FI109541B - Menetelmä bradykiniiniantagonistien valmistamiseksi - Google Patents

Description

109541

Menetelmä bradykiniiniantagonistien valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää sellaisten uusien peptidien, joilla on bradykiniiniantagonistinen vaikutus, 5 valmistamiseksi.

Julkaisussa WO 86/07263 kuvataan bradykiniinianta-gonistisia peptidejä, joissa mm. peptidihormoni bradyki-niinin tai muiden bradykiniinianalogien 7-aseman L-Pro on korvattu D-aminohapolla, kuten aminohapolla D-Phe, D-Thia, 10 D-Pal, CDF, D-Nal, MDY, D-Phg, D-His, D-Trp, D-Tyr, D- hPhe, D-Val, D-Ala, D-His, D-Ile, D-Leu tai DOMT.

Keksinnön perustana on tehtävä valmistaa uusia tehokkaita peptidejä, joilla on bradykiniiniantagonistinen vaikutus.

15 Tämä tehtävä ratkaistaan valmistamalla peptidejä,

joilla on kaava I

A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I (I) 20 jossa A on (D)-H-Arg, B on Arg C on Hyp-Pro-Gly tai Pro-Hyp-Gly, • · · ... E on Leu, Tbg tai Cha, • , 25 F on Ser, K on suora sidos, • ’ M on suora sidos, • · ·

ί ί : (D)-Tic on ryhmä, jolla on kaava V

H O

(V) • · * * » * · • · • · · ^ 35 G on cis-endo-oktahydroindoli-2-karboksyylihappo; ’...* F' on Arg ja 2 109541 I on -OH.

Esimerkkejä aivan erityisen edullisista kaavan I mukaisista peptideistä ovat: H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH 5 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Tbg-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle bradykiniinian-tagonistien valmistamiseksi, joilla on kaava I

10 A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I (I) j ossa A on H-(D)-Arg, B on Arg, 15 C on Pro-Hyp-Gly tai Hyp-Pro-Gly, E on Leu, Tbg tai Cha, F on Ser, K ja M merkitsevät suoraa sidosta,

(D)-Tic on ryhmä, jolla on kaava V

20 HO

m ocr <v» • · • · · • · • · · 25 G on Oic, * » 1 » 1 F' on Arg, ja I on -OH, sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi on tunnusomaista se, että .·, ; 30 a) fragmentti, jonka C-pääteryhmänä on vapaa kar- • ♦ · boksyyliryhmä tai sen aktivoitu johdannainen, saatetaan ·· reagoimaan vastaavan fragmentin kanssa, jonka N-pääteryh- • · : ; : mänä on vapaa aminoryhmä, tai • 1 · · · • · 3 109541 b) peptidi muodostetaan vaiheittain, kohdan (a) tai (b) mukaisesti saadusta yhdisteestä poistetaan mahdollisesti yksi tai useampi muiden ryhmien suojaksi tilapäisesti liitetty suojaryhmä, ja näin saadut 5 kaavan I mukaiset yhdisteet mahdollisesti muutetaan fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloikseen.

Peptidit valmistettiin tämän keksinnön mukaisesti yleisesti tunnetuilla peptidikemian menetelmillä, katso esim. julkaisu Houben-Weyl, Methoden der organischen 10 Chemie, Band 15/2, edullisesti kiintofaasisynteesillä, kuten on kuvattu esim. julkaisussa B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 8_5 (1963) 2149 tai R.C. Sheppard, Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) 118, tai vastaavanlaisilla tunnetuilla menetelmillä, α-aminon suojaryhmänä käytetään 15 uretaanisuojaryhmiä, kuten esim. tert-butyylioksikarbonyy-li(Boc)- tai fluorenyylimetyylioksikarbonyyli(Fmoc)-suoja-ryhmää. Jos sivureaktioiden estämiseksi tai erityisten peptidien synteesissä on tarpeen, niin aminohappojen sivu-ketjun funktionaaliset ryhmät on lisäksi suojattu sopivil-20 la suojaryhmillä (katso esim. T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis") , jolloin käytetään ensisi-jaisesti ryhmiä Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Arg(PMC), !*. Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys (4-MeBzl) , Cys (Acm) , Cys (SBut) ,

Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His (Fmoc), His(Dnp), ’ , 25 His(Trt), Lys(Cl-Z), Lys(Boc), Met(0), Ser(Bzl), Ser(But),

Thr(Bzl), Thr(But), Trp(Mts), Trp(CHO), Tyr(Br-Z), ’·"* Tyr(Bzl) tai Tyr(But).

