FI112946B

FI112946B - 4-hydroksi-1-okso-1,2-dihydro-pyridatsino-[4,5-b]-kinoliini-5-oksidijohdannaiset, niiden valmistus ja niiden käyttö glysiiniantagonisteina

Info

Publication number: FI112946B
Application number: FI990134A
Authority: FI
Inventors: Ivars Kalvinsh; Wojciech Danysz; Markus Gold; Christopher Graham Rap Parsons; Irene Piskunova; Eugene Rozhkov
Original assignee: Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1999-01-25
Publication date: 2004-02-13
Also published as: HUP9903104A3; LV12260B; PL331323A1; CZ2019997A3; FI990134A; JP2000515872A; IL128225A0; GEP20022801B; EA001711B1; ATE224894T1; BR9710569A; SI9720048A; ZA976612B; LT99007A; PL189572B1; TW402605B; SK283536B6; KR100598206B1; HUP9903104A2; IL128225A

Description

112946 4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydro-pyridatsino-[4,5-b]-kinoliim-5-oksidijohdannai-set, niiden valmistus ja niiden käyttö glysiiniantagonisteina 5 Keksinnön alue

Uudet kemialliset yhdisteet, jotka ovat pyrido-ftalatsiini-dioneja, niitä sisältävät farmaseuttiset koostumukset ja niiden käyttö valmistettaessa lääke eksitotoksisuu-teen ja glutamatergisen hermovälityksen (neurotransmissio) virhetoimintaan liitty-10 vien neurologisten häiriöiden torjumiseksi.

Keksinnön taustaa ja tekniikan nykytaso

Glutamaatti on kenties huomattavin kiihottava välittäjäaine keskushermostossa, 15 mutta se osallistuu myös todennäköisesti moniin patologisiin ja eksitotoksisiin tapahtumiin. Näin ollen hyvin tärkeänä pidetään glutamaattiantagonistien kehittämistä hoitosovelluksia varten (yleiskatsaus esitetty julkaisussa Danysz et ai., 1995). Glutamaatti aktivoi ionotrooppisten reseptoreiden kolmea päätyyppiä, jotka ovat a-ami-no-3-hydroksi-5-metyyli-4-isoksatsolipropionihappo (AMPA), kainaatti ja N-metyy-20 li-D-aspartaatti (NMDA), sekä useita erityyppisiä metabotroppisia reseptoreita. NMDA-reseptoreiden antagonismia voitaisiin käyttää hyvin erilaisissa hoitosovel-luksissa. NMDA-reseptoreiden toiminnan estäminen on mahdollista vaikuttamalla eri tunnistuskohtiin kuten primääriin välittäjäainekohtaan, strykniinin suhteen epä-herkkään glysiinikohtaan (glysiinip), polyamiinikohtaan ja kationitunnelin sisällä ; 25 sijaitsevaan fensyklidiinikohtaan.

; Julkaisussa FI 102 754 on kuvattu kemialliselta rakenteeltaan läheisiä, samanlaisia terapeuttisia vaikutuksia omaavia dihydropyridatsiini[4,5-b]kinoliineja, sekä niiden . alkyyli- tai asyylijohdannaisia. Nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia useissa hermoja 30 rappeuttavissa häiriöissä.

Reseptorin vaimentaminen saattaa olla fysiologinen prosessi, joka toimii myötäsyntyisenä säätelymekanismina glutamaattireseptoreiden pitkäaikaisen neurotoksisen aktivoitumisen estämiseksi, mutta joka sallii kuitenkin niiden lyhytaikaisen fysio-35 logisen aktivoitumisen. NMDA-reseptorin tapauksessa ko-agonistina toimiva gly-siini on myötäsyntyinen ligandi, joka estää tällaista vaimentumista aktivoimalla 2 112946 glysiinip-kohtaa. Mielenkiintoista on todeta, ettei verettömyystila suurenna vain solun ulkopuolisen glutamaatin, vaan myös glysiinin pitoisuutta, ja vaikka jälkimmäinen ilmiö onkin vähemmän selvä, se kestää kuitenkin paljon kauemmin. Näin ollen eräät täydet glysiinip-antagonistit kykenevät palauttamaan normaalin synaptisen 5 välityksen tällaisissa olosuhteissa suurentamalla NMDA-reseptorin vaimennusta fysiologiselle tasolleen. Näin ollen laboratorioeläimissä toteutetun keskitetyn antamisen perusteella on esitetty, että glysiinip-antagonistit saattavat tarjota parempia hoitomahdollisuuksia kuin NMDA-reseptorikompleksin muihin tunnistuskohtiin vaikuttavat aineet. Valitettavasti useimpien glysiinip-antagonistien huonot farmako-10 kineettiset ominaisuudet ovat aina tähän saakka tehneet mahdottomaksi näiden mahdollisuuksien selvän todentamisen systeemisen antamisen jälkeen. Eräillä glysiinip-antagonisteilla on kuitenkin esitetty olevan erittäin hyvä hoitoindeksi systeemisen antamisen jälkeen hyperalgesiamalleissa sekä tuskaa lievittävinä aineina.

15 Esillä oleva keksintö

Olemme nyt kehittäneet joukon trisyklisiä "pyridofitalatsiinidioneja". Luokan I yhdisteet ovat rakenteellisesti Zeneca:n patentoimien glysiini(rantagonistien kaltaisia (ICI, EPÄ 0 516 297 AI, 02.12.92): Luokan II yhdisteet ovat näiden yhdisteiden N-20 oksidijohdannaisia, eikä niitä ole julkaistu eikä mainittu tässä Zenecam patentissa. Luokan II yhdisteet ovat samoin voimakkaita glysiiniB-antagonisteja in vitro, ja niiden in vivo systeeminen saatavuus ja/tai tunkeutuminen veri-aivo-esteen läpi on todettu paljon paremmaksi luokan I yhdisteisiin verrattuna. Lisäksi näiden yhdisteiden suolajohdannaiset, jotka on tehty esimerkiksi lisäämällä koliinia ja 4-tetrame-25 tyyliammoniumia (4-NH3), parantavat biologista saatavuutta edelleen.

Esillä olevan keksinnön mukaiset uudet yhdisteet voidaan ennustaa käyttökelpoisiksi seuraavien häiriötilojen hoidossa. 1. Akuutti eksitotoksisuus kuten verettömyys aivohalvauksen, vamman, happivajeen (hypoksia), veren liian alhaisen sokeripitoi-30 suuden (hypoglykemia) ja maksan encephalopathy-tilan yhteydessä. 2. Krooniset, hermostoa rappeuttavat sairaudet kuten Alzheimerin tauti, verisuonista johtuva dementia, Parkinsonin tauti, Huntingtonin tauti, pesäkekovettumatauti (MS-tauti), amyotrofmen lateraalinen skleroosi, AIDS:ista johtuva hermoston rappeutuminen, olivopontoserebellaarinen atrophia, Touretten oireyhtymä, motorinen neuronisaira-35 us, mitokondrioiden virhetoiminta, Korsakoff:in oireyhtymä sekä Creutzfeldt-Ja-kob:in sairaus. 3. Muut häiriöt, jotka liittyvät keskushermoston pitkäaikaisiin plas- 3 112946 tisiin muutoksiin, kuten krooninen kipu, lääkeaineen sietokyky, eriasteiset riippuvuudet (esimerkiksi opioideista, kokaiinista, bentsodiatsepiineista ja alkoholista) sekä hidas liikuntahäiriö (tardive dyskinesia). 4. Epilepsia (yleiset ja osittaiset mutkikkaat kohtaukset), skitsofrenia, ahdistus, masennus, akuutti kipu, spastisuus ja 5 tinnitus.

Keksinnön tavoitteet

Keksinnön tavoitteena on saada aikaan uudet ja tehokkaammat pyrido-ftalatsiini-10 dioniyhdisteet, niiden farmaseuttiset koostumukset sekä niiden käyttö valmistettaessa lääke eksitotoksisuuteen ja glutamatergisen hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien neurologisten häiriöiden hoitamiseksi. Keksinnön muuna tavoitteena on saada aikaan tällaiset uudet yhdisteet, koostumukset ja niiden käyttö lääkkeen valmistamisessa, jotka täyttävät edellä esitetyt teoreettiset vaatimukset. Muut tavoitteet ilme-15 nevät seuraavasta, ja vielä muut keksinnön tavoitteet ovat ilmeisiä alan asiantuntijalle.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

20 Yhteenveto keksinnöstä Näin ollen keksintä käsittää mm. seuraavat piirteet, joko yksittäin tai yhdistelminä: Pyridyyli-ftalatsiinidionien joukosta valittu yhdiste, jolla on seuraava kaava: : 25

O

R2 il

Π ^NH

R1 N

O” OH

4 112946 missä Rl ja R2 on valittu vedyn, halogeenin ja metoksin joukosta, tai missä Rl ja R2 muodostavat yhdessä metyleenidioksin, sekä sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat; sellainen 5 yhdiste, jossa suola on valittu sen koliini- ja 4-tetrametyyliammoniumsuolan joukosta; sellainen yhdiste, joka on valittu seuraavista: 10 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 7.8- dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 15 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- sidi ja 7- kloori-8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi sekä minkä tahansa edellä mainitun yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola; kuten yhdiste, joka on valittu seuraavista: 20 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuola, 8- kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-suola, 8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-: 25 suola, : 8-fluori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini- : suola, 7.8- dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi- . koliinisuola, 30 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuola ja 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuola.

5 112946

Lisäksi farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, glysiinifl-antagonistisen määrän tällaista yhdistettä; sellainen farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, glysiiniB-5 antagonistisen määrän tällaista, koliinisuolanaan olevaa yhdistettä; sellainen farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, glysiiniB-antagonistisen määrän yhdistettä, joka on valittu seuraavista: 10 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-fluori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 7.8- dikloori-4-hydroksi-1-okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 15 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- sidi ja 7- kloori-8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi tai minkä tahansa edellä mainitun yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola; sellainen 20 farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, glysiiniB-antagonistisen määrän yhdistettä, joka on valittu seuraavista ' 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuola, : 25 8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini- ; suola, : 8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini- suola, 8- fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini- 30 suola, 7.8- dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuola, 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuola ja , 35 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- sidi-koliinisuola.

