FI113777B

FI113777B - Menetelmä atsa-spiroyhdisteiden ja niiden enantiomeerien valmistamiseksi

Info

Publication number: FI113777B
Application number: FI960238A
Authority: FI
Inventors: Dov Barak; Abraham Fisher; Yishai Karton; Daniele Marciano; Haim Meshulam
Original assignee: Israel State
Priority date: 1993-07-20
Filing date: 1996-01-17
Publication date: 2004-06-15
Also published as: EP0711292A1; NO960225D0; BG100370A; CA2167584C; FI960238A; PL178931B1; NO960225L; HU9600126D0; BG62774B1; FI960238A0; AU7191594A; DE69429724D1; WO1995003303A2; BR9407088A; KR100341683B1; JPH09503491A; NO310075B1; US5534520A; KR960703914A; WO1995003303A3

Description

113777

MENETELMÄ ATSA-SPIROYHDISTEIDEN JA NIIDEN ENANTIOMEE-RIEN VALMISTAMISEKSI

Patenttihakemus on hakemuksen U.S. 08/094,855, kirjattu 20. heinäkuuta 1993, ja sen vaa-5 timusten etuoikeuden jatko-osa.

Keksintö koskee menetelmää viisiosaisten spi-rorengasyhdisteiden valmistamiseksi, joissa rengas, joka on spiro-kytketty tässä hakemuksessa kuvattuun viisiosaiseen renkaaseen, on tyydytetty sisäsiltainen 10 tai sillaton rengas, joka sisältää yksi tai kaksi typ-piatomia.

Uusia spiro-kinuklidiiniyhdisteitä, joissa renkaat oli liitetty spiro-kytkennällä kinukidiiniren-kaisiin, kuvattiin esim. hakemuksessa EPÄ 0205247 A2, 15 julkaistu 17. joulukuuta 1986, ja patenteissa U.S.

4,855,290 (julkaistu 8. elokuuta 1989), 4,981,858 (julkaistu 1. tammikuuta 1991), 4,900,830 (julkaistu 13. helmikuuta 1990) ja 4,876,260 (julkaistu 24. lokakuuta 1989). Samalla tavoin joitakin spiro-20 oksatsoliineja on kuvattu patentissa U.S. 5,053,412 (julkaistu 5. lokakuuta 1989), samoin kuin joitakin spiro-oksatsoliineja ja spiro-tiatsoliineja on kuvattu I hakemuksessa U.S. 07/685,397. On ymmärrettävä, että yllä mainittujen patenttien ja patentin U.S. S.N 25 07/685,397, sekä muiden patenttien ja tässä patentti- .· hakemuksessa mainittujen kirjallisuusviitteiden koko sisältö sisällytetään tähän hakemukseen tällä viit-teellä. Edellä mainittujen patenttien uudet yhdisteet omaavat vaikutuksen keskushermostoon. 2-metyyli-30 spiro (1,3-oksatiolaani-5,3 1) kinuklidiinin, jota on geometrisina cis- ja trans-isomeereinä riippuen sijaitseeko 2-metyyliryhmä samalla puolella oksa-* * tiolaanirengasta kuin kinuklidiinirenkaan typpiatomi :,,,· (cis) tai kinuklidiinirenkaan typpiatomin toisella : 35 puolella (trans) , biologista vaikutusta tutkittiin erityisen intensiivisesti ja havaittiin kliinisten 113777 2 esikokeiden perusteella, että cis-yhdiste (tunnus no. AF102B) oli erityisen lupaava Alzheimer-tyyppisen vanhuuden dementian (SDAT) hallintaan. On myös kiinnostavaa että, kumpikin cis- ja trans-isomeereistä voidaan 5 optisesti hajottaa ja optisten isomeerien biologista vaikutusta oli myös tutkittu lukuisissa tapauksissa.

Keksinnön pääkohde on menetelmä uusien spiro-yhdisteiden tai niiden entiomeerien valmistamiseksi. Erityisesti keksinnön kohteena on patenttivaatimuksien 10 1 ja 12 mukaiset menetelmät:

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaavan (I) mukaisen 3-okso-l-tia-4,8-diatsaspi-ro[4.5]dekaanin valmistamiseksi

15 ryV

R

20 jossa R on etyyli, R' on valittu vedystä ja metyylistä, ja R" on valittu metyylistä ja etyylistä, . tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happo- > · additiosuolan valmistamiseksi, jossa menetelmässä saa-·* tetaan l-metyyli-4-piperidoni ja l-etyyli-4- ·· 25 piperidoni, nimittäin yhdiste, jolla on kaava f FT-f/ \=° 30 \—/ i 1 ' > I 1 · ‘ t jossa R" on kuten määritelty edellä, ‘:"ί kosketuksiin yhdisteen kanssa, joka on valit- :t* : tu joukosta, joka koostuu 2-merkaptobutyyrihaposta, • y 35 nimittäin yhdisteestä, jolla on kaava HS-CHR-COOH, ! jossa R on kuten määritelty edellä, « ♦ t » I · 113777 3 ja amiiniyhdisteen kanssa, jolla on kaava NH2R' tai [NH3R']+X·, jossa X' on vastaioni ja R1 on määritelty kuten edellä, sellaisessa lämpötilassa ja sellaisen ajanjakson ajan, 5 mikä on riittävä tuottamaan kaavan (I) mukaista yhdistettä, ja haluttaessa saatetaan kaavan (I) mukainen yhdiste kosketuksiin hapon kanssa tuottamaan sen farmaseuttisesti hyväksyttävä additiosuola, 10 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaavan (I) mukaisen 3-okso-l-tia-4,8-diatsaspi-ro[4.5]dekaanijohdannaisen (-)enantiomeerin valmistamiseksi -opc * R· 20 jossa R on etyyli, R' on valittu vedystä ja metyylistä, ja R" on valittu metyylistä ja etyylistä, nimittäin yhdisteen, jolla on kaava: •

i “ ΟΟΓ ~QCC

\—/ hN--V _ 0 : ,-V « / \ /S^^CH2CHj - ¥ί_Ν^γ vw H,C2~\ ΧΎ X Λ-Λ . h /N^°

... · o , tai h3C

f 5 35 (-)enantiomeerin valmistamiseksi, · tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happo- additiosuolan valmistamiseksi, jossa saatetaan yhdis- 113777 4 te, joka on valittu joukosta, joka koostuu 1-metyyli- 4-piperidonista ja l-etyyli-4-piperidonista, nimittäin yhdiste, jolla on kaava 5 R"-N J=0 10 jossa R" on kuten määritelty edellä, kosketuksiin 2-merkaptobutyyrihapon kanssa, nimittäin yhdisteen kanssa, jolla yhdisteellä on kaava HS-CHR-COOH, jossa R on kuten määritelty edellä ja amiiniyhdisteen kanssa, jolla on kaava 15 NH2R' tai [NH3R,]+X~, jossa X' on vastaioni ja R' on määritelty kuten edellä, sellaisessa lämpötilassa ja sellaisen ajanjakson ajan, mikä on riittävä tuottamaan kaavan (I) mukaista rase-maattia, 20 erotetaan enantiomeerisesti mainitun rasemaatin enan-tiomeerit, ja haluttaessa muutetaan enantiomeerisella erotuksella tuotettu enantiomeeri mainitun enantiomee-rin vapaaksi emäsmuodoksi, ·. ja haluttaessa saatetaan kaavan (I) mukainen mainittu : 25 enantiomeeri kosketuksiin hapon kanssa tuottamaan sen farmaseuttisesti hyväksyttävä additiosuola. i Seuraavassa kuvataan patenttivaatimuksissa valmistettavia yhdisteitä sekä suojapinnan ulkopuolelle jääviä yhdisteitä. Keksinnön mukaisten yhdisteiden 3 0 valmistusta kuvataan esimerkeissä 43, 44ja 55.

Yhdisteet voivat olla kaavojen I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII ja IX yhdisteitä

/ ,X-Y ^N N—C-Q __ X-C-Q

(><J 0< I

" z W-* H-H 1

II IH

i— j I 113777 ; 5 j __ X-Y H —C-Q' X-y (Ζλ I (D\ I (Di

C !l T '· W R*—C-Z

5 / \ Q R'"

IV V VI

_ N -- C-Q X--------C-Q X·-Y

(j^ cv I Cla 10 R#—-c-z R*—C-N R*—c-Z' \ \ \ R·" R·" R···

VII VIII IX

j ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suo-15 loja, enantiomeereja ja rasemaatteja, joissa rengas A yhdessä spiro-hiiliatomin kanssa on osa sisäsiltaista tai sillatonta rengasta, joka sisältää yhden tai kaksi typpiatomia; X on >0, >S tai >NR°; T on -C(Q)= tai -N=; Y on >C=0, >C=S, >C=NR°, >C=CRR’, >CRR’, >CHOR'’ , 20 >0, >S tai >NR°; Z on >0, >S, >C=0, >C=S, >C=NR°, >C=CRR', >CRR', >CHOR" tai >NR°; W on >0, >S, >C=0, >C=S, >C=NR°, >C=CRR', >CHOR” tai >NR°; Q ja Q' on I kumpikin valittu itsenäisesti joukosta OR, SR, NRR', * ja R; x' ja Z* on kumpikin valittu itsenäisesti joukos- : 25 ta >C=0. >C=S ja >C=CRR'; ja R, R', R”, R°, R* ja R'" ' .*’ on kukin valittu itsenäisesti ryhmästä H, Ci-6-alkyyli, ·', ·* Cj.-6-alkoksi, C2-6-hydroksialkyyli, C2-6-alkenyyli, C2.6- :alkynyyli, fenyyli ja Ci-6-alkyyli substituoituna yhdellä, kahdella tai kolmella fenyylillä, samalla kun 30 r" ja R° voidaan valita myös itsenäisesti ryhmästä Ci_ 6-alkanoyyli; edellyttäen, että kuvattu viisiosainen rengas sisältää vähintään yhden rengashiiliatomin spi-ro-hiiliatomin lisäksi, ja että kaksi viereistä renga-: : satomia eivät ole samanaikaisesti happiatomeja, ja et- ; ' t 35 tä: (ia) kaavassa I -W-Z-Y-X- ei ole -C (=0)-NH-C( = )- ! N (alkyyli) -, -C (=0)-NH-C (=0)-NH-, -O-C (=0) -CRR' -O- tai * * * * · -0-C(=0) -CRR'-S-, (ib) kaavassa I, jos rengas A on pi- 113777 6 peridiinirengas, joka voi olla N-substituoitu, silloin -W-Z-Y-X- ei ole -NR° -CRR' -CRR' -0- , -NR0-C (=0) -CRR'-0-, -NR°-CRR'-CRR'-S- tai -NR°-C(=0) -CRR'-S-, (ie) kaavassa I, jos -W-Z-Y-X- on -C (=0)-NH-C(=0)-O-, silloin rengas 5 A ei ole kinuklidiinirengas, (ii) kaavassa, jos -W-Z-Y-X- on -NH-C(=0)-N(Ph)-NH-, -NH-N(Ph)-C(=0)-NH-, - NR0-NR°-C(=0)-NR°- tai -NR0-NR0-C(=S)-NR0-, silloin rengas A ei ole N-metyylipiperidiinirengas, ja jos -W-Z-Y-X- on -NR0-NR0-C(=S)-NR0-, silloin rengas A ei 10 myöskään ole substituoimaton piperidiinirengas, (iiia) kaavassa III rengas A ei saa olla substituoitu kahdella fenyyliradikaalilla, (iiib) kaavassa III, jos Q on NRR1 ja W on C=0, silloin X ei ole 0, (iv) kaavassa

VI, jos Y on CRR' ja joko X = Z = 0 tai S tai toinen X

15 ja Z on O ja toinen on S, silloin ainakin yksi R* ja r"'* H, (v) kaavassa VI, jos Y on CRR', X on O tai S ja rengas A on piperidiinirengas, joka voi olla N- substituoitu, silloin Z on NR0, lukuunottamatta N-CHO, (vi) kaavassa VI, jos X on O, Y on NR° ja Z on C=0 tai 20 C=S, silloin joko rengas A on sisäsiltainen rengas tai ainakin yksi R* ja r'" ei ole H, (vii) kaavassa VI, jos -X-Y-Z- on -0-C(=0)-NH-, -0-C(=S)-NH-, -0-NR°- C (=0) - tai -0-NR0-C (=S) - ja R° on H tai alkyyli, silloin rengas A ei ole piperidiinirengas, (viii) kaavas-·.· 25 sa VII, jos Z on O, silloin joko Q on SR tai NRR' tai ainakin yksi R* ja R"' ei ole H, (ix) kaavassa VIII, . ·, jos X on O tai S, silloin joko Q on SR tai ainakin yk- ,'··, si R* ja r'" ei ole H, ja (x) kaavassa IX, jos -X'-Y- z'- on -C(=0) -NR°-C(=0) - ja R° on H tai alkyyli, sil-30 loin rengas A ei ole piperidiinirengas.

- t · ·;; Rengas A voidaan valita rakenteiden K, L, M, N, P ja S ryhmän joukosta, nimittäin: * * » > · * · » · 35 • t • i ·

• » I

• * » > > • > * * t • « 113777 7 5 4 5 4 CH-rl-CH CH2-j-CH CH2 (CH2)n / I \ / L , \ . ,/ Λ CH2 (CH2)rn C< CH2 CR2r3 c< Rl-N C< \2/ / Mi \ / 5 N ' — CH2 N-CH2 CH2- (CH2)p (K) (L) (M) CH-(CH2)_ CH-(CH2)n N-(CH2)n , / \ ^ ,/\2, ( / f R*-N (CH->)_ C< R^-N CR2R3 C< CH C< 10 \ / / \ / / \ / CH-(CH2)p CH-(CH2)p N-<CH2)p (N) (P) R1 (S) missä kukin rakenne on substituoimaton tai 15 substituoitu 1-3 substituent il la valittuna Ci-6- alkyylistä ja -hydroksyylistä, rakenteissa K ja L silta saadaan aikaan toisessa päässä asemaan 1 ja toisessa päässä asemaan 4 tai 5 (s.o. osa CH2-|-|CH merkitsee CH2—CH tai CH-CH2) , m on 1, 2 tai 3 ja n ja p ovat 20 / \ kumpikin riippumattomasti 0, 1, 2 tai 3 edellyttäen, että n+p = 1-3; R1 on valittu vedystä, Cx-6-alkyylistä, v.; C2.6-alkenyylistä, C2-6-alkynyylistä, C3.7-sykloalkyy- ! ‘ : listä, Ci-6-alkyylistä substi tuo ituna 1-6 halogeeniato- ' ,· 25 millä, hydroksi-Ci-6-alkyylistä, Ci_6-alkoksista, Ci-6- I » alkyylitiosta, Ci-6-alkoksi-Ci-6-alkyylistä, karboksi-Ci.

,*. 6-alkyylistä, (Cx-e-alkoksi) karbonyyli-Ci-6-alkyylistä, * « V. amino-Ci-6-alkyylistä, mono-(Ci_6-alkyyli) amino-Ci-e-al- » « kyylistä, di-(Ci-6-alkyyli) amino-Ci_6-alkyylistä, 2-30 okso-pyrrolidin-l-yyli-metyylistä, aryylistä, diaryy- * » · • ·.: limetylolista, Ci-6-alkyylistä substituoituna yhdellä *...· tai kahdella aryyli ryhmällä, Ci-6-alkanoyylistä ja .;: aryylikarbonyylistä; ja aryyli merkitseesubstituoima- .···, tonta fenyyliä tai fenyyliä substituoituna 1-3 substi- • » "·* 35 tuentilla valittuna halogeenista, Ci-6-alkyylistä, Ci-6- • · ! alkoksista ja CF3:sta; ja R2 ja R3 on valittu itsenäi- sesti Ci-4-alkyylista.

113777 8

Yhdisteet voivat olla kaavojen I-IX yhdisteitä ja niiden suoloja, kvaternaarisia yhdisteitä, enan-tiomeereja ja rasemaatteja kuten edellä on määritetty, joissa voi lisäksi tai vaihtoehtoisesti: missä tahansa 5 osassa CRR', R ja R' yhdessä hiiliatomin kanssa, johon ne kiinnittyvät, muodostua tyydytetty karbosyklinen rengas, jossa on 3-6 rengasosaa; ja rakenteissa (K) , (L) , (M) , (N) , (P) ja (S) rengashiiliatomiin kiinnit tynyt mikä tahansa H-atomi voidaan korvata R1:llä, jo-10 ka on määritetty edellä (poislukien H).

Yhdisteet voivat olla: 1-metyylipiperidiini- 4-spiro-5'-(3'-etyylihydantoiini); 1-metyylipiperidii-ni-4-spiro-51 -(1'-asetyylihydantoiini); piperidiini-4-spiro-5'-(3'-etyylihydantoiini); 1-metyylipiperidiini-15 4-spiro-5'-(3'-metyylihydantoiini); piperidiini-4- spiro-51 -(3'-metyylihydantoiini); 1-metyylipiperidii-ni-4-spiro-51 -(31-propargyylihydantoiini); 1-metyyli-piperidiini-4-spiro-41 -(21,51-bis(metyylitio)-4 Ή-imidatsoli); l-metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(3'- 20 etyyli-4'-tiohydantoiini) ; l-metyylipiperidiini-4- spiro-5'-(41-metyylitio-31-imidatsoliini-21-tioni); 1- metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2',4'-ditiohydantoii-ni) ; l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(3'-etyyli-2',4'-t: ditiohydantoiini); l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'- ,* 25 (4'-etyylitio-31-imidatsoliini-2'-tioni) ; 1-metyyli- piperidiini-4-spiro-4'-(11-etyyli-21-etyylitio-2'-imidatsoliini-51-tioni) / l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2 1-tiohydantoiini) ; l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(21-tio-4'-β-hydroksietyyli-iminohydantoiini); 1- 30 metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(oksatsolidiini-2'- - < » • : tioni); N-metyylinortropaani-3-spiro-51 -(3'-metyyli- hydantoiini) ; N-metyylinortropaani-3-spiro-51 - (3'- : etyylihydantoiini); l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'- (3 1-etyylioksatsolidiini-2 1-oni) ; 1-metyylipiperidii- • · 35 ni-4-spiro-4 1 - (3 1-etyylioksatsolidiini-2 '-oni) ; 2-N- : metyyli-spiro- (1,3-sukkiini-imidi 4,3 1) kinuklidiini; » ·’ : 2-N-etyyli-spiro- (1,3-sukkiini-imidi 113777 9 4,3')kinuklidiini; l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(oksatsolidiini-2',4'-dioni); 1-metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(31-etyylioksatsolidiini-2',41-dioni); 1-me- tyylipiperidiini-4-spiro-41 -(21-metyyli-2'-tiatsolii-5 ni) ; N-metyyli-nortropaani-3-spiro-51-hydantoiini); 1- metyylipiperidiini-4-spiro-4'(51) -(2'-metyyli-2'-imi-datsoliini); l-metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(2'-metyyli-2 '-oksatsoliini-4'-oni); l-metyylipiperidiini-4-spiro-4'(5') -[2'-metyyli-4 Ή(5 Ή)-imidatsoli-5'(4') -10 oni]; l-metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(2'-metyylitio-5'-metoksi-4Ή-imidatsoli); 1-metyylipiperidiini-4- spiro-4'-(2'-metyylitio-5'-amino-4 Ή-imidatsoli); 1- metyylipiperidiini-4-spiro-41 -(2'-metyylitio-5'-amino-etyyli-4Ή-imidatsoli); 1-metyylipiperidiini-4-spiro-15 4'-[2',5'-bis(aminoetyyli)-4Ή-imidatsoli]; & 1-metyy- lipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-tioni-3'-etyylihydanto-iini); 1-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-tioni-3'-t-butyylihydantoiini); 1-metyylipiperidiini-4-spiro-5'- (31-t-butyylihydantoiini); 1-propargyyli-piperidiini-20 4-spiro-5'-(31-etyylihydantoiini); 1-metyylipiperidii-ni-4-spiro-51 -[3'-(4-pyrrolidoni-2-butynyyli)hydantoiini] ; 1-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-[3'-(2-butynyy-li)-hydantoiini]; piperidiini-4-spiro-5'-(3'-propar-gyylihydantoiini) ; 2-metyyli-l,4-tiatsolidiini-3-oni-,J 25 spiro[5,3']-kinuklidiini; l-metyylipiperidiini-4-spi- ·. ro-41 (5') -[2'-metyylitio-21-imidatsoliini-51 (41)-oni]; >, l-metyylipiperidiini-4-spiro-41 -(1'-etyyli-21-etyyli- ! tio-21-imisatsoliini-5'-oni); 1-metyylipiperidiini-4- ' spiro-4'-(11-etyyli-2'-imidatsoliini-5'-oni).

30 Nisäkkäiden keskus ja ääreishermoston saira uksien hoidossa voidaan käyttää farmaseuttista seosta, joka sisältää ainakin yhtä yhdistettä tehokkaan määrän ,,,j käytettäväksi mainittujen sairauksien hoidossa, jolla ,··, on yksi edellä määritetyistä kaavoista I, II, III, IV, 35 V, VI, VII, VIII ja IX mukaanlukien niiden farmaseut- I » i.i : tisesti hyväksyttävät suolat, enantiomeerit ja rase- · maatit yhdessä ainakin yhden farmaseuttisesti hyväk- 113777 10 syttävän laimennusaineen, kantoaineen tai apuaineen kanssa. Tällainen seos on edullisesti sopivassa muodossa annettavaksi suun, peräsuolen, ruoansulatuskanavan ulkopuolisen kanavan kautta tai ihon läpi (tässä 5 tapauksessa seos saattaa sisältää lisäksi pienimole-kyylipainoista rasvahappoa) tai annettavaksi sisäänpu-halluksen tai nenäsuihkeen avulla ja voi olla annosyk-sikön muodossa. Ainakin yksi keksinnön edellä määritetty yhdiste voi olla mukana annosyksikössä määräl-10 tään alueella esim. 0,5-100 mg, edullisesti n. 5-100 mg, edullisemmin n. 10-50 mg.

Farmaseuttinen seos voi sisältää lisäksi ainakin yhden farmakologisesti aktiivisen lisäyhdisteen valittuna fysostigmiinista, tetrahydroaminoakridiinis-15 ta, koliinista, lesitiinistä, pirasetaamista, ani- rasetaamista, pramirasetaamista, oksirasetaamista, 4-aminopyridiinistä, 3,4-diaminopyridiinistä, somatosta-tiinista, pirentsepiinistä, N-metyyliatropiinista, N-butyyliskopolamiinista, skopolamiinista, klonidiinis-20 ta, quanfamisiinista, propanteliinistä, metanteliinis- tä, glykopyrrolaatista, tropenziliumista, nortripty-liinistä, amitriptyliinistä, imipramiinistä, minaprii- • nista, secoveriinista, AZFDX-116:sta, nikotiinista, • alaproklaatista, zimelidiinistä, deprenyylistä ja her- ! 25 mon kasvutekijästä.

: Nisäkkäiden keskus- ja ääreishermoston saira- . uksia voidaan hoitaa menetelmällä, joka käsittää aina kin yhden yhdisteen tehokkaan määrän antamisen niille käytettäväksi mainittujen sairauksien hoidossa, jolla 30 on yksi edellä määritetyistä kaavoista I, II, III, IV, ;;; V, VI, VII, VIII ja IX mukaanlukien niiden farmaseut- I » ···' tisesti hyväksyttävät suolat, enantiomeerit ja rase- :·· maat it. Tällaisia yhdisteitä voidaan tietysti käyttää tähän tarkoitukseen keksinnön mukaisen farmaseuttisen 35 seoksen muodossa, kuten edellä on määritetty.

1 · » ‘ Yhdisteet voivat olla yhdisteitä, joiden mo- ’’ · lekyylien dimensiot on esitetty alla olevassa, missä: 113777 11 r on anionin aseman määrittämä referenssipiste vastaten ei-kaksoissidoksella sidotun typpiatomin kationista muotoa, määritettynä renkaan A (tai a') N*:nä tällaisessa yhdisteessä sen stabiileimmassa konformaati-5 ossa, X* määrittää renkaan heteroatomin kuvatussa 5-osaisessa renkaassa, jolla on kaava I-IX tai X-XIII, tällaisen renkaan heteroatomin ollessa spiro-hiiliatomin viereisessä asemassa, Z* määrittää toisen renkaan atomin X*:stä lukien kuvatussa 5-osaisessa 10 renkaassa, ja Q* määrittää rengasatomiin kiinnittyneen sivuketjun hiili- tai typpi-pääteatomin atomien X* ja Z* välissä kuvatussa 5-osaisessa renkaassa, sivuketjun vetyatomit jätettäessä huomioonottamatta tähän tarkoituksen; tällaisilla molekyylien dimensioilla ollessa 15 pääosin seuraavat arvot, nimittäin: diedrikulma r-X*- q*-z* = -54° - -170°; ja molekyylien väliset etäisyydet r-N* = 3,0 Ä (referenssietäisyys) , r-X* = 5,7-6,75 Ä, r-Q* = 7,9-8,90 Ä, x-Q* = 2,4-2,8 Ä; tällaisten yhdisteiden, joilla on täten määritetyt molekyylien di-20 mensiot, ollessa tunnettuja siitä, että niillä on mus-kariinista agonistivaikutusta. Tämä molekyylien dimensioihin perustuvaa määritelmää tukevat biologiset kokeet, ks. erityisesti allaoleva taulukko 1.

: Farmaseuttinen seos voi käsittää ainakin yh- *\ j 25 den tässä hakemuksessa määritettyjen kaavojen I-IX yh- : : disteen ja lisäksi hermokasvutekijän (NGF), yhdis- : te (id) en ollessa mukana määrällä, joka edistää NGF:n • F » hermon kasvuaktiviteettia. Useimmat näistä yhdisteistä, toisin kuin tietyt tunnetut keskus- tai ääreisher-30 mostovaikutuksia omaavat yhdisteet, eivät itsessään *;;; edistä hermon kasvuaktiviteettia NGF:n poissaollessa • » '·;·* mahdollistaen siten paremman hallinnan haluttaessa hermon kasvun edistyminen käsittelyssä. Jotkut aktii-visimmista yhdisteistä kuitenkin edistävät hermon kas-. ·, 35 vuaktiviteettia NGF:stä riippumatta. Lisäksi keksinnön '*· j yhdisteillä on tavallisesti aktiviteettia valittuna * * ryhmästä muskariininen agonistivaikutus, amyloidipro- 113777 12 teiinin esiastetta (APP) erittävä vaikutus ja β-amyloideja vähentävä vaikutus sekä defosforyloitujen ]?-proteiinien osuutta kasvattava vaikutus. Suoritetut kokeet näiden yhdisteiden biologisen aktiviteetin to-5 teamiseksi kerrotaan yksityiskohtaisesti seuraavassa.

Kaavan (I) yhdisteitä, mukaanlukien niiden farmaseuttisesti hyväksyttät suolat, kvaternaariset yhdisteet, jotka ovat rakenteellisesti peräisin mainituista yhdisteistä, joissa on tertiäärinen typpiatomi, 10 enantiomeerit ja rasemaatit, voidaan käyttää lääkeaineen valmistukseen, joilla on (a) muskariinisesta agonistiaktiviteetista, (b) neurotrooppistyyppisestä eli synergistisestä aktiviteetista NFG:n kanssa, (c) amyloidiproteiinin esiastetta (APP) erittävästä akti-15 viteetista ja β-amyloideja vähentävästä aktiviteetista, (d) defosforyloitujen τ-proteiinien osuutta lisäävästä aktiviteetista ja (e) NGF-tyyppisestä aktiviteetista valittu biologinen aktiviteetti, missä -W-Z-Y-X-on -NRo-CRR'-CRR'-0-, -0-C (=0)-CRR’-O-, -0-C(=0)-CRR'- 20 S-, -NR°-C(=0) -CRR-0-, -NR0-CRR'-C'-S (=0) g- tai -NR°- C (=0)-CRR'-S (=0) q-, q on 0, 1 tai 2 ja R, r' ja R° ovat merkitykseltään edellä olevia. Esimerkkejä tällaisista » yhdisteistä ovat: : l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(21-metyyli- 25 11,4'-oksatsolidiini-3'-oni); 1-metyylipiperidiini-4- spiro-5 ' - (2 '-metyyli-11,4 1-tiatsolidiini-3 '-oni) ; 1- , *. metyylipiperidiini-4-spiro-5 ' - (2 ' , 4 ' -dimetyyli-1', 4 ' - t !> tiatsolidiini-31-oni); 1-metyylipiperidiini-4-spiro- * · ' 51 -(2'-etyyli-141-tiatsolidiini-31-oni) ; 1-metyyli- 30 piperidiini-4-spiro-5'-(21-etyyli-4-metyyli-1',4'-ti-

i ‘ I

··: atsolidiini-3 1-oni) ; piperidiini-4-spiro-5 ' - (3 '-me- tyyli-1',4 '-oksatiolaani-2 1-oni) ; piperidiini-4-spiro- 5'-(2 1-metyyli-14 1-tiatsolidiini-3 '-oni) ; 1-metyyli- .···. piperidiini-4-spiro-5 1 - (2 1 -metyyli-3 ' -okso-11,4 ' -tiat- • · 35 solidiini-11-oksidi); l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-: (3 1 -metyyli-1', 4 1 -oksatiolaani-2 ' -oni) ; 1-metyylipipe- ridiini-4-spiro-2'-(5'-metyyli-11 , 3'-oksatsolidiini); 113777 13 1-metyylipiperidiini-4-spiro-21 -(41-etyyli-11,3'-oksa-tsolidiini); 1-metyylipiperidiini-4-spiro-5'- (3 1 - etyyli-11,4'-oksatiolaani-2'-oni); 1-metyylipiperi-diini-4-spiro-5'-(21-metyyli-1',4'-tiatsolidiini-3'-5 oni); l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-etyyli- 1', 4 1-tiatsolidiini-3'-oni); l-metyylipiperidiini-4-spiro-2'-(5'-metyyli-1',31-dioksolaani-41-oni); 1- metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(21-metyyli-1',41-tiatsolidiini-3 '-tioni); ja enantiomeerit d- ja 1-1-10 metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(21-metyyli-1',4'-tiatsolidiini-3 ' -oni) ja d- ja l-l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-etyyli-11,4'-tiatsolidiini-31-oni).

Yhdisteitä voidaan siten käyttää nisäkkäiden sairauksien hoitamiseen, jotka määrätään sopiviksi 15 hoidettavaksi (yllä mainittujen aktiviteettien a-e) yhteydessä olevien) yhdiste(id)en tehoavalla määrällä, ja voidaan käyttää farmaseuttisten seosten muodossa, jotka sisältävät tehoavan määrän tällaisia yhdisteitä, mutta ovat muuten edellä kuvatun kaltaisia.

20 Näiden yhdisteiden valmistukseen käytetyt me netelmät ovat pääasiassa orgaanisen kemian kemistien tuntemia viisiosaisten renkaiden, renkaan substituoi-.1 misen, renkaan tyydyttymis/tyydyttymättömyysasteen , ,· muuttamisen, suolojen ja emästen välisen muuntamisen, : 25 kvaternaarisen suolanmuodostuksen j.n.e. muodostami- seksi. Täten, vaikka kuvataan keksinnön tiettyjen yh- . 1. disteiden valmistusmenetelmien esimerkkejä, myös muita ' » , ,·, menetelmiä voidaan käyttää niiden valmistukseen, kuten 1 > · alan asiantuntijoille on selvää.

30 Jos haluttu 5-osainen rengas on esim. hydan- · ·;;· toiini, tämä rengas voidaan muodostaa antamalla vas-

* I

taavan tyydytetyn N-heterosyklisen ketonin (esim. 1- » ·;··! metyylipiperidiini-4-oni) (NH4)2C03 + CN- kanssa, ja .···. 3 1-N atomi voidaan sitten substituoida tunnetulla ta- ’·’ 35 valla. Näitä reaktioita voidaan kuvata siten: • · · • » · • · · 1 · 113777 14 CHp CHo CHp——CHn NH——C-0 / \ / \ / CHa-N C«0 +(NH/,)2C0, CHo-N C (AA) \ / +OC * * \ / \

ch2-ch2 --------> ch2-CH2 C(-0)-WH

5 CHo—1 CH*> NK-C»0 / \ / (AA) ♦ R*· (lähtevä ryhmä) —— > C /g» \ / \ 10 ch2-CH2 C(«0)-NR* esim. AF160, R°=Et; AF178, R°=Me; AF185, R°=propargyyli; AF167, R°=Me, analogi*; ja AF168, R°=Et, analogi* (* jossa N-metyylipiperidiiniosa si-15 saitaa 2,6-etyleenisillan, s. o. N-metyylinortro-paanianalogin).

Lähtevä ryhmä R°-(lähtevä ryhmä) saattaa olla esim. bromidi, kloridi tai p-tolueenisulfonaatti ja R° on kuten tässä hakemuksessa määritetty, poislukien H, 20 alkoksi ja alkonyyli. Tämä substituutioreaktio voidaan suorittaa pääosin tunnetuissa olosuhteissa, esim. antamalla 31-substituoimattoman hydantoiinin reagoida alkalin, kuten KOH, läsnäollessa ja käyttäen liuotin-: ta, kuten etanolia. Vastaava 1' , 31-disubstituoitu yh- ,i 25 diste voidaan saada ylläolevassa reaktiossa käyttäen ylimäärää R°-(lähtevä ryhmä) reagenssia tai antamalla . ,·. yhdisteen (B) reagoida R°-(lähtevä ryhmä) kanssa.

t·;^ 1-Metyyliryhmä rakenteessa (B) voidaan siir- • » * tää reaktiolla demetylointiaineen kanssa, kuten 30 CH3CH(C1)0C0C1: CH2-CHp NH—C-0 / \ / ... | (B) ♦ demetylointi- ----> H-N C (C) aine \ j ^ ch2-CH2 C(-0)-NR* 35 » * » * » » · t • t 113777 15 esim. AF160(Des), R°=Et; AF179, R°=Me.

Rakenne (B) ja voidaan myös valmistaa esim. seuraavasti: t CH?---CH? NR-, / \ / CHg-N C ♦ R*-N"C»0; H+----> (B) \ / \ CH2-CH2 C02H (e.g. AF213, R*« t-butyyli 10 R°-N=C=S:n substituointi samanlaisessa reaktiossa antaa (B)-3-tionin, esim. AF181 (R=Et) , AF184 (R=tert.-butyyli).

Yhdisteen (AA) reaktio alkanoyylihalidin tai alkanoidisen anhydridin kanssa normaaleissa alkyloin-15 tiolosuhteissa saa aikaan substituoitumisen 1'-asemassa, siten; alkanoyyli

CHo ' -CHp N-OO

20 / \ /

(AA) ♦ alkanolyointi-w—-> CHo-N C

aine \ / \

ch2-ch2 C(-0)-NH

► * ♦ > * ♦ • 25 esim. AF164, alkanoyyli=asetyyli

Jos haluttu 5-osainen rengas on ditiohydanto-; iini, tällaisia yhdisteitä voidaan valmistaa, esim.

, ,·. muodostamalla tämä rengas antamalla vastaavan tyydyte tyn N-heterosyklisen ketonin reagoida CN-, NH4C1 ja CS2 30 kanssa. Hydantoiinien substituoituessa (esim. alkyloi-tumalla) N-atomeille, tiohydantoiinit antavat N-ja/tai S-substituoituja tuotteita. Esimerkit (alla) kuvaavat reaktio-olosuhteita, jotka antavat erilaisia tuotteita tai tuotteiden seoksia, jotka voidaan erot- . 35 taa. Näitä reaktioita kuvataan seuraavassa, missä N- * * · ; heterosyklinen ketoni on esimerkinomaisesti 1-

M t t I

metyylipiperidiini-4-oni: 113777 16 ch2-ch2 ch2-ch2 m—os / \ / \ /

-N OO ♦ NHjiCl, CHo-N C

\ / cs2/cn J \ / \

ch2-ch2 ------> ch2-ch2 C(-S)-NH

5 (AP173) + R*- lähtevä ryhmä ——> ch2-ch2 n- -c-sr* / \ / 10 c e.g. AF177. R**Me

ch2-ch2 C(-SR*)-N

CH2— —CH2 NH— OS ja/tai / \ / CH,-N C (D) esim. AF183. R*-Me; \ / \

15 CH2-CH2 C(-SR*)«N AF176. R*-EtJ

^CH2-CH^ N - C-SR* ja/tai CH3-N C (E) esim. ΑΡ17Θ, R*-Et 20 \ / \ CH2-CH2 C(»S) N-R* Lähtevä ryhmä ja R°:n arvo R°-(lähtevä ryh- v mä) :ssä voidaan kuvata kuten edellä hydantoiineja var- ten. Substituutioreaktiot voidaan suorittaa pääosin ,« 25 tunnetuissa olosuhteissa.

Ditiohydantoiineja voidaan yleensä saada ai- . ,·, kaan myös antamalla vastaavan hydantoiinin reagoida ! P2S5:n kanssa, esim. kuten: • < ·

CH->-CH-> NH-OS

30 / \ /

/ (B) ♦ fosforipen--—> h-N _ C

,>··. (AFl60) tasulfidi \ / \ ch2-ch2 c(-s)-nr’ esim. AF163. R*"Et • · t » t • * • ‘ 35 Kun yhdiste (E) reagoi 20 % HCl:n kanssa, S- i R° hydrolysoituu antaen seuraavan yhdisteen: • · 113777 17 CH2-CH-, NH-C-0 / \ / CH,-N C esim. AF182. R*-Et \ / \

CH2—CH2 C(-S)-S-R

5 Yhdisteen (D) vastaava reaktio 20 % HCl:n kanssa antaa yhdisteen, jolla on seuraava rakenne (ks. esim. esimerkki 12):

CH,-CHp NH-OS

/ \ /

CH*>N C

10 \ / \

ch2—ch2 C(-0)-NH

Tämä yhdiste on myös muodostettu hydrolysoimalla =0:n asemesta =NR°:n sisältävä analogi; =NR°-analogi voidaan valmistaa antamalla yhdisteen AF173 15 reagoida R°NH2:n kanssa (ks. esim. esimerkki 13, jossa R°= β-hydroksietyyli).

Yhdisteet, jotka ovat okso- tai tionosubsti-tuoituja oksatsolidiineja voidaan valmistaa esim. seuraavasti :

20 CH2——CHp OH

/ \ / C ♦ CS2/alkaali——> CH2-CH2 CH2NH2 • » » ·

• 25 CHp CHp 0— OS

; / / \ / CHo-N C (AF165) \ / \

CH2-CH2 CH2-NH

* » » * * *

CH2-OH, OH

30 / \ / ·' CH3-N^ C Ν,Ν-karbonyylidi-imidatsoli——> ch2-ch2 ch2nhr‘ >

Mil • I

CH2—CHp 0—C*0 r 35 / \ / • CH3-N C esim.AF172, R*-Et ... ; \ / \ ch2-· —ch2 ch2 —nr* 18 113777

CHo 'CHo NHR

/ \ /

Cjj C + N, N-'karbonyylidi-imidatscsii -> 3 \ / \

CH2 ” "CH2 CH2OH

5 CH2-CH2 NHR * -C»0 / \ / CHa“N C esim. AF17^t R -Et 3 \ / \ ch2-”CH2 ch2—0 10

CH->-CH2 OH

/ \ / CH^-N C * Et2CO^/KOMe/EtOH--> ch2---ch2 conh2 15 CHa-CH? 0-C-0 / \ / CHa-N C (AF169) R -lähtevä ryhmä ——> ^ \ / \

CH2-CH2 C(-0)-NH

20 CH2-CH2 0—-C-0 / \ / CHa-N C esim. AF180. R**Et 3 \ / \

ch2-ch2 C(-0)-NR

• 25 Lähtevä ryhmä R°-(lähtevä ryhmä):ssä voi olla edellä hydratoiineille kuvattu, kuten on R°:n arvo. Substituutioreaktio voidaa toteuttaa pääosin tunnetuissa olosuhteissa.

1 » ’· ' Yhdisteet, joissa 5-osainen rengas on sukkii- 30 ni-imidi, voidaan valmistaa esim. seuraavasti: s · · CH2-CH COOEt *:·* / / \ / ch2 (CH2)2 c ♦ r nh2---> V / / \ • N ,M CHa CHaCOOEt 35 2 2 • · • » * •. * · · 3 - karboe toksi - 3 -karboe t oksime tyyl ikinukl idi ini 113777 19 CH2-CH C(*0)-NR· / / \ / CHn (^2)2 C esim. AF133· R*“He 5 \ / / \ AF134, R*-Et

N-CH2 CH2-OO

Tiatsoliinit voidaan valmistaa esim. näin: /CH2 CH2^ / C_R H* CHi-H C fosforipentasulf idi -—> J \ / \ ch2-ch2 ch2-o

15 CH2-CH2 N — =C-R

/ \ / CH,-N C (F) AF15KS), R-Me 3 \ / \ ch2-ch2 ch2-s 20

Voidaan mainita ohimennen, että yhdistettä: CH2-CH2 S-C-Me

/ \ / I

CH,-N C I

* \ / \ I

25 eH2'— —CH2 ch2 ~n * nimettynä AF150(S), on kuvattu patenttihake-V; muksessamme U.S.S.N. 07/685,397, kun taas kaavan (F) yhdisteitä ei esitetty yksityiskohtaisesti esimerkkei-!, 30 nä tuossa U.S. patenttihakemuksessa. Kuitenkin nyt on hämmästyttävästi havaittu, että kaavan (F) yhdisteet, ;*’ yhdisteen AF151 (S) ollessa esimerkkinä, ovat hämmäs- ·"’> tyttävästi paljon lupaavampia farmakologisesta aktivi- teettinäkökulmasta kuin esimerkkinä olevan AF150(S) . 35 yhdisteiden luokka.

"* ; Imidatsoliinit voidaan valmistaa esim. seu- tili» raavan kaavion mukaan: 20 1 13 7 7 7 CH2-CH2 NH*> / \ / CHo-N C ♦ R(C»NH)0Et ----> 5 \ / \ ch2-ch2 ch2nh2

CH2 CH2 N==C—R CHp-CH? NH——0-R

/ \ / / \ / I

CHfl-N C CHo-N C I

10 \ / \ 3 \ / \ I

1U CH2-CH2 CH2-NH CH2-CH2 CH2-N

(Q) (H) 15 Tässä tapauksessa tuote, esim. AF190, R=Me, voi olla olemassa tautomeerisena rakenteiden (G) ja (H) seoksena.