« · · ί ί : Kiintofaasisynteesi alkaa peptidin C-päätteestä suojatun aminohapon liittämisellä vastaavaan hartsiin. .·, : 30 Tällaisia lähtöaineita voidaan saada liittämällä suojattu aminohappo esteri- tai amidisidoksella kloorimetyyli-, hydroksimetyyli-, bentshydryyliamino (BHA-) tai metyyliin j bentshydryyliamino(MBHA-)ryhmällä modifioituun poly- styreeni- tai polyakryyliamidihartsiin. Kantajamateriaa-35 leina käytettäviä hartseja on saatavissa kaupallisesti. Tavallisesti käytetään BHA- ja MBHA-hartseja, kun synteti- t t t • * 4 109541 soidun peptidin C-päätteessä pitää olla vapaa karbamoyyli-ryhmä. Siinä tapauksessa, että peptidin C-päätteessä pitää olla sekundäärinen amidiryhmä, käytetään kloorimetyyli-tai hydroksimetyylihartsia, ja lohkaisu suoritetaan vas-5 taavilla amiineilla. Jos halutaan aikaansaada esim. etyy-liamidi, etyyliamiinia sisältävä peptidi voidaan lohkaista hartsista, minkä jälkeen suoritetaan sivuketjusuojaryhmien poisto muilla sopivilla reagensseilla. Jos peptidissä olevien aminohapon sivuketjun tert-butyylisuojaryhmien pitää 10 säilyä, niin synteesi suoritetaan käyttäen Fmoc-suojaryh-mää aminohapon α-aminoryhmän tilapäiseksi suojaamiseksi ja käyttäen esimerkiksi menettelyä, joka on kuvattu julkaisussa R.C. Sheppard, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1982, 587, jolloin arginiinin guanidinoryhmä suojataan protonoimalla 15 pyridiniumperkloraatilla, ja muiden sivuketjussa funktionaalisia ryhmiä sisältävien aminohappojen suojaus aikaansaadaan katalyyttisellä siirtohydrauksella (A. Felix et ai. J. Org. Chem. L3 (1978) 4194) tai bentsyylisuojaryh- millä, jotka ovat poistettavissa natriumilla nestemäisessä 20 ammoniakissa (W. Roberts, J. Am. Chem. Soc. ]_6 (1954) 6203) .

V: Kun hartsiin kiinnitetyn aminohapon aminosuoja- ryhmä on poistettu sopivalla reagenssilla, kuten esim.

• · « • trifluorietikkahapolla metyleenikloridissä Boc-suojaryhmän i t · ' , 25 kyseessä ollessa tai 20-prosenttisella piperidiinin liuok sella dimetyyliformamidissa Fmoc-suojaryhmän kyseessä oi- • ’· lessa, niin seuraavat suojatut aminohapot liitetään peräk- • · t '1 ! käin halutussa järjestyksessä. Välituotteina saaduista N- päätteestään suojatuista peptidihartseista poistetaan suo- ,·. : 30 jaus edellä kuvatuilla reagensseilla ennen yhdistämistä seuraavan aminohappo johdannaisen kanssa.

*;· Liittämisreagenssina voidaan käyttää kaikkia mah-

• I

I : : dollisia peptidisynteesissä käytettäviä aktivointireagens- seja, katso esim. Houben-Weyl, Methoden der organischen t;t 35 Chemie, Band 15/2, mutta erityisesti karbodi-imidejä kuten esim. N, N '-disykloheksyylikarbodi-imidiä, N, N ' -di-isopro- t · * i · · 5 109541 pyylikarbodi-imidiä tai N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopro-pyyli)karbodi-imidiä. Liittäminen voidaan suorittaa tällöin suoraan aminohappojohdannaisen additiolla aktivoin-tireagenssin kanssa ja mahdollisesti lisäämällä rasemisoi-5 tumista estävää ainetta, kuten esim. 1-hydroksibentsotri-atsolia (HOBt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber 103 (1970) 708) tai 3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydrobentsotriatsiinia (HOObt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970) 2054), hartsiin, tai myös symmetrisenä anhydridinä tai HOBt- tai 10 HOObt-esterinä olevan aminohappojohdannaisen esiaktivointi voidaan toteuttaa erikseen, ja sopivassa liuottimessa oleva aktivoitujen aineiden liuos lisätään peptidihart- siin, johon liittyminen voi tapahtua.

