canner Res. 1993, 53, 550 -556) .

Mitox-valmisteen merkittävä kliininen aktiivisuus tekee toi- 20 sen sukupolven antraseenidionisukuisista aineista houkuttele- van tutkimusalueen. Tähän asti paljon tutkimusta on omistettu sivuketjujen luonteen vaihteluiden selvittämiseen ja hydrok- . . sisubstituenttien ja/tai samanpuoleisten sivuketjujen uudel- • · * leensi joittamiseen.

: 25 : ; Heteroatomien liittäminen antrakinonikromoforiin on suhteel- *·:·· lisen tutkimaton lähestymistapa, mutta tällainen muutos saa- v ttaisi vaikuttaa merkittävästi molekyylien vuorovaikutukseen biologisten maalien kanssa. Erityisesti antrakinonien hetero-30 sykliset analogit a) säilyttäisivät periaatteessa samat avaruudelliset ja tasomaiset ominaispiirteensä kuin lähtölääk-; ;'· keet mitä tulee isäntäeläimen molekyylien tunnistamiseen, .*·.· kuten tunkeutumiseen DNA-rakenteeseen ja b) saattaisivat tuo da mukanaan lisää vetysidoksia tai peruskohtia, joista kumpi | * '35 tahansa voisi lisätä lääkkeen yhtymistaipumusta DNA-rakentee-seen ja/tai vaikuttaa vuorovaikutukseen topoisomeraasi II:n 3 113861 kanssa. Lisäksi heteroanalogeilla saattaisi olla muuttuneet redoksiominaisuudet.

Lukuisia atsa-analogeja on valmistettu ja seulottu (Krapcho, 5 A.P., "6,9-bis(substituoitu amino)bentso[g]isoquinoline-5,10- diones". PCT Intl. Appi. WO 92/15300, 17. syyskuuta 1992 (liitetään viitteenä tähän esitykseen); A.P. Krapcho et ai.: "6,9-bis[(2-aminoalkyl)aminobenzo[g]isoquinoline-5,10-diones.

A novel class of chromophore-modified antitumor anthracene-10 9,10-diones: synthesis and antitumor evaluation'·; J. Med.

Chem. (1994), painossa (liitetään viitteenä tähän esitykseen) .

Näistä yhdisteistä 6,9-bis[(2-amionoetyyli)amino]bent-15 so[g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaattisuola nousi esiin aktiivisimpana kasvaimia vastustavissa koemalleissa.

6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dio-nin dimaleaattisuolalta puuttuu sitä paitsi minkäänlainen 20 merkittävä myrkyllinen vaikutus sydänkudokseen sekä yksittäi sen että moninkertaisen käsittelyn jälkeen rotalla ja hiirellä samassa järjestyksessä. Yksittäisen käsittelyn jälkeen • · · 1 . .· rotalla käyttäen annoksia, jotka olivat suunnilleen yhtä suu- t « * ria kuin LD10 ja LDS0 6,9-bis[ (2-aminoetyyli)amino]bent-/ ‘ 25 so[g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaattisuolayhdiste aiheut-* ; ti vähemmän punasoluniukkuutta ja verihiutaleniukkuutta kuin

Mitox-valmiste. Tämä suotuisa profiili vahvistettiin hiirissä v toistettujen käsittelyjen jälkeen verrattuna mitoksantroniin samanaktiivisilla annoksilla hiiren verisyöpämallien suhteen.

30

Valitettavasti tämän yhdisteen kemiallisessa kehittämisessä : / kohdattiin odottamattomia ongelmia johtuen yhdisteen puhtau- ,;· den alhaisesta tasosta (puhtaus vain 96 %). Yhdisteen ana- ; lyyttinen kehittäminen paljasti sitäpaitsi tuntemattomien t · '•‘35 epäpuhtauksien läsnäolon, joita muodostuu valmistusprosessin I · * viimeisessä vaiheessa ja joita ei kyetä poistamaan yhdistees- I »

I I

4 113861 tä millään nykyään käytettävissä olevalla puhdistusmenetelmällä. Koska tuntemattomien epäpuhtauksien osuus on yli 2 % ja pelkästään yhden näistä tuntemattomista epäpuhtauksista osuus on 1,3 %, yhdisteen kehittäminen vaarantuu vakavasti, 5 sillä valvontaviranomaiset vaativat laajoja tutkimuksia tuntemattomista epoäpuhtauksista, mikäli näitä viimemainittuja on läsnä tällainen merkittävä määrä.

Keksinnön yhteenveto 10 Tämän hakemuksen tekijät ovat löytäneet uusia parannettuja menetelmiä 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinolii-ni-5,10-dionin ja sen maleaattisuolan syntetisoimiseksi. Tämän keksinnön uusilla parannetuilla synteesimenetelmillä tämä yhdiste voidaan saada yli 99 %:n puhtaudella.

15

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio 1: HPLC-analyysi, joka tekee selkoa tämän keksinnön yhdisteen, piikki 6 ja tunnistettujen epäpuhtauksien seoksesta.

20

Kuvio 2: HPLC-analyysi tämän keksinnön yhdisteen varsinaisesta näytteestä, joka on tehty bis-maleaatin aikaisemman tek-. ,· niikan J. Med. Chem. tai WO 92/15300 mukaisella menetelmällä.

Pitkien retentioaikojen piikit 7, 8 ja 9 ovat tuntemattomia ! 25 epäpuhtauksia.

• » » ’ ·· Kuvio 3: HPLC-analyysi tämän keksinnön yhdisteestä, joka on « ‘ valmistettu tämän keksinnön prosessin A mukaisesti.