Keksinnön oksatsolidiinit ja tiatsolidiinit, kuten rakenteet (J) (kuten AF264, R=Me, R=H; AF268, 20 R=H, R°=H; AF266, R=R°=Me) voidaan valmistaa esim. kuten alla on kuvattu.

ai,-CH, NH-CHR' CH2—s CHR

> / \ / „ J

pii .if C CHo-N ® : 25 «T* / \ 3 \ / \ .__ CH,-CH2 0-CHR CH2-°Π2 NR —C-0

Kuvaavasti yhdisteet (J) ja (K) valmistetaan, 30 kun N-metyylipiperidoni saadaan reagoimaan HOCHRCHR'nh2 > » · ;;; tai vastaavasti HSCHRC02H + R°NH2 kanssa.

Seuraavassa yhdisteitä, joissa R ja R° ovat ·;·'· tässä hakemuksessa määritettyjä, mutta ovat kumpikin edullisesti esim. metyyli tai etyyli: 35 * » * * t

» I

113777 21

CH,-CH2 N----- C-R CH,——CH, N===C-R

/ \ / / \ /

CHa-N C CH,-N C

3 \ / \ 3 \ / \ ch2-ch2 ch2-oo ch2-ch2 ch2-c-ch2 AF20O AF210 5

ch2-ch2 N— CH CH,-CH, N- " C-R

/ w / 2 2\ /

CH3-N C CHa-N C

\ / \ . 3 \ / \

CH2-CH2 C(«0)—NR CH2—CH2 C(-0)—NH

10 AF220 AF230 CH2-CH2 »--- CH CH,-CH, NH-C-0 / \ / / \ /

CH,-N C CH,-N C

\ / \ . 3 \ / \ CH2-CH2 0-NR CH2-CH2 0— — NR* 15 AF2i»0 AF250

CH,-CH, NH-C-0 CH,-CH, C(-0)—CHR

/ \ / / \ /

CHt-N c CH,-N C

J \ / \ 3 \ / \ CH,-CH, 0-CHR CH,-CH, 0-C-0 20 AF260 AF270 CH,-CH, N .....- CT1 CH,-CH, S-NR* / \ / / \ /

CH-j-N C CH,-N C

3 \ / \ _ 3 \ / \ ; 25 CH,-CH, CH N CH, CH, CH, Ή) : : AF280 AF290 CH,— CH, 0-NR* CH, CH, 0 NR* / \ / / \ /

CH,-N C CH-a-N C

3 \ / \ 3 \ / \ 30 CH,--CH, CH,-S CH,-CH, CH,—0 AF300 * AF310 CH,-CH, CHOH-NR* CH,-CH, C(-0)—NR* : / \ / / \ /

·'**. CHq-N C CH,-N C

35 \ / \ \ / \

: CH,-CH, NH- C-0 CH,-CH, NH-CHOH

:··· AF320 AF330 113777 22

CH->-CH? N ~Cn CH2-CH2 II "OI

/ \ / / \ /

CH,-N C CHo-H C

3 \ / \ 3 \ / \ 5 ch2-ch2 n =n ch2-ch2 o-—m AF390 AF370

On ymmärrettävä, että koska edellä mainitussa kuvauksessa yhdisteet ovat tuoneet esiin piperidiini-, 10 nortropiini- ja kinuklidiinirenkaat, tässä kuvatulla 5-osaisella spirorenkaalla varustettuja spirokonfigu-raatioon sopiviksi määriteltyjä kaikkia typen hetero-syklisiä renkaita voidaan substituoida niitä varten. Vastaava huomautus sopii käytännön esimerkkeihin, jot-15 ka ovat ainoastaan selittäviä eivät rajoittavia.

Spiroyhdisteet ovat yleensä mahdollisesti käyttökelpoisia ennenaikaisen ja vanhuuden dementian, Alzheimer-tyyppisen vanhuuden dementian (SDAT), poikkeavan Alzheimerin taudin (Perry et ai. Advances in 20 Neurology, R.J.Wurtman et ai., 51:41, 1990), yhdisty neen monivammadementian ja Alzheimerin taudin, ikään liittyvän muistinhuonontumisen (AAMI), akuutin haja-mielisyyssairauksien, tunne- ja huomiokyvyn sairauksien, kiihkomielisyyden, hidasliikkeisyyden, liikaliik-25 kuvuuden, sekoittuneiden Alzheimerin ja Parkinsonin tautien, afasian, aistiharha-vainoharhatilojen, aivo-• tulehduksen jälkeisen muistin menetysoireen, alkoholin vieroitusoireiden, Huntingtonin tanssitaudin, Pickin taudin, Friedrickin ataksian, Gilles de la Tourette 30 vaivan ja Downin syndrooman hoitamiseen, koska kaikki _ ·/ näistä sairaustiloista ovat häiriöitä, joihin keskus- t kolinerginen vajaatoiminta on ollut osallisena ainakin ’*' · jossain määrin. Nämä yhdisteet ovat lisäksi mahdolli-

* » I

sesti käyttökelpoisia etenevän aivotumakkeiden yläpuo-: 35 lisen halvaantumisen hoitamiseen; ne ovat myös mahdol- ! lisesti puuduttavia aineita ja siten voivat olla käyt tökelpoisia ankarien kiputilojen hoitoon, kuten reuma- 113777 23 tismi, niveltulehdus ja terminaalivaiheen sairaus.

Kuten edellä on lyhyesti käynyt ilmi, spiro-yhdisteitä voidaan käyttää yhdessä ainakin yhden farmakologisesti aktiivisen lisäyhdisteen kanssa, esim.

5 asetyylikolinesteraasi-inhibiittien, kuten fysostig- miini tai tetrahydroaminoakridiini; yhdessä asetyyli-koliinin esimuotojen kanssa, kuten koliini tai lesitiini; lisäksi uustrooppisiin rohtoihin, kuten pi-rasetaami, aniasetaami, oksirasetaami tai prami-10 rasetaami; lisäksi yhdisteisiin, jotka ovat vuorovaikutuksessa Ca2+-kanavien kanssa, kuten 4-aminopyridiini tai 3,4-diaminopyridiini; tai lisäksi peptideihin, joilla voi olla moduloivia vaikutuksia asetyylikolii-nin vapautumiseen, kuten somastostätiini; yhdessä 15 oheisen antimuskariinisen aineen kanssa (kuten pirent-sepiini, N-metyyliatropiini, N-butyyliskopolamiini, propanteliini, metanteliini, glykopyrrolaatti tai tro-penzilium) oheisten vastareaktioiden, kuten syljeneritys, ripuli, mahaeritys tai oksentaminen, estämiseksi, 20 joita saattaisi odottaa suurilla annoksilla, tai yh dessä ihon läpiannettavien skopolamiinin, kuten Scopo-derm(R), kanssa pahoinvoinnin ja/tai oksentamisen es-/· tämiseksi; Yhdessä masennuslääkkeiden, kuten nortrip- : : tyliini, amitriptyliini, imipramiini, minapriini, jos- 25 kus S DAT, AAMI, sekoittuneeseen SDAT/Parkinsonin tau- tiin liittyviin sekä havaittavien vaurioiden että dep-

• I I

. ressiivisten oireiden lievittämiseksi; yhdessä M2- • · · !!'. antimuskariinisten lääkeaineiden kanssa, joiden saat- • · * ‘ taisi odottaa yhdisteiden suurina annoksina neutraloi- 30 van tällaisten agonistien hillitseviä vaikutuksia M2- ·*.: tyyppisissä esi- ja jälkisynaptisissa hillitsevissä • * t ·...· keskusreseptoreissa ja mahdollistavan asetyylikoliinin vapautumisen M2 tyyppisten hillitsevien autoresepto-,···, reiden inhiboinnin kautta eheissä päätteissä; yhdessä 35 nikotiinia sisältävien agonistien kanssa, kuten niko- : tiini, sekä nikotiinia että muskariinia sisältävien ':"ί reseptoreiden virkistämiseksi aivoissa; yhdessä ad- 113777 24 renergisen agonistin (klonidiini tai guanfamisiini) kanssa sekoitettuun kolinergis/noradrenergiseen puutokseen SDAT:ssa liittyvien sekä havaittavien että muiden vaurioiden lieventämiseksi; yhdessä hermosero-5 toniinin uudelleen talteenottoinhibiittien, kuten ala-proklaatti ja zimelidiini, kanssa sekä havaittavien että muiden emotionaalisten toimintojen lievittämiseksi SDAT:ssa; yhdessä monoamiinioksidaasi-B inhibiitti-en, kuten deprenyylin, kanssa sekoitettuihin olomuo-10 töihin, kuten SATD/PD, liittyvien sekä havaittavien että muiden motoristen vaurioiden lievittämiseksi; yhdessä hermon kasvutekijän kanssa (NGF, joka annetaan joko nenäsuihkeena tai aivokammionsisäisesti).

Spiroyhdisteet edellä mainittujen aktiivisten 15 lisäaineiden kanssa tai ilman niitä voidaan antaa esim. ruiskeen avulla sopivassa ohennus- tai kantoai-neessa, suun kautta, peräsuolen kautta peräpuikkojen muodossa, sisäänpuhalluksen tai nenäsuihkeen avulla, ruiskeena eli ihon läpi sopivassa väliaineessa fysos-20 tigmiinin tai terahydroaminoakridiinin kanssa tai il man sitä.

Näistä spiroyhdisteistä saattaa myös olla : v hyötyä hoidettaessa lievän paikallisen vaikutuksen : omaavan pitkävaikutteisen kolinergisen aineen käyttöä 25 vaativia sairauksia. Tällaista ainetta tarvitaan sai rauksissa, kuten viherkaihissa, koska yhdistettä ei , ·. tuhoa entsyymi, joka deaktivoi asetyylikoliinin, s.o.

asetyyli- ja butyryylikoliiniesteraasin, ja voidaan « · käyttää myös kolinergisten oheissairauksien, kuten ko-30 konaisvaltäisen lihasheikkouden ja virtsarakon toimin-···· tahäiriöiden, Adin taudin ja Eaton-Lambertin taudin hoitamiseen. Näitä yhdisteitä saatettaisiin käyttää myös häiriöihin, joissa kolinerginen vajaa-.···, aktiviteetti aiheutuu lääkeaineista.

35 Näiden spiroyhdisreiden ollessa antikoliner- : gisia aineita (jotka alan asiantuntija voi helposti : määrittää) niitä voidaan mahdollisesti käyttää ko- 113777 25 linergisesta liikatoiminnasta johtuvien sairauksien hoitoon tämän ollessa spontaania tai lääkeaineesta aiheutuvaa. Lisäksi näillä yhdisteillä on mahdollista käyttöä erilaisten tautien, kuten PD, vale-PD, sekoit-5 tunut AD/PD, ensiasteen lihasjänteyden häiriöt, spastinen kierokaulaisuus, päänpuoleinen lihasjänteyden häiriö, depressio, liikuntasairaus, istumispelko (jännitystä laukaisevan palauttamisen jälkeen), keskuslii-kajänteisyys, ihmisen päävammat, sekoittunut hidas-10 liikkeisyyshäiriö ja PD, maanis-depressio, hoidossa, yhdistelminä kirurgiassa atropiinin, skopolamiinin j.n.e asemesta, asetyylikoliiniesteraasin ehkäisemisen kaltaisesta asetyylikoliinin yliannostuksesta johtuvassa myrkytyksessä. Näitä voidaan käyttää myös silmä-15 lääketieteessä, kun tarvitaan joko pitkä- tai lyhytaikaista mustuaislaajentumaa.

Spiroyhdisteitä voidaan käyttää myös mahdollisesti sairauden hoitoon, joka tunnetaan liiallisesta oheisaktiviteetista, kuten astma, krooninen ahtauttava 20 keuhkotauti, itsesulatushaavaumatauti. Näihin oheis-sairauksiin suositellaan erityisesti käytettäväksi kvaternaarisia suoloja keksinnön yhdisteistä.

: ' ' Kvaternaarisia ammoniumsuoloja käytetään laa- : ·’: jasti nykyajan hoidossa. Siten esimerkkejä tällaisista ; . ) 25 kolinergisista agonisteista ovat asetyylikoliiniklori- , *. di, betaanikolkloridi ja karbakoli (ks. esim. Goodman & Gilman's "The Phamacological Basis of Therapeutics", 7. painos, MacMillan Publishing Co., 1985, s. 104).

‘ ’ Kvaternaarisia antikolinesteraasi aineita ovat esim.

30 neostigmiinibromidi, ambenoniumkloridi, pyridostig-; miinibromidi, edrofoniumkloridi, demecariumbromidi ja ;1(.: echotifaatti jodidi; pralidoksiimikloridia käytetään kolinesteraasin uudelleen aktivaattorina (ks. Goodman & Gilman, edellä mainittu julkaisu, s. 122-123).

» · ’I' 35 Kvaternaariset belladonna alkaloidien johdan- » · ·,; * naisia, esim. metskopolamiinibromidi ja homatro- piinimetyylibromidi, ja synteettisiä kvaternaarisia 113777 26 yhdisteitä, esim. metanteliinibromidi ja propantelii-nibromidi, käytetään maha/suolivaurioiden hoidossa (ks. Goodman & Gilman, edellä mainittu julkaisu, s. 139-140).

5 Alfred Burgerin Medicinal Chemistry1ssä, 2.

painos, Interscience Publishers, 1960, s. 497, on mainittu ennustus, että kvaternaariset ammoniumyhdisteet, huolimatta niiden kemiallisesta rakenteesta, tuottavat curare-tyyppisen halvauksen ja tämän ennusteen myöhem-10 män vahvistuksen. Tätä kvaternaaristen yhdisteiden ominaisuutta käytetään hyväksi nukutuksessa, esim. apuaineena kirurgisessa nukutuksessa lihaksiston rentoutuksen aikaansaamiseksi (ks. Goodman & Gilman, edellä mainitun julkaisun kappaleessa 11 otsakkeen 15 "Neuromuscular Blocking Agents" alla, s. 222-235).

Tämä sekä hermoa että lihasta koskeva kvaternaaristen yhdisteiden edellä mainittu estovaikutus ei ole estänyt kehitystä eikä kvaternaaristen yhdisteiden kliinistä käyttöä lääketieteessä tulevina vuo-20 sinä. Alan asiantuntijat olisivat tietoisia, että monet seikat vaikuttavat kliinisessä hoidossa käytettävän yhdisteen valintaan (mukaanlukien kvaternaarinen .· yhdiste), esim. teho aiottuun tarkoitukseen, turvalli- • *t: suus, mahdolliset sivuvaikutukset ja terapeuttinen in- : 25 deksi. Taitava vastaanottaja ymmärtäisi siten hyvin miten tulkita ilmausta -farmaseuttisesti hyväksyttäviä . *. kvaternaarisia yhdisteitä, jotka ovat rakenteellisesti peräisin keksinnön mukaisista yhdisteistä, joissa on tertiäärinen typpiatomi, kun tätä ilmausta käytetään 30 tässä patenttimäärityksessä ja patenttivaatimuksissa = · : alalla käytettävissä olevan asiaan kuuluvan osaamisen valossa.

•| Keksintöä kuvataan nyt seuraavien ei- ", rajoittavien esimerkkien avulla.

. 35 t t · : Esimerkki 1: l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5' - (3 '-etyylihydantoiini) AF160 113777 27 a) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51-hydantoiini l-Metyylipiperidiini-4-onin (36,44 g, 0,322 moolia) liuoksen etanolissa (150 ml), ammoniumkar-bonaatin (93,0 g, 0,968 moolia) liuoksen vedessä (400 5 ml) ja kaliumsyanidin (25,8 g, 0,396 moolia) liuoksen vedessä (82 ml) seos lämmitettiin 60°C:ssa 2,5 tunnin ajan ja jätettiin sitten yön yli huoneenlämpötilaan. Saostunut l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-hydantoiini suodatettiin ja pestiin pienellä määrällä kylmää vet-10 tä, etanolia ja eetteriä antaen kiteisen jauheen (27,0 g); Suodoksen pitoisuus ja pesunesteet antoivat toisen saannon (20,0 g). Tuote kiteytettiin metanolista sulamispisteen ollessa 265-276°C.

IR (KBr) 3170 (NH) ; 1700 (C=0) cm'1.

15 Massaspektri m/e 183 (M+, 38%); 71 (100%), 1H-NMR (D20) 1,8 (2H) ; 2,06 (sextet, 2H) ; 2,49 (s, - CH3) ; 2,58 (t, 2H) ; 3,14 (t, 1H) ; 3,20 (t, 1H) ppm.

b) 4-amino-1-metyylipiperidiini-4-karboksyylihappo l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-hydantoiinia 20 (9,75 g, 0,0533 moolia) ja bariumhydroksidioktahyd- raattia (28,8 g, 0,0913 moolia) vedessä (150 ml) lämmitettiin kolvissa 160°C:ssa 3 tunnin ajan. Neljän tällaisen panoksen sisältö yhdistettiin ja saostunut i '· bariumkarbonaatti suodatettiin pois. Suodos neutraloi- ; 25 tiin kiinteällä C02:lla ja saostuma poistettiin suo- ; dattamalla. Suodoksen pitoisuus antoi 4-amino-1- , ·. metyylipiperidiini-4-karboksyylihappoa (32,0 g, 95 %) < · , sulamispisteen ollessa 275-280 °C.

IR (KBr) 3300, 1655, 1580 cm'1.

30 MS m/e 158 (M+, 90 %) ; 141 (98 %, M-OH) ) ; 113 (12 %, M- * ; C02H) ; 96 (100 %) ; 71 (52 %) .

: 1H-NMR (C5D5N+D20) 1,2 (m, 2H) ; 1,48 (s, CH3N-) ; 1,7 (m, ·:··· 2H) ; 1,9 (m, 2H) ; 2,0 (m, 2H) ppm.

c) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(31-etyylihydanto-35 iini) , AF160 I i · :··’ ·* l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5 1-hydantoiinin *’ · (5 g, 27 mmoolia) ja kai iumhydroks idin (2,08 g, 37 113777 28 nmoolia) seokseen lisättiin 100 ml absoluuttisessa etanolietyylibromidissa (15 g, 137 mmoolia). Seosta lämmitettiin 80°C:ssa ja näytteet otettiin 0,5 tunnin väliajoin ja tutkittiin kaasu-nestekromatografin avul-5 la (GLC) sisäiseen standardiin (difenyylimetaani) vertaamalla. Emäksisyyttä valvottiin titraamalla (HCl IN) kaiiumhydroksidin (kokonaismäärä 2,1 g) lisäyksen jälkeen. Maksimisaannon saamisen jälkeen (2,5 t) liuosta haihdutettiin, lisättiin (50 ml) vettä ja vesiliuosta 10 ekstrahoitiin kloroformilla ja erotettiin kromatogra- fisesti silikageelikolonnilla käyttäen klorofor- mi/metanoli/ammoniakin vesiliuosta (80:20:1) eluointi-järjestelmänä. Tuote liuotettiin eetteriin ja saostet-tiin suolahapon suolana lisäämällä HCl:a isopro-15 panolissa, sulamispisteen ollessa 278-280 °C.

MS m/e 211 (M+, 45 %) ; 71 (100 %) .

1H-NMR (liikkuva kantoaine, CDC13) . 1,2 (t,J=6Hz, 3H); 1,6-1,7 (m, 2H) ; 1,9-1,95 (m, 2H) ; 2,1-2,2 (m, 2H) ; 2,34 (S, 3H); 2,85-2,95 (m, 2H); 3,5 (q,J=6Hz, 2H); 20 1H-NMR (HCl-suola, D20) 1,1 (t,J=6Hz, 3H) ; 1,95-2,05 (m, 2H) ; 2,2-2,3 (m, 2H) ; 2,85 (S, 3H) ; 3,0-3,2 (m, 2H) ; 3,4-3,5 (m, 2H)/ 3,5 (q,J=6Hz, 2H) ppm.

13C-NMR (liikkuva kantoaine, CDC13) 14,0; 33,0; 33,1; 46,0; 52,8; 59,9; 157,0; 177,0 ppm.

, : 25 UV (liikkuva kantoaine, H20) Xmax 208 nm (ε 3500) .

* * t · ! Esimerkki 2: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- ; ; 51 -(1'-asetyylihydantoiini) AF164 * « ‘ a) AF164A. l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51-hydanto- 30 iinin (3,25 g) seosta etikkahappoanhydridissä (50 ml) lämmitettiin palautusjäähdyttäjällä varustetussa kol-vissa 3 tunnin ajan. Ylimääräinen reagenssi poistet-: tiin alipaineessa jättäen jäljelle kiinteän aineen, ,···, joka dispergoitiin eetteriin ja suodatettiin antaen 35 metanoli-diklorometaanista kiteytettyä valkoista kiin- : teää ainetta (3,75 g) AF164A sulamispisteen ollessa 250-254°C.

113777 29 ^-NMR (D20) 1,89 (m, 2H) ; 2,44 (s, CH3CO-); 2,85 (s, CH3N-) ; 2,98 (m, 2H); 3,41 (m, 2H); 3,67 (m, 2H) ppm. 13C-NMR (D20, dioksaani sisäisenä standardina)) 26,6 (C3 & C5) ; 26,9 (CH3CO-) ; 43,8 (CH3N-); 51,4 (C2 & C6) ; 5 62,0 (C4); 67,3 (dioksaani); 166,0 (C2') ; 173,8 (CH3CO- ); 189,2 (CV) ppm.

MS m/e 225 (M+) ; 210; 166; 155; 123; 95; 71 (100 %) ; 70.

10 b) AF164B. Osa AF164A:sta (1,10 g) tehtiin emäksiseksi kyllästetyllä Na2C03-vesiliuoksella ja ekstrahoitiin metanoli-dilkoorimetaanin seoksella, uutetta haidutet-tiin ja jäännös ekstrahoitiin jälleen samalla liuotin-seoksella, uute suodatettiin ja suodosta haihdutettiin 15 ja jäännös (1,0 g) jauhettiin asetonilla antaen valkoisen kiinteän aineen AF164B sulamispisteen ollessa 225-230°C. (kiteytettiin CH2Cl2-CH3OH-CH3CN:sta) .

1H-NMR (D20) 1,53 (m, 2H) ; 2,21 (s, CH3CO-) ; 2,39 (s, CH3N-); 2,65-2,80 (m, 6H) ppm.

20 13C-NMR (D20, dioksaani sisäisenä standardina) 26,9 (CH3CO-); 28,3 (C3 & C5) ; 45,0 (CH3N-); 59,9 (C2 & C6) ; 64,9 (C4) ; 67,3 (dioksaani); 168,8 (C2') ; 173,6 1 (CH3CO-); 193,9 (C4·) ppm.

I /* MS m/e 225 (M+) ; 183 (M+ - CH2=C=0) ; 166; 154; 123; 95; : : 25 71 (100 %).

: c) AF164 (HCl:n suola). AF164:n HCl-suola valmistet- . tiin käsittelemällä AF164A:n tai AF164B:n liuosta me- tanolissa isopropanoliin liuotetulla HC1 kunnes pH oli • » » hapan (pH 1-2). Suola, AF164 (HCl-suola), saostettiin , 30 pienen ajan kuluttua valkoisena kiinteänä aineena su- * · » ·;;; lamispisteen ollessa 301-302°C.

*·;·’ ^-NMR (D20) 2,17 (m, 2H) ; 2,50 (s, CH3CO-); 2,93 (s, CH3N-); 3,10 (m, 2H) ; 3,48-3,71 (m, 4H) ppm.

13C-NMR (D20, dioksaani sisäisenä standardina); 26,7 35 (C3 & C5) ; 26,9 (CH3CO-); 43,9, (CH3N-); 51,1 (C2 & C6) ; ; 61,8 (C4) ; 67,3 (dioksaani); 154,8 (C2'); 173,4 (CH3CO- * : ); 176,0 (C4') ppm.

30 113 7 7 7 AF164:n hydrolyysi AF164A ja AF164B hydrolysoitiin refluksoimal-la 0,2-N NaOH vesiliuoksessa (1-2 t) 1-5 metyylipiperidiini-4-spiro-5'-hydantoiinin saamiseksi, tunnistettuna vertaamalla sen TLC ja 1H-NMR oikeaan näytteeseen.

Esimerkki 3 : Piperidiini-4-spiro-51 -(31-etyy- 10 lihydantoiini) AF160 (Des)

Kuivatun AF160 (2,0 g, 9,5 mmoolia) liuokseen dikloorietaanissa (25 ml, kuivattuna molekyyliseulalla) lisättiin a-kloroetyylikloroformaattia (1,0 ml, 9,3 mmoolia) huoneenlämpötilassa ja seos lämmitettiin 15 60°C:een 1 tunnin ajaksi. Dikloroetaani poistettiin tyhjössä, saatu kiinteä aine liuoettiin 20 ml me-tanolia ja liuosta lämmitettiin toiset 30 minuuttia 60°C:ssa. Sitten metanoli poistettiin tyhjössä ja saatu öljymäinen kiinteä aine liuotettiin natriumkar-20 bonaatin vesiliuokseen ja pestiin eetterillä. Vesiker-rosta uutettiin kloroformilla ja uutosta haihdutettiin raakaöljyn tuottamiseksi, joka puhdistettiin edelleen -,pylväskromatografisesti silikageelikolonnilla. Eluoin-: ti kloroformilla, metanolilla, ammoniakin vesiliuok- : · 25 sella (4:1:0,1) antoi AF160 (Des) (1,12 g, saanto 60 t %) valkoisen jauheen sulamispisteen ollessa 225-227°C.

, ·. MS m/e 197 (M+ kantoainepiikki) ; 57 ^-NMR (CDC13) 1,17 (t, J=6Hz, 3H) ; 1,65-1,7 (m, 2H) ; 1,85-2,0 (m, 2H) ; 2,75-2,85 (m, 2H) ; 3,05-3,15 (m, 30 2H); 3,5 (q, J=6Hz, 2H) ppm.

Esimerkki 4 : l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51- (3 1 -metyylihydantoiini) AF178 l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5' -hydantoiinin * · 35 (5,0 g, 27,3 mmoolia) ja natriumhydroksidin (2,0 g, 50 » s : mmoolia) seokseen 120 ml metanolia lisättiin metyyli- tosylaattia (11,2 g, 60 mmoolia) . Reaktioseosta sekoi- 113777 31 tettiin yön yli huoneenlämpötilassa, metanoli poistettiin haihduttamalla ja öljymäinen jäännös liuotettiin kaliumkarbonaatin vesiliuokseen ja ekstrahoitiin kolo-roformilla. Orgaaninen uutosta haihdutettiin ja saatu 5 raakatuote puhdistettiin edelleen pylväskromatografi-sesti silikalla ja eluoitiin klorofor- mi/metanoli/ammoniakin vesiliuoksella (9:1:0,1) antaen saannoksi 1,2 g (22 %) valkoista kiinteää ainetta sulamispisteen ollessa 229-231°C.

10 MS m/e 197 (M+, 30 %) ; 71 (100 %) .

1H-NMR (liikkuva kantoaine, CDCI3) 1,6-1,7 (m, 2H) ; 2,1-2,3 (m, 4H); 2,34 (s, 3H); 2,85-2,95 (m, 2H); 3,02 (s, 3H) ppm.

15 Esimerkki 5: Piperidiini-4-spiro-5'-(3-metyy- lihydantoiini) AF179

Valkoinen jauhemainen tuote, joka saatiin samalla tavalla kuin esimerkissä 3, liuotettiin isopro-panoliin ja tehtiin happameksi käyttäen suolahappoa 20 tuottaen valkoisen saostuman sulamispisteen ollessa 320°C:n yläpuolella.

MS m/e 183 (M+, kantoainepiikki); 57.

: ^-NMR (HCl-suola, D20) ; 2,0 (m, 2H) ; 2,2 (m, 2H) ; 2,96 : (s, 3H) ; 3,3 (m, 2H) ; 3,6 (s, 2H) .

: I 25 , Esimerkki 6: l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 - (3'-prpargyylihydantoiini)n synteesi AF185 ; KOH:n (11 g, 0,1 moolia; 35 p% dispersio mi- • ‘ neraaliöljyssä) ja l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'- 30 hydantoiinin (kuivattu P205:n päällä, 25 g, 0,13 moo- lia) suspensiota sekoitettiin huoneenlämpötilassa kui-:>f>: vatussa DMF:ssä (500 ml) . Lisättiin propargyyliklori- dia (15 g, 0,2 moolia) ja reaktioseos lämmitettiin 50 • » °C 20 minuutin ajaksi. Seos jäähdytettiin ja tehtiin 35 happamaksi pH-arvoon 3 (suolahapon vesiliuoksella) ja t e \] \ DMF poistettiin ekstrahoimalla petrolieetterin- :··: eetterin 1:1 seoksella ja sitten eetterillä. Vesifaasi 113777 32 tehtiin emäksiseksi pH 10 natriumkarbonaatilla ja ekstrahoitiin 2 kertaa kloroformilla. Kloroformiuutteet yhdistettiin, kuivattiin ja haihdutettiin antaen saannoksi raakaöljyn (27 g) , joka erotettiin kromato-5 grafisesti silikageelikolonnilla. Eluointi klorofor-mi/metanoli/ ammoniakilla (80:19:1) antoi 3,0 g puhdasta AF185 ja useita vähäisiä epäpuhtauksia sisältäviä jakeita (kokonaismäärä 10 g). Liikkuva kantoaine saostettiin HCl:n suolana; 3,2 g valkoista ei-10 hygroskooppista suolaa saatiin aikaan kiteyttämällä metanolista.

hl-NMR (D20, HC1-suola) 6 2,0-2,35 (m, 4H) ; 2,64 (t, 1H, J=3,5Hz) ; 2,91 (s, CH3N-) ; 3,1-3,2 (m, 2H) ; 3,5-3,7 (m, 2H); 4,27 (bs, 2H) ppm.

15 ^H-NMR (D20 Ylimäärä natriumkarbonaattia) δ 1,65-1,75 (m, 2H) ; 1,9-2,05 (m, 2H) ; 2,25 (s, CH3N-) ; 2,2-2,3 (m, 4H); 2,8-2,9 (m, 4H); 4,25 (bs, 2H) ppm.

^H-NMR (CDC13, liikkuva emäs) δ 1,85-1,95 (m, 4H) ; 2,2 (m, 2H) ; 2,23 (t, 1H, J=3,5Hz); 2,4 (s, CH3N-) ; 2,9- 20 2,95 (m, 2H); 4,3 (d, 2H, J=3,5Hz); 6,4 (bs, 1H) ppm.

MS m/e 221 (M+, kantoainepiikki) ; 206 (M-15) ; 149.

*

Esimerkki 7 : l-Metyylipiperidiini-4-spiro-41 -; (2 1,5 ' -bis (metyylitio) -4 1 H-imidatsoli) AF177 25 l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(2',4'-ditio- . hydantoiini)n (1,00 g, 4,65 mmoolia; ks. esimerkki 11) , liuokseen metanolissa (15 ml) lisättiin NaOH (0,30 g, t 7,50 mmoolia) ja sitten vähitellen metyylijodidia > » (1,00 g, 7,04 mmoolia) metanolissa (3,0 ml) ja sitten 30 seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1,5 tunnin ·-·· ajan. Saostunut NaBr suodatettiin ja pestiin me- tanolilla. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja pois-: tettiin liuotin; jäännös tehtiin emäksiseksi K2Co3- ,··>, vesiliuoksella ja ekstrahoitiin eetterillä. Orgaaninen ’’ 35 uute kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin antaen i jäännöksen, joka erotettiin kromatografisesti silika- geelikolonnilla. Eluointi 78:18:3:1 liuotinseoksella 113777 33 eetteri/kloroformi/ metanoli/ammoniakki(vesi) antoi heksaanista kiteytyksen jälkeen (465 mg) AF177 sulamispisteen ollessa 101-102°C.

1H-NMR (CDC13) 1,33 (m, 2H) ; 1,98 (m, 2H) ; 2,39 (s, 5 CH3N-) ; 2,56 (s, CH3S-) ; 2,59 (s, CH3S-); 2,48-2,64 (m, 2H); 2,82 (m, 2H) ppm.

13C-NMR (CDCI3) ; 14,1 (CH3S-) ; 14,2 (CH3S-); 34,9 (C3 & C5) ; 46,1 (CDCI3) ; 52,2 (C2 & Ce) ; 83,0 (C4) ; 171,6 (C21) ; 203,5 (C5') ppm.

10 MS m/e 244 (M+ +1); 185; 149; 93; 75.

IR (KBr) 2920; 2797; 1535; 1477; 1465; 1452; 1378; 1316; 1286; 1210; 1108; 1054; 1000; 965; 942; 900; 776; 696 cm'1.

UV (EtOH) Xmax 257 nm (ε 16100).

15

Esimerkki 8: l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(31-etyyli-41-tiohydantoiini) AF182 1-Metyylipipe-ridiini-4-spiro-4'-(11-etyyli-2'-etyylitio-2'-imidat-soliini-5'-tioni-näyte AF170 (100 mg; ks. esimerkki 20 12) liuotettiin 20% HCl (1 ml) ja liuosta refluksoi- tiin 1,5 tunnin ajan. Reaktioseos tehtiin emäksiseksi konsentroidulla NaOH-liuoksella pH-arvoon 14 ja ekst-rahoitiin sitten dikloorometaanilla. Orgaaninen uute Ί kuivattiin (Na2S04) ja liuosta haihdutettiin antaen j 25 petrolieetteri-dikloorimetaanista kiteytettyä 1- . metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(3'-etyyli-4'-tiohydan- , toiini)a valkeana kiinteänä aineena (74 mg) sulamis pisteen ollessa 176-178°C.

1H-NMR (CDCI3) 1,25 (t, J=7,2Hz, CH3CH2-); 1,54 (m, 30 2H); 2,10 (m, 2H); 2,36 (s, CH3N-); 2,41 (m, 2H); 2,96 (m, 2H) ; 3,94 (q, J=7,2Hz, -CH2CH3) ; 7,23 (NH) ppm.

; 13C-NMR (CDCI3) ; 11,8 (CH3CH2-); 36,9 (C3 & C5) ; 37,4 (- , j CH2CH3) ; 46,1 (CH3N-) ; 51,2 (C2 & C6) ; 68,1 (C4) ; 157,1 (C2·); 208,1 (C4') ppm.

* 1 35 MS m/e 227 (M+) ; 221 (M+ -O); 194 (M+ -SH); 170 (M+ - :.ί I C3H7N) ; 71; 70 (100 %) .

UV (EtOH) Xmax 280 nm (ε 13600), 229 nm (ε 4400).

113777 34

Esimerkki 9: l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 - (4'-metyylitio-31-imidatsoliini-2'-tioni) AF183

Toistettaessa esimerkki 7, mutta käyttäen yh-5 tä suuria määriä metyylijodidia, natriumhydroksidia ja ditiohydantoiinia, saatiin bis-(metyylitio)johdannaisen AF177 lisäksi l-metyylipiperidiini-4-spiro-5i_(4i-metyylitio-31-imidatsoliini-21-tioni AF183 (CH2Cl2-asetonista) sulamispisteen ollessa 218-220°C.

10 ^-NMR (CDC13) 1,74 (m, 2H) ; 2,07 (m, 2H) ; 2,37 (m, 2H) ; 2,39 (s, CH3N-); 2,69 (s, CH3S-); 2,95 (m, 2H) ; 10,3 (brs, -NH-) ppm.

MS m/e 229 (M+) ; 182 (M+ -CH3S) ; 123; 122; 70.

UV (EtOH) λτη&χ. 312 nm (ε 12000) , 280 nm (ε 15300) .

15

Esimerkki 10: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 51-(31-etyyli-21,4'-ditiohydantoiini) AF163

Jauhemaiset l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(31-etyylihydantoiioni) (0,570 g) ja fosforipentasul-20 fidi (0,570 g) sekoitettiin hyvin ja refluksoitiin tetraliinissa (15 ml) 2 tunnin ajan. Reaktioseoksen annettua jäähtyä huoneenlämpötilaan, oli muodostunut .· ruskea kova saostuma; tetraliini poistettiin alipai- • ·’ neessa ja saostuma hienonnettiin ja pestiin petroli- ; : 25 eetterillä. Se tehtiin emäksiseksi konsentroidulla

NaOH-vesiliuoksella ja ekstrahoitiin dikloorimetaanil-... la. Uute kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin antaen jäännöksen (0,250 g), joka erotettiin kromatografieesti silikageelikolonnilla (Merck, 60,15 g). Eluointi 30 77:18:4:1 seoksella kloroformi/eetteri/metanoli/ammo- ·;·· niakki(vesi) antoi puhdasta CH2CL2-eetteristä kiteytet- *...· tyä AF163 (50 mg) sulamispisteen ollessa 223-225°C.

^-NMR (CDC13) 1,27 (t, J=7,2Hz, CH3CH2-) ; 1,55-1,67 (m, 2H) ; 2,03-2,19 (m, 2H) ; 2,26-2,46 (m, 2H) ; 2,36 • · 35 (s, CH3N-) ; 2,89-3,04 (m, 2H) ; 4,27 (q, J=7,2Hz, - : CH2CH3) ; 8,25 (brs, -NH-) ppm.

13C-NMR (DMSO-d6) 11,6 (CH3CH2-) ; 36,9 (C3 & C5) ; 39,9 113777 35 (-CH2CH3) ; 45,9 (CH3N-); 49,9 (C2 & C6) ; 72,9 (C4) ; 179,8 (C2 *) ; 207,8 (C4') ppm.

MS m/e 243 (M+) ; 186 (M+ -C3H7N) ; 149; 71; 70 (100 %) ; 57.

5 IR (KBr) 3177(NH); 2930; 2778; 1513; 1434; 1357; 1231; 1116; 1090; 1070; 1040; 961; 801; 780; 626; 546; 457 cm"1.

UV (EtOH) λπ^χ 302 nm (ε 34200), 226 nm (ε 7700) . AF163:n tartraattisuolan synteesi 10 Liikkuvan AF163-kantoaineen (0,735 g, 3,025 mmoolia) liuokseen metyylikloridissa (15 ml) - me-tanolisssa (5 ml) lisättiin L(+)viinihapon (0,214 g, 1,427 mmoolia) liuosta metanolissa (2,0 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 0,5 tunnin ajan, sit-15 ten liuottimet haihdutettiin ja jäännös dispergoitiin eetteri-metyleenikloridiin, suodatettiin ja pestiin samalla liuotinseoksella antaen keltaisnen kiinteän aineen AF163(tartraatti) (0,923 g, saanto 96 %) sulamispisteen ollessa 221-225°C.

20 ^-NMR (D20) 1,27 (t, J=7,2Hz, CH3CH2-) ; 2,08 (m, 2H) ; 2,49 (m, 2H) ; 3,01 (s, CH3N-); 3,31 (m, 2H) ; 3,76 (m, 2H) ; 4,26 (q, J=7,2Hz, -CH2CH3) ; 4,37 (s, -CHOH) ppm.

Esimerkki 11: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 25 5 1 - (2 1,4 '-ditiohydantoiini) AF173 1-Metyylipiperidonin (29,35 g, 0,260 moolia), . KCN:n (26,57 g, 0,408 moolia), NH4Cl:n (21,00 g, 0,393 moolia) ja CS2:n (26 ml) liuos etanoli-(200 ml) vedes-sä (50 ml) lämmitettiin palautusjäähdytyksen alaisena 30 (50-55°C) 8 tunnin ajan. Reaktioseosa jätettiin huo- ;; neenlämpötilaan yön yli ja saatu saostuma suodatettiin ·>** ja pestiin vedellä ja sitten etanolilla antaen kel- ;··; taisnen kiinteän aineen (26,3 g; saanto 47,0 %) sula- mispisteen ollessa 250-253°C, sulamispisteen ollessa , ·, 35 metanolista kiteytettynä 252-254°C.

^-NMR (DMSO-d6) 1,43-1,56 (m, 2H) ; 1,89-2,05 (m, 2H) ; 2,21 (s, CH3N-) ; 2,26-2,40 (m, 2H) ; 2,64-2,79 (m, 2H) ; 113777 36 11,14 (br.s, -NH-) ppm.

13C-NMR (DMS0-d6) 36,2 (C3 & C5) ; 45,5 (CH3N-) ; 49,9 (C2 & C6) ; 74,8 (C4) ; 181,5 (C2 ’ ) ; 212,0 (C4') ppm.

MS m/e 215 (M+ ); 183 (M+ -S) ; 182 (M+ -SH) ; 181; 158 5 (M+ -C3H7N) ; 123; 102; 77; 70 (100 %) .

IR (KBr) 3130 (NH) ; 1484; 1350; 1295; 1231; 1198; 1176; 1145; 1083; 1062; 957; 721; 545; 504 cm'1.

UV (0,01-N HCl) Xmax 298 nm (ε 32000), 220 nm (ε 8000).

10 Esimerkki 12; l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'- (3'-etyyli-2',4'-ditiohydantoiini) AF163; 1-metyy-lipiperidiini-4-spiro-5'-(4'-etyylitio-3'-imidatsolii-ni-2'-tioni) AF176; l-metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(11-etyyli-2'-etyylitio-21-imidatsoliini-5'-tioni) 15 AF170 l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2',4'-ditiohydantoiini) n AF173 (3,30 g, 15,3 mmoolia) suspensioon kuivassa DMF:ssa (30 ml) lisättiin NaOH (0,760 g 60 % mineraaliöljyssä, 19,0 mmoolia) ja seosta sekoitettiin 20 50°C:ssa 1,5 tunnin ajan. EtBr:n (1,85 g, 17,0 mmoolia) liuosta DMF:ssa (6 ml) lisättiin vähitellen edellä olevaan seokseen ja sitä sekoitettiin 75-80°C:ssa 4 v tunnin ajan. Seistyään huoneenlämpötilassa yön yli muodostunut saostuma (NaBr) suodatettiin ja pestiin j 25 eetterillä. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja haihdutettiin antaen öljyn, josta erotettiin diklooro-, ·. metaaniin liukenematon kiinteä aine (1,5 g), jonka ha- _ valttiin olevan lähtöaine (sama NMR ja TLC) . Jäännös erotettiin kromatografisesti silikageelikolonnilla. 30 Eluointi liuotinseoksella eetteri/ kloroformi/ metano- « « · li/ammoniakki (vesi) 68:27:4:1 antoi ensimmäisen 1-*...· metyylipiperidiini-4-spiro-51 - (3 ' -etyyli-2 ', 4 ' -ditio- ;··; hydantoiini) n AF163 (0,95 g), samanlaisen tuotteen, joka saatiin aikaisemmin AF160:n reaktiosta P2S5:n • » ·[ 35 kanssa. Eluointia jatkettiin antaen 1-metyyli- • » · · piperidiini-4-spiro-5 1 - (4 1-etyylitio-3 1-imidatsoliini- ’·"· 2'-tioni)n AF176 (0,15 g). Heksaani-CH2C12 :sta ki- 113777 37 teytettynä sulamispiste oli 212-215°C.