6 112946

Edelleen keksinnön mukaisen yhdisteen käyttö valmistettaessa lääke eksitotoksi-suuteen ja glutamatergisen hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien neurologisten häiriöiden torjumiseksi; sellainen 5 käyttö, jossa yhdiste on koliinisuolanaan; sellainen käyttö, jossa yhdiste on valittu seuraavista: 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b] -kinoliini- 5 -oksidi, 10 8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 8-fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 7.8- dikloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi, 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- 15 sidi ja 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi tai minkä tahansa edellä mainitun yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola; ja sellainen 20 keksinnön mukaisen yhdisteen käyttö valmistettaessa lääke eksitotoksisuuteen ja glutamatergisen hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien neurologisten häiriöiden torjumiseksi, joka yhdiste on valittu seuraavista: 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuola, 25 8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini- : suola, ; 8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini- suola, , , 8-fluori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini- , 30 suola, 7.8- dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi- ' 1 koliinisuola, 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1-okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-; sidi-koliinisuola ja 35 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- sidi-koliinisuola.

7 112946

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Seuraavan tarkastelun, esimerkkien ja farmakologian tarkoituksena on havainnollis-5 taa esillä olevaa keksintöä, eikä rajoittaa sitä.

Menetelmät ja tulokset

Luokan I ja II trisyklisten "pyridoftalatsiini-dionien" perusrakenne on: 10

O O

R2 8 Jiv R2 8/4 il

I ίΓ NH \\ NH

O o" OH

Rl / R2 = H ja/tai halogeeni Rl / R2 = H ja/tai 0-CH3 15 Rl / R2 = H ja/tai metyleenidioksi

Kemiaa

Yleinen menettely dimetyyli-kinoliini-2,3-dikarboksylaatti-l-oksidien (3) valmis- : : 20 tamiseksi.

. . Kylmää (jäähaude) liuosta, joka sisälsi 2-nitrobentsaldehydiä 1 (25 mM) ja natri umia (27 mM) vedettömässä metanolissa (40 ml), käsiteltiin 30 minuutin ajan liuok-;. sella, joka sisälsi dimetyyli(dietoksifosfinyyli)sukkinaattia 2 (30 mM, valmistettu 25 tavalla, joka on kuvattu julkaisussa S. Like et ah, Lieb. Ann. Chem., 1980 (4), 542) vedettömässä metanolissa (10 ml). Tuloksena saatua tummaa liuosta sekoitettiin 0-v : 5 °C:ssa 1,5 tuntia, liuotin poistettiin haihduttamalla alennetussa paineessa ja : , : jäännös ositettiin etyyliasetaatin ja veden välille. Etyyliasetaatti kuivattiin natrium- , ; sulfaatilla ja haihdutettiin sitten alennetussa paineessa. Jäännös kiteytettiin uudes- . · 30 taan isopropanolista, jolloin otsikon mukaista dimetyyli-kinoliini-2,3-dikarboksy- laatti-1-oksidia 3 saatiin lähes valkoisena (tai vaalean kaltaisena) jauheena.

8 112946 Näiden yhdisteiden 3 fysikaaliset ominaisuudet ja 'H-NMR-spektritiedot on esitetty taulukoissa 1 ja 2.

a. 5-bromi-4-kloori-2-nitrobentsaldehydi (lf).

Rikkihapon (40 ml) ja natriumnitraatin (2,66 g, 31,3 mM) seokseen lisättiin 0-5°C:ssa 3-bromi-4-klooribentsaldehydiä (6,25 g, 28,5 mM). Tuloksena ollutta seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 7 tuntia ja sitten se laimennettiin jäävedellä (300 ml). Saostunut kiintoaine erotettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin jauhetta. Tämä materiaali kiteytettiin uudestaan isopropanolin ja veden seoksesta (2:1), jolloin saatiin otsikon mukaista 2-nitrobentsaldehydiä lf (3,6 g, 51,5%) vaalean keltaisena jauheena, sp. 81-82 °C.

Analyysi yhdisteelle CyffyBrCINCfy

Laskettu (%): C 31,79 H 1,14 N 5,30

Todettu (%): C 31,55 H 0,98 N 5,09 'H-NMR (CDCI3), δ: 8,22 (s, 1H), 8,23 (s, 1H), 10,39 (s, 1H) b. 4-bromi-5-kloori-2-nitrobentsaldehydi (lg) Tässä meneteltiin kohdassa (a) esitetyllä tavalla, paitsi että lähtöaineena käytettiin 4-bromi-3-klooribentsaldehydiä (2,97 g, 13,5 mM), jolloin otsikon mukaista yhdis-: tettä lg saatiin (1,9 g, 53,0%)vaalean keltaisena jauheena, sp. 95-98 °C.

: Analyysi yhdisteelle C7H3BrClN03: : Laskettu (%): C 31,79 H 1,14 N 5,30 : Todettu (%): C 31,60 H 1,01 N 5,11 ’H-NMR (CDC13), δ: 8,02 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 10,39 (s, 1H) 5

Yleinen menettelytapa dimetyyli-kinoliini-2,3-dikarboksylaattien (7) valmistamiseksi

Liuosta, joka sisälsi N-oksidia 3(10 mM) ja fosfori-trikloridia (30 mM) vedettömäs-: 10 sä kloroformissa (100 ml), palautusjäähdytettiin 7 tuntia. Liuotin poistettiin alenne- ; tussa paineessa ja jäännös ositettiin etyyliasetaatin ja veden välille. Orgaaninen ker ros kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutettiin sitten alennetussa paineessa. Jään- 9 112946 nös kiteytettiin uudestaan isopropanolista, jolloin otsikon mukaista dimetyyli-kino-liini-2,3-dikarboksylaattia 7 saatiin lähes valkoisena (tai vaalean keltaisena) jauheena.

5 Näiden yhdisteiden 7 fysikaaliset ominaisuudet ja 'H-NMR-spektritiedot on esitetty taulukoissa 3 ja 4.

Yleinen menettelytapa 4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kino-liini-5-oksidien (5) valmistamiseksi.

10

Sekoitettuun liuokseen (tai suspensioon), joka sisälsi dimetyylikinoliini-2,3-dikar-boksylaatti-1-oksidia 3 (5 mM) kiehuvassa etanolissa (25 ml), argon-ilmakehässä, lisättiin hydratsiinihydraattia (15 mM), ja seosta palautusjäähdytettiin 3 tuntia, minä aikana muodostui tummaa sakkaa. Sen jälkeen, kun reaktioseos oli jäähdytetty huo-15 neen lämpötilaan, se suodatettiin ja talteen saatu kiintoaine pestiin etanolilla ja eetterillä ja kuivattiin, jolloin saatiin hydratsiinisuolaa 4. Tätä materiaalia sekoitettiin 70-110°C:ssa 3 tuntia etikkahapossa (15 ml) ja huoneen lämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen seos laimennettiin vedellä (45 ml) ja suodatettiin sitten kiintoaineen keräämiseksi. Talteen kerätty kiintoaine pestiin etanolilla ja kuivattiin, jolloin saatiin 20 tumman keltaista kiintoainetta. Tämä materiaali kiteytettiin moneen kertaan uudestaan dimetyyliformamidista, jolloin otsikon mukaista pyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidia (5) saatiin oranssina jauheena.

Näiden yhdisteiden 5 fysikaaliset ominaisuudet ja ^-NMR-spektritiedot on esitetty : 25 taulukoissa 5 ja 6.

Yleinen menettelytapa l,4-diokso-l,2,3,4-tetrahydropyridatsino[4,5-b]-kinolii-nien (9) valmistamiseksi.

30 Sekoitettuun liuokseen (tai suspensioon), joka sisälsi dimetyylikinoliini-2,3-dikar-boksylaattia 7 (5 mM) kiehuvassa etanolissa (25 ml), lisättiin hydratsiinihydraattia (30 mM), ja seosta palautusjäähdytettiin 8 tuntia, minä aikana muodostui tummaa sakkaa. Sen jälkeen, kun reaktioseos oli jäähdytetty huoneen lämpötilaan, se suoda-: : tettiin ja talteen saatu kiintoaine pestiin etanolilla ja eetterillä ja kuivattiin, jolloin . 35 saatiin hydratsiinisuolaa 8. Tätä materiaalia sekoitettiin 70-110°C:ssa 3 tuntia etik kahapossa (15 ml) ja huoneen lämpötilaan jäähdyttämisen jälkeen seos laimennettiin 10 112946 vedellä (45 ml) ja suodatettiin sitten kiintoaineen keräämiseksi. Talteen kerätty kiintoaine pestiin etanolilla ja eetterillä ja kuivattiin, jolloin otsikon mukaista pyridatsi-no[4,5-b]-kinoliinia (9) saatiin keltaisena jauheena.

5 Näiden yhdisteiden 9 fysikaaliset ominaisuudet ja 1 H-NMR-spektritiedot on esitetty taulukoissa 7 ja 8.

Yleinen menettelytapa 4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kmo-liini-5-oksidi-koliinisuolojen (6) ja l,4-diokso-l,2,3,4-tetrahydropyridatsino-10 [4,5-b]-kinoliini-koliinisuolojen (10) valmistamiseksi.

Sekoitettuun suspensioon, joka sisälsi pyridatsino[4,5-b]kinoliinia 9 tai N-oksidia 5 (10 mM) metanolissa (50 ml), lisättiin koliinihydroksidia (10,5 mM, 45 paino-% liuos metanolissa). Tuloksena ollut liuos väkevöitiin käyttäen pyöröhaihdutinta, ja 15 kiinteä jäännös kiteytettiin uudestaan etanolista, jolloin otsikon mukaista koliinisuo-laa 10 tai 6 saatiin hygroskooppisena oranssina (tai punaisena) jauheena.

Näiden yhdisteiden 6 ja 10 fysikaaliset ominaisuudet ja 'H-NMR-spektritiedot on esitetty taulukoissa 9 ja 10, sekä 11 ja 12, vastaavasti.