30 Kuvio 4: HPLC-analyysi tämän keksinnön yhdisteestä, joka on valmistettu tämän keksinnön prosessin B mukaisesti.

> * * Tämän keksinnön yhdisteen synteesi Tämän keksinnön yhdistettä, 6,9-bis[(2-aminoetyyli)a- | » *’35 mino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionia tai sen dimaleaat- tisuolaa valmistetaan kahdella parannetulla menetelmällä, t · * · » * · 5 113861 jotka johtavat yhdisteen tuotantoon hyvin suurella puhtaudella.

6,9-bis[(2-aminoetyy1i)amino]bentso[g]isokinoli ini-5,10-dioni 5 ei vapaana emäksenä ole stabiili, koska se syklisoituu erittäin nopeasti liuoksessa, mikä johtaa yhdisteisiin la ja Ib, jotka HPLC-analyysissä muodostavat kaksi eri piikkiä, jotka johtuvat jommasta kummasta yhdisteestä (vrt. kuvio 1).

10 O NH^ O NH2

1a:X-N;Y.C 2a:$’!^=S

1b: X= C; Y= N 2b: X= C, Y= N

0 nh^/\NH2 o nh^NH2 15

Lisäksi vapaa emäs on erittäin liukoinen veteen; tämän vuoksi sitä tuskin voidaan uuttaa orgaanisilla liottimilla ja sitä on erittäin vaikea käsitellä ja puhdistaa.

20

Sitäpaitsi 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinolii-.*. ni-5,10-dionin muut suolat, kuten dihydrokloridisuola hajoa- . · vat seistessään, koska ne ovat luontaisesti liian happamia.

I i

Itse asiassa 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bent-25 so[g]isokinoliini-5,10-dioni-yhdiste hajoaa happamilla pH-: ; arvoilla (alle 2,5) muodostaen yhdisteitä 2a ja 2b, joista yksi sivuketjuon hävinnyt. Yhdisteitä 2a ja 2b ei kyetä erottamaan toisistaan HPLC-analyysissä ja ne modostavat yhden ainoan piikin (vrt. kuvio l). Kaikkia edellä selostettuja 30 hajoamistuotteita on läsnä epäpuhtauksina 6,9-bis[(2-aminoe-tyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionissa (vrt. kuvion ·, ;* 2 piikit 3, 4 ja 5). Sitävastoin dimaleaattisuolalla on erin- * » · , omainen luontainen stabiilisuus.

’·’ 35 Aikaisemman tekniikan menetelmiä, joissa tehdään selkoa 6,9-bis[ (2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin ja • » i » 6 113861 sen dimaleattisuolan synteesistä, selostetaan seuraavissa lähteissä: 1) WO 92/15300 ja 2) A.P. Krapcho et ai., "6,9-bis[(2-aminoa-5 lkyl)amino]benzo[g]isoquinoline-5,10-diones. A novel class of chromophore-modified antitumor anthracene-9,10-diones: synthesis and antitumor evaluations", J. Med. Chem. (1994), painossa .

10 Selostetuissa synteesimenettelyissä käytetään avainvälituot- teena 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionia. Tämän yhdisteen annetaan reagoida etyleenidiamiinin kanssa, mikä tuottaa haluttua 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino)bent-so[g]isokinoliini-5,10-dionia.

15

Toinen selostettu menetelmä käsittää 6,9-difluoribent-so[g]isokinoliini-5,10-dionin reaktion mono-t-butoksikar-bonyylietyleenidiamiinin (BOC-etyleenidiamiini) kanssa ja sen jälkeen suojaavan BOC-ryhmän poiston kuivalla HCl:lla, mikä 20 johtaa 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini- 5.10- dionin dihydrokloridisuolaan. HCl-suolan konvertointi stabiiliksi dimaleaattisuolaksi ei ole mahdollista, koska HC1 ei vaihdu vähemmän happaman maleiinihapon kanssa. Sitäpaitsi, kun HCl-suola on kerran liuotettu veteen, se hajoaa.

:.25

Sitäpaitsi aikaisemman tekniikan synteettiset menetelmät l) eivät johda 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinolii-ni-5,10-dionin tai sen dimaleaattisuolan valmistukseen enempää kuin 96,1 %:n puhtaudella ja 2) niillä ei vältetä tunnis-30 tamattomien epäpuhtauksien läsnäoloa, joita muodostuu proses sin viimeisen vaiheen aikana. Kuviossa 2 tehdään selkoa sellaisen 6,9-bis[(2-aminetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini- 5.10- dionin dimaleaattisuolan tyypillisen erän HPLC-analyy-sistä, joka on valmistettu aikaisemman tekniikan menettelyl- '35 lä: läsnä on kolme tuntematonta epäpuhtautta (vrt. piikit 7, .· 8 ja 9), joita on yli 2 % ja joista yksi (ts. piikki 8) muo- 7 113861 dostaa noin 1,3 %. Yhdisteen puhtautta ei kyetty parantamaan eikä tuntemattomien epäpuhtauksien läsnäoloa voitu välttää: - toistetulla suspendoinnilla tai kiteytyksillä eri liuottimissa tai liuottimien seoksissa, sillä tunte- 5 mattomien epäpuhtauksien määrä pysyy vakiona, - pylväskromotografisesti - tai suorittamalla synteesimenettelyn viimeinen vaihe eri liuottimissa ja eri lämpötiloissa.

10 Sitäpaitsi aikaisemman tekniikan menetelmien mukaisesti viimeisen vaiheen puhdistuksen aikana saadaan yhdisteen saostuminen dimaleaattisuolana epäpuhtaan dihydrofluoridin suspension läsnäollessa. Täydellistä liuosta ei koskaan saavuteta. Prosessin mittakaavaa suurennettaessa tämä suspensio saattai-15 si johtaa epähomogeeniseen tuotteeseen, joka saattaisi vangita muita suoloja ja/tai sisältää epämieluisia materiaaleja (ts. liukenemattomia materiaaleja, epäpuhtauksia). Lopullisen tuotteen täydellinen liukeneminen ainakin kerran viimeisen vaiheen aikana on tärkeä edellytys kemiallisen yhdisteen saa-20 miselle, joka on tarkoitettu käytettäväksi nisäkkäiden hoidossa .