^-NMR (CDC13) 1,42 (t, J=7,2Hz, CH3CH2-); 1,73 (m, 2H); 2,06 (m, 2H); 2,31 (m, 2H); 2,38 (s, CH3N-); 2,95 (m, 2H) ; 3,33 (q, J=7,2Hz, -CH2CH3) ; 10,0 (br. , -NH-) 5 ppm.

13C-NMR (DMS0-d6) 14,2 (CH3CH2-) ; 25,6 (-CH2CH3); 35,0 (C3 & C5) ; 45,8 (CH3N-); 50,5 (C2 & C6) ; 74,3 (C4) ; 192,1 (C2 1 ) ; 198,1 (C4 1 ) ppm.

MS m/e 243 (M+) ; 182 (M+ -EtS, 100 %) ; 156 (M+ -EtSCN); 10 123; 124; 96; 71; 70; 57.

IR (KBr) 3135 (NH); 2930; 2788; 1476; 1463; 1446; 1281; 1257; 1232; 1158; 1141; 1121; 1096; 958; 711; 674; 535 cm"1.

UV (EtOH) Xmax 314 nm (ε 5400) alapuolella, 282 nm (ε 15 6700) .

Yllä olevan reaktion toistaminen EtBr:n 1,5 moolin ylimäärällä AF173 nähden antoi edellä mainittujen monoetyylijohdannaisten lisäksi dietyylijohdannaisen l-metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(11-etyyli-2'- 20 etyylitio-21-imidatsoliini-5'-tioni) AF170 sulamispis teellä 66-67°C (kiteytettynä heksaanista) .

XH-NMR (CDC13) 1,24 (t, J=7,2Hz, CH3CH2-); 1,24 (m, V 2H) ; 1,44 (t, J=7,2Hz, CH3CH2-) ; 2,27 (m, 2H) ; 2,39 (s, : CH3N-) ; 2,52 (m, 2H) ; 2,81 (m, 2H) ; 3,24 (q, J=7,2Hz, i 25 -CH2CH3) ; 3,93 (q, J=7,2Hz, -CH2CH3) ppm.

13C-NMR (CDC13) 12,2 (CH3CH2-) ; 13,9 (CH3CH2-); 25,7 (- : CH2CH3) ; 36,8 (C3 & C5) ; 39,0 (-CH2CH3); 46,1 (CH3N-); . ·. 51,5 (C2 Se C6); 82,2 (C4) ; 158,5 (C2' ) ; 216,7 (C5' ) ppm.

30 MS m/e 271 (M+) ; 242 (M+ -Et); 214 (M+ -C3H7N) ; 185; ;;; i62; 75,· 71,· 70 (100 %) ,· 57.

IR (KBr) 1574 (C=N) ; 1446; 1372; 1354; 1212; 1071; ·:··: 1060; 936 cm"1.

UV (EtOH) Xmax (ε) 296 (22000); 252 (17700) nm.

. 35 AF176:n happohydrolyysi » · · ’·· j AF176:een (48 mg) lisättiin HC1-vesiliuosta (1 ml, 20 %) . Havaittiin välitön merkaptaanin haju.

113777 38

Saatua liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, haihdutettiin sitten 50°C:ssa alipaineessa, antaen valkoisen kiinteän aineen 1-metyylipiperidiini- 4-spiro-5'-(2'-tiohydantoiini)n HCl-suolan (X).

5 ^-NMR (D20) 2,10-2,43 (m, 4H) ; 2,94 (s, CH3N-) ; 3,20 (m, 1H); 3,47-3,78 (m, 3H) ppm.

MS m/e 199 (M+) ; 181; 171 (M+ -OH); 156 (M+ -HNCO) ; 142 (M+ -C3H7N) ; 111; 96; 71; 70; 57.

UV (H20) Xmax 264 nm (ε 20400) , 224 nm (ε 8600) .

10

Esimerkki 13: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-(2'-tiohydantoiini) AF195 a) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2',4'-ditiohydan-15 toiini)n (AF173) (10,0 g) liuosta etanolamiinissa (40 ml)- vedessä (75 ml) refluksoitiin 1,75 tunnin ajan. Liuotin ja ylimääräinen reagenssi poistettiin alipaineessa. Toistettiin jäännöksen kiteytys asetonitriili-dikloorimetaanista; asetoni ja etanoli-asetonitriili 20 antoivat puhtaan l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(21 -tio-4'-(8S-hydroksietyyli-iminohydantoiini)n sulamispisteellä 230-231°C.

V 1H-NMR (D20) 11,74 (m, 2H) ; 1,94 (m, 2H) ; 2,26 (s, : ',·* CH3N-); 2,17-2,34 (m, 2H) ; 2,92 (m, 2H) ; 3,54 (t, 25 J=5,4Hz, -CH20H) ; 3,74 (t, J=5,4Hz, =NCH2-) ppm.

: 13C-NMR (DMS0-d6) 33,7 (C3 & C5) ; 45,4 (-CH2-); 45,9 (CH3N-); 50,6 (C2 & C6) ; 59,2 (-CHa-); 66,3 (C4) ; 182,5 (-C=S) ; 195,0 (-C-N-) ppm.

MS m/e 242 (M+) ; 224 (M+ -H20) ; 199; 185; 172 (M+ -70); 30 154 (M+ -70-H2O) ; 71; 70.

UV (0,01-N HCl) Xmax 227 nm (ε 22200), 242 nm (ε ;·’ 10200) .

νί Iminohydantoiini-johdannainen (1,40 g) liuo- tettiin HCl-vesiliuokseen (5 ml, 1:1) ja refluksoitiin . 35 1 tunnin ajan. Reaktioseosta haihdutettiin alipainees- ; sa ja jäännös kiteytettiin metanolista antaen 1- metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoiini)n 113777 39 suolahapon suolan (0,756 g), samanlaisen tuotteen, joka saatiin AF176:n hydrolyysistä (ks. esimerkki 12).

b) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(2',4'-ditiohydan-5 toiini)n (AF173) (10,0 g, 0,0465 moolia) ja n- butyyliamiinin (17,0 g, 0,233 moolia) liuosta etanolissa (80 ml) lämmitettiin palautusjäähdytyksen alaisena 1,5 tunnin ajan. Kiteinen kiinteä aine, joka erotettiin jäähtyneestä reaktioseoksesta, suodatettiin, 10 pestiin pienellä määrällä etanolia, eetterillä ja pet-rolieetterillä antaen l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-tio-41-etyyli-iminohydantoiini)a (AF189) (11,1 g, 0,0437 moolia) saannolla 94 %. Tuote kiteytettiin di-kloorimetaani-metanolista antaen kideneuloja sulamis-15 pisteen ollessa 236-239°C.

1H-NMR (CDCI3+CD3OD) 0,94 (t, J=7,2Hz, CH3CH2-); 1,38 (m, 2H) ; 1,60 (m, 2H) ; 1,69 (m, 2H) ; 1,89 (m, 2H) ; 2,40 (m, 2H) ; 2,41 (s, CH3N-); 2,91 (m, 2H) ; 3,47 (t, J=7,2Hz, -CH2-N=) ppm.

20 MS m/e 254 (M+) ; 197 (M+ -C4H9) ; 184 (M+ -70); 149; 128; 71; 70; 57 (C4H9+) .

Iminohydantoiini-johdannainen AF189 (10,45 g) ,·.· liuotettiin suolahapon vesiliuokseen (15 ml, 16 %) ja * refluksoiitiin 1 tunnin ajan. Reaktioseosta tislattiin ·,; 25 kunnes ainoastaan pieni määrä nestettä oli jäljellä.

Etanolin (50 ml) lisääminen jäännökseen ja jäähdyttä- < · . minen antoi kiinteän aineen, joka suodatettiin ja pes- , tiin pienellä määrällä etanolia ja eetterillä antaen l-metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(2'-tiohydantoiini)n 30 suolahapon suolan (AF195) (8,42 g, saanto 87 %) sula- * * » mispisteen ollessa >295°C, samanlaisen kuin aikaisem-min saatu tuote.

*

Esimerkki 14: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- • 35 5 ' - (oksatsolidiini-2 '-tioni) AF165 • » »

Pienen määrän KOH-jauhetta sisältävään vedet-tömään DMSO (10 ml) lisättiin sekoittaen 4- 113777 40 aminoetyyli-4-hydroksi-l-metyylipiperidiinin (0,595 g, 4,13 mmoolia) jälkeen hiilidisulfidia (0,340 g, 4,47 mmoolia). Reaktioseosta lämmitettiin 50°C:ssa 2 tunnin ajan. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös kitey-5 tettiin useita kertoja metanolista, asetonista ja CH2CL2:sta antaen kiteisen kiinteän aineen (211 mg) sulamispisteen ollessa 190-195°C.

Hi-NMR (CDC13) 1,80-1,98 (m, 2H) ; 2,03-2,16 (m, 2H) ; 2,32 (s, CH3N-); 2,44-2,72 (m, 4H); 3,51 (s, -CH2N-C=S) 10 ppm.

13C-NMR (DMSO-d6) 35,1 (C3Cls) ; 45,7 (CH3N-); 51,5 (C2Cl & C6) ; 53,1 (-CH2NH-) ; 86,4 (C4) ; 187,2 (-C=S) ppm.

Esimerkki 15: N-metyylinortropaani-3-spiro- 15 5'-(31-metyylihydantoiini) AF167 ja N- metyylinortropaani-3-spiro-5'-(3'-etyylihydantoiini) AF167 a) N-metyylinortropaani-3-spiro-51-hydantoiini 2 0 Seosta, jossa on tropinonia (45 g, 0,32 moo lia) etanolissa (160 ml) , ammoniumkarbonaattia (93 g, 0,96 moolia) vedessä (400 ml) ja KCN (25,8 g, 0,40 moolia) vedessä(84 ml), lämmitettiin 60°C:ssa 2 tunnin j : ajan ja pidettiin sitten huoneenlämpötilassa 16 h. N- ; 25 metyylinortropaani-3-spiro-5'-hydantoiini (61,33 g, . 0,29 moolia, saanto 92 %) erotettiin ja kuivattiin ek- sikaattorissa, sulamispiste 330°C.

» ·. MS m/e 209 (M+) ^-NMR (CD3COOD) 2,1 (m, 2H, H6=H7 (a) ) ; 2,3 (m, 2H, 30 H2=H4 (S) ) ; 2,4 (m, 2H, H2=H4 (a) ) ; 2,7 (m, 2H, ;·;* H6=H7 (β) ) ; 2,9 (s, 3H) ; 3,0 (bs, NH) ; 4,1 (bs, 2H, Η1=Η5(β)) ppm.

^-NMR (DCl, D20) 2,3 (m, 4H, H6=H7 (a) ja H2=H4(β); 2,5 ,···. (m, 2H, H2=H4 (a) ) ; 2,7 (m, 2H, H6=H7 (β) ) ; 2,9 (s, 3H) ; * · 35 4,15 (bs, 2H, H1=H5) ppm.

ί 13C-NMR (DCl, D20) 25,5 (C6=C7, t) ; 33,5 (C2=C4, t) ; 39,7 (CH3, q) ; 59,3 (C3-C5', s); 63,0 (C1=C5, d) ; 41 1 13777 159,3 (C2\ s) ; 180,2 (C4' , s) ppm.

b) AF167 ja AF168 N-metyylinortropaani-3-spiro-5'-hydantoiinia 5 (1 ekvivalentti) ja KOH (1 ekvivalentti) sekoitettiin vedessä huoneenlämpötilassa muutamien minuuttien ajan. Metyylijodidia tai etyylibromidia (2 ekvivalenttia) metanolissa tai etanolissa lisättiin tipoittain vesi-liuokseen. Reaktioseosta ekstrahoitiin kloroformilla 10 ja kuivattiin magneesisulfaatilla ennen haihdutusta. Saatiin tuotteita AF167 ja AF168 n. 10 % saannolla. AF167

Hi-NMR (D20) 1,65 (m, 2H, H6=H7 (a) ) ; 1,8 (m, 2H, H2=H4 (S) ) ; 2,2 (m, 2H, H2=H4 (a) ) ; 2,4 (m, 2H, 15 H6=H7 (S) ) ; 2,55 (s, 3H) ; 2,85 (s, 3H) ; 3,25 (bs, 2H, H1=H5) ppm.

^-NMR (CDCls) 1,55 (m, 4H, H6=H7 (a) ) ; 1,75 (m, 2H, H2=H4 (β) ) ; 2,2 (m, 2H, H2=H4 (a) ) ; 2,4 (s, 3H) ; 2,45 (m, 2H, Η6=Η7(β)); 3,0 (s, CH3) ; 3,3 (bs, 2H, H1=H5) ; 20 6,3 (bs, NH) ppm.

MS m/e 223 (M+) AF168 : 1H-NMR (CDCl3, CD3OD) 1,1 (t, 3H) ; 1,6 (m, 2H, ; H6=H7 (a) ) ; 1,75 (m, 2H, H2=H4(S)); 2,2 (m, 2H,

t I

; 25 H2=H4(a)); 2,35 (s, 3H) ; 2,4 (m, 2H, H6=H7 (β) ) ; 3,3 . ·.’ (bs, 2H, H1=H5) ; 3,55 (q, 2H) ppm.

1H-NMR (CDC13) 1,2 (t, 3H) ; 1,6 (m, 2H, H6=H7 (a) ) ; 1,75 ’ (m, 2H, H2=H4 (β) ) ; 2,2 (m, 2H, H2=H4(a)); 2,4 (s, 3H) ; • * 2,45 (m, 2H, H6=H7(β) ) ; 3,3 (bs, 2H, H1=H5); 3,55 (q, 30 2H) ; 6,3 (bs, NH) ppm.

13C-NMR (CDC13, δ) 13 (CH3CH2) ; 25 (C6=C7); 35 <C2=C4); 40 (N-CH3) ; 40,5 (N-CH2) ; 59 (C3-C5'); 60 (C1=C5) ; 159 (C2') ; 180 (C4 ') ppm.

• · MS m/e 237 (M+) • · t 35 i.l · Esimerkki 16; l-metyylipiperidiini-4-spiro- 5 1 - (3 '-etyylioksatsolidiini-2 '-oni) AF172 42 1 13777 a) 4-Asetamidometyyli-4-hydroksi-1-metyylipiperidiini 4-aminometyyli-4-hydroksi-l-metyylipiperidii-niä (2,95 g, 0,02 moolia), kaliumkarbonaattia (6,5 g, 5 0,047 moolia) ja etikkahappoanhydridia (8,5 g, 0,08 moolia) metanolissa sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Natriumhydhoksidia lisättiin neutralointia varten ja liuosta ekstrahoitiin kloroformilla. Haihduttamisen jälkeen saatiin keltainen öljy, joka 10 tunnistettiin 4-asetamidometyyli-4-hydroksi-l-metyyli- piperidiiniksi (3,4 g, 0,018 moolia, saanto 91 %).

b) 4 -Etyyliaminometyyli -4 - hydroksi -1 -metyylipiperi -diini 15 4 - Ase t ami dome tyyl i - 4 - hydroks i -1 -metyyl ipipe - ridiini (3,4 g, 0,018 moolia) kuivassa THF:ssa refluk-soitiin litiumalumiinihydridin (4 g) läsnäollessa. Kolmen päivän jälkeen seos kaadettiin jäävesihautee-seen ja suodatettiin piimaasuodattimen läpi. Liuotin 20 haihdutettiin ja veden lisäyksen jälkeen liuosta ekstrahoitiin kloroformilla ja uute kuivattiin magnesium-sulfaatilla ja haihdutettiin antaen saannoksi 1,03 g ; (saanto 33 %) raaka-ainetta. Siten saatua tuotetta ; käytettiin ilman lisäpuhdistusta.

I 25 c) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(31-etyylioksatso- lidiini-21-oni) AF172 t 4-Etyyliaminometyyli-4-hydroksi-l-metyylipi- peridiiniä (16,8 g, 0,1 moolia) ja N,N1-karbonyylidi-imidatsolia (32 g, 0,2 moolia) sekoitettiin 400 30 cm3:iin kloroformia typpikaasun alaisena. Haihuttami- nen antoi 50 g raaka-ainetta, joka pestiin huolelli-;,,.ϊ sesti heksaanilla, joka haihdutuksen jälkeen antoi tuotteen, l-metyylipiperidiini-4-spiro-5 1 - (3 '- etyylioksatsolidiini-2' -oni) AF172, kellertävänä öljy- • · 35 nä (16,8 g, 0,085 moolia, saanto 85 %).

Li : 1H-NMR (CDC13, δ) 1,15 (t, 3H) ; 1,8 (m, 2H) ; 1,95 (m, :*'! 2H) ; 2,3 (s, 3H) ; 2,55 (m, 2H) ; 3,28 (s, 2H) ; 3,32 (q, 113777 43 2H) ppm.

13C-NMR (CDCI3) 13 (CH3CH2) ; 22 (CH3CH2) ; 37 (CH3CH2N) ; 39 (CH2NEt) ; 52 (NCH2CH2) ; 55 (C-0) ; 157,5 (C=0) ppm.

MS m/e 198 (M+) 5

Esimerkki 17: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 41 -(3'-etyylioksatsolidiini-2-oni) AF174 a) 4-Asetamido-4-hydroksimetyyli-l-metyylipiperidiini 10 4 -amino-4-hydroks imetyyli-1-metyylipiperi- diiniä (2,95 g, 0,02 moolia), kaliumkarbonaattia (6,5 g, 0,047 moolia) ja etikkahappoanhydridiä metanolissa sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Natri-umhydroksidia lisättiin neutralointia varten ja liuos-15 ta ekstrahoitiin kloroformilla. Haihduttamisen jälkeen saatu valkoinen kiinteö aine kiteytettiin lämpimällä asetonilla antaen 4-asetamido-4-hydroksimetyyli-l-metyylipiperidiiniä (1,67 g, 0,009 moolia, saanto 45%) .

20 b) 4 -Etyyliamino-4 -hydroks imetyyli-1-metyylipiperi-diini ’ 4-Asetamido-4-hydroksimetyyli-l-metyylipi- ; ; peridiini (1,6 g, 8,6 mmoolia) kuivassa THFrssa ref- 25 luksoitiin litiumaluminiumhydridin (3 g) läsnäollessa.

. . Neljän tunnin jälkeen seos kaadettiin jäävesihautee- , ·. seen ja suodatettiin piimaasuodattimen läpi. Liuotin haihdutettiin ja veden suurimman osan haihdutuksen ' jälkeen liuosta ekstrahoitiin kloroformilla, kuivat- 30 tiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin antaen ··>* saannoksi 1,13 g (saanto 77 %) melko puhdasta materi- » · 1 aalia. Siten saatua tuotetta, 4-etyyliamino-4-hydroksimetyyli-l-metyylipiperidiiniä, käytettiin il- .*··, man lisäpuhdistusta.

35 ί.i : c) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(3'-etyylioksa- ,;"ί tsolidiini-2-oni) AF174 113777 44 4-Etyyliamino-4-hydroks imetyyli-1-metyylipi -peridiiniä (172 mg, 1 mmoolia) ja N,N' -karbonyylidi-imidatsolia (486 mg, 3 mmoolia) sekoitettiin kloroformissa typpikaasun alaisena 3 tunnin ajan. Haihduttami-5 sen jälkeen saatiin raaka-aine, joka pestiin huolellisesti heksaanilla, joka haihduttamisen jälkeen antoi tuotteen, l-metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(3'-etyyli-oksatsolidiini-2-oni)n AF174, valkeana kiinteänä aineena (140 mg, 0,71 mmoolia, saanto 71 %).

10 ^-NMR (CDCI3, δ) 1,10 (t, 3H) ; 1,6 (m, 2H) ; 1,95 (m, 4H) ; 2,25 (s, 3H) ; 2,85 (m, 2H) ; 3,2 (q, 2H) ; 4,1 (s, 2H) ppm.

MS m/e 198 (M+) 15 Esimerkki 18: 2-N-metyylispiro-(1,3-sukkiini- imidi-4,3')kinuklidiini AF133 a) Etyyli(3-kinuklidylideeni)-syanoasetaatti 3-Kinuklidinonin (30 g, 0,24 moolia), etyy-20 lisyanoasetaatin (40 g, 0,35 moolia), ammoniumasetaa-tin (3,8 g), etikkahapon (11 g) seos ja 120 ml bent-seeniä lämmitettiin palautusjäähdytyksen alaisena ja ; v vesi poistettiin atseotrooppisella tislauksella (veden : kokonaismäärä 4 ml). Bentseeniliuos jäähdytettiin, li- ; ; 25 sättiin kaliumkarbonaattia (30 g) 120 ml:ssa vettä ja ; seosta ekstrahoitiin tolueenilla (3x500 ml) . Tolueeni- , , uutteet yhdistettiin, kuivattiin ja tuote seostettiin

I I

suolahapon suolana antaen saannoksi 63 g (saanto 95 %) raaka-ainetta eluentilla TLC ammoniumhydroksidia (25 % 30 vedessä) 2 til% metanolissa silikatyypillä 5735 ·;;;’ (Merck) Rf 0,67.

* ·

Tuote voidaan lisäpuhdistaa kiteyttämällä ·:·-· etanolissa tai isopropanolissa.

.·". ^H-NMR (CDCI3-TMS) liikkuva kantoaine; 1,29 (t, 3H, 35 CH3) ; 4,2 (q, 2H, CH2) ; 1,7-1,9, 2,8-3,2 (m, kinukli- · diinirunko) .

13C-NMR δ (CDC13-TMS) 14 (CH3) ; 62 (CH20) ; 189 (C=0) ; 113777 45 162 (C=N); 115 (C-CN); 100 (C=C); 33,7 (C-H).

b) 3-Karboetoksi-3-karboetoksimetyylikinuklidiini 25 Miraan liuotettu etyyli(3-kinuklidyli-deeni)-syanoasetaatti (64 g, 0,24 moolia) ja kalium-5 syanidi (17 g, 0,26 moolia) liuotettiin 125 ml etanolia. Seosta refluksoitiin 20 minuuttia, jäähdytettiin, dekantoitiin kaliumkloridista ja jäljelle jäänyt ka-liumkloridi pestiin kahdella 50 ml annoksella etanolia. Yhdistetty alkoholiliuosta haihdutettiin ja öljy-10 mäinen jäännös liuotettiin 250 ml konsentroitua suolahappoa ja refluksoitiin 24 tunnin ajan. Sitten liuosta haihdutettiin jäännös pestiin useita kertoja asetonilla ja kuivattiin. Kuivattua kiinteää ainetta refluksoitiin kloorivedyllä kyllästetyssä etanolissa 20 tun-15 nin ajan. Sitten poistettiin etanoli ja jäännös tehtiin emäksiseksi huolellisesti käyttäen natriunkarbo-naattia ja ekstrahoitiin kloroformiin. Kloroformiliuos kuivattiin, haihdutettiin ja raaka diesteri puhdistettiin edelleen pylväskromatografisesti käyttäen 2 % me-20 tanolia kloroformissa eluointijärjestelmänä.

MS m/e 2,69 (M+) ; kantoaineen piikki m/e 196 (M-C- OEt) .

1H-NMR δ (CDC13-TMS) 1,2 (dt, 6H, CH3) ; 4,2-4,3 (dt, ; 4H, CH20) ; 1,3-1,6, 2,6-3,1 (m, kinuklidiinirunko) .

; | 25 c) 2-N-metyylispiro-(1,3-sukkiini-imidi- 4,3')kinuklidiini (AF133) * * 3-Karboetoksi-3-karboetoksimetyylikinukli-' diini (3,35 g, 12 mmoolia) liuotettiin 4,5 g metyyli- amiinia ja lämmitettiin paineen alaisena 190°C:ssa (90 3 0 h) . Reaktioseos jäähdytettiin, haihdutettiin ja kiin-teä jäännös puhdistettiin pylväskromatograf isesti si- * t t likalla käyttäen 2 % metanolia 2,2 % ammoniakkia si- sältävässä kloroformissa eluointijärjestelmänä. AF133 • · saatiin valkoisena kiinteänä aineena (5,7 mmoolia) su- • · 35 lamispisteen ollessa 94-96°C.

i.l - MS 209 (M+) .

·:·*: ^-NMR δ (CDCla-TMS) 3,4 (d, 1H, H2) ; 2,96 (s, 3H, CH3) ; 113777 46 2,5 (d, 1H, H2) ; 1,5-1,9 (m, kinuklidiinirunko) .

Esimerkki 19: 2-N-etyylispiro-(1,3-sukkiini- imidi-4,31)kinuklidiini AF134 5 Raaka 3-karboetoksi-3-karboetoksimetyylikinu- klidiini (20 g) liuotettiin etyyliamiinin 70 % vesi-liuokseen ja lämmitettiin 140°C:ssa paineen alaisena 7 tunnin ajan. Reaktiota valvottiin kaasukromatografin avulla. Raakatuotetta ekstrahoitiin kloroformilla ja 10 sitten kuivattiin ja haihdutettiin. Öljymäinen jäännös puhdistettiin pylväskromatografisesti silikalla käyttäen kloroformi/petrolieetteri/etanoli/ammoniakkivettä suhteessa 17/13/3/0,4. Liikkuva kantoaine saostettiin suolahapon suolana, antaen saannoksi 6,6 g valkoista 15 kiinteää ainetta, sulamispiste 270-272°C, eluentilla TLC ammoniumhydroksidia (25 % vedessä) 2 til% me- tanolissa silikatyypillä 5735 (Merck) Rf 0,47.

MS 222 (M+) XH-NMR δ (CDCI3-TMS) liikkuva kantoaine: 1,5 (t, 3H, 20 CH3) ; 3,5 (q, 2H, N-CH2) ; 1,6-3,3 (m, kinuklidiinirun ko) .

; ,· Esimerkki 20: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- : 5'-(oksatsolidiini-21,4'-dioni) AF169 ja 1- * 25 metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(3'-etyylioksatsolidii- . ni-2',41-dioni) AF180 a) 4-Hydroksi-4-syano-l-metyylipiperidiini

Vasta tislattuun l-metyylipiperidiini-4-oniin 30 (81,72 g, 0,72 moolia) vedessä (200 cm3) lisättiin n.

•;;j 100 cm3 37 % HC1 pH-arvoon 3. Reaktioseosta jäähdy- tettiin jäävesihauteessa ja kaliumsyanidi (49 g, 0,75 moolia) vedessä (200 cm3) lisättiin sopivalla nopeu-.*· , della sisäisen lämpötilan pitämiseksi n. 10°C:ssa. Re-

f I

'· 35 aktioseosta sekoitettiin vielä 2 tunnin ajan lisäyksen .* jälkeen ja sitten suodatettiin. Vedellä pesemisen ja kuivaamisen jälkeen tuote, 4-hydroksi-4-syano-l- 47 113777 metyylipiperidiini, saatiin 67 % saannolla valkoisena jauheena (67 g, 0,48 moolia, sulamispiste 135°C.

1H-NMR (CDC13) δ 1,9 (m, 2H) ; 2,4 (m, 2H) ; 2,4 (m, 2H) ; 2,75 (m, 2H); 2-3,5 (bm, 1H, OH) ppm.

5 b) 4-Hydroksi-4-karbamoyyli-1-metyylipiperidiini

Yhdistettä 4-hydroksi-4-syano-1-metyylipiperidiini (36,4 g, 0,26 moolia) lisättiin vähitellen rikkihappoon (80 ml) ulkoisen jäähdytyksen alaisena. 10 Seosta pidettiin huoneenlämpötilassa 41 tunnin ajan, lisättiin sitten jäämurskaan (30 g) . Tuolokseksi saatu liuos neutraloitiin bariumkarbonaatilla (376 g) pH-arvoon 8-9 ja veden lisäyksen jälkeen tuloksena ollut bariumsulfaatti erotettiin ja pestiin metanolilla. 15 Suodos väkevöitiin alipaineessa. Tuote, 4-hydroksi-4-karbamoyyli-1-metyylipiperidiini, kiteytettiin etanolista valkoisena kiinteänä aineena (sulamispiste 180°C).

1H-NMR (CDCI3) δ 1,51 (m, 2H) ; 2,15 (m, 2H) ; 2,25 (s, 20 3H); 2,4 (m, 2H); 2,7 (m, 2H) ppm.

MS m/e 158 (M+) .

c) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(oksatsolidiini-2 ' , 4 ' -dioni) AF169 ; 25 Kaiiummetoksidin (9,8 g, 0,14 moolia) liuok- . seen kuivassa etanolissa (60 ml) lisättiin 4-hydroksi- 4-karbamoyyli-l-metyylipiperidiinin (27,5 g, 0,17 moolia) ja dietyylikarbonaatin (26,23 g, 0,22 moolia) » liuosta etanolissa (300 ml) . Tulokseksi saatua seosta 30 refluksoitiin 80°C:ssa 60 tunnin ajan. Reaktioseosta haihdutettiin, jäännöstä ravisteltiin kylmässä vedessä * t i (70 ml) ja neutraloitiin (2-N) HClrlla pH-arvoon 7.

* ... j Liuos väkevöitiin puoleen tilavuuteen ja valkoinen sa- ostuma suodatettiin. Hienonnus etanolin kanssa antoi * · T 35 saannoksi l-metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(oksatsoli- ! diini-2' ,41 -dioni)n AF169 (22 g, 0,12 moolia) 70 % *·"! saannolla valkoisena kiinteänä aineena (sulamispiste 113777 48 285°C).

3H-NMR (D20, pH 7) 2,07 (m, 2H) ; 2,27 (m, 2H) ; 2,95 (s, 3H); 3,30 (m, 2H); 3,60 (m, 2H) ppm.

MS (yhdisteen pH on 7) m/e 185 ja 184 (M+ +1 ja M+) .

5 d) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(31-etyylioksatso-lidiini-21,41-dioni) AF180 l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(oksatsoli-diini-2',41-dioni)n (2,8 g, 0,015 moolia) liuokseen 10 kuivassa DMF:ssa (100 cm3) lisättiin hitaasti kalium-hydridiä (65 % öljyssä) kunnes reaktio lämmitettäessä pysähtyi (4,9 g käytettiin). Valkoista suspensiota refluksoitiin 1 tunnin ajan ja jäähdytettiin. Etyyli-bromidia (4,6 g, 0,042 moolia) lisättiin tipoittain. 15 Reaktiotuote lämpeni itsestään. Seoksen jäähdyttämisen jälkeen huoneenlämpötilaan sitä refluksoitiin 2 tunnin ajan. Valkoinen kiinteä aine erotettiin jäähdytyksen jälkeen ja pestiin etanolilla. Liuottimien haihdutuksen jälkeen raakatuote erotettiin kromatografisesti 20 silikageelikolonnilla käyttäen kloroformia ja me- tanolia eluenttina. Tutetta sisältäviä jakeita haihdutettiin. Tuote eristettiin ja tunnistettiin liikkuvan * kantoaineen muodossa. Käytännön käsittelyä varten se : muunnettiin suolahapon suolaksi HCl/eetteri/etanoli- ί 25 liuoksella, josta se saostettiin 1-metyylipiperidiini- ; 4-spiro-5'-(3'-etyylioksatsolidiini-2',4'-dioni)n kloorivetysuolana (0,746 g, 0,003 moolia, saanto 21 %),(sulamispiste 305°C).

^-NMR (CDC13, liikkuva kantoaine) δ 1,2 (t, 3H) ; 1,75 30 (m, 2H); 2,15 (m, 2H); 2,3 (s, 3H); 2,32 (m, 2H); 2,80 *·;; (m, 2H) ; 3,55 (q, 2H) ppm.

13C-NMR (CDCI3, liikuva kantoaine) δ 13 (CH3CH2) ; 32 (CH2CH3) ; 35 (CH2-CH2-C) ; 46 (N-CH3) ; 50 (CH2-N-CH3) ; 85 .···. (C spiro) ; 155 (0C=0) ; 175 (C-C=0) ppm.

• · — “ • 35 MS (liikkuva kantoaine) m/e 212 (M+) .

Il» 113777 49

Esimerkki 21: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 4'-(2'-metyyli-21-tiatsoliini) AF151(S) a) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-41 -(21-metyyli-2'-ok- 5 satsoliini)n, AF151, (1,85 g, 11,01 mmoolia), fosfori- pentasulfidin (1,83 g, 8,23 mmoolia) ja p-tolueenisulfonihapon monhydraatin (4,20 g, 22,08 mmoolia) seosta ksyleenissä (70 ml) sekoitettiin magneet-tisekoittajalla ja refluksoitiin 3 tunnin ajan. Liuo-10 tin tislattiin atseotrooppisesti ja jäljelle jäänyt jäännös tehtiin emäksiseksi väkevöidyllä NaOH vesiliuoksella ja ekstrahoitiin sitten dikloorimetaanilla. Orgaaninen uutos kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin antaen ruskean öljyn (2,10 g), joka erotettiin 15 kromatografisesti silikageelikolonnilla (Kieselgel S, 0,032-0,063 mm. Riedel DeHaen, 70 g). Eluointi kloroformi (97 %)/metanoli (3%) liuotinseoksella, joka sisälsi 10 M ammoniakkia, antoi jakeet, jotka sisälsivät puhdasta AF151(S) (0,90 g).

20 b) 4-Asetamido-4-hydroksimetyyli-1-metyylipiperidii-nin (8,00 g, 0,043 moolia) ja fosforipentasulfidin * ,· (6,10 g, 0,0275 moolia) perinpohjainen jauheseos dis- ,· pergoitiin ksyleeniin (120 ml) , sekoitettiin magneet- : 25 tisekoittajalla ja refluksoitiin 6 tunnin ajan. Reak- tioseos jätettiin huoneenlämpötilaan yön yli ja saatu saostuma suodatettiin ja pestiin petrolieetterillä (40-60°C) antaen harmaata jauhetta (13,0 g). Saatu jauhe jäähdytettiin ja tehtiin emäksiseksi konsent-30 roidulla NaOH-vesiliuoksella, ekstrahoitiin sitten ; useita kertoja dikloorimetaanilla. Yhdistetyt uutteet kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin. Jäjelle jäänyttä ,··· osaa ekstrahoitiin heksaanilla ja heksaani poistettiin ·'. antaen punaisen öljyn (3,53 g), joka tislattiin antaen 35 väritöntä öljyä (2,4 g), kiehumispiste 60-68°C (0,4 ·: · mm), joka erotettiin kromatografisesti silikageeliko- : lonnilla 60 (Merck, 100 g). Eluointi liuotin seoksella 113777 50 CHCl3/Et20/Me0H/NH40H (70:25:4:1) antoi puhdasta AF151(S) (1,71 g).

1H-NMR (CDCls) 1,65-1,78 (m, 2H) ; 1,90-2,04 (ra, 2H) ; 2,19 (s, CH3C=N-) ; 2,32 (s, CH3N-) ; 2,30-2,43 (m, 2H) ; 5 2,60-2,75 (m, 2H) ; 3,11 (s, CH2S-) ppm.

13C-NMR (CDC13) 19,9 (CH3C=N-) ; 35,8 (C3 & C5) ; 43,1 (- CH2S-) ; 45,6 (CH3N-) ; 52,1 (C2 & C6) ; 78,5 (C4) ; 161,0 (S-C=N) ppm.

MS ra/e 184 (M+, 100 %) ; 110 (26 %) ; 109 (56 %) ; 72 10 (93%); 71 (24 %).

Esimerkki 22: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 4'(5)'-(2'-metyyli-2'-imidatsoliini) AF190 15 a) 4-Amino-4-syano-l-metyylipiperidiini l-Metyylipiperidiini-4-oni (33,0 g, 0,292 moolia), kaliumsyanidi (19,5 g, 0,299 moolia) ja ammo-niumkloridi (16,5 g, 0,308 moolia) dispergoitiin me-tanoliin (225 ml) ja veteen (150 ml) ja seosta sekoi-20 tettiin huoneenlämpötilassa 12 päivän ajan. Saatu saostuma suodatettiin ja suodosta haihdutettiin alipaineessa. Veden poistamiseksi, jota jäännökseen saattaa olla jäänyt, siihen lisättiin etanolia ja tislattiin sitten atseotrooppisesti. Etanolia lisättiin uudelleen 25 jäännökseen, joka liukeni osittain ja jätti epäor- . gaanisen kiinteän aineen, joka suodatettiin ja pestiin • etanolilla. Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja liu otin poistettiin jättäen viskoosia öljyä (35,5 g), joka osoitti kaksi täplää TLC:lla (kloroformi/meta-30 noli/ammoniumhydroksidi (vedellinen) 17:2:1 - silika- ·;;; geeli) . Se kiteytettiin eetteristä antaen kiinteän ai- '··’ neen, joka kiteytettiin edelleen samasta liuottimesta ;*·· antaen 4-syano-4-hydroksi-l-metyylipiperidiiniä kitei- nä, sulamispiste 130-133°C. Emäliuos saosti väkevöitä-35 essä toisen saannon kiteistä kiinteää ainetta, joka ··· - oli suurimmalta osalta 4-amino-4-syano-l-metyylipipe- ·’ · ridiiniä.

113777 51 ^-NMR (CDC13) 1,72-1,88 (m, 2H) ; 2,01 (m, 2H) ; 2,25- 2,37 (m, 2H) ; 2,32 (s, CH3N-) ; 2,74-2,83 (m, 2H) ppm.

MS m/e 139 (M+) ; 112 (M+ -HCN) ; 71; 70.

4-Amino-4-syano-1-metyylipiperidi ini antoi 5 asetyloitaessa etikkahappoanhydridilla ja pyridiinillä 4-asetamido-4-syano-l-metyylipiperidiinia, joka kiteytettiin petrolieetteri-dikloorimetaanista sulamispisteen ollessa 143-144°C.

^-NMR (CDCI3) 1,78-1,96 (m, 2H) ; 2,04 (s, CH3CON-); 10 2,32 (S, CH3N-) ; 2,35-2,50 (m, 4H) ; 2,66-2,84 (m, 2H) ; 6,22 (s, -NHCO-) ppm.

MS m/e 181 (M+) ; 122 (M+ -CH3CONH2) .

IR (CHCI3) 3438; 3303; 2940; 2804; 2242 (C=N); 1670 (amidi) cm'1.

15 4-Amino-4-syano-l-metyylipiperidiinin happo- hydrolyysi (H2S04) antoi 4-amino-4-karbamoyyli-l-metyylipiperidiiniä, joka kiteytettiin etyyliasetaat-ti-dikloorimetaanista sulamispisteen ollessa 145-147°C.

20 ^-NMR (CDCI3) 1,44 (m, 2H) ; 1,68 (br, -NH2) ; 2,12-2,34 (m, 4H); 2,30 (s, CH3N-); 2,70-2,82 (m, 2H); 5,47 (br, -NH-); 7,39 (br, -NH-) ppm.

MS m/e 158 (M+ +1); 157 (M+) ; 140 (M+ -NH3/ 100 %) ; 113 ; [: (M+ -CONH2) ; 96; 71.

i 25 b) 4-Amino-4-aminometyyli-l-metyylipiperidiini 4-Amino-4-syano-1-metyylipiperidiinin (3,60 g) liuos kuivassa dimetoksietaanissa lisättiin mekaanisesti sekoitettuun LiAlH4 (3,0 g) supensioon kuivas-, 30 sa dimetoksietaanissa typpikaasun alaisena sellaisella 1 > · ;; nopeudella, että lämpötila ei nouse yli 50°C. Lisäyk- * . · ’··* sen loppuvaiheessa seosta lämmitettiin palutusjäähdy- ;*· tyksen alaisena 6 tunnin ajan. Ylimääräinen LiAlH4 hä- vitettiin lisäämällä kylmään (0°C) sekoitettuun reak-35 tioseokseen typpikaasun alaisena 4 M NaOH (10 ml) , '·> - vettä (3 ml) , kyllästettyä NaOH-liuosta (10 ml) ja • vettä (5 ml) . Orgaaninen liuotin erotettiin ja vesi- 113777 52 faasia ekstrahoitiin useita kertoja kuumalla THFrlla. Erotettu orgaaninen liuos ja THF-uutteet yhdistettiin, kuivattiin (Na2S04) ja liuottimet poistettiin antaen nimi yhdisteen viskoosina öljynä (3,17 g), joka puhdis-5 tettiin tislaamalla, kiehumispiste 60-62°C (0,8 mm). 1H-NMR (CDC13) 1,43 (m, 2H) ; 1,58 (m, 2H) ; 2,15 (br, -NH2) ; 2,30 (s, CH3N-) ; 2,30 (m, 2H) ; 2,56 (s, -CH2NH2) ; 2,56 (m, 2H) ppm.

Saadun diamiini asetylointi antoi diasetami-10 din kiinteänä aineena sulamispisteen ollessa 175-176°C (asetonitriilistä).

^-NMR (CDCI3) 1,74 (m, 2H) ; 1,96-2,10 (m, 2H) ; 1,99 (S, CH3CON-) ; 2,02 (CH3CON-) ; 2,21 (m, 2H) ; 2,28 (s, CH3N-) ; 2,51-2,61 (m, 2H) ; 3,50 (d, J=5,7Hz, -CH2NH-) ; 15 5,62 (s, -NHC0-); 7,18 (t, -CH2NHCO-) ppm.

MS m/e 227 (M+) ; 184 (M+ -CH3CO) ; 169 (M+ -CH3CONH) ; 168 (M+ -CH3CONH2) ; 167; 155; 112; 109 (100 %) ; 96; 71; 70.