Aminohappojohdannaisten liittäminen tai vastaa- 15 vasti aktivointi jollakin edellä mainituista aktivointi-reagensseista voidaan suorittaa dimetyyliformamidissa, N-metyylipyrrolidonissa tai metyleenikloridissa tai mainittujen liuottimien seoksessa. Aktivoitua aminohappojohdannaista lisätään tavallisesti 1,5 - 4-kertainen ylimäärä. 20 Tapauksissa, joissa tapahtuu epätäydellinen liittyminen, toistetaan liittymisreaktio suorittamatta ensin seuraavan V: aminohapon liittämiselle tarpeellista peptidihartsien a- • « aminosuojaryhmien poistoa.

* · ...# Liittämisreaktion menestyksellistä kulkua voidaan • 1 1 ’ , 25 tutkia ninhydriinireaktion avulla, kuten on kuvattu esim.

julkaisussa E. Kaiser et ai. Anal. Biochem. j34_ (1970) 595.

* · Synteesi voidaan toteuttaa myös automaattisesti esim. yh- • · ίί : tiön Applied Biosystems peptidisyntetisaattorilla Modell 430A, jolloin voidaan käyttää joko laitteen valmistajalta ,·, ; 30 saatuja tai käyttäjällä itsellään olevia synteesiohjelmia.

* · 1 ..." Viimeksi mainittuja käytetään erityisesti käytettäessä *|’ aminohappojohdannaisia, jotka on suojattu Fmoc-ryhmällä.

» » < 1 » »f 1 t » t » i i » • « I · »tl • I I · t » · » • » fi 109541

Kun peptidien synteesi on suoritettu edellä kuvatulla tavalla, peptidi voidaan lohkaista hartsista rea-gensseilla, kuten esim. nestemäisellä vetytluoridilla (edullinen Boc-menetelmillä valmistettujen peptidien ky-5 seessä ollessa) tai trifluorietikkahapolla (edullinen Fmoc-menetelmillä syntetisoitujen peptidien kyseessä ollessa) . Nämä reagenssit eivät lohkaise ainoastaan peptidiä hartsista, vaan myös aminohappojohdannaisten muut sivuket-jusuojaryhmät. Tällä tavalla saadaan peptidi vapaana hap-10 pona lukuunottamatta tapausta, jossa käytetään BHA- ja MBHA-hartseja. BHA- tai MBHA-hartseilla saadaan peptidi happoamidina, kun lohkaisu suoritetaan vetyfluoridilla tai trifluorimetaanisulfonihapolla. Muita peptidiamidien valmistusmenetelmiä on kuvattu julkaisuissa EP-A 287 882 ja 15 EP-A 322 348. Tällöin peptidiamidien lohkaisu hartsista suoritetaan käsittelemällä peptidisynteesissä tavallisesti käytettävillä keskivahvoilla hapoilla (esim. trifluori-etikkahapolla), jolloin kationien sitojiksi lisätään aineita, kuten fenolia, kresolia, tiokresolia, anisolia, 20 tioanisolia, etaaniditiolia, dimetyylisulfidia, etyylime-tyylisulfidia tai niiden kaltaisia kiintofaasisynteesissä : ! tavallisia kationien sitojia yksittäin tai seoksena, jonka muodostavat kaksi tai useampia tällaisia apuaineita. Tri- *:*. fluorietikkahappoa voidaan tällöin käyttää myös sopivalla • · · 25 liuottimena, kuten esim. metyleenikloridilla, laimennettuna .

Jos peptidien tert-butyyli- tai bentsyylisivuket-·.· · jusuojaryhmät halutaan säilyttää, niin erityisellä tavalla modifioidulle kantajahartsille syntetisoidun peptidin loh- j 30 kaisu suoritetaan 1-prosenttisella trif luorietikkahapolla • · .···, metyleenikloridissa, kuten on kuvattu esim. julkaisussa R.C. Sheppard, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1982, 587. Jos ·.· · yksittäiset tert-butyyli- tai bentsyylisivuketjusuojaryh- : mät pitää säilyttää, niin käytetään sopivaa synteesi- ja 35 lohkaisumenetelmien yhdistelmää.