Nämä epäkohdat, jotka ovat tyypillisiä aikaisemman tekniikan synteesimenettelyille, muodostavat vakavan esteen tämän kek-“.25 sinnön yhdisteen valmistukselle ja kehitykselle. Valvontaviranomaiset eivät tavallisesti salli sellaisten lääkkeiden käyttöönottoa ihmisten hoitoon, joiden aktiivisen pääaineosan puhtaus on vain 96 %, varsinkaan jos läsnä on tuntemattomia epäpuhtauksia, jotka muodostavat siitä yli 2 %. On erittäin 30 edullista välttää minkään epäpuhtauden yli 0,5 %:n määrien läsnäoloa.

.·. Nyt on yllättäen aikaansaatu uusia menetelmiä, jotka tekevät ·· mahdolliseksi saada 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bent- ‘.35 so[g]isokinoliini-5,10-dionia ja sen dimaleaattisuolaa yli 97 %:n ja edullisesti yli 99 %:n puhtaudella kaikkien läsnä ole- δ 113861 vien epäpuhtauksien määrien ollessa alle 0,5 % ja jokaisen tuntemattoman epäpuhtauden määrän ollessa alle 0,2 %, ts. analyyttisen menetelmän toteamisrajalla.

5 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dio- nin ja sen dimaleaattisuolan muodostaminen voidaan toteuttaa käyttäen jompaa kumpaa seuraavista menetelmistä:

Menetelmä A: Sisältää seuraavat uudet tunnuspiirteet: 10 - 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionin rea ktio etyleenidiamiinin kanssa suoritetaan käänteis-lisäykselläi· ts. lisäämällä hitaasti kiinteä 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dioni liuokseen, jossa on suuri ylimäärä diamiinia THF:ssa.

15 - reaktioseoksesta saatu epäpuhdas 6,9-bis[(2-amino- etyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dihy-drofluoridi liuotetaan täysin veteen ja etikkahap-poon pH-arvolla 5; liuos suodatetaan sitten ja edellä mainitusta liuoksesta kiteytetään dimaleaat-20 tisuola lisäämällä maleiinihapon vesiliuosta.

Käänteislisäys ja itse lisäyksen nopeus ovat kriinttisiä :· tuotteen suuren puhtauden suhteen ja ne tekevät mahdolliseksi , ·. saada erittäin suuria saantoja (92 %). Hyvin tärkeä on myös .25 liuottimen valinta: THF:n käyttö pyridiinin sijasta parantaa , ! saantoa. Epäpuhtaan dihydrofluoridin liuottaminen on tärkeää ; lopullisen tuotteen suuren puhtauden ja homogeenisuuden kan- naita. Sitäpaitsi pH-arvo, jossa liuottaminen suoritetaan, on kriittinen, jotta vältetään muiden epämieluisten epäpuhtauk-30 sien muodostuminen. Täydellinen menettely kuvataan jäljempänä esimerkissä 1.

·,*: Menetelmä B: Sisältää seuraavat uudet tunnuspiirteet: - 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dioniväli-;35 tuotteen annetaan reagoida mono-BOC-etyleenidiamii- nin kanssa ja saatua 6,9-bis[2-[[N(t-butoksikar- • • · 9 113861 bonyy1i)amino]etyyli]amino]bentso[g]isokinoli ini- 5,10-dionivälituotetta käsitellään trifluorietikka-hapolla, mikä johtaa epäpuhtaaseen 6,9-bis[(2-ami-noetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin 5 trifluoriasetaattisuolaan, joka liuotetaan sitten täysin veteen, pH säädetään arvoon 4,2 NaOH:lla ja suodatetaan; - edellä mainittua epäpuhtaan trifluoriasetaat-tisuolan liuosta käsitellään maleiinihapon vesili-10 uoksella, mikä johtaa puhtaan 6,9-bis[(2-amioetyy- li)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dimale-aattisuolan kiteytymiseen. Täydellinen menettely esitetään jäljempänä esimerkissä 4.

15 Nyt on yllättäen keksitty, että haluttua 6,9-bis[(2-aminoety-yli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaattia voidaan saada syrjäyttämällä vastaava epäpuhdas trifluoriasetaa-tti, joka voidaan saada poistamalla suojaavat BOC-ryhmät trifluorietikkahapolla.

20

Avainväliaineena olevan 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini- 5,10-dionin valmistus voidaan suorittaa monivaiheisella pa-rannetulla menettelyllä. Parannukset on otettu käyttöön saan-, tojen parantamiseksi ja jotta olisi mahdollista suurentaa •25 menetelmän mittakaavaa, mikä on välttämätöntä 6,9-bis[(2-ami-, ! noetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin farmaseutti- ’ ; selle kehittämiselle.

1,4-difluoribentseenin reaktio pyridiini-3,4-dikarboksyyli- 30 happoanhydridin kanssa alumiinikloridin läsnäollessa, joka johtaa 4-(2/,5'-difluoribentsoyyli)nikotiinihapon ja 3-(2/- ,S'-difluoribentsoyyli)isonikotiinihapon seokseen, suorite- ;*· taan kuvatulla tavalla sillä muutoksella, että reaktioseos ;· laimennetaan nitrobentseenillä ylimääräisen 1,4-difluoribent- ;35 seenin talteenoton jälkeen ja kaadetaan sitten hitaasti ve-» teen. Aikaisemman tekniikan menettely vaati veden lisäämistä I I · 10 113861 koko puolikiinteään reaktioseokseen ylimääräisen 1,4-dif-luoribentseenin talteenoton jälkeen: tämä menettely on erittäin riskialtis eikä sovellu toistettavaksi suuressa mittakaavassa johtuen alumiinikloridin ja veden välisestä erittäin 5 eksotermisestä reaktiosta. Uusi puhdistusmenetelmä tekee mahdolliseksi lisätä hitaasti jäljelle jääneiden alumiinikom-pleksien ja ylimääräisen kloridin liuos suureen ylimäärään vettä.