Diasetamidi saatiin myös hydraamalla 4-amino-4-syano-l-metyylipiperidiiniä vedyllä (50 psi) Raney-20 nikkeli katalyyttinä kuumassa (60°C) natriumasetaattia sisältävässä etikkahappoanhydridissä.

c) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-41(5)'-(2'-metyyli- : 2'-imidatsoliini) AF190 : 25 Liuokseen b), 4-amino-4-aminometyyli-l- metyylipiperidiini (0,248 g, 1,734 mmoolia) dikloori-metaanissa (5 ml) , lisättiin etyyliasetimidaattihypo- t · kloridia (0,282 g, 2,282 mmoolia) ja seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan. Liuotin pois-30 tettiin alipaineessa ja jäännös tehtiin emäksiseksi väkevöidyllä Na2CC>3-vesiliuoksella, sitten ekstrahoi-·...* daan dikloorimetaanilla. Uute kuivattiin (Na2C03) ja ...,j liuotin poistettiin antaen väritöntä öljyä (191 mg) , .···. joka erotettiin kromatografisesti silikageelikolonnil- • » 35 la. Eluointi liuotinseoksella metanoli/kloroformi/1% : ammoniumhydroksidi (vedellinen) metanolipitoisuuden kasvaessa 10 %:sta 99 %:in antoi puhtaan tuotteen 113777 53 AF190 öljynä, joka jähmettyy jäähdytettäessä.

^-NMR (CDC13) 1,57-1,84 (m, 4H) ; 1,93 (s, CH3C=N-); 2,17-2,33 (m, 2H); 2,29 (s, CH3N-); 2,56 (m, 2H); 3,37 (s, -CH2-N-) ppm.

5 13C-NMR (CDC13) 15,2 (CH3C=N-); 37,3 (C3 & C5) ; 46,1 (- CH3N-); 52,5 (C2 Se C6); 59,7 (C4) ; 63,7 (-CH2N-); 162,1 (-C=N-) ppm.

MS m/e 167 (M+) ; 152 (M-CH3) ; 138; 109 (100%); 97; 96; 72; 71; 70.

10 IR (laimentamaton) 3260; 2933; 2852; 2800; 1620 (-C=N-) cm'1.

Esimerkki 23: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 41 (5) 1 -[2'-metyyli-4 Ή(5 Ή)-imidatsoli-51 (4')-oni] 15 AF230 4-Amino-4-syano-l-metyylipiperidiini (1,03 g) liuotettiin konsentroituun rikkihappoon (4,0 ml) ja jätettiin huoneenlämpötilaan 4 päivän ajaksi. Reak-tioseos lisättiin kylmään veteen (10 ml) ja sitten li-20 sättiin bariumkarbonaattia kunnes mitään reaktiota ei ollut nähtävissä. Saostettu bariumsulfaatti suodatettiin eroon ja pestiin vedellä ja etanolilla. Yhdiste- • v tyn suodoksen ja pesunesteiden pH säädettiin arvoon 13 * konsentroidulla NaOH-liuoksella ja liuottimet poistet- 25 tiin alipaineessa. Jäännökset ekstrahoitiin etanolil la, uutetta haihdutettiin, jäännös ekstrahoitiin di-kloorimetaanilla ja uutetta haihdutettiin antaen öljyä » (0,75 g), joka erotettiin kromatografisesti silikagee-likolonnilla 60 (Merck 0,040-0,063 mm, 32g). Eluointi 30 1:9 metanoli-kloroformilla antoi puhdasta AF230 (0,185 t · ; : g), kiteytettynä dikloorimetaani-eetteristä, sulamis- ·.·“ pisteen ollessa 231-234°C.

;··: ^-NMR (CDC13) δ 1,49 (m, 2H) ; 1,97 (m, 2H) ; 2,20 (s, CH3-) ; 2,34 (s, CH3-); 2,48 (m, 2H) ; 2,80 (m, -NH-) • » 35 ppm.

: ^H-NMR (D20) δ 1,55 (m, 2H) ; 1,88 (m, 2H) ; 2,22 (s, : CH3-) ; 2,29 (s, CH3-) ; 2,33 (m, 2H) ; 2,90 (m, 2H) ppm.

113777 54 MS m/e 181 (M+) ; 111 (M+ -70); 104; 94; 77; 71 (100 %) ; 70.

UV (EtOH) λιηβχ 224 nm (ε 4650), 248 nm (ε 2450). IR

(KBr) 3140; 2795; 2540; 1665; 1540 cm'1.

5 4-Asetamido-4-syano-l-metyylipiperidiinin rengasrakenteeseen voitaisiin vaikuttaa myös emäksisessä väliaineessa. Siten tämän yhdisteen keittäminen palautusjäähdyttäjällä varustetussa kolvissa 1-N eta-nolisessa KOH:ssa tai 1-N NaOH-vesiliuoksessa antoi 10 myös AF230. Viimemainitussa tapauksessa saatiin myös 4-asetamido-4-karbanoyyli-l-metyylipiperidiiniä, sulamispiste 207-208°C, kiteytettynä dikloorimetaani-metanolista.

^-NMR (CDC13) δ 2,05 (CH3CO-); 2,08-2,30 (m, 6H) ; 2,28 15 (CH3N-); 2,63 (m, CH2-); 5,40 (brs, -NH-) ; 5,56 (brs, - NH-); 7,04 (brs, -NH-) ppm.

MS m/e 199 (M+) ; 181 (M+ -HzO) ; 155 (M+ -CONH2) ; 140 (M+ -CH2CONH2) ; 122; 112; 111; 96; 71 (100 %) ; 70.

AF230 saattaa olla tautomeerien muodossa, ku-20 ten otsikko ilmaisee.

Esimerkki 24; l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-metyyli-2'-oksatsoliini-41-oni) AF238 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 a) 4-Asetamidokarbonyyli-4-asetoksi-l-metyylipiperi- 2 ,* diini 3 *' 4 -Syano-4-hydroks i-1-metyylipiperidi inin 4 (2,55 g, 18 mmoolia) ja etikkahappoanhydridin (11 ml, 5 : 108 mmoolia) seokseen kolmikaulakolvissa lisättiin ti- 6 poittain 5,1 g (2 ekvivalenttia) 60 % perkloorihappo- 7 :· liuosta (HCIO4) . Tapahtui eksoterminen reaktio, mutta 8 ·/ lämpötila putosi 20 minuutin jälkeen. Liuosta sekoi- 9 ’ , tettiin 2 tunnin ajan ja jätettiin seisomaan yön yli 10 huoneenlämpötilaan. Valkoinen saostuma suodatettiin ja 11 pestiin eetterillä ja petrolieetterillä. Perklooriha- pon 4 - ase t amidokarbonyyl i - 4 - ase t oks i -1 -me tyyl ipiperi - M » t diinisuolaa saatiin melkein kvantitatiivinen saanto.

113777 55 ^-NMR [perkloraatti] (D20) δ 2,2-2,4 (tn, 2H) ; 2,26 (s, 3H); 2,27 (s, 3H); 2,5 (m, 2H); 2,95 (s, 3H); 3,32 (m, 2H); 3,58 (m, H) ppm.

1H-NMR [liikkuva kantoaine] (CDC13) δ 2,05-2,27 (m, 5 4H) ; 2,13 (s, 3H) ; 2,28 (s, 3H) ; 2,67-2,75 (m, 4H) ; 8,4 (bs, 1H, NH) ppm.

MS m/e 242 (M+) ; 182; 167; 139; 123 (100 %) ; 114; 96; 82; 70; 60.

UV (H20) kmax 206 nm (ε 20400) .

10 IR (KBr) 3380; 3020; 1740; 1670 (sh); 1550; 1400; 1380; 1250 cm'1.

b) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(2'-metyyli-2'- oksatsoliini-4-oni) AF238 15 Perkloorihapon 4-asetamidokarbonyyli-4-ase- toksi-l-metyylipiperidiinisuolaa (70 mg, 0,25 mmoolia) ksyleenissä lämmitettiin 172°C:ssa (silikoniöljy-hauteen lämpötila), jolloin valkoinen dispergoitu kiintoaine muuttui keltaiseksi. Voimakas eikkahapon 20 haju oli havaittavissa reaktion kuluessa. TLC osoittaa kokonaismuutoksen l-metyylipiperidiini-4-spiro-5' - (2 1 -metyyli-21-oksatsoliini-4-oni)ksi, AF238, jota kuva-; : taan perkloorihapon suolaksi.

; *: ^-NMR (D20) δ 2,2 (m, 3H) ; 2,25 (m, 2H) ; 2,45 (m, 2H) ; j 25 2,8 (s, 3H); 3,25 (m, 2H); 3,5 (m, 2H) ppm.

\ MS m/e 182 (M+) ; 140; 123; 112; 104; 96; 77; 70 (100 *>· < ·

Esimerkki 25: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 30 5'-(1'-metyyli-31-etyylihydantoiini) AF161 AF160:n (100 mg, 0,47 mmoolia) ja KOH:n (100 • t > mg, 35 p% mineraaliöljyssä) seokseen 5 ml:ssa DMF li-sättiin metyyli p-tolueenisulfonaattia (0,4 g, 1 mmoo-

• I

,··. lia) , liuosta sekoitettiin 10 minuuttia huoneenlämpö- • · ‘1' 35 tilassa ja tehtiin happamaksi oksaalihapolla eetteris- i sä. Saostuma liuotettiin veteen, tehtiin emäksiseksi ja ekstrahoitiin petrolieetterillä ja uutteet väkevöi- 113777 56 tiin ja erotettiin kromatografisesti silikalla käyttäen 90:10:1 kloroformi/metanoli/ammoniakkivettä. Puhtaat jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin ja jäännös liuotettiin eetteriin ja saostettiin HCl:n suolana (85 5 mg, saanto 72 %).

XH-NMR (liikkuva kantoaine, CDC13) δ 1,2 (t, J=6Hz, 3H) ; 1,6-1,65 (m, 2H); 2,0-2,1 (m, 2H); 2,39 (s, 3H) ; 2,75-2,85 (m, 4H) ; 2,86 (s, 3H) ; 3,55 (q, J=6Hz, 2H) PPm.

10 XH-NMR (HCl-suola, D20) δ 1,2 (t, J=6Hz, 3H) ; 2,1-2,15 (m, 2H) ; 2,3-2,4 (m, 2H) ; 2,95 (s, 3H) ; 3,0 (s, 3H) ; 3,5 (q, J=6Hz, 2H) ppm.

MS m/e 225 (M+ 18 %) ; 71 (100 %) .

15 Esimerkki 26: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-(1',3'-dietyylihydantoiini) AF162 l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-hydantoiinin (110 mg, 0,6 mmoolia) ja KOH:n (0,2 g, 35 p% mineraaliöljyssä) seokseen 3 ml:ssa DMF lisättiin etyylibro-20 midia (0,5 g, 4,6 mmoolia), liuosta sekoitettiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, laimennettiin eetterillä ja tehtiin happamaksi ylimäärällä oksaalihappoa. Saostuma liuotettiin veteen, tehtiin emäksiseksi ja ekstrahoitiin useita kertoja kloroformilla, ja uutteet 25 yhdistettiin, väkevöitiin ja erotettiin kromatografi- sesti silikageelillä käyttäen kloroformin ja 90:10:1 kloroformi/metanoli/ammoniakkiveden gradienttia antaen puhtaan AF162 (60 mg, saanto 42 %).

I · XH-NMR (liikkuva kantoaine, CDC13) δ 1,2 (t, J=6Hz, 30 6H) ; 1,65-1,7 (m, 2H) ; 1,96-2,15 (m, 2H) ; 2,4 (s, 3H); *;;; 2,5-2,6 (m, 4H) ; 3,3 (q, J=6Hz, 2H) ppm.

1H-NMR (HCl-suola, D20) δ 1,15 (t, J=6Hz, 6H) ; 2,05-·; · 2,15 (m, 2H) ; 2,25-2,35 (m, 2H) ; 2,9 (s, 3H) ; 3,3 (q, J=6Hz, 3H) ppm.

35 13C-NMR (HCl-suola, D20) O δ 14,0; 28,6; 35,0; 44,0; ·: 5 52,7; 59,2; 157,0; 177,0 ppm.

': : MS m/e 239 (M* 75 %) ; 71 (100 %) .

113777 57

Esimerkki 27: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 4'-(2'-metyylitio-5'-metoksi-4 Ή-imidatsoli) AF191 l-Metyylipiperidiini-4-spiro-41 -(21,5'-dime-tyylitio-4Ή-imidatsoli) AF177 (0,700 g, 2,881 mmoo- 5 lia) ja natriummetoksidia (0,360 g, 6,667 mmoolia) lämmitettiin palautusjäähdytyksen alaisena metanolissa (15 ml) 3,5 tunnin ajan. Kaasun kehitys havaittiin. Liuotin poistettii reaktioseoksesta ja jäännös ekstra-hoitiin dikloorimetaanilla. Orgaaninen uute haihdutet-10 tiin antaen kiinteän jäännöksen (0,613 b) , jota uutettiin kuumalla petrolieetterillä. Liuotin haihdutettiin uutteesta antaeb jäännöksen (0,263 g), joka kiteytettäessä petrolieetteristä antoi puhtaan AF191, sulamispiste 84-85°C.

15 ^-NMR (CDC13) 1,40 (m, 2H) ; 1,97 (m, 2H) ; 2,36 (s, CH3N-); 2,52 (s, CH3S-) ; 2,53 (m, 2H) ; 2,70-2,80 (m, 2H) ; 4,10 (s, CH3O-) ppm.

13C-NMR (CDCI3) 13,6 (CH3S-); 32,3 (C3) ; 46,2 (CH3N-) ; 51,9 (C2) ; 57,9 (CH30-); 74,2 (C4) ; 171,6 (-N=C-SCH3); 20 196,0 (-N=C-OCH3) ppm.

MS m/e 228 (M+ +1).

Esimerkki 28: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- ; 4'-(2 '-metyylitio-5 1-amino-4 Ή-imidatsoli) AF192 • 25 Ammoniakkiin metanolissa (15 p%) liuottamalla valmistettua AF177:n (0,411 g) liuosta reagenssissa , (15 ml) sekoitettiin 3 päivää huoneenlämpötilassa. Re- aktioseosta haihdutettiin ja uusi 15 ml osuus reagens-siä lisättiin jäännökseen ja reaktio toistettiin vielä 30 2 kertaa. Lopuksi reaktioseosta haihdutettiin alipai- t "·* neessa ja kiinteä jäännös pestiin asetonilla antaen AF192, valkoista kiinteää ainetta (0,266 g), sulamis-•;* *· piste > 240°C (etanolista).

^-NMR (D20) 1,48 (m, 2H) ; 1,89 (m, 2H) ; 2,29 (s, CH3N- » · 35 ); 2,46 (m, 2H) ; 2,48 (s, CH3S-); 2,86 (m, 2H) ppm.

: : i MS m/e 212 (M+) ; 142 (M+ -70); 70.

113777 58

Esimerkki 29: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 4'-(2'-metyylitio-5'-aminometyyli-4 Ή-imidatsoli) AF193 ja l-metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(2',5'-bis(aminometyyli)-4 Ή-imidatsoli) AF194 5 AF177:n (0,338 g) liuosta metyyliaminin vesi- liuoksessa (5,0 ml, 35 %) lämmitettiin 80°C:ssa 2 tunnin ajan. Vesi ja reagenssiylimäärä poistettiin haihduttamalla alipaineessa ja jäännös erotettiin kromato-grafisesti silikageelikolonnilla (Merck 60, 0,040-0,06 10 mm). Eluointi liuotinseoksella 80:20:1 klorofor-mi/metanoli)ammoniakkivesi antoi AF193 valkoisena kiinteänä aineena (0,061 g). Kiteytys asetonitriilistä antoi sulamispisteen 193-194°C.

^-NMR (CDC13) 1,44 (m, 2H) ; 1,85 (m, 2H) ; 2,38 (s, 15 CH3N-); 2,52 (s, CH3S-) ; 2,66 (m, 2H) ; 2,81 (m, 2H) ; 3,06 (s, CH3NH-); 6,47 (-NH-) ppm.

MS m/e 226 (M+) ; 179 (M+ -CH3S) ; 170 (M+ -CH3NHCN) ; 169; 156 (M+ -70).

Eluointi liuotinseoksella 50:50:1 klorofor-20 mi/metanoli/ammoniakkivesi antoi AF194 valkoisena kiinteänä aineena (0,130 g). Kiteytys asetonitriilistä antoi sulamispisteen 113-114°C.

^-NMR (CDCI3 + CD3OD) 1,44 (m, 2H) ; 1,81 (m, 2H) ; 2,37 : (s, CH3N-); 2,57 (m, 2H) ; 2,80 (m, 2H) ; 2,95 (s, CH3NH- : 25 ); 2,96 (m, CH3NH-) ppm.

; MS m/e 209 (M+) ; 152; 139 (M+ -70).

Toistettaessa ylläoleva reaktio, mutta käyttäen kaksi molekyyliä metyyliaminia kutakin AF177-molekyyliä kohden saatu päätuote oli AF193, sen sisäl-30 täessä ainoastaan jälkiä AF194:stä.

* > · » · '··>* Esimerkki 30: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- *:··* 4 1 - (2 '-metyyli-2 1-oksatsoliini) AF150 • · • · , ·, 35 a) l-Metyyli-4-nitrometyylipiperidiini-4-oli-hydro- » » · ’·· I kloridi “ ‘ Tämä lähtöaine valmistettiin käyttäen A.D.

113777 59

Calen (U.S. 4,746,655, 1988) menetelmän pientä modifikaatiota. N-metyylipiperidiinin (142 g, 1,28 moolia) ja nitrometaanin (78,1 g, 1,28 moolia) seosta lisättiin hyvin sekoitettuun natriumetoksidin (1,28 moolia) 5 liuokseen, 20 % etanolissa, pitäen sisäinen lämpötila 5-8°C:ssa. Valkoinen kiinteä aine saostua, sekoitusta jatketaan 20 minuutin ajan ja vielä 40 minuuttia huoneenlämpötilassa. Saatu liuos tehtiin happamaksi 500 ml :11a 7,2-N HCl isopropyylialkoholissa. Suolahappoa 10 ja epäorgaanisia suoloja ekstrahoitiin CH3OH:lla (3x200 ml) ja liuotin poistettiin tyhjössä antaen otsikon yhdisteen sulamispisteen ollessa 180-182°C (ei-hygroskooppinen).

m/z: 174 (liikkuvan kantoaineen M+, 100 %) ; 157 (M-OH, 15 20 %) ; 127 (M-H-N02, 25 %) ; 113 (M-N02-CH3/ 40 %) .

b) 4 - Aminome tyyl i -1 -me tyyl ipiper idi ini - 4 - oi i -hydro -kloridi

Palladiumia puuhiilellä (10 %, 4 g) lisättiin 20 annoksittain l-metyyli-4-nitrometyylipiperidiini-4-olin (133,5 g) liuokseen metanolissa (1500 ml). Yhdistettä hydrattiin Paarissa 55 lbs/sq2:n paineessa huo-neenlämpötilassa 48 tunnin ajan. Liuos suodatettiin t varovasti, käsiteltiin aktiivisella puuhiilellä, liuo- ; 25 tin poistettiin ja jäännös hienonnettiin etanolin * kanssa (200 ml) antaen otsikon tuotteen sulamispisteen ollessa 177-179°C.

m/z: 144 (liikkuvan kantoaineen M+, 15 %) ; 127 (M-OH, ! 25 %); 114 (M-CH2NH2, 100 %) .

30 c) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-4 1 - (2 1-metyyli-2 '- !(i<: oksatsoliini) AF150 KOH-liuos (1,43 g, 86 %) metanolissa (50 ml) • % lisättiin 4-aminometyyli-l-metyylipiperidiini-4-oli- ·;·' 35 hydrokloridiliuokseen (3,61 g, 0,02 moolia) absoluut- • * ;tj | tisessa metanolissa (50 ml) . 10 minuutin sekoittamisen •:·'; jälkeen lisättiin etyyliasetimidaattivetykloridin (2,7 113777 60 g) liuosta 20 ml:ssa absoluuttista metanolia ja sekoitusta jatkettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Liuotin poistettiin ja kiinteä jäännös liuotettiin 2,8 Na2C03-g liuokseen 50 ml:ssa vettä, joka väkevöitiin 5 kuivaksi tyhjössä. Valkoinen kiinteä aine ekstrahoi-tiin 2x50 ml :11a kloroformia, käsiteltiin aktiivisella puuhiilellä, kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin tuottaen otsikon tuotteen (saanto 62,5 %), sulamispiste 45°C (sublimoitui 40°C/0,05 mm Hg:ssa), antaen yh-10 den täplän silika TLCrllä eluoituna 2 % NH3:lla CH3OH:SSa, Rf=0,4.

m/z: 168 (liikkuvan kantoaineen M+, 100 % 7,5 ev:ssä). XH-NMR (300 MHz, CDC13) δ 3,56 (2H, q, J=l,5 Hz); 2,53 (4H, m); 2,34 (3H, s); 1,96 (3H, t, J=l,5 Hz); 1,82 15 (4H, m) .

Tässä esimerkissä käytetyn KOH:n korvaaminen ekvivalenttimäärällä NaOH tai Et3N antoi vastaavat tulokset .

20 d) AF150-dibentsoyyli-D-tartraatti

Kuuma dibentsoyyli-D-taraarihapon (5,4 g, 15 mmoolia) liuos 500 ml:ssa tolueenia lisättiin sekoit-taen 200 ml:aan kuivaan tolueeniin liuotettua AF150 (5,5 g, 32 mmoolia). Saostuman annettiin laskeutua ja ·,; 25 sakan yläpuolella oleva liuos dekantoitiin. Kiinteä '. jäännös pestiin 3x100 ml :11a kuivaa tolueenia ja kui- ·, vattiin alipaineessa antaen 8,4 g (saanto 80 %) vai- ! koista hieman hygroskooppista kiinteää ainetta.

TLC kloroformi/alumiinioksidi (Merck tyyppi 5581) 30 Rf=0,4.

m/z: 168 (M+) .

^-NMR (300 MHz, D20 sisältäen 1,5 mg Na2CO3/0,5 ml D20) δ 1,95 (S, 6H, CH3-C) ; 2,35 (s, 6H, CH3-N) ; 3,5 (s, 4H, CH2) ; 5,7 (s, 2H) ; 7,5-8,2 (m, 10H, aromaattisia vety- 35 jä) .

ti* * t · · » * » ♦ · » · 113777 61

Esimerkki 31: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 4'-(2'-etyyli-2'-oksatsoliini) (AF150:n 2'-etyyli- analogi) Tämä yhdiste valmistettiin samoin kuin esi-5 merkin 30 c) yhdiste käyttäen ekvivalenttimäärää etyy-lipropionimidaattihydrokloridia etyyliasetaattihydro-kloridin asemesta. Tuote saatiin nesteenä 60,5 %:n saannolla, kiehumispisteen ollessa 53°C/0,03 mmHg. 1H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 3,52 (2H, t, J=l,5 Hz); 2,47 10 (4H, m); 2,30 (3H, s); 2,6 [2H, quartet (J=7 Hz), trio (J=1,5 Hz)]; 1,86 (2H, m) 1,72 (2H, m) 1,18 (3H, t) .

Esimerkki 32: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 51 -(21-metyyli-2'-oksatsoliini) AF151 15 a) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-hydantoiini l-Metyylipiperidiini-4-onin (36,44 g, 0,322 moolia) etanolissa (150 ml), ammoniunkarbonaatin (93,0 g, 0,968 moolia) vedessä (400 ml) ja kaliumsyanidin 20 (25,8 g, 0,396 moolia) vedessä (82 ml) liuosten seosta lämmitettiin 60°C:ssa 2,5 tunnin ajan ja jätettiin sitten huoneenlämpötilaan yön yli/ kun 1-metyylipiperidiini-4-spiro-51-hydantoiini erottui. Se suodatettiin ja pestiin pienillä määrillä kylmää vet-25 tä, etanolia ja eetteriä antaen kiteistä jauhetta (27,0 g). Suodoksen ja pesunesteiden väkevöinti antoi toisen saannon (20,0 g). Tuote kiteytettiin metanolis-ta, sulamispiste 265-276°C.

IR (KBr) 3170 (NH) ; 1700 (C=0) cm-1.

30 m/z: 183 (M+, 38 %) ; 71 (100 %) .

;;j* ^-NMR (300 MHz, D20) δ 1,8 (2H) ; 2,06 (sextet, 2H) ; 2,49 (s, -CH3) ; 2,58 (t, 2H) ; 3,14 (t, 1H) ; 3,2 (t, 1H).

• · < * · ·* 35 b) 4-Amino-l-metyylipiperidiini-4-karboksyylihappo : l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-hydantoiinia ’·”* (9,75 g, 0,0533 moolia) ja bariumhydroksidioktahyd- 113777 62 raattia (28,8 g, 0,00913 moolia) vedessä (150 ml) lämmitettiin autoklaavissa 160°C:ssa 3 tunnin ajan. Neljän tällaisen panoksen sisältö yhdistettiin ja saostunut bariumkarbonaatti suodatettiin. Suodos netraloi-5 tiin kiinteällä hiilidioksidilla ja saostuma poistettiin suodattamalla. Suodos väkevöitiin pieneen tilavuuteen antaen 4-amino-l-metyylipiperidiini-4- karboksyylihappoa (32,0 g, saanto 95 %) , sulamispiste 275-280°C.

10 IR (KBr) 3300; 1655; 1580 cm'1.

m/z: 158 (M+, 90 %) ; 141 (98 %, M-OH) ; 113 (12 %, M-C02H) ; 96 (100 %) ; 71 (52 %) .

1H-NMR (300 MHz, C5D5N + D20) δ 1,2 (m, 2H) ; 1,48 (s, CH3N-); 1,7 (m, 2H); 1,9 (m, 2H); 2,0 (m, 2H).

15 c) 4-Amino-4-hydroks imetyyli-1-metyylipiperidiini

Litiumalumiinihydridijauhetta (15,62 g, 0,412 moolia) kuivassa tetrahydrofuraanissa (THF) (600 ml) lämmitettiin palautusjäähdytyksen alaisena 15 minuutin 20 ajan, jonka jälkeen lisättiin annoksittain typen alla 4-amino-l-metyylipiperidiini-4-karboksyylihappoa (31,0 g, 0,196 moolia) kuivan jauhon muodossa tehokkaasti .· sekoittaen. Kun lisäys oli päättynyt reaktioseosta lämmitettiin palautusjäähdytyksen alaisena 4 tunnin 25 ajan, jäähdytettiin 0°C:en typen alla tehokkaasti sekoittaen, laimennettiin lisäämällä huolella hitaasti ·. vettä (20 ml), 15 % NaOH:n vesiliuosta (20 ml) ja uu- t ! delleen vettä (10 ml). Reaktioseos suodatettiin ja saostuma ekstrahoitiin kiehuvalla THF:11a (3x150 ml) .

30 THF-suodos ja uutteet yhdistettiin ja liuotin poistet- * · ·*' tiin 25 mm:ssä antaen keltaista viskoosia öljyä (28,0 ’...· g, saanto 98,9 %) .

IR (laimentamaton) 3320 (NH) ; 3200 (br. OH) ; 1587 • · .··>. (NH2) ; 1468; 1448 cm'1.

35 m/z: 144 (M+, 15 %) ; 127 (M-OH); 113 (M-C02H) ; 96 (100 * %) ; 70 (41 %) .

XH-NMR (300 MHz, CDC13) δ 1,41 (m, 2H) ; 1,60 (m, 2H) ; 63 113777 2,24 (s, CH3-N) ; 2,29 (m, 2H) ; 2,48 (m, 2H) ; 2,50 (br., -NH2) ; 3,29 (s, -CH2OH.

d) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(2'-metyyli-2'- oksatsoliini) AF151 5 4-Amino-4-hydroksimetyyli-l- metyylipiperidiinin (1,80 g) seosta etikkahapon (20 ml) ja ksyleenin (20 ml) kanssa tislattiin atseotroop-pisesti 28 tunnin ajan. Jäljelle jäävä etikkahappo ja ksyleeni poistettiin alipaineessa (25 mmHg) jättäen 10 jäljelle viskoosia öljyä, joka tehtiin emäksiseksi pH-arvoon 11 K2C03:n vesiliuoksella. Ekstrahointi kloroformilla ja uutteen haihduttaminen jätti jäljelle pienen määrän ruskeata öljyä (0,27 g). Kloroformilla ekstrahoinnin jälkeen jäänyttä vesiliuosta haihdutet-15 tiin veden poistamiseksi, jäljelle jäänyttä kiinteää ainetta ekstrahoitiin kloroformilla ja uute kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin tuottaen hyvin hygroskooppisen kiinteän jäännöksen (3,0 g). TLC osoitti, että viimemainittu antoi pääasiassa yhden täplän, joka oli 20 polaarisempi kuin lähtöaminoalkoholi. Hygroskooppista kiinteää aineosaa, joka suli 150-160°C:ssa, lämmitettiin vakuumin alaisena ja melkein heti alkoi tislautua väritöntä öljyä 45°C/0,15 mmHg:ssa. Tämä öljy, pidettäessä jääkaapissa, muodosti huoneenlämpötilassa sula-·, · 2 5 via kiteisiä neulasia. Tisle oli otsikon tuotteen ' etikkahapon suola.

IR (laimentamaton) 1664 (-C=N) ; 1565 & 1398 (-C02~~) ; 1256 (C-O) cm'1.

m/z: 168 (liikkuvan kantoaineen M+) ; 109; 70.

30 1H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 1,77 (m, 2H) ; 1,96 (m, 2H) ; 1,98 (s, CH3-) ; 2,0 (s, CH3-) ; 2,49 (s, CH3-N-); 2,91 (m, 4H); 3,95 (s, -CH20-); 9,30 (br.s, -C02H) .

*:··: 13C-NMR (300 MHz, CDC13) δ 14,0 (CH3C02-) ; 22,9 (CH3C=N- :*··; ); 35,6 (C3 & Cs) ; 44,4 (CH3N+) ; 51,1 (C2 & C6) ; 67,0 35 (C4) ; 77,4 (Cs) ; 164,3 (C-N=) ; 176,7 (-C02-).

* * · ; Liikkuvan kantoaineen ^H-NMR (300 MHz, CDC13) δ 1,64 (m, 2H) ; 1,84 (m, 2H) ; 1,98 (s, CH3-) ; 2,26 (m, 2H) ; 113777 64 2,30 (s, CH3-) ; 2,69 (m, 2H); 3,94 (s, -CH2-).

Esimerkki 33: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 51 -(2'-etyyli-21-oksatsoliini) (AF151:n 2'-etyyli-5 analogi) 4-Amino-4-hydroksimetyyli-1-metyylipiperi-diinin (3,0 g) seosta propionihapon (50 ml) ja ksylee-nin (90 ml) kanssa tislattiin atseotrooppisesti 5 tunnin ajan. Jäännös (7 ml) tehtiin emäksiseksi pH-arvoon 10 11-12 K2C03:n vesiliuoksella. Ekstrahointi kloroformil la ja uutteen haihdutus antoi ei-polaaristen yhdisteiden seoksen (0,80 g). Kloroformiuuton jälkeen jäävää vesiliuosta haihdutettiin veden poistamiseksi, kiinteä jäännös ekstrahoitiin kloroformilla ja uute kuivattiin 15 (Na2S04) ja haihdutettiin tuottaen hygroskooppisen kiinteän jäännöksen (3,6 g). TLC osoitti, että viimemainittu antoi pääasiassa yhden täplän, joka oli po-laarisempi kuin lähtöaminoalkoholi (silikageeli, liuotin 40:58:2 metanoli/kloroformi/ammmoniakkivesi). Osa 20 hygroskooppisesta kiinteästä aineesta (1,5 g) lämmitettiin vakuumissa ja melkein välittömästi se alkoi tislautua viskoosina värittömänä öljynä 50°C/0,1 • .· mmHg:ssa. Tisle oli otsikon tuotteen propionihapon / suola.

25 m/z: 182 (liikkuvan kantoaineen M+, 14 %) ; 167 (5 %) ; 154 (71 %) ; 125 (9 %) ; 109 (100 %) ; 96 (45 %) ; 81 (30 %) ; 74 (57 %) ; 70 (89 %) ; 57 (64 %) .

^-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1,12 (t, J=7,5 Hz, CHCH2-) ; 1,17 (t, J=7,6 Hz, CH3CH2-) ; 1,75 (m, 2H) ; 2,00 (m, 30 2H) ; 2,29 (q, J=7,5, CH3CH2-); 2,30 (q, J=7,6, CH3CH2- ;;; ); 2,56 (s, CH3N-) ; 3,02 (m, 2--CH2-); 3,95 (s, -CH20- ); 7,52 (br. -C02H) .

·:· Yllä olevan propionihapon suolan (700 mg) se- .*"; koitettuun liuokseen koloroformissa lisättiin kylläs- 35 tettyä K2C03:n vesiliuosta kunnes C02-kaasun kehitys : oli lakannut. Seosta sekoitettiin sitten 0,5 tunnin ‘ : ajan ja faasit erotettiin. Vesifaasia ekstrahoitiin 113777 65 CHCl3:11a, yhdistetty erotettu CHCl3-faasi ja uutteet kuivattiin (Na2S04) ja liuotinta haihdutettiin antaen otsikon tuotetta (liikkuva kantoaine) värittömänä jäännösöljynä (550 mg), joka osoitti yhden täplän 5 TLC:ssa.

^-NMR (300 MHz, CDC13) δ 1,17 (t, J=7,5 Hz, CH3CH2-); 1,61 (m, -CH2-) ; 1,86 (m, -CH2-); 2,18 (m, -CH2~) ; 2,29 (q, J=7,6, CH3CH2 -) ; 2,30 (s, CH3N-) ; 2,71 (m, -CH2-) ; 3,94 (s, -CH20-) .

10 m/z: 182 (M+, 25 %) ; 167 (9 %) ; 154 (78 %) ; 125 (17 %) ; 109 (100 %) ; 81 (54 %) ; 70 (96 %) ; 57 (77 %) .

Vaihtoehtoinen tie yhdisteisiin, kuten AF150 ja AF151, riippuu sopivien amidien syklodehydraukses-ta. Dehydrausaineita, kuten P205, rikkihappo, BF3-15 eetteraatti, CaCl2, ja molekyyliseuloja voidaan käyttää yllä oleviin reaktioihin. Vastaavia tiatsoliineja voidaan saada oksatsoliinien asemesta vastaavilla reaktioilla käyttämällä P2S5.

20 Esimerkki 34: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-(2'-metyyli-2'-tiatsoliini) AF150(S) .· a) 4-Asetamidometyyli-4-hydroksi-l-metyylipiperidiini 4-Aminometyyli-4-hydroksi-1-metyylipiperi-.· 25 diiniä (0,83 g, 5,7 mmoolia) liuotettiin 10 ml CHC13 ja lisättiin etikkahapon anhydridiä (0,58 g, 5,7 mmoolia) . Reaktioseos lämpeni itsestään 40-50°C:en. 30 mi-, ·. nuutin jälkeen liuotin haihdutettiin ja raakajäännös erotettiin kromatografisesti silikageelikolonnilla 30 (Merck 7734) käyttäen eluenttina 33:67 2 % ammoniakki- * 1 1 vesi/metanolia.

';·1 m/z 186 (M+) ·:··: XH-NMR (300 MHz, CDC13) δ 1,60 (multiplet, 4H, H3 ja ···1; H4) ; 2,01 (singlet, 3H, CH3-C) ; 2,29 (singlet, 3H, CH3- 35 N); 2,38 (multiplet, 2H, Hl); 2,55 (multiplet, 2H, • » · ; H2) ; 2,98 (multiplet, 1H, NH) ; 3,26 (douplet, 2H, H5) : Ppm.

113777 66 1H-NMR (300 MHz, D20) δ 1,42 (multiplet, 4H, H3 ja H4) ; 1,81 (singlet, 3H, CH3-C) ; 2,08 (singlet, 3H, CH3-N) ; 2,27 (multiplet, 2H, HI); 2,46 (multiplet, 2H, H2) ; 3,03 (singlet, 2H, H) ppm.

5 Epäpuhtaus antaa piikin 3,44 ppm.

b) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(2'-metyyli-21 - tiatsoliini) AF150(S) 4-Asetamidometyyli-4-hydroksi-l-metyylipipe-10 ridiinin (6,5 g, 35 mmoolia) seos fosforipentasulfidin (10 g, 22 moolia) kanssa lämmitettiin 220°C:ssa 30 minuutin ajan, jäähdytettiin ja liuotettiin 30 ml konsentroitua HC1-vesiliuosta. Liuos sekoitettiin 100 ml kanssa kylmää konsentroitua NaOH-vesiliuosta, ekstra-15 hoitiin 2x100 ml CHC13 ja yhdistetyt uutteet kuivattiin ja haihdutettiin tuottaen 5 g mustaa öljyjäännöstä, joka puhdistettiin tislaamalla 75°C/1 mmHg:ssa antaen 1,8 g kirkasta nestettä, m/z 186 (M+) 20 ^-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1,8-2,0 (m, 4H) ; 2,17 (t, 3H, CH3-C) ; 2,2 (s, 3H, CH3-N) ; 3,9 (q, 2H, CH2- tiatsoliinirengas).

Esimerkki 35: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- • 25 51 -(2'-tioni-3'-etyylihydantoiini) AF181 4-Aminometyyli-l-metyylipiperidiini-4-karbok-syylihapon (1,78 g, 0,0113 moolia) ja natriumhydroksi-din (0,47 g, 0,0118 moolia) liuokseen vedessä (3,0 ml) * · lisättiin etyyli-isotiosyanaattia (1,00 g, 0,0111 moo-30 lia) ja seosta lämmitettiin palautusjäähdytyksen alai- < * * sena 6,5 tunnin ajan. Reaktioseos tehtiin happameksi 1 · * ’...· pH-arvoon 1 konsentroidulla suolahapolla ja refluk- sointia jatkettiin 1,5 lisätunnin ajan. Reaktioseoksen .··*. seistessä huoneenlämpötilassa saostui kiinteä aine 35 (0,61 g), joka kiteytettiin metanolista antaen kiteitä • * · ·’ (83 mg) sulamispisteen ollessa > 260°C. Tämän kiinteän aineen 1H-NMR spektri osoittaa, että se on AF181:n 113777 67 suolahapon suola.

^-NMR (D20) δ 1,16 (t, J=7,2 Hz, CH3CH2-) ; 2,0-2,4 (m, 4H) ; 2,94 (s, CH3N-); 3,20 (m, 1H) ; 3,4-3,74 (m, 3H) ; 3,80 (q, J=7,2, CH3CH2-) ppm.

5 Edellä mainitun suolan eristämisen ja kitey

tyksen jälkeen jääneet emäliuokset yhdistettiin, tehtiin emäksiseksi pH-arvoon 13 konsentroidulla natrium-hydroksidin vesiliuoksella, ekstrahoitiin sitten di-kloorimetaanilla. Uute kuivattiin (Na2C03) ja haihdu-10 tettiin antaen kellertävän kiinteän aineen, joka erotettiin kromatografisesti silikageelikolonnilla (Merck 60 0,04.0,06 mm). Eluointi kloroformi/metanoli/ ammo-niumhydroksidin vesiliuoksella 96:3:1 antoi ensin 1,3-dietyyli-2-tioureaa (0,287 g), sulamispiste 76-78°C

15 (kiteitä eetteristä) ja jälkeenpäin 8-metyyli-3-etyyli-1,3,8-triatsaspiro[4,5]dekaani-4-oni-2-tioni (AF181) (135 mg) liikkuvana kantoaineena. Se kiteytet tiin eetteri-dikloorimetaanista antaen neulakiteitä sulamispisteen ollessa 180°C.

20 ^-NMR (CDC13) δ 1,24 (t, J=7,2 Hz, CH3CH2-) ; 1,69 (m, 2H); 2,05 (m, 4H); 2,35 (s, CH3N-); 2,90 (m, 2H); 3,87 (q, J=7,2 Hz, CH3CH2-) ppm.

MS m/e 227 (M+) ; 71; 70.

, ,.· 25 Esimerkki 36: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- ,5'-(2'-tioni-3'-t-butyylihydantoiini) AF184 . ‘. 4-Amino-l-metyylipiperidiini-4-karboksyyli- , ·, hapon (1,80 g, 0,0114 moolia) ja t-butyyli- isotiosyanaatin (1,00 g, 0,0087 moolia seosta vedessä 30 (3,0 ml) lämmitettiin 80°C:ssa 5 tunnin ajan. Kun re- ;;; aktio TLC:n mukaan ei ollut päättynyt, lisättiin eta- I · nolia (4,0 ml) ja reaktioseosta lämmitettiin palautus-·;·*· jäähdytyksen alaisena 1 lisätunnin ajan. Se tehtiin happameksi pH-arvoon 1 konsentroidulla suolahapolla ja • At 35 refluksointia jatkettiin 1 lisätunnin ajan. Yön yli ·' seisomisen jälkeen sakka erotettiin ja se suodatettiin ’ · antaen lähtöaminohappoa (0,60 g). Emäliuosta haihdu- 113777 68 tettiin ja emäksiseksi konsentroidulla natriumhydrok-sidin vesiliuoksella tehty jäännös ekstrahoitiin sitten dikloorimetaanilla. Orgaaninen uute kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin antaen kiteistä kiinte-5 ää ainetta (0,101 g), neulaskiteitä eetteri- dikloorimetaanista sulamispisteen ollessa 200-201°C. ^-NMR (CDC13) δ 1,63 (m, 2H) ; 1,81 [s, (CH3)3C-]; 2,0- 2,21 (m, 4H) ; 2,33 (s, CH3N-); 2,87 (m, 2H) ; 7,82 (bs, -NH-) ppm.

10 MS m/e 255 (M+) ; 199 (M+ -C4H8) ; 96; 71; 70; 57.

Esimerkki 37: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-(31-t-butyylihydantoiini) AF213

Otsikon tuote syntetisoitiin samalla tavalla 15 kuin AF181. Tuote saatiin l-metyylipiperidiini-4- spiro-5'-(3'-t-butyylihydantoiini)n AF213 suolahapon suolana ja kiteytettiin metanolista sulamispisteen ollessa 300-303°C.

^-NMR (D20) δ 1,55 [s, (CH3)3C-]; 2,01 (m, 2H) ; 2,22 20 (m, 2H) ; 2,92 (s, CH3N-) ; 2,97-3,5 (m, 2H) ; 3,62 (m, 2H) ppm.