Sellaisten peptidien syntetisoimiseksi, joiden 7 109541 C-paätteessä on karbamoyyliryhmä tai ω-amino- tai vastaavasti a)_guanidinoalkyyliryhmä, käytetään myös Sheppardin kuvaamaa modifioitua kantajahartsia. Synteesin jälkeen sivuketjustaan täysin suojattu peptidi lohkaistaan hart-5 sista ja sen jälkeen saatetaan reagoimaan perinteisellä ; liuossynteesillä vastaavan amiinin tai vastaavasti co_ aminoalkyyliamiinin tai co-guanidinoalkyyliamiinin kanssa, jolloin mahdollisesti läsnä olevat muut funktionaaliset ryhmät voidaan tilapäisesti suojata tunnetulla tavalla.

10 Edelleen eräs menetelmä co-aminoalkyyliryhmän si sältävien peptidien valmistamiseksi on kuvattu julkaisussa EP-A 264 802.

Tämän keksinnön mukaisesti peptidit syntetisoi tiin edullisesti käyttäen kiintofaasitekniikkaa kahden 15 yleisen suojaryhmämenettelyn mukaisesti:

Synteesi suoritettiin yhtiön Applied Biosystems automaattisella peptidisyntetisaattorilla Modell 430 A käyttäen Boc- tai Fmoc-suojaryhmiä α-aminoryhmän tilapäiseen suojaukseen.

20 Käytettäessä Boc-suojaryhmää käytettiin etukäteen ohjelmoituja synteesisyklejä, jotka oli saatu synteesiä : : varten laitteen valmistajalta.

Peptidit, joiden C-päätteessä oli vapaa karbok-·;·. syyliryhmä, syntetisoitiin vastaavalla yhtiön Applied Bio- 25 systems Boc-aminohappofunktionalisoidulla 4-(hydroksime-tyyli)fenyyliasetamidometyylipolystyreenihartsilla (R.B.

' ' Merrifield, J. Org. Chem. 4_3 (1978) 2845) . Peptidiamidien V ·' valmistukseen käytettiin saman yhtiön MBHA-hartsia. Akti- vointireagensseina käytettiin N,N'-disykloheksyylikarbodi-: 30 imidiä tai N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidiä. Aktivointi ,···, suoritettiin symmetrisenä anhydridinä, HOBt-esterinä tai t HOObt-esterinä CH2Cl2:ssa, ClbC^m ja DMF:n seoksessa tai • · •tj · NMP:ssa. Liittämisreaktioon käytettiin 2-4 ekvivalenttia :***: aktivoitua aminohappo j ohdannaista. Tapauksissa, joissa • · · .h 35 kiinnittyminen tapahtui epätäydelliseksi, reaktio toistet- *···* tiin.

„ 109541

Kun Fmoc-suojaryhmää käytettiin α-aminoryhmän tilapäiseen suojaukseen, niin yhtiön Applied Biosystems automaattisella peptidisyntetisaattorilla Modell 430A suoritettua synteesiä varten käytettiin omia synteesiohjelmia.

5 Synteesi suoritettiin yhtiön Bachem p-bentsyylioksibent-syylialkoholihartsilla (S. Wang, J. Am. Chem. Soc. 95 (1973) 1328), joka oli esteröity tunnettujen menetelmien mukaisesti (E. Atherton et ai. J.C.S. Chem. Comm. 1981, 336) vastaavalla aminohapolla. Aminohappojohdannaisten 10 aktivointi HOBt- tai HOObt-esterinä suoritettiin suoraan laitevalmistajan toimittamissa aminohappopatruunoissa lisäämällä di-isopropyylikarbodi-imidin liuosta DMF:ssa etukäteen punnittuun aminohappojohdannaisen ja HOBt:n tai HOObt:n seokseen. Samoin voidaan käyttää aineessa valmis-15 tettuja Fmoc-aminohappo-OObt-estereitä, jollaisia on kuvattu julkaisussa EP-A 247 573. Fmoc-suojaryhmän lohkaisu suoritettiin 20-prosenttisella piperidiinin liuoksella DMF:ssa reaktioastiassa. Käytetyn reaktiivisen aminohappo j ohdannaisen ylimäärä oli 1,5 - 2,5 ekvivalenttia. Jos 20 kiinnittyminen ei ollut täydellinen, toistettiin kuten Boc-menetelmän ollessa kyseessä.