20 1 1 112946 r o

<N

X

u

(N

X

I £ 2 3 x" X i-I *z 2-i 8 § * /Γ\_„ o=/ Ve W' )=° ö ο Ο—Γ *=0 0=\ τ' \ / )-/ M— z'/ «*—► /3 <*>— y~) y} -}~\ * * “ * a x Λ

X

°w

Is δ O o x o o « o O O 5 w \ / 2« - s x > - ' M -r X * _ ds « / “ \ X 2—X 2— Z 2 « =-/3=° 0-/3=° 'o-/_v° /3 ^ -Ö tm—^°-\} '°'*ö ^ K x a: * * "« ’ « ® 2 2 o g 8 8

^—/ <NI

0=0.

S

, :. Si 4"

: : : O

o *

§ ,U

y • #*·

K CC

12 112946

Taulukko 1

Valmistetut dimetyylikinoliini-2,3-dikarboksylaatti-1 -oksidit 3

Yhd. R1 R: Kaava Alkuaineanalyysi Sp. Saanto (mol.p.) Laskettu (%) Todettu (%) °C (%)

C H N C H N

3a H H CuHuNOs 59,77 4,24 5,36 59,84 4,11 5,31 175-176 61,5 (261,2) , 3b H Cl Ci3H10C1NO5 52,81 3.41 3.73 52,80 3.32 4,78 126-127 49.0 (295,7) 3c H Br CuHioBrN05 45,89 2,96 4,11 45,57 2,75 4,00 168-170 72,0 (340.2) 3d H F C13H,oFN05 55,86 3,60 5,01 55,19 3,38 4,95 194-196 49,0 (279.2) 3e Cl Cl C13H9C12N05 47,30 2.75 4.24 47.18 2.62 4,14 183-186 41,0 (330,1) 3f Cl Br C13H9BrClN05 41,69 2,42 3,74 41,39 2.13 3.65 171-173 60,0 (374.6) 3g Br Cl Ci3H9BrClN05 41,69 2,42 3,74 41,68 2,25 3,75 206-208 62,5 (374.6) 5

Taulukko 2

Yhdisteiden 3 'H-NMR (CDC13) -spektritiedot Yhd. δ (ppm), J (Hz) 3a 3,98 (s, 3H). 4,11 (s. 3H), 7,66-8,05 (m, 3H), 8,43 (s, 1H), 8,75 (dd, J, = 8,5, J2 = 2,0, 1H) 3b 3,98 (s. 3H), 4.11 (s. 3H), 7,71 (dd, J, = 8.5, J2 = 2,5. 1H), 7,91 (d, J=8,5, 1H), 8,38 (s. 1H). 8.74 (d.

.: J=2,5 1H) 3c 3,91 (s. 3H). 4,07 (s, 3H), 7,13 (dd, J, = 9,5, J2 = 2,0, 1H), 7,44 (d, J=2,0, 1H). 8,22 (s, 1H), 8,58 (d, J=9,5, 1H) 3d 3,98 (s, 3H), 4,11 (s, 3H), 7,48-7,72 (m, 2H), 8,31 (s, 1H), 8,73 (dd, J, = 10,0, J2 = 5,0, 1H) ;, : : 3e 3,97 (s. 3H). 4,10 (s, 3H), 8,08 (s, IH), 8,28 (s. 1H), 8,83 (s, 1H) 3f 3.97 (s, 3H). 4,09 (s. 3H), 8,26 (s, 2H), 8,82 (s. 1H) 10 : '.1 3g 3.97 (s, 3H), 4,09 (s, 3H), 8,06 (s, 1H), 8,27 (s, 1H), (0,2 9s, 1H) ,3 112946

Taulukko 3

Valmistetut dimetyyhkinoUini-2,3-dikaiboksylaatit 7

C H N C H N

7a H H CuHnNO* 63,67 4,52 5,71 63,48 4,52 5,63 104-106 88 0 (245,2) 7b H Cl C13H10CINO4 55,83 3,60 5,01 55,74 3,59 5,00 152-154 9o 0 (279,7) 3c H Br C|3H,0BrNO4 48,17 3,11 4,32 48,09 3,05 4,26 155-157 81 5 (324.1) 7d H F C,3Hi0FNO4 59,32 3,83 5,32 59,23 3,79 5,26 119-121 85,0 (263.2) 7e Cl Cl CnHsCKNO, 49,71 2.89 4,46 49.56 2.85 4,41 113-115 96 0 (314,1) 7f Cl Br C13H9BrCIN04 43,55 2,53 3.91 43.60 2.48 3,88 128-130 95 0 (348.6) 7g Br Cl Ci3H9BrCIN04 43,55 2,53 3.91 43.47 2,51 3,87 142-144 67.0 (348.6) 5

Taulukko 4

Yhdisteiden 7 ^-NMR (CDCI3) -spektritiedot Yhd. δ (ppm), J (Hz) 7a 3,98 (s. 3H), 4,06 (s, 3H), 7,58-8,00 (m, 3H), 8,21 (dd, J, = 9,5, J2 = 2,0, 1H), 8 77 (m 2H) 8 77 (s : 1H) 7b 3,97 (s. 3H), 4,06 (s, 3H), 7,76 (dd, J, = 9,5, J3 * 2,0, 1H), 7,90 (d, J=2,0, 1H), 8,67 (s. 1H) ' 7c 3,97 (s. 3H), 4,07 (s, 3H), 7,90 (dd, J, = 9,5, J; = 2,0, 1H), 8,09 (m, 2H). 8,66 (s, 1H) 7d 3,98 (s. 3H), 4,07 (s. 3H), 7,49-7,72 (m, 2H), 8,20 (dd, J, = 10, T = 5,0. 1H), 8.69 (s, 1H) 7e 3.97 (s. 3H). 4.04 (s, 3H), 8,02 (s, 1H). 8,31 (s. 1H), 8,64 (s, 1H) ‘: 7f 3.98 (s. 3H). 4,06 (s, 3H), 8,24 (s, 2H), 8,33 (s. 1H), 8.68 (s, 1H) : f 10 ; ; 7g 3.96 (s. 3H), 4,04 (s, 3H), 8,03 (s, 1H), 8,53 (s. 1H), 8,62 (s, 1H)

Taulukko 5

Valmistetut 4-hydroksi- 1-okso-1,2-dihydiOpyridatsino[4,5-b]kinoliini-5-oksidit 5 14 1 12946

Mrz Yhd. R1 R: Kansa Alkuaineanalyysi Sp. Saanto 2/ (mol p.) Laskettu (%) Todettu (%) °C (%)

C H N C H N

499 5a H H ^ιΗ;Ν,03 57,65 3,08 18,33 57,56 2,93 18,22 >300 44,5 (229,2) 502 5b H CI CuHeClNjOj 50,11 2,29 15,94 49,34 2,29 15,40 >300 88,0 (263,6) 514 5c H Br CnHoBrNjOj 42,88 1,96 13,63 42,57 1,91 13,49 >300 78,0 (308.1) 516 5d H F CuFUFNsOj 55,44 2,44 16,99 53,44 2,35 16,90 297-298 37,0 (247.2) 518 5e Cl Cl CiiH5C12N303 44,32 1,69 14,10 44,17 1,91 14,34 >300 16,0 (298.1) 551 5f Cl Br CnFRBrCl^Oj 38,57 1,47 12.27 37,93 1.33 11.94 >300 15,0 (342.5) 568 5g Br Cl CnHjBrCINjCk 38,57 1,47 12,27 38,17 1,31 12,00 >300 17,0 (342.5) 5

Taulukko 6

Yhdisteiden 5 'H-NMR (DMSO-dö) -spektritiedot δ (ppm), J (Hz) ’ Yhd. aromaattiset protonit (ja OCH3) NH, OH (keskenään vaihdettavat) : 5a 7,88-8.28 (m. 2H), 8,46-8,79 (m, 2H), 9,07 (s, 1H) 10,65 (br, s, 1H). 12,00 (br, s, 1H) 5b 8,07 (dd, Ji =9.0, J2 =2,5, 1H), 8,59 (d, J=9,0, 1H). 8,69 (d, 12,05 (br, s, 1H). 14,40 (br, s, 1H) J=2,5, 1H), 9.11 (s, 1H) : 5c 8,27 (dd, J, =9.0, J2 =2,0, 1H), 8,60 (d, J=9.0, 1H), 8,82 (d, 11,00 (br, s, 1H). 12,00 (br, s, 1H) J=2,0, 1H), 9.00 (s, 1H) 5d 8,07 (ddd, J| =9,5. J2 =8,5, J3 =2,5, 1H), 8,36 (dd, Ji =9,5, J2 10,92 (br, s, 1H)„ 12,00 (br, s, 1H) =2,5, 1H), 8.75 (dd. Ϊ, =9,5, J2 =5,0, 1H), 9,02 (s, 1H) .. t 5e 8,83 (s. 1H). 8.90 (s. 1H), 9,06 (s, 1H) 11,25 (br. s, 1H). 12.05 (br. s, 1H) 5f 8,80 (s, 1H). 9.00 (s. 1H), 9,01 (s, 1H) 12,06 (br, s, 1H). 14.28 (br. s, 1H) ’···. 5g 8,90 (s. 1H). 9.01 (s. 1H), 9,04 (s. 1H) 12,13 (br. s. 1H). 14.32 (br. s, IH) :· 10

Taulukko 7

Valmistetut 1,4-diokso-1,2,3,4-tetrahydiOpyi idatsmo[4,5-b]kinoliinit 9 15 112946

Mrz Yhd. R1 R~ Kaava Alkuaineanalyysi Sp. Saanto 2/ (inol.p) Laskettu (%) Todettu (%) °C (%)

C H N C H N

585 9a H H C,,H-N302 61,97 3,31 19,71 61,43 3.45 19.16 >300 86,0 (213.2) 501 9b H Cl CnH6ClN302 53,35 2,44 16,97 32,89 2,28 16,68 >300 88.5 (247.6) 503 9c H Br ^,Η6ΒγΝ302 45,23 2,07 14,39 44,74 2,11 14,09 >300 82.0 (292.1) 519 9d H F C„H6FN302 57,14 2,60 18,18 56,73 2,47 17,99 >300 84,0 (231.2) 515 9e Cl Cl CnHjCBNjCL 46,84 1,79 14,90 46,44 1.70 14,87 >300 82,5 (282.1) 539 9f Cl Br CnH5BrClN302 40,46 1,54 12.87 40,16 1,42 12,88 >300 69,5 (326.5) 538 9g Br Cl CuHjBrClNjCh 40,46 1,54 12,87 40,23 1,40 12.98 >300 88,0 (326.5) 5