Saatu liikkuva kantoaine kiteytettiin eetteri -dikloorimetaanista ja sen sulamispiste oli 221-• *: 223 °C.

. 25 ^-NMR (CDC13) δ 1,57 (m, 2H) ; 1,60 [s, (CH3)3C-]; 2,01- 2,18 (m, 4H) ; 2,31 (s, CH3N-) ; 2,88 (m, 2H) ; 4,77 (bs, . ·. -NH-) ppm.

13C-NMR (CDC13) δ 28,6 [(CH3)3C-]; 33,5 (C6 & C10) ; 46,2 (CH3N-); 51,0 (C7 & C9) ; 57,5 ja 58,1 [C5 & (CH3)3C-]; 30 158,4 (C2) ; 177,4 (C4) ppm.

•;;f MS m/e 239 (M+) ; 237; 224 (M+ -CH3) ; 194; 181; 155; 110; 104; 71; 56; 43.

* » · « · .···. Esimerkki 38: l-Propargyylipiperidiini-4- ·’ 35 spiro-5 ' - (3 '-etyylihydantoiini) AF196 : l-Piperidiini-4-spiro-5 ' - (3 ' -etyylihydanto- iini)n (AF160)DES (40,9 mg, 0,21 mmoolia) ja propar- 113777 69 gyylibromidin (24,7 mg, 0,21 mmoolia, 80 p% tolueenis-sa) seosta sekoitettiin metanolissa (1,0 ml) 25°C:ssa 24 tunnin ajan. Metanoli poistettiin typpivirralla ja saatu massa tehtiin emäksiseksi natriumkarbonaatin ve-5 siliuoksella ja uutettiin kloroformilla. Kloroformi-uutteet haihdutettiin ja jäännös puhdistettiin sili-kageelirikastuslevyllä (kloroformi/metanoii/ammoniak- kivesi 90:10:1) ja saostettiin ylimäärällä oksaalihappoa antaen saannoksi kiteistä kiinteää ainetta (29 10 mg).

Hi-NMR (D20, oksaalihapon suola) δ 1,12 (t, 3H, J=6 Hz, CH3CH2-) ; 2,1-2,35 (m, 6H) ; 3,12 (t, 1H, J=3,5 Hz); 3,5 (q, J=6 Hz, CH3CH2-) ; 3,7-3,85 (m, 2H) ; 4,12 (d, J=3,5

Hz) ppm.

15 MS m/e 235 (M+) ; 196 (M+ -C3H3) ; 95; 80; 67; 56.

Esimerkki 39: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-[3'-(4-pyrrolidoni-2-butynyyli)hydantoiini] AF197 l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(3'-propar-20 gyylihydantoiini)n (AF185) (204 mg, 0,92 mmoolia), pyrrolidonin (88 mg, 1,23 mmoolia), paraformaldehydin (52 mg, 1,7 mmoolia) ja kupari (I) kloridin (4,2 mg) seosta sekoitettiin dioksaanissa (10 ml) huoneenlämpö-; : tilassa 70 tunnin ajan. Dioksaani poistettiin typpi- .· 25 virralla, saatu massa tehtiin emäksiseksi kaliumkar bonaatin vesiliuoksella ja uutettiin kloroformilla.

, ·. Kloroformiuutteita haihdutettiin ja 50 p% jäännöksestä puhdistettiin silikageelirikastuslevyllä (klorofor-mi/metanoli/eetteri/ammoniakkivesi 150/20/100/6), ki-30 teytettiin kahdesti eetteristä antaen saannoksi ki- I * · teistä kiinteää ainetta (25 mg) .

1H-NMR (CDC13, liikkuva kantoaine) δ 1,12 (m); 2,1-2,2 (m); 2,35 (S, 3H) ; 2,6 (m); 2,9-2,95 (m); 3,4 (t, 2H, ,··. J=3,5 Hz); 5,9 (bs, 1H) ppm.

/* 35 MS m/e 304 (M+) ; 234 (M+ -C4H8N) ; 71 (C4H9N+) .

’ * > * » * · 113777 70

Esimerkki 40: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-(21-metyyli-11,4'-oksatsolidiini-3'-oni) AF260 1-Metyyli-4-piperidonin (5,0 g, 44,2 mmoo-lia) , etyyli-(s)-laktaatin (5,75 g, 48,8 mmoolia), am-5 moniumkarbonaatin (6,38 g) ja p-tolueenisulfonihapon (2,1 g) seos tolueenissa (100 ml) suljettiin ruostumattomaan teräsastiaan ja lämmitettiin sekoittaen 107°C:ssa 24 tunnin ajan. Tolueeni poistettiin reak-tioseoksesta tislaamalla ja jäännös erotettiin kroma-10 tografisesti silikageelikolonnilla (Merck 60) . Eluoin-ti liuotinseoksella kloroformi/metanoli/ammoniakki 92:7:1 antoi jakeen (1,01 g), joka edelleen erotettiin kromatografisesti silikageelikolonnilla. Eluointi liuotinseoksella kloroformi/eetteri/metanoli/ammonium-15 hydroksidi 54:37:7:2 antoi raakatuotteen (0,441 g), joka kiteytettiin eetteri-petrolieetteristä ja sitten tolueenista antaen l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-metyyli-1',41-oksatsolidiini-3'-oni)a (AF260) neu-laskiteinä (85 mg) sulamispisteenollessa 148-150°C.

20 1H-NMR (CDC13) δ 1,42 (d, J=6,6 Hz, CH3CH-) ; 1,85 (m, 4H) ; 2,31 (s, CH3N-); 2,52 (m, 4H) ; 4,40 (q, J=6,6 Hz, CH3CH-); 7,64 (bs, -NH-) ppm.

MS m/e 184 (M+) ; 156; 126; 114; 84; 71; 70; 43 (100 : > %)· ! 25 , *: Esimerkki 41: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- . 5 ' - (2 ' -metyyli-1' , 4 '-tiatsolidiini-3 ' -oni) AF261 ja , . Esimerkki 42: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-{2',A'-dimetyyli-11,4'-tiatsolidiini-3'-oni) AF266 30 *;;; a) 1-Metyyli-4-piperidonin (5,65 g, 0,050 moolia), I · '··*' tiomaitohapon (6,37 g, 0,060 moolia) ja ammoniumkar- ·;·· bonaatin (7,20 g) seosta bentseenissä (150 ml) lämmi- tettiin palautusjäähdytyksen alaisena 16 tunnin ajan, 35 kunnes sublimoitui kiinteä aine (ammoniumkarbonaatti), · joka kondensoitui reaktioastian ulkopuolelle. Ajoit- ’ tain tätä kiinteää ainetta lisättiin takaisin reaktio- 113777 71 astiaan uuden ammniumkarbonaatin lisäannoksen (yhteensä 6,3 g) kanssa. Lopuksi poistettiin bentseeni tislaamalla ja jäännös pestiin eetterillä antaen eetteriin liukoisen aineen (0,76 g) ja liukenemattoman ai-5 neen (12,9 g), joka liuotettiin pieneen määrään me-tanolia ja tehtiin emäksiseksi ammoniakin metanoliliu-oksella. Sitä haihdutettiin ja erotettiin kromatogra-fisesti silikageelikolonnilla (Merck). Eluointi liuo-tinseoksella kloroformi/metanoli/ammoniakki 89:10:1 10 antoi jakeen (0,61 g), joka tunnistettiin 1- metyylipiperidiini-4-spiro-5 ^(2^41 -dimetyyli-11,4 ' -tiatsolidiini-3'-oni)ksi AF266. Se on alhaisessa lämpötilassa sulava hygroskooppinen kiinteä aine.

1H-NMR (CDC13) δ 1,53 (d, J=7 Hz, CH3CH-); 1,69 (m, 15 2H) ; 2,16-2,44 (m, 4H); 2,32 (s, CH3N-); 2,87 (m, 2H) ; 2,90 (s, CH3NCO-) ; 3,79 (q, J=7 Hz, CH3CH-) ppm.

13C-NMR (CDCI3) δ 19,7 (CH3CH-) ; 27,2 (CH3NCO-) ; 36,0 ja 37,3 (C6 & C10) ; 39,7 (C2) ; 45,3 (CH3N-) ; 51,8 ja 52,2 (C7 & C9) ; 68,5 (C5) ; 172,8 (C3) ppm.

20 AF266:n suolahapon suola saatiin käsittele mällä liikkuvan kantoaineen liuosta eetterissä suolahapon isopropyylialkoholiliuoksella antaen hygroskoop-'·/· pisen kiinteän aineen, joka kiteytettiin isopropyyli- , *: alkoholista, sulamispisteen ollessa 238-240°C.

·.: 25 ^-NMR (D20, HC1-suola) δ 1,48 (d, J=7,2 Hz, CH3CH-) ; \ 2,05 (m, 2H) ; 2,57 (m, 2H) ; 2,89 ja 2,91 (2s, CH3N+- ja ”, CH3NCO-) ; 3,31 (m, 2H) ; 3,61 (m. 2H) ; 4,04 (q, J=7,2

Hz, CH3CH-) ppm.

• ♦ MS m/e 214 (M+) ; 181; 156; 125; 124; 96; 71; 70; 57 30 (100 %); 43.

* » ·

Kolonnin eluoinnin jatkaminen liuotinseoksel- * * la kloroformi/metanoli/ammoniakki 85:14:1 antoi jakeen (3,50 g), joka kiteytettiin eetteri-dikloorimetaanista ,···, antaen l-metyylipiperidiini-4-spiro-5' - (2' -metyyli- » * 35 11,4 1-tiatsolidiini-3 1-oni) a AF261 neulaskiteinä (1,83 !.; · g) sulamispisteen ollessa 133-134°C.

':· i 1H-NMR (CDCI3) δ 1,53 (d, J=7 Hz, CH3CH-) ; 1,9-2,20 (m, 113777 72 4H) ; 2,20-2,42 (m, 2H) ; 2,30 (s, CH3N-); 2,68 (m, 2H) ; 3,85 (q, J=7 Hz, CH3CH-); 6,90 (bs, -NH-) ppm.

13C-NMR (CDC13) δ 19,9 (CH3CH-) ; 41,0 ja 41,3 (C6 & Ci0) ; 41,3 (C2) ; 45,7 (CH3N-) ; 52,5 ja 52,8 (C7 & C9) ; 63,6 5 (C5) ; 176,3 (C3) ppm.

MS m/e 200 (M+) ; 167; 140 (M+ -CH3CHS-); 91; 71; 70; 69; 57.

AF261:n suolahapon suola saatiin käsittelemällä liikkuvan kantoaineen liuosta eetterissä suola-10 hapon isopropyylialkoholiliuoksella, sp. 285-287°C.

^-NMR (HCl-suola D20: ssa) Ö 1,50 (d, J=7,l Hz, CH3CH- ); 2,17-2,44 (m, 4H) ; 2,89 (s, CH3N-); 3,24 (m, 2H) ; 3,59 (m, 2H) ; 4,10 (q, J=7,l Hz, CH3CH-) ppm.

15 b) 1-Metyyli-4-piperidonin (5,65 g, 0,050 moolia), tiomaitohapon (6,37 g, 0,060 moolia) ja ammoniumkar- bonaatin (7,20 g) seos bentseenissä (100 ml) suljettiin ruostumattomaan teräspaineastiaan ja lämmitettiin yön yli 95°C:ssa magneettisekottajalla sekoittaen.

20 Liuotin poistettiin reaktioseoksesta ja jäännös liuotettiin pieneen määrään metanolia ja ladattiin silika-geelikolonnille (Merck 60, 200 g) . Eluointi liuotinse-oksella kloroformi/metanoli/ammoniakkivesi 94:5:1 antoi ensin AF266 (0,71 g) ja jälkeenpäin AF 261 (3,02 •f 25 g).

• ; *t* c) l-Metyyli-4-piperidonin (2,50 g, 22,1 mmoolia) , . ·. tiomaitohapon (2,81 g, 26,5 mmoolia) ja metyyliaminin (0,90 g, 29,0 mmoolia) seos tolueenissä (60 ml) sul-. 30 jettiin ruostumattomaan teräspaineastiaan ja lämmitet- tiin sekoittaen 96°C:ssa 24 tunnin ajan. Reaktioseos on viskoosi öljy, josta erottui sakka ja tolueeniliu-*:*: os. Liuos erotettiin ja liuotin poistettiin tislaamal- la. Jäännös (1,68) tislattiin alipaineessa antaen puh-.·. 35 taan l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2',4'-dimetyyli- ··· | 1',4 '-tiatsolidiini-3 ' -oni) n AF266, kiehumispisteen ' * ollessa 100°C (0,35 mmHg), kiinteänä aineena (1,02 g), 73 113777 sp. 43-45°C.

Esimerkki 43: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'- (21-etyyli-1',41-tiatsolidiini-3'-oni) AF267; ja 5 Esimerkki 44: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 51 -(21-etyyli-4-metyyli-1',4'-tiatsolidiini-31-oni) AF272

Otsikon tuote AF267 valmistettiin, kuten on kuvattu AF261:n valmistuksen yhteydessä, käyttäen 2-10 merkaptobutyyrihappoa 2-merkaptopropionihapon (tiomai-tohapon) asemesta. Se kiteytettiin asetonista, sp. 140-141°C.

^-NMR (CDC13) δ 1,02 (t, J=7,2 Hz, CH3CH-) ; 1,75 ja 2,06 (m, CH3CH2-); 1,98 (m, 4H) ; 2,30 (s, CH3N-) ; 2,32 15 (m, 2H) ; 2,67 (m, 2H) ; 3,81 (dd, -CHS-); 6,35 (bs, - NH-) ppm.

13C-NMR (CDCI3) δ 11,4 (CH3CH2-); 27,1 (CH3CH2) ; 41,5 (C6 & C10) ; 45,8 (CH3N-) ; 49,0 (C2) ; 52,9 (C7 & C9) ; 63,7 (C5) ; 175,5 (C3) ppm.

20 MS m/e 214 (M+) ; 181; 140; 71; 57.

AF267:n suolahapon suolan sulamispiste oli 267-269°C. Sivutuotteena saatiin 1-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-etyyli-4-metyyli-1',4'-tiatsolidiini-3'-oni)a AF272 viskoosina öljynä, ί 25 1H-NMR (CDCI3) ϋ 1,0 (t, J=7,4 Hz, CH3CH-) ; 1,67 (m, 2H) ; 1,58-1,78 (m) ja 2,13 (m, CH3CH2-) ; 2,20-2,42 (m, 4H) ; 2,32 (s, CH3N-) ; 2,89 (s, CH3NCO-) ; 2,90 (m, 2H) ; , 3,76 (dd, j 1=3,6 Hz, j2 = 9,0 Hz, CH3CH2H-) ppm.

MS m/e 228 (M+) ; 195; 170; 138; 125; 96; 71; 70; 57.

30

Esimerkki 45; l-Metyylipiperidiini-4-spiro-’'y1 5 1 - (11-sulfoksi-4 '-atsa-2 '-metyyli-3 '-oni) AF262 ’;· ί l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5 ' - (2 ' -me tyyli- 14'-tiatsolidiini-3'-oni)n (AF261) (48,4 mg, 0,24 . 35 mmoolia) seosta 2,0 ml:ssa etikkahappoa ja 0,5 ml:ssa 1 1 1 ; vetyperoksidin vesiliuosta (32%) sekoitettiin 25°C:ssa 1 minuutin ajan. Reaktioseos tehtiin happamaksi li- 113777 74 säämällä ylimäärin suolahappoa ja laimennettiin 20 ml :11a petrolieetteri/eetteriä 4:1. Sakka liuotettiin natriumkarbonaatin vesiliuokseen ja liuosta ekstrahoi-tiin kloroformilla. Kloroformiuute kuivattiin, haihdu-5 tettiin ja saatu massa erotettiin kromatografisesti silikageelirikastuslevyllä (kloroformi/metanoli/ammo- niakkivesi 80:20:1) antaen saannoksi 3,3 mg öljyä, joka saostettiin eetteristä oksaalihapolla antaen saannoksi kiteisen kiinteän aineen yhden isomeerin (puhta-10 us >90 %) .

^-NMR (CDC13, liikkuva kantoaine) δ 1,52 (d, 3H, J=6

Hz, CH3CH-) ; 1,85-2,7 (m, 8H) ; 2,36 (s, 3H, CH3-N) ; 3,55 (q, J=6 Hz, CH3CH-); 7,0 (bs, 1H) ppm.

MS m/e 216 (M+) ; 199; 167; 149; 125; 111.

15

Esimerkki 46: Piperidiini-4-spiro-5'-(2'- metyyli-1',4'-tiatsolidiini-31-oni) AF263 l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(21-metyyli-1',4'-tiatsolidiini-3'-oni)n (AF261) (250 mg, 1,25 20 mmoolia) ja a-kloorietyyliklooriformaatin (0,15 ml, 1,4 mmoolia) seosta lämmitettiin 5 ml:ssa dikloori-etaania 60°C:ssa 90 minuutin ajan. Dikloorietaani poistettiin typpivirralla ja öljymäinen jäännös liuotettiin metanoliin ja lämmitettiin 60°C:ssa 1 tunnin . 25 ajan. Metanoli haihdutettiin, jäännös liuotettiin nat- ' riumkarbonaatin vesiliuokseen, uutettiin kloroformilla ja erotettiin silikageelirikastuslevyllä (klorofor-mi/metanoli/ammoniakkivesi 80:20:1) antaen saannoksi , · 20 mg liikkuvaa kantoainetta, joka saostettiin kitei- 30 senä oksaalihapon suolana.

; ^-NMR (D20, oksaalihapon suola) δ 1,51 (d, 3H, J=6 Hz, f; CH3CH-) ; 2,2-2,35 (m, 4H) ; 3,1-3,6 (m, 4H) ; 4,1 (q, ·’. J=6 Hz, CH3CH-) ppm.

» I I · » 113777 75 1-Metyylipiperidonin (11,3 g, 0,1 moolia), tiomaitohapon (15 ml) ja p-tolueenisulfonihapon liuosta asetonitriilissä refluksoitiin 24 tunnin ajan ja jatkettiin TLC:lla (Silika-20 % metanoli kloroformis-5 sa) . Sitten liuosta haihdutettiin, liuotettiin kloroformiin ja pestiin natriumbikarbonaatin liuoksella ja sitten vedellä. Orgaaninen faasi kuivattiin natrium-sulfaatilla ja haihdutettiin. Tuote puhdistettiin si-likageelikolonnilla (Merck 60) . Eluointi liuotinseok-10 sella kloroformi/metanoli/ammoniakki antoi 10,27 g öljyä, joka kiteytyy seistessään huoneenlämpötilassa. Se tunnistettiin l-metyylipiperidiini-4-spiro-51 - (3 1 - metyyli-1',4'-oksatiolaani-2'-oni)ksi (AF265), sp. 92°C.

15 ^-NMR (CDC13) 6 11,6 (d, 3H) ; 1,98-2,12 (m, 2H) ; 2,13- 2,3 (m, 2H) ; 2,34-2,55 (m, 2H) ; 2,55-2,72 (m, 2H) ; 2,30 (S, 2H); 4,06 (q, 1H) ppm.

13C-NMR (CDCI3) δ 18 (CH3CH, quartet) ; 39 (C6 ja Ci0, yksi tripletti) ; 40 (CH3CH, dupletti) ; 45,5 (CH3-N, kvar-20 tetti) ; 51,8 ja 52 (C7 ja C9, kaksi erillistä triplet- tiä); 87 (C5, singlet); 175 (C=0) ppm.

MS m/e 201 (M+) AF265-yhdiste (liikkuva kantoaine) liuotettiin asetoniin ja lisättiin oksaalihappoa (1 mooli/2 • 25 moolia liikkuvaa kantoainetta). Valkoinen kiinteä aine saostui muutamien sekuntien jälkeen. Se suodatettiin, pestiin asetonilla, kloroformilla ja eetterillä ja kuivattiin eksikaattorissa. Se tunnistettiin AF265:n oksaalihapon suolaksi. Tämän suolan pysyvyyttä tutki-30 taan yhä. Osa siitä hajoaa vedessä mahdollisesti lak-tönin hydrolyysissä ja renkaan avautumisella saadusta tuotteesta aiheutuvia merkkejä voidaan nähdä 13C-NMR-,...1 spektrissä, joka tallennettiin D20.-ssa ainakin 3 tun- ,···, nin lukukasautuman ajan. Heti liukenemisen jälkeen mi- ’!* 35 tatussa ΙΗ-NMR-spektrissä on näkyvissä ainoastaan spi- : ro-yhdiste. Havaittiin, että AF265:n liuos vedessä osoittaa yhden viikon jälkeen n. yhden kolmasosan ren- 113777 76 kaista avautuneen sulamispisteen ollessa 120°C.

^-NMR (Da0) δ 1,55 (d, 3H) ; 2,3-2,6 (m, 4H) ; 2,9 (s, 3H) ; 3,2-3,4 (m, 2H) ; 3,4-3,7 (m, 2H) ; 4,4 (q, 1H) ppm.

5 13C-NMR (D20) δ 17,5 (CH3CH) ; 36 ja 36,5 (C6 ja Ci0) ; 41,5 (CH3CH) ; 43 (CH3-N) ; 51 (C7 ja C9) ; 87 (C5) ; 167 (oksaalihapon CO); 177 (C=0) ppm.

Esimerkki 48: Piperidiini-4-spiro-5'-(3'- 10 metyyli-1',4'-oksatiolaani-2'-oni) AF269 Lähtöaine l-metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(3'-metyyli-14'-oksatiolaani-21-oni) (AF265) (80 mg) liuotettiin bentseeniin ja liuos haihdutettiin kuivaksi varmistamaan, ettei kosteutta ole mukana. Lisättiin 15 typpi-ilmakehässä molekyyliseulalla kuivattu dikloori-metaani (n. 4 ml) ja sen jälkeen 1-kloori- etyylikiooriformaatti (56 mg) . Reaktioseos lämmitettiin 100°C:en n. 1 tunnin ajaksi ja haihdutettiin sitten. Lisättiin kloroformia ja suodatettiin valkoinen 20 kiinteä aine, pestiin kloroformilla ja hiilitetraklo-ridilla ja sitten kuivattiin. Tuote tunnistettiin pi-peridiini-4-spiro-51 -(3'-metyyli-1',4'-oksatiolaani-2'-oni)n (AF269) suolahapon suolaksi.

1H-NMR (D20) δ 1,55 (d, CH3CH) ; 2,25-2,55 (m, 4H) ; 3,3- ,1 25 3,42 (m, 4H) ; 4,4 (q, CH3CH) ppm.

\ MS m/e 187 (M+) .

»

Esimerkki 49: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- » ™ 1 .............. “ 21 -(51-metyyli-11,31-oksatsolidiini) AF264 30 l-Metyyli-4-piperidonin (11,30 g, 0,10 moo- lia) ja DL-l-amino-2-propanolin (9,75 g, 0,13 moolia) * * » ·.,.· seosta lämmitettiin refluksoimalla 1,5 tunnin ajan.

....: Reaktioseos tislattiin alipaineessa. Jakeen, joka tis- ,···, lautui 30-110°C:ssa (18 mmHg) ja sisälsi vettä, yli- • > *” 35 määrin aminoalkoholia ja tuotteen, poiston jälkeen : tislattiin puhdas tuote l-metyylipiperidiini-4-spiro- 2'- (5' -metyyli-11,3' -oksatsolidiini) (AF264) 110- 113777 77 115°C:ssa (18 mmHg, 10,70 g).

^-NMR (CDC13) δ 1,22 (d, J=6 Hz, CH3CHO-) ; 1,75 (m, 4H) ; 2,30 (s, CH3N-); 2,49 (m, 4H) ; 2,70 (dd) ja 3,27 (dd, j 1=6,6 Hz, j2 = 12 Hz, -CH2NH-) ; 4,04 (m, jl=6,6 5 Hz, j2=6 Hz, CH3CHO-) ppm.

13C-NMR (CDCI3) δ 20,3 (CH3CHO-) ; 35,3 ja 36,7 (C6 & C10) ; 45,5 (CH3N-); 51,7 (-CH2NH-); 52,8 (C7 & C9) ; 71,8 (CH3CHO-) ; 93,3 (C5) ppm.

MS m/e 170 (M+) ; 169 (M+ -1); 123; 112; 85; 83 (100 %); 10 71; 70; 58.

Esimerkki 50: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 2'-(4'-etyyli-11,3'-oksatsolidiini) AF268 1-Metyyli-4-piperidonin (5,65 g, 0,05 moolia) 15 ja DL-2-amino-l-butanolin (6,24 g, 0,7 moolia) seosta lämmitettiin refluksoimalla 3 tunnin ajan. Reaktioseos tislattiin alipaineessa. Jakeen, joka tislautui 30-128°C:ssa (19 mmHg, 5,65 g) ja sisälsi pääosin tuotetta ja pieniä määriä vettä ja lähtöaineita, poiston 20 jälkeen tislattiin puhdas tuote 1-metyylipiperidiini-4-spiro-2'-(41-etyyli-1',3'-oksatsolidiini) (AF268) 129-130°C:ssa (19 mmHg, 4,5 g).

^-NMR (CDCI3) δ 0,97 (t, J=7,5 Hz, CH3CH2-) ; 1,45 ja 1,69 (m, CH3CH2-) ; 1,70-1,89 (m, 4H) ; 2,30 (s, CH3N-); ; 25 2,32-2,62 (m, 4H); 3,25 ja 3,96 (m, -CH20-); 3,29 (m, : -CHCH2CH3-) ppm.

13C-NMR (CDCI3) δ 10,7 (CH3CH2-) ; 26,1 (CH3CH2-) ; 34,9 ja 36,3 (C6 & Cm) ; 45,3 (CH3N-) ; 52,5 ja 52,7 (C7 & C9) ; 58,5 (C3) ; 69,5 (C2) ; 93,1 (C5) ppm.

30 ;;; Esimerkki 51: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5 ' - (3 ' -etyyli-11,4 -oksatiolaani-2 1 -oni) AF271 ·:··· 1-Metyyli-4-piperidonin (1,921 g, 0,017 moo- .··. lia) , 2-merkaptobutyyrihapon (2 g, 0,0167 moolia) ja 35 p-tolueenisulfonihapon (300 mg) liuosta asetonitrii- • · · : Iissä refluksoitiin 36 tunnin ajan. Sitten tuote haih- dutettiin, liuotettiin metanoliin ja tuote erotettiin 113777 78 silikageelikolonnilla eluenttina kloroformi/me-tanoli/ammoniakki (97:2,5:0,5). Jatkopuhdistus suoritettiin silikageelikolonnilla eluenttina klorofor-mi/metanoli (95:5).

5 1H-NMR (CDC13) δ 1,0 (t, CH3CH2) ; 1,6 (m, 3H) ; 2,1 (m, 1H, CH3CH2) ; 2,25-2,4 (m, 4H) ; 2,3 (s, 3H) ; 2,8-2,95 (m, 2H) ; 3,75 (dd, CH2CH) ppm.

MS m/e 215 (M+) .

10 Esimerkki 52: Piperidiini-4-spiro-5'- (31 - propargyylihydantoiini)n AF271 synteesi AF185-yhdiste demetyloitiin AF160(Des):a varten kehitetyn menetelmän (ks. esimerkki 3) mukaisesti ja puhdistettiin edelleen kromatografisesti silikako-15 lonnilla (kloroformi/metanoli/ammoniakki 80:19:1). Liikkuva kantoaine saostettiin valkoisena ei-hygroskooppisena suolahapon suolana.

^-NMR (D20, HC1-suola) δ 2,0-2,15 (m, 2H) ; 2,2-2,35 (m, 2H) ; 2,68 (t, 1H, J=3,5 Hz); 2,91 (s, CH3N-) ; 20 3,25-3,35 (m, 2H) ; 3,55-3,65 (m, 2H) ; 4,3 (d, 2H, J=3,5 Hz) ppm.

MS m/e 207 (M+, liikkuva kantoaine); 179; 151; 113.

• ,· Esimerkki 53: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- ! 25 5'-[3'-(2-butynyyli)hydantoiini]n AF199 synteesi AF199-yhdiste syntetisoitiin AF185:a varten kehitetyn menetelmän (ks. esimerkki 50) mukaisesti ja puhdistettiin edelleen kromatografisesti silikakolon- » nilla (kloroformi/metanoli/ammoniakki 80:19:1). Liik-30 kuva kantoaine saostettiin valkoisena ei- • · hygroskooppisena suolahapon suolana.

;·’ '‘n-NMR (CDC13/ liikkuva kantoaine) δ 1,65-1,8 (m, 2H) ; ·;··· 1,78 (t, 3H, J-1,7 Hz); 1,9-2,25 (m, 4H) ; 2,33 (s, CH3N-); 2,8-2,95 (m, 2H) ; 4,22 (q, 2H, J-1,7 Hz); 6,7 35 (bs, 1H) ppm.

I MS m/e 235 (M+) ; 165; 154; 71 (kantoainepiikki) .

* * * ; » * » 113777 79

Esimerkki 54: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 5'-(2'-metyyli-11,4'-tiatsolidiini-3'-oni] AF261 ja sen optiset isomeerit (+) AF261 & (-) AF261

Yhdiste AF199 liikkuvana kantoaineena (3,23 5 g, 16 mmoolia) ja di-p-toluoyyli-D-viinihappo (5,8 g, 15 mmoolia) sijoitettiin 250 ml:n kolviin, lisättiin 28 g isoamyylialkoholia ja 130 g tolueenia ja seosta refluksoitiin 5 minuutin ajan. Kirkas liuos haihdutettiin osittain palautusjäähdytyksen alaisena N2-10 virrassa kunnes muodostui hieman sameutta ja annettiin seistä yön yli. Saatu sakka suodatettiin ja kiteytettiin uudelleen isoamyylialkoholi-tolueenista useita kertoja kunnes saatiin enantiomeerien yli 98 % puhtaus (GC:lla ja NMR:11a) . Kiinteä tuote tehtiin emäksiseksi 15 ja saostettiin suolahapon suolana antaen saannoksi 207 mg valkoista ei-hygroskooppista kiinteää ainetta [a]25D = -54,8° (suolahapon suola metanolissa).

Emäliuosta haihdutettiin, tehtiin emäksiseksi ja käsiteltiin di-p-toluoli-L-viinihapolla ja kitey-20 tettiin neljä kertaa kunnes saatiin enantiomeerien yli 98 % puhtaus (GC:lla ja NMRilla). Kiinteä tuote tehtiin emäksiseksi ja saostettiin suolahapon suolana an-,* taen saannoksi 207 mg valkoista ei-hygroskooppista kiinteää ainetta [a]25D = +55,7° (suolahapon suola me-; 25 tanolissa).

: Optisen puhtauden määritys tehtiin NMR:11a käyttäen (R)-(-)-2,2,2-trifluori-1-(9-antryyli)etanolia erotusaineena. Siitä 7,5 mg kutakin 2,5 mg enan- » tiomeeria kohden C6D6:ssa osoittaa yksittäisen enan-30 tiomeerin läsnäolon. Suolahapon suolan NMR-spektri oli identtinen (±) AF261:n spektrin kanssa.

Kunkin enantiomeerin puhtaus määritettiin :* · GC:lla käyttäen kapillaarikolonnia Chrompack XE-60-S- .*··. Val-S-α-ΡΕΑ, WCOT kvartsilasi 50 m, sisäh. 0,26 mm,

* I

35 ulkoh. 0,35 mm, virtaus 0,9 ml N2, uunin lämpötila :·: : 175°C; viipymäaika 64 min ja 65 min.

’ · Suolahapon suolan NMR-spektri oli identtinen 80 113 7 7 7 (±) AF269:n spektrin kanssa.

Esimerkki 55; l-Metyylipiperidiini-4-spiro-51 -(21-etyyli-1',4'-tiatsolidiini-3'-oni] AF267 ja sen 5 optiset isomeerit (+) AF267 & (-) AF267

Yhdistettä AF267 liikkuvana kantoaineena ja di-p-toluoyyli-D-viinihappoa käsiteltiin AF261 varten kehitetyn menetelmän mukaisesti (ks. esimerkki 53) kunnes saavutettiin enantiomeerien yli 90 % puhtaus 10 (GC:lla). Kiinteä tuote tehtiin emäksiseksi ja saos-tettiin HCl:n suolana antaen saannoksi 207 mg valkoista hygroskooppista kiinteää ainetta, [a]25D = -67,0° (HCl:n suola metanolisssa, optinen puhtaus >90 %) .

Emäliuosta haihdutettiin, tehtiin emäksiseksi ja käsi-15 teltiin di-p-toluoyyli-L-viinihapolla samalla tavoin. Neljän uudelleenkiteytysten jälkeen saatu tuote (>90 %) tehtiin emäksiseksi ja saostettiin HCl:n suolana, [a]25D = +70,8° (HC1:n suola metanolissa, optinen puhtaus >95 %).

20 Kunkin enantiomeerin puhtaus määritettiin GC:lla käyttäen kapillaarikolonnia Chrompack XE-60-S-Val-S-α-ΡΕΑ, WCOT kvartsilasi 50 m, sisäh. 0,26 mm, ulkoh. 0,35 mm, virtaus 0,9 ml N2, uunin lämpötila 175°C; viipymäaika 83 min ja 88 min.

: 25 Suolahapon suolan NMR-spektri oli identtinen : (+) AF267:n spektrin kanssa.

Esimerkki 56: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 2'-(5'-metyyli-1',31-dioksolaani-4'-oni]n AF274 syn-30 teesi : Maitohappo (8 ml) kuivattiin atseotrooppises- ti bentseenillä. Kuivaan ja vielä kuumaan maitohappoon *; · lisättiin lisää kuivaa bentseeniä ja sen jälkeen p- tolueenisulfonihappoa (300 mg) ja 1-metyylipiperidonia • 35 (5,00 g, 0,027 moolia). Seosta refluksoitiin kunnes '>'> : lisävettä ei erottunut. Sitten liuosta haihdutettiin • * ja jäännös liuotettiin kloroformiin ja pestiin kylläs- 113777 81 tetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella (25 ml). Vesi-faasi pestiin kloroformilla (25 ml) ja yhdistetyt orgaaniset faasit pestiin uudelleen vedellä (2x10 cm3). Orgaaninen faasi kuivattiin puuhiilen kanssa sekoite-5 tulla natriumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin antaen 8,7 g öljymäistä raakatuotetta. Hienonnuk-sen jälkeen heksaanin, eetterin ja petrolieetterin (40/60) kanssa jäljelle oleva öljy liuotettiin asetoniin ja sitten siihen lisättiin oksaalihappoa (1 ekvi-10 valentti). Hetken kuluttua saostui valkoista kiinteää ainetta, joka tunnistettiin l-metyylipiperidiini-4-spiro-21 -(51-metyyli-1',3'-dioksolaani-4'-oni]n AF274 oksaalihapon suolaksi.

1H-NMR (oksaalihapon suola, CDCl3+DMSO-d6) δ 1,5 (d, 15 3H, J=7 Hz); 2,15 (m, 4H) ; 2,63 (s, 3H) ; 2,9 (m, 2H) ; 3,05 (m, 2H); 4,55 (q, 1H, J=7 Hz) ppm.

^-NMR (liikkuva kantoaine, CDCI3) δ 1,5 (d, 3H, J=7

Hz); 1,95 (m, 4H) ; 2,32 (s, 3H) ; 2,5 (m, 2H) ; 2,6 (m, 2H); 4,5 (q, 1H, J=7 Hz) ppm.

20 MS m/e 185 (M+) .

Esimerkki 57: 2-Metyyli-l,4-tiatsolidiini-3- .· oni-spiro- [5,3 1 ] -kinuklidiini AF273 ,· 3-kinuklidinonin (2,50 g, 20,0 mmoolia) , tio- , i 25 maitohapon (2,55, 24,0 mmoolia) ja ammoniumkarbonaatin (2,9 g) seos tolueenissa (100 ml) suljettiin ruostumattomaan teräspaineastiaan ja lämmitettiin 108°C:ssa sekoittaen 28 tunnin ajan. Öljy erottui reaktioseok-sesta, se poistettiin ja tolueeniliuosta, joka jäi , 30 jäljelle, haihdutettiin antaen jäännöksen (2,5 g). Se ·;;; kiteytettiin asetonista antaen kiteistä kiinteää ai- » · *···* netta (0,460 g) , joka koostui enimmältään yhdestä ·;·; AF273 :n enantiomeeriparista. Se kiteytettiin uudelleen asetonitriilistä ja sitten dikloorimetaanista antaen

• t I

. ·, 35 yhden puhtaan enantiomeeriparin (±) AF273A (0,210 g),

# > I

; sp. 201-202°C.

: ^-NMR (CDCI3) δ 1,53 (d, J=7,2 Hz, CH3CH-) ; 1,65 (m, 113777 82 2H); 1,92 (m, 2H); 2,03 (m, 1H); 2,83 (m, 4H); 3,18 ja 3,32 (dd, J=15 Hz, -NCH2CNH-) ; 3,89 (q, J=7,2 Hz, CH3CH-); 8,58 (bs, -NH-) ppm.

MS m/e 212 (M+) ; 155; 142 (M+ -70); 123; 96; 71; 70 5 (100 %); 58.

Emäliuos ensimmäisestä kiteytyksestä, joka oli rikastunut toiseen enantiomeeripariin, erotettiin kromatografisesti silikageelikolonnilla (Merck 60). Eluointi liuotinseoksella kloroformi/metanoli/am-10 moniakkivesi 96:3:1 antoi ensimmäisen puhtaan enan-tiomeeriparin (±) AF273B (0,106 g) sulamispisteen ollessa 181-182°C (asetonitriilistä).

^-NMR (CDC13) δ 1,52 (d, J=7 Hz, CH3CH-) ; 1,64 (m, 2H) ; 1,93 (m, 2H) ; 2,03 (m, 1H) ; 2,70-2,98 (m, 4H) ; 15 3,19 (S, -NCH2CNH-); 3,85 (q, J=7 Hz, CH3CH-) ; 8,60 (bs, -NH-) ppm.

MS sama kuin (±) AF273A.

Seuraavana saatiin kaikkien isomeerien seos ja lopuksi toinen puhdas enantiomeeripari (±) AF273A.

20

Esimerkki 58: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 51 -(21-metyyli-11,4'-tiatsolidiini-3'-tioni) AF275 .· l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-metyyli- 11,41-tiatsolidiini-3'-oni)n AF261 (1,00 g, 5,00 mmoo-25 lia) ja Lawesson-reagenssin (1,40 g, 3,46 mmoolia) *; suspensiota kuivassa tolueenissa (25 ml) sekoitettiin ja lämmitettiin 100°C:ssa 3 tunnin ajan. Liuotin poistettiin reaktioseoksesta ja jäännös erotettiin kuival-la silikageelikolonnilla (Merck 60, 0,040-0,065). Elu- 30 ointi liuotinseoksella kloroformi/metanoli/ammonium- s · ' j hydroksi 96:3:1 (tilavuusosia) antoi puhtaan 1- * t ’··’ metyylipiperidiini-4-spiro-5 ' - (2 1 -metyyli-1 ’ ,4 1 -tiat- ·; · solidiini-31-tioni)n AF275 (0,81 g) neulaskiteitä ase- tonista, sp. 171-172°C.

35 Hl-NMR (CDCI3) 1,69 (d, J=7,l Hz, CH3CH-); 2,00 (m, : 2H) ; 2,00-2,35 (m, 4H) ; 2,30 (s, CH3N-); 2,80 (m, 2H) ; 4,26 (q, J=7,1 Hz, CH3CH-) ; 8,74 (bs, -NH-) ppm.

113777 83 MS m/e 216 (M+) ; 156; 98; 97; 96 (100 %) : 70.

Esimerkki 59: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 4' (5') -(2'-metyylitio-2'-imidatsoliini-5' (41)-oni) 5 AF187 a) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-tiohydantoii-ni)n (AF195) suolahapon suolaa (1,00 g, 4,25 mmoolia) lisättiin sekoitettuun natriumhydroksidiin (0,36 g, 10 9,00 mmoolia) liuokseen metanolissa (30 ml). Muodostui saostuma (NaCl). Metyylijodidia (0,664 g, 4,68 mmoolia) lisättiin huoneenlämpötilassa yllä olevaan seokseen ja sekoittaminen jatkui 1,3 tunnin ajan. Reak-tioseosta haihdutettiin alipaineessa ja jäännös ekst-15 rahoitiin kuumalla dikloorimetäänillä. Dikloorimetaa- nin poistaminen antoi jäännöksen (0,58 g), joka erotettiin silikageelikolonnilla (Merck 60, 0,040-0,065). Eluointi liuotinseoksella klorofor- mi/metanoli/ammoniumhydroksi 89:10:1 (tilavuusosia) 20 antoi l-metyylipiperidiini-4-spiro-4' (5')- (2'- metyylitio-2'-imidatsoliini-51(4')-oni)a (AF187) (0,23 g); sp. 176-177°C (asetonista).

'.· ^-NMR (CDC13) 1,57 (m, 2H) ; 2,00 (m, 2H) ; 2,35 (s, CH3N-) ; 2,52 (m, 2H) ; 2,56 (s, CH3S-) ; 2,84 (m, 2H) ; • 25 6,73 (bs, -NH-) ppm.

13C-NMR (CDCI3) 12,6 (CH3S-) ; 32,7 (C3) ; 45,8 (CH3N-) ; 50,8 (C2) ; 68,3 (C4) ; 163,8 (-C-SCH3) ; 188,1 (-C=0) ppm.

MS m/e 213 (M+) ; 198 (M+ -CH3) ; 143 (M+ -70); 71.

30 UV (EtOH) λπ^χ 236 nm (ε 7800) ; 255 nm (olkapää, 8ε 4300) . ,j b) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-41 -(2'-metyylitio-5'- ,··>, aminometyylii-41 H-imidatsoli) a AF193 (0,30 mg) jätet- * » 35 tiin suolahapon vesiliuokseen (0,5 ml, 16 %) huoneen- i lämpötilaan 3 päivän ajaksi. Liuotin poistettiin ali- '!' ! paineessa ja jäännös tehtiin emäksiseksi konsent- 113777 84 roidulla natriumhydroksidin vesiliuoksella, sitten ekstrahoitiin dikloorimetaani-metanolilla. Uute kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin antaen jäännöksen, joka erotettiin paksukerrossilikageelilevyllä 5 (Merck piimaageeli 60 F254) eluoituna kloroformi/metanoli/ammoniakkivedel la 79:20:1 (tilavuusosia) antaen oikean näytteen kanssa identtistä AF187 (8 mg) .