• ·

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla peptideillä on yksinään tai yhdistelmänä bradykiniiniantagonistinen *:·. vaikutus, jotka voidaan tutkia erilaisilla malleilla (ks.

>tti. 25 Handbook of Exp. Pharmacol. Voi. 25, Springer Verlag, 1970, s. 53 - 55) kuten esim. eristetyllä rotan kohdulla, marsun sykkyräsuolella tai marsun eristetyllä keuhkoval-: timolla.

Keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien <’· [ 30 tutkimiseksi eristetyllä keuhkovaltimolla marsut (Dunkin .···. Hartley) , joiden paino on 400 - 500 g, tapetaan iskulla '!1 niskaan.

• » • · • « » « 4 1 1 9 109541

Rintakehä avataan ja keuhkovaltimo preparoidaan varovaisesti erilleen. Sitä ympäröivä kudos poistetaan huolellisesti ja keuhkovaltimo leikataan 45°:n kulmassa spiraalimaisesti.

5 2,5 cm pitkä ja 3 - 4 mm leveä suoniliuska kiin nitetään tilavuudeltaan 10 ml:n elinkylpyyn, joka on täytetty Ringer-liuoksella.

Liuoksen koostumus yksiköissä mmol/1 on seuraava: i 10 NaCl 154 KC1 5,6

CaCl2 1,9

NaHC03 2,4 glukoosi 5,0 15

Liuoksen läpi puhalletaan 95 % 02:ta ja 5 % C02:ta ja se lämmitetään 37 °C:seen. pH on 7,4, suoniliuskan esi-kuormitus 1,0 g.

Isometriset supistumismuutokset mitataan vipuesi-20 laitteistolla ja HF-modeemilla (matkan mittari), valmistaja Hugo Sachs, ja rekisteröidään kompensaatiopiirturilla :: (BEC, Goerz Metrawatt SE 460).

·’· . Tunnin tasapainotusajan jälkeen aloitetaan koe.

·;·. Sen jälkeen kun suoniliuskat ovat saavuttaneet maksimi- 25 herkkyytensä bradykiniinin pitoisuuden 2 x 10’7 mol/1 suhteen - bradykiniini aiheuttaa suoniliuskan supistumisen -annetaan peptidien vaikuttaa suoniliuskoihin kulloinkin 10 · minuutin ajan annoksina 5 x 10~5 mol/1, ja kun bradykinii nin lisäys on toistettu, verrataan bradykiniinin vaikutuk-j 30 sen vähenemistä vertailunäytteeseen.

,·*. Osittaisagonistisen vaikutuksen havaitsemiseksi peptidejä käytetään annoksina 1 x 10~5 - 1 x 10’3 mol/1.

; Keksinnön mukaisten peptidien annos-vaikutuskäy- : : ristä lasketut ICso-arvot on esitetty taulukossa 1.

.;. 35 10 109541

Taulukko 1:

Yhdiste IC50[M] H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Leu-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH 5, 9.10-9 5 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH 3,7.1CT8 H-(D)-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Tbg-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH 6,0.1CT6

Keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien terapeuttinen käyttö käsittää kaikki patologiset tilat, 10 joita bradykiniini ja bradykiniinille läheiset peptidit välittävät, laukaisevat tai edistävät. Näitä ovat mm. vauriot kuten haavat, palohaavat, ihottumat, eryteema, turvotukset, angiina, niveltulehdus, astma, allergiat, allerginen nuha, shokki, tulehdukset, alhainen verenpaine, 15 kipu, kutina ja muuttunut sperman liikkuvuus.

Keksintö koskee sen vuoksi myös kaavan I mukaisia peptidejä sisältäviä farmaseuttisia valmisteita.

Farmaseuttiset yhdisteet sisältävät tehokkaan määrän kaavan I mukaista tehoainetta - yksin tai yhdistelmänä -20 yhdessä epäorgaanisen tai orgaanisen farmaseuttisesti käyttökelpoisen kantajan kanssa.