Taulukko 8

Yhdisteiden 9 ‘H-NMR (DMSO-d0) -spektritiedot δ (ppm), J (Hz) , Yhd. aromaattiset protonit NH (keskenään vaihdettavat) 9a 7,76-8.16 (m. 2H). 8,22-8,47 (m, 2H), 9,30 (s, 1H) 11,60 (br, s, 2H) • 9b 8,02 (dd, J, =9.0, J2 =2,5, 1H), 8,28 (d, J=9.0, 1H), 8,52 (d. 11,60 (br, s, 2H) J=2,5, 1H). 9.26 (s, 1H) , 9c 8,16 (m, 2H). 8,60 (br, s, 1H), 9,25 (s, 1H) 11,55 (br, s, 2H) 9d 7,93 (ddd, J, =9,5. J2(H,F) =9,0, J3 =2,5, 1H), 8,18 (dd, J1(H,F) 11,90 (br, s, 2H) =9,5, h =2.5, 1H). 8,36 (dd, J, =9,5, J2(H,f) =5,5, 1H). 9,24 (s, ‘; 1H) ; 9e 8,47 (s. 1H). 8.67 (s. 1H), 9.22 (s, 1H) 11,60 (br. s. 2H) i . 9f 8,52 (s. 1H). 8.91 (s. 1H). 9,28 (s. 1H) 11.65 (br. s, 2H) 9g 8,68 (s, 1H). 8.7J ts. 1H), 9,26 (s, 1H) 11,70 (br, s, 2H) 10 16 112946

Taulukko 9

Valmistetut 4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyiidatsino[4,5-b]kinoliini-5-oksidi-ko-liinisuolat 6

Mrz Yhd. R1 R: Kaava Alkuaineanalyysi Sp Saanto 2/ (mol.p.) Laskettu muodolle Todettu (%) °C (%) 1ϋ·.\ H2O* (%)

C H N C H N

577 6a H H CigH^RA 54,84 6,32 15.99 54,76 6,32 15,86 179-180 52,5 (332.4) 576 6b H Cl CisH,, C1N404 49.93 5.50 14,55 49,31 5,47 14,24 185-188 87.5 (366.8) 570 6c H Br C16H19BrN40,, 44,75 4,92 13,04 44,85 4,93 12,86 191-193 71,5 (41U) 571 6d H F C!6H)9FRA 51,19 5,63 14,92 51,74 5,73 14.95 201-203 27,0 (366.4) 574 6e Cl Cl 6f Cl Br 6g Br Cl 5 * x = 1,0 (a, b, c) 0,5 (d)

Taulukko 10 10 Koliinisuolojen 6 'H-NMR (CD3OD) -spektritiedot δ (ppm), J (Hz) ' Yhd. koliimprotonit aromaattiset protonit 6a 3,20 (s, 9H). 3.47 (m, 2H), 3,98 (m, 2H) 7,69-8,00 (m, 2H), 8,18 (d, J=8,0, 1H), 8,59 (s, 1H), 8,76 ; (d, J=8,5, 1H) : 6b 3,22 (s, 9H), 3,50 (m, 2H), 4,01 (m, 2H) 7,88 (dd, Ji =9,0, J2 =2,5. 1H). 8,27 (d, J=2,5. 1H), 8,52 •, (s, 1H), 8,76 (d, J=9,0, 1H) 6c 3,20 (s, 9H), 3,48 (m, 2H), 3,99 (m, 2H) 7,99 (dd, J, =9,5, h =2,0, 1H), 8,41 (d, J=2,0, 1H), 8,53 (s, 1H), 8,64 (d, J=9,5, 1H) 6d 3,22 (s, 9H), 3.51 (m. 2H), 4,02 (m, 2H) 7,64-7,98 (m, 2H). 8,62 (s. 1H), 8,87 (dd. J, =10,0. J; =5,0. 1H) , * 6e C 6f 6g

Taulukko 11

Valmistetut l,4-diokso-l,2,3,4-tetrahydropyridatsino[4,5-b]kinoliini-koliinisuolat 1U

17 112946

Mrz Yhd. R1 R~ Kaava Alkuaineanalyysi Sp. Saanto 2/ (mol.p.) Laskettu muodolle Todettu (%) °C (%) 10-x H;0* (%)

C H N C H N

604 10a H H Ci6H2oN403 54,26 7,59 14,06 54,23 7.39 14,25 102-110 82,0 (316,36) 596 10b H Cl Ci6Hi9ClN403 54,08 5,53 15,76 54,10 5,55 15,61 189-191 84,0 (350,8) 586 10c H Br Ci6H19BrN403 43,64 5,49 12,72 44.07 5.14 12,73 234-236 61,0 (308,1) 572 lOd H F C|6Hi9FN403 52.16 15.20 5,74 52.08 6.23 15,19 229-230 95,0 (334,4) 574 lOe Cl Cl C16Hi8Cl2N403 47,65 4,99 13,89 47,24 5.03 13,60 205-208 83.0 (385,3) 598 lOf Cl Br Ci6H18 BrClN403 42,92 4,5 12,51 42.78 4,60 12.44 207-209 92,0 (429.7) 597 lOg Br Cl C|sHISBrClN403 42,92 4.5 12.51 42.66 4.57 12,37 201-203 95,0 (429.7) 5 * x = 0,25 (d) 1,0 (d, e) 2,5 (c)

Taulukko 12 , 10 Koliinisuolojen 10'H-NMR (CD3OD)-spektiitiedot δ (ppm), J (Hz) '; Yhd. koliiniprotonit aromaattiset protonit 1 10a 3,21 (s. 9H), 3,51 (m, 2H), 4,01 (m, 2H) 7,64-8,57 (m, 4H). 9,17 (s, 1H) : 10b 3,25 (s, 9H), 3,52 (m, 2H), 4,02 (m, 2H) 7,89 (dd, k = 9,0, J2 = 2,5, 1H). 8,23 (d, J= 2,5, 1H), 8,34 (d, J=9,0, 1H), 9,13 (s, 1H) ': 10c 3,22 (s, 9H), 3,47 (m, 2H), 3,97 (m. 2H) 7,99 (dd. k = 9,0, J2 = 2,0, 1H), 8,26 (d, J= 9,0, 1H), 8.41 (d, J=2,0, IH). 9,09 (s, 1H) lOd 3.20 (s, 9H). 3,49 (m, 2H), 3,98 (m. 2H) 7.64-7.81 (m, 2H). 8,39 (dd. J, = 9,5, L = 5,0. 1H), 9.12 ; ': (s. 1H) lOe 3,22 (s, 9H), 3,51 (m, 2H), 4,02 (m, 2H) 8,46 (s, 1H), 8,55 (s. 1H), 9,14 (s, IH) lOf 3,22 (s, 9H), 3.50 (m, 2H), 4,00 (m, 2H) 8,53 (s, IH), 8,64 (s. IH). 9.13 (s, IH) • ; lOg 3,22 (s. 9H), 3,50 (m, 2H), 4,02 (m, 2H) 8,43 (s, IH), 8,73 (s. IH). 9.13 (s. IH)

Farmakologia 1B 112946 I o

In vitro 5 Reseptorisitoutumistutkimukset

Kalvojen preparointi ja proteiinimääritys

Kudosten preparointi toteutettiin Fosterin ja Wong.in (1987) mukaan. Sprague-10 Dawley-urosrottien (200-250 g) päät irrotettiin ja aivot poistettiin nopeasti. Aivokuori (cortex) leikeltiin ja homogenoitiin 20 tilavuudessa jääkylmää 0,32M sakkaroosia, käyttäen lasi-Teflon-homogenisaattoria. Homogenaattia sentrifugoitiin nopeudella 1000 x g 10 minuuttia. Kasauma hylättiin ja supematanttia sentrifugoitiin nopeudella 20 000 x g 20 minuuttia. Tuloksena ollut kasauma suspendoitiin uudes-15 taan 20 tilavuuteen tislattua vettä ja sentrifugoitiin 20 minuuttia nopeudella 8000 x g. Sitten supematantti ja nahkamainen peite sentrifugoitiin kolmeen kertaan (48 000 x g, 20 minuuttia) 5 mM Tris-HCl:n, pH 7,4, läsnä olessa. Kaikki sentrifugoinnit toteutettiin 4°C:n lämpötilassa. Kalvopreparaatti suspendoitiin uudestaan 5 tilavuuteen 5 mM Tris-HCl-liuosta, pH 7,4, minkä jälkeen kalvosuspensio pakastettiin no-20 peasti -80°C:ssa määrityspäivään saakka. Määrityspäivänä kalvot sulatettiin ja ne pestiin neljään kertaan suspendoimalla uudestaan 5 mM Tris-HCl-liuosta, pH 7,4, ja sentrifugoimalla nopeudella 48 000 x g 20 minuuttia. Lopullinen kasauma suspendoitiin määrityspuskuriin.

' 25 Proteiinimäärä lopullisessa kalvopreparaatissa määritettiin Lowiyn (1951) menetel- : män mukaisesti, kuitenkin eräin muutoksin (Haitfree, 1972). 50 μΐ proteiininäytteitä (kolmena linnakkaismääiityksenä) laimennettiin 1 miksi tislatulla vedellä ja niitä . käsiteltiin 0,9 mklla liuosta, joka sisälsi 2 g kaliumnatriumtartraattia ja 100 g yhdis tettä Na2C03 500 ml:ssa IN NaOH-liuosta ja 500 rnkssa vettä. Nollanäytettä ja 30 standardia (naudan seerumin albumiini) käsiteltiin samalla tavalla. Putket laitettiin 10 minuutiksi vesihauteeseen, jonka lämpötila oli 50°C, ja niitä jäähdytettiin huoneen lämpötilassa. Sitten lisättiin 100 μΐ liuosta, joka sisälti 2 g kaliumnatriumtart- : raattia ja 1 g yhdistettä CuSCL x 5H20 90 inl.ssa vettä ja 10 ml.ssa IN NaOH-liuos- ; . ta. Näytteet jätettiin huoneen lämpötilaan vähintään 10 minuutiksi, sitten lisättiin , . 35 nopeasti, samalla sekoittan 3 ml Folin-Ciocalteu-reagenssia (1 ml reagenssia laimen nettuna 15 mklla vettä). Putkia lämmitettiin jälleen 50°C:ssa 10 minuuttia ja ne jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Sitten absorbanssit määritettiin 1 cm:n kyveteissä . ; aallonpituudella 650 nm. Tutkimuksissamme käytetty lopullinen proteiinipitoisuus 011 alueella 100-250 pg/ml.