Esimerkki 60: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 10 4 ' - (11-etyyli-2'-etyylitio-21-imidatsoliini-5'-oni) (AF188) l-Metyylipiperidiini-4-spiro-5'-(2'-tiohydan-toiini)n suolahapon suolan (AF195) (4,04 g, 0,0172 moolia) ja kaiiumhydroksidin (3,85 g, 0,0686 moolia) 15 suspensioon etanolissa (100 ml) lisättiin etyylibromi-dia (5,60 g, 0,0514 moolia) ja seosta refluksoitiin sekoittaen. 2 tunnin refluksoinnin jälkeen päätuote oli yhä monoetyylijohdannainen, sen vuoksi reak-tioseokseen lisättiin lisää kaliumhydroksidia (0,95 g, 20 0,0169 moolia) ja etyylibromidia (2,00 g, 0,0184 moo lia) ja refluksointi jatkui 3 lisätunnin ajan. Liuotin haihdutettiin alipaineessa, vettä (20 ml) lisättiin jäännökseen ja sitä ekstrahoitiin eetterillä. Uute kuivattiin (Na2S04) ja liuotin poistettiin antaen jään-j 25 nöksen (0,973 g), joka kiteytettiin petrolieetteristä antaen puhdasta l-metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(1'-etyyli-21-etyylitio-2'-imidatsoliini-5'-oni)a (AF188) (0,513 g), sp. 95-96°C. Liuottimen poiston jälkeen emäliuoksen kromatografinen erottaminen kuivalla sili-30 kageelikolonnilla (20 g, Merck 60, 0,040-0,065 mm) ja . : eluointi liuotinseoksella kloroformi/metanoli/ammoni- akkivesi 84:5:1 antoi lisää puhdasta AF188 (0,310 g). 1H-NMR (CDC13) 1,19 (t, J=7,2, CH3CH2N-) ; 1,40 (t, J=7,2 Hz, CH3CH2S-); 1,43 (m, 2H) ; 1,99 (m, 2H) ; 2,36 35 (s, CH3N-) ; 2,51 (m, 2H) ; 2,77 (m, 2H) ; 3,18 (q, J=7,2 i Hz, CH3CH2S-) ; 3,49 (q, J=7,2 Hz, CH3CH2N-) ppm.

:* : 13C-NMR (CDCia) 14,1 (2CH3CH2-) ; 24,4 (CH3CH2S-); 33,0 113777 85 (Ce) ; 35,1 (CH3CH2N-); 46,2 (CH3N-) ; 51,0 (C7) ; 68,6 (Cs); 158,8 (-N-C-); 183,9 (-C=0) ppm.

MS m/e 255 (M+); 226 (M+ -Et); 185 (M+ -70); 70.

5 Esimerkki 61: l-Metyylipiperidiini-4-spiro- 4'-(1'-etyyli-2'-imidatsoliini-51-oni) AF220

Raney-nikkeliä )0,30 g) lisättiin 1-metyylipiperidiini-4-spiro-41 -(11-etyyli-21-etyylitio-2'-imidatsoliini-5'-oni)n (AF188) (0,214 g) liuokseen 10 etanolissa (10 ml) ja seosta refluksoitiin 4 tunnin ajan. Koska reaktio ei mennyt loppuun lisättiin lisää Raney-nikkeliä (0,30 g) ja refluksointi jatkui vielä 4 tunnin ajan. Reaktioseos suodatettiin ja katalyytti pestiin metanolilla ja dikloorimetaanilla. Suodos ja 15 pesunesteet yhdistettiin ja haihdutettiin antaen 1-metyylipiperidiini-4-spiro-4'-(1'-etyyli-21-imidatsoliini-5 '-oni)a (AF220) (0,160 g) öljynä.

^-NMR (CDCI3) 1,27 (t, J=7,3 Hz, CH3CH2-) ; 1,46 (m, 2H); 2,03 (m, 2H); 2,36 (s, CH3N-); 2,48 (m, 2H); 2,82 20 (m, 2H) ; 3,53 (q, J=7,3 Hz, CH3CH2-) ; 7,72 (s, -CH=N-) ppm.

13C-NMR (CDCI3) 13,9 (CH3CH2-) ; 32,2 (C6) ; 35,3 (CH3CH2-),-45,7 (CH3N-) ; 50,5 (C7) ; 68,2 (C5) ; 151,6 (-N=CH-) ; 183,9 (-C=0) ppm.

: 25 Koe tuotteen puhdistamiseksi kromatografises- ; ti kuivalla silikageelikolonnilla (20 g, Merck 60, . 0,040-0,065 mm) eluoimalla liuotinseoksella klorofor- mi/eetteri/metanoli/ ammoniakkivesi (25:17:3:1) antoi päätuotteena rengas avautuneena hydrolyysituotteen; 1- 30 metyylipiperidiini-4-formyyliamino-4-N-etyylikarboksi- ;;; amidin (AF221) kiteytettynä eetteri-dikloorimetaanista '··’ sulamispisteen ollessa 108-109°C.

» •" · ^-NMR (CDCI3) 1,13 (t, J=7,2 Hz, CH3CH2-) ; 2,04-2,32 (m, 6H) ; 2,28 (s, CH3N-); 2,65 (m, 2H) ; 3,28 (dq, 35 CH3CH2-) ; 5,73 (s, HCONH-) ; 6,97 (bs, EtNHCO-) ; 8,18 : (s, HCON-) ppm.

MS m/e 213 (M+) ; 195 (M+ -H20) ; 168 (M+ -EtNH2) ; 141 (M+ 86 1 13777 -EtNHCO); 98; 97; 96; 71; 70.

Hydrolyysituotteen AF221 rengas voidaan sulkea AF220:ksi lämmittämällä (150°C) sitä vakuumissa.

Yhdisteet osoittavat farmakologisia vaikutuk-5 siä ja ovat siksi käyttökelpoisia lääkeaineina, esim. hoitoa varten. Tarkemmin spiro-yhdisteillä on keskus-ja ääreisvaikutusta (tai molempia) hermostoon. Yksi tavanomainen tunnusomainen vaikutus on kolinergiseen järjestelmään, missä yhdisteet ovat ligandeja (esim.

10 agonisteja tai antagonisteja) muskariinisilla reseptoreilla.

Yhdisteiden agonistinen tai antagonistinen muoto arvioitiin useissa kokeissa mukaanlukien tietokoneavusteinen molekyyliarviointi, biologinen testaus 15 koemaljassa ja elimistössä.

Seuraavassa käsitellään tietokoneavusteista molekyylien arviointia.

Muskariiniselle agonistiselle vaikutukselle rakennettiin lukuisiin agonistien tutkimuksiin perus- 20 tuen lääkeaineopillinen malli. Malli sisältää niiden osien määritelmän agonistien rakenteessa, jotka ovat olennaisia vaikutukselle, niiden keskinäisen avaruus-. järjestäytymisen ja jossain määrin ligandille salli- , tulle maksimi tilavuudelle ollakseen agonisti.

: 25 1 -1/ (3)p*-:'(·/) 30 ''N''' · 1 ''λ: «οΛ* 1 35 i.|·: Yleinen Esimerkkejä * · 113777 87

Edellä olevissa kaavoissa piste r on agonis-tin kationiseen päähän vaikuttava negatiivinen varaus. Sen asema suhteessa typpeen on määritetty mallissa. Tärkeät etäisyydet (D) ovat seuraavat: D(r-N*) = 3,0; 5 D(r-X*) = 6,50; D(r-Q*) = 8,70; D(x*-Q*) = 2,45. Optimaalinen diedrikulma r-x*-Q*-z* = -85. Poikkeama noista optimimallin parametreista tietyissä rajoissa ei kumoa vaikutusta (taulukko 1).

Tämän mallin tiettyjä tärkeitä piirteitä on 10 lueteltu alla olevassa: 1. Malli mahdollistaa kokonaan ja osittain muskariinisten agonistien erottamisen. Erottaminen perustuu etäisyyden r-X* ja agonistisen tehokkuuden väliseen korrelaatioon.

15 2. Atomilaji asemassa 4, vastaten karbonyyli- happea asetyylikoliinissa, voi vaihdella huomattavasti kuten myös diedrikulma r-x*-Q*-z* muskariinisten agonistien ryhmässä.

3. Etäisyyden r-Q* tullessa liian suureksi 20 agonistiselle toiminnalle saadaan heikosti sitoutuvia antagonisteja.

Tästä mallista voidaan tehdä ennuste koskien .· reseptorin alatyypin muskariinisen agonistin spesifi- syyttä perustuen agonistin rakenteelliseen jäykkyy-; 25 teen, Z*:n lajiin ja mallin parametreihin.

; Lääkeopillista mallia voidaan käyttää uusien yhdisteiden seulontaan mahdollista muskariinista vaikutusta varten seuraavalla tavalla a: uusi rakenne optimoidaan sen matalaenergiaisten mukautujien määrittä-30 miseksi; b: nämä mukautujat tutkitaan lääkeopillisten : osien järjestämiseksi oikein. Vaihtoehtoisesti uusi rakenne voidaan pakottaa lääkeopilliseen konformaati-* oon käyttämällä jotain nopeutetuista soveltuvuusrutii- . ' , neista. Saatua konformaatiota verrataan sitten saman 35 rakenteen matalaenergiaiseen konformaatioon. Näiden : menetelmien käyttö tuotti luotettavan vastauksen kai- * · kissa tutkituissa tapauksissa (taulukko 1) . Vaikka ei 113777 88 voida ennakoida onko muskariininen vaikutus ilmeistä ainoastaan tähän malliin mukautuville yhdisteille, ne, jotka todella sopivat, ovat toimivia agonisteina.

Kationisen pään tilavuuden rajoitus muska-5 riinisille agonisteille päätellään kyseeseen tulevien rakenteiden telakoitumiskokeista (kuten on kuvattu taulukossa 1) Ml muskariinisen reseptorin siirtokalvon alan molekyylimalliin. Suuremmat yhdisteet kuin kinuk-lidiinijohdannaiset eivät mahdu makromolekyyliin si-10 dospaikkaan.

Taulukossa 1 luetellut yhdisteet jaetaan neljään ryhmään. Ensimmäinen ryhmä sisältää useita tunnettuja muskariinisia agonisteja. Niiden rakennetta kuvataan optisilla lääkeopillisilla parametreillä. 15 Toinen ryhmä sisältää agonisteja, jotka osoittavat optimaalisia alempia lääkeopillisia malleja ja ovat siksi pääosin osittaisia agonisteja. Yhdisteiden rakenne kolmannessa ryhmässä poikkeaa edellisten ryhmien määrittämästä lääkeopillisesta mallista muskariiniselle 20 vaikutukselle. Nämä yhdisteet ovat senvuoksi joko antagonisteja tai vailla muskariinista vaikutusta. Ryhmä neljä luettelee joitakin mahdollisia muskariinisia .· agonisteja perustuen niiden lääkeopi11isiin paramet- reihin.

25 ' « ' · I · 1 : · · » I · • · » · » 113777 89

Taulukko 1; Muskariinisten agonistien lääkeopillisia parametrejä

Agonisti Selektii- r-X* (A) r-Q* (A) X*-Q* (A) r-X*-Q*-Z* _visyys_____ (Ryhmä 1)______ ACh_ M2 >M1__6,40__8,44__2,40__J36_

Dioksolaani M2>M1__6,51__8,71__2,42___

Muskariini M2>M1__6,50__8,53__2,44__^75_

Metyylifurm* M1>M2__6,40__8,54__2,43__-59_

Oksatolaani M1>M2__6,55__8,90__2,43__-_25_ (Ryhmä 2)______ AF102B_ M1>M2__5,93__8,24__2,45__-173_ AF150_ M1>M2__5,78__7,91__2,45__-118_ AF151_ M1>M2__5,82__8,20__2,45__-170_ AF150 (S) M1>M2__5,72__8,35__2,81__J34_ AF151 (S)_ M1>M2__5,88__8,15__2,38__-177_ AF160_ M1>M2__5,80__8,25__2,72__-96_ AF160 (Des) M1>M2__5,78__8,26__2/7__^95_ (Ryhmä 3)______ AF133___5,98__8,33__2,96__34_ AF134___6,00__8,58__2,62__9_ AF168___6,69_ 9,10 2,72__^44_ AF172___5,71__9,64 4,00__-101_ . (Ryhmä 4) I AF170___6,07__8,62__3,01__^60_ ‘ .' AF181___5,92__8,35__2,75__^88_ ' j AF184___5,93__8,44__2,65__J37_ AF185___5,96__8,21__3,13__-105_ , AF196___5,92__8,40__2,73__J37_ AF202___5,78__8,10__2,42__-170_ .' *’ AF210__5,89__8,20__2,43__-170_ AF215___5,94__7,93__2,44__-108_ ;. AF216___5,72__8,32__2,84__^96_ AF260___5,75__8,02__2,45__-132_ ;*’ AF261___5,91__7,80__2,37__-107_ ':··· AF264___5,77__8,07__2,46__-128_ .*·*. AF265___5,82_ 7,72 2,38__^94_ AF267___5,91__7,84__3,25__-105_ : : : af270_ 5,79_|8,27 12,73_-93_ ·; ; *metyylifurmetiidi^ 113777 90

Seuraavassa esitetään suoritettuja biologisia koeohjelmia

Koe 1: Eristetty marsun ileumpreparaatti 5 Keksinnön yhdisteitä testattiin niiden ago- nisti- ja antagonistivaikutuksia varten marsun ileum-preparaatissa (Fisher et ai. on kuvannut käytettyä menetelmää julkaisussa J. Pharm. Exp. Therap. 257: 392-403 (1991) . Taulukko 2 kokoaa yhteen joillakin yhdis- 10 teillä saadut tulokset.

Taulukko 2: Vaikutus marsun ileumpreparaattiin

Yhdiste__EC50 (μΜ) Huomautuksia_ AF102B*__3,5__osittainen agonisti_ AF1340___antagonisti 6 μΜ: ssa_ AF151 (S)__1_J2'__täysi agonisti_ AF160__3,2__täysi agonisti_ AF160(Des) osittainen agonisti 0,1 mM:ssa maksimaalinen supistus 80 % karba-___kolista_ , AF177 heikko antagonisti 0,25 mM:ssa * AF178 100 osittainen agonisti (80 % ACh:sta) « · AF179__100__osittainen agonisti (80 % ACh:sta) i » * AF180__100__osittainen agonisti (80 % ACh:sta) AF182 antagonisti 0,1 mM:ssa; ___täysi antagonisti 0,2 mM:ssa_ » 15 * cis-2-metyylispiro(1,3-oksatiolaani- 5.3')kinuklidiini (U.S. 4,855,290); heikko antagonisti .··. ACh-peräiselle supistukselle • ^ ° Käyttäytyi muskariinisena antagonistina

Iti» ’ * marsun ileumpreparaatissa; se esti hämmästyttävästi 20 AF102B-peräiset supistukset paremmin kuin se esti ACh- j peräiset supistukset. Täten, jos AF102B:n aiheuttama supistus tässä preparaatissa välittyy pääosin M3 re- 113777 91 septorin kautta, AF134 näyttää olevan selektiivinen M3 antagonisti tässä preparaatissa.

Koe 2: Sitoutuminen muskariinisiin resepto- 5 reihin aivoissa; kilpailu [3H]QNB:n, [3H]NMS:n ja [3H]OXO-M:n kanssa rotan aivokuoresta ja pikkuaivoista valmistetuissa kalvoissa.

Rotan aivokuori- ja pikkuaivokalvopreparaat-teja, käyttäen ligandeja [3H]NMS, [3H] Pirentsepiiniä ja 10 [3H]oksotremoriinia, käytettiin uusien yhdisteiden ar vioimiseen (taulukot 3 ja 4).

Taulukko 3; Testattujen yhdisteiden kilpailu [3H]PZ:n, [3H]QNB:n tai [3H]NMS:n kanssa (rotan aivokuori) ja 15 [3H]QNB:n tai vastaavasti [3H]NMS:n kanssa (pikkuaivot) .

Aivokuori

Yhdiste [3H]PZ__[3H] QNB__[3H] NMS _ _ Kh μΜ(%) KL μΜ K« μΜ(%) KL μΜ 1¾ μΜ(%) KL μΜ , Karbakoli 0,06(38) 18,6 6,8 (18) 980 0,1 (41) 11_ : Oksotre- moriini_____^ >4___ . McN-A-343____7,9___ AF102B___1___7/L___1,1/1,5 ·;’ AF133___2/7_____ AF134___0,13_____ .' ’’ AF151 (S) 0,75 (11) 20 24 (44) 459___ AF160_ 1,4 (34 19___58__0,45(31) 12_ ,,’ AF160 (Des) 1,3 (58) _9___40___7_ AF178__17 (58) 90_____ AF180___5_j_4_____ .···. AF177 0,06(10) 7 0,1 (14) 13 * · ——————— .

AF182 0,06(27) 8,3 0,12(23) 9,2 :.i i AF183____0,06(14) 100__ 260_ :* IAF185_____4,8___9 _ 113777 92

Taulukko 3 (jatko)

Aivokuori

Yhdiste [3H] PZ__[3H] NMS _ _KH μΜ (%) KL μΜ KH μΜ (%) Κχ, μΜ AF181__3,6_____ AF184__0,64___ AF196__>1000_____ AF197___48___ AF213__5,7_____ AF264__ 294___ AF260 0,2 (36) 16_ 0,014(12) 32_ AF261 0,03 (26) 25__8,6 (33) 100 AF261A__JL8__20_ AF261B 0,13(34) 6,7_ 0,032 (31) 4,2 AF263 0,33 (14) 10 0,19 (23) 13_ AF265 0,93 (12) 49 0,18 (27) 39 i _ ~ "" _ AF2671__2,81__5,88 AF267A____10,9 AF267B T__LZZ_1 4,3 5 * Cu2+-käsittelyn jälkeen kilpailuanalyysi [3H]PZ:n | kanssa osoitti kaksipaikkaisen sidoskohdan AF267:lle (KH = 22 nM (18%); KL = 2,5 μΜ). Tämä havainto ilmai-see, että AF267 sitoutuu muskariinisiin reseptoreihin ! 10 rotan aivokuoressa agonistina (Fisher et ai., J. Phar macol. Exptl. Therap. 257: 392-403 (1991).

· > i * »

Iitti • · |

• I

* « I

• t • · » * · » · 113777 93

Taulukko 3 (jatko)

Pikkuaivot

Yhdiste__[3H] QNB__[3H]NMS _ _ KH μΜ (%) KL μΜ KH μΜ (%) KL μΜ

Karbakoli 1,5 (54) 52 0,02 (56) 6

Oksotremoriini 0,8

McN-A-343__24,4___ AF102B__18,1__1,4/0,4 AF133___5_j_l___ AF134__3j_8___ j AF151 (S)___45___ AF160___61_ 0,56 (46) 19_ AF160 (Des) 5 (36) 86__2,4_ AF178__ 200___ AF180__ 350___ AF177____20_ AF182____21_ AF183____310_ AF185_____7_ AF181 5 AF184 2,9 ; AF197_____18_ AF260___ 0,46 (58) 87_ I* AF261___ 0,83 (45) 23_ AF261A_____18_ AF261B___ 0,29 (53) 24_ AF267____2,3_ AF267A____6, 9_ AF267B___I 0,15 (26) | 3,2_ 5 • t

Laskettuja suhteita Ki^/Ki1™0 tai KiPZ/KiQNB

lit (taulukko 3) käytetään tavallisesti ilmaisemaan muska- • s · ! riinisten ligandien Ml selektiivisyyttä alempien suh- ‘ teiden ilmaistessa parempaa Ml selektiivisyyttä. Li- 113777 94 saksi suhteet Kipz/KiQNB rotan aivokuori- vastaan pikku-aivokalvopreparaateista ilmaisevat myös muskariinisten ligandien Ml selektiivisyyttä, alempien suhteiden kuin 1 ilmaistessa Ml selektiivisyyttä (Fisher et ai., J.

5 Pharmacol. Exptl. Therap. 257: 392-403 (1991). Näitä analyysejä käyttäen voitiin havaita, että tämän keksinnön jotkut yhdisteet osoittavat suhteellisen korkean preferenssin Ml muskariinisille reseptoreille. Tällaisia ovat: AF133, AF134, AF160, AF160(Des), AF177, 10 AF178, AF181-AF185, AF261, AF265, AF267.

Esim. AF185 osoitti 3 kertaa suuremman affiniteetin kilpailussa [3H]PZ:n kanssa verrattuna sen kilpailuun [3H]NMS sitovista paikoista (Ki = 1,4±0,15 μΜ vastaavasti vastaan 5±1 μΜ; taulukko 3) . Tämä on 15 voimakas vastakohta AF102B:lle (US-patentti), joka osoitti melkein saman affiniteetin kilpailussa molempien ligandien kanssa (Ki = 1,43±0,2 μΜ vastaavasti vastaan 1,86±0,43 μΜ; taulukko 3). Koska [3H]PZ:n uskotaan erikoisesti merkitsevän MlAChR:n rotan aivo-20 kuorikalvossa, nämä uudet tiedot saattavat ilmaista, että AF185 on Ml selektiivisempi ligandi verrattuna AF102B:hen.

Joidenkin uusien yhdisteiden [3H]NMS sidos-käyrät aivokuorikalvoissa ilmaisivat vuorovaikutusta 25 kahden paikan kanssa: n. neljännes sidospaikoista osoitti suurta affiniteettia näitä yhdisteitä kohtaan.

. Tämä saattaa ilmaista suurta agonistin tehokkuutta i tässä preparaatissa. Tällaisia yhdisteitä ovat: AF260, ’ ’ AF261, AF263 ja AF265.

, 30 Hämmästyttävästi jotkut uusista yhdisteistä ·;·: toivat esiin kaksipaikkaisia kilpailukäyriä [3H]PZ:n kanssa rotan aivokuoressa (taulukko 3) . Näihin kuulu- vat AF160, AF160 (Des) , AF260, AF261, AF265 . Näiden yh- .··, disteiden kaksipaikkaiset kilpailukäyrät [3H]PZ:n * » ’·" 35 kanssa muutettiin yksittäisiksi massavaikutuskäyriksi I I t : stabiilin GTP-analogin mukanaollessa, GppNHp:ksi (ei esitetty) . Vastaavia havaintoja GppNHp-herkkyydestä 113777 95 tehtiin kilpailua varten [3H]NMS:n kanssa (ei esitetty) . Tämä ilmaisee, että nämä yhdisteet käyttäytyvät kuten tehokkaat agonistit Ml reseptoreille rotan aivokuoressa. Tämä on vastakohta AF102B:n kilpailuanalyy-5 seille, jotka tyypillisesti antavat tulokseksi massa-vaikutuskäyriä. Nämä havainnot saattavat tuoda mieleen joitakin eroja rotan aivokuoren Ml reseptoreiden tunnistamisen ja näiden uusien yhdisteiden välillä.

AF267 toi esiin yksipaikkaisia kilpailukäyriä 10 sekä [3H]NMS:n että [3H]PZ:n kanssa rotan aivokuorikal-voissa. Fosfoinositidien (PI) hydrolyysin ja arakis-donihapon vapautumisen alla kuvatut tutkimukset ilmaisivat, että tämä yhdiste on osittainen agonisti. Mas-savaikutuksen sidosrakenne oli siksi samanlainen kuin 15 aineisto Ml selektiiviselle agonistille AF102B muska-riinisiin reseptoreihin tässä preparaatissa. Olemme aikaisemmin esittäneet, että rotan aivokuoren käsittely 0,1 mM CuS04:lla saattaa tuoda esiin AF102B:n salatut agonistiset sidosominaisuudet (Fisher et ai., JPET 20 257: 392-403 (1991); julkaistu aineisto käytti AF102B.-n kilpailua [3H]QNB:n kanssa, mutta samanlaisia havaintoja saatiin käyttäen [3H]NMS ja [3H]PZ. Tällai-·' nen käsittely saattaa myös lisätä suuriaffiniteettis- : ten paikkojen osuutta tiettyjä agonisteja varten, jot- l 25 ka jo omaavat suuriaffiniteettisia paikkoja ilman Cu2+- käsittelyä (esim. AF160). Olemme siksi tutkineet AF267:n sidosominaisuuksia Cu2+-käsittelyn jälkeen.

[ Tällainen käsittely, jota seurasi kilpailukoe [3H]PZ:n kanssa, toi esiin 18 % suuremman affiniteetin paikkoja 30 AF267:lle (KH = 22 nM, s.o. n. 100-kertaa suuremman affiniteetin verrattuna KL = 2,5 μΜ-.in) ilman merkit-tävää muutosta matalan affiniteetin paikoissa. Tämä havainto tuo mieleen, että AF267 saattaa sitoutua mus- • · kariinisiin reseptoreihin rotan aivokuoressa samoin • » *!' 35 kuin AF102B. Cu2+-käsittelyn kyky tuoda esiin suuriaf- * finiteettisia paikkoja tietyille osittaisille agonis- teille saattaa liittyä reseptori/G-proteiini- f 96 113777 vuorovaikutuksen stabiloitumiseen metalli-ionien koor-dinaatiokomplekseilla kriittisten sulfhydryylien kanssa näillä makromolekyyleillä (Gurwitz et ai., BBRC 1984, 120: 271-277). Vertailukalvoissa tämä vuorovai- 5 kutusta ei ilmeisesti suosita osittaisten agonistien läsnäollessa, joka siten ei tuo esiin suuriaffiniteet-tista paikkaa kilpailukokeissa merkittyjen antagonistien kanssa.

Yhdisteiden kyky korvata [3H]oksotremoriini-M 10 ([3H]OXO-M) sidos tuotti affiniteetin suureen reseptorin suuriaffiniteettiselle agonistimuodolle. Ki- arvojen suhdetta [3H]NMS:n [3H]QNB:n ja [3H] OXO-M: n korvaamiseksi käytetään kirjallisuudessa ennakoimaan tehokkuutta. Suuremmat suhteet kuin 100 liitetään täy-15 siin agonisteihin; antagonistit antavat suhteita lä hellä yhtä ja välissä olevat arvot indikoivat osittaisia agonisteja (Orlek et ai., J. Med. Chem. 34: 2726, 1991).

Uusia yhdisteitä tutkittiin kilpailukokeissa 20 merkityn, ei-selektiivisen muskariinisen agonistin, [3H]OXO-M, kanssa käyttäen rotan aivokuorikalvoja; AF179:n ja AF160:n voimakas agonistinen luonne heijas-• tuu niiden suhteellisen suurissa KiNMS/Ki°X0'M-arvoissa (taulukko 4) .

; 25 : Taulukko 4: AF160:n tyyppisten ja muskariinisten ver- tailuagonistien kilpailu [3H]OXO-M:n kanssa rotan ai-vokuoripreparaatissa.

Yhdiste_Ki (μ)_Κί^/Κΐ0*0-" A.Massavaikutuskäyrät*:

I I

*;·' CCh 0,06+0,005 (3) 380 *:·: Pilokarpiini 0,1 ;···. AF102B 0,6±0,2 (3) 2,1 . AF160 1,8±0,2 (3) 9,4 ; AF177 11 1,4 AF179 1,3±0,3 31 113777 97 AF182 14 1 AF183 >100 -1

Yhdiste_KH (μΜ) %H KL (μΜ) KiNMS/Kioxo-M

B.Kaksipaikkaiset kilpailukäyrätb: AF160(Des) 0,05 36 2,2 j Esim. 1

Esim. 2 0,03 58 1,8

Esim. 3 0,02 42 2,1

Keski- 0,033 ± 45 ±6 2,0 ±0,1 3,5 arvo (1-3) 0,07 (3) AF185 0,04 53 49 0,18

Esim. 1 _Esim. 2_0,01 18_3_3_

Huomautus: Sidoskokeet suoritettiin käyttäen 5 TRIS/Mn2+ puskurissa 0,5 tunnin ajan 25°C:ssa pestyjä rotan aivokuorikalvoja; Ki®18 arvot ovat keskiarvoja taulukosta 3. Arvot ovat yleensä 1-4 kokeesta.

a tiedot ovat lääkeaineille, jotka esittävät massavaikutuksen kilpailukäyriä [3H]0X0-M:n kanssa.

10 b tiedot ovat lääkeaineille, jotka esittävät : kaksipaikkaisia kilpailukäyriä [3H]0X0-M:n kanssa; j AF160(Des):n ja AF185:n massavaikutuskäyriä havainnoi tiin tietyissä kokeissa.

Hämmästyttävästi AF160(Des) ja AF185 olivat ! 15 ainoat testatut lääkeaineet, joiden kilpailukäyrät (käyttäen [3H]OXO-M ja rotan aivokuorikalvoja) eivät tuoneet esiin yksipaikkaisia massavaikutuskäyriä (tau- > » * lukko 4) . Näiden lääkeaineiden erittäin voimakas kil-:...· pailu [3H] OXO-M:n merkitsemien reseptoreiden jatko- 20 fraktioiden kanssa rotan aivokuorikalvoissa saattaa ,···. merkitä, että nämä lääkeaineet ovat hyvin lähellä se- lektiivisen tyyppisiä. Siten lasketut k^nms^k^oxo-m_ : suhteet (taulukko 4) voivat ilmaista, että AF160 (Des) '· on voimakas agonisti rotan aivokuoren muskariinisten 113777 98 reseptoreiden osajoukolle verrattuna muihin AF160-ryhmän sukulaisiin ja itseensä AF102B:hen. Tätä ei kuitenkaan havaittu: Sekä AF160(Des):n että AF185:n kilpailukäyrät [3H]NMS:n kanssa tuottivat yhdenmukai-5 sesti yksinkertaisia massavaikutuskäyriä. Todellisuudessa ainoastaan AF160, joka omasi kaksipaikkaisen käyrän kilpailussa [3H]NMS:n kanssa, kuitenkaan kilpaili [3H]OXO-M:n kanssa yksinkertaisella massavaiku-tuksen käyrällä. Siten selitys reseptoreiden osajoukon 10 heterogeenisyyteen, jota on tutkittu ainoastaan [3H] OXO-M-sidoksessa, mutta ei [3H]NMS- sidosanalyyseissä, ei näytä houkuttelevältä. Vaihtoehtoisia selityksiä voisivat olla mahdolliset vuorovaikutukset allosteeristen paikkojen kanssa muskariini-15 silla reseptoreilla, joita ei ilmaise reseptorin olomuoto, joka sitoo antagonisteja, kuten [3H]NMS, vaan paljastaa agonistin [3H]OXO-M käyttäminen. Toinen mahdollinen selitys matalille kilpailukäyrille [3H]OXO-M sidosanalyysissä on, että järjestelmä ei ole saavutta-20 nut tasapainoa. AF160(Des) tai AF185 käyttävissä kil-pailuanalyysissä tasapainoa ei saavutettu 30 minuutissa, koska sidosarvot olivat 25°C:ssa erilaisia 30 minuutin kohdalla verrattuna 60 minuuttiin. Lopetettaes-: sa kokeet 30 minuutin kohdalla havaittiin matalia kil- 25 pailukäyriä [3H]OXO-M:n kanssa sekä AF160(Des):lle et-tä AF185:lle. Todennäköinen selitys on, että AF160(Des):11a ja AF185:llä on suhteellisen hidas ki-netiikka (sekä hitaat assosiaatio- että dissosiaatio- • i nopeudet) verrattuna AF102B:hen. Tämä johtaisi hyvin 30 hitaaseen tasapainon lähestymiseen kilpailuanalyyseis- *·: sä tuottaen kaksipaikkaisten sidosisotermien ilmeisen t · t paljastumisen ei-tasapaino-olosuhteissa. On järkevää :· j olettaa, että sekä assosiaatio- että dissosiaationo- ···. peudet ovat suhteellisen alhaisia. Jos ainoastaan 35 AF160(Des):n assosiaationopeudet olisivat alhaisia : verrattuna AF102B:hen, ne olisivat näyttäneet paljon ‘ alhaisempia affiniteetteja kuin AF102B. Toisaalta, jos 113777 99 niiden dissosiaationopeudet olisivat alhaisia, niiden affiniteettien olisi pitänyt olla paljon suurempia kuin AF102B:n affiniteetti.

Rotan pikkuaivot ovat suhteellisen homogeeni-5 set ilmaistuihin (useimmiten M2) mAChR-alatyyppeihin nähden. AF102B osoitti vastaavia voimia kilpailussa [3H]OXO-M sidoksen kanssa sekä rotan aivokuoressa että pikkuaivoissa. Sitävastoin AF160(Des) ja AF185 osoittivat suurempia voimia aivokuori- kuin pikkuaivokal-10 voissa. Tämä heijastui kaksipaikkaisina kilpailukäyri-nä ainoastaan aivokuorikalvoissa (viitaten myös taulukkoon 4 aivokuorelle). Tämä saattaisi jälleen ilmaista erilaisen kinetiikan näille yhdisteille aivokuoressa verrattuna vastaavasti pikkuaivoihin.

15 Koe 3: Sekundaariset lähettivaikutukset aivo- leikkeissä ja soluviljelmissä.

Menetelmässä testattujen yhdisteiden tehokkuuden mittaamiseksi agonisteina Ml muskariinisilla reseptoreilla, valmistetaan aivoleikkeitä rotan aivo-20 kuoresta (200 μΜ kuutioita). Fosfoinositidien (PI) vaihtokoetta varten nämä aivoleikkeet panostetaan [3H] inositolilla (4 μΟχ/ταΙ) inkuboimalla niitä 37°C:ssa merkityn ligandin sisältävässä Krebsin tasa-painosuolaliuoksessa 1 tunnin ajan hapetuksen alaise-·, *;' 25 na. Pesun jälkeen lisätään 50 μΐ alikvootteja kuhunkin /· 10 mM LiCl.-ia tuoreessa Krebsin liuoksessa sisältävään ; koeputkeen, testattavan yhdisteen kanssa tai ilman si- : tä. 20 minuutin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa reaktio päätettiin ja merkityt tuotteet erotettiin Berridgen 30 (Biochem. J. 258: 849-858, 1983) kuvaamilla AG-1-X8 '!!! kolonneilla. Testatun yhdisteen mukaiset osittaiset *;· agonist it tuottivat alle 80 % PI-hydrolyysin aktivoin- i nin verrattuna CCh:en (täysagonisti) . Siten esim.

AF160 aikaansai merkittävän nousun IP3.-ssa (1,6- . *. 35 kertainen). Verrattaessa CChren AF160 oli osittainen • · » ; agonisti 50 %:n teholla vertailutuotteeseen nähden.

AF160(Des) oli myös aktiivinen, vaikkakin vähemmässä 113777 100 määrin kuin AF160. AF102B toisena Ml agonistina oli vähemman aktiivinen kuin AF160, kun taas AF178 ei ollut aktiivinen tässä kokeessa.

Muskariinisten reseptoreiden osapopulaatiossa 5 rikastettuja soluviljelmiä käytetään arvioitaessa toisia lähettiaktivointeja testatuilla yhdisteillä. PI-vaihtotutkimuksiin käytetään Berridgen menetelmää (Biochem. J. 258: 849-858, 1983); arakisdonihapon mo- bilisaatiotutkimuksia varten soluja merkitään 16 tun-10 nin ajan 0,2 /iCi/ml:lla jauhettua arakisdonihappoa alkuperäisessä kasvualustassa. Ennen koetta soluja pestään kaikkiaan kuusi kertaa seerumivapaalla HEPES:lla ja naudan seerumialbumiinilla (1 mg/1) täydennetyllä DME:lla (20 mM) . Pesuvaiheen jälkeen lisättiin 0,5 ml 15 samaa väliainetta jatkaen testattujen ligandien lisäyksellä. Kokeet päätettiin siirtämällä väliaine Eppen-dorf-putkiin ja sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 6000 G:n voimalla. Sakan yläpuolisten nesteiden radioaktiivisuus lasketaan ja esitetään maljaa kohti vapautunee-20 na dpm tritioituna arakisdonihappona. Syklisen AMP:n kumuloituminen ehjiin soluihin arvioidaan Pinkas-Kramarski et alin menetelmän, Neurosci. Lett. 108: 335-340, 1990, mukaan, kun taas adenylyylisyklaasin vaikutus eristettyihin kalvoihin määritetään Johnsonin , : 25 ja Salomonin mukaan (Methods in Enzymology, osa 195.

R.A. Johmson and J.D.Corbin, eds. Academic Press, s.

;* 3-21, 1991) .

Kaavojen I-IX yhdisteitä, joilla on PI vaihdon ja/tai arakisdonihapon mobilisaation maksimaaliset 30 nopeus (mutta ei merkittävää adenylyylisyklaasin akti-vointia) suurempi kuin 25 %, ovat edullisia. Joitakin : : esimerkkejä tällaisesta aktiivisuudesta voidaan havai- ta yhdisteissä AF160, AF160 (Des) , AF178, AF179, AF180, AF185, AF260, AF261, AF263, AF265, AF266, AF267. Nämä • » 35 yhdisteet kykenevät aktivoimaan Ml muskariinisia re- • ! ·,· septoreita.

! Toisin kuin asetyylikoliini, CCh, oksotremo- 113777 101 riini-M ja muut klassiset täysagonistit, nämä yhdisteet saavat aikaan erillisen viestinnän selektiivistä aktivoitumista Ml (tai M3) muskariinisten reseptorei-den kautta. Erityisesti selektiivinen aktivoituminen 5 PI-hydrolyysin muskariinisten agonistien avulla ilman (tai minimaalisella) cAMP-kumuloitumisen aktivointia on uusien yhdisteiden vaikutuksen yleinen malli. Nämä havainnot saattavat sisältää Ml muskariinisen resepto-rikytkennän johtamisen erillisiin G-proteiineihin 10 näillä selektiivisten muskariinisten ligandien kautta. Täten Ml reseptoreiden aktivoinnin lisäksi nämä yhdisteet ovat selektiivisiä myös erillisten sekundääristen lähettien tasolla. Tätä käsitystä ainoastaan erillisten G-proteiinien selektiivisestä aktivoinnista saman 15 muskariinisen reseptorin kautta käyttäen selektiivisiä muskariinisia ligandeja keksijät kuvasivat äskettäin rotan mlAChR:lla (Fisher et ai., Biorganic & Medicinal Chem. Lett. 2; 893-844, 1992) muunnettuja CHO-soluja käyttävän ligandiselektiivisen viestintäkäsityksen al-20 la ja neuronaalisen tyyppisessä solulinjassa, esim. PC12M1 soluraja (Soc. Neuroci. Abs. Nov. 1993). Tämän viestintäreitin mahdollinen asiaankuuluminen koliner-gisen korvaushoidon kehittämiseksi Alzheimerin tautia (AD) varten on ilmeistä havaintojen valossa korote- : 25 tuilla Gs-tasoilla AD-potilaissa ja ikääntyneissä ai- 1 · / voissa (Harrison et ai., Mol. Brain Res., 10: 71, « I 1991; Young et ai., Dev. Brain Res., 61: 243, 1991).

» · ;* Täten keksinnön yhdisteet voivat olla tärkeitä Ai- » · ’· * zheimerin taudin hoitoa varten.

30 Jotkut yhdisteistä ovat täysagonisteja, kun ,,'j' taas toiset ovat osittaisia agonisteja verrattaessa CCh:n kanssa herkistävässä PI-hydrolyysissä mlAChR:lla ti|>: muunnetuissa soluviljelmissä. Osittaisia agonisteja ovat AF160, AF160 (Des) , AF178, AF180, AF181, AF265, • · 35 AF267. AF260:llä, AF261:llä, AF263:lla ja AF266:lla • 1 j_: | oli täysagonistisia vaikutuksia tässä kokeessa. Pitoi- *:· * suuden vastekäyrät AF260:lle ja AF261:lle osoittivat, 113777 102 että maksimaaliset vaikutukset saatiin 10 μΜ:33Ά ja vastaavasti 100 /xM:ssa. AF265 ja AF267 toimivat osittaisina agonisteina maksimaalisten vaikutusten ollessa 75 % ja 66 % suhteessa vastaavasti 1 mM CCh:en. AF181 5 osoitti heikkoa osittaista agonistivaikutusta tässä kokeessa. Siten 1 mM:n pitoisuudella se osittain aktivoi ΡΙ-hydrolyysiä, mutta vaimensi CCh:n aiheuttamaa ΡΙ-hydrolyysiä, kuten oli odotettua osittaiselta agonistilta. AF213 ja AF184 osoittivat antagonistista 10 vaikutusta, koska nämä yhdisteet estivät CCh:n PI-hydrolyysisignaalin. AF267:n enantiomeereistä aktiivisempi on AF267B, (-)-enantiomeeri; tämä yhdiste akti voi PI-hyrolyysin Ml reseptoreilla muunnetuissa soluissa sekä 10μΜ:383 (40 % CCh:sta) että 100 ^M:ssa 15 (80 % CCh:sta).

Testattiin uusien yhdisteiden voimakkuus saada aikaan CCh-välitetty PI-hydrolyysisignaalin herkkyyden vaimentaminen. AF261 tuotti pienemmän herkkyyden vaimennusvasteen verrattuna CCh:n 24 tunnin altis-20 tuksen jälkeen 100 μΜ:1ΐ3 tai ^M:lla AF261 PI-hydrolyysivaste herkistymiselle 1 mM CCh:n kanssa aleni 45 % verrattuna 60 %:n alenemaan esi-inkubaation » t ·* jälkeen 1 mM CCh: 11a. Yhdiste AF267, joka osoitti osittaista agonistiaktiivisuutta aiheutettaessa PI-• 25 hydrolyysi, oli vähemmän kykenevä aiheutettaessa herk- : kyyden vaimentaminen. Siten yli yön inkubaation jäl keen 1 mM AF267:llä alkuperäisen CCh-välitetyn PI-. hydrolyysin vaste aleni ainoastaan 29 %.