10 Tuloksena oleva 4-(2',5'-difluoribentsoyyli)nikotiinihapon ja 3- (2',5'-difluoribentsoyyli)isonikotiinihapon seos saatetaan sitten syklisointireaktioon 20 %:sessa savuavassa rikkihapossa sillä parannuksella, että jatkettu 20 %:sen savuavan rikkihapon annosmainen lisääminen tekee mahdolliseksi parantaa 15 saannot jopa 81 %:iin.

Valmistusesimerkki 1: 3,4-pyridiinidikarboksyylihappoanhydri-din valmistus

Typpiatmosfäärissä suspensio, jossa oli 97 %:sesti puhdasta 20 3,4-pyridiinidikarboksyylihappoa (152 g, 0,88 mol) etikkahap- poanhydridissä (450 ml), kuumennettiin refluksoivaksi ja saatiin täydellinen liuos. Kun refluksointi lämpötila saavutet-<j tiin, liuotin poistettiin tislaamalla ilmakehän paineessa , ,· (noin 400 ml kerättiin talteen) noin 1 tunnin aikana. Höyrykö jen lämpötilan havaittiin kohoavan noin 132 °C:sta 140 °C:s- . een ja tislaus lopetettiin, kun sisäinen lämpötila saavutti ’ ; 150 - 155 °C. Reaktioseos jäähdytettiin 70 °C:seen ja tert.-

BuOMe:a (450 ml) lisättiin tipoittain samalla sekoittaen.

Tumman harmaata kiinteää ainetta saostui noin 40 0C:ssa sa-30 maila, kun lämpötilan annettiin itsestään saavuttaa 20 - 25 -°C. Suspensio jäähdytettiin edelleen 0-5 °C:seen ja sitä sekoitettiin kaksi tuntia. Typpisuojakaasussa tumman harmaa sakka kerättiin talteen suodattamalla, pestiin tert.-BuOMe:-I* 11a (100 ml) ja kuivattiin alipaineessa (2,66 kPa; 30 °C; 2 ;35 h), jolloin saatiin 3,4-pyridiinidikarboksyylihappoanhydridiä ' (100 g; saanto 76 %), jota käytettiin suoraan seuraavassa * » 11 113861 vaiheessa.

3.4- pyridiinidikarboksyylihappoanhydridi on erittäin herkkä ilmakehän kosteudelle, joten sitä on käsiteltävä typen alais- 5 ena ja säilytettävä P205:n yläpuolella. Sulamispiste 72 - 74-°C.

Valmistusesimerkki 2: 4-(2/,5'-difluoribentsoyyli)niko-tiinihappo ja 3-(2#,5,-difluoribentsoyyli)isonikotiinihappo 10 3,4-pyridiinidikarboksyylihappoanhydridiä (95,7 g, 0,67 mol) ja AlCl3:a (367,3 g, 2,67 mol) lisättiin samanaikaisesti, mutta erikseen viidessä erässä (joka 15. minuutti) kiehuvaan 1.4- difluoribentseeniin (650 ml, 90 °C). Noin 1 tunnin kuluttua viimeisestä lisäyksestä pääosa 1,4-difluoribentseenistä 15 poistettiin tislaamalla normaalipaineessa, kunnes saatiin paksu massa. Lämpötila laskettiin 80 °C:seen ja nitrobent-seeniä (150 ml) lisättiin jäännösmassan liuottamiseksi. Tuloksena olevan liuoksen ollessa vielä kuuma se sammutettiin jäillä jäähdytettyyn ja sekoitettuun veteen (1000 g jäätä ja 20 530 g mineraalitonta vettä) (ts. liuosta tiputettiin hitaasti jääveteen). Tämän jälkeen lisättiin väkevää HCl:a (37 %, 160 ml) kaadettuun seokseen 0-5 °C:ssa ja sekoitusta jatkettiin : noin 3 tuntia. Rasvainen beigen värinen sakka (noin 150 g 4 I t . ,· märkänä) kerättiin talteen suodattamalla samalla, kun vesi- •25 kerros erotettiin nitrobentseenistä ja uutettiin AcOEt:lla (6 , ! x 500 ml). Nitrobentseenikerros laimennettiin petrolieette- • ; rillä (400 ml) ja saatu pieni määrä sakkaa kerättiin talteen ’· suodattamalla (noin 2 g). Yhdistetyt uutteet väkevöitiin ali paineessa ja jäljelle jäänyt epäpuhdas kiinteä aine (noin 45 30 g) yhdessä aikaisemmin kerättyjen sakkojen kanssa suspendoi-tiin AcOEt/petrolieetterin seokseen (1/1) (600 ml). Noin kahden tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa suspensio suodatettiin ja kuivattiin alipainessa, jolloin saatiin 4-(2',5'-dif- > · luoribentsoyyli)nikotiinihapon ja 3-(2',5'-difluoribentsoyy- ;35 li)isonikotiinihapoon seosta (147,3 g, saanto 84 %) vaalean » beigen värisenä kiinteänä aineena. Sulamispiste: 214 - 216- * » * » 12 113861 °C.