19 112946

Kummassakin sitoutumiskokeessa inkubointi päätettiin käyttäen Milliporem suodatusjärjestelmää. Näytteet, kaikki kolmena rinnakkaismäärityksenä, huuhdottiin jatkuvaa tyhjöä käyttäen kolmeen kertaan 2,5 inklla jääkylmää määrityspuskuria lasi-kuitusuodattimilla, jotka oli saatu yhtiöstä Schleicher & Schuell. Suodattimet ero-5 tettiin ja huuhdottiin ja laitettiin tuikenesteeseen (5 ml; Ultima Gold), ja suodattimille pidättynyt radioaktiivisuus määritettiin käyttäen tavanomaista nesteen tuikelasku-ria (Hewlett Packard, Liquid Scintillation Analyser). "Kokonaissitoutuminen" tarkoittaa ilman mitään lisäaineita sitoutuneen radioligandin absoluuttista määrää, kun taas "epäspesifinen" sitoutuminen määritettiin kilpailevan aineen suuren pitoisuuden 10 läsnä ollessa.

[3H]5,7-DCKA-sitoutumiskoe

Kokeet suoritettiin aikaisemmista ryhmistä (Canton et af, 1992; Yoneda et ai., 15 1993) saaduilla muokatuilla menetelmillä. Kalvot suspendoitiin ja niitä inkuboitiin 10 mM Tris-HCl-liuoksessa, pH 7,4. Inkubointiaika oli 45 minuuttia 4°C;ssa. [3H]5,7-DCKA:n epäspesifinen sitoutuminen määriteltiin lisäämällä leimaamatonta glysiiniä pitoisuutena 0,1 mM. Pysäytysliuos sisälsi 10 mM Tris-HCI ja 10 mM magnesiumsulfaattia, pH 7,4. Suodatus toteutettiin mahdollisimman nopeasti. 20 Syrjäytyskokeet toteutettiin käyttäen 10 nM olevaa kiinteätä [3H]5,7-DCKA-pitoi-suutta. Testattavat yhdisteet laimennettiin vedellä tai DMSO-liuoksella ja niitä lisättiin vähintään 5 eri pitoisuutena.

[3H]glysiini-sitoutumiskoe ; 25 : [3H]glysiini-sitoutumiskokeet toteutettiin menetelmällä, jonka Kessler ja työtoverit i ovat kuvanneet (1989). Rotan aivokuoren kalvot preparoitiin edellä kuvatulla tavalla ; ja lopullinen kasauma suspendoitiin 50 mM Tris-asetaattiin, pH 7,4. Testattavia : yhdisteitä inkuboitiin vähintään 5 erilaisena pitoisuutena [3H]glysiinin (20 nM) 30 kanssa 30 minuuttia 4°C:ssa, strykniinin (100 μΜ) läsnä ollessa. Kaikki yhdisteet •, liuotettiin kulloinkin veteen tai DMSO-liuokseen. Epäspesifinen sitoutuminen mää ritettiin sisällyttämällä inkubointiseokseen 100 μΜ glysiiniä. Inkubointi päätettiin laimentamalla näytteet 2 ml.lla pysäytysliuosta (50 mM Tris-HCI sisältäen 10 mM magnesiumsufaattia, pH 7,4, ja jäähdyttäen alle 2°C:n lämpötilaan), mitä seurasi , ; 35 vielä huuhtelu 2,5 inklla puskuria. Suodatus toteutettiin mahdollisimman nopeasti.

20 112946

Tulokset

Kahdeksan testatun yhdisteen IC5u-arvot olivat [3H]-DCKA-määrityksessä < ΙμΜ (katso taulukko 13). Kuuden valitun yhdisteen teho [’H]glysiinimäärityksessä näyt-5 tää ensi silmäyksellä olevan suurempi, mutta tämä ei heijastu Kd-arvojen (ei esitetty) suuriin eroihin. Erityisen mielenkiinnon kohteena olevien yhdisteiden pareista luokkaan II kuuluvien yhdisteiden affiniteetti oli suurempi kuin luokkaan 1 kuuluvilla yhdisteillä [3H]-DCKA-määrityksessä. Tämä ero ei ollut niin ilmeinen [3H]glysiinimäärityksessä.

10

Taulukko 13a

Mrz 2/ Aine [JH]DCKA [3H]glysiini IC50 μΜ IC50 μΜ 499 Π ϊόβ 501 8-C1-I 0,120 0,080 502 8-C1-II 0,020 0,013 5Ö3 8-Br-I 0,250 0,013 _ g_Br_n 0,010 0,004 ΤΪ9 8-F-I UÖÖ “ 0,015

Jl6 8-F-II 0,300 “ 0,017 ΤΪ5 7,8-DiCl-I 0,530 5l8 7,8-DiCl-II 0,650 , : 15 Taulukko 13b

. *. Mrz2/ IAine [3H]DCKA

IC50 μΜ 572 8-F-I (koliini) 1,14 ΊΤ\ 8-F-II (koliini) 0,32 : 569 8-C1-I (koliini) 0,97 576 8-C1-II (koliini) 0,45 21 112946

Laastaripuristin (Patch clamp)

Menetelmät 5 Etukukkuloita (colliculus rostralis) saatiin rotan alkioista (E20-E21) ja sitten ne siirrettiin kalsiumia ja magnesiumia sisältämättömään Hankiin puskuroituun suolaliuokseen (Gibco), jota pidettiin jäissä. Solukko rikottiin mekaanisesti 0,05% DNAasi / 0,3% ovomukoidi (Sigma) -liuoksessa sen jälkeen, kun niitä oli ensin inkuboitu 15 minuuttia trypsiinin (0,66%) / DNAasin (0,1%) (Sigma) läsnä ollessa. Sitten rikottua 10 solukkoa sentrifugoitiin nopeudella 18G 10 minuuttia, se suspendoitiin uudestaan olennaiseen vähimmäisalustaan (Gibco) ja maljattiin tiheydellä 200 000 solua/cm2 edeltäkäsin poly-L-lysiinillä (Sigma) pinnoitetuille muovisille petrimaljoille (Falcon). Soluja ravittiin NaHCCVHEPES-puskuroidulla olennaisella vähimmäis-alustalla, jota oli täydennetty 5%:lla sikiövasikan seerumia ja 5%:lla hevosen seera-15 mia (Gibco), ja niitä inkuboitiin 37°C:ssa olosuhteissa 5% C02, kosteus 95%. Alusta vaihdettiin täydellisesti sen jälkeen, kun gliaalimitoosin eteneminen edelleen oli estetty sytosiini-B-D-arabinofuranosidilla (20μΜ; Sigma) noin 7 vuorokauden jälkeen in vitro. Tämän jälkeen alusta vaihdettiin osittain kahdesti viikossa. Näihin kokeisiin valittiin etukukkulaviljelmä, koska sen avulla saadaan aikaan hyvin pysy-20 vät mittausolosuhteet, jotka ovat jänniteriippuvuuskokeen ja kineettisen kokeen ehdoton edellytys. Lisäksi suhteellisen pienet neuronit (halkaisija noin 15-20 pm) ovat ihanteellisia puskuroituun diffuusioon liittyvien ongelmien minimoimiseksi pitoisuuspuristinkokeita varten.

25 Laastaripuristinmittaukset toteutettiin huoneen lämpötilassa (20-22°C) näillä neuroneilla käyttäen kiillotettuja lasielektrodeja (4-6 mQ), kokonaisia soluja ja EPC-7-vahvistinta (List). Testattavia aineita levitettiin vaihtamalla asiakaskohtaisesti teh-* dyn nopean superfuusiojärjestelmän kanavia, jolla järjestelmällä on tavanomainen : ulosvirtaus (vaihtoajat 10-20 ms). Solun sisäisen liuoksen pitoisuudet olivat (mM): 30 CsCl (120), TEAC1 (20), EGTA (10), MgCl2 (1), CaCl2 (0,2), glukoosi (10), ATP . '. (2), cAMP (0,25); pH asetettiin aivoon 7,3 yhdisteellä CsOH tai HC1. Solujen ulko puolisilla liuoksilla oli seuraava pemskoostumus (mM): NaCl (140), Kcl (3), CaCl2 (0,2), glukoosi (10), HEPES (10), sakkaroosi (4,5), tetrodotoksiini (TTX 3*10-4). i Useimmissa kokeissa glysiiniä (1 μΜ) oli läsnä kaikissa liuoksissa. Kokeet, joilla 35 testattiin trisyklisten "pyrido-ftalatsiini-dionien" glysiiniriippuvuus, toteutettiin olosuhteissa, joissa oli jatkuvasti läsnä suurenevia glysiinipitoisuuksia (1-10 μΜ).

22 112946

Tulokset

Viiden trisyklisen "pyrido-ftalatsiini-dioni-" parin ICso-arvot NMDA (200 μΜ) -inenovirtoja vastaan olivat alemmalla μΜ-alueella ja luokan II yhdisteiden vaiku-5 tusteho oli yleisesti noin 2-3 kertaa voimakkaampi luokan l yhdisteisiin verrattuna (taulukko 14a). Kaikkein voimakkaimpia näistä olivat Mrz 2/502 ja Mrz 2/514. Tämä ilmiö välittyi glysiini0-kohdassa, mikä nähtiin yhdensuuntaissiirtymänä pitoi-suus-vaste-käyrissä suurenevien glysiinipitoisuuksien läsnä ollessa. Näin ollen yhdisteen Mrz 2/502 Kb-arvot määritettyinä Cheng-Pmsoff-riippuvuuden mukaisesti 10 olivat samankaltaiset glysiinipitoisuuksissa 1, 3 ja 10 μΜ (vastaavasti 80, 124 ja 118 nM). Edelleen Mrz 2/50l:n ja 2/502:n vaikutukset eivät riippuneet jännitteestä. Kaikki testatut yhdisteet olivat noin 3-10 kertaa voimakkaampia muuttumattomia virtoja vastaan kuin huippuvirtoja vastaan. Koliinijohdannaisten voimakkuudet vapaiden happojen suhteen in vitro olivat samankaltaisia (Taulukko 14b).