Testattiin myös uusien yhdisteiden kyky aihe-30 uttaa PI-hydrolyysi ihmisen mlAChR:lla, m3AChR:lla tai m5AChR:lla lyhytaikaisesti muunnetuissa soluissa sa-·;’ manlaisissa kokeissa kuin Pittelin ja Wessin kuvaamat ·;· : (Mol. Pharmacol. 45: 61-64, 1994). AF267 omasi suurim-

man selektiivisyyden mlAChR alajoukkoa kohtaan ollen , 35 100 kertaa voimakkaampi mlAChR:lie verrattuna m3AChR

» t » ; muunnettuihin soluihin (ED50-arvot olivat 1,5 ja vas taavasti 150 μΜ). Tämä on erityisen ilmeistä verratta- 113777 103 essa 10 μΜ AF267:n aiheuttamaa signaalia, joka on jo maksimaalinen mlAChRrlla muunnetuissa soluissa, mutta ainoastaan 15 % maksimaalisesta CCh-signaalista m3AChR:lla muunnetuissa soluissa. AF265 oli jonkin 5 verran voimakkaampi ja tehokkaampi mlAChR:ssa kuin m3AChR:lla muunnetuissa soluissa ja paljon vähemmän aktiivinen m5AChR:ssa. Vastaavia tuloksia saatiin AF267:lla ja erityisesti sen aktiivisemmalle enan-tiomeerille, (-)-enantiomeerille, mlAChRrlla ja vas-10 taavasti m3AChR:lla pysyvästi saatutetuissa soluviljelmissä.

Arakisdonihapon (AA) vapautuminen on toinen biokemiallinen reitti, jonka aktivoivat mlAChR-agonistit. Koska tämä biokemiallinen reitti täytyy yh-15 distää mlAChR:aan eri G-proteiinin kautta kuin PI-hydrolyysi, testattiin myös uusia yhdisteitä tässä kokeessa käyttäen rotan mlAChRrlla pysyvästi muunnettuja soluviljelmiä. AF263, AF265, AF266 ja AF263 osoittivat (1 mMrssa) osittaisia agonistisia vaikutuksia tässä 20 kokeessa. AF267:n enantiomeerestä aktiivinen enan-tiomeeri on AF267B, (-)-enantiomeeri, joka on täysago- nisti AA:n vapautumiselle 0,1 ja 1 mMrssa. AF260 ja ,· AF261 osoittivat täysagonistisia vaikutuksia verrattu- ,·' na 1 mM CChm kanssa sopusoinnussa PI-hydrolyysin ha- I 25 vääntöjen kanssa samassa solulinjassa. Havaittiin näi-den agonistien pyrkimys aiheuttaa enemmän AA:n vapautumista verrattuna 1 mM CCh:en. Tämä saattaa ilmaista, että CChrn välittämä signaali on jo läpikäynyt herk- * * » kyyden vaimentamisen koejakson aikana (20 minuuttia 30 37°C:Ssa). On uskottavaa, että tämä herkkyyden vaimen- ;;; taminen on pienempi testatuilla yhdisteillä. Vaihto- ’;·* ehtoisesti tietyt testatut yhdisteet saattavat olla ·;·: tehokkaampia kuin CCh Ml agonistina, s.o. superagonis- tina. Siinä tapauksessa ei ole selvää, miksi tätä omi- , ·, 35 naisuutta ei havaittu AF260:a ja AF261:a käyttävässä » · » · PI-hydrolyysikokeessa.

' * MlAChRrlla muunnettujen soluviljelmien esi- 113777 104 inkubointia 1 mM CCh:ssa 3 tunnin ajan seuraava ligan-din perusteellinen pesu (6x1 ml) vähensi AA:n vapautumista huomattavasti. AA:n perusvapautumiseen vaikutettiin minimaalisesti ilmaisten, että jäännös CCh ei ol-5 lut mukana pesun jälkeen. Vertaamalla samassa kokeessa esi-inkubointia 1 mM AF265:lla tai AF102B:lla väheni AA:n vapautumisvaste 1 mM CCh:an ainoastaan n. puoleen alkuperäisestä vasteesta. Pidempiä inkubointijaksoja varten pidettiin edullisina lääkeainepitoisuuksia 100 10 μΜ, koska 1 mM:n pitoisuuksilla ei ollut fysiologista vaikutusta pitkäaikaisiin käsittelyihin. Esi-inkuboinnin 100 μΜιεβΆ CCh 24 tunnin ajan jälkeen AA-vaste menetettiin melkein kokonaan. Verrattiin uusien yhdisteiden kykyä vaimentaa CCh-välitetyn AA- 15 vastesignaalin herkkyyttä. Hämmästyttävästi esi-inkubointi 100 μΜ:8ΒΆ AF265 24 tunnin ajan ei johtanut AA-vasteen vähenemiseen. Tämä ansaitsee erityistä huomiota ajatellen havaintoja, että tämä yhdiste on osittainen agonisti tässä kokeessa. Toisaalta herkistys 20 AF260:lla, AF261:lla ja AF260:lla (kaikki 100 μΜ:88Ά 24 tunnin ajan) vähensi huomattavasti CCh-välitettyä AA:n vapautumissignaalia. Vastaavat esi-inkuboinnit AF102B:11a ja AF267:lla johtivat suhteellisen pieneen l häiriöön seuraavassa CCh-välitetyssä AA:n vapautumis- 25 signaalissa osoittaen jälleen samankaltaisuutta näiden kahden yhdisteen välillä.

Koe 4: Neurotrooppistyyppiset vaikutukset soluviljelmissä

Ml reseptoreiden aktivointi agonisteilla voi 30 johtaa synergistisiin vaikutuksiin hermon kasvuteki- • » jällä (NGF) tietyissä Ml reseptoreilla rikastetuissa ··.1 soluviljelmissä, esim. rotan mlAChR:lla (PC12M1 solu- ja) muunnetussa PC12:ssa (rotan kromaffiinikasvainso-luja), (Pinkas-Kramarski et ai., «J. Neurochem. 59: * » 35 2158-2166, 1992).

il Kaavojen I-IX yhdisteet voivat PI-vaihdon » : maksiminopeudella tehostaa NGF:n tuottamaa hermosolun 105 113777 viejähaaran kasvua yli 25%:11a. Kaksi yhdisteryhmää voidaan voidaan havaita keksinnön yhdisteiden joukosta: 1) Yhdisteet kuten AF260, AF261 ja AF263, jotka NGF:n poissaollessa aiheuttivat hermosolun viejähaaran | 5 kasvua melkein kuin CCh; ja 2) ne yhdisteet, jotka | jyrkkänä vastakohtana oksotremoriinille eivät edistä hermosolun viejähaaran kasvua tai aikaansaavat ainoastaan minimaalisia morfologisia muutoksia NGF:n poissaollessa. Molemmat ryhmät ovat tärkeitä AD:n hoitoa 10 varten. Toisessa ryhmässä ei mitään solun keskuslieri-ön kasvua tapahtuisi hallitsemattomasti. Siten suotuisa lääke-ehdokas AD:n hoitoa varten aiheuttaisi esim. hermon syntymistä ainoastaan paikallisesti syntetisoitujen ja vapautettujen kasvutekijöiden, kuten NGF, ai-15 voperäinen hermotekijä (BDNF), NT-3 j.n.e, tarkassa valvonnassa. Joitakin esimerkkejä tällaisesta ainutlaatuisesta aktiivisuudesta voidaan havaita yhdisteissä kuten AF160, AF160(Des), AF185, jotka ovat vähintään yhtä voimakkaita kuin AF102B tehostamaan NGF:n 20 aiheuttaman hermosolun viejähaaran kasvua. Hermosolun haarat laajenivat yhdistetyn NGF-käsittelyn jälkeen ja nämä uudet yhdisteet olivat pysyviä pitkiä aikoja vil-. jelmässä. Tämän vuoksi voidaan otaksua, että näiden , yhdisteiden käyttämän viestintäreitin herkkyys her- , 25 mosolun haaran kasvun aiheuttamiseksi ei vaimene nope asti. Tämä on hyvin NGF:a itseään muistuttava, joka aiheuttaa hyvin pysyviä ja pitkäkestoisia hermosolu- haaroja edistäviä vaikutuksia PC12-soluissa sekä sym-* paattikushermosolujen alkuviljelmissä. Pitäisi havaita 30 kuitenkin, että testattujen solujen vanhat käsittele- :* mättömät viljelmät pilaantuivat ja sisälsivät monia : kuolleita soluja, jotka irtosivat levyn pinnasta.

' , Kiinnostavasti solujen kuolemisilmiöt olivat vähempiä

I > M I

viljelmissä, joita käsiteltiin aikaisemmin uusien yh-35 disteiden ja NGF:n yhdistelmillä. On tunnettua, että • NGF pelastaa PC12 soluja ohjelmoidulta soiukuolemältä

* I > I

(esim. Rukenstein et ai., J. Neuroscience 11: 2552- • » 113777 106 2563, 1991). Siten nämä havainnot osoittavat olevan mahdollista, että vastaavia olemassa oloa edistäviä reaktioita välittävät keksinnön yhdisteet. Kaikki nämä ominaisuudet tuottavat lisähyötyä näille yhdisteille 5 Alzheimerin taudin mahdolliseen hoitoon nähden.

Niiden agonistien neurotrooppistyyppinen vaikutus hermosoluihin, joka riippuu myös NGF-.n mukanaolosta, aiheuttaa todennäköisesti sen, että nämä yhdisteet kohdistavat neurotrooppisia vaikutuksia yh-10 dessä joidenkin NGF reseptoreiden kautta välitettyjen signaalien kanssa. Yksi mahdollisuuksista on, että nämä vaikutukset ovat epäsuoria mlAChR-välitteisen amy-loidin esiproteiinien (APP) lisääntyneen vapautumisen kautta, ks. alla. Merkittävää on, että endogeeniset 15 AP-proteiinit ovat välttämättömiä kuiturakenteisten solujen normaalille kasvulle ja eksogeeniset AP-proteiinit voivat herkistää näiden solujen lisääntymistä (Saitoh et ai. Cell, 58: 615, 1989); Mattson et ai., TINS 16: 409-414, 1993). Kiinnostavasti APP:n 20 erittämien muotojen, muiden vaikutusten joukossa, tiedetään sääntelevän hermosoluhaaran kasvua ja edistävän hermosolujen olemassa oloa (Mattson et ai:n selostama-. na, TINS 16: 409-414, 1993). Hermosolujen kuolema AD:ssa liittyy todennäköisesti hermoravinteiden vähen-. 25 tyneeseen tuotantoon ja/tai saatavuuteen, joka vuoros taan sisältää kolinergisten hermosolujen olemassa ·’ olon. Jos Ml agonistien aiheuttamat neurotrooppistyyp- pisiä tapahtumia tapahtuu myös aivoissa, tällä saat-* taisi olla mitä tärkein kliininen merkitys ja saattaa 30 siten merkitä AD:n uutta hoitoa, l· Koe 5: Amyloidin esiproteiinin (APP) eritys aivoleikkeissä ja soluviljelmissä ’ . On lisääntyvää näyttöä siitä, että β-amyloidi / on osatekijä AD:hen johtavassa patologisessa proses- ’;·* 35 sissa. Perustuen amyloidin peräkkäishydrolyysiin AD on • tuloksena amyloidin esiproteiinin (APP) aineenvaihdun- ·;··· tahäiriöstä (Mattson et ai., TINS 16: 409-414, 1993).

113777 107 MAChR:ien aktivoituminen ja erityisesti Ml alalajin, lisää APP:n eritystä koemaljassa (Nitsch et ai., Science 258: 304, 1992; Buxbaum et ai., PNAS US 89: 10075, 1992; Lahiri et ai., Biochem. Int. 28: 853, 5 1992). Siten keksinnön lisänäkökohdan mukaan kaavojen I-IX yhdisteitä, erityisesti niitä, jotka osoittavat selektiivistä Ml agonistiaktiivisuutta ja lisääntynyttä APP:n vapautumista, voivat olla edullisia, ei ainoastaan AD:n hoidossa, vaan sen etenemisen hidastami-10 sessa tai jopa AD:n estämisessä.

APP:n erityksen arviointiin käytetty menetelmä on Western-immuuni-imeytysmenetelmä (Nitsch et ai., PNAS 90: 5191-5193, 1993). Olemme käyttäneet monokloo-nianti-APP:ta 22C11, jota käytetään laajasti APP:n il-15 maisemiseen. Tämä vasta-aine suunnataan APP:n amino-päätealuetta vastaan ja se tunnistaa kaikki tähän mennessä julkaistut isomuodot. Se ei paljasta APP-erityksen jälkeen muodostuneita amyloidi tai c-pääte APP-osia. Uusien yhdisteiden vaikutusten APP:n vapau-20 tumiseen arvioimiseksi Ml reseptoreilla muunnettuja solulinjoja viljeltiin Pinkas-Kramarskin (J. Neu-rochem. 59: 2158, 1992) kuvaamilla 12-paikkaisilla le- * vyillä (joissakin kokeissa 6-paikkaisilla levyillä).

1 Ligandeja lisättiin steriilistä lOOx varastoiiuoksesta : 25 koejaksoja varten. Kokeet päätettiin pesemällä levyt : kahdesti seerumivapaassa väliaineessa. Solut kaavit tiin irti levyistä kylmään fosfaatti/suolapuskuriin (pH = 7,4; PBS-puskuri). Sentrifugoinnin jälkeen (10 min, 10000 G) sakan yläpuoliset nesteet heitettiin

30 pois ja hiukkaset dispergoitiin 0,1 ml:aan proteaasi-; inhibiittiseoksen (50 mM TRIS:HC1 (pH = 7,4, 150 iriM

: NaCl, 5mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,1 mM PSMF, 5 yk- ·;··· sikköä/ml aprotiniini, 5 ^g/ml pepstatiini A, 5 /zg/ml leupeptiini) sisältävää kylmää lysiinipuskuria. Hiuk-35 kasia käsiteltiin sitten ultraäänellä 5 sekunnin ajan * · · :·: · maksimiasetuksella (Branson ultraäänilaite, malli 130) ja sentrifugoitiin uudelleen. Sakan yläpuoliset nes- 108 1 13 7 7 7 teet (solukalvouutteet) siirrettiin puhtaisiin koeputkiin. Otettiin näytteet proteiinimääritystä varten Lowry-menetelmällä.

APP-analyysiä varten laimennettiin yhtäsuuret 5 määrät proteiinia (tyypillisesti 100 näyte- puskurissa, joka sisälsi 0,6 % SDS ja 1 % 2- merkaptoetanolia, ja panostettiin 10 % akryyliami- di/SDS-pienoisgeeleille (Hoeffer Scientific). Esivär-jätyt molekyylipainostandardit (Sigma) panostettiin 10 kullekin geelille. Geelejä syötettiin 25 mA/geeli ta-savirralla 4°C:ssa. Imeyttämistä suoritettiin 100 mArlla 16-18 tunnin ajan 4°C:ssa käyttäen nitrosellu-loosakalvoa. Seuraavat vaiheet toteutettiin huoneenlämpötilassa. Kalvot eristettiin 1 tunnin ajaksi upot-15 tamalla 10 % vähärasvaista maitoa sisältävään PBS:aan. Tätä vaihetta seurasi peseminen 3x5 minuutin ajan 0,05 % Tween-20 ja 0,1 % BSA (PBST) sisältävässä PBS:ssa. Anti-APP monokloonivasta-ainetta, klooni# 22C11 Boeh-ringer Manneheimilta (luettelo # 1285-262) , lisättiin 20 laimennuksella 1:200 (0,25 ^g/ml IgG) PBST-puskurissa 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa tai 18 tunnin ajan 4°C:ssa. Joissakin kokeissa vastaavia imeytyksiä tutkittiin hiiren vertailu IgG:11a samassa pitoisuudessa.

: Tätä vaihetta seurasi 3x5 minuutin pesuvaiheet * : 25 PBST:ssa. Sekundäärisiä piparjuuriperoksidaasi- kytkettyjä vuohen hiiren vastaisia IgG vasta-aineita t » ► . (Jackson Immunochemicals; luettelo # 115-035-003) käy- , tettiin suhteessa 1:2000 PBST:ssa 1 tunnin ajan, sen > · · jälkeen pesten kuten edellä. Immuuni-imeytysten värjä- 30 ys suoritettiin huoneenlämpötilassa 15-30 minuutin ai- ·;;; kana käyttäen tuoretta 4-kloorinaftolin liuosta (0,2 '·;·1 mg/ml 16 % etanolia sisältävässä TBS:ssa) ja HfeC^a

·:·1: (0,01 %) . Värjätyt täplät valokuvattiin (Kodak TMAX

negatiivi f ilmi) ja eroteltiin LKB UltroScan KL lasers- , 1, 35 kannerilla, joka oli säädetty 40 /zm:n pystysuoraan vä- * 1 · : limitoitukseen ja 2,4 mm:n vaakasuoraan rakoleveyteen.

• · » 1 · * ' Kukin kaista eroteltiin kolme kertaa hieman eriasemis- 113777 109 ta; saadut tulokset olivat optisen tiheyden keskiarvoja.

Tällä menetelmällä mitattiin solukalvon osassa inkuboinnin jälkeen (tyypillisesti 24 tunnin) jäl-5 jellä olevan APP:n määrä testatuille yhdisteille. Kalvoissa tällaisen agonisteilla inkuboinnin jälkeen jäljellä olevat pienempiä APP-määriä pidettiin merkkinä siitä, että solut erittivät lisää APP:ia. Tämän tyyppinen mittauksella on merkitystä tarkasteltaessa mus-10 kariinisten agonistien kykyä vähentää β-amyloidin kumuloitumista Alzheimerin taudissa, koska ainoastaan kalvoon liittynyt APP, toisin kuin APP:n erittyneet muodot, voivat lisätä β-amyloidia. APP:n mittaamiseksi, joka on erittynyt soluviljelmän väliaineeseen (kä-15 siteltyyn väliaineeseen), täytyi väkevöidä käsiteltyä väliainetta käyttäen Amicon mikrosuodatuskalvoja (30 kDa:n leike). Konsentrointivaiheen jälkeen mitattiin näytteiden proteiinimäärät Bradford.menetelmällä (Bio-Rad sarja # 500-0006) käyttäen naudan gammaglobuliinia 20 standardina. Yhtäsuuret proteiinimäärät panostettiin polyakryyliamidigeelin ionoforeesille (PAGE). APP:n määrä näytteissä analysoitiin immuuni-imeytyksen avulla monokloonianti-APP vasta-aineella 22C11, kuten edellä on kuvattu. Molekyylipainot arvioitiin esivär-: 25 jätyistä standardeista (Sigma), jotka oli sisällytetty kuhunkin geeliin.

Kaavojen I-IX yhdisteet, joiden APP-erityksen maksimaalinen nopeus soluviljelmissä on suurempi kuin ’ 125 % (perustason ollessa 100 %), olivat edullisia.

30 Esimerkkejä tällaisesta vaikutuksesta voidaan havaita yhdisteissä AF160(Des), AF179, AF185, AF261, AF263, AF265, AF267 .

Suurempien näytemäärien samanaikaisen työstä- « · ,··>, misen mahdollistamiseksi suoritettiin tutkimuksia • · T 35 käyttäen piste-imumenetelmää (96 pistettä voidaan • 1 työstää samanaikaisesti yhdellä kalvolla ) . Tässä me- 1 ί‘’ϊ netelmässä käsiteltyä väliainetta levitetään herkiste- 110 1 13777 tyistä PC12Ml-soluista suoraan nitroselluloosakalvoi-hin vakuumissa (ilman edeltävää väkevöintiä). Kalvot tutkitaan sitten vastaavasti immuuni-imeytys-käytännön mukaan. Yksityiskohtainen konsentraatiovaste ja aika-5 riippuvuustutkimukset analysoitiin myös erottamalla erittynyt APP PAGE:11a. Näiden tutkimusten tulokset ja piste-imututkimuksesta saadut tulokset olivat hyvin yhdenmukaisia. MlAChR:lla muunnettujen solujen APP-eritystutkimukset suoritettiin näin uusilla yhdisteil-10 lä ja käyttäen myös piste-imumenetelmää ja 1 tunnin inkubointia. Jotkut yhdisteistä, kuten AF261, AF263, AF265 ja AF267, ovat täysagonisteja tässä analyysissä.

MIAChR-välitteisen APP erityksen herkkyyden vaimentaminen on voimakkaampaa pidennettyjen inkuboin-15 tien aikana verrattuna tämän keksinnön osittaisiin agonisteihin. Tämä selitys on erityisen houkutteleva tarkasteltaessa näitä tietoja arakisdonihapon (AA) vapautumissignaalien herkkyyden vaimentamisesta yhdessä Emmerling et al:n viimeaikaisen ehdotuksen kanssa 20 (BBRC 197: 292-297, 1993), että AA:n vapautuminen sisältää APP-erityksen herkistämisen. Hakijoiden tiedot osoittaisivat, että joitakin uusista yhdisteistä voidaan suosia hyvin tehokkaisiin agonisteihin nähden : sairaalakäytössä soluun liittyvien APP-tasojen alenta- j 25 miseksi pitkiksi ajanjaksoiksi. Yhdisteitä, jotka osoittivat minimaalista herkkyyden vaimentamista AA->t vapautumisen analyysissä, ovat AF265 ja AF267. Soluun liittyneen APP:n mittaustulokset 24 tunnin inkuboin-tien jälkeen AF265:llä tai AF267:llä (molemmat 100 30 μΜ.-ssa) ilmaisivat alentuneita APP-tasoja, jotka olivat vahvempia AF267:llä ja melkein CCh:n vaikutusta vastaavia, kun taas AF265:llä oli heikompi vaikutus.

Tulokset mlAChR:lla muunnettujen soluviljel-,*··, mien APP-erityksestä tuovat selvästi esiin, että useat 35 uusista yhdisteistä voivat herkistää APP-eritystä ja : siten johtaa pienempään amyloidin kumuloitumiseen eli- *ί“ί mistössä. Kuitenkin ekstrapoloitaessa kudosviljelmän 113777 111 tiedot elimistön tilanteeseen, pitäisi edullisesti käydä ilmi, että yhdisteet saattavat myös herkistää APP-eritystä aivoissa. Tätä tarkoitusta varten tutkittiin APP-eritystä rotan aivokuorileikkeissä. Tyypilli-5 sessä kokeessa rotan aivokuorileikkeet preparoitiin välittömästi vasta leikellystä kudoksesta, paloiteltuna kahteen kohtisuoraan suuntaan Mcllwain-kudosleikkurilla (300x300 mikronia) ja pestynä kolme kertaa hapella kyllästetyllä Krebs-puskurilla. Pestyjä 10 leikkeitä tasapainotettiin tällä puskurilla 50 minuutin ajan 37°C:ssa. Tasapainotusvaiheen jälkeen (joka tarvitaan leikkausmenetelmästä johtuvan solujäännöksen poistamiseksi) puskuri vaihdettiin Krebs-puskuriin, joka sisälsi 50 μ9/τη1 BSA (proteiinin kantoaineena) ja 15 proteaasiseoksen (0,1 mM PMSF ja 5 ^g/ml leupeptiiniä, pepstatiinia ja aprotiniini-A:ta kutakin). Leikkeet annosteltiin muoviputkiin ja herkistettiin 1 tunnin ajan (2 tuntia yhdessä kokeessa) 37°C:ssa testattavien yhdisteiden esitetyillä pitoisuuksilla. Inkubointijak-20 son päättyessä puskurinäytteet kerättiin yhteen sent-rifugoimalla, analysoitiin proteiinipitoisuus ja yhtäsuuret proteiinimäärät erotettiin ja työstettiin im-i muuni-imeytystä varten anti-APP monokloonivasta- : aineella 22C11 käyttäen PAGE:ta vastaavasti kokeisiin j 25 viljellyillä soluilla. Erittynyt APP näkyi kahtena proteiiniryhmänä, joiden näennäiset molekyylipainot olivat 117 kDa (pääryhmä) ja 90 kDa (sivuryhmä) . Nämä APP-ryhmät saattavat vastata APP751:n ja APP695:n erittyneitä muotoja (APP:n Kunitz-pitoiset ja Kunitz-30 vapaat päämuodot). Vaihtoehtoisesti ne saattavat vas-tata erittyneen APP751:n kypsiä ja kypsymättömiä (ei-glykosyloituja) muotoja. Nykyään ei ole käytettävissä riittävästi tietoa näiden kahden mahdollisuuden väli- » · ·.. sen eron havaitsemiseksi, koska näissä tutkimuksissa T 35 käytetty monokloonivasta-aine 22C11 tunnistaa kaikki • > i.i i eritetyn APP:n muodot. Esim. sekä CCh tai AF 267 lisä- '1**: sivät APP: n eritystä rotan aivokuorileikkeillä 2-3 113777 112 kertaiseksi verrattuna APP:n vertailueritykseen. Tämä oli ilmeistä sekä 117 kDa:n että 90 kDa:n prote-iiniryhmille.

Havainnot aivokuorileikkeiden APP:N erityk-5 sesta ovat ainutlaatuisia. Tähän päivään mennessä ainoa julkaistu esitys APP:n erityksestä aivokudoksella koemaljassa on Nitsch et al:n (PNAS 90: 5191-5193, 1993), joka selostaa, että rotan aivotursoleikkeiden sähköinen herkistäminen lisäsi APP:n vapautumista. 10 Huomattavaa on, että tuo tutkimus ei sisältänyt herkistämistä reseptoriagonisteilla. Meidän havaintomme ovat siten keksinnöllisiä ja uusia, koska ne ovat ensimmäinen esitys APP:n erityksen sääntelemisestä aivo-kudoksessa reseptoriligandin avulla ja erityisesti Ml 15 agonistin avulla, kuten AF267. Ne yhdisteet, jotka herkistävät APP:n eritystä rotan kuorileikkeissä ovat edullisia. Tällaisina yhdisteinä voidaan pitää kaikkia niitä agonisteja tässä keksinnössä, jotka kykenevät herkistämään sekundaarisia lähettejä vastaten PI >25 % 20 vertailusta. Nämä ainutlaatuiset havainnot saattavat osoittaa joidenkin yhdisteiden mahdollisuutta hidastaa A4-amyloidipeptidien saostumista Alzheimerin taudin ' potilaiden aivoissa.

Koe 6: τ-proteiinin fosforylaatio mlAChR:lla ) 25 muunnetuissa soluviljelmissä ja rotan kuorileikkeissä

Tau (τ) on neurospesif inen mikrohaaroihin liitetty proteiini, jota on runsaasti keskuslieriöis-sä. Tau ilmaistaan useina isomuotoina, joista kaikkia saadaan yhden geenin vaihtoehtoisella jatkostamisella 30 (ihmisen taulla on 6 isomuotoa, joissa on 352-441 aminohappoa) . Se toimii hermon keskuslieriöiden mikrohaa-rojen stabiloinnissa; sen sitoutumista mikrohaaroihin » sääntelee sen fosforylaatio tietyissä paikoissa (Man-delkow ja Mandelkow, TIBS 18: 480-483, 1993). Tätä si- • » 35 toutumista puolestaan säätelee keskuslierön kasvu ja i stabiilisuus (Baas et ai., J. Cell Biol. 115: 1333- : 1344, 1991; Mattson, Brain Res. 582: 107-118, 1992).

113777 113

Eräs Alzheimerin taudin tunnusmerkeistä, amyloidin täplissä saostumisen lisäksi, on taun tai tau-johdannaisten kumuloituminen hermon alkusäietiheikköön (NTF). Nämä tiheiköt kuvastavat todennäköisesti her-5 mosolun kuoleman tulosta sairastuneessa aivokudoksessa. Lukuisat tutkimukset ovat tuoneet esiin muutoksia τ-proteiinin fosforylaatiossa AD-potilaiden kuoleman jälkeisissä aivonäytteissä. Tätä ilmiötä on parhaiten selostettu lisääntyneenä immuunireaktiivisuutena mono-10 kloonivasta-aineen ALZ-50 kanssa, jonka esitettiin ilmaisevan taun ylifosforyloituja muotoja näissä aivo-näytteissä (Vincent ja Davis, PNAS 87: 4840-4844, 1990); Vincent ja Davies, Brain Res. 531: 127-135, 1990) . Sen vuoksi ehdotettiin, että muutokset tau-15 spesifisten kinaasien/fosfataasien välisessä herkässä tasapainossa saattavat liittyä hermosoiukuolemän tapahtumiseen AD:ssa ja siten tällaisen todennäköisen epätasapainon korjauksella saattaa olla mahdollista hoitoon liittyvää arvoa.

20 Näin ollen tutkittiin τ-proteiinien fosfory- laatiotasoa pysyvästi mlAChR:lla muunnetuissa soluviljelmissä CCh:lla tai yhdellä testattavista yhdisteistä herkistämisen jälkeen. Tämä tehtiin käyttämällä mono-: kloonivasta-ainetta tau-1, jonka osoitettiin tunnista- ; 25 van vain defosforyloidut, mutta ei fosforyloituja, » : taun isomuotoja (Mandelkow ja Mandelkow, TIBS 18: 480- 483, 1993). Solujen eli rotan aivokuorileikkeiden in- kuboinnin jälkeen agonisteilla eri aikoja solut eli leikkeet pestiin kolme kertaa PBSrlla, kaavittiin 0,2 30 mM EDTA sisältävään PBS:iin, sentrifugoitiin 5 minuut- > * · tia 10000 G:ssä. Kalvohiukkasista analysoitiin prote- '...· iinipitoisuus ja yhtä suuret määrät proteiinia panos- tettiin PAGE: lie immuuni - imeytystä varten tau-1 vasta- .···. aineella. Immuuni reaktiivisuuden mittaukset suoritet- ’[ 35 tiin samoin kuin APP:n tutkimukset (käyttäen video- » > · : densitometriaa) , sillä poikkeuksella, että peroksidaa- si-kytketty sekundaarinen vasta-aine tutkittiin käyt- 113777 114 täen intensiivistä kemiluminointimenetelmää (ECL) (sarja RPN-2109; Amersham, UK).

Havaittavasti sekä CCh tai testattavat agonistit lisäsivät tau-1 immuunireaktiivisuutta ja 5 tämän lisäyksen esti kokonaan atropiini. Huomiota herättävä lisäys CCh-välitteisessä tau-1 immuunireaktii-visuudessa havaittiin NGF:n (50 ng/ml) kanssa 3 päivän ajan viljellyissä soluissa ennen herkistämistä muska-riinisilla ligandeilla. Vastaavat vaihtelevia CCh- tai 10 testatun agonistin pitoisuuksia käyttävät kokeet ilmaisivat, että lisääntynyt tau-1 immuunireaktiivisuus vaati suhteellisen korkeita ligandipitoisuuksia (10-100 μΜ).

Tau-fosforylaatio rotan aivokuorileikkeissä 15 CCh:11a herkistämisen jälkeen keksinnön yhdisteillä myös mitattiin. Testatut muskariiniset agonistit kykenevät jälleen hämmästyttävästi vähentämään tau-fosforylaatiota.

Täten muskariiniset agonistit kykenevät vä-20 hentämään tau-fosforylaatiota aktivoimalla muunnetun mlAChR:n soluviljelmissä ja mikä tärkeämpää aivoleik-keissä. Näiden agonistien vaikutukset näyttävät myös olevan pitkäkestoisia ollen ilmeisiä vielä solujen 100 : μΜ:η ligandeilla inkubointien jälkeen ainakin 3 päivän | 25 ajan. Nämä havainnot saattavat ilmaista, että selek tiiviset Ml-agonistit kykenevät vähentämään tau-fosforylaatiota.

Nämä havainnot ovat uusia, sikäli kun me tiedämme tähän päivään mennessä ei ole tuotu esiin mitään 30 yhteyttä kolinergisen puutoksen Alzheimerin taudissa

• < I

<*: ja fosforyloidun τ-proteiinin isomuotojen välillä sai-

• * I

·...· rastuneille aivoille tyypillisissä hermon alkusäieti- 9 ...,: heiköissä. Näillä uusilla havainnoilla saattaa olla • · ,···, merkitystä Alzheimerin taudin hidastamiselle Ml • · 35 agonisteilla.

» i :.! : Lopuksi: »

Ml agonisteilla voi olla useita vaikutuksia.

113777 115 Täten Ml agonistien toimintamekanismit ovat hämmästyttävästi monimutkaisempia kuin alunperin näytti. Seu-raavat vaikutukset on jo yhdistetty Ml agonisteihin lasimaljassa (ja kenties elimistössä: 5 1. Sitoutuminen Ml reseptoreihin ja niiden aktivointi; 2. Valittujen G-proteiinien (esim. Gq mutta ei Gs) erillinen aktivointi; 3. Nerotrooppistyyppiset ja synergistiset 10 vaikutukset NGF:n kanssa; 4. Amyloidiesiproteiinin (APP) eritys ja β-amyloidien väheneminen; 5. Defosforyloitujen τ-proteiinien osuuden lisääminen; 15 6. NGF-tyyppiset vaikutukset.

Kaikki nämä vaikutukset voidaan yhdistää malliin, jossa mlAChR:ien aktivointi johtaa siihen liittyvien tapahtumien vyöryyn. Nämä monimutkaiset Ml agonistisen vaikutuksen takana olevat mekanismit voi-20 daan liittää yleiseen skenarioon, joka selittää normaalista poikkeavan APP-käsittelyn, NGF-tyyppiset puutteet ja kolinergiset vajavuudet SDATrssa ja AD:ssa. Näin ollen Ml agonisteilla, kuten keksinnön : agonisteilla, voi olla arvoa estettäessä amyloidin • 25 muodostusta edistämällä selektiivisesti ja positiivi- * , sesti erittymisen käsittelyreittiä ja saattavat myös edistää hermoravinteiden toimintaa AD:ssa johtuen nii-den synergistisestä vaikutuksesta NGF:n kanssa. Siten Ml agonistit saattavat olla käyttökelpoisia kolinergi-30 sessa vaihtamisstrategiassa ja myös AD:n etenemisen < · viivyttämisessä. Keksinnön yhdisteet, jotka ovat Ml agonisteja, ovat (toisin kuin peptidit) suhteellisen i ... : pieniä molekyylejä, joilla on hermoravitsemuksellisia .··. vaikutuksia ja edistävät APP:n vapautumista ja normaa- '·’ 35 lia käsittelyä ja lisäävät defosforyloituja (tai vä- ί.ί : hentävät fosforyloituja) τ-proteiineja. Siten solujen : käsittely Ml agonist ilia saattaisi mahdollisesti kään- 113777 116 tää APP:n käsittelyn amyloidogeenisen lysosomireitin normaaliksi eritysreitiksi ja näin ollen AD:n koliner-gisilla hoidoilla on pitempiaikaisia vaikutuksia β-amyloidin saostumiseen (koskien myös Lahiri et ai., 5 Biochem. Int. 28: 853-860, 1992). Lisäksi, koska jot kut tämän keksinnön agonisteista osoittavat NGF-tyyppisiä vaikutuksia hallitulla tavalla ja erityisesti NGF:n läsnäollessa, tällaisilla yhdisteillä voi olla huomattavaa arvoa AD/SDAT:n tulevassa hoidossa. 10 Tällä tavoin hermosoluhaaran kasvua voidaan hallita paremmin. Lisäksi yhdisteillämme on pitkäkestoinen edullinen vaikutus hermosoluhaaran kasvuun NGF:n läsnäollessa. Täten voidaan spekuloida, että tuleva mahdollinen hoito käyttäen sellaisia kasvutekijöitä, ku-15 ten NGF, AD/SDAT-potilaille, saattaisivat vaatia harvemmin toistuvia itsensä kasvutekijän antamisia, kun se annetaan yhdessä Ml agonistin kanssa. Huomattavaa on, että NGF:n antaminen aivoihin on mitä vaikein tehtävä, koska tämä yhdiste ei kulje veren-aivojen väli-20 kerroksen läpi. Kun tämä ongelma ratkaistaan (esim. erikoisten siirtojärjestelmien kautta), se vaatii yhä NGF-tyyppisten yhdisteiden toistuvaa antamista. Ml /· Agonist it voivat tässä suhteessa alentaa NGF: n vaadit tavan toistetun antamisen lukumäärää, koska tällaiset f 25 agonistit pidentävät NGF:n vaikutuksia (ainakin lasi-. maljassa) . Kiinnostavasti NGF:n (icv) sairaalakokeet kahdella AD potilaalla osoittivat hyvin vakavia nega-! tiivisia vaikutuksia (ankaraa kipua, hajamielisyyttä, minimentaalisen tuloksen huonontumista), (3rd Spring-30 field Symposium on Alzheimer's Disease, May 11-15, 1994, Springfield, II., USA). Keksinnön kaltaisten Ml agonistien käytöllä, jotka toimivat synergisesti NGF:n ;· .* kanssa, voi olla suurta arvoa pienennettäessä NGF:aan liittyviä sivuvaikutuksia ihmisissä, koska silloin • 35 voitaisiin käyttää pienempiä annoksia.

' i Koe 7: Farmakologiset ja toksikologiset kuva- ' · ’'· ukset 113777 117

Tutkimus suoritettiin tarkkailemalla eläimiä kunkin aineen 3-6 annostason suonen sisäisen tai suun kautta (hiiret) tai suun kautta (vatsan sisään rotille) antamisen jälkeen. Tulokset on koottu yhteen tau-5 lukossa 5.

Eri aikavälein lääkkeen antamisen jälkeen (10, 20, 30, 45, 60, 120, 240 minuuttia ja 24 tuntia) eläimet altistettiin yleiseen käytöksen, refleksien ja tahdosta riippumattomien vaikutusten muutosten yksilö tyiskohtaiseen tarkkailuun. Kuolleisuus merkittiin muistiin 24 tuntia koeyhdisteiden antamisen jälkeen. Rottien kehon lämpötila mitattiin käyttäen lämpömittaria Tele-Thermometer (Model 46 TUC). Erilaisiin farmakologisiin ja käyttäytymisparametreihin kuuluivat: 15 syljeneritys, nenän ja suun ympäristön punotus, verinen kyynelvuoto, rauhallisuus, ataksia, sinerrys, vapina, kouristukset, vajaalämpöisyys, selkälihaskouris-tus, hengitysvaikeudet, ripuli, jyrsiminen, pystykar-vaisuus, kuolleisuus, muutokset pupillin halkaisijas-20 sa, pyörätanko, ali- tai yliaktiivisuus ja ääntely. Jotkut testatuista yhdisteistä eivät ole myrkyllisiä 500 mg/kg määrään asti (suun kautta hiiret & rotat).

» 113777 118

Taulukko 5: Farmakologiset ja toksikologiset profiilit hiirissä ja rotissa

Cnd. Unesi 1 I 2 3 * I 5 I 6 I 7 I 8 I Ilo 111 j 12 13 « AF- ‘ * __ 5 133 50* 100* 3/5 hiiret 200* 5/5 400 i/5 134 10* ®/5 10 25* 0/5 50* 0/5 hiiret 100* 4/5 2/5 3/5 100 0/5 200 1/5 0/5 15 151 50 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 Θ/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 (S) 100 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 θ/4 0/4 3/4 0/4 0/4 0/4 200 4/4 4/4 4/4 2/4 1/4 1/4 1/4 0/4 1/4 4/4 0/4 0/4 1/4 rotat 500 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4' 4/4 0/4 2/4 4/4 0/4 0/4 2/4 160 8 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 NT 0/4 0/4 NT NT 0/4 16 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 hiiret 31 2/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 “ 0/4 1/4 0/4 20 63 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Θ/4 125 3/4. 4/4 4/4 0/4 .0/4 1/4 0/4 0/4 2/4 0/4 250 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 4/4 0/4 0/4 3/4 0/4 500 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 4/4 0/4 0/4 3/4 0/4 : rotat 10 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 25 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 0/4 4/4 0/4 0/4 i 25 50 4/4 4/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 4/4 4/4 0/4 Θ/4 100 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 1/4 4/4 4/4 0/4 0/4 200 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 4/4 2/4 4/4 4/4 2/4 0/4 500 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 4/4 4/4 4/4 0/4 160{ 63 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4

Des) 125 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 250 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 1/4 Θ/4 0/4 0/4 30 rotat 500 3/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 1/4 0/4 hiiret 120 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 240 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 1/4 0/4 500 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 2/4 0/4 ·:··; 1000 2/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 3/4 0/4 3/4 Θ/4 * I » ’···" 35 * mg/kg suun kautta annettuna ellei toisin : ilmoiteta ° annettuna suonensisäisesti 113777 119

Taulukko 5: (jatko)

Cpd. Annos l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H 12 13 11 AF- * 163 25 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 NT 0/4 0/4 0/4 NT NT 0/4 50 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 hiiret 100 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 200 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 400 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 rotat 50 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 NT 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 100 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 200 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 400 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 177 31 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 NT NT 0/4 62 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 1/4 -liiret 125 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 0/4 4/4 250 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 0/4 4/4 500 4/4 0/4 4/4 4/4 0/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 4/4 178 30 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4' 0/4 NT 0/4 0/4 0/4 NT NT 0/4 60 1/4 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 liiret 144 3/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 288 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 2/4 0/4 500 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 2/4 0/4 4/4 0/4 rotat 63 1/4, 0/4 0/4 0/4 .0/4 0/4 0/4 0/4 NT 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 125 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 4/4 4/4 0/4 0/4 250 3/4 3/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 4/4 3/4 0/4 0/4 500 4/4 3/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 1/4 4/4 4/4 0/4 0/4 180 63 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 NT 0/4 0/4 0/4 NT NT 0/4 .· liiret 125 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 0/4 0/4 250 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 0/4 0/4 : 500 4/4 3/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 rotat 31 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 NT 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 62 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 125 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 250 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 » * > · »0 113777

Taulukko5: (jatko)

Cpd. Amos 123456 7 I 8 9 10 H 12 13 14 AF- * " " ~ - ' —1 — »V — — 1 — " — - 1 11' —- -1- — 185 31.3 G/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 5 62.5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4 0/4 0/4 0/4 hiiret 125 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 4/4 0/4 0/4 0/4 250 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 500 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 rotat 62.5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 125 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 -, n 250 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 500 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 261 3.75 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 7.52 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 rotat: 15.6 3/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 3/4 0/4 0/4 0/4 62.5 4/4 4/4 4/4 0/4 4/4 θ/4 4/4 0/4 3/4 3/4 3/4 0/4 250 4/4 4/4 4/4 0/4 4/4 4/4 4/4 0/4 1/4 4/4 4/4 4/4

15 — - - '1. - . — .1 -. .— I... I .......I

265 125 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 '0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 rotat 250 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 500 0/4 0/4 0/4 0/4 4θ4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 G/4 hiiret 125 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 G/4 θ/4 θ/4 θ/4 250 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 θ/4 2/4 2/4 θ/4 θ/4 θ/4 20 500 2/4 0/4 θ/4 θ/4 . θ/4 θ/4 4/4 4/4 θ/4 4/4 θ/4 AVAIN TAULUKKOON 5 1 = syljeneritys 8 = hypotermia 2 = verinen kyynelvuoto (rotat) 9 = mustuaislaajentuma : tai kyyneleritys (hiiret) 10 = hengitysvaikeudet .· 25 3 = rauhoitus 11 = ripuli t . 4 = ataksia 12 = jyrsiminen , 5 = sinerrys 13 = pystykarvaisuus 6 = vapina 14 = kuolleisuus 7 = kouristukset 30 • » ··-> Tulosten tarkastelu: AF160 ... : AF160 on suhteellisen voimakas muskariininen agonisti ollen enemmän keskus- kuin ääreishermostoon vaikuttava '· 35 (esim. hypotermia vastaan syljeneritys) ja ainakin 5 : kertaa vähemmän myrkyllinen verrattuna AF102B:hen.