Valmistusesimerkki 3: 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dioni 5 Liuos, jossa oli 4-(27,57-difluoribentsoyyli)nikotiinihapon ja 3-(27,57-difluoribentsoyyli)isonikotiinihapon seosta (120 g, 0,456 mol) 20 %:sessa savuavassa H2S04:ssa (180 ml), kuumennettiin 140 °C:seen. Noin 30 minuutin kuluttua lisää 20 %:sta savuavaa rikkihappoa (120 ml) lisättiin kuumaan reak-10 tioseokseen neljässä 30 ml:n erässä joka 20. minuutti. Kaksikymmentä minuuttia viimeisen lisäyksen jälkeen reaktioseos jäähdytettiin noin 80 °C:seen ja se kaadettiin sitten jäillä jäähdytettyyn mineraalittomaan veteen (3000 g jäitä ja 3000 ml vettä). Sammutetun reaktioseoksen pH säädettiin arvoon 1 15 40 %:sella NaOH:lla (850 ml) ja havaittiin keltaruskean sakan muodostumista. Noin 1 tunnin kuluttua 0-5 eC:ssa epäpuhdas sakka suodatettiin ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin epäpuhdasta 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dio-nia (98,5 g). Epäpuhdas reaktiotuote liuotettiin kiehuvaan 20 THF:iin (1000 ml) ja kuumasta liuoksesta poistettiin väri aktiivihiilellä (9 g), se suodatettiin ja väkevöitiin noin 300 ml:n tilavuuteen. Kun liuosta oli jäähdytetty 0-5 °C:-ssa noin 2 tuntia, keltainen kiinteä aine kerättiin talteen suodattamalla, jolloin saatiin analyyttisesti puhdasta 6,9-.:25 difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionia (90,6 g, saanto 81 :%)·

Sulamispiste: 197 - 199 °C.

Esimerkki 1: 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokino-30 liini-5,10-dionin dimaleaatti Lämpimään liuokseen (55 °C), jossa oli etyleenidiamiinia (1- 54,4 ml, 2,29 mol) THF:ssa (1400 ml) lisättiin annoksittain 2,5 tunnin aikana 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionia (70,1 g, 0,29 mol) (noin 4,6 g/10 min joka annoksessa).

"35 Seosta sekoitettiin 3 tuntia samassa lämpötilassa ja sininen sakka muodostui vähitellen. Yhden yön sekoituksen jälkeen 13 113861 25 °C:ssa suspensio suodatettiin typpisuojakaasussa, pestiin THFrlla (200 ml) ja kuivattiin alipaineessa (2,0 kPa, 60 °C, 3h), jolloin saatiin epäpuhdasta 6,9-bis[(2-aminoetyyli)a-mino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionia dihydrofluoridisuolana 5 (117 g).

Epäpuhdas tuote liuotettiin suoraan veden (2340 ml) ja AcOH:n (40 ml) seokseen tumman sinisen liuoksen saamiseksi, jonka pH oli noin 5, joka suodatettiin lasikuitusuodattimella. Tämä 10 pH-arvo on erittäin tärkeä reaktiotuotteen mahdollisen hajoamisen estämiseksi. Suodatettua liuosta käsiteltiin vähitellen huoneenlämpötilassa maleiinihapon suodatetulla 3-M vesiliuoksella (585 ml) pH-arvon 3,5 saavuttamiseksi. Noin 30 minuutin kuluttua 40 °C:ssa suspensiota sekoitettiin yli yön huoneen-15 lämpötilassa. Sininen sakka suodatettiin ja pestiin lisäve- dellä (3 x 80 ml) ja EtOH:lla (3 x 100 ml) ja kuivattiin sitten alipaineessa (2,0 kPa, 60 °C, 4h), jolloin saatiin epäpuhdasta 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini- 5,10-dionin dimaleaattia (168 g).

20

Epäpuhdas dimaleaattisuola suspendoitiin veteen (3180 ml) ja • ·; lämmitettiin 50 °C:seen 30 minuutiksi. Yhden yön sekoituksen ‘ ··' jälkeen 25 °C:ssa suspensio suodatettiin jälleen, sininen : v sakka pestiin lisävedellä (3 x 100 ml) ja tämä kostea materi- : ‘.25 aali suspendoitiin uudelleen veteen (2400 ml) ja pidettiin : : : sekoittumassa huoneenlämpötilassa noin 40 h.

Dimaleaattisuola suodatettiin, pestiin lisävedellä (3 x 100 ml) ja EtOH:lla (3 x 100 ml) ja kuivattiin sitten alipainees-30 sa (2,0 kPa, 60 °C, 4 h, sitten 40 °C yön yli), jolloin saa tiin 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-;;; dionin dimaleaattia (146,7 g, 92 %:n saanto).

- HPLC-analyysit (Waters, UV/Vis-detektori 486, pum-. ppu 510): ‘$5 kolonni: Lichrospher C18 (5 μια) t.a.

eluentti: H20/CH3CN/dioksaani 75/20/5 natriumheptaa- 14 113861 nisulfonaatti (20 mmol, pH 3,0 H3P04:lla virtausnopeus: 1 ml/min detektori : UV (245 nm) r.t. : 12 min 5 HPLC puhtaus (pinta-ala %) = 99,586 %; vrt. kuvio 3, piikki nro 4.

-AH NMR-analyysit (Brucker 200 MHz spektrometri, kemialliset siirtymät (5) ilmoitetaan miljoonasosina alaspäin sisäisestä standardista Me4Si).

10 («; D20): 3,30 (m, 4H); 3,70 (m, 4H); 6,05 (s, 4H); 7,05 (s, 2H); 7,70 (d, 1H); 8,70 (d, 1H); 8,95 (s, 1H) .