15

Sitä vastoin kolme näistä voimakkaista glysiiniB-antagonisteista oli vain hyvin heikkoja antagonisteja AMPA (ΙΟΟμΜ) -inenovirtoja vastaan. Yhdisteiden Mrz 2/502, 2/514 ja 2/516 ICjo-arvot AMPA-indusoituja huippuvirtoja vastaan olivat vastaavasti 25, 73 ja 18 μΜ, mutta ne olivat olennaisesti inaktiivisia tasannevirtoja vas-20 taan, kaikki ICso-arvot > ΙΟΟμΜ (taulukko 14a). Tämä vaikutusprofnli, vaikkakin hyvin heikko, on tyypillinen kilpaileville AMPA-reseptorin antagonisteille, jotka salpaavat ensisijaisesti reseptorin vaimentamattoman huipputilan, pienen affiniteetin tilan (katso Parsons et ai., 1994).

„ 112946 2j>

Taulukko 14a

Mrz 2/ Aine Huippu- Tasanne- Huippu- Tasanne-

NMDA NMDA AMPA AMPA

__IC50 μΜ ICjp μΜ IC50 μΜ IC50 μΜ 585 I__65z9__19J___ 499 II_ 51,2 13,8___ 501 8-C1-I 2,3_0J___ 502 8-C1-II 0,8_03_ 25,0 150,0 503 8-Br-I__U__06___ 514 8-Br-lI 0,5_02_ 72,7 307,0 519 8-F-I__18,0 5,8___ 516 8-F-II__03__Ιβ__17,6 >100 515 7,8-DiCl-I 3,7_0β___ 518 7,8-DiCl-II 3,8_08___ 539 7-C1,8-Br-I 5,3_0/7___ 551 7-Cl,8-Br-II 2,4__06___ 538 7-Br,8-Cl-I 93,9 2,5___ 568 7-Br,8-Cl-II 10,0__U___ 554 |8-0-CH3-I 170 36,2

Taulukko 14b 5 ____

Mrz 2/ Aine Huippu- Tasanne-

NMDA NMDA

____IC30 μΜ IC50 μΜ 569 8-C1-I (koliini)_2β_05_ : 576 8-C1-II (koliini) 1,1_05_ : 586 8-Br-I (koliini)_23_06_ 570 8-Br-II (koliini) 0,6_0J_ : 572 8-F-I (koliini)__12,4 3,5_ : 571 8-F-II (koliini)_419_ Ιβ_ : 578 8-0-CH3-H (koliini) 101_7J_ 575 7-O-CH3-I (koliini) 94,0 114,5 24 112946

Eksitotoksisuus in vitro Menetelmät 5 Aivokuoren neuronit eristettiin samalla tavalla kuin mitä on kuvattu laastaripuris-tinmittausten yhteydessä, paitsi että nyt käytettiin 17-19 vuorokautta kestäneestä raskaudesta saatuja sikiörottia. Neuronit maljattiin 24-monikuoppalevylle (Greiner) tiheydeksi 300 000 solua/kuoppa, jotka kuopat oli pinnoitettu poly-D-lysiinillä, 0,025 mg/ml. Soluja viljeltiin Dulbeccon muunnetussa olennaisalustassa (DMEM, 10 Gibco), jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua sikiövasikan seerumia (Gibco). Viljelmiä pidettiin 37°C:ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% C02. Alusta vaihdettiin ensimmäisen kerran viikon kuluttua ja sitten joka 3. päivä korvaamalla puolet alustasta uudella alustalla. Kokeissa käytettiin 17 vuorokauden ikäisiä viljelmiä.

15

Altistaminen EAA:lle tapahtui seerumia sisältämättömässä MEM-N2-alustassa (Bottenstein 1979), joka sisälsi 0,5 mM NMDA/lmM glysiiniä sekä testattavaa lääkeainetta. Soluja inkuboitiin edeltäkäsin lääkeaineiden ja glysiinin (1 μΜ) kanssa 15 minuuttia ennen NMDA:n lisäämistä. Sytotoksista vaikutusta tutkittiin 24 tunnin 20 kuluttua morfologisesti faasikontrastimikroskoopilla ja se kvantitoitiin biokemialli-sesti mittaamalla LDH-virtaus.

LDH-aktiivisuus määritettiin supematantista 24 tunnin kuluttua menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Wroblewski ja La Due (1955). Lyhyesti, 0,1 ml supematant-25 tia lisättiin 0,9 mkaan natriumfosfaattipuskuria (pH = 7,5), joka sisälsi natriumpyru-: vaattia (22,7 mM) ja NADH (0,8 mg/10 ml) huoneen lämpötilassa. Pyiuvaatin kon- : versiota laktaatiksi mitattiin aallonpituudella 340 nm 10 minuutin ajan Kontron- : spektrofotometrillä.

30 Tulokset Täydellisiä pitoisuus-vaste-käyriä ei ole vielä saatavilla. Yhdisteiden Mrz 2/501 ja Mrz 2/502 alhaiset μΜ-pitoisuudet olivat kuitenkin tehokkaita hermosuojelijoita in : : vitro, yhdisteen Mrz 2/502 näyttäessä voimakkaammalta tässä suhteessa (katso tau- :' 35 lukko 15).

25 112946

Taulukko 15

Mrz 2/ Aine Sytotoksisuus in vitro IC50 μΜ 5ÖI 8-C1-I <5 302 8-C1-II ~ <<5 303 8-B1-I >20 5 In vivo

Kouristuksia torjuva aktiivisuus Tavoite 10 Määrittää testattujen aineiden antagonistiset ominaisuudet NMDA-reseptorin suhteen määrittämällä kouristuksia torjuvat vaikutukset. Lisäksi kuljettimina toimivien orgaanisten happojen merkitys testattujen aineiden katoamisessa aivoista määritettiin Probenisidi-inhibiittoria käyttäen, kouristuksia torjuvan aktiivisuuden keston 15 perusteella.

Menetelmät NMDA-letaalisuuskokeessa käytettiin valkoisia Swiss-urOshiiriä (19-21 g), joita . 20 pidettiin häkeissä, 10-15 hiirtä/häkki (Leander et ai., 1988). Pentyleenitetratsolilla (PTZ) indusoituihin kouristuksiin käytettiin valkoisia Swiss-utOshiiriä (25-34 g), joita pidettiin häkeissä, 40 hiirtä/häkki (58x38x20 cm), kun taas suurimpaan mahdolliseen sähköshokkiin (maximal electroshock; MES) ja motoriseen häiriintymi-: seen perustuvissa kokeissa käytettiin NMR-naarashiiriä (18-28 g), joita pidettiin 25 häkeissä, 5 hiirtä/häkki. Kaikkien eläinten saatavilla oli vettä ja ravintoa ad libitum, : ja niitä pidettiin olosuhteissa, joissa valoisat ja pimeät jaksot vuorottelivat 12 tumiin ; välein (valot syttyivät kello 6 aamulla), ja hallitussa lämpötilassa (20 ± 0,5°C).

Kaikki kokeet toteutettiin kello 10 ja kello 17 välillä. Testattavia aineita injektoitiin i.p. 15 minuuttia ennen kouristusten indusointia, mikäli toisin ei ole mainittu (katso 30 jäljempänä). Yhdistettä Mrz 2/502 liuotettiin suolaliuokseen, johon oli lisätty NaOH:ta. Suurin osa muista aineista liuotettiin seuraavaan liuokseen: 0,606 g Tris; 5,0 g glukoosia; 0,5 g Tween 80; ja 95 ml vettä. Koliini- ja tetrametyyliammonium-suolat liuotettiin tislattuun veteen.

26 112946

Hiirissä toteutetuissa, NMDA-indusoituihin kouristuksiin perustuvissa kokeissa annos-vaste-nippuvuus NMDA:n tapauksessa selvitettiin ensin EDi^-annoksen määrittämiseksi, jota annosta käytettiin sitten antagonististen ominaisuuksien testaamiseen. NMDA:n ED97-annoksen injektion jälkeen eläimet laitettiin pieneen 5 häkkiin (20x28x14 cm) ja niitä tarkkailtiin 20 minuuttia. Farmakologinen päätepiste oli kuolema, jota edelsivät nykivät kouristukset ja toniset kohtaukset.

Pentyleenitetratsolia injektoitiin 90 mg/kg olevana annoksena i.p. Yleisten tonisten kohtausten esiintymistä seurattiin 30 minuuttia, sillä tämä parametri on herkempi 10 NMDA-reseptorin antagonisteille kuin nykivät kouristukset. Farmakologiseksi päätepisteeksi otettiin tonuksen esiintyminen takaraajoissa, joita venytettiin.

Sähköshokki MES (100 Hz, shokin kesto 0,5 sekuntia, shokin voimakkuus 50 mA, impulssin kesto 0,9 ms, Ugo Basile) aiheutettiin sarveiskalvoelektrodeilla. Tonisten 15 kouristusten esiintymistä seurattiin (takakäpälien töninen ojentuminen siten, että pienin raajan ja ruumiin välinen kulma oli 90°). Eräässä lisäkokeessa hiiriin injektoitiin Probenisidia (200 mg/kg) 30 minuuttia ennen testattavien aineiden antamista, millä pyrittiin selvittämään orgaanisen hapon kuljetuksen merkitys poistumiselle (vaikutuksen kestolle). Tavoitteena oli saada ED50-arvot kaikille todetuille paramet-20 reille käyttäen kvantaalisten annosvasteiden Litchfield VVilcoxon-testiä (1949).