·' : Merkittävä havainto tässä yhdisteessä oli vapinan m 113777 puuttuminen rotissa korkeimpiin koeannoksiin saakka (500 mg/kg) ja jonkin verran vapinaa hiirissä annoksilla > 125 mg/kg suun kautta annosteltuna. Vastaava vaikutus havaittiin AF160:n metyylianalogissa, nimit-5 täin AF178:ssa, jolla ei havaittu vapinaa hiirissä eikä rotissa 500 mg/kg asti, p.o. Hiiret ovat herkempiä tälle yhdisteelle kuin rotat, koska ääreis- ja keskushermoston sivuvaikutuksia tapahtuu alemmilla annoksilla .

10 Rotissa AF160:n havaittiin olevan voimakas agonisti. Merkit olivat näkyviä niinkin alhaisilla annoksilla kuin 25 mg/kg. ED50-arvot saatiin hypotermial-le ja jyrsimiselle. Oireiden määrä ja ankaruus olivat annoksesta riippuvia. Hypotermiavaikutus kesti pit-15 kään, yli 4 tuntia.

Neljä näkökohtaa on huomionarvoista AF160:ssa: 1. Ilmeisesti yhdiste on enemmän CNS aktiivinen kuin PNS aktiivinen (esim. hypotermia tapahtuu 20 alemmilla annoksilla kuin syljeneritys).

2. CNS-selektiivisyyttä on, koska kaikkia CNS-vaikutuksia ei havaittu (esim. hypotermia vastaan vapinan puuttuminen).

3. Havaittujen vaikutusten kestoaika oli pit- i 25 kä.

: 4. Kuolleisuutta ei havaittu hiirillä ja ro- '. tiliä korkeimmalla annosmäärällä, 500 mg/kg.

, , AF160(Des)

Rotissa havaittiin syljeneritystä, hypotermi- 30 aa ja ripulia yhdessä neljästä eläimestä 45 minuuttia *;;; 125 mg/kg:n annoksen jälkeen. Annoksen kasvaessa 500 ’·;·* mg/kg näitä oireita omaavien eläinten lukumäärä ryhmää ·:·: kohden lisääntyi ja lisäksi pystykarvaisuus ja rauhoi- tus tulivat selvästi esiin. Hypoterminen vaikutus ei , *, 35 ollut annoksesta riippuva. Tämä yhdiste ei tuottanut • « · muita keskushermosto- tai tahdosta riippumattomia vai-’ * kutuksia. Yhdiste on suhteellisen epäaktiivinen ko- 113777 122 linergisiin sivuvaikutuksiin nähden. AF160(Des):n tapauksessa sivuvaikutukset tulevat esiin annoksille > 246 mg/kg, p.o. rotilla.

Hiirillä havaittiin kyyneleritystä, ripulia 5 ja mustuaislaajentumaa 240 mg/kg:n AF160(Des)-annoksen jälkeen. Korkeammilla annoksilla ja 1000 mg/kg asti lisäoireet, kuten syljeneritys, rauhoitus ja hypoter-mia olivat ilmeisiä. Useimpien oireiden määrä ja vakavuus (lukuunottamatta kyyneleritystä) riippui annok-10 sesta. Kuolleisuutta ei havaittu korkeimmallakaan annosmäärällä, 1000 mg/kg. AF160(Des):n 1 mg:n (raja-arvo) ulkoinen käyttö silmään tuotti mustuaislaajentu-man 15 minuutin kuluessa. Toisaalta tunnetun paikallisen mustuaista laajentavan vaikutuksensa vuoksi ver-15 tailulääkkeenä käytetty atropiini tuotti mustuaislaa-jentuman 45 minuutin kuluessa niinkin alhaisella määrällä kuin 40 ^g. Tämä tulos osoittaa selvästi, että AF160(Des):n aiheuttama mustuaislaajentuma on lähtöisin keskushermostosta.

20 AF163

Rotilla annosalueella 50-400 mg/kg olivat syljeneritys ja punotus nenän ja suun ympärillä ainoat : tämän yhdisteen tuottamat vaikutukset. Nämä vaikutuk set olivat nopeasyntyisiä (10 min) ja lyhytkestoisia ’ j 25 (20 min). Samalla kun syljeneritystä osoittavien eläinten lukumäärä oli annoksesta riippuva, punoitusta Ύ nenän ympärillä havaittiin ainoastaan yhdellä eläimel- ;;; lä annosmäärällä 100 mg/kg. Lopputuloksena havaittiin ·' rotissa ainoastaan tahdosta riippumattomia vaikutuksia 30 tämän yhdisteen antamisen jälkeen.

...Y Hiirillä yhdellä eläimellä korkeimmalla koe- :,Y annoksella (400 mg/kg) havaittua ääntelyä lukuunotta- ,Y; matta tämä yhdiste oli ilman muita näkyviä vaikutuk- • * t..._ siä. Näkyviä keskus- tai ääreishermoston sivuvaikutuk- • · Y 35 siä ei havaittu AF163:lla hiirissä korkeimmalla koean- i.i * noksella (400 mg/kg, p.o.). AF163 voidaan pitää ·:··: AF160 :n esilääkkeenä samalla tavoin kuin RS86:n ditio- 113777 123 analogia (ks. Bollinger et ai., julkaisuissa Alzheimer and Parkinson's Disease; Stratedies in R&D, Fisher et ai., Plenum Press, s. 585, 1986).

AF177 5 Rotilla havaittiin hypotermiaa, yliaktiivi- suutta ja vapinaa 10 minuuttia 31 mg/kg:n antamisen jälkeen. Annoksen kasvaessa 62 mg/kg:aan oireiden määrä lisääntyi. Rauhoitusta, ataksiaa, rohtumaa ja putoaminen pyörätangolta havaittiin havaittiin 20 mi-10 nuuttia antamisen jälkeen 4/4 hiirellä. Kuolleisuutta 1/4 sattui 30 minuuttia antamisen jälkeen. Annoksen kasvaessa 125, 250 ja 500 mg/kg:an havaittiin myös syljeneritystä, kouristuksia ja kuolleisuutta 4/4 hiirellä, mutta oireiden synty ja kesto tulivat edetes-15 sään vakavimmiksi. Lasketut ED5o-arvot osoittivat,että AF177 omaa useimmiten keskushermostovaikutuksia. AF177 voidaan pitää esilääkkeenä keskushermostoon vaikuttavana ja voimakkaana muskariinisena agonistina.

AF178 20 Hiirissä nähtiin alentunutta motorista aktii visuutta, syljeneritystä, kyyneleritystä ja ripulia 1 tunti 60 mg/kg-.n antamisen jälkeen. Annoksen lisäämi-nen 500 mg/kg:an johti lisäoireisiin, kuten hengitysvaikeudet, suorituskyvyn aleneminen pyörätangolla, va-25 pina ja mustuaislaajentuma. Useimpien oireiden määrä ja vakavuus olivat annoksesta riippuvaisia. Yleensä , *. annosten lisääminen pidensi vaikutusta. Esim. ripuli, vapina, mustuaislaajentuma j.n.e kestivät n. 4 tuntia.

* · t

Maininnan arvoista on, että 500 mg/kg:lla yksi eläin 30 osoitti tykytystä 20 minuutin kuluessa antamisen jäl-·;;; keen kestäen 10 minuutin ajan. Vaikka 500 mg/kg:n an- nos tuotti vaikeita toksikologisia oireita, kuollei-·:·*· suutta ei kirjattu muistiin. Täten arvioitu LD50 saat- taisi olla yli 500 mg/kg:n annoksella.

• t 35 Rotilla syljeneritys oli ainoa näkyvä merkki ’··· : 62,5 mg/kg AF178:n antamisen jälkeen. Annosta lisättä- *·”· essä 125 mg/kg.-an oli näkyvissä useampia merkkejä, ku- 113777 124 ten verinen kyynelvuoto, hypotermia, ripuli ja jyrsiminen. Noiden oireiden määrä ja vakavuus kasvoi annoksen kasvaessa. Hengitysvaikeudet olivat ilmeisiä ainoastaan yhdellä eläimellä annoksella 500 mg/kg, 5 mi-5 nuuttia ruiskutuksen jälkeen. Yhdiste voi omata suhteellisen laajan turvamarginaalin.

AF180

Rotilla syljeneritys oli ainoa 125 mg/kg AF180:n tuottama oire. Se tuli ilmeiseksi 20 minuutin 10 kuluessa antamisen jälkeen ja kesti 40 minuutin ajan. Annoksen lisääminen edelleen lisäsi syljenerityksen kestoaikaa 230 minuuttiin. Tällä annostasolla hypotermia merkittiin muistiin kolmella eläimellä 15-240 minuuttia ruiskutuksen jälkeen. Muita keskushermoston 15 tai tahdosta riippumattomia vaikutuksia ei havaittu tällä annosmäärällä.

Hiirillä havaittiin hypotermiaa ja mustuais-laajentumaa 20 minuuttia 125 mg/kg:n antamisen jälkeen. Annoksen lisäännyttyä 500 mg/kg:an näitä oireita 20 osoittavien eläinten määrä ryhmää kohden kasvoi ja lisäksi syljeneritys, kyyneleritys ja rauhoitus tulivat selvästi esiin. Lisäksi näiden oireiden kestoaika oli 500 mg/kg:n antamisen jälkeen pidempi kuin 1,5 tuntia. Tämä tuote ei tuottanut muita keskushermoston tai tah-• 25 dosta riippumattomia vaikutuksia.

AF185 : Hiirillä mustuaislaajentumaa havaittiin 62,5 mg/kg AF185:n antamisen jälkeen. Korkeammilla annoksilla 500 mg/kg:an asti olivat lisäoireet, kuten syl-30 jeneritys ja hypotermia näkyvissä yhdisteen antamisen jälkeen. Kuolleisuutta ei havaittu korkeimmi Hakaan I f annosmäärillä (500 mg/kg) . --------- ----------------- *:‘ ; Rotilla, lukuunottamatta yhdellä eläimellä havaittua punotusta nenän ja suun ympärillä korkeim-

«M

. 35 maila koeannoksella (500 mg/kg), tämä yhdiste oli • » t ·'·· ·’ vailla muita ilmeneviä vaikutuksia. Siitä päätellään, » < t * * * ‘ että AF185 on hyvin turvallinen yhdiste.

113777 125 AF261

Rotilla oli hypotermia (tyypillinen CNS vaikutus) ainoa 7,5 mg/kg AF261:n tuottama oire. Se ilmeni 10 minuutin kuluessa antamisen jälkeen ja kesti 50 5 minuuttia. Annoksen lisäännyttyä 15,6 mg/kg:an olivat lisäoireet, kuten syljeneritys, verinen kyynelvuoto, aliaktiivisuus, ataksia ja ripuli, näkyvissä 10 minuutin kuluessa. Suuremmilla annoksilla ja 250 mg/kg asti lisämerkit, kuten punotus nenän ja suun ympärillä, valo pina, kouristukset, selkälihaskouristus, jyrsintä ja pystykarvaisuus, olivat ilmeisiä. Nämä merkit voitiin havaita 5-10 minuuttia antamisen jälkeen. Useimpien noiden oireiden vakavuus ja määrä olivat annoksesta riippuvia. Kuolleisuutta 4/4 tapahtui ainoastaan kor-15 keimmalla koeannoksella (250 mg/kg), 45 minuuttia antamisen jälkeen.

AF265

Rotilla hypotermia (tyypillinen CNS vaikutus) oli ainoa 250 mg/kg AF265:n tuottama oire. Se ilmeni 20 10 minuutin kuluessa antamisen jälkeen ja kesti 110 minuuttia. Muita keskushermoston tai tahdosta riippumattomia vaikutuksia ei havaittu tämän yhdisteen anta-: misen jälkeen. Siten tämä yhdiste on merkittävä johtu- : en sen ainoastaan CNS vaikutuksesta.

; 25 Koe 8: AF134:n vaikutukset hamstereihin AF134:n vaikutukset muistiin ja oppimiskykyyn arvioitiin vaiheittaisessa passiivisessa väistämisteh-tävässä hamstereilla. Käyttäytymiskaava ja välineistö on kuten Fisher et ai on kuvannut, Neurosci. Lett. 30 102: 325 (1986). Neljä ryhmää (20 eläintä/ryhmä) Spra- gue-Dawley uroshamsteria, 200-300 g, iältään 3-4 kuu-kautta (Charles River Breeding, UK) käsiteltiin yhdel-lä seuraavista AF134-annoksista: 1, 5, 10 mg/kg vatsa-ontelonsisäisesti (ip) ja yksi ryhmä sai suolaliuosta I* 35 (1 ml/kg, ip) .

·.· · AF134 käsitellyissä hamstereissa ei havaittu : * : merkittäviä eroja esishokilla käsiteltyjen eläinten, 113777 126 joihin ruiskutettiin yhdistettä 30 minuuttia ennen shokkia, ja jälkishokilla käsiteltyjen eläinten (joihin ruiskutettiin yhdistettä 60 minuuttia shokin jälkeen) muistissa pysymisen välillä.

5 Toisessa koekaaviossa AF134:a verrattiin sko- polamiiniin (antimuskariininen yhdiste) hamstereissa 8-haaraisessa säteittäislabyrintissa (käyttäytymiskaava ja välineistö kuten Fisher et al:n kuvaama, Neu-rosci. Lett. 102: 325, 1986). 14 hamsterin ryhmä käsi-10 teltiin skopolamiinilla (0,2 mg/kg, ip) tai suolaliuoksella (1 ml/kg, ip) 20 minuuttia ennen labyrintin juoksemista. Kaikki haarat varustettiin syötillä. Kaikki hamsterit saivat molemmat käsittelyt 3 päivän käsittelyvälein. (10 päivän harjoittelua seurasi kym-15 menen päivän koe.) Sama koe toistettiin samoilla hamstereilla AF134:11a (5 mg/kg, ip) ja vastaavasti suolaliuosta (1 ml/kg, ip). Skopolamiini osoitti odotetusti tyypillisen antikolinergisen muistinmenetysvaikutuksen käytetyllä annoksella. AF134 ei kuitenkaan aiheuttanut 20 mitään muutosta eläinten käytöksessä.

AF134, jolla on antagonistinen vaikutus mus-kariinisiin Ml (perustuen sidostutkimuksiin) ja M3 » (perustuen marsun ileumipreparaatteihin) reseptoreihin, ei huononna havaittuja vaikutuksia ja saattaa si- • 25 ten olla käyttökelpoinen liikuntasairauksien, Parkin- * . sonin taudin, sekoittuneen Parkinsonin ja Alzheimerin taudin, maanis-depressiivisyyden, ihmisen päävamman hoidossa ja lukuisissa ääreissairauksissa sekä äkillisen nuhan, mahahaavan ja astman hoidossa.

30 Koe 9: Käyttäytymistutkimukset koe-eläimillä AF160 ja AF102B - Säteittäinen labyrintti AF160- (3 ja 5 mg/kg, p.o) ja AF102B-annosten (3 mg/kg, p.o) mahdollista hyötyvaikutusta tutkittiin .·**, AF64A-ruiskutettujen (1,5 nmoolia/2 μΐ/puoli) eläinten • · ’·’ 35 palautuviin muistikatkoksiin. Nämä koe-eläimet jäljit- : televät tietyssä määrin kolinergista vajaatoimintaa SDAT:ssa. (Fisher et ai., J.Pharmacol. Expl. Therap.

113777 127 257: 392-403, 1991). 80 Sprague-Dawley uroshamsteria, iältään 4-6 kuukautta (340-580 g) , käytettiin tässä tutkimuksessa. Aikaväli toimenpiteen ja käyttäytymis-kokeen välillä oli 2-3 kuukautta. Viikkoa ennen käyt-5 täytymiskokeen alkamista hamsterit siirrettiin omiin häkkeihinsä ja syötettiin rajoitetusti kunnes saavutettiin n. 85 %:n paino niiden normaaliin syöttämiseen nähden. Sitten hamsterit saivat 5-6 palaa Altrominia (15 g) päivittäin niiden kehonpainon pitämiseksi valo kiotilassa. Hamstereilla oli vapaa pääsy veden ääreen. Huone valaistiin 12 tuntia päivässä (06.00-18.00) ja käyttäytymiskoe suoritettiin aamun aikana.

Käyt t äytyrni skoe 40 AF64A:lla ja 40 suolaliuoksella ruiskutet-15 tua hamsteria jaettiin sattumanvaraisesti neljään alaryhmään ja niihin siirrettiin AF160 3 mg/kg, AF160 5 mg/kg, AF102B 3 mg/kg ja DDW (10 ml/kg, p.o.). Käyt-täytymiskokeen ensimmäisen kahden päivän aikana hams-tereita harjoitettiin 8/8 RAM-syöttimenetelmän mukai-20 sesti niiden tutustuttamiseksi labyrinttiin ja vahvistaviin pelletteihin (tarkkuus 45 mg) . Tässä vaiheessa hamsterit sijoitettiin keskusaukiolle ja sallittiin vapaa pääsy kaikkiin 8 syöttihaaraan. Jokainen harjoi-: tusvaihe päättyi kun kaikki kahdeksan pellettiä oli ; 25 kerätty tai 15 minuuttia kulunut, kumpi tahansa täyt- : tyi ensin. Kolmannen ja neljännen päivän aikana pelle tit sijoitettiin ainoastaan haarojen päähän. Muutoin muut toimenpiteet olivat samat kuin esiharjoituksessa. Koe suoritettiin harjoituksen toisen viikon aikana. 30 Tuona aikana AF160, AF102B tai (vertailuna käytetty) ‘i;; DDW annettiin kerran päivässä viiden päivän ajan 60 • > '·;> minuuttia ennen koetta.

Tietojen analysointi

Kaikki liikkeet, kulunut aika sekä oikeat ja , ·, 35 väärät vastaukset labyrintissä merkittiin muistiin.

··· · AF160:n tai AF102B:n vaikutuksen arvioimiseksi koeai- ' · kana verrattuna harjoitusjaksoon, jota käytettiin pe- 113777 128 rustason suorituksena, tehtiin ANOVA 3-tieanalyysi (2x4x2) toistetulla muuttujalla (harjoitus- tai koepäivä jakso ja) ja kahdella toistamattomalla muuttujalla (AF64A/suolaliuosruiskutus ja käsittely erilaisilla 5 AF160- ja AF102B- tai DDW-annoksi11a). Jälkivertailuja täydennettiin käyttäen yksinkertaisia päävaikutusten vastakohtia.

Tulokset 10 Mitä tulee oikeisiin valintoihin kahdeksasta käynnistä, havaittiin merkittävä keskinäinen yhteys ryhmien x käsittelyn x viikkojen välillä [F(2/48)=3,95; P <0,025]. Tarkemmin sekä harjoitus että lääkkeen antamisjakson aikana AF64A-ruiskutetut 15 hamsterit tekivät huomattavasti vähemmän virhevalinto-ja kuin suolaliuoksella ruiskutetut (P <0,001). Molemmat lääkeaineet AF102B (3 mg/kg) ja AF160 (3 mg/kg) paransivat AF64A-ruiskutettujen hamstereiden suoritusta toisen viikon aikana verrattuna harjoituspäiviin 20 (vastaava P <0,001). Toisen viikon aikana molemmat ryhmät, AF160 (3 mg/kg) ja AF102B (3 mg/kg) saavutti vat saman suoritustason, joka oli huomattavasti korke-ampi kuin vedellä käsiteltyjen AF64A-ruiskutettujen hamstereiden (P <0,05) suoritustaso. AF160 5 mg/kg:lla .· 25 ei ollut merkittävää vaikutusta tähän parametriin.

Verrattaessa suolaliuoksella ruiskutettuihin hamstereihin, vedellä käsiteltyjen hamstereiden suoritus pa-! rani (5 %) toisen viikon aikana verrattuna ensimmäi- seen viikkoon (P <0,01). Vastaavasti havaittiin paran-30 nus (7,5 %) myös AF160:lla (3 mg/kg) käsitellyissä ’ 9 *·’ hamstereissa (P <0,001) . AF102B:lla (3 mg/kg) ei ollut *...· vaikutusta tähän parametriin suolaliuoksella ruiskute- » tuissa hamstereissa.

.··, Mitä tulee kokonaisvirheisiin havaittiin mer- t · 35 kittävä keskinäinen yhteys ryhmien x käsittelyjen x : viikkojen välillä [F (3/64) =3,46; P <0,025]. Molemmilla : viikoilla AF64A-ruiskutettujen hamstereiden virheiden 113777 129 lukumäärä oli huomattavasti korkeampi kuin suolaliuoksella ruiskutettujen hamstereiden virhemäärä (P <0,001). AF64A-ruiskutettujen hamstereiden kaikkien neljän ryhmän virheiden lukumäärä väheni huomattavasti 5 toisella viikolla verrattuna ensimmäiseen viikkoon: AF64A + vesi-20 % (P <0,01), AF64A + AF160-3 mg/kg-16 % (P <0,001), AF64A + AF160-5mg/kg-15 % (P <0,02) ja AF64A + AF102B-3 mg/kg-30 % (P <0,001). Vaikka kaikki neljä ryhmää paransivat suoritustaan, ainoastaan 10 AF102B-3 mg/kg:n suoritus oli parempi kuin AF64A:n + vesi suoritus. Suolaliuoksella ruiskutetuissa hamstereissa AF160-3 ja 5 mg/kg paransivat huomattavasti suoritusta toisella viikolla ensimmäiseen verrattuna (P <0,01 ja vastaavasti P <0,001). AF102B-3 mg/kg huo-15 nonsi suoritusta ja tämä ryhmä teki enemmän virheitä toisella viikolla ensimmäiseen verrattuna (P <0,001).

Mitä tulee kokonaisaikaan havaittiin merkittävä yhteys ryhmien x käsittelyn x viikkojen välillä [F(2/48)=3,29; P <0,05]. Parannusta havaitti in AF64A-20 ruiskutetuissa alaryhmissä, lukuunottamatta AF64A + AF160-5 mg/kg: AF64A + vesi-31 % (P <0,01), AF64A + AF160-3 mg/kg-(47 %) (P <0,001) ja AF64A + AF102B-3 mg/kg-(21 %) (P <0,01). Suolaliuoksella ruiskutetuissa ·' hamstereissa havaittiin merkittävä vaikutus ajan pa- i 25 rannukseen suolaliuos + vedellä-(54 %) (P <0,001) ja : suolaliuos + AF160:lla 3 mg/kg-(37 %) (P <0,001).

. AF102B:lla ei ollut vaikutusta suolaliuoksella ruisku tettuihin hamstereihin tällä parametrilla, ehkä johtuen pohjavaikutuksesta. AF160-5 mg/kg ei vaikuttanut 30 merkittävästi suolaliuoksella ruiskutettujen hamste- : · reiden suoritukseen, vaikka pyrkimystä parannukseen voidaan havaita.

*;·· Päätelmät .···. 1. AF64A:lla (1,5 nmoolia/2 μΐ/puoli) ruisku- 35 tetut hamsterit osoittivat merkittävää oikeiden valin- • » 1 : tojen, virhemäärien ja kokonaisa jän parametrien huo- nontumista verrattuna suolaliuoksella ruiskutettuihin α30 113 7 7 7 hamstereihin.

2. AF160 (3 mg/kg) paransi huomattavasti AF64A-ruiskutettujen hamstereiden suoritusta (verrattuna plasebokäsittelyyn) oikeiden valintojen ja koko-5 naisajan parametreillä. Korkeampi annos 5 mg/kg havaittiin tehokkaaksi ainoastaan virhemäärien parametrilla verrattuna perustasoon (mutta ei plasebotasoon).

AFieO(Des) - Morris vesilabyrinttitehtävä (MWM) 10 Tämän tutkimuksen tarkoitus oli arvioida koe- materiaalin AF160(Des) kykyä kääntää havaitut huononemiset päinvastaisiksi AF64A-ruiskutetuissa hamstereissa käyttäen MWM-tehtävää Fisher et al:n menetelmän mukaisesti, J. Pharmacol. Exptl. Therap. 257: 392-403, 15 1991. AF160(Des) testattiin käyttäen kahta annosta: 1 ja 3 mg/kg, p.o. 38 AF64A:lla (3 nmoolia/2 μΐ/puoli) ja 42 suolaliuoksella ruiskutettua hamsteria jaettiin sattumanvaraisesti neljään alaryhmään ja niihin siirrettiin erilaisia annoksia AF160(Des) (1 ja 3 mg/kg, 20 p.o.) ja DDW (10 ml/kg, p.o.). Lääkeaine annettiin kerran päivässä 5 päivän ajan 60 minuuttia ennen koetta.

Mitään yhtenäisiä sivuvaikutuksia ei havaittu käyttäytymiskokeen aikana. Saatiin seuraavat tulokset: • 25 1. AF64A:n (3 nmoolia/2 μΐ/puoli) ruiskutus . johti suorituksen merkittävään huononemiseen ilmaistu na sekä pakomuisti- että reitin pituusparametrin avul-la.

2. AF160(Des)-3 mg/kg paransi sekä AF64A:lla 30 että suolaliuoksella ruiskutettujen hamstereiden suo- · ritusta kolmannella harjoitusjaksolla. Positiivinen vaikutus rohkaisee käyttämään tuon yhdisteen eri an-noksia tulevaisuudessa sen mahdollisten hyötyvaikutus-,··*. ten testaamiseksi oppimis- ja mui st iva j aukeissa.

*’ 35 AF185 - Passiivinen väistäminen (PA) : Tämä tutkimus selvitti AF185:n vaikutusta eri annoksina passiivisen väistämisen AF64A:lla käsi tel- 131 113777 lyissä hamstereissa.

Menetelmät AF64A:ta ruiskutettiin kaksipuolisesti (3 5 nmoolia/2 μΐ/puoli, icv) koe-eläimen tuottamiseksi (Fisher et ai., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 257: 392-403, 1991). Neljä viikkoa toimenpiteen jälkeen AF64A:11a ja suolaliuoksella ruiskutetut ryhmät jaettiin sattumanvaraisesti neljään alaryhmään, kuhunkin 10 10-11 hamsteria; kolmeen alaryhmään kohdistettiin AF185-käsittelyn erilaisia annoksia (1, 5, 10 mg/kg, p.o.) ja yksi ryhmä sai DDW (10 ml/kg) . AF185 annettiin heti shokin jälkeen ja hamsterit testattiin 72 tuntia myöhemmin. Kokeen yksityiskohdat ovat julkai-15 sussa Fisher et ai., J. Pharmacol. Exptl. Therap. 257: 392-403, 1991.

Tulokset

Alkuperäiset ja aiheutetut muistissa pysy-misominaisuudet analysoitiin erikseen ANOVA 2-20 tieanalyysissä (2x4); Ruiskutus AF64A/suolaliuos kautta AF185- tai DDW-annokset.

Mitä tulee alkuperäiseen pysymiseen, merkit-täviä eroja ei havaittu alkuperäisessä pysyvyydessä : minkään ryhmän välillä [F(3/75)=22,31; P <0,001]. Yk- : 25 sinkertaiset päävaikutuksen vastakohdat osoittivat, että AF64A-hamstereiden aiheutettu muistissa pysyminen *. oli huomattavasti lyhyempi kuin DDW:llä käsiteltyjen suolaliuoshamstereiden vastaava (P <0,001). AF185:lla- 1,5 tai 10 mg/kg käsiteltyjen hamstereiden muistissa 30 pysyminen oli huomattavasti pidempi kuin AF64A + DDW:n ;;; vastaava )P <0,001). Muita merkittäviä eroja ei ha- t · '>··' vaittu.

·;·· Päätelmät 1. AF64A:lla ruiskutetut hamsterit osoittivat • · 35 merkittävää muistissa pysymisen huonontumista verrat- > I * :·ί : tuna suolaliuoksella ruiskutettuihin hamstereihin.

’·”· 2. AF185:11a (1,5 ja 10 mg/kg) käsitellyt 113777 132 AF64A-ruiskutetut hamsterit ilmaisivat vertailueläimiä vastaavan muistikapasiteetin.

3. AF185 saattaa olla yksi mahdollisista yhdisteistä Alzheimerin taudissa havaittujen kaltaisten 5 muistisairauksien hoitamiseen.

Seuraava vastaavuusluettelo on tuotettu esimerkeiksi keksinnön mukaisista erikoisyhdisteistä, IU-PAC:n järjestelmällisen nimikkeistön mukaisesti, valo rustettuna niiden tässä hakemuksessa käytetyillä tunnusnumeroilla: 2,8-dimetyyli-l-okso-l-tia-4,8-diatsa- spiro[4.5]dekaani-3-oni (AF262); 3-etyyli-8-metyyli-l-oksa-4,8-diatsa-spiro[4.5]dekaani (AF268); 2,8- dimetyyli-l-oksao-4,8-diatsa-spiro[4.5]dekaani 15 (AF264); 3,8-dimetyyli-1,4-dioksa-8-atsa-spiro[4.5]de- kaani-2-oni (AF274); 2-etyyli-4,8-dimetyyli-l-tia-4,8-diatsa-spiro[4.5]dekaani-3-oni (AF272); 3-metyyli-l-oksa-4-tia-8-atsa-spiro[4.5]dekaani-2-oni (AF269); 3- etyyl'i-8-metyyli-l-oksa-4-tia-8-atsa-spiro [4.5] dekaa-20 ni-2-oni (AF271); 2-metyyli-l-tia-4,8-diatsa- | spiro[4.5]dekaani-3-oni (AF263); 3,8-dimetyyli-l-oksa- 4-tia-8-atsa-spiro[4.5]dekaani-2-oni (AF265); 2,8- .* dimetyyli-l-oksa-4,8-diatsa-spiro[4.5]dekaani-3-oni * ,· (AF260) ; 2,4,8-trimetyyli-l-tia-4,8-diatsa- ,! 25 spiro[4.5]dekaani-3-oni (AF266); 2-etyyli-8-metyyli-1- tia-4,8-diatsa-spiro [4.5] dekaani-3-oni (AF267) ; 2,8- ·. dimetyyli-l-tia-4,8-diatsa-spiro[4.5]dekaani-3-oni ·. (AF261) ; 2,8-dimetyyli-1-oksa-3,8-diatsa- spiro[4.5]dek-2-eeni-4-oni (AF238); 2,8-dimetyyli- 30 1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dek-l-eeni-4-oni (AF230); 3- etyyli-8-metyyli--1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dek-l-eeni- * · 4-oni (AF22 0) ; 1-etyyli-8-metyyli-3-oksa-1,8-diatsa- spiro [4.5] dekaani-2-oni (AF174) ; 8-metyyli-l-oksa-3,8-;*’ j diatsa-spiro[4.5]dekaani-2-tioni (AF165); 3-etyyli-8- , 35 metyyli-l-oksa-3,8-diatsa-spiro[4.5]dekaani-2-oni *·· ; (AF172) ; 8-metyyli-l-oksa-3,8-diatsa- * ’ spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni (AF169); 3-etyyli-8- 113777 133 metyyli-1-oksa-3,8-diatsa-spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni (AF180); 4-butyyli-8-metyyli-l,3,8-triatsa- spiro [4.5]dekaani-2-tioni (AF189); 8,N,N'-trimetyyli- 1.3.8- triatsa-spiro[4.5]deka-1,3-dieeni-2,4-diamiini 5 (AF194); metyyli-(8-metyyli-2-metyylisulfanyyli-l,3,8- triatsa-spiro[4.5]deka-1,3-dieeni-4yyli)-amiini (AF193); 8-metyyli-2-metyylisulfanyyli-l,3,8-triatsa-spiro [4.5]deka-1,3-dieen-4-yyliamiini (AF192); 4- metoksi-8-metyyli-2-metyylisulfanyyli-1,3,8-triatsa-10 spiro[4.5]deka-1,3-dieeni (AF191); 2,8-dimetyyli- 1.3.8- triatsa-spiro[4.5]dek-l-eeni (AF190); 3-etyyli- 2-etyylisulfanyyli-8-metyyli-l,3,8-triatsa- spiro [4 . 5] dek-l-eeni-4-tioni (AF170); 3-etyyli-2- etyylisulfanyyli-8-metyyli-l,3,8-triatsa-15 spiro[4.5]dek-l-eeni-4-oni (AF188); 8-metyyli-2-metyylisulfanyyli-1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dek-l-eeni-4-oni (AF187); 8-metyyli-2,4-bis-metyylisulfanyyli- 1.3.8- triatsa-spiro[4.5]deka-1,3-dieeni (AF177); 8- metyyli-4-metyylisulfanyyli-l,3,8-triatsa- 20 spiro[4.5]dek-3-eeni-2-tioni (AF183); 4- etyylisulfanyyli-8-metyyli-1,3,8-triatsa-spiro [4 . 5] dek-l-eeni-2-tioni (AF176); 3-etyyli-8- .* metyyli-1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dekaani-2,4-ditioni (AF163); 8-metyyli-l,3,8-triatsa-spiro[4.5]dekaani- i 25 2,4-ditioni (AF173); l-asetyyli-8-metyyli-l,3,8-; triatsa-spiro[4.5] dekaani-2,4-dioni (AF164); 3- metyyli-1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni (AF179); 3,8-dimetyyli-l,3,8-triatsa- spiro [4.5]dekaani-2,4-dioni (AF178); 3-etyyli-8-30 metyyli-1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni • · (AF160); 3-etyyli-8-metyyli-4-tiokso-l,3,8-triatsa- f | '· spiro [4.5] dekaani-2-oni (AF182) ; 8-metyyli-3-(4- ·:·: pyrrolidoni-l-yyli-but-2-ynyyli) -1,3,8-triatsa- spiro [4.5] dekaani-2,4-dioni (AF197) ; 3-prop-2-ynyyli-35 1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni (AF186); 3- t l | !! ! tert-butyyli-8-metyyli-1,3,8-triatsa- ’·' * spiro [4.5] dekaani-2,4-dioni (AF213) ; 8-metyyli-3-prop- 113777 134 2-ynyyli-l,3,8-triätsa-spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni (AF185); 3-tert-butyyli-8-metyyli-2-tiokso-1,3,8- triatsa-spiro[4.5]dekaani-4-oni (AF184); 3-etyyli-8-metyyli-2-tiokso-l,3,8-triatsa-spiro[4.5]dekaani-4-oni 5 (AF181); 3-etyyli-8-prop-2-ynyyli-1,3,8-triatsa- spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni (AF196); 5-(1-metyyli- piperidin-4-yyli)-2-tiokso-imidatsoliini-4-oni (AF195); 5-metyyli-2-(1-metyyli-piperidin-4-yyli)- tiatsolidiini-4-tioni (AF275); 3-but-2-ynyyli-8-10 metyyli-1,3,8-triatsa-spiro[4.5]dekaani-2,4-dioni (AF199).

Samalla kun keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti tässä hakemuksessa erityisesti viitaten esimerkkeihin ja muutoin määritettyihin suoritusmuotoihin alan asi-15 antuntijat ovat tietoisia, että monia muunnelmia ja modifikaatioita voidaan tehdä. Keksintöä ei näin ollen ole tiukasti rajattu näihin suoritusmuotoihin, joita erityisesti on kuvattu, vaan sen käsitteet, suojapiiri ja henki on ymmärrettävä patenttivaatimuksiin nähden, 20 jotka ovat liitteenä.

» »

Claims

135 113777

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaavan (I) mukaisen 3-okso-l-tia-4,8-diatsaspi-ro [4.5]dekaanin valmistamiseksi ~OC( K 10 jossa R on etyyli, R' on valittu vedystä ja metyylistä, ja R" on valittu metyylistä ja etyylistä, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happo-additiosuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, 15 että saatetaan 1-metyyli-4-piperidoni ja 1-etyyli-4-piperidoni, nimittäin yhdiste, jolla on kaava '-O” t » jossa R" on kuten määritelty edellä, 25 kosketuksiin yhdisteen kanssa, joka on valit tu joukosta, joka koostuu 2-merkaptobutyyrihaposta, ' nimittäin yhdisteestä, jolla on kaava HS-CHR-COOH, v * jossa R on kuten määritelty edellä, ja amiiniyhdisteen kanssa, jolla on kaava · 30 NH2R' tai [NH3R']+X"/ jossa X' on vastaioni ja R' on määritelty kuten edellä, • . sellaisessa lämpötilassa ja sellaisen ajanjakson ajan, [ ’ mikä on riittävä tuottamaan kaavan (I) mukaista yhdis- '···* tettä, »* · > » * 136 113777 ja haluttaessa saatetaan kaavan (I) mukainen yhdiste kosketuksiin hapon kanssa tuottamaan sen farmaseuttisesti hyväksyttävä additiosuola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 5 tunnettu siitä, että R" on metyyli.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R on etyyli.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R' on vety.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että amiiniyhdiste on (NH4)2C03.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R1 on metyyli.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä 15 tunnettu siitä, että amiiniyhdiste on NH2CH3.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että amiiniyhdiste on (NH4)2C03.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R" on etyyli.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että saadaan happoadditiosuola ja mainittu happo on enantiomeerinen happo.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että menetelmä käsittää happo- 25 additiosuolan kiteytysvaiheen.

12. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen kaavan (I) mukaisen 3-okso-l-tia-4,8-diatsaspi- ^ ro[4.5]dekaanijohdannaisen (-)enantiomeerin valmista- * · miseksi 30 /—ysYR (i) R 35 > » 113777 137 jossa R on etyyli, R' on valittu vedystä ja metyylistä, ja R" on valittu metyylistä ja etyylistä, nimittäin yhdisteen, jolla on kaava: ' ~ocr -occ HN (0 H3C 9 _ 9 10 / \ /S\/CH2CH3 / \ /S\^CH2CH3 H5c2—N V T "‘-yJn j -/ HN^0 , tai H,/ 15 (-)enantiomeerin valmistamiseksi, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän happo-additiosuolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan yhdiste, joka on valittu joukosta, joka 20 koostuu l-metyyli-4-piperidonista ja l-etyyli-4-piperidonista, nimittäin yhdiste, jolla on kaava R"-N y=0 v_y t s · > * : jossa R" on kuten määritelty edellä, kosketuksiin 2-merkaptobutyyrihapon kanssa, 30 nimittäin yhdisteen kanssa, jolla yhdisteellä on kaa-va HS-CHR-COOH, jossa R on kuten määritelty edellä “* ja amiiniyhdisteen kanssa, jolla on kaava NH2R' tai [NH3R']+X', jossa X' on vastaioni ja R' on määritelty kuten edellä, . \ 35 sellaisessa lämpötilassa ja sellaisen ajanjakson ajan, ; mikä on riittävä tuottamaan kaavan (I) mukaista rase- maattia, 113777 138 erotetaan enantiomeerisesti mainitun rasemaatin enan-tiomeerit, ja haluttaessa muutetaan enantiomeerisella erotuksella tuotettu enantiomeeri mainitun enantiomee-rin vapaaksi emäsmuodoksi, 5 ja haluttaessa saatetaan kaavan (I) mukainen mainittu enantiomeeri kosketuksiin hapon kanssa tuottamaan sen farmaseuttisesti hyväksyttävä additiosuola.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R" on metyyli.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R on etyyli.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R' on vety.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä 15 tunnettu siitä, että amiiniyhdiste on (NH4)2C03.

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R' on metyyli.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että amiiniyhdiste on NH2CH3.

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että amiiniyhdiste on (NH4)2C03.

20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että R" on etyyli.

21. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä 25 tunnettu siitä, että mainittu enantiomeerisen '. erotuksen vaihe käsittää mainitun rasemaatin yhden i * , .·. enantiomeerin happoadditiosuolan muodostamisen enan- ·_ tiomeerisella hapolla.

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä 30 tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi I * · ; mainitun happoadditiosuolan kiteytysvaiheen. ·.,«· 23. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä • ;..j tunnettu siitä, että saatetaan l-metyyli-4- .··. piperidoni kosketuksiin 2-merkaptobutyyrihapon ja ara- • 35 moniumkarbonaatin kanssa, jolloin saadaan rasemaatti, : jolla on kaava • » „9 113777 j _ / \ /s\^ch2ch3 H3C“NwC( 5 ja erotetaan mainitun rasemaatin enantiomeeri enan-tiomeerisesti.

24. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä 10 tunnettu siitä, että saatetaan l-metyyli-4- piperidoni kosketuksiin 2-merkaptobutyyrihapon ja me-tyyliamiinin kanssa, jolloin saadaan rasemaatti, jolla on kaava i 15 / \ h1_v_XnJ[ h3<t 20 ja erotetaan mainitun rasemaatin enantiomeeri enan-tiomeerisesti.

25. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä t : tunnettu siitä, että saatetaan l-etyyli-4- ·,· 25 piperidoni kosketuksiin 2-merkaptobutyyrihapon ja am- moniumkarbonaatin kanssa, jolloin saadaan rasemaatti, jolla on kaava ♦ · 30 / \/S^CH!CH3 o H5C! NwiΛ “·' 35 ja erotetaan mainitun rasemaatin enantiomeeri enan- : tiomeerisesti. 140 113777

26. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että saatetaan l-etyyli-4-piperidoni kosketuksiin 2-merkaptobutyyrihapon ja me-tyyliamiinin kanssa, jolloin saadaan rasemaatti, jolla 5 on kaava / \ yS-^/CH2CH3