Esimerkki 2 15 Typpiatmosfäärissä liuos, jossa oli di-t-butyylidikarbonaat-tia (290,8 g, 1,32 mol) kuivassa THF:ssa (1200 ml), lisättiin hitaasti noin 3 tunnin aikana jäähdytettyyn (0 °C) ja sekoitettuun liuokseen, jossa oli 1,2-etyleenidiamiinia (268 ml, 4 mol) THFrssa (3600 ml). Kolmen tunnin kuluttua 10 °C:ssa ja 20 noin 16 tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa liuotin poistettiin alipaineessa. Jäljelle jäänyt keltainen öljy (noin 230 g) liuotettiin isopropyylieetteriin (460 ml) ja pestiin suo-:· lavedellä (50 ml). Kuivauksen jälkeen natriumsulfaatilla (50 g) orgaaninen liuos väkevöitiin pieneen tilavuuteen ja tis-I .25 lättiin alipaineessa (1,1 kPa, 119 - 121 °C), jolloin saatiin N-t-butoksikarbonyyli-1,2-etyleenidiamiinia (161 g, 76 %:n : saanto di-t-butyylidikarbonaatin suhteen).

NMR (CDCls, 6): 1,3 (s, 2H, vaihdot D20:n kanssa), 1,4 (s, 9H), 2,7 (bt, 2H), 3,1 (dd, 2H), 5,4 (bs, 1H).

30

Esimerkki 3 .! Typen alaisena liuos, jossa oli 6,9-difluoribent- so[g]isokinoliini-5,10-dionia (15 g, 0,061 mol) ja N-t-butok-sikarbonyyli-1,2-etyleenidiamiinia (49 g, 0,305 mmol) vedetkö tömässä N-metyylipyrrolidonissa (300 ml), lämmitettiin 60 °C-:seen. Noin 4,5 tunnin kuluttua reaktioseosta jäähdytettiin 15 113861 hieman (50 °C) ja se kaadettiin sekoitettuun mineraalittomaan veteen (1500 ml). Sekoitusta jatkettiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja tummansininen kiinteä sakka kerättiin talteen suodattamalla ja pestiin vedellä. Epäpuhdas suodatettu sakka 5 suspendoitiin uudelleen veteen (1500 ml), suodatettiin ja kuivattiin alipaineessa. Epäpuhdas reaktiotuote liuotettiin metyleenikloridin ja metanolin kuumaan seokseen (1/1, 500 ml), lämmin liuos suodatettiin lasikuitusuodattimellä ja jäähdytettiin 10 - 15 °C:seen kahdeksi tunniksi. Vielä 16 10 tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa kiteytynyt tumman sininen tuote kerättiin talteen suodattamalla ja kuivattiin, jolloin saatiin 27 g 6,9-bis[(2-N-t-butoksikarbobyyliaminoetyyli)a-mino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionia (saanto 84 %).

NMR (CDC13, Ä): 1,4 (s, 18H), 3,4 - 3,7 (m, 8H), 5,4 (m, 2H), 15 7,3 (S, 2H), 8 (d, J = 6 Hz, 1H), 8,85 (d, J = 6 Hz, 1H), 9,5 (S, 1H), 11 (m, 2H).

Esimerkki 4 20 Trifluorietikkahappoa (32 ml, 0,42 mol) lisättiin suspensi oon, jossa oli 6,9-bis[(2-N-tert.-butoksikarbobyyliamioetyy-' ! li)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionia (22 g, 0,042 mol) ; metyleenikloridissa (330 ml). Noin 16 tunnin sekoituksen jäl keen huoneenlämpötilassa reaktioseos laimennettiin EtOH:lla : .25 (100 ml) ja väkevöitiin alipaineessa. Jäännösöljy lairaennet- : tiin tuoreeltaan etanolilla (300 ml) ja väkevöitiin jälleen ; pieneen tilavuuteen. Mineraalitonta vettä (220 ml) lisättiin öljymäiseen jäännökseen ja pH säädettiin 4,2 yksikköön KOH:n 20 %:sella vesiliuoksella (45 ml). Saatu tumman sininen liuos 30 suodatettiin lasikuitusuodattimella ja sekoitettiin male- iinihapon 3-M vesiliuokseen (45 ml, 0,135 mol). Liuoksen pH säädettiin uudelleen 3,4 yksikköön KOHin 20 %:sella liuoksella (24 ml) ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa noin 40 tuntia. Epäpuhdas maleaatti kerättiin talteen suodattamalla '35 ja suspendoitiin uudelleen mineraalittomaan veteen (200 ml), lämmitettiin 50 °C:seen 1 tunniksi ja pidettiin sekoitettuna » 16 113861 vielä 16 tuntia huoneenlämpötilassa. Tumman sininen kiinteä aine suodatettiin, pestiin vedellä (2 x 50 ml) ja etanolilla (2 x 50 ml) ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 18,6 g 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-5 dionin dimaleaattisuolaa (saanto 80 %).

- HPLC-analyysit (Waters, UV/Vis-detektori 486, pumppu 510): kolonni: Lichrospher C18 (5 μια) t.a. eluentti: H20/CH3CN/dioksaani 75/20/5 natriumheptaa-10 nisulfonaatti (20 mmol) , pH 3,0 H3P04:lla virtausnopeus: 1 ml/min detektori: UV (245 nm) r.t.: 12 min HPLC puhtaus (pinta-ala %) = 99,285 %; 15 vrt. kuvio 4, piikki nro 3.

-'H-NMR-analyysit (Brucker, 200 MHz spektrometri, kemialliset siirtynät (δ) ilmoitetaan miljoonasosina alaspäin sisäisestä standardista Me4Si).

(δ; D20) : 3,30 (m, 4H) ; 3,70 (m, 4H) ; 6,05 (s, 4H) ; 20 7,05 (S, 2H); 7,70 (d, 1H); 8,70 (d, 1H); 8,95 (s, : 1H) .