• « t·'^ Käyttö voi tapahtua enteraalisesti, parenteraalises- ti - kuten subkutaanisti, i.m. tai i.v. - kielen alle, epi-·;·. kutaanisti, nasaalisti, rektaalisti, intravaginaalisesti, 25 intrabukkaalisesti tai sisäänhengityksen kautta. Tehoaineen . annostus riippuu lämminverisen eläimen lajista, painosta, iästä ja antotavasta.

'.· · Tässä kuvattuja farmaseuttisia valmisteita val mistetaan sinänsä tunnetuilla liuotus-, sekoitus-, granu-30 lointi- tai rakeistusmenetelmillä.

.**. Oraalista käyttömuotoa varten tai käytettäviksi ’ limakalvoille aktiiviset yhdisteet sekoitetaan tässä tar- ;.! · koituksessa tavanomaisiin lisäaineisiin kuten kantajiin, : ί stabilisaattoreihin tai inertteihin laimentimiin ja saa- 35 tetaan tavanomaisilla menetelmillä sopiviksi antomuodoiksi, ,)'* kuten tableteiksi, rakeiksi, siirrostekapseleiksi, vesi-, u 109541 alkoholi- tai öljysuspensioiksi tai vesi-, alkoholi- tai öljyliuoksiksi. Inertteinä kantajina voidaan käyttää esim. arabikumia, magnesiumoksidia, magnesiumkarbonaattia, kaliumfosfaattia, maitosokeria, glukoosia, magnesiumstearyy-5 lifumaraattia tai tärkkelystä, erityisesti maissitärkke- lystä. Valmistus voi tällöin tapahtua sekä kuiva- että märkägranuloinnilla. Öljykantajina tai -liuottimina tulevat kysymykseen esimerkiksi kasvi- tai eläinöljyt kuten aurin-gonkukkaöljy ja kalanmaksaöljy.

10 Paikalliseen käyttöön tarkoitettu valmiste voi olla vesi- tai öljypitoisena liuoksena, lotionina, emulsiona tai hyytelönä, salvana tai voiteena tai, mikäli mahdollista, suihkeena, jolloin kiinnittymistä voidaan haluttaessa parantaa lisäämällä polymeeriä.

15 Intranasaalia käyttömuotoa varten yhdisteet sekoi tetaan tässä tarkoituksessa tavanomaisiin lisäaineisiin kuten stabilisaattoreihin tai inertteihin laimentimiin ja saatetaan tavanomaisilla menetelmillä sopiviksi antomuo-doiksi, kuten vesi-, alkoholi- tai öljysuspensioiksi tai 20 vesi-, alkoholi- tai öljyliuoksiksi. Vesipitoisiin intra- nasaaleihin valmisteisiin voidaan lisätä kelaatinmuodos-tajia, etyleenidiamiini-N,N,N' , N'-tetraetikkahappoa, sit-ruunahappoa, viinihappoa tai niiden suoloja. Nasaaliliuos-·;·. ten anto voi tapahtua annostussumuttimen avulla tai vis- 25 kositeettia suurentavaa ainetta sisältävinä nenätippoina tai vastaavasti nenägeelinä tai nenävoiteena.

Sisäänhengityskäyttöä varten voidaan käyttää sumut- • * · ·.· · timia tai painekaasupakkauksia, joissa on inerttejä kan- tajakaasuja.

j 30 Intravenöösiä, subkutaania, epikutaania tai intra- .··. dermaalista käyttöä varten aktiiviset yhdisteet tai niiden *!* fysiologisesti hyväksyttävät suolat saatetaan liuokseksi, ; suspensioksi tai emulsioksi, haluttaessa yhdessä farmaseut- : : tisesti tavallisten apuaineiden kanssa, esimerkiksi iso- 35 tonisoivien tai pH:ta säätävien aineiden sekä liuotusvälit- ;· täjien, emulgaattorien tai muiden apuaineiden kanssa.

12 109541

Koska joillakin kuvatuista lääkeaineista on lyhyt puoliintumisaika kehon nesteissä, on injektoitavien hidas-tevalmisteiden käyttö tarkoituksenmukaista. Lääkemuotoina voidaan käyttää esim. öljypitoisia kidesuspensioita, mik-5 rokapseleita, sauvoja tai siirrosteita, jolloin viime mainitut on voitu muodostaa kudoksen kanssa yhteensopivista polymeereistä, erityisesti biologisesti hajoavista polymeereistä kuten poly-maitohappo-polyglykolihapposekapoly-meereihin tai ihmisalbumiiniin perustuvista polymeereistä.