Tulokset

Testatuista yhdisteistä vain neljä yhdistettä, jotka kaikki kuuluivat luokkaan II, ' 25 tehosivat i.p.-annettuina M.E.S.-kokeessa (Mrz 2/499, Mrz 2/502, Mrz 2/516 ja Mrz : 2/514, katso taulukko 16a). Liitännäisluokan I yhdisteet olivat inaktiivisia. Kaikkien neljän yhdisteen puoliintumisaika näytti olevan hyvin lyhyt in vivo. PTZ-koe näytti ; olevan herkempi malli i.p. annettujen glysiinift-antagonistien aktiivisuutta tutkitta- ; essa, ja todellakin samat luokan II yhdisteet olivat aktiivisia 2-4 kertaa pienempinä 30 annoksina, kun taas luokan I yhdisteet olivat edelleen inaktiivisia (taulukko 16a).

Näiden samojen N-oksidijohdannaisten koliinisuoloilla (rakenteet II) oli selvää ' * kouristuksia torjuvaa aktiivisuutta kaikissa kolmessa mallissa, kun taas niiden ei-N- : oksidijohdannaiset olivat joko inaktiivisia tai heikkoja (Taulukko 16b). Lisäksi ; : 35 näyttää siltä, että koliinisuolojen vaikutus kestää kauemmin. Probenesidi-injektio '. > pidensi huomattavasti kaikkien testattujen aineiden kouristuksia torjuvaa vaikutusta.

V;. Esimerkiksi yhdisteiden 2/514 ja 2/570 puoliintumisajat olivat vastaavasti noin 40 ja • : 80 minuuttia ilman probenisidia. Probenisidin läsnä ollessa puoliintumisajat pitenivät vastaavasti noin 180 ja 210 minuutiksi. Näin ollen näyttää siltä, että 27 112946 orgaanisten happojen kuljetuksella suonipunoksessa (plexus choroideus) pois aivoista on tärkeä merkitys testattujen yhdisteiden lyhyelle vaikutusteholle. Probenesidilla ei ole käytettynä annoksena (200 mg/kg) sinänsä minkäänlaista itsenäistä vaikutusta MES-indusoituihin kouristuksiin.

5

Taulukko 16a

Mrz 2/ Aine MES i.p. NMDA i.p. PTZ i.p.

__(IDso mg/kg) (1D50 mg/kg) (1DS0 mg/kg) 585 I_>100_58S_59^0_ 499 II_SIS___ISS_ 501 8-C1-I_>100_>100_>40,0_ 502 8-C1-II 47,6_26S_JU_ 503 8-Br-I_>100_>100_>100_ 514 8-Br-lI__2Ck2_99^0__1218_ 519 8-F-I_>60,0_>100_>100_ 516 8-F-II__16S_4ChO_719_ 515 7,8-DiCl-I >100_98^0_>100_ 518 7,8-DiCl-II >60,0_>100__ 539 7-C1,8-Br-I >60,0_>100_>100_ 538 7-Br, 8-C1-I >60,0_106,0_>100_ 554 8-O-CH3-I |>100

Taulukko 16b 10 ____

Mrz 2/ Aine MES i.p.

;__(ID5q mg/kg) 577 II (koliini)_23J_ 569 8-Cl-I(koliini) >50_ 576 8-Cl-II(koliini) 7,7_ 586 8-Br-I(koliini) >50_ : 570__8-Br-II(koliini)__12,8_ 572 8-F-I(koliini)_>100_ 571 8-F-II(koliini)__15,5_ : 574 7,8-DiCl-I(koliini) >100 : 578 8-O-CH,-II (koliini) >100 |575 17-O-CHrI (koliini) |>100 28 112946 EAA-agonistieii mikroclcktroforcettincn levitys selkäytimen hermosoluihin in vivo Näiden glysiiniu-antagonistien kyky toimia NMDA-reseptorin antagonisteina in vivo 5 määritettiin käyttäen i.v.-antamisen riippuvuutta AMPA.n ja NMDA.n mikroelektro-foreettisella levityksellä tuotetusta yksittäisten neuronien vasteesta rotan selkäytimessä. Luokan II yhdisteet Mrz 2/502 ja Mrz 2/516 olivat voimakkaita NMDA-reseptorin antagonisteja in vivo, IDso-arvojen ollesa vastaavasti 1,2 ja 1,8 mg/kg i.v., kun taas kantaluokan 1 yhdisteet olivat täysin inaktiivisia aina annokseen 16 mg/kg 10 i.v. saakka. Kolmesta neljään keitaan suuremmat annokset antagonisoivat myös AMPA:lla saatuja vasteita, vaikka tämä selektiivisyyden näennäinen puuttuminen onkin ristiriidassa in v/p-o-kokeiden kanssa (Taulukko 17a).

Taulukko 17a 15 ____

Mrz 2/ Aine Mikroelektrof. NMDA Mikroelektrof. AMPA

__(IDso mg/kg i.v.)_(ID50 mg/kg i.v.)_ 501 8-C1-I_>16,0_>16,0_ 502 8-C1-II 1,2_4,9_ 519 8-F-I_>16,0_>16,0_ 516 8-F-II 1,8 3,6

Koliinisuolat olivat lähes yhtä voimakkaita kuin vapaat hapot tässä mallissa i.v.-antamisen jälkeen, mutta ne olivat hiemat selektiivisempiä NMDA.n suhteen AMPA.han venattuna (Taulukko 17b). Ei-N-oksidi-johdannaiset (luokan I yhdis-20 teet) olivat jälleen inaktiivisia.

: Taulukko 17b

: Mrz 2/ Aine Mikroelektrof. NMDA Mikroelektrof. AMPA

__(IDso mg/kg i.v.)_(IDso mg/kg i.v.)_ 577 II (koliini)_34^0_>32,0_ 569 8-C1-I (koliini) >16,0_>16,0_ 576 8-C1-II (koliini) 2,8_>16,0_ 586__8-Br-I (koliini) >16,0_>16,0_ • : 570 8-Br-II (koliini) 4,5_>16,0_ 572 8-F-I (kolijni) >16,0_>16,0_ 571 18-F-II (koliini) [4,7 9,2 . 25 29 112946

Tarkastelu

Neljä luokan II yhdistettä Mrz 2/499, 2/501, 2/514 ja 2/516 ovat glysiinitrantago-nisteja in viira, ja niiden in vivo systeeminen saatavuus ja/tai saatavuus keskusher-5 mostossa on paljon parempi kuin niiden liitännäisluokan I yhdisteillä (Mrz 2/585, 2/501, 2/503 ja 2/519). Pääsy keskushermostoon on lähes kaikkiin tähän saakka kehitettyihin glysiini0-antagonisteihin liittyvä huomattava ongelma, mutta tämä suuri este vältetään tällä uudella yhdisteluokalla, ja näi ollen nämä yhdisteet ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia glysiiniirantagonisteja.

10

Additiosuolat

Edellä yhdisteiden 5, 6, 7, 8, 9 ja 10 yhteydessä esitettyjä menetelmiä noudattaen valmistetaan additiosuoloja kvatemääristen amiinien (esim. 4-tetrametyyliammo-15 nium, 4-tetraetyyliammonium), kvatemääristen aminoalkoholien (esim. koliini) tai kvatemääristen aminohappojen (esim. Ν,Ν,Ν-trimetyyliseriini) kanssa. Koliini-ja 4-tetrametyyliammonium (4-NH3) -suolat parantavat biologista saatavuutta olennaisesti ja ne ovat edullisia.

20 Farmaseuttiset koostumukset

Esillä olevan keksinnön mukaisista yhdisteistä voidaan valmistaa farmaseuttisia koostumuksia, jotka käsittävät farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimen-ninta esillä olevan keksinnön mukaisen aktiivisen yhdisteen lisäksi. Tällaisia koos-: 25 tumuksia voidaan antaa elävälle eläimelle, erityisesti elävälle ihmiselle suun kautta tai ruuansulatuskanavan ulkopuolista reittiä. Esimerkiksi suun kautta annettavat : kiinteät valmisteet tai farmaseuttiset koostumukset voivat olla kapseleina, tablettei- : na, pillereinä, jauheina tai rakeina. Tällaisissa kiinteissä farmaseuttisissa valmisteis- . sa aktiivinen aine tai sen esimuoto on sekoitettu vähintään yhteen, farmaseuttisesti 30 hyväksyttävään laimentimeen tai kantajaan kuten ruokosokeriin, laktoosiin, tärkkelykseen, talkkiin tai synteettiseen kumiin tai luonnonkumiin, sideaineeseen kuten gelatiiniin, liukastuneen kuten natriumstearaattiin ja/tai hajottavaan aineeseen kuten ‘ ' natriumbikarbonaattiin. Pitkittyneeseen vapautumiseen pääsemiseksi tähän fanna- '; seuttiseen koostumukseen voidaan sisällyttää sellaista ainetta kuten hydrokolloidia 35 tai muuta polymeeriä. Myös muita lisäaineita kuten liukastavia aineita tai puskureita voidaan myös lisätä alalla tavanomaisella tavalla. Tabletit, pillerit tai rakeet voidaan toivottaessa varustaa enterisellä pinnoitteella. Suun kautta annettavat nesteet voivat olla liposomeina, emulsioina, liuoksina tai suspensioina, jotka sisältävät tavallisesti käytettyjä inerttejä laimentimia kuten vettä. Lisäksi tällaiset nestemäiset farmaseut 30 112946 tiset koostumukset voivat sisältää myös kostuttavia, emulgoivia, dispergoivia tai yleisesti pinta-aktiivisia aineita sekä makeutusaineita, flavoriaineita tai tuoksua tuottavia aineita.

5 Sopivat, ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti annettavat valmisteet voivat olla mm. steriileinä vesipitoisina tai vettä sisältämättöminä liuoksina, suspensioina, liposo-meina tai emulsioina. Farmaseuttisesti hyväksyttävänä laimentimena tai kantajana voidaan käyttää muita monista olemassa olevista lisäaineista, jotka ovat jo tuttuja tällaisessa muodossa olevissa farmaseuttisissa koostumuksissa.

10

Aktiivisten yhdisteiden täsmällinen annostus keksinnön mukaisissa valmisteissa saattaa vaihdella aiotusta käyttötavasta ja hoidon kestosta riippuen, erityisesti hoitavan lääkärin tai eläinlääkärin näkemyksen mukaan. Esillä olevan keksinnön mukaisia aktiivisia aineita voidaan ilmeisestikin yhdistää antamista varten muihin, 15 farmakologisesti aktiivisiin aineisiin.