Hoito , ! Esillä olevan keksinnön yhdistettä voidaan käyttää terapeut- • 25 tisten koostumusten aktiivisena aineosana syöpien ennalleen :· palautumisen ja/tai lievityksen aikaansaamiseksi nisäkkäillä, kun sitä annetaan määrät, jotka vaihtelevat välillä noin 1 mg - 0,4 g/kg kehon painoa. Edullinen annostusohjelma olisi noin 1-50 mg/kg kehon painoa vuorokaudessa. Annostusyksikköä 30 voidaan käyttää niin, että noin 70 mg - 3,5 g aktiivista yh-distettä annetaan kehon painoltaan noin 70 kg:n potilaalle 24 :· tunnin aikana. Annostus voidaan säätää yhteensopivaksi muiden hoito-ohjelmien, kuten sädehoidon kanssa.

.3.5 Farmaseuttiset koostumukset voivat olla tablettien, kapselei-den, geelikapseleiden, peräpuikkojen, lyofilisoitujen pulve-. reiden ja suonensisäisesti annettavien liuosten muodossa.

Claims

113861 Patenttivaat imukset

1. Menetelmä puhtaudeltan yli 99 %:sen 6,9-bis[(2-amino-etyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaatin 5 syntetisoimiseksi, tunnettu siitä, että a) lämpimään liuokseen (55 °C), jossa on etyleenidiamiinia THF:ssa, lisätään annoksittain 2,5 tunnin aikana 6,9-difluo-ribentso[g]isokinoliini-5,10-dionia siten, että diamiinia on 10 suuri mooliylimäärä dioniin nähden, dihydrofluoridisuolan muodostamiseksi, b) seosta sekoitetaan 3 tuntia samassa lämpötilassa, jolloin sinistä sakkaa muodostuu vähitellen; 15 c) yhden yön sekoituksen jälkeen 25 °C:ssa suspensio suodatetaan typpisuojakaasussa, pestään THF:lla ja kuivataan alipaineessa, jolloin saadaan epäpuhdasta 6,9-bis[(2-amino-etyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionia dihydrofluo- 20 ridisuolana; d) epäpuhdas tuote liuotetaan suoraan veden ja AcOHrn seok- ij : seen, jolloin saadaan tumman sininen liuos, jonka pH on noin : 5 ja joka suodatetaan lasikuitusuodattimella; • ;25 . , , e) suodatettua liuosta käsitellään vähitellen huoneenlämpö- * i tilassa maleiinihapon suodatetulla 3-M vesiliuoksella pH- • « · arvon 3,5 saavuttamiseksi; 30 f) noin 30 minuutin kuluttua 40 °C:ssa suspensiota sekoite- ' taan yli yön huoneenlämpötilassa; >'* ; g) sininen sakka pestään lisävedellä ja EtOH;lla, kuivataan ’ sitten alipaineessa, jolloin saadaan epäpuhdasta 6,9-bis[(2- ;; *35 aminoetyyli)amino)bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dimale- ’*·’ aattia; 113861 h) epäpuhdas dimaleaattisuola suspendoidaan veteen ja lämmitetään 50 °C:seen 30 minuutiksi; i) yhden yön sekoituksen jälkeen 25 °C:ssa suspensio suoda- 5 tetaan jälleen, sininen sakka pestään lisävedellä ja tämä kostea materiaali suspendoidaan uudelleen veteen ja pidetään sekoitettuna huoneenlämpötilassa noin 40 tunnin ajan; j) dimaleaattisuola suodatetaan, pestään lisävedellä ja

10 EtOH:lla ja kuivataan sitten alipaineessa, jolloin saadaan 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dio- nin dimaleaattia.

2. Menetelmä puhtaudeltaan yli 99 %:sen 6,9-bis[(2-amino-15 etyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaatin syntetisoimiseksi, tunnettu siitä, että a) trifluorietikkahappoa lisätään suspensioon, jossa on 6,9-bis[(2-N-tert.-butoksikarbonyyliaminoetyyli)amino]bentso[g]-20 isokinoliini-5,10-dionia metyleenikloridissa; ,,, ’ b) noin 16 tunnin sekoituksen jälkeen huoneenlämpötilassa • 'l · reaktioseos laimennetaan EtOH:lla ja väkevöidään alipaineessa; ·'· ;25 c) jäljelle jäänyt öljy laimennetaan tuoreeltaan etanolilla ... ja väkevöidään jälleen pieneen tilavuuteen; d) mineraalitonta vettä lisätään öljymäiseen jäännökseen ja pH säädetään 4,2 yksikköön KOH:n 20-%:isella vesiliuoksella; 30 e) saatu tumman sininen liuos suodatetan lasikuitusuodatti- ·;· mella ja se sekoitetaan maleiinihapon 3-M vesiliuokseen; » « » i \ f) liuoksen pH säädetään uudestaan 3,4 yksikköön KOH:n 20- *';’35 %:isella liuoksella ja seosta sekoitetaan huoneenlämpöti- lassa noin 40 tuntia; 113861 g) epäpuhdas maleaatti kerätään talteen suodattamalla ja suspendoidaan uudelleen mineraalittomaan veteen, lämmitetään 50 °C:seen 1 tunniksi ja pidetään sekoitettuna vielä 16 tuntia huoneenlämpötilassa; 5 h) tumman sininen kiinteä aine suodatetaan, pestään vedellä ja etanolilla ja kuivataan alipaineessa, jolloin saadaan 6.9- bis[(2-aminoetyyli)amino)bentso[g]isokinoliini-5,10-dio-nin dimaleaattisuolaa. 10