10 Sopivan annostusalueen paikallisia ja sisäänhengi- tyskäyttömuotoja varten muodostavat liuokset, joiden pitoisuus on 0,01 - 5 mg/ml, systeemisissä käyttömuodoissa on 0,01 - 10 mg/kg sopiva.

Luettelo lyhenteistä: 15 Aminohapoista käytetyt lyhenteet vastaavat peptidi- kemian lyhenteitä, jotka ovat tavallisesti kolmikirjainkoo-deja, kuten on kuvattu julkaisussa Europ. J. Biochem. 138 (1984) 9. Muut käytetyt lyhenteet on lueteltu seuraavassa.

20 Acm asetamidometyyli ε-Ahx ε-aminoheksanoyyli .V Aoc cis,endo-2-atsabisyklo[3.3.0]oktaani-3-S- • karbonyyli

Boc tert-butyylioksikarbonyyli 25 But tert-butyyli

Bzl bentsyyli • » CDF kloori-(D)-fenyylialanyyli *·’ ’ Cha sykloheksyylialanyyli

Chg sykloheksyyliglysyyli : *,: 30 Cl-Z 4-klooribentsyylioksikarbonyyli DM F dimetyyliformamidi DOMT O-metyyli-(D)-treonyyli ·»; ί Dnp 2,4-dinitrofenyyli

Fmoc 9-f luorenyylimetyylioksikarbonyyli ,···_ 35 MDY O-metyyli-(D)-tyrosyyli

Me metyyli 13 109541 4-Mebzl 4-metyylibentsyyli

Mtr 4-metoksi-2,3,6-trimetyylifenyylisulfo- nyyli

Mts mesityleeni-2-sulfonyyli 5 Nal 2-naftyylialanyyli NMP N-metyylipyrrolidiini

Npg neopentyyliglysyyli

Oic cis-endo-oktahydroindoli-2-karbonyyli

Opr isoksatsolidin-3-yylikarbonyyli 10 Pal pyridyylialanyyli

Pmc 2,2,5,7,8-pentametyylikromaani-6-sulfo- nyyli

Tbg tert-butyyliglysyyli TFA trifluorietikkahappo 15 Thia 2-tienyylialanyyli

Tcs 4-metyylifenyylisulfonyyli

Tic 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-3-yylikarbo- nyyli

Trt trityyli 20

Seuraavien esimerkkien on tarkoitus valaista edul- • · lisiä menetelmiä keksinnön mukaisten peptidien syntetisoi-‘ '·· miseksi kiintofaasisynteesillä ilman, että keksintö rajoit- tuisi niihin.

25 Käytettiin seuraavia aminohappojohdannaisia: _ . Fmoc-Arg (Mtr) -OH, Boc-(D)-Arg-OH, Fmoc-Arg (Pmc)-OH, Fmoc-

Hyp-OH, Fmoc-Pro-OObt, Fmoc-Gly-OObt, Fmoc-Phe-OObt, Fmoc- * · · '·* * Ser(tBu)-OObt, Fmoc-(D)-Tic-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Aoc-OH,

Fmoc-Thia-OH, Fmoc-Opr-OH, Fmoc-(D)-Asn-OH, Fmoc-5-Ala-OH, ; 30 Fmoc-Oic-OH.

Esimerkki 1: H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Leu-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH hi : muodostettiin vaiheittain peptidisyntetisaattorilla Modell ;ι>(· 430 A, jota toimittaa yhtiö Applied Biosystems, käyttäen 35 Fmoc-menetelmää Fmoc-Arg(Mtr)-OH:11a esteröidylle p-bent-syylioksibentsyylialkoholihartsille, jota toimittaa yhtiö 14 109541

Novabiochem (täyttö n. 0,5 mmol/g hartsia). Lisättiin 1 g hartsia, ja synteesi suoritettiin erään Fmoc-menetelmää varten modifioidun synteesiohjelman avulla.