Esillä olevan keksinnön mukaisissa koostumuksissa aktiivisen aineen tai aineiden osuus koostumuksessa voi vaihdella suuresti siten, että välttämätöntä on ainoastaan se, että keksinnön mukaista aktiivista aineosaa tai sen esimuotoa saadaan tehokas 20 määrä eli että sopiva tehokas annos saadaan käytetyn annosmuodon mukaisesti. Ilmeistä on, että useita annosmuotoja sekä useita yksittäisiä aktiivisia yhdisteitä voidaan antaa samanaikaisesti tai lähes samanaikaisesti tai jopa samassa farmaseuttisessa kootumuksessa tai valmisteessa.

25 Hoitomenetelmä ; Kuten aikaisemmin on todettu, esillä olevan keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan ; antaa erityisesti farmaseuttisina koostumuksina tai valmisteina suun kautta tai ruu- , ansulatuskanavan ulkopuolisesti, täsmällisen yksilöllisen annostuksen sekä päivit- 30 täisten annostusten määräytyessä yksittäistapauksessa luonnollisestikin hyvin vakiintuneiden lääketieteellisten ja/tai eläinlääketieteellisten periaatteiden mukaisesti, vastaavan lääkärin tai eläinlääkärin ohjeiden mukaisesti.

: Suun kautta tai ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti tapahtuvan antamisen lisäksi '. 35 mahdollista on myös antaminen peräsuolen kautta ja/tai laskimon sisäisesti, annos tusten pienentyessä yleensä huomattavasti silloin, kun kysymyksessä on antaminen ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti, vaikka antaminen suun kautta onkin edullista.

.'· Arviolta 1-3 g/vrk oleva määrä toistettuina tai jaettuina annoksina on sopiva. Noin 0,5-10 g/vrk olevat laajemmat alueet saattavat myös olla sopivia, riippuen olosuh- 31 112946 teista yksittäistapauksessa. Vaikka 500 mg aktiivista aineosaa onkin todettu erityisen käyttökelpoiseksi tableteissa, niin yksilölliset annokset voivat vaihdella noin alueella 200-1000 mg, ja tämä tableteissa käytettäväksi ehdotettu 500 mg voidaan luonnollisestikin antaa suun kautta, esimerkiksi yhdestä kolmeen kertaa vuorokaudessa. Itses-5 tään selvää on, että useampia kuin yksi tabletti voidaan antaa yksittäisannoksena edellä esitettyyn, 1-3 g/vrk olevaan päivittäisannokseen pääsemiseksi suun kautta annettaessa.

Kuten edellä on jo mainittu, keksinnön mukaista yhdistettä tai sen esimuotoa voi-10 daan antaa elävälle eläimelle, elävä ihminen mukaan lukien, millä tahansa lukuisalla mahdollisella tavalla, esimerkiksi suun kautta kapseleissa tai tableteissa, ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti steriileissä liuoksissa tai suspensioissa tai istutettavassa pelletissä ja eräissä tapauksissa laskimon sisäisesti steriilinä liuoksena. Muita ilmeisiä antotapoja ovat antaminen ihon kautta, ihon alaisesti, posken kautta, lihaksen si-15 säisesti ja vatsaontelon sisäisesti, ja erityisen antamistavan valitsee nytkin vastaava lääkäri tai eläinlääkäri.

Näin ollen on nähty, että esillä olevassa keksinnössä saadaan aikaan uudet pyrido-ftalatsiinidioniyhdisteet ja niiden farmaseuttiset koostumukset, sekä menetelmä 20 eksitotoksisuuteen ja glutamatergisen hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien neurologisten häiriöiden torjumiseksi, joilla yhdisteillä ja koostumuksilla saadaan yhdessä aikaan jo kauan odotettu ratkaisu aikaisempaan ongelmaan, jota tekniikan nykytaso ei ole kyennyt ratkaisemaan riittävällä tavalla.

: 25 On selvää, ettei esillä olevaa keksintöä ole tarkoitus rajoittaa kuvattuihin tiettyihin yhdisteisiin, koostumuksiin, menetelmiin tai menettelytapoihin, sillä lukuisat mah-; dolliset muokkaukset ja muutokset ovat välittömästi ilmeisiä sen alan, johon tämä ; keksintö liittyy, asiantuntijalle, ja näin ollen esillä olevan keksinnön laajuutta ra- , joittavat yksinomaan liitteenä olevat viralliset patenttivaatimukset.

30 32 112946

Viitteet

Bottenstein JE, Sato GH (1979): Proc. Nall. Acad Sei. USA 76 sivut 514-517.

5 Canton T, Doble A, Miquet JM, Jimonet P, Blanchard JC (1992): J. Pharm. Pharmacol. 44 sivut 812-816.

Dansyz W, Parsons CG, Bresink I, Quack G (1995): Drug News & Perspectives 8, sivut 261-277.

10

Foster AC, Wong EHF (1987): Bril. J. Pharmacol. 91, sivut 403-409.

Hartfree EF (1972): Analytical Biochemistry 48, sivut 422-427.

15 Kessler M, Teiramani T, Lynch G, Baudry M (1989): J. Neitrochem. 52, sivut 1319-1328.

Leander JD, Lawson RR, Omstein PL, Zimmerman DM (1988): Brain Res. 448, s. 115.

20

Litchfield JT, Wilcoxon F (1949): J. Pharmacol. Exp. Ther. 96, s. 99.

Lowiy OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randell RJ (1951): J. Biol Chem. 193, sivut 265-275.

; 25

Parsons CG, Gruner R, Rozental J (1994): Neuropharmacology 33, sivut 589-604.

: Wroblewski F, LaDue JS (1955): Soc. Exp. Biol. Med. 90, s. 210.

» 30 Yoneda Y, Suzuki T, Ogita K, Han DK (1993): J. Neitrochem. 60, sivut 634-645.

* $ * *

Claims

112946 33 1. 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidijohdan-naisten joukosta valittu yhdiste, jolla on seuraava kaava: 5 o R2 8 /4* A Y ^NH r o" OH jossa Rl ja R2 on valittu vedyn, halogeenin ja nietoksin joukosta, tai jossa Rl ja R2 muodostavat yhdessä metyleenidioksin, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, jossa suola on valittu sen koliini- ja 4-tetrametyyliammoniumsuolan j oukosta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste, joka on valittu 15 4-hydroksi-1-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, : * 8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 8-fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, : 20 7,8-dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidinja 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidin sekä minkä tahansa edellä mainitun yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävän 25 suolan joukosta.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, joka on valittu : "; 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuolan, 30 8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-suolan, 34 112946 8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-ko]iini- suolan, 8-fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-suolan, 5 7,8-dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuolan, 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuolan ja 7- kloori-8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- 10 sidi-koliinisuolan joukosta.

5. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, glysiiniB-antagonistisen määrän patenttivaatimuksen 1 mukaista yhdistettä sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimenninta. 15

6. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, glysiini(rantagonistisen määrän patenttivaatimuksen 1 mukaista, koliinisuolanaan olevaa yhdistettä sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimenninta.

7. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, glysiinilrantagonistisen määrän yhdistettä, joka on valittu 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, ' 8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, : 25 8-bromi-4-hydroksi-l-okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 8- fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 7,8-dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- : sidinja 30 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-l-okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- sidin tai minkä tahansa edellä mainitun yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan j oukosta. : : 8. Farmaseuttinen koostumus, joka sisältää aktiivisena aineosana tehokkaan, ; 35 glysiiniB-antagonistisen määrän yhdistettä, joka on valittu 35 112946 4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuolan, 8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-suolan, 8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-5 suolan, 8-fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-suolan, 7.8- dikloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuolan, 10 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuolan ja 7- kloori-8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuolan joukosta.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen käyttö valmistettaessa lääke eksitotoksisuuteen ja glutamatergisen hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien neurologisten häiriöiden hoitamiseksi.

10. Patenttivaatimuksen 2 mukaisen, koliinisuolanaan olevan yhdisteen käyttö 20 valmistettaessa lääke hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien neurologisten häiriöiden hoitamiseksi.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen yhdisteen käyttö valmistettaessa lääke eksitotoksisuuteen ja glutamatergisen hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien 25 neurologisten häiriöiden hoitamiseksi, joka yhdiste on valittu 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 8- kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, ; 8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, . ' 30 8-fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 7.8- dikloori-4-hydroksi-1-okso-1,2-dihydropyridatsino [4,5-b]-kinoliini-5-oksidin, 1 ·’ ‘ 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- sidinja : 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok- : ; 35 sidin tai minkä tahansa edellä mainitun yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan joukosta. 36 112946

12. Patenttivaatimuksen 2 mukaisen yhdisteen käyttö valmistettaessa lääke eksitotoksisuuteen ja glutamatergisen hermovälityksen virhetoimintaan liittyvien neurologisten häiriöiden hoitamiseksi, joka yhdiste on valittu 5 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliinisuolan, 8-kloori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-suolan, 8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-10 suolan, 8-fluori-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi-koliini-suolan, 7,8-dikloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi- koliinisuolan, 15 7-bromi-8-kloori-4-hydroksi-l-okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuolan ja 7-kloori-8-bromi-4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-ok-sidi-koliinisuolan joukosta.

13. Menetelmä 4-hydroksi-1 -okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksi- din (5) :: ; o o f: '7 0 25 valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheen, jossa dimetyyli-kinoliini-2,3-' ’ dikarboksylaatti-1 -oksidi (3) 112946 37 cr R1 I \^^VXN^^N\N^'C00Me muunnetaan hydratsiinisuolaksi (4) O' OH.H2NNH2

5 O reaktiolla hydratsiinihydraatin kanssa, ja tuloksena oleva hydrasiinisuola (4) hydrolysoidaan toivotun 4-hydroksi-1 -okso-1,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidin (5) tuottamiseksi. 10

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, jossa täten saatu 4-hydroksi-1-. okso-l,2-dihydropyridatsino[4,5-b]-kinoliini-5-oksidi (5) muunnetaan koliinisuolak- seen (6) O' 0‘N+Me3CH2CH20H *γ-γΑΎΛΝ

15 Ci reaktiolla koliinihydroksidin kanssa. 38 112946