3. Parannettu menetelmä 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini- 5.10- dionin syntetisoimiseksi, tunnettu siitä, että mainittu menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 15 a) liuos, jossa on 4-(2',5'-difluoribentsoyyli)nikotiinihapon ja 3-(2',5'-difluoribentsoyyli)isonikotiinihapon seosta 20-%:isessa savuavassa rikkihapossa, kuumennetaan 140 °C:seen; b) noin 30 minuutin kuluttua lisää 20 %:sta rikkihappoa 20 lisätään kuumaan reaktioseokseen neljässä erässä joka 20. minuutti; • · * c) 20 minuuttia viimeisen lisäyksen jälkeen reaktioseos : : : jäähdytetään noin 80 °C: seen ja kaadetaan jäillä jäähdytet- ·’ ;25 tyyn mineraalittomaan veteen; d) sammutetun reaktioseoksen pH säädetään arvoon 1 40-%:isella NaOHrlla ja muodostuu keltaruskea sakka; 30 e) noin 1 tunnin kuluttua 0-5 °C:ssa epäpuhdas sakka ; ’ suodatetaan ja kuivataan alipaineessa, jolloin saadaan ' ' epäpuhdasta 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionia;

1 I f) epäpuhdas reaktiotuote liuotetaan kiehuvaan THF:iin ja ;;; 35 kuumasta liuoksesta poistetaan väri aktiivihiilellä, se suo- datetaan ja väkevöidään; ja 113861 g) noin 2 tunnin jäähdytyksen jälkeen 0-5 °C:ssa keltainen kiinteä aine kerätään talteen suodattamalla, jolloin saadaan analyyttisesti puhdasta 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini- 5.10- dionia. 5 4. 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokinoliini- 5.10- dionin dimaleaattiyhdiste, jonka puhtaus on yli 97 %.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, 10 että sen puhtaus on yli 99 %.

6. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se si- Ϊ sältää patenttivaatimuksen 4 mukaista yhdistettä ja farma seuttisesti hyväksyttävää täyteainetta. 15

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että minkään siihen sisältyvän epäpuhtauden määrä ei ylitä 0,5 %.

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen yhdiste, tunnettu siitä, että minkään siihen sisältyvän tuntemattoman epäpuhtauden määrä ei ylitä 0,2 %. I ( « • I » • V. 9. Menetelmä puhtaudeltaan yli 99-%:isen 6,9-bis [ (2-amino- ”.'.25 etyyli)] bentso [g] isokinoliini-5,10-dionin dimaleaatin val- , mistamiseksi, tunnettu siitä, että: a) annetaan 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionin reagoida etyleenidiamiinin kanssa lisäämällä hitaasti 6,9-; 30 difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionia diamiinin liuok seen tetrahydrofuraanissa (THF), jossa diamiinia on suuri ;· mooliylimäärä dionin suhteen, 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]- , ·. bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dihydrofluoridisuolan muodostamiseksi; ’’ 735 113861 b) liuotetaan 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokino-liini-5,10-dionin dihydrofluoridisuola veteen ja etikkahap-poon oleellisesti pH-arvolla 5; 5 c) suodatetaan vaiheen b) liuos; ja d) lisätään maleiinihapon vesiliuosta vaiheen c) suodatettuun liuokseen kiteytyneen dimaleaattisuolan muodostamiseksi . 10

10. Menetelmä puhtaudeltaan yli 99 %:sen 6,9-bis-[2-aminoetyyli) amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että: 15 a) aikaansaadaan 6,9-bis[(2-N-t-butoksikarbonyyliaminoetyy- li)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionia; b) poistetaan suojaus 6,9-bis[(2-N-t-butoksikarbonyyliamino-etyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionista trifluori-20 etikkahapolla 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokino- liini-5,10-dionin trifluoriasetaattisuolan muodostamiseksi; • ♦ 4 - ' c) vaihdetaan 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokino- ; liini-5,10-dionin trif luoriasetaattisuola maleiinihapolla • *•',25 käsittelemällä trifluoriasetaattisuolaa maleiinihapon vesi- liuoksella kiteytyneen 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso-[g] isokinoliini-5,10-dionin dimaleaattisuolan muodostamiseksi .

11. Menetelmä puhtaudeltaan yli 99 %:sen 6,9-bis[(2-amino- etyyli)amino]bentso[g]isokinoliini-5,10-dionin dimaleaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että: a) aikaansaadaan 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]iso-; ;’35 kinoliini-5,10-dionin trifluoriasetaattisuolaa; » i j 22 113861 b) liuotetaan 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino]bentso[g]isokino-liini-5,10-dionin trifluoriasetaattisuola veteen; c) säädetään vaiheen b) liuoksen pH happamaan pH-arvoon, 5 joka on yli 2,5; d) suodatetaan vaiheen c) liuos; ja e) vaihdetaan vaiheen d) trifluoriasetaattisuola dimaleaat- 10 tisuolaksi käsittelemällä trifluoriasetaattisuolaa maleiini- hapon vesiliuoksella kiteytyneen 6,9-bis[(2-aminoetyyli)amino] bentso [g] isokinoliini-5 , 10-dionin dimaleaattisuolan muodostamiseksi .

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH säädetään arvoon noin 4,2.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH säädetään alkalimetallihydroksidilla. 20

14. Menetelmä 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionin ·;· valmistamiseksi, tunnettu siitä, että: I I f a) Friedel-Crafts-asyloidaan 1,4-difluoribentseeniä 3,4-py-;V,25 ridiinidikarboksyylihappoanhydridillä, jolloin saadaan \ t 4-(2 ' , 5 1-dif luoribentsoyyli ) nikotiinihappoa ja 3-(2',5'-diili fluoribentsoyyli)isonikotiinihappoa ja poistetaan ylimää- • i · * räinen 1,4-difluoribentseeni; . ί 30 b) liuotetaan kiinteä sakka nitrobentseeniin ja kaadetaan 1 > liuos jääveteen; ,··, c) syklisoidaan seos savuavalla rikkihapolla korotetussa lämpötilassa 6,9-difluoribentso[g]isokinoliini-5,10-dionin .*35 saamiseksi. • · 113861