Kuhunkin syntetisaattorin patruunaan mitattiin 5 1 mmol aminohappojohdannaista, jossa oli vapaa karboksyy- liryhmä, yhdessä 0,95 mmol:n kanssa HOObt:a. Nämä aminohapot esiaktivoitiin suoraan patruunoissa liuottamalla ne 4 mlraan DMF:a ja lisäämällä 2 ml di-isopropyylikarbodi-imidin DMF-liuosta, jonka pitoisuus oli 0,55 mol/1. Muiden i 10 aminohappojen HOObt-esterit liuotettiin 6 mlraan NMP:a, ja liitettiin sitten samoin kuin in situ -esiaktivoidut aminohapot hartsiin, josta oli poistettu suojaus 20-prosentti-sella piperidiinillä DMF:ssa. Kun synteesi oli päättynyt, j peptidi lohkaistiin hartsista poistamalla samanaikaisesti 15 sivuketjusuojaryhmät trifluorietikkahapolla käyttäen tio- anisolia ja etaaniditiolia kationinsitojina. Trifluorietik-kahapon poistamisen jälkeen saatua jäännöstä uutettiin etikkahapolla ja sentrifugoitiin useita kertoja. Jäljelle jäänyt jäännös kromatografoitiin Sephadex LH 20:11a 10- 20 prosenttisen etikkahapon avulla. Puhdasta peptidiä sisäl- | tävät fraktiot yhdistettiin ja pakastuskuivattiin.

.V MS (FAB) : 1264 (M+H) * Seuraavat esimerkit valmistettiin analogisesti esi- I · I *:*. merkin 1 kanssa.

• * * 2 5 Esimerkki 2: • ·

. H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Cha-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH

MS (FAB): 1304 (M+H) 1 i · · J · * · '.* · Esimerkki 3: H-(D)-Arg-Arg-Hyp-Pro-Gly-Tbg-Ser-(D)-Tic-Oic-Arg-OH 30 MS (FAB) : 1264 (M+H)

« I I

* · · * · t t · 11» · » t >

Claims (3)

15 109541 Patenttivaatimus Menetelmä bradykiniiniantagonistien valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I (I) | jossa A on H-(D)-Arg, 10. on Arg, C on Pro-Hyp-Gly tai Hyp-Pro-Gly, E on Leu, Tbg tai Cha, F on Ser, K ja M merkitsevät suoraa sidosta, 15 (D)-Tic on ryhmä, jolla on kaava V H O OCT 20 G on Oic, F' on Arg, ja I on -OH, ·;·. sekä niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmis- -it>. 25 tamiseksi, tunnettu siitä, että a) fragmentti, jonka C-pääteryhmänä on vapaa kar-boksyyliryhmä tai sen aktivoitu johdannainen, saatetaan ·.· ·’ reagoimaan vastaavan fragmentin kanssa, jonka N-pääteryh- mänä on vapaa aminoryhmä, tai ;\j 30 b) peptidi muodostetaan vaiheittain, .··, kohdan (a) tai (b) mukaisesti saadusta yhdisteestä poiste- ’’ taan mahdollisesti yksi tai useampi muiden funktionaalis- ί,ί i ten ryhmien suojaksi tilapäisesti liitetty suojaryhmä, ja • i · ί : näin saadut kaavan I mukaiset yhdisteet mahdollisesti muu- 35 tetaan fysiologisesti hyväksyttäviksi suoloikseen. 16 109541 Förfarande för framställning av bradykininanta-gonister med formeln I 5 A-B-C-E-F-K-(D)-Tic-G-M-F'-I (I) väri A är H-(D)-Arg,

10 B är Arg, C är Pro-Hyp-Gly eller Hyp-Pro-Gly, E är Leu, Tbg eller Cha, F är Ser, K och M betecknar en direkt bindning, 15 (D)-Tic är en grupp med formeln V I? (V) CCT

20 G är Oic : : F' är Arg och • · I är -OH, ·;·, samt för f ramställning av deras fysiologiskt godtagbara ! · · t salter, kännetecknat av att i ·:··: 2. a) ett fragment, vars C-ändgrupp är en fri ! 1 * karboxylgrupp eller dess aktiverade derivat, fäs att • · · ·' reagera med ett motsvarande fragment, vars N-ändgrupp är en fri aminogrupp, eller j b) peptiden bildas stegvis, ,···, 30 frän föreningen som erhällits enligt punkt (a) eller (b) avlägsnas eventuellt en eller flera skyddsgrupper som • · ·,· | infogats temporärt som skydd för andra funktionella ,* grupper, och de sälunda erhällna föreningarna enligt formeln I förvandlas eventuellt tili sinä fysiologiskt t · ’*··* 35 godtagbara salter. • ·